KR101317264B1 - 톨 유사 수용체 3 길항제, 방법 및 용도 - Google Patents

톨 유사 수용체 3 길항제, 방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101317264B1
KR101317264B1 KR1020077014790A KR20077014790A KR101317264B1 KR 101317264 B1 KR101317264 B1 KR 101317264B1 KR 1020077014790 A KR1020077014790 A KR 1020077014790A KR 20077014790 A KR20077014790 A KR 20077014790A KR 101317264 B1 KR101317264 B1 KR 101317264B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ser
thr
delete delete
tlr3
Prior art date
Application number
KR1020077014790A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070090969A (ko
Inventor
질 카르톤
마크 쿠닝함
아누크 다스
카렌 더피
데이비드 엠. 나이트
로베르타 람브
모우하마도우 엘. 엠보우
고팔란 라그후나탄
마테오 라니 산
로버트 티. 사리스키
니콜 스토웰
레이몬드 스위트
샨롱 자오
쉬즈홍 첸
질 자일즈-코마르
크리스텐 피카
베드라나 스토자노빅-수수릭
테레사 제이. 고레트즈
Original Assignee
얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 얀센 바이오테크 인코포레이티드 filed Critical 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Publication of KR20070090969A publication Critical patent/KR20070090969A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101317264B1 publication Critical patent/KR101317264B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

톨 유사 수용체 3(TLR3) 길항제, TLR3 길항제 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 제조 방법 및 상기한 것의 용도가 개시된다.

Description

톨 유사 수용체 3 길항제, 방법 및 용도{TOLL LIKE RECEPTOR 3 ANTAGONISTS, METHODS AND USES}
본 발명은 톨 유사 수용체 3(TLR3) 길항제, TLR3 길항제 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 제조 방법과 상기한 것의 용도에 관한 것이다.
염증성 상태와 관련된 병리는 건강 관리에 유의적인 공격을 나타내며, 고통스럽고, 쇠약하게 되고, 죽음에 이를 수 있다. 예를 들어, 패혈증 및 패혈증-관련 증상은 연간 215,000명을 사망에 이르게 하는 사망률 28-50%로, 미국에서 연간 750,000 초과된 사람들에게 영향을 미치고 있다(Natanson et al., Crit. Care Med. 26:1927- 1931 (1998); Angus et al., Crit. Care Med. 29:1303-1310 (2001)). 염증성장질환(IBD), 크론 질환 및 궤양 대장염과 같은 다른 염증성 상태는 미국에서 일년에 백만을 넘는 사람들에게 영향을 주고 있다(Hanauer et al. , Rev. Gastroenterol. Disord. 3:81-92 (2003)).
만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식 및 폐 감염과 같은 폐 기능에 영향을 주는 염증성 폐질환 또한, 미국에서 유의적인 수의 사람들에게 영향을 준다. 예를 들어, COPD는 추측하여 천만명의 성인 미국인에 영향을 주며, 그 출현이 증가하고 있다(Mapel et al., Manag. Care Interface 17:61-66 (2004)). 이러한 염증 증상에 관련된 병리 및 이러한 상태의 악화는 유의적으로 건강과 경제 영향을 갖는다.
천식 및 COPD와 같은 폐 질환에서의 악화는 증상의 악화 및 폐 기능 감소에 의하여 특성화된다. 바이러스 감염은 많은 폐 질환의 악화와 관련되며(Johnston, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: S46-52 (1995) ; Bandi et al, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 37: 69-75 (2003)), 악화의 주요한 원인이라고 믿어진다. 바이러스 감염 다음, 폐에서의 전-염증성 사이토카인 분비는 많은 폐 질환에서 염증성 반응을 자극하는 데 중요한 단계를 나타낸다(Gern et al. , Am. J. Respir. Cell. MoI. Biol. 28:731-737 (2003); Panina-Bordignon et al., Curr. Opin. PuIm. Med. 9:104-110 (2003)).
인슐린 저항성은 당 거부증, 인슐린 저항성, 비만, 과중성 지방혈증, 낮은 HDL 콜레스테롤, 고혈압 및 가속 죽상동맥경화증을 포함하는 대사 증후군의 중요한 부분으로 인지되었다(Wisse, J. Am. Soc. Nephrol. 15:2792-800 (2004)). 비만, 2형 당뇨병 및 인슐린 저항성 사이의 경향이 잘 확립된 한편, 비만-관련 인슐린 저항성 및 2형 당뇨병을 조절하는 분자 및 세포적 기작은 아직 명료하지 못한 채 남아있다.
비만 개체가 TNF-α, IL-1b 및 IL-6와 같은 전-염증성 사이토카인의 증가된 레벨을 갖는다는 사실은 비만-유도된 인슐린 저항성이 염증 증상이라는 가설을 제시하도록 한다(Karin et al., Nat. Rev. Drug Discov. 3:17-26 (2004)). 이에 따라, 염증, 비만, 인슐린 저항성 및 이상 지질 대사는 대사 증후군의 공통된 부분을 구성할 것이다. 사실상, 사이클로옥시지나제 저해제와 같은 비-스테로이드 약물은 NF-kβ 및 IKKβ와 같은 핵심적인 염증성 전사 요소를 방해할 수 있으며, 2형 당뇨병 동물 모델 및 인간 환자에서 인슐린 감수성을 증가시킬 수 있다(Karin et al., supra). 더욱이, 간 발달 전신 인슐린 저항성(Arkan et al., Nat. Med. 21:191-198 (2005); Cai et al., Nat. Med. 11:183-90 (2005))에서 IKKb가 과발현되는 마우스 뿐만 아니라, 인슐린 저항성에 대하여 보호되고, 와전된 인슐린 감수성을 나타내는 골수 세포에서 IKKb 조건 낙아웃 마우스의 능력에 의하여 나타낸 바와 같이, 최근의 데이터는 인슐린 저항성 및 염증 사이의 연결의 지지를 제공한다. 이러한 결과는 다 같이 비만, 인슐린 저항성 및 2형 당뇨병을 염증성 질환에 연결하기 위한 강한 이론적 근거를 제공한다.
숙주 면역계에 의한 미생물의 항원의 인식은 그 활성이 염증성- 반응의 개시에서 중요한 단계를 나타내는 선천 면역 수용체에 의하여 매개된다. 톨-유사 수용체(TLR)는 외부 항원에 대한 면역 반응을 매개하는 데 중요한 역할을 수행하는 선천 면역 수용체과를 나타낸다. 예를 들어, TLR3은 합성 ds RNA 유사체 폴리-리보이노시닉- 리보시티딜릭 산(폴리(I:C))(Alexopoulou et al. , Nature 413: 732-238 (2001)) 뿐만 아니라, 이중-나선 (ds) RNA를 인지하는 포유 동물 유형 인지 수용체이다. 더욱이, TLR3는 염증 부위에서 괴사 세포사를 제시하는 괴사 세포(Kariko et al., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004))로부터 방출되는 mRNA 같은 내부의 리간드를 인지하는 것으로 보여지며, 이는 TLR3 활성화의 원인이 될 것이다.
폴리 (I:C) 또는 내부 mRNA 리간드에 의한 TLR3의 활성화는 전-염증성 사이토카인 및 케모카인의 분비를 유도하며, 이러한 발견은 TLR3 작용제가 감염-관련 염증에서 질환 결과를 조절하는 것을 제안한다. 이에 따라, 생체 내에서 TLR3 라이게이션은 바이러스 감염 또는 염증 관련 괴사(Kariko et al., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004))의 범위에서 발생한다고 판단된다(Tabeta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:3516- 3521 (2004)). 전체적으로 이러한 데이터는 TLR3의 라이게이션이 전사 활성화 사건과 인산화의 연쇄반응을 개시하고, 그 결과로 선천 면역에 기여한다고 판단되는 수많은 염증성 사이토카인을 생산시킨다는 것을 보여준다(reviewed by Takeda and Akira, J". Derm. Sci. 34:73-82 (2004)). 더욱이, 이러한 데이터는 지속된 TLR3 활성화가 감염-관련 염증성 질환의 조절에서 결정적 성분일 수 있다는 것을 제시한다. 개시된 데이터는 류마티스성 관절염 (Miossec et al., Curr. Opin. Rheumatol. 26:218-222 (2004)에 의한 리뷰) 및 염증성 장 질환 (reviewed by- Ogata and Hibi, Curr. Pharm. Des. 9: 1107-1113 (2003))과 같은 면역-매개의 만성 증상 및 감염-관련 급성 사이토카인 급발(Van Amersfoort et al., Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414 (2003)에 의한 리뷰) 및 전신 염증성 반응 증후군에 전-염증 사이토카인 과-생산의 관련을 발견함에 의하여 나타낸 바와 같은, 이러한 가설의 지지를 제공한다.
비록 실험상 연구에서 폴리(I:C)로 폐 상피 세포를 자극시키면, TLR의 발현이 증가되고(Ieki et al., Clin. Exp. Allergy 34: 745-52 (2004); Sha et al. , Am. J. Respir. Cell. MoI. Biol. 31: 358-64 (2004)), 전사 요소의 유도와 많은 사이토카인, 케모카인의 분비를 도출하는 것을 나타내며, 그러한 사건의 생리적 관련성은 명확하지 않은 채로 남아있다.
감염에 관련된 것과 같은 이러한 염증 상태 등과 관련된 병리는 유의적인 건강 및 경제 영향을 갖는다. 약제의 많은 분야에서의 진보에도 불구하고, 많은 이러한 상태에 유용한 치료법 및 치료 선택이 비교적으로 거의 없다.
예를 들어, 폐 질환 악화는 높은 투약량의 코르티코스테로이드 및 omalizumab의 XOLAIR® 브랜드와 같은 항-IgE로 치료된다. β2 작용제와 조합물로 흡입되는 코르티코스테로이드는 악화의 발생수를 줄이는 데 효율적인 것으로 보여진다. 그러나 이러한 치료법은 악화로 발전할 위험을 감소시킬 뿐이며, 유의적 부작용과 관련되기 때문에, 폐 질환 악화의 예방 및 치료를 위하여 대신하는 치료 종류가 필요하다.
이에 따라, 염증성 증상에서 TLR3의 역할을 이해하고, 그러한 증상을 효과적으로 치료하는 길항제와 같은 약제를 개발하기 위하여 이러한 기능을 활용할 필요가 있다.
도 1은 항-인간 TLR3(hTLR3) 단일클론성 항체 길항제로부터의 중쇄 가변 영역 서열을 보여준다(CDR에 밑줄그었다).
도 2는 항-hTLR3 단일클론성 항체 길항제로부터의 경쇄 가변 영역 서열을 보여준다(CDR에 밑줄그었다).
도 3은 인간 폐 상피 유래 세포에서 폴리(I:C) 유도된 IL-6 사이토카인 생산의 TLR3 길항제에 의한 저해를 보여준다.
도 4는 인간 폐 상피 유래 세포에서 폴리(I:C) 유도된 IL-8 사이토카인 생산 의 TLR3 길항제에 의한 저해를 보여준다.
도 5는 인간 폐 상피 유래 세포에서 폴리(I:C) 유도된 RANTES 사이토카인 생산의 TLR3 길항제에 의한 저해를 보여준다.
도 6은 인간 폐 상피 유래 세포에서 폴리(I:C) 유도된 MIP1-알파 사이토카인 생산의 TLR3 길항제에 의한 저해를 보여준다.
도 7은 원발성 인간 기관지-상피 세포에서 폴리(I:C) 유도된 IL-6 사이토카인 생산의 TLR3 길항제에 의한 저해를 보여준다.
도 8은 IBD-관련 무게 감소에서, TLR3 활성을 낙아웃시킨 효과를 보여준다.
도 9는 TLR3 길항제에 의한 IBD-관련 무게 감소의 저해를 보여준다.
도 10은 뮤린(murine) 패혈증 모델에서 TLR3 길항제로 치료를 통한, 증가된 생존을 보여준다.
도 11은 뮤린 패혈증 모델에서 TLR3 길항제에 의한 IL-6 사이토카인 생산의 감소를 보여준다.
도 12는 뮤린 패혈증 모델에서 TLR3 길항제에 의한 TNF-알파 사이토카인 생산의 감소를 보여준다.
도 13은 뮤린 폐 조직의 염증성 세포 전체수에서, 폴리(I:C) 유도된 증가를 보여준다.
도 14는 뮤린 폐 조직의 호중구에서, 폴리(I:C) 유도된 증가를 보여준다.
도 15는 뮤린 폐 조직의 단핵 염증성 세포에서, 폴리(I:C) 유도된 증가를 보여준다.
도 16은 메타콜린 투여 마우스에서 폐 기능을 더욱 약화시키는 폴리(I:C)의 단일 투여와 함께 TLR3의 활성화를 보여준다.
도 17은 메타콜린 투여 마우스에서 폐 기능을 더욱 약화시키는 폴리(I:C)의 다중 투여와 함께 TLR3의 활성화를 보여준다.
도 18은 TLR3 낙아웃 마우스가 메타콜린을 투여하는 동안 단일 폴리(I:C) 투여 유도된 폐 기능 약화로부터 보호되는 것을 보여준다.
도 19는 TLR3 낙아웃 마우스가 메타콜린을 투여하는 동안 다중 폴리(I:C) 투여로 유도된 폐 기능 약화로부터 보호되는 것을 보여준다.
도 20은 인간 폐 기관지 상피 세포에서, 사이토카인 및 케모카인 생산에 TLR3 길항제의 효과를 보여준다.
도 21은 TLR3 길항제로 예방 및 치료를 통하여, 치사 폐렴 뮤린 모델에서 증가된 생존을 보여준다.
도 22는 인플루엔자 바이러스 A/PR/8 및 Streptococcus pneumoniae의 준치사 투여로 감염 후, 뮤린 모델에서, 치사 폐렴의 발달을 보여준다.
도 23은 인플루엔자 바이러스 A/PR/8 및 Streptococcus pneumoniae 감염된 마우스의 폐에서 박테리아 부하를 보여준다.
도 24A, B, C 및 D는 ELISA 분석에서 hTLR3에 인간-순응된 항-TLR3 mAbs의 결합을 보여준다.
도 25는 세포-기초의 사이토카인 방출 분석에서 인간-순응된 항-TLR3 mAbs의 평가를 보여준다.
도 26은 IP-10 판독과 함께 세포-기초의 생물활성 분석에서 HBV8(HBV4 배제)을 통한, 변형체 mAbs HBV1의 측정을 보여준다.
도 27은 RANTES 판독과 함께 세포-기초의 생물활성 분석에서 HBV8(HBV4 배제)을 통한, 변형체 mAbs HBV1의 측정을 보여준다.
도 28은 IL-8 판독과 함께 세포-기초의 생물활성 분석에서 HBV8(HBV4 배제)을 통한, 변형체 mAbs HBV1의 측정을 보여준다.
도 29는 MCP-1 판독과 함께 세포-기초의 생물활성 분석에서 HBV8(HBV4 배제)을 통한, 변형체 mAbs HBV1의 측정을 보여준다.
도 30은 IL-6 판독과 함께 세포-기초의 생물활성 분석에서 HBV8(HBV4 배제)을 통한, 변형체 mAbs HBV1의 측정을 보여준다.
도 31A 및 B는 고-지방 식이에 있는 TLR3 낙아웃 마우스가 고-지방 식이와 관련된, 약화된 글루코오스 내성의 발달로부터 보호되는 것을 보여준다.
도 32는 고-지방 식이 26주 후, TLR3 낙아웃 마우스가 정상적 공복 혈당 수치를 갖는 것을 보여준다.
도 33A, B 및 C는 고-지방 식이 26주 후, TLR3 낙아웃 마우스에 글루코오스 투여 전 및 후에, 공복에서 인슐린 수치의 증가를 보여준다.
도 34A, B, C, D 및 E는 고-지방 식이에 있는 야생형 마우스와 비교하여, 30주 동안 고-지방 식이를 급식한 TLR3 낙아웃 마우스의 개선된 지질 특성을 보여준다.
도 35는 만성 DSS 대장염을 유도하는 동안, TLR3 길항제로 예방(Pr) 및 치료 적(T) 처치를 위한 실험적 프로토콜을 보여준다.
도 36은 DSS 섭취의 각 사이클과 함께 발생하는 무게 감소에서 TLR3 길항제에 의한 보호를 보여준다.
도 37은 체중 감소 및 두번째 DSS 사이클 후, TLR3 길항제로의 회복을 보여준다.
도 38은 체중 감소 및 세번째 DSS 사이클 후, TLR3 길항제로의 회복을 보여준다.
도 39는 만성 DSS 대장염과 관련된 순 체중 감소에서, TLR3 길항제 처리의 효과를 보여준다.
도 40은 만성 DSS 대장염과 관련된 결장 수축에서, TLR3 길항제 처리의 효과를 보여준다.
도 41A, B 및 C는 중증의 만성 DSS 대장염에서 TLR3 길항제 처리의 효과를 보여준다. 도 41D, E 및 F는 만성 DSS 대장염에서 hTLR3 길항제 처리의 조직병리학적 효과를 보여준다.
도 42는 만성 DSS 대장염에서 T-세포 활성화를 보여준다.
도 43은 비장에서 DSS-관련된 CD11b+ 세포의 증가에, TLR3 길항제의 예방적 처리 효과를 보여준다.
도 44는 만성 DSS 대장염에서 IL-4 및 IL-10의 전신 수치에서 TLR3 길항제 처리 효과를 보여준다.
[발명의 요약]
본 발명의 일면은 RANTES의 세포적 생산을 저해하는 톨 유사 수용체 3(TLR3)의 길항제이다.
본 발명의 다른 면은 서열 번호 9, 11 및 13에 나타낸 바와 같은 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열, 및 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론성 항체의 항원 결합 능력을 갖는, TLR3와 반응하는 분리된 항체이다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 9, 11 및 13에 나타낸 바와 같은 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열, 및 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 포함하는, TLR3와 반응하는 분리된 항체이다.
본 발명의 또다른 면은 화학식 (I)에 나타낸 바와 같은 VH CDR1 아미노산 서열; 화학식 (Ⅱ)에 나타낸 바와 같은 VH CDR2 아미노산 서열; 화학식 (Ⅲ)에 나타낸 바와 같은 VH CDR3 아미노산 서열; 및 서열 번호 19, 21, 23에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 갖는 분리된 항체이다.
[화학식 I]
Thr Thr Tyr Trp Xaa1 His
[화학식 Ⅱ]
Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa2 Xaa3 Glu Lys Xaa4 Lys Thr
[화학식 Ⅲ]
Val Gly Val Xaa5 Ile Thr Thr Phe Pro Tyr
상기 화학식에서,
Xaa1은 Ile 또는 Met(서열 번호 61)이고,
Xaa2는 Tyr 또는 Gly이며,
Xaa3는 Asn 또는 Ala이고,
Xaa4는 Phe 또는 Gly(서열 번호 62)이며,
Xaa5는 Met 또는 Ile(서열 번호 63)이다.
본 발명의 다른 일면은 서열 번호 9, 11 및 13에 나타낸 CDR 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 일면은 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 CDR 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 일면은 서열 번호 6, 25, 27, 29, 31, 45, 47, 49, 51 또는 53에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또다른 일면은 서열 번호 16, 33, 35, 37 또는 39에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또다른 일면은 염증성 증상을 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 이를 필요로 하는 환자에게 TLR3 길항제를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여, 염증성 상태를 치료하거나 예방하는 방법이다.
본 발명의 다른 일면은 세포의 증식률을 증가시키기 충분한 시간 동안 TLR3 수용체를 발현하는 세포와 TLR3 길항제를 접촉시키는 것을 포함하여, 세포의 증식률을 증가시키는 방법이다.
본 명세서에서 인용한, 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 한정되지 않는 모든 공보 문헌은 본 발명에서 완전 개시된 참고문헌에 속한다.
본 발명에서 이용된 바와 같이, 용어 "길항제"는 임의의 기작에 의하여, 수용체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 전체적으로 저해시키는 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용된 바와 같이, "TLR3 길항체" 또는 "TLR3에 반응성있는" 화합물은 직접적으로 또는 간접적으로 TLR3 생물학적 활성 또는 TLR3 수용체 활성화를 실질적으로 방해, 감소 또는 저해시킬 수 있는 분자를 말한다. 이러한 길항제는 예를 들면, 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 융합 단백질, 항체, 항체 단편, 모방체 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 넓은 의미에 있는 것을 의미하며, 면역글로블린 또는 다중클론 항체, 뮤린, 인간, 인간-순응된, 인간화된, 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 항체 분자 및 항체 단편을 포함한다.
일반적으로, 항체는 특이 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 완전한 항체는 두개의 동일한 경쇄 및 두개의 동일한 중쇄로 구성된 이형사량체 당단백질이다. 이황화 결합의 수는 다른 면역글로블린 동형사이에 다양하나, 전형적으로 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의하여 중쇄에 연결된다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 배치된 사슬내 이황화 가교를 갖는다. 각 중쇄는 일단에서 가변 부위(VH) 다음에, 많은 불변 부위를 갖는다. 각 경쇄는 일단에(VL) 가변 부위와, 그 타단에 불변 부위를 갖는다; 경쇄의 불변 부위는 중쇄의 첫번째 불변 부위와 함께 배열되고, 경쇄 가변 부위는 중쇄의 가변 부위와 함께 배열된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그들의 불변 부위의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는, 두개의 완전하게 다른 타입 중 하나에 지정될 수 있다.
면역글로블린은 중쇄 불변 부위 아미노산 서열에 근거하여, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM라고 불리는 다섯개의 주요한 분류에 지정될 수 있다. IgA 및 IgG는 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 동형으로써, 하류-분류된다.
용어 "항체 단편"은 일반적으로 항원에 결합하거나, 완전한 항체의 가변 영역인, 완전한 항체의 부분을 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디(diabodies), 단일 사슬 항체 분자 및 적어도 두개의 완전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바, 용어 "항원"은 직접적으로 또는 간접적으로(대신하여 면역원이라 명명) 항체를 생산할 능력을 갖는 임의의 분자를 의미한다. "항원"에 대한 정의 내에서, 단백질-암호화 핵산을 포함한다.
"CDRs"는 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 과가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로써 정의된다. 예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)를 참조한다. 면역 글로블린의 가변 부위에는 세개의 중쇄 및 세개의 경쇄 CDR 또는 CDR 영역이 있다. 이에 따라, 본 발명에서 이용된 바, 적절하다면, "CDRs"는 모든 세개의 중쇄 CDRs 또는 모든 세개의 경쇄 CDRs 또는 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR을 언급한다.
CDRs는 항원 또는 에피토프에 항체의 결합을 위한 접촉 잔기의 대부분을 제공한다. 본 발명에서 관심있는 CDRs는 공여 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래되며, 자연적으로 발생한 CDRs의 유사체를 포함하고, 이 유사체는 또한, 그들이 유래된 공여 항체와 같은 항원 결합 특이성 및/또는 중화 능력을 공유하거나 보유한다.
본 발명에서 이용된 바, 용어 "상피 세포"는 동물의 자유로운 표면(예를 들면, 피부)의 부분을 덮거나, 튜브 또는 공간(예를 들면, 결장)에 정렬된 막의 세포적 조직으로부터 기원한다. 그러한 세포는 분리되거나, 조직, 기관 또는 이들의 실험상 모델에서 발견되는 것과 같은 세포의 더욱 고도로 조직된 군의 부분을 포함할 수 있다.
용어 "상동성"은 참조 서열에 대하여 40%와 100% 사이의 서열 동일성을 갖는 단백질 서열을 의미한다. hTLR3의 상동성은 알려진 hTLR3 서열에 대하여 40%와 100% 사이의 서열 동일성을 갖는 다른 종으로부터의 폴리펩티드를 포함한다. 두 펩티드 사슬 사이의 동일성 퍼센트는 AlignX module of Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA)의 디폴트 세팅을 이용한 쌍 정렬에 의하여 결정될 수 있다. "TLR3"는 hTLR3 및 그 상동성을 의미한다. 전장 인간 TLR3 아미노산 서열 및 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 및 2에 각각 나타냈다.
본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "조합하여"는 단일 약제로써 동시에, 또는 단일 약제로써 임의의 순서의 순서대로, 혼합물로써 동물에 함께 투여될 수 있는 기술된 약제를 의미한다.
본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "염증 증상"은 대부분 예를 들어, 고통, 발적, 부기 및 조직 기능의 손실로 특징화되는 사이토카인, 케모카인 또는 염증성 세포(예를 들면, 중성구, 단핵구 및 림프구)의 활성에 의하여 부분적으로 매개되는 세포적 손상에 대한 국부적인 반응을 의미한다. 본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "염증성 폐 증상"은 폐와 관련되거나, 영향을 미치는 염증성 증상을 의미한다.
본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "모방체"는 일반식 (I)을 갖는 단백질을 의미한다.
[일반식 (I)]
(V1-Pep-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t)
상기 식에서 V1은 면역글로블린 가변 영역의 N-말단의 부분,
Pep는 세포 표면 TLR3에 결합하는 폴리펩티드,
Lk는 폴리펩티드 또는 화학적 링크,
V2는 면역글로블린 가변 영역의 C-말단의 부분,
Hg는 면역글로블린 힌지(hinge) 영역의 부분,
CH2는 면역글로블린 중쇄 CH2 불변 영역,
CH3는 면역글로블린 중쇄 CH3 불변 영역,
t는 1 내지 10의 독립적인 정수이다.
모방체는 컨스트럭트에서 나타나는 중쇄 불변 부위 아미노산 서열에 의존하여, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 및 IgE와 같은 면역글로블린 분자의 다른 타입의 특성 및 기능을 모방할 수 있다. 몇몇 모방체 구체예에서, V1은 부재일 수 있다. 본 발명의 모방체 길항제는 세포 표면 TLR3에 결합하여, TLR3 생물학적 활성에 영향을 미친다.
모방체는 컨스트럭트에서 나타나는 중쇄 불변 부위 아미노산 서열에 의존하여, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 및 IgE와 같은 면역글로블린 분자의 다른 타입의 특성 및 기능을 모방할 수 있다. 몇몇 모방체 구체예에서, V1은 부재일 수 있다. 본 발명의 모방체 길항제는 세포 표면 TLR3에 결합하여, TLR3 생물학적 활성에 영향을 미친다.
본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "단일클론성 항체"(mAb)는 실질적으로 동족인 항체 집단으로부터 얻은 항체(또는 항체 단편)를 의미한다. 단일클론성 항체는 전형적으로 지정된 단일 항원성 결정자에 대하여 고도로 특이적이다. "단일클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 뮤린 mAbs는 Kohler et al., Nature 256:495-491 (1975)의 하이브리도마 방법에 의하여 제조될 수 있다. 수용체 항체(전형적으로, 인간과 같은 다른 포유동물 종)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 관련하여, 공여 항체(전형적으로, 뮤린)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 키메라 mAbs는 미국 특허 4,816,567에 개시된 방법에 의하여 준비될 수 있다. 하나 이상의 인간 면역글로블린으로부터 유래된 면역글로블린-유래 부분의 분자가 남아 있고, 비-인간 공여 면역글로블린(전형적으로 뮤린)으로부터 유래된 CDR을 갖는 인간-순응된 mAbs은 미국 특허 5,225,539에 개시된 것과 같이, 본 분야의 숙련자에게 잘 알려진 기술에 의하여 준비될 수 있다. 부가적으로, 인간-순응된 mAbs는 Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sex. (USA), 85:10029-10032 (1989) and Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)에 개시된 것과 같은 기술에 의하여, 결합 친화도를 유지하기 위하여, 바뀐 골격 지지 잔기를 병합하여, 더욱 변형시킬 수 있다.
인간 순응을 위한 대표적인 인간 프레임워크(framework) 서열은 예를 들어,
Figure 112007047290913-pct00001
에 개시되며, 각각은 본 발명에서 참조에 의하여 전체적으로 삽입된다.
전체적으로 임의의 비-인간 서열이 결여된 인간 mAbs는 예를 들어, Lonberg et al. , Nature 368:856-859 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996) 및 Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)에 참조된 기술에 의하여 인간 면역글로블린 트랜스제닉 마우스로부터 준비될 수 있다. 인간 mAbs는 또한, 예를 들어, Knappik et al., J. MoI. Biol. 296:57-86 (2000) and Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84 (2001)에서 참조된 기술에 의하여 라이브러리를 나타내는 파지로부터 준비되거나, 활용될 수 있다.
본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "증식률"은 단위 시간당 세포 수의 변화 또는 단위 시간당 세포 분화를 향하여 세포 주기를 통한 진행의 표지자를 보유하는 세포 수의 변화를 언급한다. 이러한 마커는 DNA 복제 또는 발현된 유전자 산물의 형상적 지시자일 수 있다.
본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "TLR3 생물학적 활성" 또는 "TLR3 수용체 활성화"는 세포 표면 TLR3에 리간드 결합의 결과로써 발생하는 임의의 활성을 언급한다.
다음과 같은 일반적 하나 및 세-문자 아미노산 코드가 본 발명에서 이용된다:
아미노산 세-문자 코드 한-문자 코드
알라닌 ala A
아르기닌 arg R
아스파라긴 asn N
아스파르트산 asp D
시스테인 cys C
글루탐산 glu E
글루타민 gln Q
글리신 gly G
히스티딘 his H
이소루신 ile I
루신 leu L
라이신 lys K
메티오닌 met M
페닐알라닌 phe F
프롤린 pro P
세린 ser S
트레오닌 thr T
트립토판 trp W
티로신 tyr Y
발린 val V
물질의 조성물
본 발명은 TLR3 수용체-매개의 신호를 저해할 수 있는 길항제 및 그러한 길항제의 용도에 관한 것이다. 상기의 TLR3 길항제는 TLR3 수용체에 결합하고, TLR3 수용체-매개의 신호를 저해시키는 특성을 가질 수 있다. 그러한 길항제에 의하여 저해될 수 있는 TLR3 신호에 의한 바람직한 기작은 키나아제 활성, 전사 감소 또는 수용체 길항 작용의 저해를 포함한다. 다른 기작에 의하여 TLR3 수용체-매개의 신호를 저해할 수 있는 다른 길항제 또한, 본 발명의 다양한 면들과 구체예들의 범위 내에 있는 것이다. 이러한 길항제는 연구 시약, 진단 시약 및 치료 약제로써 유용하다.
본 발명의 일면은 RANTES(Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted) 사이토카인의 세포적 생산을 저해하는 톨 양성 수용체 3(TLR3)의 길항제이다. 본 발명의 다른 면은 RANTES의 세포적 생산을 저해하는 TLR3의 길항제이며, 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8) 및 대식세포 염증성 단백질-1 알파(MIP-1 알파)로 이루어진 군에서 선택된 사이토카인이다.
또다른 면에서, 본 발명은 서열 번호 9(VH CDRl), 11(VH CDR2) 및 13(VH CDR3)에 나타낸 바와 같은 중쇄 상보성 결정 영역(CDRs)의 아미노산 서열 및 서열 번호 19(VL CDR1), 21(VL CDR2) 및 23(VL CDR3)에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDRs의 아미노산 서열을 갖는 단일클론성 항체의 항원 결합 능력을 갖는 TLR3와 반응하는 분리된 항체를 제공한다. 바람직한 항원은 서열 번호 9, 11 및 13에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR 아미노산 서열과 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 단일 클론성 항체이다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH와 서열 번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 TLR3와 반응하는 분리된 항체이다.
본 발명의 또다른 면은 임의의 항체 또는 본 발명의 다른 단백질 TLR3 길항제 또는 그것의 보체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 특정 바람직한 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 개시되었으나, 주어진 발현 계에서 유전적 코드 또는 코돈 참조의 변성이 주어지는, 항체 또는 본 발명의 다른 단백질 TLR3 길항제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 있는 것이다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 9, 11 및 13에 나타낸 CDR 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄이다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 CDR 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5에 나타냈다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 15에 나타냈다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 25, 27, 29 또는 31에 나타낸 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 33, 35, 37 또는 39에 나타낸 VH 아미노산 서열을 포함하는 인간-순응된 mAb이다. 서열 번호 25, 27, 29 및 31에 나타낸 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 33, 35, 37 및 39에 나타낸 VL 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 일면이다. 이러한 인간-순응된 mAbs는 서열 번호 9, 11 및 13에 나타낸 VH CDR 아미노산 서열 및 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 VL CDR 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호 25, 27, 29 및 31의 VH 아미노산 서열을 암호화하는 바람직한 핵산 서열은 서열 번호 26, 28, 30 및 32에 각각 나타냈다. 서열 번호 33, 35, 37 및 39의 VL 아미노산 서열을 암호화하는 바람직한 핵산 서열은 서열 번호 34, 36, 38 및 40에 각각 나타냈다. 본 발명의 인간-순응된 단일클론성 항체의 특정 일구체예는 서열 번호 25에 나타낸 바와 같은 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 33에 나타낸 VL 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예는 화학식 (I)에 나타낸 바와 같은 VH CDR1 아미노산 서열; 화학식 (Ⅱ)에 나타낸 바와 같은 VH CDR2 아미노산 서열; 화학식 Ⅲ에 나타낸 바와 같은 VH CDR3 아미노산 서열; 및 서열 번호 19, 21, 23에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 갖는 분리된 항체이다.
[화학식 I]
Thr Thr Tyr Trp Xaa1 His
[화학식 Ⅱ]
Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa2 Xaa3 Glu Lys Xaa4 Lys Thr
[화학식 Ⅲ]
Val Gly Val Xaa5 Ile Thr Thr Phe Pro Tyr
상기 화학식에서, Xaa1은 Ile 또는 Met(서열 번호 61),
Xaa2는 Tyr 또는 Gly,
Xaa3는 Asn 또는 Ala,
Xaa4는 Phe 또는 Gly(서열 번호 62), 및
Xaa5는 Met 또는 Ile(서열 번호 63)이다.
바람직한 종은 Xaa1이 Met인 화학식 (I)의 VL-CDR1과 서열 번호 11 및 13 각각(서열 번호 45, 서열 번호 46에 나타난 바람직한 핵산)에서 나타낸 바와 같은 VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 33에 나타낸 바와 같은 VL 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 종에서, Xaa1은 Met, Xaa2는 Tyr, Xaa3는 Asn, Xaa4는 Phe, 및 Xaa5는 Met이다.
다른 바람직한 종은 화학식 Ⅱ의 VH-CDR2 및 서열 번호 9 및 13에 각각 나타낸 바와 같은 VH-CDR1 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 아미노산 서열 및 서열 번호 33에 나타낸 바와 같은 VL 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며: 상기 식에서 Xaa2는 Gly, Xaa3는 Asn 및 Xaa4는 Phe(서열 번호 47, 서열 번호 48에 나타낸 바람직한 핵산 서열); Xaa2는 Tyr, Xaa3는 Ala 및 Xaa4는 Phe (서열 번호 49, 서열 번호 50에 나타낸 바람직한 핵산 서열) ; 및 Xaa2는 Tyr, Xaa3는 Asn 그리고 Xaa4는Gly (서열 번호 51, 서열 번호 52에 나타낸 바람직한 핵산 서열).
다른 바람직한 종은 서열 번호 33에 나타낸 바와 같은 VL 아미노산 서열 및 서열 번호 9 및 11에 나타낸 바와 같은 VH-CDR1 및 VH-CDR2 아미노산 서열과 Xaa5가 Ile인 화학식 (Ⅲ)의 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 아미노산 서열을 갖는 항체를 함유한다.
요컨대, 바람직한 종은 다음 VL 및 VH 아미노산 서열 조합 중 하나를 갖는 항체를 함유한다.
VL 서열 번호 VH 서열 번호
33 45
33 47
33 49
33 51
33 53
본 발명은 VH가 서열 번호 45, 47, 49, 51 또는 53에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, VL이 33, 35, 37 또는 39에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 분리된 항체를 함유한다.
바람직한 항원 길항제는 IgG, IgD, IgGA 또는 IgM 동형의 항체일 수 있다. 덧붙여, 그러한 길항제 항체는 당화, 이성질화, 디글리코실레이션(deglycosylation) 또는 비-자연적 발생 공유 변형, 즉, 폴리에틸렌 글리콜의 부가(PEGylation) 및 지질부가 과정에 의하여 번역-후 변형될 수 있다. 그러한 변형은 생체내 또는 실험상에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이트되어 그들의 약동학적 성질을 향상시킬 수 있다. 컨쥬게이션은 본 분야의 숙련자에게 알려진 기술에 의하여 수행될 수 있다. PEG와 치료적 항체의 컨쥬게이션은 기능을 방해하지 않고, 약역학을 증가시키는 것으로 보여진다. Deckert et al., Int. J. Cancer 87: 382-390, 2000; Knight et al. , Platelets 15: 409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16: 106-119, 2001; 및 Yang et al., Protein Eng. 16: 761-770, 2003를 참고.
본 발명의 항체 약동학적 특성은 본 분야의 숙련자에게 알려진 기술에 의한 Fc 변형을 통하여 증가될 수 있다. 예를 들어, IgG4 동형 중쇄는 그들의 힌지 영역에, 사이- 또는 내부- 중쇄 이황화 결합을 형성할 수 있는 Cys-Pro-Ser-Cys (CPSC) 모티브를 함유하며, 예를 들어, CPSC 모티브에서 두 Cys 잔기는 다른 중쇄에서 상응하는 Cys 잔기와 이황화 결합할 수 있거나(사이-), 주어진 CPSC 모티브내에서 두 Cys 잔기가 서로 이황화 결합할 수 있다(내부-). 생체내 이성질화 효소는 IgG4 분자의 중쇄-사이 결합을 중쇄-내부 결합으로 그리고 그 반대로 전환시킬 수 있는 것으로 믿어진다(Aalberse and Schuurman, Immunology 105:9-19 (2002)). 따라서, 힌지 영역에서 중쇄-내부 결합을 갖는 그러한 IgG4 분자에서 중:경쇄(HL) 쌍이 공유적으로 서로 회합하지 않기 때문에, 그들은 HL 모노머로 해리되고, 그 다음, 양특이성, 이형다이머 IgG4 분자를 형성하는 다른 IgG4 분자로부터 유래된 HL 모노머로 재회합될 수 있다. 양특이성 IgG 항체에서, 항체 분자의 두 Fab는 그들이 결합하는 에피토프가 다르다. IgG4의 힌지 영역에서 Ser228을 Pro 잔기로 치환하는 것은 "IgG1-유사 행동"이 되게 하며, 예를 들어, 분자는 중쇄 사이에서 안정한 이황화 결합을 형성하며, 더욱이, 다른 IgG4 분자와 HL 교환을 할 수 없다. 일구체예에서, 본 발명의 항체는 S228P 돌연변이와 함께 IgG4 Fc 부위를 포함할 것이다.
더욱이, 본 발명의 항체에서, FcRn 구조 수용체를 제외한 Fc 수용체에 결합하는 부위는 제거될 수 있다. 예를 들어, ADCC 활성에 속하는 Fc 수용체는 본 발명의 항체에서, 제거될 수 있다. 예를 들어, IgG1의 힌지 영역에서 Leu234/Leu235의 L234A/L235A로의 돌연변이, 또는 IgG4의 힌지 영역에서 Phe234/Leu235의 P234A/L235A로의 돌연변이는 FcR 결합을 최소화하고, 상보성 의존 세포 독성 및 ADCC를 매개하는 면역 글로블린의 능력을 감소시킨다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 P234A/L235A 돌연변이와 함께 IgG4 Fc 부위를 포함할 것이다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 항체는 S108P, P114A 및 L115A 돌연변이와 함께 IgG4 Fc 부위를 포함할 것이며, 여기서, Fc 부위는 서열 번호 41에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호 41을 암호화하는 바람직한 핵산 서열은 서열 번호 42에 나타내었다. 전장 IgG4 중쇄에서, 돌연변이 좌표는 S228P, P234A 및 L235A이다.
전체적인 인간, 인간-순응된, 인간화된 그리고 친화도-성숙된 항체 분자 또는 항체 단편은, 모방체, 융합 단백질 및 키메라 단백질과 같이, 본 발명의 관점 내에 있는 것이다.
본 발명의 길항제는 약 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 또는 10-12M 이하의 Kd로 TLR3와 결합할 수 있다. TLR3 수용체. 즉 hTLR3를 위한 주어진 분자의 친화도는 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 그러한 방법은 본 분야의 숙련자에게 알려진 Biocore 또는 KinExA 장비, ELISA 또는 경쟁적 결합 분석를 이용할 수 있다.
바람직한 친화도로 주어진 TLR3 상동체에 결합하는 길항제 분자는 항체 친화도 숙성 및 비-항원 분자에 적합한 다른 공지된 기술을 함유한 기술에 의하여, 변형체 또는 단편의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존 기초의 벡터 또는, 임의의 수단에 의하여, 주어진 기관 또는 유전적 배경으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드 도입에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 서열 번호 9, 서열 번호 11 및 서열 번호 13을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 서열 번호 19, 서열 번호 21 및 서열 번호 23을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 같은 본 발명에 따른 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다. 다른 바람직한 숙주 세포는 서열 번호 25, 27, 29, 31, 45, 47, 49, 51 또는 53 중 하나를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 서열 번호 33, 35, 37 또는 39를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 아케(archeal) 세포일 수 있다. 바람직한 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원일 수 있다. 포유 동물의 진핵 세포는 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 즉, SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, CRL-1581) , NSO (European Collection of Cell Cultures (ECACC) , Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주와 같은 무한 증식 세포주를 함유한다. 바람직한 인간 골수종 세포주는 U266 (ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 CHO-Kl (ATCC CRL-61) 또는 DG44와 같은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래되는 것을 함유한다.
본 발명의 또다른 구체예는 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것 및 숙주 세포에 의하여 생산되는 항체를 회수하는 것을 포함하여, TLR3와 반응성 있는 항체를 생산하는 방법이다. 그러한 항체는 아래와 같이, 서열 번호 6 및 16에 각각 나타낸 바와 같은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 mAb1068, 또는, 서열 번호 25, 27, 29, 31, 45, 47, 49, 51 또는 53에 나타낸 바와 같은 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 mAb 1068의 인간-순응된 또는 인간-순응된 CDR 변형체 또는, 서열 번호 33, 35, 37 또는 39에 나타낸 경쇄 아미노산 서열로 예시되는 TLR3 길항제 항체일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주이다.
치료 방법
본 발명은 TLR3 활성의 감쇠가 요구되는 증상을 위한 예방 및 치료 방법을 제공한다. TLR3 길항제로 치료되거나 예방될 수 있는 증상은 사이토카인에 의하여 매개되는 것과 TLR3 경로를 통한 신호 또는 TLR3의 활성화로부터 전체적으로 또는 부분적으로 기인하는 것을 함유한다. 본 발명은 이러한 사이토카인의 생산을 저해하기 충분한 시간 동안 TLR3 수용체를 발현하는 세포와 함께, 본 발명에서 개시된 분리된 항체와 같이, TLR3 길항제와 접촉하는 것을 포함하여, RNATES 또는 IL-6, IL-8 또는 MIPl-알파와 함께 RANTES의 세포내 생산을 저해하는 방법을 함유한다.
본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하는 데 이용될 수 있다. 그러한 동물들의 예는 인간, 설치류, 개, 고양이 및 농장 동물 그리고, 새, 파충류 및 물고기와 같은 다른 동물 종류를 함유한다. 임의의 특정 이론에 의한 도약할 의도 없이, TLR3 길항제의 치료적 혜택은 몇몇 염증 증상에 수반되는 전-염증성 케모카인 및 사이토카인의 분비를 억제하는 그러한 길항제의 능력에 기인할 것이다. 또한, TLR3 길항제의 치료적 혜택은 세포 증식과 나아가, 조직 회복을 증가시키는 그러한 길항제의 능력에 기인할 것이라고 믿어진다.
예를 들어, 본 발명의 방법은 환자의 염증성 증상을 치료하거나 예방하고, 조직 회복(외상성 손상 후, 상처 또는 화상 치유)을 증진시키는 데 유용하다. 더욱이, 본 발명의 방법은 실험상에서 세포 농도를 위하여 제공된다.
임의의 TLR3 길항제는 본 발명의 예방 및 치료의 방법에 이용될 수 있다. 예로써, 본 발명에서 개시된 분리된 항체 중 임의의 것은 조직 회복을 증진시키거나, 감염성 증상을 치료 또는 예방하는 데에서 TLR3 길항제로써, 유용하다. 특히, 서열 번호 9, 11 및 13에 나타낸 바와 같은 VH CDR 아미노산 서열 및 서열 번호 19, 21 및 23에 나타낸 바와 같은 VL CDR 아미노산 서열을 포함하는 단일클론성 항체의 항원 결합 능력을 갖고, TLR3와 반응성 있는 분리된 항체가 유용하다. 다른 유용한 항체는 서열 번호 25, 27, 29, 31, 45, 47, 49, 51 또는 53에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH와 서열 번호 33, 35, 37 또는 39에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다.
주어진 염증 증상을 치료하거나, 예방하기 충분한 주어진 TKR3 길항제의 양은 즉시 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에서, TLR3 길항제는 단독으로, 또는 적어도 하나의 다른 분자와의 조합으로 투여될 수 있다. 그러한 추가적인 분자는 다른 TLR3 길항제 분자 또는 TLR3 수용체 신호에 의하여 매개되지 않는 치료적 혜택을 갖는 분자일 수 있다. 항생제, 항바이러스제, 완화제(palliative) 및 사이토카인 수치 또는 활성을 감소시키는 다른 화합물은 그러한 추가적인 분자의 예이다.
염증 증상을 치료하거나 예방하는 방법의 또다른 구체예에서, TLR3 유전자 발현을 저해함으로써 TLR3 활성이 감소된다. TLR3 유전자 발현은 TLR3 매개의 신호를 저해하기 위하여, TLR3 생물학적 활성의 발현을 저해하는 임의의 수단에 의하여 저해될 수 있다. 그러한 수단은 예를 들어, 비활성화 게놈 DNA에 재조합을 통한 유전자 비활성화(예를 들어, 유전자 낙-아웃, 프로모터 하이재킹(hijacking) 또는 다른 유전자 돌연변이 유발 방법)와 유전자 전사체 비활성화(예를 들어, RNA 또는 안티-센스 RNA 침묵)를 포함한다. 본 분야의 숙련자는 활동적 TLR3의 발현을 감소시킬 많은 다른 수단을 인지할 것이다.
이에 따라, 본 발명의 일면은 TLR3 길항제를 치료적 유효량으로 이를 필요로 하는 환자에게 염증 증상을 치료하거나 예방하기 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하여, 염증 증상을 치료하거나 예방하는 방법이다.
그러한 염증 증상의 일예는 패혈증-관련 증상이다. 패혈증은 감염에 대한 전신의 반응이며, 이는 기관 장애 및 심각한 경우 죽음에 이르게 한다. 패혈증은 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생충 감염때문이며, 의학적으로 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)이라고 정의된다. 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생충 감염 및 괴사 세포에 의하여 방출되는 dsRNA는 패혈증의 발병에 기여할 수 있다. 패혈증-관련된 증상은 SIRS, 패혈증 쇼크 또는 다중 기관 기능이상 증후군(MODS)을 포함할 수 있다. 특정 이론에 의하여 도약할 의도 없이, TLR3 길항제로의 치료는 패혈증-관련된 염증 증상으로 고통받는 환자의 생존 시간을 늘리거나, 국부적 염증 사건(예를 들어, 폐에서)에서 전신 증상으로 퍼지는 것을 예방함으로써, 선천적 항균 활성을 강력하게 함으로써, 항균 약제와 결합할 때 상승적인 활성을 나타냄으로써, 병리에 기여하는 국부적 염증 상태를 최소화함하여, 또는 상기한 것 중 임의의 조합물로써, 치료적 혜택을 제공할 수 있다고 믿어진다. 그러한 관여는 환자의 생존을 안전하게 하는 데 필요한 추가적인 치료(예를 들어, 선행 감염의 치료 또는 사이토카인 레벨의 감소)를 허용하는 데 충분할 수 있다
그러한 염증 증상의 또다른 예는 염증성 장 질환이다. 염증성 장 질환은 코른 질환 또는 궤양 대장염일 수 있다. 본 분야의 숙련자는 장의 염증을 유발하는 알려진, 또는 알려지지 않은 병인의 다른 염증성 장 질환을 인지할 것이다. 더욱이, TLR3 길항제는 궤양 대장염 또는 코른 질환, 즉, 강직 척추염(ankylosing spondylitis), 엉치엉덩관절염(sacroiliitis) 및 건선 척추관절염을 포함하는 관절통 및 관절염과 관련된 장외 후유증(extraintestinal sequelae)의 치료 및 예방에 유용할 것이다. 다른 장외 후유증은 입 궤양(oral ulcer), 결절홍반(통증 경화성 타원형 결절의 발달) 및 피부의 깊고 심각한 궤양 형성에 의하여 특징화 되는 괴저고름피부증과 같은 점막피부 병반(mucocutaneous lesion); 상공막염(episcleritis), 홍채염(iritis) 및 포도막염(uveitis)과 같은 안과 합병증(opthlamologic complication); 신결석증(nephrolithiasis)과 같은 콩팥 질환; 일차 경화쓸개관염, 궤양 대장염 크론 질환과 관련된 섬유 염증에 의하여 특징되는 만성 간 질환과 같은 간담즙 질환; 및 지속적 코르티스테로이드 이용의 합병증으로써 발생할 수 있는 골다공증과 골감소증을 함유하는 뼈 질환을 포함한다.
간질성 폐렴, 기관 협착증, 세기관지염, 폐쇄세기관지기질화폐렴, 폐 혈관염, 사르코이드증, 만성 기관지염 및 호산구 증가증과 함께 폐 침윤을 보여주는 임상적 증상을 함유하는 IBD-유도된 폐 기능이상 및 호흡 장애 또한, 포함된다.
그러한 염증 증상의 또다른 예는 감염-관련 증상이다. 감염-관련 증상은 중증 폐렴, 낭성섬유증, 기관지염, 기도 결절(airway exacerbations), 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)를 함유하는 바이러스 또는 박테리아 폐렴을 포함할 수 있다. 그러한 감염-관련된 증상은 일차 바이러스 감염 및 이차 박테리아 감염과 같은, 다중 감염을 수반할 수 있다.
그러한 염증 증상의 또다른 예는 염증성 폐 증상이다. 바람직한 염증성 폐 증상은 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충 또는 프리온(prion) 감염에 관련된 것; 알러지 유도된 폐 증상; 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 또는 벨릴륨증(berylliosis)과 같은 오염물질 유도된 폐 증상; 위 흡인 유도된 폐 증상; 면역 조절곤란; 낭성섬유증과 같은 유전적으로 유도된 염증성 폐 증상; 및 호흡기 손상(ventilator injury)과 같은 물리적 외상 유도된 폐 증상을 포함하는 감염 유도된 폐 증상을 함유한다. 이러한 염증 증상은 또한 천식, 폐기종, 기관지염, COPD, 사코이드증, 조직구증, 림프관근종증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐 질환, 기관지폐형성이상, 지역사회 획득 폐렴, 병원내 폐렴, 호흡기-관련 폐렴, 패혈증, 바이러스성 폐렴, 인플루엔자 감염, 파라인플루엔자 감염, 인간 폐렴후바이러스 감염(human metapneumovirus infection), 호흡기 세포융합 바이러스 감염 및 아스파르길루스 또는 다른 곰팡이 감염을 포함한다.
그러한 염증성 증상의 또다른 예는 2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및 대사 증후군이다. TLR3 길항제는 비만과 인슐린 저항성에 관련된 염증성 과정의 저해에 유용하다. TLR3 신호의 저해는 다시 말해, 전체 콜레스테롤 레벨을 감소시키고, HDLc/LDLc 비율을 증가시키는 환자의 지질 특성을 향상시킬 것이다. TLR3 신호의 저해는 인슐린 분비를 증가시키고, 더욱이, 인슐린 저항성이 개선되도록 한다. 2형 당뇨병을 위하여 통용되는 치료는 저혈당증 및 체중 증가를 포함하는 다양한 해로운 부작용과 관련된다. 2형 당뇨병의 치료를 위한 TLR3 길항제의 이용은 적은 부작용을 갖고 약동학적 특성을 유지하는 것으로 기대된다. 더욱이, 본 발명의 분리된 항체와 같이, 긴 순환 반감기를 갖는 화합물로의 치료는 드문 투약을 필요로 할 것이다.
덧붙여, 지질 특성의 개선은 죽상 경화증과 같은 2형 당뇨병 및 비만과 관련된 심혈관 질환의 발달을 지연시키거나 막을 것이다. 또한, TLR3 신호의 저해는 이자섬 세포에 직접적 영향을 통하여, 또는 지질 특성에 영향을 주는 것과 섬 세포를 높은 지질 레벨에 의하여 유도되는 쇠약으로부터 보호하는 것에 의하여 순환하는 인슐린 레벨을 증가시킬 수 있다. 더욱이, TLR3 저해제 단독 또는 다른 치료와의 조합은 인슐린 치료와 관련된 원하지 않는 부작용을 피하고, 2형 당뇨병에서 인슐린 치료의 도입을 연기시키는 경향이 있다.
더욱이, C형 간염과 HIV 감염을 갖는 환자는 간에서 지질의 축적 또는 치료 약제로부터 기인한 섬유증 또는 경화에 기인한 인슐린 자극에 대한 반응의 간 무능력때문에, 인슐린 저항성 및 2형 당뇨병이 발달하려는 경향이 있다. TLR3 길항제에 의한 TLR3 신호의 저해는 이렇게 고도로 저항력 저하된 환자 집단에서 감염과 인슐린 저항성 둘다를 목표로 삼을 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 예방되거나 치료될 수 있는 다른 염증성 증상 및 신경병증은 다발경화증, 경화성 홍반성 루푸스와 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 양극성 장애와 근육위축가쪽경화증을 포함하는 신경변성 및 중추 신경계(CNS) 장애 및 섬유증, C형 간염 바이러스(HCV)와 B형 간염 바이러스를 포함하는 간 질환, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선 관절염 및 소아 류마티스성 관절염(JRA), 골다공증, 골관절염, 이자염, 섬유증, 뇌염, 건선, 거세포동맥염, 강직성척추염, 자기면역 간염, 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 염증성 피부 증상, 이식, 암, 알러지, 내분비 질환, 다른 자가면역 장애 및 기도 과민증을 포함한다.
본 발명의 또다른 면은 예를 들어, TLR3 길항제와 세포를 접촉시키는 것에 의하여, 세포 내에서 TLR3 활성을 감소시키는 것을 포함하여, 세포의 증식률을 증가시키는 방법이다. 본 발명의 일구체예에서, 세포는 상피 또는 대장 조직과 같은 조직으로부터 온 것일 수 있다. 상피 세포는 예를 들어, 위장관 상피, 피부 상피, 폐 상피, 또는 기관지허파 상피와 같은 임의의 상피 조직으로부터 기원될 수 있다. 염증 증상은 예를 들어, 심장 조직 및 위장관 조직과 같은 임의의 조직에 영향을 미쳐, 정상 조직으로부터 구조적 및 기능적으로 벗어나게 한다. 몇몇 예에서, 그러한 염증성 증상은 유전적 요소 또는 감염의 결과일 수 있다. 다른 위치에서, 그러한 염증성 증상은 예를 들어, 화상과 같은 외상 손상의 결과일 수 있다. 본 분야의 숙련자는 많은 다른 염증성 증상과 관계된 다른 조직에 의하여 나타나는 관련된 병리를 인지할 것이다.
본 발명의 또다른 면은 TLR3 길항제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 증상을 치료하기 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하여, 세포 사망으로부터 기인한 증상을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또다른 면은 TLR3 길항제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 증상을 예방하기 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하여, 세포 사망으로부터 기인한 증상을 예방하는 방법이다.
투여/약제학적 조성물
본 발명의 길항제의 치료학적 용도를 위한 투여의 방법은 숙주에 약제를 전달할 수 있는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 단백질, 항체, 항체 단편 및 모방체와 이러한 약제의 약제학적 조성물은 특히, 예를 들어, 피하조직내, 근육내, 피부내, 정맥내, 비강내, 또는 흡입에 의한 비경구적 투여에 유용하다.
본 발명의 길항제는 약제학적으로 수용가능한 담체에 활성있는 성분으로써, 길항제의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로써 준비될 수 있다. 길항제를 함유하는 수성 현탁액 또는 수용액은 생리적 pH로 바람직하게 완충될 수 있고, 주입을 위하여 준비된 형태로 있는 것이 바람직하다. 비경구적 투여용 조성물은 일반적으로 본 발명의 길항제의 수용액, 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 이들의 칵테일을 포함할 것이다. 예를 들어, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등의 다양한 수성 담체가 채용될 수 있다. 이러한 수용액은 무균이며, 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이러한 수용액은 통상의, 잘-알려진 멸균 기술(예를 들어, 필터)에 의하여, 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절과 완충 약제 등과 같이 생리적 환경에 근접하게 하기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형화에서 본 발명의 길항제의 농도는 예를 들어, 중량비 약 0.5%미만에서, 보통 약 1%이상, 최대 15 또는 20%까지로 광범위하게 변화할 수 있고, 선택된 특정 투여 방법에 따라, 일차적으로 액체 부피, 점성 등에 기초하여 선택될 것이다.
이에 따라, 근육내 주입용 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균 완충된 물 1ml와, 본 발명의 길항제를 약 1ng에서 약 100mg사이, 예를 들어, 약 50ng 내지 약 30mg, 또는 더욱 바람직하게 약 5mg 내지 약 25mg를 함유하도록 준비될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주입을 위하여, 멸균 링거 수용액 약 250ml과, 본 발명의 길항제를 약 1mg 내지 약 30mg, 바람직하게는 5mg 내지 약 25mg 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 준비하는 실제적 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA에 더욱 상세하게 기술된다.
약제학적 제제에서 본 발명의 길항제는 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 적절한 치료학적 유효량은 본 분야의 숙련자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 필요하다면, 결정된 투여량은 치료 기간 동안 의사에 의하여 적절하게 선택된 간격의 적절한 시간에 반복될 수 있다.
본 발명의 길항제는 저장을 위하여, 동결건조될 수 있으며, 이용에 앞서 적합한 담체 내에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로블린과 단백질 제제에 유효하며, 공지의 동결건조 및 재구성 기술이 채용될 수 있다. 길항제는 세포에 그러한 분자를 제공하는 임의의 기술에 의하여 투여될 수 있다. 세포에서, 실험상 길항제 투여는 예를 들어, 길항제로 배양 배지를 보충하는 것에 의할 수 있다. 세포에서, 실험상 길항제 투여는 예를 들어, 동물 또는 조직에 길항제의 정맥내 주입에 의할 수 있다. 본 분야의 숙련자는 실험상 또는 신체 내에서 세포에 길항제를 투여하는 다른 수단을 인지할 것이다. 그러한 수단은 상기에서 기술된 숙주에 약제를 전달하는 방법 또한 함유한다.
본 발명은 참조와 함께 다음 상세하고, 비-한정된 실시예에 기술될 것이다.
실시예 1. 항- hTLR3 길항제 mAbs 의 확인
hTLR3 수용체를 통한 신호를 막을 수 있는 항-hTLR3 길항제 mAbs는 세포-기초의 스크리닝 분석에 의하여 확인할 수 있다. 항-hTLR3 mAbs를 생산하는 하이브리도마의 풀을 일반적인 기술을 이용하여 BALB/C 마우스에서 생성시켰다(Kohler et a.1., 1976). hTLR3의 아미노산 1-703(서열 번호 3)을 암호화하는 플라스미드 DNA를 피하내 주입하여, 마우스를 hTLR3로 면역화시켰다. 아미노산 1-703은 hTLR3의 예측되는 세포외 부위(서열 번호 4)에 상당한다. 마우스에 10㎍의 플라스미드 DNA를 처음 주입한 다음, 2주 후에, 두번째로 10㎍ DNA를 주입하였다. 두번째 10㎍ 플라스미드 DNA를 주입한 다음 2주 후에, 각 마우스에 15㎍의 DNA의 보조 주입을 투여하였다. B 세포 융합 마우스 인산 완충 식염수(PBS; 10 mM phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4)에서 hTLR3 단백질의 15㎍을 B 세포 융합 3일 전 마우스의 정맥내로 주입하였다. 그 다음, 면역화된 마우스로부터의 비장을 채취하였으며, 표준 방법(Kohler et a.1., 1976)을 이용하여 B 세포 융합을 수행하였다. 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘을 함유하는 배지를 이용하여 하이브리도마를 선택하고, 효소-링크된 immunosorbent 분석(ELISA)를 이용하여 항-TLR3 항체를 첫번째로 스크리닝하였다. 항-hTLR3를 생산하는 개개의 하이브리도마를 제한된 희석에 의하여 클로닝시켰다.
hTLR3를 안정적으로 과-발현시키는 폐 상피 세포주 유래의 인간 A549를 이용한 세포 기초의 스크리닝 분석에 의하여, 항-TLR3 길항제 mAbs를 생산하는 하이브리도마를 확인하였다. 스크리닝의 생성에 이용된 A549 세포 (ATCC CRL: CCL-185)와 이러한 스크리닝을 위한 대조군 세포주를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 얻었다. 스크리닝 세포주는 A549-hTLR3라 명명된, A549 유래의 세포주이다. hTLR3 및 네오마이신 저항성 유전자를 암호화하는 포유동물 플라스미드 발현 벡터로 A549-hTLR3 세포를 안정적으로 형질감염시켰다. 대조군 A549 유래의 세포주는 A549-neo라 명명하였다. 네오마이신 저항성 유전자를 단독으로 암호화하는 동물 플라스미드 발현 벡터로 A5498-neo 세포를 안정적으로 형질감염시켰다. 제조자의 지시에 따른 Lipofectamine® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 형질감염과 선택 및 클로닝의 표준 방법에 의하여, 상기와 같이 안정적으로 형질감염된 세포주를 생성시켰다. 10% FBS, 1% MEM 비필수 아미노산 (Gibco Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), 1 mM 글루타민, 1 mM 피루브산염, 20 mM HEPES 및 0.5 mg/ml G418를 포함하는 Minimal Essential Media (MEM)과 표준 환경 하에서, A549-hTLR3 및 A549-neo 세포를 배양하였다.
A549-hTLR3 세포를 이용한 세포 기초의 스크리닝 분석으로 mAb 1068로 지시된 하나의 hTLR3 길항제 mAb를 확인하였다. 이러한 스크리닝 분석의 기초가 되는 원리는 A549-hTLR3 세포에 존재하는 hTLR3 수용체의 폴리(I:C) 자극이 세포의 사이토카인 생산을 증가시키는 것이다. 스크리닝 분석을 통하여 확인된 후보자 hTLR3 길항제 mAbs는 A549-hTLR3 세포에서 hTLR3 수용체를 통한 폴리(I:C) 매개의 신호를 저해시키고, mAb에 노출되지 않은 대조군 A549-hTLR3 세포와 비교하여 사이토카인 생산을 감소시킬 것이다. 5㎍/㎖의 폴리(I:C)(Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ) 첨가 전에, A549-hTLR3 세포를 시험 mAb와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고; 24시간 후 세포 배양 상층액에서 사이토카인 레벨을 측정함으로써, 스크리닝 분석을 수행하였다. 대조군 A549-hTLR3 세포를 비록 시험 mAb와 인큐베이션시키지는 않았지만, 동일하게 처리하였다.
Luminex? 다중채널 분석(Luminex Corp., Austin, TX)과 IL-6 (인터루킨-6) , IL-8 (인터루킨-8), 및 RANTES (Regulated Upon Activation, Normally T-Expressed, and presumably Secreted) 특이적 mAb 컨쥬게이트된 비드를 세포의 사이토카인 생산 레벨을 측정하기 위하여 제조자에 의하여 지시된 대로, 스크리닝 분석에서 이용하였다. hTLR3 결합된 길항제 mAb 1068을 그러한 분석으로 확인하였다.
mAb 1068의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 핵산 서열을 표준 방법을 이용하여, mAb 1068을 발현하는 하이브리도마로부터 클로닝하였다. mAb 1068 중쇄 및 경쇄 핵산과 아미노산 서열을 도 1과 2 및 서열 번호 6과 16에 각각 나타내었다. 재조합 mAb 1068(r1068)을 암호화하는 중쇄 및 경쇄 핵산 서열 둘 다를 함유하는 세포주를 표준 방법을 이용하여 생성하였다.
실시예 2. hTLR3 길항제의 인간 폐 유래된 세포에서 IL -6, IL -8 및 RANTES 사이토카인 생산 저해
도 3, 도 4 및 도 5에 나타낸 대로, 5㎍/㎖ 폴리(I:C) (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)의 첨가에 앞서, 37℃에서 30분 동안 1068 mAb 또는 TLR3.7 mAb와 함께 A549-hTLR3 세포를 인큐베이션함으로써, IL-6, IL-8 및 RANTES 특이적 사이토카인 분석을 수행하였다. 24시간 후에, Luminex® 기기(Luminex Corp., Austin, TX)와 적절하게 IL-6, IL-8 및 RANTES 특이적 mAb 컨쥬게이트된 비즈를 이용하여 세포 배양 상층액에서 사이토카인 레벨을 측정하였다. 각 사이토카인을 위한 Luminex® 분석을 제조자에 의해 지시된 대로 수행하였다.
결과는 hTLR3 길항제 mAb 1068이 인간 폐 상피 유래된 A549-hTLR3 세포에서 hTLR3-매개의 IL-6 (도 3), IL-8 (도 4) 및 RANTES (도 5) 사이토카인 생산을 저해한다는 것을 알려준다. 그러나 hTLR3 특이적 뮤린 mAb TLR3.7(eBioscience, San Diego, CA)은 hTLR3 매개의, 폴리(I:C) 유도된 IL-6 (도 3) 및 IL-8 (도 4)의 생산을 mAb 1068과 같은 정도로 저해하지 않는다. 이러한 인간 폐-유래된 세포에서 RNATES 생산(도 5)에 관하여, mAb TLR3.7이 RANTES의 생산을 증가시키는 반면, mAb 1068는 생산을 저해한다. 1068 및 TLR3.7 mAbs 사이의 이러한 차이는 TLR3.7 mAb가 hTLR3 수용체를 길항시킬지도 모른다고 제안한 전의 연구와 같이 중요하다(Matsumoto M. et al. , Biochem. Biophys Res. Commun. 24:1364-1369 (2002)). 이러한 전의 연구는 인간 섬유아세포 유래된 MRC-5 세포에서, TLR3.7 mAb가 폴리(I:C) 유도된 IFN-베타 생산을 저해하는 것으로 보인다고 기록하였다(Matsumoto M. et al., Biochem. Biophys Res. Commun.24:1364-1369 (2002)).
본 발명에서 이러한 결과는 1068 hTLR3 길항제 mAb가 TLR3.7 mAb보다 더 넓은 범위의 사이토카인의 생산을 저해하는 것을 명확하게 나타내며, 이러한 두 mAb는 이러한 이유로 서로 구별될 수 있다.
실시예 3. 일차 인간 기관지-상피 세포에서 hTLR3 길항제의 MIP1 -알파 및 IL-6 사이토카인 생산 저해
hTLR3 길항제 mAb 1068은 일차 인간 기관지-상피 세포에서 MIP1-알파 (도 6) 및 IL-6 (도 7) 사이토카인의 hTLR3-매개 생산을 저해한다. 도 6 또는 도 7에 나타낸 바와 같이, 5㎍/㎖ 폴리(I:C) (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)의 첨가에 앞서, 37℃에서 30분 동안 1068 mAb 또는 비특이적 다중클론 마우스 IgG 제제와 함께, 일차 인간 기관지-상피 세포를 인큐베이션함으로써, MIP1-알파 및 IL-6 특이적 사이토카인 분석을 수행하였다. 24시간 후에, Luminex? 기기(Luminex Corp., Austin, TX)와 적절하게 MIP1-알파 또는 IL-6 특이적 mAb 컨쥬게이트된 비즈를 이용하여 세포 배양 상층액에서 사이토카인 레벨을 측정하였다. 각 사이토카인을 위한 Luminex? 분석을 제조자에 의해 지시된 대로 수행하였다. 인간 조직 샘플로부터 일차 인간 기관지-상피 세포를 분리하고, 표준 방법을 이용하여 배양하였다.
실시예 4. 염증성 장 질환 증후군의 심각성을 완화시키는 TLR3 활성의 낙아 웃
뮤린의 IBD 모델에서, TLR3 수용체 유전자 활성(도 8)을 낙아웃시킴으로써,염증성 장 질환(IBD) 증후군의 심각성을 감소시켰다. 덱스트란 황산염(DSS)를 섭취시켜, 크론 질환 및 궤양 대장염을 동물에서 모델화시킬 수 있다(Hendrickson B.A. et al. , Clin Microbiol Rev. 15:79-94, 2002). 이러한 동물 모델에서 관찰되는 증상은 실질적인 체중 감소(도 8)와 상피 세포 궤양화를 포함한다. 이러한 증상은 궤양 대장염 또는 크론 질환과 같은 IBD를 갖는 환자에게서 관찰되는 증상을 모방한다. IBD의 이러한 뮤린 모델에서, DSS 처리된 TLR3 낙-아웃 마우스는 실질적으로 체중이 감소되지 않고(도 8), DSS 처리된 야생형 마우스와 비교하여 조직병리학 분석에 의하여 평가된 바와 같이, 더 완화된 상피 세포 손상으로 발전된다. 이러한 결과는 TLR3 신호가 IBD에 속하는 것과 같은 염증성 과정에서 중요한 역할을 수행할 수 있음을 지시한다.
이러한 실험에서, 암컷 야생형 C57BL/6 마우스 또는 TLR3 낙-아웃 마우스(Alexopoulou et al., Nature, 423:732-738 (2001))에서 급성 궤양 대장염을 유도하기 위하여, 각각에 도 8에 개시된 바와 같이, 자유롭게 마시는 물 또는 비보충용 물에 5% (w/v) 덱스트란 황산염 (DSS)을 5일 동안 공급하였다. 모든 마우스는 6-8 주령이며, 각 처리군은 적어도 5마리의 마우스를 갖는다. DSS 처리 후, 대장염의 발전을 체중, 결장 무게, 대변 굳기, 직장 출혈, 및 결장 조직병리학의 변화(도 8) 관찰에 의하여, 평가하였다. 모든 그러한 평가를 공공 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC) 지침에 따라 수행하였다. 도 8에서의 데이터는 1 내지 5일 처리로부터 퍼센트 무게 변화로써 나타내었다. 각각의 상징은 하나의 마우스로부터의 데이터를 나타낸다. WT는 야생형 마우스를 나타내고, KO는 TLR3 낙아웃 마우스를 나타낸다. 수평 막대는 평균을 의미한다. 보여진 데이터는 세개의 독립적인 실험의 합성물이다. DSS를 받아 들이지 않은 대조군 야생형 및 TLR3 낙아웃 마우스는 무게에서 유사한 변화를 보인다(P=O.6, t-test). DSS를 받아들인 야생형 및 TLR3 낙아웃 마우스(도 8)는 무게에서 유의적으로 다른 변화를 보여준다(P=O.003, t-test).
실험 5일째, 조직병리학 분석을 위한 결장을 동물로부터 수집하였다. 표준 방법을 이용하여 결장을 파라핀에 묻고, 섹션하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. DSS를 받아들인 야생형 마우스로부터의 대표적인 결장 섹션은 장샘 및 술잔 세포 손실 뿐만 아니라, 점막 궤양화 및 치밀한 염증 침투를 나타낸다. 비보충용(unsupplemented) 물을 받아들인 TLR3 낙아웃 마우스로부터의 대표적인 결장 섹션은 비보충용 물을 받아들인 야생형 마우스의 결장에서 관찰된 것과 형태적 및 조직적으로 유사하다. DSS를 받아들인 TLR3 낙아웃 마우스로부터의 대표적인 결장 섹션은 몇몇 치밀한 세포 침투를 함유하나, 그렇지 않으면, 손실이 최소화된 술잔 세포와 본래의 점막 상피를 나타낸다. 이러한 조직병리학 데이터는 DSS를 받아들인 TLR3 낙아웃 마우스가 DSS를 받아들인 야생형 마우스보다 덜 상피 궤양이 형성되는 것을 보여주며, TLR3 활성이 IBD에 속하는 것과 같은 염증성 과정에서, 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5. 염증성 장 질환을 멈추게 하는 hTLR3 길항제의 처리
hTLR3 길항체 치료와 관련된 체중 감소는 IBD의 뮤린 모델에서 체중 감소와 관련하여, 염증성 장 질환(IBD)의 심각성을 감소시킨다(도 9). 데이터는 TLR3 길항제로의 치료가 궤양 대장염 및 크론 질환과 같은 IBD와 관련된 증상을 완화시킬 수 있다는 것을 보여준다. 덧붙여, 이러한 결과는 TLR3 신호가 IBD와 같은 염증성 증상에서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 보여준다.
이러한 실험에서, 암컷 야생형 C57BL/6 마우스 각각에, 도 9에 지시한 바와 같이, 자유롭게 마시는 물 또는 비보충용 물에 5% (w/v) 덱스트란 황산염 (DSS)을 5일 동안 공급하여, 급성 궤양대장염을 유도하였다. PBS 담체 내에 0.2 mg의 mAb 1068, PBS 담체 내에 0.2 mg의 비-특이적 마우스 IgG 다중클론 항체 제제, 또는 PBS 담체를 단독으로 도 9에 지시한 바와 같이, DSS 처리의 처음 4일 동안 매일 복막내 주입에 의하여 마우스에 투여하였다. 모든 마우스는 6-8주령이며, 각 처리군은 적어도 5 마우스를 포함한다. DSS 처리 후, 궤양의 발달을 체중의 변화(도 9), 결장 무게, 대변 굳기, 직장 출혈, 및 결장 조직병리학의 변화를 관찰함으로써 평가하였다. 모든 그러한 평가를 동물 관리 및 이용 지침에 따라 수행하였다.
도 9에서의 데이터는 1 내지 4일 처리로부터 퍼센트 무게 변화로써 나타낸다. 각각의 상징은 하나의 마우스로부터의 데이터를 나타낸다. 수평 막대는 중앙값 수치를 나타낸다. 보여진 데이터는 두개의 독립적 실험을 혼합한 것이다. DSS를 받아들이지 않은 마우스와 DSS 및 mAb 1068을 받아들인 마우스 사이에 체중 변화의 유의적 차이가 없었다(P>0.05, Dunn's test; 도 9). DSS 및 mAb 1068을 받아들인 마우스에서 체중 변화는 DSS 및 PBS 중 비-특이성 IgG 또는 PBS를 단독으로 받아들인 마우스에서 관찰된 체중 변화와 유의적 차이가 있었다(둘다 P<0.01 ; Dunn's test; 도 9).
실시예 6. TLR3 낙아웃 마우스 또는 hTLR3 길항제 처리된 마우스에서 만성 대장염의 심각성 감소
C57BL/6 배경 (Alexopoulou et al. , Nature 413:732-738, (2001))에서 6 내지 8 주령 암컷 야생형 C57BL/6 마우스 및 TLR3 낙아웃(KO) 마우스를 모든 연구에서 이용하였다. 마시는 물 내에 2%(무게/부피) 덱스트란 황산염(DSS)을 전체 세 사이클으로 마우스에게 급식하였다(Okayasu et al., Gastroenterology 98:694-702 (1990)). DSS 물은 5일 동안 자유롭게 급식하여, 궤양대장염을 유도하고, 그 다음, 순수한 마시는 물을 9일 동안 급식하였다. 2% DSS의 두번째 5-일 사이클은 14일째 시작하였고, 그 다음 9-일 휴식하였다. 7일 동안의 2% DSS의 세번째 사이클은 28일째에 시작하였다. 두개의 다른 시간 포인트에서 마우스를 희생시켰다: 본 연구의 25일째 두번째 휴식 기간 후, 또는 본 연구의 37일째 세번째 DSS 사이클 후. 각각의 처리군은 적어도 8 마우스로 구성하였다. 본 연구를 통하여, DSS 처리 후, 결장 길이, 결장 무게, 대변 굳기, 직장 출혈, 및 결장 조직병리학을 포함하는 희생물에서의 다른 파라미터 측정 뿐만 아니라, 체중 변화를 관찰함으로써, 대장염의 발달을 평가하였다.
본 연구 계획을 알지 못하는 독립적 수의학 병리학자가 조직병리학을 평가하였다. 상피 세포 괴사, 상피 궤양 형성과 딱지 형성, 장샘 손실, 장샘 세포 증식, 고유판에서 육아 조직 형성, 점막밑층에서 육아 조직, 점막밑 염증성 세포 침윤 및 점막밑 부종을 포함하는 구획의 변화를 위하여, 결장의 세로 섹션을 점수로 계산하였다. 다음과 같은 점수는 병변의 확대를 반영하였다: 0, 존재하지 않음; 1, 경증, 국부적; 2, 경증, 다발성; 3, 중등, 자주 발견되나 제한된 부위에서 발견됨; 4, 중증, 제시된 조직의 많은 부위에서 자주 발견됨; 5, 매우 심각한 중증, 제시된 조직의 넓은 부위에 확대됨. Student's t tests (JMP, SAS Institute; GraphPad Prism)를 이용하여, 통계적 분석을 수행하였다. 궤양대장염 및 크론 질환을 갖는 환자에서의 증상은 체중 감소, 대변에 피의 존재 및 결장에서 상피층의 궤양 형성을 포함한다. 이에 따라, 덱스트란 황산염-처리된 마우스에서 유도된 증상은 궤양대장염 또는 크론 질환(Hendrickson et al., Clin. Microbiol. Rev. 25:79-94 (2002))을 갖는 환자에게 보이는 증상을 부분적으로 모방한다.
야생형 및 TLR3 KO 마우스의 이러한 모델 둘다에서, DSS 섭취의 각 사이클은 체중 감소를 유도한다. 그러나, TLR3 KO 마우스는 야생형 마우스보다 유의적으로 적은 체중 감소를 경험하게 된다. TLR3 KO 마우스는 또한, 결장 염증 및 손상의 전체 측정에 의하여 평가되는 감소된 질환 심각성을 보여준다: TLR3 KO 마우스에서 결장 단축은 WT 마우스에서 관찰되는 것보다 유의적으로 적으며, TLR3 KO 마우스는 직장 출혈의 훨씬 낮은 빈도수를 보였다. 결장 점막 손상의 조직병리학적 평가는 이러한 전체적 측정과 일관된다. 단일 세포 괴사, 상피 궤양 형성, 상피 딱지 형성, 장샘 소실 및 장샘 농양을 위한 중간값 수치는 WT 마우스보다 TLR3 KO 마우스에서 더 낮았다. 이러한 데이터는 함께, 만성 대장염의 마우스 모델에서 TLR3 신호의 부재가 질환으로부터 부분적으로 보호를 부여하는 것을 보여주며, TLR3 신호가 인간 IBD에서 질환 심각성을 악화시키는 경향이 있음을 제안한다.
질환 조절에서 TLR3의 역할을 더욱 설명하기 위하여, WT C57BL/6 마우스를 항-TLR3 mAb 1068로 처리하였다. DSS-노출된 마우스 군은 0.2 mg의 항-TLR3 mAb 1068을 예방적으로(첫번째 DSS 사이클과 함께 시작, "Pr") 또는 "치료적으로"(두번째 DSS 사이클과 함께 시작, "Th"; 도 35). DSS-노출된 마우스의 대조군에 PBS(매개체 대조군) 또는 0.2 mg의 비-특이적 음성 대조군 mAb를 처리하였다. 추가적인 대조군에는 DSS를 처리하지 않았다. 도 35에서 별표는 항-TLR3 길항제 mAb 복용 시간 포인트를 나타낸다.
DSS 섭취의 각 사이클 다음으로, DSS-노출된 마우스의 모든 군에서 체중 감소가 나타났다(도 36). 도 36에서 각 상징은 적어도 8 마우스의 평균을 나타내며, 오류 막대는 표준 분포를 나타낸다. DSS는 0에서 4, 14에서 18 및 28에서 35일에 처리하였다. 그러나 항-TLR3 mAb로 처리한 군은 PBS 또는 대조군 mAb로 처리한 군과 비교하여, 두번째 DSS 사이클 후에, 더 빠른 체중 회복비와 낮은 체중 감소를 보였다(도 37). 세번째 DSS 사이클 후, 항-TLR3 mAb-처리된 군에서의 체중 감소는 크게 낮아진다(도 38). 연구의 시작(0일)부터 연구의 마지막(37일)까지 PBS 또는 대조군 mAb를 받아들인 DSS-노출된 마우스에서 순 체중 감소의 평균은 대략 20%였다. 항-TLR3 mAb로의 처리는 체중 감소를 대략 10%로 유의적으로 감소시킨다(도 39). 도 39에서, 데이터는 연구의 시작(0일)부터 연구의 마지막(37일)까지 체중의 % 변화로 나타냈으며, 양수는 순 이득을 나타내며, 음수는 순 손실을 나타낸다. 항-TLR3 mAb 처리된 군에서 % 체중 손실은 매개체 대조군(PBS) 또는 비-특이적 IgG로 처리된 군에서보다 유의적으로 적다(예방적 항-TLR3 처리(항-TLR3 P) 대. PBS, P=O.006; 항-TLR3 P 대. 비-특이적 IgG, P=O.006); 치료적 항-TLR3 (항-TLR3 Th) 대. PBS, P=0.001; 항-TLR3 Th 대. 비-특이적 IgG, P=O.009). 각 기호는 하나의 마우스를 나타낸다; 수평 막대는 평균을 의미한다.
항-TLR3 mAb 처리는 또한 결장 수축의 범위를 감소시킨다. 예방적 또는 치료적으로 항-TLR3 mAb 처리된 마우스 군에서의 결장 길이는 매개체 또는 대조군 mAb를 처리한 군의 것보다 더 크다(도 40). (항-TLR3 P 대. PBS, P=O.009; 항-TLR3 P 대. 비-특이적 IgG, P=O.01; 항-TLR3 Th 대. PBS, P=O.03; 항-TLR3 Th 대. 비-특이적 IgG, P=O.04).
더욱이, 항-TLR3 mAb로 치료적으로 처리한 군에서의 결장 점막 손상은, 경증 조직병리학적 변화(상피 세포 괴사, 장샘 소실(cryptal dropout), 상피 궤양 형성과 딱지 형성, 장샘 손실(crypt loss) 및 장샘 세포 증식 포함) 및 만성 수선의 조직병리학적 변화(고유판에서 육아 조직, 점막밑에서 육아 조직, 점막밑 염증 세포 침윤 및 점막밑 부종-도 41a)에 의하여 평가되는 바, PBS 또는 비특이적 대조군 mAb로 처리한 대조군과 비교하여, 유의적으로 덜 심각하다.
그래프에 나타낸 데이터는 DSS 및다른 치료를 받은 마우스의 각 군에서(군: 1, PBS 매개체-처리된; 3, 예방적 항-TLR3 mAb; 4, 치료적 항-TLR3 mAb; 5, 비-특이적 대조군 mAb) 모든 조직병리학적 점수의 합계, 경증 변화의 합계, 또는 만성 면화의 합계를 보여준다. 각 그래프의 오른쪽 틀에서의 원은 각 처리군 점수의 평균 및 표준 분포를 나타낸다. 각 군 사이에 통계적으로 유의적인 차이는 최소한의 겹침을 갖는 원으로써 나타난다.
특히, 점막밑과 고유판에서의 항-TLR3 mAb 처리는 PBS 또는 비-특이적 mAb와 비교하여, 상피 궤양 형성을 감소시키고, 육아 조직의 형성을 막는다(도 41b). 그래프에 나타낸 데이터는 DSS와 다른 치료를 받아들이는 마우스의 각 군에서 조직병리학적 점수를 나타낸다(군: 1, PBS 매개체-처리된; 3, 예방적 항- TLR3 mAb; 4, 치료적 항-TLR3 mAb; 5, 비-특이적 대조군 mAb). 각 그래프의 오른쪽 틀에서 원은 각 처리 군에서 점수의 평균과 표준 분포를 둘러싼다. 각 군에서 통계적으로 유의적인 차이는 최소한의 겹침을 갖는 원으로써 나타낸다. 항-TLR3-부여된 보호의 잠재적 면역 관련성을 결정하기 위하여, 면역 세포 집단과 전신 사이토카인 레벨을 시험하였다. 이러한 만성 대장염 모델에서, T 세포 연루를 개시한 공개된 보고와 일치하게, DSS 노출이 비장 및 장간막림프절에서 활성화된 T 세포수의 증가와 관련된다는 것이 관찰되었다(도 42). 유동세포분석법을 이용하여, 전신 및 국부적 T 세포 각각의 활성화를 나타내는 비장 및 장간막림프절에서 CD62Llow T 세포의 빈도를 측정하였다. 만성 대장염은 헬퍼 T 세포 활성화의 전체적 증가를 제안하는 비장 및 장간막림프절에서 활성화된 CD4+(헬퍼) T 세포의 증가된 빈도와 관련된다. 비장에서, 활성화된 CD8+ 작용자 T 세포의 감소된 빈도는 작용자 T 세포의 장 부위로의 트래피킹(trafficking)을 제안하는 장간막림프절에서 활성화된 CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 동반한다. 데이터는 25일부터, 다음 두번째 DSS 사이클을 나타낸다. 각 기호는 하나의 마우스로부터의 데이터를 나타내며,- 수평의 막대는 평균을 나타낸다.
덧붙여, DSS-노출된 마우스의 비장에서 염증성 대식세포에서 대장염-관련된 증가를 반영할련지 모르는 CD11b+ 세포의 더욱 큰 빈도를 발견하였다. 두드러지게, 예방적 항-TLR3 mAb 치료는 DSS에 노출되지 않은 대조군 마우스에서 보이는 레벨로까지 유의적으로 감소된 비장 CD11b+ 세포의 빈도와 관련된다(도 43). DSS-노출된 항-TLR3 mAb-처리된 마우스의 비장에서 CD11b+ 세포의 퍼센트는 DSS를 받아들이지 않은 마우스와 유사하며, PBS (P=O.001) 또는 비-특이적 IgG (P=O.02)를 받는 DSS-노출된 마우스의 것보다 유의적으로 낮았다. 데이터는 25일부터, 다음 두번째 DSS 사이클을 나타낸다. 각 기호는 하나의 마우스로부터의 데이터를 나타내며; 수평의 막대는 평균을 나타낸다.
DSS-노출된 마우스의 혈청 사이토카인 특성은 또한 항-TLR3 mAb 처리와 관련된 변형을 보여주며: 항-TLR3 mAb를 예방적으로 받아들인 마우스에서 증가된 IL-4 및 IL-10 레벨을 측정하였다(도 44). 만성 DSS 대장염을 유도하는 동안 항-TLR3 mAb의 처리는 전신 IL-4 및IL-10 레벨을 증가시킨다. 각각 두번째 및 세번째 DSS 사이클 후 시간 포인트를 나타내는 25일 및 37일로부터의 데이터를 나타냈다. 각 기호는 하나의 마우스로부터의 데이터를 나타내며; 수평의 막대는 평균을 나타낸다. IL-4 및 IL-10은 둘다 염증의 조절에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 기술되었다. IBD에서 면역병인을 조절하는 데에서 IL-10의 특이한 역할이 IL-10 낙-아웃 마우스에서 자발적으로 대장염이 발달된다는 관찰에 의하여, 제안된다. 이러한 결과는 항-TLR3 mAb 치료가 DSS 섭취에 의하여 유도되는 염증성 및 T 세포 반응을 변형시키는 것을 제안한다.
다함께 취하여, 이러한 데이터는 만성 대장염 모델에서 항-TLR3 mAb로 TLR3 신호의 차단이 질환 심각성을 개선시킬 수 있음을 증명하며, 인간 IBD의 치료를 위한 항-TLR3 mAb의 잠재적 효능의 근거를 제공한다.
실시예 7. 패혈증 생존을 증가시키는 hTLR3 길항제 치료
마우스와 같은 동물에서 D-갈락토사민 및 폴리(I:C)를 투여하는 것에 의하여 패혈증을 모델화할 수 있다. 그러한 모델에서, D-갈락토사민은 패혈증 "민감제"로 기능하는 간독소이며, 폴리(I:C)는 dsRNA를 모방하고, TLR3를 활성화시키는 패혈증-유도 분자이다. 결과는 패혈증의 뮤린 모델에서 TLR3 길항제를 처리하는 것이 동물 생존률을 거의 두배로 되게 할 수 있다는 것을 나타낸다.
이러한 실험에서, 암컷 야생형 C57BL/6 마우스는 PBS 담체 중 1 mg의 hTLR3 길항제 1068 mAb, PBS 담체 중 1 mg의 비특이적 뮤린 다중클론 IgG 제제, 또는 도 10에 나타낸 바와 같이 단독으로 PBS 담체를 복막내 주입하였다. 각 주입은 PBS 중 1 ml의 mAb 또는 비-특이적 IgG 제제, 또는 1 ml의 단독 PBS를 포함한다. 다음 날, 마우스는 도 10에 나타낸 바와 같은 복막내 주입에 의한 멸균 PBS 100㎕ 중 10㎍ 폴리(I:C) 및 20 mg D-갈락토사민(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)을 받아들인다. 3일 동안 매일 2번 마우스의 생존을 모니터하였다. 확립된 동물 관리 및 이용 지침에 따라 모든 평가를 수행하였다. 결과는 hTLR3 길항제 처리가 패혈증 뮤린 모델에서 동물 생존률을 높이는 것을 보여준다(도 10).
실시예 8. 패혈증의 뮤린 모델에서 IL-6 및 TNF -알파 사이토카인 생산을 감소시키는 hTLR3 길항제 처리
패혈증의 뮤린 모델에서 hTLR3 처리는 염증 관련된 IL-6(도 11) 및 TNF-알파(도 12) 사이토카인의 혈청 레벨을 감소시킨다. 이러한 결과는 TLR3 활성을 저해하는 것이 패혈증에 기여하는 TLR3 매개의 사이토카인 생산을 감소시키는 것에 의하여, 패혈증의 생존을 증가시킬 수 있는 것을 나타낸다. 상기 실시예 6에 나타낸 바와 같이 처리된 마우스에서, 폴리(I:C) 투여 2시간 후, CO2/O2 마취된 마우스의 눈-뒤 공간으로부터 피를 뽑아 혈청을 준비하였다. 상온에서 피를 인큐베이션시키고, 다음으로, 2500rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 준비하였다. 사이토카인 분석 전에, 혈청을 -80℃에 보관하였다. 적합하게 IL-6 (도 11) 또는 TNF-알파 (도 12) 특이적 mAb 컨쥬게이트된 비드와 Luminex® 기기(Luminex Corp., Austin, TX)를 이용하여, 혈청 샘플에서 사이토카인 레벨을 측정하였다. 각 사이토카인을 위한 Luminex? 분석을 제조자에 의하여 지시된 대로 수행하였다. 확립된 동물 관리 및 이용 지침에 따라, 모든 평가를 수행하였다.
도 11 및 도 12에서 각 기호는 하나의 마우스로부터의 데이터를 나타낸다. 수평의 막대는 평균을 의미한다. 두개의 독립적인 실험을 혼합하여 데이터에 나타내었다. 폴리(I:C) 투여 2시간 후, mAb 1068로 처리하면, 혈청 IL-6 레벨이 유의적으로 감소되었다(P=O.04, t-test; 도 11). 폴리(I:C) 투여 2시간 후, mAb 1068로 처리하면, 혈청 TNF-알파 레벨이 유의적으로 감소되었다(P=O.03, t-test; 도 12).
실시예 9. 폐에서 TLR 유전자 발현의 상향조절과 전-염증성 사이토카인 분비를 유도하는 폴리 I:C의 투여
이소푸루란 마취된 수컷 또는 암컷 야생형 C57BL/6 마우스에 3일 동안 24시간 마다 PBS 단독 또는 PBS 중 폴리(I:C)의 투여량을 세번 비강내 투여하였다. 모든 마우스는 24주령이었다. 각 폴리(I:C) 투여량은 표 1에 나타낸 대로, 50㎍ 또는 100㎍ 폴리(I:C)를 함유한다. 각 투여량의 부피는 50㎕였다. 각 처리군은 6-8 마우스를 함유하였다. CO2 처리로 마우스를 희생시키고, 마지막 복용 24시간 후에, 폐에 캐뉼러를 꽂았다. 그 다음 폐에 1㎖의 PBS를 주입하여 기관지 폐포 세척(BAL)를 수행하고, 유출액을 회수하였다. 그 다음, BAL 제제를 펠렛 세포와 세포가 없는 상층액으로 원심분리시키고, 수집하여, 다중채널 사이토카인 분석에 이용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 확립된 동물 관리 및 이용 지침에 따라 모든 평가를 수행하였다.
적절한 대로, Luminex® 다중채널 분석(Luminex Corp., Austin, TX) 및 IFNγ, IL-lα, IL-6, CXCLlO, JE, KC, MGCSF, MIPIa, RANTES, TNFα, 또는 GMCSF 특이적 mAb 컨쥬게이트된 비드(LINCO Research, St. Charles, MO)를 이용하여, 상층액에서 사이토카인 레벨을 측정하였다. 각 사이토카인을 위한 Luminex? 분석을 제조자에 의하여 지시된 대로 수행하였다. 6-8 마우스로부터의 데이터를 평균 pg/ml + 평균의 표준 오류(SEM)로써 표현하였다.
이 결과는 50㎍ 또는 100㎍ 폴리 I:C의 다중 투여가 사이토카인, 케모카인 과 인터페론-γ(IFNγ), 인터루킨-6 (IL-6), 조직 괴사 요소-α (TNFα), 케모카인(CXC 모티브) 리간드 10 (CXCLlO), 케모카인(CC 모티브) 리간드 2 (JE), 케모카인 KC (KC), 대식세포 염증성 단백질-1 α(MIP-lα), 활성화로 조절되어, 정상적으로 발현 및 분비되는 T 세포/CCL5(RANTES), 뮤린 과립구 콜로니 자극 요소(mG-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 요소(표 1)를 포함하는 성장 요소의 높은 단백질 레벨을 유도한다는 것을 지시한다. 이러한 결과는 TLR3 활성화가 COPD와 같은 폐 병리를 매개하는 사이토카인, 케모카인 및 성장 요소에서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다.
덧붙여, 폐 조직의 Taqman 실시간 PCR 분석은 그들의 관련된 세포내 신호 분자와 다중 TLR을 위한 mRNA 뿐만 아니라, 사이토카인 유전자의 상향 조절을 다중 투여가 도출해냄을 설명한다(도 2). 이러한 데이터는 생체내로 투여되는 합성 이중-나선 RNA 유사체인 폴리 I:C가 연속된 사건을 도출하여, 다중 전염증성 사이토카인, 케모카인 및 TLR2, TLR3, TLR7 및 TLR9와 같은 TLR 유전자 발현의 상향 조절을 방출시킨다는 것을 설명한다.
표 1: C57BL/6 마우스의 폐에 폴리(I:C)의 다중 투여는 사이토카인, 케모카인 및 성장 요소가 기도로 분비되는 것을 유도한다. 6-8 마우스로부터의 데이터는 평균 pg/ml ± 평균의 표준 오류(SEM)로 표현하였다.
Figure 112007047290913-pct00002
실시예 10. 폐조직에서 사이토카인, 케모카인 , 성장 요소 및 톨 유전자 전사 체 레벨을 증가시키는 TLR3 활성화
상기 실시예 8에 개시된 바와 같이 처리된 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스의 폐로부터 추출한 전체 RNA에서의 전사체 레벨을 실시간-PCR(RT-PCR)을 이용하여 측정하였다. Trizol™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)을 이용하여, 마우스 폐 조직 샘플로부터 전체 RNA를 추출하고, RNEasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA)를 이용하여 분리하였다. 그 다음, 6-8의 동일하게 처리된 마우스로부터의 RNA를 합했다.
Omniscript™ kit (Qiagen Inc., Valencia, CA)를 이용하여, 제조자의 지시에 따라, 각 RNA 풀로부터 cDNA를 준비하였다. TaqMan™ Low Density Immune Profiling Array Cards (Applied Biosystems, Foster City, CA) 또는 custom Low Density Array (LDA) cards를 이용하여 제조자에 의하여 지시된 대로, 100 ng의 cDNA를 증폭시켰다. Primer Express™ software (Applied Biosystems)를 이용하여 프로브 및 프라이머 조합물을 디자인하였다. 그 다음, ABI PRISM™ 7000HT 기기 (Applied Biosystems)를 이용하여 384 웰 형식에서 제조자에 의해 지시된 대로, TaqMan™ RT-PCR (Applied Biosystems)을 수행하였다.
ABI PRISM™ 700OHT 기기 및 관련된 소프트웨어를 이용하여, 초기 대수증식기에서 데이터 수집과 전사체 정량을 수행하였다. 18S 리보좀 RNA의 전사체 레벨에 대하여, 개개의 전사체 레벨을 표준화하였다. 표 2의 데이터는 PBS 매개체만 처리한 마우스와 비교하여, 폴리(I:C)를 다중 처리한 마우스에서 mRNA 전사체 레벨에서의 평균 배수 증가로써, 표현하였다. 데이터는 6-8 마우스로부터 혼합된 RNA를 나타낸다.
데이터는 TLR3 활성화가 뮤린 폐 조직에서, 사이토카인, 케모카인, 성장 요소 및 톨 유전자 전사(예를 들어, TLR3 및 다른 톨-유사 수용체)를 증가시킨다는 것을 보여준다(표 2). 또한, 이러한 결과는 TLR3 활성화와, 다른 톨 유사 수용체(TLRs)의 활성화가 폐 병리를 매개하는 사이토카인, 케모카인 및 성장 요소에서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 보여준다.
표 2: C57BL/6 마우스의 폐로 폴리(I:C)를 다중 투여하는 것에 의한 TLR3 활성화는 사이토카인, 케모카인, 성장 요소 및 톨 유전자 전사체 레벨을 증가시킨다. PBS 매개체로 처리된 마우스와 비교하여, 폴리(I:C)를 다중 투여하는 마우스에서 mRNA 전사체 레벨의 평균 배수 증가로써 데이터를 표현하였다. 데이터는 6-8 마우스로부터 혼합된 RNA를 나타낸다.
Figure 112007047290913-pct00003
Figure 112007047290913-pct00004
Figure 112007047290913-pct00005
실시예 11. 폐 조직에서 염증성 세포 레벨을 증가시키는 TLR3 활성화
뮤린 폐 조직에서, TLR3 활성화는 염증성 세포 레벨을 증가시킨다(도 13, 14 및 15). 이러한 결과는 TLR3 활성화가 호중구(도 14) 및 단핵 세포(도 15)(예를 들어, 단핵구 또는 림프구)와 같은 염증 세포(도 13)에 의한 증가된 폐 침윤과 관련된 폐 병리에서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 지시한다. 폴리(I:C)를 처리한 C57BL/6 마우스의 폐로 염증성 세포가 침윤하는 것을 혈구계 산출(도 13) 또는 분별 염색법(도 14 및 도 15)를 이용하여 평가하였다. 상기 실시예 9에 개시된 바와 같이 다중 폴리(I:C) 투여량 또는 단일 폴리(I:C) 투여량을 마우스에 처리하였다. 단일 폴리(I:C) 투여량을 이소프루란 마취된 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스에 비강으로 투여하였다. 모든 마우스는 8주령과 12주령 사이였다. 단일 투여량은 50㎕의 PBS내에 50㎍ 또는 100 ㎍의 폴리(I:C)로 구성된다. 단일 폴리(I:C) 투여량을 처리한 동물에서 폴리(I:C) 투여 24시간 후, 또는, 다중 투여량을 처리한 동물에서 마지막 폴리(I:C) 투여 24시간 후에 폐 침윤 세포를 회수하기 위한 BAL을 수행하였다. 상기 실시예 8에 개시된 바와 같이 BAL을 수행하였다.
처리된 마우스 폐에서 BAL후에, 회수한 세포 펠렛을 0.1% BSA를 포함하는 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 200㎕에 희석시켰다. 희석된 세포의 50㎕ 알리쿼트를 50㎕의 Turk's Blood diluting fluid (Red Bird Service, Osgood, IN)에 첨가하고, 완전하게 혼합하였으며, 혈구계 카운팅을 이용하여 전체 세포 수를 계산하였다(도 13). 그 다음, 1x105 세포/㎕ 미만을 함유하는 희석액의 100㎕ 알리쿼트를 Cytospin™ 슬라이드 어셈블리에 로딩하고, 400rpm에서 4분 동안 회전시켰다. 슬라이드를 Cytospin™ 어셈블리로부터 제거하고, 적어도 1시간 동안 건조시켰다. 그 다음 슬라이드를 Wright-Giemsa 염색에 90분 동안 잠기게 하고, ddH2O로 5분 동안 탈색시켰다. 슬라이드를 오버나이트 건조시켰다. 100x 대물 렌즈를 이용하여, 오일 액침하에서 슬라이드를 분별하여 측정하였으며, 호중구(도 14) 및 단핵 세포(도 15)의 전체 수를 측정하였다. 각 처리군의 6-8 마우스로부터 수집한 폐 침윤 세포의 평균 및 SEM 데이터로 그래프를 그렸다(도 13, 14 및 15).
실시예 12. 폐 조직에서 염증성 세포 레벨 증가를 유도하는 폴리(I:C)로부터 보호되는 TLR3 낙아웃 동물
호중구 및 단핵 세포를 확인하기 위한 분별 염색 및 혈구계 산출을 이용하여, 단일 또는 다중 폴리(I:C) 투여를 처리하거나, C57BL/6 또는 TLR3 낙아웃 마우스의 폐로, 염증성 세포의 침윤을 측정하였다. 실시예 8에 개시된 바와 같은 다중 폴리(I:C) 투여량 또는 도 10에 개시된 바와 같은 단일 폴리(I:C) 투여량을 마우스에 처리하였다.
단일 폴리(I:C) 투여량을 처리한 동물에서 폴리(I:C) 투여 24시간 후에, 또는 다중 투여량을 처리한 동물에서 마지막 폴리(I:C) 투여 24시간 후에, 폐 침윤 세포를 회수하기 위한 BAL을 수행하였다. 상기 실시예8에 개시된 대로 BAL을 수행하였다. 야생형 C57BL/6 또는 TLR3 낙아웃 마우스의 폐로 염증성 세포가 침윤되는 것의 평가는 실시예 10에 개시된 대로, 혈구계 산출 또는 분별 염색법을 이용하였다. PBS만을 처리한 동물에서 폐 침윤한 세포 수의 평균과 비교하여, 폴리(I:C) 처리한 동물에서 폐 침윤한 세포 수 평균의 배수 증가로써 데이터를 표현하였다. 데이터는 6 마우스로부터 얻은 수치를 나타낸다.
표 3에 나타낸 결과는 TLR3 낙아웃 마우스가 야생형 마우스와 비교하여, 폐 조직에서 염증성 세포 레벨의 증가를 유도시키는 폴리(I:C)로부터 보호되며, 폴리(I:C) 투여의 영향이 대부분 TLR3 활성화 때문이라는 것을 보여준다. 더욱이, 결과는 TLR3 활성화가 호중구 및 단핵 세포(예를 들어, 단핵구 또는 림프구)와 같은 염증성 세포에 의하여 증가된 폐 침윤과 관련된 폐 병리에서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 보여준다.
표 3 : TLR3 낙아웃 (KO) 마우스는 야생형 마우스와 비교하여, 폐 조직에서 염증성 세포 레벨의 증가를 유도하는 폴리(I:C)로부터 보호된다. PBS만을 처리한 동물에서 폐 침윤한 세포 수의 평균과 비교하여, 폴리(I:C) 처리한 동물에서 폐 침윤한 세포 수 평균의 배수 증가로써 데이터를 표현하였다. 6 마우스로부터 얻은 수치를 데이터로 표현하였다.
Figure 112007047290913-pct00006
실시예 13. 메타콜린 유발된 동물에서 폐 기능을 더욱 약화시키는 폴리(I:C) 로 TLR3 의 활성화
PBS 단독 또는 PBS 중 단일 폴리(I:C) 투여량으로(도 16), 또는 3일 동안 매24시간마다 세번의 PBS 단독 또는 PBS 중 폴리(I:C)의 비강내 투여로(도 17), 수컷 또는 암컷 야생형 C57BL/6 마우스를 처리하였다. 폴리(I:C)는 TLR3를 활성화시킨다. 모든 마우스는 20주령이었다. 각 폴리(I:C) 투여량은 50㎍ 또는 100㎍의 폴리(I:C)를 함유하고, 50㎕의 부피로 구성된다. 각 처리군은 6-8 마우스를 함유한다.
마지막 폴리(I:C) 투여 24시간 후에, 기도 폐쇄 및 호흡 운동의 표지자로써 PenH 수치를 이용하여 폐 기능을 평가하였다. 전신 혈량계(WBP)를 이용하여 도 16 및 도 17에 개시된 바와 같이, 증가된 메타콜린의 노출로 유발된 마우스로부터, PenH 수치를 수집하였다. 메타콜린은 호흡 운동을 증가시키고, 폐 기능을 손상시킨다. 메타콜린을 PBS에 희석시키고, 분무된 에어로졸로써 투여하였다. 확립된 동물 관리 및 이용 지침에 따라 모든 평가를 수행하였다. 도 16 및 17에서의 데이터는 6-8 마우스의 각 치료군으로부터의 평균 수치 및 SEM을 나타내었다.
결과는 TLR3의 활성화가 메타콜린 유발된 야생형 마우스에서 폐 기능을 더욱 손상시킨다는 것을 지시한다(도 16 및 도 17). 이러한 결과는 TLR3 활성화가 감염, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 또는 다른 장애들 때문인 폐 손상으로부터 이미 고통받는 개체에서 폐 기능을 더욱 손상시킬 수 있다는 것을 제안한다. 이에 따라, TLR3 활성을 길항시키는 치료적 조정은 손상된 폐 기능으로부터 이미 고통받고 있는 개체에서 추가적으로 폐 기능이 손상되지 않도록 할 수 있다.
실시예 14. 메타콜린으로 유발되는 동안 폐 기능의 손상을 유도하는 폴 리(I:C)로부터 보호되는 TLR3 낙아웃 동물
실시예 12에 개시된 바와 같은 암컷 또는 수컷의 TLR3 낙아웃 마우스 또는 야생형 C57BL/6 마우스에서 단일(도 18) 및 다중 투여량(도 19)으로 폴리(I:C) 투여를 수행하였다. 도 12에 개시된 바와 같은 WBP를 이용하여 수집된 PenH 수치를 이용하여 폐 기능을 평가하였다. 메타콜린 투여 또한 실시예12에 개시되어 있는 바와 같다. 확립된 동물 관리 및 이용 지침에 따라 모든 평가를 수행하였다. 도 18 및 19에서의 데이터는 6-8 마우스의 각 처리군으로부터의 평균 수치 및 SEM을 나타낸다.
TLR3 낙아웃 마우스는 메타콜린으로 유발되는 동안 폐 기능의 손상을 유발하는 폴리(I:C)로부터 보호된다(도 18 및 도 19). 이러한 결과는 감염, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 또는 천식과 같은 다른 장애들 때문인 폐 기능 손상으로부터 이미 고통받는 개체에서 TLR3를 길항시키는 치료적 조정이 추가적인 폐 기능 손상을 예방할 수 있다는 것을 지시한다. 덧붙여, 이러한 결과는 폴리(I:C) 투여의 영향이 대부분 TLR3 활성화 때문이라는 것을 지시한다.
실시예 15. 인간 폐 기관지 상피 세포에서 사이토카인 및 케모카인 생산에 영향을 미치는 hTLR3 길항제
인간 폐 기관지 상피 세포주 BEAS-2B를 American Type Culture Collection (CRL-9609)로부터 얻었다. 콜라겐 I 코팅된 플라스크 (BD Biosciences) 내의 LHC-9 혈청이 없는 배지에서 BEAS-2B를 배양하고, 0.25% 트립신/EDTA로의 간단한 세척 후에 수집하였다. 그 다음, 세포를 LHC-9 혈청이 없는 배지 (Biosource)로 세척하고, LHC-9 배지에 1x106/㎖로 재현탁시켰다. 콜라겐 I 코팅된 95-웰 평평한 바닥 플라스크에 200㎕/웰로 세포를 플레이팅하고; 각 환경으로 3개의 배양 웰을 운영하였다.
6시간 인큐베이션시켜 세포가 부착되도록 한 다음, 배지를 제거하고, 200㎕의 새로운 배지로 교체시켰다. 100㎍/㎖에서 시작된 mAb 1068의 10-배의 연속된 희석액에 TLR3 작용제 폴리(I:C)를 125 ng/웰로 첨가하기 전에, 37℃에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. 폴리(I:C) 자극 24시간 후, 배양 상층액을 수집하고, 샘플에 Luminex® 다중채널 분석(Luminex Corp., Austin, TX)을 수행하여, IL-6, IL-8, RANTES, MCP-I, IP-10, IFN-α, IFN-γ, IL-IS, IL-12, TNF-α, MCP-I, 및 IL-10 발현 레벨을 분석하였다.
결과는 항-TLR3 길항제 mAb 1068(mQb CNTO260으로써 도 20에서 확인됨)가 폴리(I:C) 자극된 BEAS- 2B 세포에서 IL-6, IL-8, RANTES, MCP-I 및 IP-10의 생산을 감소시킨다는 것을 지시한다. IL-6, IL-8, RANTES, MCP-I 및 IP-10 발현은 도 20에 나타낸 바와 같이, mAb 1068 투여량 의존적 방식으로 감소되었다. IFN-α, IFN-Y, IL-lβ, IL-12, TNF-α, MCP-I, 및 IL-10 발현은 샘플에서 검출되지 않았다.
실시예16 . 치사 폐렴의 생존을 증가시키는 hTLR3 길항제 처리
이러한 실험에서, 50㎕ PBS 중 인플루엔자 바이러스 A/PR/8의 5 플라크 형성 단위(PFU)를 비강으로 8 내지 10 주령 암컷 야생형 C57BL/6 마우스에 감염시키고, 7일 후에, 50㎕ PBS 중 S. pneumoniae 박테리아의 50 플라크 형성 단위를 비강으로 감염시켰다. 바이러스 및 박테리아 투여량을 단독으로 투여하는 것은 준치사였으나, 이러한 투여량을 함께 투여하는 것은 대부분의 마우스에서 치사였다(도 22). 가상-감염된 마우스의 대조군은 인플루엔자 바이러스 A/PR/8 또는 S. pneumoniae 대신 PBS로 처리하였다. hTLR3 길항제 처리된 마우스에 PBS 0.2㎖ 중 0.6 mg 또는 0.06 mg을 7일째에 S. pneumoniae를 주입하기 2시간 전에 복막내 주입을 통하여 투여하였으며(예방적 투여), 8일째에 동일하게 다시 투여하였다(치료적 투여).
PBS 중 0.6 mg 또는 0.06 mg의 비특이적 IgG를 가상 처리된 마우스의 대조군에 복막내 투여하였다. 각각의 처리 또는 대조군은 7 마우스를 함유한다. 본 발명에서 개시된 모든 평가는 IACUC 지침에 따라 수행하였다.
인플루엔자 A/PR/8 바이러스를 달걀 내에서 배양하고, MDCK 세포로 표준 분석을 이용하여, PFU 적정량을 결정하고, 주입을 위하여, 냉동한 바이얼 스톡으로 유지시켰다. Streptococcus pneumoniae (ATCC® 번호: 6301™) 접종원을 5% 양의 피(TSA/blood)를 함유하는 트립티카제(trypticase) 콩 아가 플레이트에서 오버나이트 배양하고, 그 다음 플레이트로부터 박테리아를 제거하고, 인간-완충염(PBS)에 현탁시켰다. 600nm에서의 광학 밀도와 표준 방법을 이용하여, PBS 현탁액 내에서의 박테리아 CFU 적정량을 측정하였다. 그 다음, 박테리아 주입원을 PBS 중에 준비하였다. 표준 콜로니 형성 분석을 하여, 마우스에 투여되는 주입원에서 실제로 존재하는 박테리아 수를 결정함으로써, 박테리아 주입원에서의 CFU를 확인하였다. 주입원을 준비한 다음, 인플루엔자 A/PR/8 바이러스 또는 S. pneumoniae를 마우스의 비강내로 감염시켰다. 상기에서 개시된 바와 같이, 가상-감염된 대조군 마우스에 비강내로 PBS를 투여하였다. hTLR3 길항제 처리된 마우스를 상기에서 개시된 바와 같이, 예방적 및 치료적으로 mAb 1068을 복막내 투여하였다. 가상 처리된 대조군 마우스를 상기에서 개시된 바와 같이 PBS 중 비-특이적 IgG를 복막내 투여하였다. 바이러스 또는 박테리아를 단독으로 감염시킨 마우스 100%가 생존한 것와 같이, 인플루엔자 A/PR/8 바이러스 및 S. pneumoniae를 단독으로 투여하는 것은 준치사였다(도 22). 그러나 바이러스 또는 박테리아를 모두 감염시킨 이러한 다른 준치사 투여량은, 대부분의 마우스에서 치사 폐렴을 생성시켰다(도 22).
박테리아 감염 48시간 후에 마우스를 안락사시키고, 폐를 무균적으로 수집하였으며, 멸균 PBS에서 균일화시키고, PBS 내에서 균일화 희석액을 준비하고, 희석액을 TSA/피 플레이트에 위치시켜, 폐에서 박테리아 적재량을 결정하였다. 그 다음 콜로니가 보일 때까지 플레이트를 인큐베이션시키고, CFU를 측정하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 인플루엔자 바이러스의 준치사 투여량으로 전의 투여는 S. pneumoniae로 감염시키고 2일 후, 마우스의 폐에서, 박테리아 적재량을 증가시켰다.
8일 및 9일째, 마우스당 항-TLR3 mAb 1068를 0.6 mg 또는 0.06 mg으로 투여하는 것은 비특이적 IgG 대조군 mAb를 0.6 mg 또는 0.06 mg로 투여한 대조군 마우스와 비교하여, 인플루엔자 A/PR/8 및 S. pneumoniae로 감염시킨 마우스에서 마우스 생존률을 증가시켰다(도 21).
중요하게, 암컷 C57BL/6 마우스의 체중 평균은 18g 및 20g 사이이며, 결과적으로 투여되는 TLR3 길항제의 투여량 범위는 mAb 1068을 0.6mg 처리한 마우스에서 대략 3.0 mg/kg 및 3.3 mg/kg 체중 사이, 또는 mAb 1068의 0.06mg 처리한 마우스에서 대략 30 mg/kg 및 33 mg/kg 체중 사이이다. 도 21은 이러한 범위의 낮은 끝을 지시하기 위하여 표지하였다.
실시예 17. 콜로니 상피 세포 증식률에서 TLR3 활성의 효과
뮤린 모델에서 콜로니 상피 세포의 증식률은 TLR3 수용체 유전자 활성을 낙아웃시킴으로써 증가된다(데이터는 표 4에 나타냄). 이러한 실험에서, 암컷 야생형 C57BL/6 마우스 또는 상기에서 개시된 TLR3 낙아웃 마우스에 1㎖의 PBS 중, 1mg의 브로모데옥시유리딘(BrdU)를 복막내 투여하고, 두시간 후 희생시켰다. 모든 마우스는 6-8 주령이며, 각 처리군은 적어도 3마리의 마우스를 갖는다.
그 다음, 조직병리학적 분석을 위하여, 결장을 수집하였다. 결장 조직을 고정시키고, 단편으로 자른 다음, 파라핀에 묻고, 5㎛ 섹션을 준비하였다. 순차적으로 섹션을 제조자의 지시에 의하여, 마우스 항-BrdU IgG mAb(Becton-Dickinson Biosciences, Inc., San Jose, CA) 염소 항-마우스 IgG mAb horse radish peroxidase(HRP) 컨쥬게이트(Becton-Dickinson Biosciences, Inc., San Jose, CA) 및 디아미노벤지딘(DAB) 기질(Becton-Dickinson Biosciences, Inc., San Jose, CA로 인큐베이션시켰다. 인큐베이션된 섹션을 표준 방법에 의하여 헤마톡실린으로 반대염색(counterstained)시켰다.
그 다음, 인큐베이션시킨 섹션을 가시적으로 조사하고, DNA에 BrdU의 도입을 위해 양성 염색되는 결장 장샘에서 세포의 수를 측정하였다. 결장의 같은 단편으로부터의 섹션에서, 24의 연속된 알맞게-지향된 장샘세포에서 세포 수를 측정하였다. BrdU의 도입은 대리 표지자로써 이용되어, 세포 사이클을 통한 세포 진행을 확인한다; 예를 들어, 증식시킨 세포. 표 4에서, 2시간 마다 동물의 결장 장샘 세포마다 BrdU 염색된 세포의 평균 숫자로써 증식률 데이터를 표현하였다. 이러한 데이터를 평균 증식률 + 표준 분포(P<0.0001, T-test)로써 나타내었다. 데이터는 TLR3의 불활성화가 결장 상피 세포 증식을 증가시키는 것을 지시한다.
표 4; TLR3 낙아웃(KO) 마우스에서 증가된 결장 상피 세포 증식률
Figure 112007047290913-pct00007
실시예 18. 염증성 장 질환으로부터 회복하는 동안 결장 상피 세포 증식률에서 TLR3 활성의 효과
염증성 장 질환(IBD)의 뮤린 모델에서 회복하는 동안 결장 상피 세포의 증식률은 TLR3 수용체 유전자 활성을 낙아웃시킴으로써 증가된다(도 5). 이러한 실험에서, 암컷 야생형 C57BL/6 마우스 또는 상기에서 개시된 TLR3 KO 마우스 각각을 3일 동안 마시는 물 내에 5%(w/v)의 덱스트란 황산염(DSS)을 처리하여, 급성 궤양 대장염을 유도하였다. 그 다음 30시간 후, 실험이 끝날 때까지 마우스에 순수한 물을 보충하였다. 상기에서 개시된 바와 같이, 마우스를 BrdU로 주입시킨 다음 6시간 후에, 순수한 물을 급식하였다. 그 다음, 24시간 동안, DSS 유도된 궤양 대장염으로부터 마우스를 회복시키고, 희생시켰다. 모든 마우스는 6-8주령이었으며, 각각의 처리군은 적어도 3마리의 마우스를 갖는다. 결장 장샘 세포 증식의 조직병리학적 분석을 위한 결장 샘플을 준비하고, 상기 실시예 15에 개시된 바와 같이 분석하였다. 동물 결장 장샘 세포마다 BrdU 염색된 세포의 평균 수로써 증식률 데이터를 24시간 마다 나타내었다. 이러한 데이터는 평균 증식률 ± 표준 분포로써, 나타내었다(P<0.004, T-test). 표 5에서의 데이터는 염증성 장 질환으로부터 회복하는 동안, TLR3의 비활성화가 결장 상피 세포의 증식률을 증가시킨다고 지시한다.
표 5: 염증성 장 질환의 TLR3 KO 마우스 DSS 유도된 모델에서 회복하는 동안 증가된 결장 상피 세포 증식률
Figure 112007047290913-pct00008
실시예 19. TLR3 낙아웃 마우스에서 인슐린 민감성
TLR3 낙아웃(KO)(C57BL/6 배경에서) 및 야생형(WT) 대조군 마우스(C57 Bl/6)에 60.9% kcal의 지방 및 20.8%의 탄수화물로 구성된 고지방 식이(Purina TestDiet #58126)를 급식시켰다. 대조군 TLR3 KO 및 WT 마우스에 정상적 식이를 급식시켰다. 동물을 오버나이트동안 굶기고, 1.0mg/g의 글루코오스를 복막내로 주입하여, 글루코오스 내성 테스트(GTT)를 수행하고, 0, 15, 30, 60, 90 및 120분에 혈액 글루코오스 기록을 얻었다.
도 31은 14 및 26주 동안 고지방 식이에 있는 TLR3 KO 마우스는 고지방 식이에 있는 야생형 마우스와 비교하여, 글루코오스 내성 테스트에서의 증진을 나타내는 것을 보여준다. 정상적 식이를 급식시킨 마우스는 기대한 바와 같은 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 이러한 결과는 TLR3 신호가 인슐린 민감성에 나쁜 영향을 줄 수 있는 것을 보여주며, 2형 당뇨병 처리용으로 TLR3 길항제를 이용하기 위한 기초를 제공한다.
도 32는 고지방 및 정상적 식이에서 공복의 마우스에서 혈당 레벨을 보여준다. TLR3 KO 동물에서, 고지방 식이에 있는 야생형 마우스와 비교하여, 그들의 공복의 혈당 레벨을 정규화하였다. 이러한 데이터는 TLR3 신호가 글루코오스 내성 및 인슐린 저항성의 발달에서 손상에 기여하는 간 글루코오스 대사를 간섭할 수 있다는 것을 제안한다. 다음으로, 고지방 식이 또는 정상 식이를 급식시킨 TLR3 KO 및 야생형 마우스의 인슐린 레벨을 평가하였다. 오버나이트 공복시킨 마우스에서, 글루코오스 도전 전과 후의 혈중 인슐린 레벨을 측정하였다. Crystal Chem (Downers Grove, IL) 초-민감 ELISA 분석 키트 (cat # 90060)를 이용하여 인슐린을 정량화하였다. 고지방 식이를 급식시킨 TLR3 KO 마우스는 그들의 기준선(글루코오스 도전 없이)과 글루코오스 도전 후 20 및 60분 후에 증가된 인슐린 레벨을 보인다(도 33). 전체적으로 글루코오스 내성 테스트에서 얻은 데이터는 TLR3 신호의 부재가 인슐린 레벨과 인슐린 민감성에 영향력을 갖는 것을 제안한다.
고지방 식이 30주 TLR3 KO 마우스를 희생시키고, 그들의 지질 특성을 혈청 샘플에서 결정하였다. 전체 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리글리세리드 및 FFA의 레벨을 결정하였다. 간단하게, GEMCAL Reference Serum (Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LCC, West Caldwell, NJ)을 이용하여, 표준의 absorbance에서의 변화에, 알지 못하는 샘플의 absorbance에서의 변화를 참고하여, 모든 지질 테스트를 대조시켰다. 결과를 기록하기 전 각 날에, 대조군의 두 레벨을 수행하였다. 샘플을 로드하고, 지질 데이터를 획득하고, 통상의 단위 mg/dL로 표현하였다. NEFA kit (Wako)를 이용하여 FFA 레벨을 측정하였다. 같은 식이에 있는 야생형 마우스와 비교하여, TLR3 KO 동물은 FFA 뿐만 아니라, 순환하는 콜레스테롤, LDL 및HDL에서 더 낮은 레벨을 보인다. 이러한 결과는 TLR3 신호의 부재가 콜레스테롤 레벨을 낮추는 데 유익한 역할을 갖는 것을 보여주며, 심혈관 질환의 치료와 2형 당뇨병과 관련된 심혈관 합병증의 발달을 예방하기 위한 TLR3 길항제 MAbs를 위한 효용을 보인다.
요컨대, 나타난 결과는 야생형 마우스와 비교하여, 인슐린 저항성의 특성으로써, 손상된 글루코오스 내성의 발달로부터 고지방식이를 섭취시킨 TLR3 KO 마우스를 보호한다는 것을 알려주며, TLR3 신호의 부재가 마우스를 2형 당뇨병으로부터 보호한다는 것을 설명한다. 더욱이, 데이터는 고지방 식이에 있는 TLR3 KO 마우스가 고지방 식이에 있는 야생형 마우스와 비교하여, HDLc/LDLc 뿐만 아니라, 전체 콜레스테롤, LDH 및HDL 콜레스테롤을 더 낮은 레벨으로 갖는다는 것을 보여주며, 따라서, 심혈관 질화과 관련된 위험 요소를 하향-조절시키는 데에서 TLR3 길항제의 유익한 역할을 지시한다. 이러한 발견은 TLR3 저해제의 용도를 2형 당뇨병, 이상지질혈증 및 대사 증후군을 치료하기 위한 방법으로써 제안한다.
실시예 20. 인간-순응된 항- TLR3 mAbs 의 생성 및 특성화
공공 항체 서열 데이터베이스로부터 인간 항체 데이터베이스를 찾는 데, 뮤린 항-TLR3 mAb C1068의 아미노산 서열을 이용하였다. C1068(서열 번호 6)의 중쇄 가변 영역은 인간 VH1 중쇄 과의 VB_1-O3/JH1 72, VB_l-02/JHl 71, VB_1-O8/JH1 71 및 VB_l-69/JH2 70로 명명된 네개의 생식 계열(germline) 서열 중쇄에 높은 상동성을 보인다. 그 다음 C1068 중쇄의 CDR 영역이 선택된 인간 germline 중쇄 서열로 이동된 네개의 핵 컨스트럭트를 합성하여, 서열 번호 25, 27, 29 및 31 각각에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 HVl, HV4, HV5 및 HV7로써 지시되는 4개의 인간-순응된 항-TLR3 mAb 중쇄를 생성하였다.
C1068(서열 번호 16)의 경쇄 가변 영역은 인간 VK I 과의 VB_O12/JK2 78, VB_A30/JK2 77, VB_A20/JK4 76 및 VB_Ll/JK2 76로 명명된 네개의 생식 계열 경쇄 서열에 높은 상동성을 보인다. 그 다음 C1068 경쇄의 CDR 영역이 선택된 인간 생식 계열 경쇄 서열로 이동된 네개의 핵 컨스트럭트를 합성하여, 서열 번호 33, 35, 37 및 39 각각에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 LVl, LV3, LV5 및 LV7로써 지시되는 4개의 인간-순응된 항-TLR3 mAb 경쇄를 생성하였다.
네개의 중쇄 및 네개의 경쇄 가변 영역의 가능한 모든 조합물을 나타내는 16개의 mAb 컨스트럭트를 발현시켰다. 모든 중쇄 가변 영역 프레임워크는 108 잔기에서 Ser의 Pro 치환과 Phe114 및 Leu115의 Ala 치환(서열 번호 41); 전장 중쇄에서 S228P, F234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG4 중쇄 불변 영역과 함께 발현된다. 인간 K 불변 영역(서열 번호 4)을 이용하여 모든 경쇄 가변 영역 프레임워크를 발현시켰다.
플라스미드를 포함하는 적합한 중쇄 및 경쇄를 공동-형질 감염시켜, 포유 동물 세포 내에서 항체를 일시적으로 발현시켰다. 표준 단백질 A 정제를 이용하여 항체를 정제하고, 특성화를 위하여 PBS로 투석하였다.
부모의 뮤린 mAb C1068과 비교한 ELISA 형식을 이용하여, 인간 TLR3(서열 번호 4)의 세포외 부위에 결합하기 위한 모든 16 mAb를 평가하였다. 간단하게, 수용성 인간 TLR3 세포외 부위를 96 웰 플레이트의 웰에 코팅하고, 후보자 mAb를 다양한 농도(10-3 내지 103 ng/ml)에서 인큐베이션시키고, 뮤린 IgGl 동형 (Zymed, South San Francisco, CA)를 위하여 토끼 항-마우스 IgG-HRP로, 인간 IgG4 동형을 위하여 HRP-표지된 항-인간 IgG (Jackson 109-036-088)로 결합된 항체를 검출하였다. EC50 수치를 결정하고, 결과를 도 24 및 아래 표 7에 나타내었다.
표 7: 조합의 mAb를 위해 측정된 EC50 수치
Figure 112007047290913-pct00009
C1068을 위해 측정된 EC50은 8 ng/ml이고; 결과는 12의 인간-순응된 mAb가 뮤린 부모 mAb 1068과 비교하여 40-배 감소된 측정된 EC50 미만을 갖는다는 것을 지시한다. Biacore에 의하여 결합 친화도를 결정하고, 세포-기초의 사이토카인 방출 분석에서 결합 활성을 결정하는 것에 의하여 두드러진 본문에서 EC50 수치를 갖는 mAb를 더욱 특성화하였다.
mAb 획득 및 TLR3 획득 기술을 이용하여, Biacore에 의한 결합 친화도의 측정을 수행하였다. 25℃에서 표준 아민 커플링에 의하여, 단백질 A(6,000 RU)로 변형된 표면과 함께 CM5 칩으로 장비된 Biacore 2000 바이오센서를 이용하여 25℃에서 mAb 획득 분석을 수행하였다. 항체를 30nM로 희석시키고, 다른 단백질 A 표면에서 일분 동안 획득하였다.
TLR3를 0, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 및 9.0 nM로 주입하고, 5분 동안 회합 및 해리를 모니터하였다. 두 6-초 펄스 100 mM 인산을 이용하여 단백질 A 변형된 표면을 재생성하였다. 유용한 결합 데이터 세트를 1:1 상호작용 모델 (CLAMP™)에 맞췄다. 비율 정수와 그들의 비(KD= kd/ka) 및 명백한 평형화 상수의 예측에 걸쳐 수행된 적합 오류를 측정하였다.
30℃에서 표준 아민 커플링에 의하여, 항-His 항체(R&D Systems)로 변형된 표면과 함께 CM5 칩으로 장비된 Biacore 2000 바이오센서를 이용하여 25℃에서 TLR3 획득 분석을 수행하였다. 네번째 표면을 참고로 이용하면서, 80, 120, 및 300 RU 밀도에서 세 표면의 인간 헥사-히스티딘-TLR3를 획득하였다. 0, 0.4 1.1, 3.3, 10, 및 30 nM로 항체를 중복 주입하였다. 회합 단계를 3분 동안 모니터하고, 해리를 7분 동안 모니터하였다. 두 3-초 펄스 50 mM 인산을 이용하여 항-His 항체 표면을 재생성시켰다. 유효한 결합 데이터 세트를 mAb-농도 특성의 다른 경향을 위하여 수정된 1:1 상호작용 모델 (BIAeval™)에 맞췄다. 비율 정수와 그들의 비(KD= kd/ka) 및 명백한 평형화 상수의 예측에 걸쳐 수행된 적합 오류를 측정하였다.
측정된 KD 결과를 아래 표 8에 나태내었다. 두 측정은 1) 수용액 내에서 적용된 인간 TLR3와 함께 칩 표면에서 획득된 항-TLR3 mAb와의 결합 친화도 2) 칩 표면에서 획득한 TLR3와 수용액 상에서 적용된 항-TLR3 mAb를 나타낸다. 결과는 고정된 mAb에 의하여 수용액 기초의 TLR3를 획득할 때 모든 후보자들이 nM 친화도를 보유한다는 것을 지시하며, mAb 조합이 1068의 결합 특성을 보유한다는 것을 확인하였다. 대부분의 후보자가 단단하게 결합하는 특성을 보유하는 침에 TLR3가 고정될 때, 결과는 ELISA 결합 커브에 일치한다.
표 8: mAb 조합에서 측정된 KD 수치
Figure 112007047290913-pct00010
Biacore를 이용하여 분석한 인간-순응된 항-TLR3의 결합 활성을 또한 세포-기초의 사이토카인 배출 분석으로 결정하였다. 인간 폐 상피 세포주 BEAS-2B를 96-웰 플레이트에 플레이팅시키고, 폴리(I:C) 또는 혈청이 없는 기반에서 항체 후보자와 함께 미리 인큐베이션시킨 폴리(I:C)를 세포에 첨가하였다. 4일 후, 조절된 배양액을 제거하고, Luminex® 기술을 이용하여 수용성 사이토카인 레벨을 측정하였다. 결과는 도 25에 나타냈으며, 부모 mAb C1068의 생물학적 활성, 예를 들어, TLR3 리간드 폴리(I:C)로 처리된 세포에서 전-염증성 사이토카인 생성의 감소에 의하여 측정되는 것과 같은 TLR3 활성의 중성화가 인간-순응된 mAb에서 보유됨을 설명한다.
실시예 21. 인간-순응된 C1068 중쇄 및 경쇄 변형체의 생성 및 특성화
뮤린 항-TLR3 mAb 1068의 규소 면역원성 분석에서 CDR은 서열의 면역원성 점수를 감소시키기 위하여 조작될 수 있는 CDR 경계 내에서의 어그리토프(aggretope) 시리즈를 나타낸다. 조작될 수 있는 하나의 영역을 확인하였고, 서열 및 구조적 기준 둘다를 이용되는 아미노산 치환을 결정하는 데 적용하였다. 이러한 기준을 이용하여, 4개의 단일 포인트-아미노산 치환을 중쇄 가변 영역(VH)에서 확인하였고, 경쇄 가변 영역(VK)에서 세 돌연변이(단일, 이중, 삼중)를 확인하였다. HV1/LV1 배경에서 모든 여덟 돌연변이를 독립적으로 생성시켰고, 표 9에 나타내었다. 하나의 치환의 다른 타입 또한 M102 잔기를 이소루신으로 변화시키는 효과를 결정하는 데 적용하였으며, 이러한 잔기가 단백질의 수용성에 잠재적으로 해로운 변형을 번역-후 산화시킬 수 있는 것과 같이, CDR에서 메티오닌의 전체적 수를 줄이는 것이 완전하게 된다. 이러한 항체를 생성하고, 상기에서 개시된 대로, TLR3 결합(표 10 및 11 참조)과 생활성(도 26-30 참조)을 평가하였다.
표 9: CDR 점 돌연변이의 위치 및 확인
Figure 112007047290913-pct00011
표 10: TLR3 결합 분석에서 VH CDR 변형체의 측정된 EC50
Figure 112007047290913-pct00012
표 11: TLR3 결합 분석에서 VK CDR 변형체의 측정된 EC50
Figure 112007047290913-pct00013
HVl/LVl 배경으로 이식된 1068 CDR의 VH에서 만들어진 모든 다섯 단일 점 돌연변이는 인간 TLR3에 대한 EC50의 결합에 의하여 지시된 것과 같이, 잘 허용된다. HVl/LVl 배경의 EC 50을 29.2 ng/ml에서 측정하였고; I34M 및 Y60G 수치는 각각 17 and 14.6 ng/ml로 이보다 더 낮다. 이는 이러한 변화가 HV1/LV1의 실리콘 면역원성을 감소시킬 뿐만 아니라, TLR3에 결합을 향상시키는 것을 제안한다. 다른 세 돌연변이는 HV1/LV1보다 훨씬 더 약하게 결합한다. V1의 CDR1에서 돌연변이가 묵인되지 못하는 것은 (EC50 > 1000 ng/ml), 1068에서 인간 TLR3를 인지하기 위하여, 이러한 영역이 결정적이라는 것을 제안한다.
본 발명은 지금 완전하게 기술되었으며, 덧붙인 청구항의 정신 또는 범위로부터 벗어남 없이, 많은 변화 및 변형이 될 수 있음은 본 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTOCOR, INC. <120> TOLL LIKE RECEPTOR 3 ANTAGONISTS, METHODS AND USES <130> CEN5083 PCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2005-11-30 <150> 60/631,815 <151> 2004-11-30 <150> 60/636,399 <151> 2004-12-15 <150> 60/641,877 <151> 2005-01-06 <150> 60/713,195 <151> 2005-08-31 <150> 60/727,610 <151> 2005-10-18 <160> 63 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2712 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagacaga ctttgccttg tatctacttt tgggggggcc ttttgccctt tgggatgctg 60 tgtgcatcct ccaccaccaa gtgcactgtt agccatgaag ttgctgactg cagccacctg 120 aagttgactc aggtacccga tgatctaccc acaaacataa cagtgttgaa ccttacccat 180 aatcaactca gaagattacc agccgccaac ttcacaaggt atagccagct aactagcttg 240 gatgtaggat ttaacaccat ctcaaaactg gagccagaat tgtgccagaa acttcccatg 300 ttaaaagttt tgaacctcca gcacaatgag ctatctcaac tttctgataa aacctttgcc 360 ttctgcacga atttgactga actccatctc atgtccaact caatccagaa aattaaaaat 420 aatccctttg tcaagcagaa gaatttaatc acattagatc tgtctcataa tggcttgtca 480 tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540 aataaaattc aagcgctaaa aagtgaagaa ctggatatct ttgccaattc atctttaaaa 600 aaattagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660 ggaagattat ttggcctctt tctgaacaat gtccagctgg gtcccagcct tacagagaag 720 ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcatt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780 tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaatctcac tatgctcgat 840 ctttcctaca acaacttaaa tgtggttggt aacgattcct ttgcttggct tccacaacta 900 gaatatttct tcctagagta taataatata cagcatttgt tttctcactc tttgcacggg 960 cttttcaatg tgaggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020 gcctcactcc ccaagattga tgatttttct tttcagtggc taaaatgttt ggagcacctt 1080 aacatggaag ataatgatat tccaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140 ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc gaactttgac aaatgaaaca 1200 tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260 aaaatagaga gtgatgcttt ctcttggttg ggccacctag aagtacttga cctgggcctt 1320 aatgaaattg ggcaagaact cacaggccag gaatggagag gtctagaaaa tattttcgaa 1380 atctatcttt cctacaacaa gtacctgcag ctgactagga actcctttgc cttggtccca 1440 agccttcaac gactgatgct ccgaagggtg gcccttaaaa atgtggatag ctctccttca 1500 ccattccagc ctcttcgtaa cttgaccatt ctggatctaa gcaacaacaa catagccaac 1560 ataaatgatg acatgttgga gggtcttgag aaactagaaa ttctcgattt gcagcataac 1620 aacttagcac ggctctggaa acacgcaaac cctggtggtc ccatttattt cctaaagggt 1680 ctgtctcacc tccacatcct taacttggag tccaacggct ttgacgagat cccagttgag 1740 gtcttcaagg atttatttga actaaagatc atcgatttag gattgaataa tttaaacaca 1800 cttccagcat ctgtctttaa taatcaggtg tctctaaagt cattgaacct tcagaagaat 1860 ctcataacat ccgttgagaa gaaggttttc gggccagctt tcaggaacct gactgagtta 1920 gatatgcgct ttaatccctt tgattgcacg tgtgaaagta ttgcctggtt tgttaattgg 1980 attaacgaga cccataccaa catccctgag ctgtcaagcc actacctttg caacactcca 2040 cctcactatc atgggttccc agtgagactt tttgatacat catcttgcaa agacagtgcc 2100 ccctttgaac tctttttcat gatcaatacc agtatcctgt tgatttttat ctttattgta 2160 cttctcatcc actttgaggg ctggaggata tctttttatt ggaatgtttc agtacatcga 2220 gttcttggtt tcaaagaaat agacagacag acagaacagt ttgaatatgc agcatatata 2280 attcatgcct ataaagataa ggattgggtc tgggaacatt tctcttcaat ggaaaaggaa 2340 gaccaatctc tcaaattttg tctggaagaa agggactttg aggcgggtgt ttttgaacta 2400 gaagcaattg ttaacagcat caaaagaagc agaaaaatta tttttgttat aacacaccat 2460 ctattaaaag acccattatg caaaagattc aaggtacatc atgcagttca acaagctatt 2520 gaacaaaatc tggattccat tatattggtt ttccttgagg agattccaga ttataaactg 2580 aaccatgcac tctgtttgcg aagaggaatg tttaaatctc actgcatctt gaactggcca 2640 gttcagaaag aacggatagg tgcctttcgt cataaattgc aagtagcact tggatccaaa 2700 aactctgtac at 2712 <210> 2 <211> 904 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Gln Thr Leu Pro Cys Ile Tyr Phe Trp Gly Gly Leu Leu Pro 1 5 10 15 Phe Gly Met Leu Cys Ala Ser Ser Thr Thr Lys Cys Thr Val Ser His 20 25 30 Glu Val Ala Asp Cys Ser His Leu Lys Leu Thr Gln Val Pro Asp Asp 35 40 45 Leu Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Thr His Asn Gln Leu Arg 50 55 60 Arg Leu Pro Ala Ala Asn Phe Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Thr Ser Leu 65 70 75 80 Asp Val Gly Phe Asn Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro Glu Leu Cys Gln 85 90 95 Lys Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu Gln His Asn Glu Leu Ser 100 105 110 Gln Leu Ser Asp Lys Thr Phe Ala Phe Cys Thr Asn Leu Thr Glu Leu 115 120 125 His Leu Met Ser Asn Ser Ile Gln Lys Ile Lys Asn Asn Pro Phe Val 130 135 140 Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gly Leu Ser 145 150 155 160 Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gln Val Gln Leu Glu Asn Leu Gln Glu Leu 165 170 175 Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile Gln Ala Leu Lys Ser Glu Glu Leu Asp 180 185 190 Ile Phe Ala Asn Ser Ser Leu Lys Lys Leu Glu Leu Ser Ser Asn Gln 195 200 205 Ile Lys Glu Phe Ser Pro Gly Cys Phe His Ala Ile Gly Arg Leu Phe 210 215 220 Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val Gln Leu Gly Pro Ser Leu Thr Glu Lys 225 230 235 240 Leu Cys Leu Glu Leu Ala Asn Thr Ser Ile Arg Asn Leu Ser Leu Ser 245 250 255 Asn Ser Gln Leu Ser Thr Thr Ser Asn Thr Thr Phe Leu Gly Leu Lys 260 265 270 Trp Thr Asn Leu Thr Met Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu Asn Val 275 280 285 Val Gly Asn Asp Ser Phe Ala Trp Leu Pro Gln Leu Glu Tyr Phe Phe 290 295 300 Leu Glu Tyr Asn Asn Ile Gln His Leu Phe Ser His Ser Leu His Gly 305 310 315 320 Leu Phe Asn Val Arg Tyr Leu Asn Leu Lys Arg Ser Phe Thr Lys Gln 325 330 335 Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pro Lys Ile Asp Asp Phe Ser Phe Gln 340 345 350 Trp Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Asn Met Glu Asp Asn Asp Ile Pro 355 360 365 Gly Ile Lys Ser Asn Met Phe Thr Gly Leu Ile Asn Leu Lys Tyr Leu 370 375 380 Ser Leu Ser Asn Ser Phe Thr Ser Leu Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr 385 390 395 400 Phe Val Ser Leu Ala His Ser Pro Leu His Ile Leu Asn Leu Thr Lys 405 410 415 Asn Lys Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala Phe Ser Trp Leu Gly His 420 425 430 Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Leu Asn Glu Ile Gly Gln Glu Leu Thr 435 440 445 Gly Gln Glu Trp Arg Gly Leu Glu Asn Ile Phe Glu Ile Tyr Leu Ser 450 455 460 Tyr Asn Lys Tyr Leu Gln Leu Thr Arg Asn Ser Phe Ala Leu Val Pro 465 470 475 480 Ser Leu Gln Arg Leu Met Leu Arg Arg Val Ala Leu Lys Asn Val Asp 485 490 495 Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gln Pro Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp 500 505 510 Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ala Asn Ile Asn Asp Asp Met Leu Glu Gly 515 520 525 Leu Glu Lys Leu Glu Ile Leu Asp Leu Gln His Asn Asn Leu Ala Arg 530 535 540 Leu Trp Lys His Ala Asn Pro Gly Gly Pro Ile Tyr Phe Leu Lys Gly 545 550 555 560 Leu Ser His Leu His Ile Leu Asn Leu Glu Ser Asn Gly Phe Asp Glu 565 570 575 Ile Pro Val Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Glu Leu Lys Ile Ile Asp 580 585 590 Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn 595 600 605 Gln Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gln Lys Asn Leu Ile Thr Ser 610 615 620 Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu 625 630 635 640 Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cys Thr Cys Glu Ser Ile Ala Trp 645 650 655 Phe Val Asn Trp Ile Asn Glu Thr His Thr Asn Ile Pro Glu Leu Ser 660 665 670 Ser His Tyr Leu Cys Asn Thr Pro Pro His Tyr His Gly Phe Pro Val 675 680 685 Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pro Phe Glu Leu 690 695 700 Phe Phe Met Ile Asn Thr Ser Ile Leu Leu Ile Phe Ile Phe Ile Val 705 710 715 720 Leu Leu Ile His Phe Glu Gly Trp Arg Ile Ser Phe Tyr Trp Asn Val 725 730 735 Ser Val His Arg Val Leu Gly Phe Lys Glu Ile Asp Arg Gln Thr Glu 740 745 750 Gln Phe Glu Tyr Ala Ala Tyr Ile Ile His Ala Tyr Lys Asp Lys Asp 755 760 765 Trp Val Trp Glu His Phe Ser Ser Met Glu Lys Glu Asp Gln Ser Leu 770 775 780 Lys Phe Cys Leu Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ala Gly Val Phe Glu Leu 785 790 795 800 Glu Ala Ile Val Asn Ser Ile Lys Arg Ser Arg Lys Ile Ile Phe Val 805 810 815 Ile Thr His His Leu Leu Lys Asp Pro Leu Cys Lys Arg Phe Lys Val 820 825 830 His His Ala Val Gln Gln Ala Ile Glu Gln Asn Leu Asp Ser Ile Ile 835 840 845 Leu Val Phe Leu Glu Glu Ile Pro Asp Tyr Lys Leu Asn His Ala Leu 850 855 860 Cys Leu Arg Arg Gly Met Phe Lys Ser His Cys Ile Leu Asn Trp Pro 865 870 875 880 Val Gln Lys Glu Arg Ile Gly Ala Phe Arg His Lys Leu Gln Val Ala 885 890 895 Leu Gly Ser Lys Asn Ser Val His 900 <210> 3 <211> 2109 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgagacaga ctttgccttg tatctacttt tgggggggcc ttttgccctt tgggatgctg 60 tgtgcatcct ccaccaccaa gtgcactgtt agccatgaag ttgctgactg cagccacctg 120 aagttgactc aggtacccga tgatctaccc acaaacataa cagtgttgaa ccttacccat 180 aatcaactca gaagattacc agccgccaac ttcacaaggt atagccagct aactagcttg 240 gatgtaggat ttaacaccat ctcaaaactg gagccagaat tgtgccagaa acttcccatg 300 ttaaaagttt tgaacctcca gcacaatgag ctatctcaac tttctgataa aacctttgcc 360 ttctgcacga atttgactga actccatctc atgtccaact caatccagaa aattaaaaat 420 aatccctttg tcaagcagaa gaatttaatc acattagatc tgtctcataa tggcttgtca 480 tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540 aataaaattc aagcgctaaa aagtgaagaa ctggatatct ttgccaattc atctttaaaa 600 aaattagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660 ggaagattat ttggcctctt tctgaacaat gtccagctgg gtcccagcct tacagagaag 720 ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcatt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780 tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaatctcac tatgctcgat 840 ctttcctaca acaacttaaa tgtggttggt aacgattcct ttgcttggct tccacaacta 900 gaatatttct tcctagagta taataatata cagcatttgt tttctcactc tttgcacggg 960 cttttcaatg tgaggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020 gcctcactcc ccaagattga tgatttttct tttcagtggc taaaatgttt ggagcacctt 1080 aacatggaag ataatgatat tccaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140 ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc gaactttgac aaatgaaaca 1200 tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260 aaaatagaga gtgatgcttt ctcttggttg ggccacctag aagtacttga cctgggcctt 1320 aatgaaattg ggcaagaact cacaggccag gaatggagag gtctagaaaa tattttcgaa 1380 atctatcttt cctacaacaa gtacctgcag ctgactagga actcctttgc cttggtccca 1440 agccttcaac gactgatgct ccgaagggtg gcccttaaaa atgtggatag ctctccttca 1500 ccattccagc ctcttcgtaa cttgaccatt ctggatctaa gcaacaacaa catagccaac 1560 ataaatgatg acatgttgga gggtcttgag aaactagaaa ttctcgattt gcagcataac 1620 aacttagcac ggctctggaa acacgcaaac cctggtggtc ccatttattt cctaaagggt 1680 ctgtctcacc tccacatcct taacttggag tccaacggct ttgacgagat cccagttgag 1740 gtcttcaagg atttatttga actaaagatc atcgatttag gattgaataa tttaaacaca 1800 cttccagcat ctgtctttaa taatcaggtg tctctaaagt cattgaacct tcagaagaat 1860 ctcataacat ccgttgagaa gaaggttttc gggccagctt tcaggaacct gactgagtta 1920 gatatgcgct ttaatccctt tgattgcacg tgtgaaagta ttgcctggtt tgttaattgg 1980 attaacgaga cccataccaa catccctgag ctgtcaagcc actacctttg caacactcca 2040 cctcactatc atgggttccc agtgagactt tttgatacat catcttgcaa agacagtgcc 2100 ccctttgaa 2109 <210> 4 <211> 703 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Gln Thr Leu Pro Cys Ile Tyr Phe Trp Gly Gly Leu Leu Pro 1 5 10 15 Phe Gly Met Leu Cys Ala Ser Ser Thr Thr Lys Cys Thr Val Ser His 20 25 30 Glu Val Ala Asp Cys Ser His Leu Lys Leu Thr Gln Val Pro Asp Asp 35 40 45 Leu Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Thr His Asn Gln Leu Arg 50 55 60 Arg Leu Pro Ala Ala Asn Phe Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Thr Ser Leu 65 70 75 80 Asp Val Gly Phe Asn Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro Glu Leu Cys Gln 85 90 95 Lys Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu Gln His Asn Glu Leu Ser 100 105 110 Gln Leu Ser Asp Lys Thr Phe Ala Phe Cys Thr Asn Leu Thr Glu Leu 115 120 125 His Leu Met Ser Asn Ser Ile Gln Lys Ile Lys Asn Asn Pro Phe Val 130 135 140 Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gly Leu Ser 145 150 155 160 Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gln Val Gln Leu Glu Asn Leu Gln Glu Leu 165 170 175 Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile Gln Ala Leu Lys Ser Glu Glu Leu Asp 180 185 190 Ile Phe Ala Asn Ser Ser Leu Lys Lys Leu Glu Leu Ser Ser Asn Gln 195 200 205 Ile Lys Glu Phe Ser Pro Gly Cys Phe His Ala Ile Gly Arg Leu Phe 210 215 220 Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val Gln Leu Gly Pro Ser Leu Thr Glu Lys 225 230 235 240 Leu Cys Leu Glu Leu Ala Asn Thr Ser Ile Arg Asn Leu Ser Leu Ser 245 250 255 Asn Ser Gln Leu Ser Thr Thr Ser Asn Thr Thr Phe Leu Gly Leu Lys 260 265 270 Trp Thr Asn Leu Thr Met Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu Asn Val 275 280 285 Val Gly Asn Asp Ser Phe Ala Trp Leu Pro Gln Leu Glu Tyr Phe Phe 290 295 300 Leu Glu Tyr Asn Asn Ile Gln His Leu Phe Ser His Ser Leu His Gly 305 310 315 320 Leu Phe Asn Val Arg Tyr Leu Asn Leu Lys Arg Ser Phe Thr Lys Gln 325 330 335 Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pro Lys Ile Asp Asp Phe Ser Phe Gln 340 345 350 Trp Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Asn Met Glu Asp Asn Asp Ile Pro 355 360 365 Gly Ile Lys Ser Asn Met Phe Thr Gly Leu Ile Asn Leu Lys Tyr Leu 370 375 380 Ser Leu Ser Asn Ser Phe Thr Ser Leu Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr 385 390 395 400 Phe Val Ser Leu Ala His Ser Pro Leu His Ile Leu Asn Leu Thr Lys 405 410 415 Asn Lys Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala Phe Ser Trp Leu Gly His 420 425 430 Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Leu Asn Glu Ile Gly Gln Glu Leu Thr 435 440 445 Gly Gln Glu Trp Arg Gly Leu Glu Asn Ile Phe Glu Ile Tyr Leu Ser 450 455 460 Tyr Asn Lys Tyr Leu Gln Leu Thr Arg Asn Ser Phe Ala Leu Val Pro 465 470 475 480 Ser Leu Gln Arg Leu Met Leu Arg Arg Val Ala Leu Lys Asn Val Asp 485 490 495 Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gln Pro Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp 500 505 510 Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ala Asn Ile Asn Asp Asp Met Leu Glu Gly 515 520 525 Leu Glu Lys Leu Glu Ile Leu Asp Leu Gln His Asn Asn Leu Ala Arg 530 535 540 Leu Trp Lys His Ala Asn Pro Gly Gly Pro Ile Tyr Phe Leu Lys Gly 545 550 555 560 Leu Ser His Leu His Ile Leu Asn Leu Glu Ser Asn Gly Phe Asp Glu 565 570 575 Ile Pro Val Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Glu Leu Lys Ile Ile Asp 580 585 590 Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn 595 600 605 Gln Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gln Lys Asn Leu Ile Thr Ser 610 615 620 Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu 625 630 635 640 Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cys Thr Cys Glu Ser Ile Ala Trp 645 650 655 Phe Val Asn Trp Ile Asn Glu Thr His Thr Asn Ile Pro Glu Leu Ser 660 665 670 Ser His Tyr Leu Cys Asn Thr Pro Pro His Tyr His Gly Phe Pro Val 675 680 685 Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pro Phe Glu 690 695 700 <210> 5 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 240 agattcagtg gcagtgaatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccatttac gttcggctcg 360 gggacaaagt tggaactaaa a 381 <210> 6 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Gln Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe 20 25 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Thr Thr Tyr Trp Ile His 1 5 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 20 25 30 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 240 agattcagtg gcagtgaatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccatttac gttcggctcg 360 gggacaaagt tggaactaaa a 381 <210> 16 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 35 40 45 Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr 1 5 10 15 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Gln Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro 1 5 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV1 <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV1 <400> 26 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV4 <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV4 <400> 28 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagg gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcattag caccgcgtat 240 atggaactga gccgcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV5 <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV5 <400> 30 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 accggccagg gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatg acccgcaaca ccagcattag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV7 <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain HV7 <400> 32 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcgg cacctttagc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagg gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cgcggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV1 <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV1 <400> 34 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa a 321 <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV3 <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV3 <400> 36 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaacgcct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgaa tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa a 321 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV5 <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV5 <400> 38 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagtgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagatgtgg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggcggc 300 ggcaccaaag tggaaattaa a 321 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV7 <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain LV7 <400> 40 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtttca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaaagcct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa a 321 <210> 41 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG4 heavy chain constant region variant <400> 41 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 42 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG4 heavy chain constant region variant <400> 42 gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccgt gcagccgcag caccagcgaa 60 agcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 120 tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 180 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg caccaaaacc 240 tatacctgca acgtggatca taaaccgagc aacaccaaag tggataaacg cgtggaaagc 300 aaatatggcc cgccgtgccc gccgtgcccg gcgccggaag cggcgggcgg cccgagcgtg 360 tttctgtttc cgccgaaacc gaaagatacc ctgatgatta gccgcacccc ggaagtgacc 420 tgcgtggtgg tggatgtgag ccaggaagat ccggaagtgc agtttaactg gtatgtggat 480 ggcgtggaag tgcataacgc gaaaaccaaa ccgcgcgaag aacagtttaa cagcacctat 540 cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcat caggattggc tgaacggcaa agaatataaa 600 tgcaaagtga gcaacaaagg cctgccgagc agcattgaaa aaaccattag caaagcgaaa 660 ggccagccgc gcgaaccgca ggtgtatacc ctgccgccga gccaggaaga aatgaccaaa 720 aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaaa ggcttttatc cgagcgatat tgcggtggaa 780 tgggaaagca acggccagcc ggaaaacaac tataaaacca ccccgccggt gctggatagc 840 gatggcagct tttttctgta tagccgcctg accgtggata aaagccgctg gcaggaaggc 900 aacgtgttta gctgcagcgt gatgcatgaa gcgctgcata accattatac ccagaaaagc 960 ctgagcctga gcctgggcaa a 981 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human k constant region <400> 43 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 44 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human k constant region <400> 44 gcgcgcaccg tggcggcgcc gagcgtgttt atttttccgc cgagcgatga acagctgaaa 60 agcggcaccg cgagcgtggt gtgcctgctg aacaactttt atccgcgcga agcgaaagtg 120 cagtggaaag tggataacgc gctgcagagc ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgaacag 180 gatagcaaag atagcaccta tagcctgagc agcaccctga ccctgagcaa agcggattat 240 gaaaaacata aagtgtatgc gtgcgaagtg acccatcagg gcctgagcag cccggtgacc 300 aaaagcttta accgcggcga atgc 324 <210> 45 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV1 <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV1 <400> 46 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga tgcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 47 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV2 <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Gly Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV2 <400> 48 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaacggc 180 aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV3 <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV3 <400> 50 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 gcggaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV4 <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Gly 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV4 <400> 52 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 aacgaaaaag gcaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 53 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV5 <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Ile Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted heavy chain variant HBV5 <400> 54 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180 aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300 gtgattatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain variant HBV6 <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain variant HBV6 <400> 56 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcgg caacattagc aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa a 321 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain variant HBV7 <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain variant HBV7 <400> 58 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcgg caacattagc agctatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa a 321 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain variant HBV8 <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 60 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-adapted light chain variant HBV8 <400> 60 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcgg cggcattagc agctatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa a 321 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> unsure <222> (5) <223> Heavy chain CDR1 wherein Xaa at position 5 can be Isoleucine or <223> Methionine <400> 61 Thr Thr Tyr Trp Xaa His 1 5 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> unsure <222> (11) <223> Heavy chain CDR2 wherein Xaa at position 11 can be Tyrosine or <223> Glycine <220> <221> unsure <222> (12) <223> Heavy chain CDR2 wherein Xaa at position 12 can be Asparagine or <223> Alanine <220> <221> unsure <222> (15) <223> Heavy chain CDR2 wherein Xaa at position 15 can be Phenylalanine or <223> Glycine <400> 62 Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa Xaa Glu Lys Xaa Lys 1 5 10 15 Thr <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> unsure <222> (4) <223> Heavy chain CDR3 wherein Xaa at position 4 can be Methionine or <223> Isoleucine <400> 63 Val Gly Val Xaa Ile Thr Thr Phe Pro Tyr 1 5 10

Claims (62)

  1. 서열번호 9, 11 및 13에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 19, 21 및 23에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR을 포함하는, RANTES(Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted) 사이토카인의 세포적 생산을 저해하는 분리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 분리된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 33에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 분리된 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 기원의 것인 분리된 항체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Fab 단편을 포함하는 분리된 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편이 인간-순응된 분리된 항체.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이트된(conjugated) 분리된 항체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IgG4 동형을 갖는 분리된 항체.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 염증성 증상 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 항체의 치료적 유효량을 포함하는, 염증성 증상 치료 또는 예방용 약제.
  11. 제10항에 있어서, 염증성 증상이 패혈증-관련 증상인 약제.
  12. 제10항에 있어서, 염증성 증상이 염증성 장질환인 약제.
  13. 제10항에 있어서, 염증성 증상이 감염-관련 증상인 약제.
  14. 제10항에 있어서, 염증성 증상이 염증성 폐 증상인 약제.
  15. 제10항에 있어서, 염증성 증상이 2형 당뇨병, 이상지질혈증(lipidemia) 또는 대사 증후군인 약제.
  16. 제10항에 있어서, 염증성 증상이 자기면역 질환에 의하여 유발되는 약제.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 항체를 포함하는, 세포의 증식률 증가용 약제.
  18. 제17항에 있어서, 세포가 동물의 조직에 존재하는 약제.
  19. 제17항에 있어서, 세포가 상피 세포인 약제.
  20. 제18항에 있어서, 조직이 결장 조직인 약제.
  21. 제18항에 있어서, 조직이 염증성 증상과 관련된 병리를 나타내는 약제.
  22. 제21항에 있어서, 염증성 증상이 염증성 장질환인 약제.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 항체의 치료적 유효량을 포함하는, 세포사로부터 기인한 증상 치료 또는 예방용 약제.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
KR1020077014790A 2004-11-30 2005-11-30 톨 유사 수용체 3 길항제, 방법 및 용도 KR101317264B1 (ko)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63181504P 2004-11-30 2004-11-30
US60/631,815 2004-11-30
US63639904P 2004-12-15 2004-12-15
US60/636,399 2004-12-15
US64187705P 2005-01-06 2005-01-06
US60/641,877 2005-01-06
US71319505P 2005-08-31 2005-08-31
US60/713,195 2005-08-31
US72761005P 2005-10-18 2005-10-18
US60/727,610 2005-10-18
PCT/US2005/043373 WO2006060513A2 (en) 2004-11-30 2005-11-30 Toll like receptor 3 antagonists, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070090969A KR20070090969A (ko) 2007-09-06
KR101317264B1 true KR101317264B1 (ko) 2013-10-15

Family

ID=36565702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077014790A KR101317264B1 (ko) 2004-11-30 2005-11-30 톨 유사 수용체 3 길항제, 방법 및 용도

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8153583B2 (ko)
EP (2) EP2481425A1 (ko)
JP (2) JP5039560B2 (ko)
KR (1) KR101317264B1 (ko)
AR (1) AR051836A1 (ko)
AU (1) AU2005311894A1 (ko)
BR (1) BRPI0518664A2 (ko)
CA (1) CA2589636C (ko)
EA (1) EA200701192A1 (ko)
HK (2) HK1111360A1 (ko)
IL (1) IL183541A (ko)
MX (1) MX2007006442A (ko)
NO (1) NO20073293L (ko)
NZ (1) NZ555475A (ko)
TW (1) TWI487535B (ko)
WO (1) WO2006060513A2 (ko)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
JP5199878B2 (ja) * 2005-10-27 2013-05-15 セントカー・インコーポレーテツド Ｔｏｌｌ様受容体３モジュレーター、方法および用途
US8066981B2 (en) * 2006-11-14 2011-11-29 The Texas A & M University System Compositions and methods related to toll-like receptor-3
EP2155889A4 (en) * 2007-05-25 2010-06-16 Centocor Ortho Biotech Inc TOLL RECEPTOR 3 MODULATORS AND USES THEREOF
TR201802202T4 (tr) 2007-12-07 2018-03-21 Merck Serono Sa IL-31'e spesifik beşerileştirilmiş antikor molekülleri.
JP2011507552A (ja) * 2007-12-26 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド カニクイザルトール様受容体３
EP2294085A1 (en) * 2008-06-09 2011-03-16 Novartis AG Antibodies against neisserial factor h binding protein
EP2138513B1 (en) * 2008-06-27 2011-02-09 Theranor SPRL Pharmaceutical compositions of antibodies for diseases caused by viruses
WO2010040054A2 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods for suppressing toll-like receptor activity
US8460659B2 (en) 2008-10-31 2013-06-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
CA2742014A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Centocor Ortho Biotech Inc. Toll-like receptor 3 antagonists
US20100136097A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Systems for modulating inflammation
US20100136095A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Systems for modulating inflammation
US20100137246A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Anti-inflammatory compositions and methods
US20100136096A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Systems for modulating inflammation
US20100137843A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Delivery devices for modulating inflammation
US20100136094A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Systems for modulating inflammation
US20100135983A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-03 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Anti-inflammatory compositions and methods
MX2011011623A (es) * 2009-04-29 2011-11-18 Janssen Biotech Inc Antagonistas del receptor tipo toll 3.
CA2766747C (en) 2009-07-10 2019-04-02 Innate Pharma Tlr3 binding agents
JP2013506687A (ja) 2009-09-30 2013-02-28 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ オートファジー促進遺伝子産物の変調によりオートファジーを変調する方法
EP2663329A2 (en) 2011-01-12 2013-11-20 Innate Pharma Tlr3 binding agents
WO2013026837A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3892640A1 (en) * 2011-08-23 2021-10-13 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP2014526464A (ja) * 2011-09-12 2014-10-06 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト
ES2695151T3 (es) 2012-05-31 2019-01-02 Innate Pharma Agentes de ligación a TLR3
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
RS59992B1 (sr) 2013-02-26 2020-04-30 Roche Glycart Ag Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije specifični za cd3 i cea
US8906951B1 (en) 2013-06-24 2014-12-09 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
US9198898B2 (en) 2013-06-24 2015-12-01 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
KR102614189B1 (ko) 2014-11-17 2023-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
DK3277725T3 (da) 2015-03-30 2021-01-11 Regeneron Pharma Konstante tungkædeområder med reduceret binding til FC-gammareceptorer
AU2016329111A1 (en) 2015-10-02 2018-02-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-CEAXCD3 T cell activating antigen binding molecules
BR112018003984A2 (pt) 2015-12-09 2018-09-25 Hoffmann La Roche anticorpos
EP3400246B1 (en) 2016-01-08 2020-10-21 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2020047389A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1998050547A2 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Schering Corporation Human toll-like receptor proteins, related reagents and methods
US20030032090A1 (en) * 1997-05-07 2003-02-13 Schering Corporation, A New Jersey Corporation Human receptor proteins; related reagents and methods
DE60035262T2 (de) 1999-03-09 2008-02-21 Anker, Stefan, Prof. Dr. Endotoxinhemmern zur behandlung von kachexie
GB9930616D0 (en) 1999-12-24 2000-02-16 Mathilda & Terence Kennedy Ins Activation and inhibition of the immune system
JP2005501917A (ja) 2001-09-07 2005-01-20 ザ トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 免疫複合体関連疾患を処置するための方法および組成物
WO2003031573A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
EP2366389A1 (en) 2002-04-08 2011-09-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Severe sepsis preventive therapeutic agent
JP2004016021A (ja) * 2002-06-12 2004-01-22 Japan Science & Technology Corp 抗体および阻害剤並びにそれを用いた形質転換方法および形質転換キット
AU2004257149A1 (en) * 2003-06-20 2005-01-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Small molecule toll-like receptor (TLR) antagonists

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemical and Biophysical Research Communications 293 (2002) 1364-1369 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006060513A2 (en) 2006-06-08
TW200631594A (en) 2006-09-16
MX2007006442A (es) 2007-10-23
TWI487535B (zh) 2015-06-11
NO20073293L (no) 2007-08-17
HK1131744A1 (en) 2010-02-05
US20060115475A1 (en) 2006-06-01
BRPI0518664A2 (pt) 2008-12-02
EA200701192A1 (ru) 2009-12-30
EP1824514A2 (en) 2007-08-29
HK1111360A1 (en) 2008-08-08
CA2589636A1 (en) 2006-06-08
AU2005311894A1 (en) 2006-06-08
CA2589636C (en) 2015-03-24
EP2481425A1 (en) 2012-08-01
EP1824514B1 (en) 2015-03-04
IL183541A0 (en) 2007-09-20
EP1824514A4 (en) 2009-11-18
KR20070090969A (ko) 2007-09-06
IL183541A (en) 2011-10-31
AR051836A1 (es) 2007-02-14
WO2006060513A3 (en) 2009-05-14
JP5039560B2 (ja) 2012-10-03
JP2008521440A (ja) 2008-06-26
JP2012149092A (ja) 2012-08-09
US8153583B2 (en) 2012-04-10
NZ555475A (en) 2010-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101317264B1 (ko) 톨 유사 수용체 3 길항제, 방법 및 용도
RU2286351C2 (ru) Антитела к человеческому il-1бета
AU2011329647B2 (en) Neutralizing anti-CCL20 antibodies
KR101859857B1 (ko) Ｉｌ－21 항체
DK2340039T3 (en) Use of IL-20 antagonists for treating osteoporosis
US20220411520A1 (en) Gipr antibody and fusion protein between same and glp-1, and pharmaceutical composition and application thereof
JP2022540918A (ja) ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質及びその医薬組成物並びに用途
US20140255388A1 (en) Toll like receptor 3 antagonists, methods and uses
US11780916B2 (en) GIPR antibody and GLP-1 fusion protein thereof, and pharmaceutical composition and application thereof
RU2539034C2 (ru) Лечение рассеянного склероза
US20230084102A1 (en) Antibodies binding to plasmodium circumsporozoite protein and uses thereof
US10183971B2 (en) SAA-domain-specific antibodies and peptide antagonists and use thereof to treat inflammatory diseases
JP2009543579A (ja) 抗炎症反応のための標的としてのＷＳＸ−１／ｐ２８
CN114437212B (zh) 抗人胸腺基质淋巴细胞生成素抗体及其制备方法和应用
CN101415438B (zh) Toll样受体3拮抗剂、方法和用途
RU2800370C2 (ru) Антитело к gipr и его слитый с glp-1 белок, а также фармацевтическая композиция на его основе и его применение
KR20230142834A (ko) 항-cd38 항체 및 이의 용도
AU2012241182A1 (en) Toll like receptor 3 antagonists, methods and uses
JP2021534229A (ja) 特定の腸内細菌の抗体媒介中和による免疫疾患の治療

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160921

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170919

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180918

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190917

Year of fee payment: 7