KR101431324B1 - ＷＫＹＭＶｍ 펩티드를 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 및 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 장질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 WKYMVm 펩티드는 염증성 장질환의 증상인 결장단축, 체중감소, 출혈지수 상승 또는 배변지수 상승 등을 회복시킴으로써, 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 건강기능식품으로도 이용 가능하다.

Description

ＷＫＹＭＶｍ 펩티드를 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition comprising a peptide WKYMVm for prevention and treatment of inflammatory bowel diseases}

본 발명은 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 및 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 장질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

크론병(Chron's disease)과 궤양성 대장염(ulcerative colitis)로 대표되는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)은 위장관을 침범하는 원인이 정확히 밝혀지지 않은 만성적인 염증성 질환을 의미한다. 크게는 상기 크론병과 궤양성 대장염의 두 종류로 구분되지만 우리나라에서 비교적 흔하게 발병하는 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease)을 포함시키기도 한다. 흑인이나 동양인보다는 백인이나 유태인에서 많이 발견되지만 동양인에서 발병되는 경우가 점차 증가하고 있다. 호발연령은 15 내지 35세 사이이며, 증상은 궤양성 대장염의 경우 설사(혈변 및 점액변), 뒤무직, 복통, 복부압통, 체중감소 등이 주로 나타나며, 크론병의 경우에는 체중감소, 우하복부 종류, 항문주위 이상, 복부압통 등이 나타난다. 장형 베체트병은 이들과 유사하게 설사와 복통 등의 증상을 나타내며 이외의 베체트병에 준하는 증상을 동반한다. 내과적 치료가 원칙이나 이것이 어렵거나 합병증이 발병한 경우에는 외과적 치료를 한다. 약물치료를 수행하고는 있으나, 원인이 명확히 밝혀지지 못한 만큼 이렇다할 치료제가 개발되지 못하였고 일반적인 항염증제, 부신피질 호르몬제, 면역억제제, 항생제 및 기타 약품을 적절히 병용하여 복합적으로 사용하는 추세이다. 염증의 종류, 정도, 부위, 합병증 등에 따라 약품의 종류와 양을 조절하여 사용한다. 그러나 이러한 복합요법은 부작용이 발생할 가능성이 높다는 단점이 있다. 따라서, 효과적인 염증성 장질환의 치료를 위한 치료제의 개발은 매우 중요하다.

WKYMVm은 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 동정한 합성 펩티드로, 적어도 3개의 포르밀 펩티드 수용체(formyl peptide receptor; FPR), FPR1, FPR2 및 FPR3에 결합한다. WKYMVm은 중성구(neutrophil), 단핵구(monocyte), 수지상세포(dendritic cell) 및 자연살상세포(natural killer cell)와 같은 백혈구(leukocyte)의 화학주성이동(chemotactic migration)을 촉진하며, 또한 중성구 및 단핵구를 포함하는 대식세포로부터 초과산화물 음이온(superoxide anion) 생성을 촉진한다. WKYMVm 펩티드는 면역조절 펩티드로 알려져 있으며, 최근 발명자들은 복합균 패혈증(polymicrobial sepsis) 모델에 대하여 치료효과가 있음을 확인한 바 있으나, 염증성 장질환에 대한 WKYMVm 펩티드의 효과에 대해서는 아직까지 알려진 바 없었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 WKYMVm 펩티드의 다양한 기능에 대하여 연구한 결과, WKYMVm 펩티드가 염증성 장질환 동물 모델에서도 그 예방 및 치료효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

[선행기술문헌]
1. J. Biol. Chem., 271(14): 8170-8175 (1996.04.05.)
2. J. Immunol., 163(12): 6777-6784 (1999.12.15.)
3. J. Leukoc. Biol., 65(2): 241-248 (1999.02.)
4. Mol. Pharmacol., 64(4): 841-847 (2003.10.)
5. J. Immunol., 185(7): 4302-4310 (2010.10.01.)

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1로 표시되는 트립토판(tryptophan)-리신(lysine)-티로신(tyrosine)-메티오닌(methionine)-발린(valine)-디-메티오닌(D-methionine)(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met; WKYMVm)의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서열번호 1로 표시되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 트립토판(tryptophan)-리신(lysine)-티로신(tyrosine)-메티오닌(methionine)-발린(valine)-디-메티오닌(D-methionine)(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met; WKYMVm)의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드는 일련의 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 동정한 합성 펩티드로, 면역조절 펩티드로 알려져 있다. 트립토판(tryptophan)-리신(lysine)-티로신(tyrosine)-메티오닌(methionine)-발린(valine)-디-메티오닌(D-methionine)(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met) 잔기가 차례로 연결된 펩티드이다. 상기 펩티드는 중성구(neutrophil) 및 단핵구(monocyte)와 같은 대식세포(phagocytic cell)에서 발현되는 포르밀 펩티드 수용체(formyl peptide receptor; FPR)에 결합할 수 있으며, 중성구, 단핵구, 수지상세포(dendritic cell) 및 자연살상세포(natural killer cell)와 같은 백혈구(leukocyte)의 화학주성이동(chemotactic migration)을 촉진시킬 수 있다. 또한, 중성구 및 단핵구를 포함하는 대식세포로부터 초과산화물 음이온(superoxide anion) 생산을 촉진시킬 수 있다.

상기 WKYMVm의 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 면역조절제로서 스크리닝하여 동정하고 합성한 것으로, 상기 펩티드가 염증성 사이토카인 IL-23 및 TGF-β 생산을 감소시킴으로 염증성 장질환을 예방 또는 치료할 수 있음에 대해서는 보고된 바 없다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 서열번호 1로 표시되는 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄 술폰산, p-톨루엔 술폰산, 아세트산, 트리프루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, WKYMVm의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 거의 포함한다. 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 용어, "염증성 장질환(inflammatory bowel disease)"은 장에 발생하는 원인불명의 만성적인 염증을 뜻하는 것으로, 통상적으로 특발성 염증성 장질환인 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 크론병(Chron's disease)을 지칭하지만, 우리나라에서 비교적 흔하게 발병하는 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease)도 이에 포함될 수 있다. 보다 넓은 의미로는 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등 모든 장에서 발생하는 염증성 질환을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 넓은 의미의 염증성 장질환, 예컨대, 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등 모든 장에서 발생하는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크론병, 궤양성 대장염 및 장형 베체트병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이 염증성 장질환의 원인은 아직까지 규명되지 못하고 있으나, 유전적 및 환경적 영향을 받으며, 면역학적 이상에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 원인이 명확히 규명되지 못하였으므로 뚜렷한 치료제도 개발되지 못하였다. 따라서, 현재로서는 약물을 이용한 염증성 장질환의 치료를 위하여 일반적인 항염증제, 부신피질 호르몬제, 면역억제제 또는 항생제 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용함으로 치료효과는 극대화하고 부작용은 최소화할 수 있는 범위에서 치료제의 종류 및 용량 등을 선택하는 방법을 택하고 있다.

상기 염증성 장질환의 증상은 구체적인 질병에 따라 차이는 있으나, 일반적으로 복통, 하복부 불쾌감, 결장의 단축(shortening of colon), 체중감소, 출혈지수 상승(출혈) 또는 배변지수 상승(설사)의 증상을 나타낼 수 있다. 동일한 질병이라도 병변의 범위나 위치 또는 중증도에 따라 다른 양상을 나타낼 수 있다.

상기 염증성 장질환의 예방 또는 치료는 결장에서 분비되는 염증성 사이토카인 IL-23 또는 TGF-β의 증가를 감소시킴으로써 수행될 수 있다.

상기 IL-23은 이형이합체의 사이토카인으로 면역반응에서 중요한 역할을 한다. 수지상세포(dendritic cell), 대식세포(macrophage) 및 기타 면역세포에서 생산되는 것으로 장에서 내성과 면역 간의 균형에 영향을 주는 주요한 요소로 여겨지며, 결장에서 염증을 매개하는 것이 확인되었다. 상기 TGF-β는 다양한 조직에서 합성되는 요소로 TGF-α와 상승적으로 작용한다. 배아발달, 세포분화, 호르몬분비 및 면역기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 동물모델 실험과 더불어 추가적으로 염증성 사이토카인의 분비량을 측정하였다. 그 결과, 염증성 장질환 모델에서 염증을 매개하는 사이토카인인 IL-23과 TGF-β의 증가된 분비량을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 4G 및 4H).

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, DSS(dextran sodium sulfate)를 투여하여 궤양성 대장염을 유발한 마우스모델에 있어서, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 WKYMVm의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 투여함으로써, 질환 유도로 인해 감소된 체중, 상승된 배변지수 및 출혈지수를 회복시킬 수 있었다(도 1). 또한, 육안 및 조직학적 관찰에 따르면 WKYMVm의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 투여함으로써, 질환 유도로 짧아진 결장 및 파괴된 점막층을 현저히 회복시킬 수 있음을 확인하였다(도 2). 또한 염증성 장질환의 알려진 다른 증상인 장투과성 증가와 관련하여 본 발명의 펩티드 투여시 장상피세포의 증식 및 이동을 촉진함으로 장투과성이 증가할 수 있음을 확인하였다(도 3). 뿐만 아니라 장에서 분비되는 각종 염증성 사이토카인의 분비 수준을 측정하여 본 발명의 펩티드에 의한 염증성 장질환의 예방 또는 치료 효과는 질환 유발에 의해 증가된 사이토카인 IL-23 및 TGF-β 분비 증가를 감소시킴으로 성취될 수 있음을 확인하였다(도 4G 및 4H).

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 장질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 장질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 사용가능한 계면활성제로는 스테로이드에서 유도된 것이나, N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드](DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 용어 “건강기능식품”은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 화합물을 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 WKYMVm 펩티드는 6개의 아미노산으로 구성된 펩티드의 형태이므로 약학적 조성물 또는 식품 첨가물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로, 안전하게 약학적 조성물 및 건강기능식품에 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "개체"란 염증성 장질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 염증성 장질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 염증성 장질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 그러나 경구 투여시, 펩티드는 소화가 되기 쉽기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 펩티드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스, 덱스트란 등의 카보하이드레이트, 아스코르빅산, 글루타치온 등의 항산화제, 킬레이팅 물질, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제들을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 활성물질을 약 0.01 mg/kg/일 내지 1000 mg/kg/일의 용량으로 투여할 수 있다. 경구 투여하는 경우, 50 내지 500 mg/kg의 범위가 적합할 수 있으며, 1일 1회 이상 투여할 수 있다.

본 발명의 WKYMVm의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여함으로써, 짧아진 결장, 감소된 체중, 상승된 출혈지수 또는 상승된 배변지수를 회복시켜 염증성 장질환을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 WKYMVm 펩티드는 염증성 장질환의 증상인 결장단축, 체중감소, 출혈지수 상승 또는 배변지수 상승 등을 회복시킴으로써, 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 건강기능식품으로도 이용 가능하다.

도 1은 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 실험동물모델에서 WKYMVm의 치료효과를 나타낸 도이다. DSS 모델을 확립한 후, 0, 12, 24, 36, 48 및 60시간에 WKYMVm(8 mg/kg)을 피하로 6회 투여하였다. 매일 (A) 체중, (B) 배변지수 및 (C) 출혈지수를 측정하였다. 데이터는 평균±표준편차로 표현하였다(^* P<0.05; ^*** P<0.001 대조군과 비교, ^# P<0.05; DSS 단독군과 비교). 샘플크기는 군 당 각각 8마리를 사용하였다(A 내지 C).
도 2는 DSS-유도 궤양성 대장염 실험동물에서 WKYMVm의 보호효과를 나타낸 도이다. DSS 모델을 확립한 후, 0, 12, 24, 36, 48 및 60시간에 WKYMVm(8 mg/kg)을 피하로 6회 투여하였다. 7일째에 DSS를 처리한 마우스로부터 결장을 분리하였다. (A)는 DSS 마우스로부터 획득한 결장의 육안검사 결과를 나타낸 도이다. (B)는 DSS 마우스로부터 획득한 결장의 단면을 헤마토자일린 및 에오신(haematoxylin & eosin; H&E)으로 염색한 결과를 나타낸 도이다. 실험은 각 그룹당 8마리의 마우스에 대해 수행하였으며, 데이터는 이 중 대표적인 것을 도시하였다.
도 3은 대장염에서 장장벽(intestinal barrier)에 대한 WKYMVm의 보호효과를 나타낸 도이다. C57BL/6 마우스에 비히클, 3% DSS, 3% DSS 및 WKYMVm(8 mg/kg, 6회 피하주사하여 12시간 간격으로 투여)으로 5일 동안 처리하였고, 추가적인 2일 동안은 신선한 물로 처리하였다. (A)는 7일 후, 급식에 의해 FITC-덱스트란을 투여하고 4시간 후 혈청을 회수하여 혈청으로부터의 FITC-덱스트란의 양을 측정하여 나타낸 도이다. (B)는 농도에 따른 WKYMVm가 세포증식에 미치는 영향을 흡광도를 측정하여 나타낸 도이다. (C)는 CsH 및/또는 WRW4를 처리한 세포의 세포증식에 대한 WKYMVm의 영향을 나타낸 도이다. CsH(1 μM) 및/또는 WRW4(10 μM)을 포함 또는 불포함하는 Caco-2 세포의 배양액에 0, 10, 100 및 1000 nM 농도의 WKYMVm을 24시간 동안 첨가하여 Caco-2 세포를 자극하였다. 세포증식은 Cell Counting Kit-8을 이용하여 측정하였다. 데이터는 평균±표준편차로 표현하였다(군 당 n=7, ^*** P<0.001 대조군과 비교, ^# P<0.05; DSS 단독군과 비교 (A), ^* P<0.05 대조군과 비교, ^# P<0.05; WKYMVm 처리군과 비교).
도 4는 DSS-처리 마우스의 결장으로부터의 사이토카인 생산에 대한 WKYMVm의 효과를 나타낸 도이다. DSS 처리 후, 0, 12, 24, 36, 48 및 60시간에 WKYMVm 또는 PBS를 마우스에 제공하였다. 정상, DSS-처리 또는 DSS 및 WKYMVm-처리 마우스로부터 7일째에 장을 회수하여 1 cm 길이로 절단하였다. 각 절편을 RPMI 1640 배지에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액으로 분비된 사이토카인의 양을 ELISA를 이용하여 측정하였다: A, IL-17; B, INF-ν; C, IL-6; D, IL-1β; E, TNF-α; F, IL-12; G, IL-23; H, TGF-β. 데이터는 평균±표준편차로 표현하였다(군 당 n=7, ^* P<0.05; ^** P<0.01; ^*** P<0.001 DSS 자체와 비교).

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: WKYMVm 처리에 따른 DSS ( dextran sodium sulfate )-처리 궤양성 대장염( ulcerative colitis ) 증상 완화 효과

WKYMVm 처리가 염증성 장질환 개선에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 동물모델을 통해 체중, 배변지수 및 출혈지수를 측정하였다.

먼저, 궤양성 대장염 동물모델을 제조하기 위하여, 6주령의 C57BL/6 마우스를 오리엔트 바이오 사(성남, 한국)로부터 구입하였다. 도착 후 일주일 동안 적응시킨 후, 5일간 3% (w/v) 덱스트란 황산나트륨(dextran sodium sulfate; DSS, 분자량 약 40,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 식수를 마우스에 공급하고, 이후 8일째 실험이 끝날 때까지 3일 동안은 정상 식수를 공급하였다. DSS 처리 후 0, 12, 24, 36, 48 및 60 시간에 WKYMVm(Anygen, 광주, 한국) 펩티드를 포함하는 용액 또는 비히클(vehicle; PBS)을 DSS-처리 마우스에 피하주사하였다. 약물처리 과정을 모르는 기술자가 매일 궤양성 대장염의 증상을 나타내는 지표인 체중, 총 직장출혈(gross rectal bleeding) 및 변 내의 잠혈(occult blood)을 측정하였다.

그 결과, 먼저 체중감소에 관하여, DSS-처리 C57BL/6 마우스는 정상 마우스와 비교하여 시간에 따른 체중 감소를 나타내었으나, 상기 DSS-처리 마우스에 WKYMVm을 투여한 경우에는 체중 감소를 회복하는 것을 확인할 수 있었다(도 1A). 다음으로, 변 내의 잠혈에 의해 변이 묽어지는 정도를 확인할 수 있는 배변지수(stool score) 및 직장의 출혈에 의하여 항문에서 피가 나오는 정도인 출혈지수(bleeding score)를 측정한 결과, DSS-처리 마우스에서는 매우 높은 수치를 나타낸 반면, WKYMVm의 투여는 DSS-유도 배변지수 및 출혈지수 증가를 효과적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 1B 및 C).

이러한 결과를 통해 DSS-처리에 의해 유도된 염증성 장질환의 증상을 WKYMVm이 현저히 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 2: 육안 및 조직학적 관찰에 의한 WKYMVm 의 효과

WKYMVm 처리가 염증성 장질환 개선에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 동물모델의 장을 회수하여 육안으로 및 조직학적 염색을 통해 관찰하였다.

상기 실시예 1에 개시된 방법으로 마우스를 DSS로 처리하고, 이에 PBS 또는 8 mg/kg의 WKYMVm을 수용액의 형태로 제공하였다. DSS 처리 후 8일째에 장을 고정시킨 후 마우스를 안락사시키고 절개하여 형태학적 분석을 위해 헤마토자일린 및 에오신(haematoxylin and eosin; H&E)으로 염색하였다.

그 결과, 먼저 궤양성 대장염의 진행과 관련하여 공지된 증상인 결장 단축(colon shortening)에 관하여, 도 2A에 나타낸 바와 같이, DSS 처리는 현저한 결장 단축을 유도하였으며, 이는 WKYMVm의 투여에 의해 효과적으로 예방하는 것을 확인하였다. 다음으로, 염증으로 인한 점막층의 파괴정도를 H&E 염색으로 확인한 결과, DSS-처리 마우스에서는 심각한 점막층 구조 파괴가 유발되었으나, WKYMVm을 투여한 경우에는 현저히 저해된 것을 확인할 수 있었다(도 2B).

이러한 결과를 통해 WKYMVm 처리로 DSS-처리에 의해 유도되는 증상인 결장 단축 및 점막층의 파괴를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: 장투과성 및 장상피세포 증식에 대한 WKYMVm 의 효과

WKYMVm 처리가 염증성 장질환 개선에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 장 투과성 및 장상피세포의 증식 정도를 확인하였다.

우선, 장투과성을 확인하기 위하여, 마우스를 6시간 동안 금식시키고 FITC-덱스트란(10 mg/head; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 급식하였다. 급식 후 안구 뒤로부터 4시간 동안 혈청을 수거하였다. 수거된 혈청에 대하여 Gemini XPS 형광 마이크로플레이트 리더(Molecular devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 FITC-형광을 측정하였다. DSS에 의해 유도되는 궤양성 대장염의 발병기전에 있어서, 장상피장벽(intestinal epithelial barrier)의 파괴에 의해 야기되는 장투과성이 증가됨이 보고되었다.

이에 본 발명자들은 또한 DSS 처리가 마우스에서 장투과성의 증가를 유발함을 확인하였다. 한편, WKYMVm의 투여로 DSS 처리 마우스에서 증가된 장투과성을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 3A).

이러한 장투과성은 장상피세포의 증식 및 이동과 연관된다. 이에 본 발명자들은 WKYMVm이 장투과성을 억제함을 확인하여 WKYMVm이 장상피세포의 증식에 영향을 미칠 수 있음을 가정하고 이를 실험적으로 확인하였다.

구체적으로 Caco-2 인간 상피 결장 선암종(Caco-2 human epithelial colorectal adenocarcinoma) 세포를 20% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS; Life Technologies, Grand Island, NY)을 포함하는 DMEM으로 배양하였다. 건강한 배양세포를 4×10³ 세포/웰로 분주하였다. 24시간 후 CsH(1 μM) 및/또는 WRW4(10 μM)을 포함 또는 불포함하는 배양액에 0, 10, 100 및 1000 nM 농도의 WKYMVm 용액을 24시간 동안 첨가하였다. Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD)을 이용하여 세포증식을 정량하였다.

그 결과, WKYMVm으로 Caco-2 세포를 자극하는 것이 세포증식을 유도함을 확인하였다(도 3B). 나아가 WKYMVm-유도 Caco-2 세포 증식에 대한 FPR1 또는 FPR2의 역할을 확인하기 위하여, WKYMVm에 앞서 FPR1 길항제인 CsH 또는 FPR2 길항제인 WRW4로 세포를 선처리하였다. 길항제에 의한 FPR2의 억제는 WKYMVm-유도 세포 증식의 억제를 야기하였다. 더불어 Caco-2 세포의 이동에 대한 WKYMVm의 효과를 확인하였다. 상처를 낸 Caco-2 세포에 WKYMVm 첨가는 현저한 상처치유를 유도하였다.

이러한 결과를 통해 WKYMVm 처리는 장상피세포의 증식을 촉진하고 염증부위로의 이동을 유도함으로써 염증성 장질환의 증상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 결장에서의 사이토카인 생산에 대한 WKYMVm 의 효과

WKYMVm 처리가 염증성 장질환 개선에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 상기 동물모델 실험과 더불어 염증성 사이토카인의 분비량 변화를 측정하였다.

구체적으로 말초혈액에서 DSS-처리-유도 사이토카인 생산을 측정하기 위하여, DSS 모델에서 WKYMVm 처리 여부에 따른 사이토카인 프로파일을 측정하였다. DSS 처리 후 0, 12, 24, 36, 48 및 60시간에 마우스에게 WKYMVm을 제공하였다. DSS 처리 7일 후에 장을 회수하여 1 cm 길이로 절단하였다. 각 절편을 RPMI 1640 배지에 24시간 동안 인큐베이션하고 상등액으로 분비된 사이토카인을 ELISA(BD Biosciences Pharmingen)로 측정하였다.

그 결과, DSS 처리 마우스에서 IL-17, INF-γ, IL-6, IL-1β 및 TNF-α 분비가 현저히 증가되는 것을 확인하였다. WKYMVm의 투여는 DSS-처리 마우스의 장으로부터 이들 사이토카인의 생산을 보다 증가시켰다(도 4A 내지 E). 그러나, IL-12, IL-23 및 TGF-β 수준은 WKYMVm 투여에 의해 현저히 감소하였다(도 4F 내지 4H). WKYMVm을 투여한 DSS-처리 마우스의 장으로부터의 IL-22에 대해서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.

이러한 결과를 통해 WKYMVm 처리는 장에서 염증을 유발하는 사이토카인인 IL-23 및 TGF-β 분비를 감소시켜 염증성 장질환의 증상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> A pharmaceutical composition comprising a peptide WKYMVm for prevention and treatment of inflammatory bowel diseases <130> PA120753/KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W-peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> D-Met <400> 1 Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5

Claims (7)

1. 서열번호 1로 표시되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 염증성 장질환은 크론병(Chron's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 염증성 장질환은 결장의 단축(shortening of colon), 체중감소, 출혈지수 상승 또는 배변지수 상승의 증상을 갖는 것이 특징인 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 예방 또는 치료는 결장에서 분비되는 염증성 사이토카인 IL-23 또는 TGF-β의 증가를 감소시킴으로써 수행되는 것인 약학적 조성물.
   
5. 서열번호 1로 표시되는 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
6. 제1항의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 장질환을 치료하는 방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 조성물을 투여함으로써 짧아진 결장, 감소된 체중, 상승된 출혈지수 또는 상승된 배변지수를 회복시키는 것이 특징인 방법.
   

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