KR101859857B1

KR101859857B1 - Ｉｌ－21 항체

Info

Publication number: KR101859857B1
Application number: KR1020167025492A
Authority: KR
Inventors: 줄리안 데이비스; 파비오 마그리니; 안드레아 파울라 마틴; 니루파 모차파리안; 체탄쿠마르 나트바를랄 파텔; 올리버 슈로더
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2018-05-18
Also published as: SG11201606705QA; CN106061999A; US20150266954A1; EP3119806A1; MA39342B2; MY177915A; TWI646105B; EA033335B1; AU2015231777A1; CL2016002281A1; TW201623330A; JP2017093435A; JP6053989B2; IL246909A0; CA2939543C; MX2016012120A; JP6373944B2; CA2939543A1; PE20161221A1; ECSP16075416A

Abstract

본 발명은 인간 IL-21에 대하여 높은 결합 친화도를 가지고, 그를 중화시키는 조작된, 인간화 항체, 상기 항체를 사용하여 IL-21의 효과의 길항작용 또는 중화가 보장되는 것인 병태, 예컨대, 자가면역 병태를 치료하는 방법, 상기 항체를 재조합적으로 제조하기 위한 조성물 및 방법, 및 상기 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

Description

ＩＬ－21 항체 {IL-21 ANTIBODIES}

본 발명은 인간 IL-21에 대하여 높은 결합 친화도를 가지며, 그를 중화시키는 조작된 인간화 항체, 상기 항체를 사용하여 IL-21의 효과의 길항작용 또는 중화를 필요로 하는 병태, 예컨대 자가면역 병태를 치료하는 방법, 상기 항체를 재조합적으로 제조하기 위한 조성물 및 방법, 및 상기 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

WO2010/055366에는 인간 IL-21에 결합하여 그를 중화시키는 것으로 알려져 있는, 트랜스제닉 마우스 유래의 인간 항체가 개시되어 있다. 특정 항체는 클론 362.78로부터 유래된 것이다.

마우러, M.(Maurer, M.) 등 (Generation and characterization of human anti-human IL-21 neutralizing monoclonal antibodies, 4 MAbs 69 (2012))은 클론 362.78로부터 유래된 항체를 비롯한, 인간 IgG 트랜스제닉 마우스 유래의 인간 항-인간 IL-21 모노클로날 항체로 이루어진 패널의 생성 및 초기 특징 규명을 기술하였다. WO2010/055366, US 20130323259A1 및 문헌 [Maurer et al.]에서 기술된 항-IL-21 항체, 즉, "mAb 362.78" (이는 또한 NN8828 및 NNC114-0006 또는 NNC-0000-0006으로도 지칭된다)에 관한 임상 연구가 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 크론병을 앓는 환자에서 수행되었다.

WO2012/098113에는, 앞서 WO2010/055366에서 언급되었던 항체인 모노클로날 항체 362.78 (NNC 0114-0005)의 Fab 단편과 복합체를 형성한 인간 IL-21의 결정 구조가 형성되었고 X선 방법을 사용하여 분석되었다는 것이 진술되어 있다.

본원에 개시된 본 발명은 상기 기술된 항-IL-21 항체에 대한 대안을 제공하고자 한다. 본 항체는 잠재적으로는, 그에 대하여 이용가능한 치료법이 거의 없고, 전세계적으로 의학상 여전히 요구되고 있는 자가면역 병태 또는 질환, 예컨대, 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS) 및 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 그레이브스병, 1형 당뇨병 등의 치료에 고도로 적합화된 것이다. 환자를 위한 현 표준 치료보다 안전성 프로파일이 더 우수한 더 효과적인 치료법이 강하게 요구되고 있다.

특히, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로서 본원에서 Ab327로 지칭되는 항체의 조작된 인간화 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 가지는 항체를 제공한다.

본 발명은 하기 특성: 1) 인간 IL-21에, 및 사이노몰구스 원숭이 IL-21에 고친화도로 결합하는 특성 (KinExA 용액 평형 결합에 의하면 37℃에서 각각 K_D = 0.8 ± 0.5 x 10^-12 M 및 0.3 ± 0.1 x 10^-12 M); 2) 마우스 및 래트 IL-21에 중간 정도의 친화도로 결합하는 특성 (KinExA 용액 평형 결합에 의하면 37℃에서 각각 K_D = 2.4 ± 1.3 x 10^-7 및 2.3 ± 0.2 x 10^-7 M); 3) 임의의 다른 인간 γ-공통 쇄 패밀리 구성원 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, 및 IL-15)에는 실질적으로 결합하지 않는 특성; 4) 특정 범(pan)-STAT-IM9-루시페라제 리포터 검정법에서 양성 대조군인 hIL-21R-Fc 구축물보다 약 6배 더 낮은 IC50으로 (각각 ~46.7 pM 및 ~41 pM 대 ~271 pM) 인간 및 사이노몰구스 원숭이 IL-21 활성을 중화시키는 특성; 5) 시험관내에서 약 1.15 nM의 IC50으로 1차 인간 B 세포의 인간 IL-21-유도성 증식을 중화시키는 특성; 6) 시험관내에서 1차 인간 B 세포의 인간 IL-21-유도성 형질 세포 분화를 중화시키는 특성; 7) 인간 IL-21을 주사맞은 마우스에서 (B 및 T 세포의 서브집단을 비롯한) 비장내 여러 세포 유형의 신속하고, 일시적인 확장을 효과적으로 차단하는 특성; 및/또는 8) 제약상 제조, 보관, 및 치료 용도로 충분히 안정적인 특성 중 하나 이상을 가지는 항체를 제공한다.

본 발명의 제1 측면에 따라, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하며, 여기서 LCVR은 CDRL1에 서열식별번호(SEQ ID NO): 7, CDRL2에 서열식별번호: 8, 및 CDRL3에 서열식별번호: 9를 포함하고, HCVR은 CDRH1에 서열식별번호: 10, CDRH2에 서열식별번호: 11, 및 CDRH3에 서열식별번호: 12를 포함하는 것인, 인간 IL-21에 결합하는 항체를 제공한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 항체는 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 1을 가지는 HCVR을 포함하고, 경쇄는 서열식별번호: 2를 가지는 LCVR을 포함한다.

본 발명은 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하는 인간 IL-21에 결합하는 항체로서, 여기서 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 서열이며, 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 서열인 항체를 추가로 제공한다.

바람직하게는, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지고, 여기서 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 서열이고, 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 서열인 본 발명의 항체인 항체를 제공한다.

특정 실시양태는 인간 IL-21에 대한 조작된 인간화 항체로서, 그의 각 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 서열이고, 그의 각 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4의 서열인 항체 Ab327이다.

본 발명은 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물 또한 제공한다.

본 발명은 본 발명의 항체를 발현하기 위한 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 분자를 또한 포함한다. 특히, 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 서열인 항체 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 본 발명은 그의 서열이 서열식별번호: 5의 서열인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자 또한 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 중쇄에 상응한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 4의 서열인 항체 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 본 발명은 그의 서열이 서열식별번호: 6의 서열인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 추가로 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 경쇄에 상응한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 서열인 항체 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 4의 서열인 항체 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 본 발명은 그의 서열이 서열식별번호: 5의 서열인 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그의 서열이 서열식별번호: 6의 서열인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 추가로 제공한다.

본 발명은 재조합 수단에 의해 본 발명의 항체를 발현하는 포유동물 세포를 포함한다. 특히, 본 발명은 상기 기술된 본 발명의 DNA 분자로 형질전환된 포유동물 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 a) 항체가 발현되도록 하는 조건하에서 상기 기술된 바와 같이 본 발명의 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및 b) 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 항체는 2개의 항체 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하고, 여기서 2개의 중쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 서열이고, 2개의 경쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4의 서열인, 항체를 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명은 바로 앞에서 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 항체를 포함한다.

본 발명은 특히 자가면역 (AI) 병태, 특히, 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS), 전신 홍반성 루푸스, 그레이브스병, 또는 1형 당뇨병을 치료하기 위하여 상기 항체를 사용하는 방법, 상기 항체를 제조하는 방법, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포를 형질전환시키기 위한 및 상기 항체를 발현시키기 위한, 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 항체를 발현시키기 위한 숙주 세포, 포유동물 숙주 시스템에서 재조합 발현 방법에 의해 제조된 항체, 및 항체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 항체의 제약 조성물을 포함한다.

항체에 대하여 고려되는 특정 용도는 AI 병태, 특히, AI 병태, 예컨대, 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS), 전신 홍반성 루푸스, 그레이브스병, 또는 1형 당뇨병 치료이다. 본 발명은 요법에서, 자가면역 병태 치료에서, 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS), 전신 홍반성 루푸스, 그레이브스병, 또는 1형 당뇨병 치료에서, 및 특히, 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS) 또는 전신 홍반성 루푸스 치료에서 사용하기 위한 항체를 포함한다. 본 발명은 자가면역 병태 치료에서 사용하기 위한; 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS), 전신 홍반성 루푸스, 그레이브스병, 또는 1형 당뇨병 치료에서 사용하기 위한; 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS) 치료를 위한; 또는 전신 홍반성 루푸스 치료를 위한 의약 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 포함한다. 특히, 본 발명은 자가면역 병태; 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (pSS), 전신 홍반성 루푸스, 그레이브스병, 또는 1형 당뇨병; 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS); 또는 전신 홍반성 루푸스 치료용 의약 제조에서의 본 발명의 항체의 용도를 포함한다.

도 1. 인간 IL-21, 및 인간 공통-감마 쇄 수용체에 결합하는 다른 리간드에의 Ab327의 결합을 ELISA를 이용해 제시한다.
도 2. 시험관내에서 1차 인간 B 세포의 인간 IL-21-유도성 증식을 중화시키는 Ab327을 제시한다.
도 3. 42일 동안 IL-21 항체 또는 이소형 대조군 항체로 처리된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)가 생착된 심하게 면역손상된 NSG 마우스 (NOD-scid IL-2Rγ 널(null))에서의 기준선으로부터의 평균 체중 변화율(%). 처리는 화살표로 표시된 시점에 이루어졌다. 기호: -■- Ab327 (10 mg/kg); --▼-- Ab327 (1 mg/kg); --□--; 이소형 대조군 (10 mg/kg); -●- 비-생착.
도 4. IL-21 항체 또는 이소형 대조군 항체로 처리된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)가 생착된 심하게 면역손상된 NSG 마우스 (NOD-scid IL-2Rγ 널)에서의 기준선으로부터의 평균 체중 변화율(%). 처리는 화살표로 표시된 시점에 이루어졌다. 기호: -■- Ab327 (10 mg/kg); --□--; 이소형 대조군 (10 mg/kg); -●- 비-생착.
도 5 및 6. 항-마우스 IL-21 항체 처리가 NOD 마우스의 침샘에서의 림프구 침윤을 제거하였다는 것을 mRNA 분석 (도 5) 및 조직학적 분석 (도 6, 림프구를 윤곽선으로 표시)에 의해 제시한 것이다.
도 7a 및 7b. 대용 항체 728이 NOD 마우스에서 자가면역 당뇨병 발생을 예방하였다는 것을 보여주는 것이다. 처리는 예방으로서 7주령째 (a) 또는 당뇨병 전증 단계 동안 13주령째 (b) 시작하였다. 2회 연속 판독치가 250 mg/dl 초과인 것으로 군당 당뇨병 발병률을 계산하고, 군당 당뇨병에 걸린 마우스의 백분율로서 나타내었다 (a: mIgG1 n=12; Ab728 n=12 및 b: mIgG1 n=8; Ab728 n=11). 당뇨병 발병률을 생존 곡선 데이터로서 점수화하였고, 로그 순위 검정에 의하면 상이하였다 (a: p=0.0007 및 b: p=0.002).

본 발명의 항체의 용도

인터루킨 (IL)-21은 T 세포의 각종 서브세트에 의해 생산되고, IL-21 수용체 (IL-21R)로 명명되는 특이 수용체 및 공통 γ-쇄 서브유니트로 이루어진 복합 수용체에 결합한다. 인간 IL-21은 시험관내에서 162-아미노산 전구체 분자로부터 제조된다. 성숙한 인간 IL-21은 전구체 단백질의 잔기 30-162 (133개의 아미노산)로 이루어진다. 클래스 I 시토카인을 대표하는 IL-21은 업-업-다운-다운(up-up-down-down) 토폴로지로 배열된 4-나선 번들 구조를 가진다. 전구체 162-아미노산 단백질의 넘버링을 사용할 때, 나선은 하기 잔기로 이루어진 것으로 간주된다: A 나선: 41-56, B 나선: 69-84, C 나선: 92-105, 및 D 나선: 135-148. 상기 구조는 다른 1형 시토카인 패밀리 구성원, 가장 특히, IL-2, IL-4, 및 IL-15의 구조와 밀접한 관계를 가진다.

IL-21이 수용체 복합체에 결합하고, 이어서, 수용체 활성화가 이루어졌을 때, Jak-STAT 신호전달 경로를 통한 신호전달이 이루어진다. IL-21R 쇄는 고친화도로 IL-21에 결합하고, 결합 에너지의 대부분을 제공한다. 그러나, 신호전달을 위해서는 공통 γ-쇄와의 상호작용이 요구된다. IL-21과 IL-21R 사이의 상호작용은 A 및 C 나선에 존재하는 잔기에 의해, 및 IL-21의 C 나선 바로 다음에 있는 CD 루프의 작은 부분에 의해 매개된다 (O. Hamming, et al., Crystal Structure of Interleukin-21 Receptor (IL-21R) Bound to IL-21 Reveals That Sugar Chain Interacting with WSXWS Motif Is Integral Part of IL-21R, 287 J. Biol. Chem. 9454-9460 (2012)).

IL-21은 선천성 및 적응성 면역 반응 둘 모두, 예컨대, 림프구 증식 자극, CD8+ T 세포 및 NK 세포 세포독성 촉진, 및 B 세포의 형질 세포로의 분화에 대하여 다면 발현성 영향을 미치는 클래스 I 시토카인이다. IL-21은 활성화된 CD4+ T 세포, 특히, Th17 및 T 소포 헬퍼 세포 뿐만 아니라, 자연살 세포에 의해 분비된다. 이는 피드-포워드(feed-forward) 기전에 의해 Th17 및 T 소포 헬퍼 세포의 발생을 촉진시키는 데 중요한 역할을 한다. 추가로, IL-21은 다른 시토카인과 협력하여 CD8+ T 세포의 세포독성 증가시키고, 항원 존재하에서 CD8+ 세포의 증식을 촉진시킨다. IL-21은 또한 B 세포에 의한 항체 생산에도 영향을 미친다. IL-21은 T 세포의 증식을 증강시키는 작용, B 세포의 기억 세포, 및 최종적으로 분화된 형질 세포로의 분화를 구동시키는 작용, 및 자연살 세포의 활성을 증강시키는 작용을 비롯한, 다양한 작용을 한다. 특정 인간 병태 및 질환에서, IL-21의 활성을 차단시키는 것이 바람직할 수 있다. 특히, IL-21의 그의 수용체에의 결합을 차단하는 항체가 상기 병태 및 질환을 치료하는 데 바람직할 것이다.

그의 특성을 고려해 볼 때, 본 발명의 항체는 잠재적으로는, T 세포 - B 세포 상호작용, Th17 세포, T 소포 헬퍼 세포, 형질 세포 및 활성화된 CD8 및 NK 세포가 뚜렷한 병원성 역할을 하는 자가면역 병태 또는 질환의 치료에 고도로 적합화된 것이다. 상기 카테고리에 순조롭게 잘 맞는 질환은, 그에 대하여 이용가능한 치료법이 거의 없고, 전세계적으로 의학상 여전히 크게 요구되고 있는 것인, 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 쇼그렌 증후군 (SS) 및 전신 홍반성 루푸스 (SLE)이다. 다른 잠재적인 적응증으로는 그레이브스병 및 1형 당뇨병을 포함한다.

쇼그렌 증후군은 인구 중 0.5-1.0%에서 관찰되고, 모든 연령에서 및 남성 및 여성 둘 모두에서 발생할 수 있지만, 주로 중년 여성에서 발병되는, 천천히 진행되는 전신 자가면역 질환이다. 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS) 및 쇼그렌 증후군 (SS)은 외분비샘, 특히, 침샘 및 눈물샘의 만성 염증을 특징으로 한다. pSS의 주요 특징은 구강 및 안구 건조 ("건조 증후군")이고, 조직학적 특징은 외분비샘의 국소 림프구 침윤으로, 이는 작은 구순 침샘 생검에 의해 측정될 수 있다. 건조 특징은 삶의 질에 영향을 주며, 이는 연루된 점막에서 국부 합병증을 유발한다. 중증의 입안 건조는 불쾌하고, 장애를 초래할 수 있는 상태이다. 그러나, 많은 환자에서는 샘외 소견이 발생할 수 있으며, 이는 거의 모든 기관을 포함할 수 있다. 현재 pSS 및 SS를 치료하는 것으로 승인받은 질환 변경 작용제는 없다. 약물 요법은 증상을 처리하고, 지지 요법을 제공한다. pSS 및 SS를 앓는 환자용으로서 더욱 우수한 안전성 프로파일을 가지는 더욱 효과적인 요법이 요구되고 있다. 본 발명의 항체를 이용한 약리학적 개입이 pSS 및 SS 발병에 원인적으로 관련되어 있는 것으로 보이는 조절이상 면역계의 여러 측면에 영향을 줄 수 있고, 이로써, 환자에게 상당한 임상적 이익을 제공할 수 있다. 이러한 요법은 또한 만성 (비-특이) 면역억제제의 필요성을 감소시킬 수 있으며, 이로써, pSS 및 SS 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다.

치료 및 투여

"치료," "치료하는" 또는 "치료하기 위해"라는 용어 등은 환자에 존재하는 증상, 병태, 질환 또는 장애의 진행 또는 중증도를 제지하거나, 저속화시키거나, 중단시키거나, 또는 역전시키는 것을 포함한다. "환자"라는 용어는 인간을 지칭한다. "유효량"이라는 용어는 환자에게 단일 또는 다회 용량으로 투여되었을 때, 환자에서 원하는 효과를 제공하는, 본 발명의 항체의 양 또는 용량을 의미한다. 유효량은 통상의 기술자와 같이 주치 진단 의사 또는 건강 관리 전문가에 의해서 공지 기술을 사용함으로써 및 결과를 관찰함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 환자를 위한 유효량을 결정할 때, 환자의 크기, 연령 및 일반적인 건강 상태; 연루된 특이 질환 또는 장애; 질환, 병태, 또는 장애의 중증도; 개별 환자의 반응; 투여 모드; 투여되는 제제의 생체이용가능성 특징; 선택된 용량 요법; 동시 약물 요법 사용; 및 다른 관련 인자를 비롯한 다수의 인자가 고려될 수 있다.

본 발명의 항체는 자가면역 병태를 치료하기 위해 인간에게 비경구적으로 투여되는 것으로 의도한다. 피하 및 정맥내 경로가 바람직하다. 항체는 투여 이전에 수성 기반 제약 용액으로 제제화될 수 있다. 부하 정맥내 용량이 건강 전문가에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 투여는 피하 주사에 의해 환자에 의한 자가 투여로 또는 또 다른 사람, 예컨대, 건강 관리 전문가에 의하여 이루어질 것으로 예상된다. 피하 주사를 위해, 자기 주사기 또는 미리 충전된 시린지가 사용될 수 있다. 용량은 고정된 용량 - 즉, 모든 환자에 대하여 활성 항체의 동일 질량일 수 있거나 - 또는 체중 (질량)에 기반할 수 있다. 체중 (질량) 기준으로, 용량은 바람직하게 환자 체중 (질량) 1 kg당 0.01 내지 30 mg 항체 범위일 것이다. 더욱 바람직하게, 용량은 환자 체중 (질량) 1 kg당 0.1 내지 20 mg 항체 범위일 것이다. 투약 빈도는 인간에서의 실제 약동학적 성질 및 약력학적 성질에 따라 매주 또는 그보다 덜 빈번할 것으로 예상된다. 치료 지속 기간은 많은 인자에 따라 달라질 것이며, 이는 관련 기술분야에서의 경험 및 기술에 기초하여 환자의 진단의 또는 치료하는 건강 관리 제공자에 의해 결정될 것이다. 치료 빈도 및 지속 기간은 적응증에 의해 달라질 수 있다.

본 발명의 항체의 구조

본 발명의 항체는 전장의 인간 IgG 항체에 대해 전형적인 3차 및 4차 구조를 가진다. 적합한 포유동물 숙주 세포에서 생합성되었을 때, 본 발명의 항체는, 쇄가 일반적인 방식으로 쇄내 및 쇄간 디술피드 결합에 의해 함께 공유적으로 결합되어 있고, 여기서, 중쇄들은 서로 결합되어 있고, 하나의 경쇄가 중쇄 각각에 결합되어 있는 것인, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 분자로서 분비될 것이다. 쇄내 및 쇄간 디술피드 결합의 위치는 널리 공지되어 있다.

각 중쇄는 N-말단에서부터 C-말단으로 중쇄 가변 도메인, IgG CH1, IgG CH2, 및 IgG CH3 도메인인 4개의 도메인을 함유한다. CH1과 CH2 사이의 힌지 영역은 2개의 중쇄를 연결하는 쇄간 디술피드 결합 또는 결합들을 함유한다. 각 경쇄는 N-말단에서부터 C-말단으로 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인 (CL) 도메인인 2개의 도메인을 함유한다. 중쇄 불변 도메인은 인간 IgG4 또는 그의 변이체인 것이 바람직하다. 경쇄 불변 도메인은 인간 카파인 것이 바람직하다. 가변 영역은 함께 인간 IL-21에 결합하고, 인간 IL-21 활성을 중화시키는 기능적 특성을 담당한다. 본 발명의 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2로 제공된다. 본 발명의 한 항체인 Ab327의 불변 도메인은 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4 내에 제공된다. 서열식별번호: 3의 Asn294의 N-연결된 글리코실화 부위가 글리코실화될 수 있다.

항체의 중쇄 (HC)의 아미노산 서열은 그의 C-말단에서, 적절한 인간 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3), 또는 안정성을 개선시키기 위한 또는 이펙터 기능을 감소시키기 위한 널리 공지된 돌연변이 또는 돌연변이들을 가질 수 있는, 인간 중쇄 불변 도메인의 구조상 유사한 변이체에 융합된, 본 발명의 중쇄 가변 도메인인 서열식별번호: 1로 이루어진다. 안정성 및/또는 감소된 이펙터 기능과 관련된 돌연변이를 가진 인간 IgG4 불변 도메인의 변이체가 바람직하다. 서열식별번호: 3은 Ab327의 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다.

경쇄 (LC)의 아미노산 서열은 그의 C-말단에서 적절한 인간 경쇄 불변 도메인 (CL), 또는 그의 구조상 유사한 변이체에 융합된, 본 발명의 경쇄 가변 도메인인 서열식별번호: 2로 이루어진다. 인간 카파 경쇄 불변 도메인이 바람직하다. 서열식별번호: 4는 Ab327의 경쇄의 아미노산 서열을 제공한다. Ab327을 발현시키기 위해, 각각 HC 및 LC에 대하여 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6에 의해 제공되는 DNA 서열이 사용될 수 있다.

CDR L1, L3, 및 H2는 카바트(Kabat) 협약에 따라 지정되었고, CDR L2, H1, 및 H3은 노쓰(North) 협약에 따라 지정되었다. 문헌 [Kabat EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]; [North B, et al, J Mol Biol 2011 Feb 18; 406(2): 228-256].

본 발명의 항체의 제조

본 발명의 항체는 널리 공지된 방법에 의해 생합성되고 정제되고, 투여용으로 제제화될 수 있다. 만일 2개의 벡터가 사용된다면, 미리 결정된 HC:LC 벡터 비를 사용하여 항체를 분비하기 위한 발현 시스템으로, 또는 중쇄 및 경쇄, 둘 모두를 코딩하는 단일 벡터 시스템으로 적절한 숙주 세포, 예컨대, HEK 293 또는 CHO를 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염시킨다. 이러한 보편적으로 사용되는 숙주 세포로부터의 항체의 발현 및 분비에 적합한 벡터는 널리 공지되어 있다.

항체 발현 및 분비 후, 배지를 정화시켜 세포를 제거하고, 정화된 배지를 보편적으로 사용되는 많은 기술 중 임의의 것을 사용하여 정제시킨다. 예를 들어, 배지를 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수 (pH 7.4)로 평형화된 프로테인 A(Protein A) 칼럼에 적용시킬 수 있다. 칼럼을 세척하여 비특이 결합 성분을 제거한다. 결합된 항체는 예를 들어, pH 구배 (예컨대, 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 6.8) 내지 0.1 M 시트르산 나트륨 완충제 (pH 2.5))에 의해 용리시킨다. 예컨대, SDS-PAGE에 의해 항체 분획을 검출하고, 풀링한다. 의도된 용도에 따라 추가 정제는 임의적이다. 통상의 기술을 사용하여 항체를 농축시키고/거나, 멸균 여과시킬 수 있다. 항체 이외의 다른 물질, 예컨대, 숙주 세포 및 성장 배지 성분, 및 항체의 가용성 응집체 및 다량체는 크기 배제, 소수성 상호작용, 양이온 교환, 음이온 교환, 친화도, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 비롯한 통상의 기술에 의해 효과적으로 감소 또는 제거될 수 있다. 상기 크로마토그래피 단계 이후 항체의 순도는 전형적으로 95% 초과이다. 생성물을 4℃에서 보관, -70℃에서 냉동할 수 있거나, 또는 동결건조시킬 수 있다.

본원에 기술된 연구에서 사용된 Ab327은, 각각 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6의 DNA 서열을 도입한 별개의 중쇄 및 경쇄 발현 DNA 벡터의 공동 형질감염 후 HEK293 세포에서 일시적으로 발현되었거나, 또는 각각 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6, 둘 모두의 DNA 서열을 도입한 단일 DNA 벡터의 형질감염 후 CHO 세포에서 안정적으로 발현되었다. 5일 HEK293 배양물 또는 14일 CHO 벌크 배양물로부터 수거된 배지를 정화시키고, 생성된 조 상청액은 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Ab327은 프로테인 A 수지에 결합하였고, 이를 저 pH 완충제를 사용하여 용리시켰다. 용리된 항체는, HEK293의 일시적인 형질감염으로부터 제조된 것인 물질인 경우, 분취용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여, 또는 CHO의 안정적인 형질감염으로부터 제조된 물질인 경우, 연마 단계로서 다중 모드 음이온 교환 크로마토그래피 (캡토 어드히어® GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(Capto adhere ® GE Healthcare Life Sciences))를 사용하여 추가로 정제하였다. SDS-PAGE, 분석적 SEC-HPLC, 및 LC/MS 분석에 의해 Ab327의 최종 순도를 평가하였다. 엔도세이프(Endosafe)-PTS 분석을 사용하였을 때, 내독소 수준은 <1 EU/mg인 것으로 나타났다. 정제된 Ab327은 4℃에서 PBS (포스페이트 완충처리된 염수 (pH 7.2)에 보관하였다.

본 발명의 항체의 제약 조성물

단백질 및 항체를 제제화하는 널리 공지된 방법에 따라 정제된 항체를 비경구 투여, 특히, 피하 또는 정맥내 투여를 위한 제약 조성물로 제제화할 수 있다. 항체를 적절한 제약상 허용되는 부형제와 함께 동결건조시키고, 추후에 사용 이전에 물 기반 희석제로 재구성할 수 있다. 대안적으로, 항체를 수용액으로 제제화하고, 사용 전 최대 1 내지 3년 동안 보관할 수 있다. 어느 경우에서든, 보관형 및 주사형의, 항체의 제약 조성물은 아마도 항체 이외의 다른 성분인 제약상 허용되는 부형제 또는 부형제들을 함유할 것이다. 성분이 제약상 허용되는지 여부는 안전성 및 유효성에 미치는 그의 효과, 또는 제약 조성물의 안전성, 순도, 및 효능에 미치는 그의 효과에 의존한다. 성분이 안전성 또는 유효성에 (또는 안전성, 순도, 또는 효능에) 충분하게 바람직하지 못한 효과를 미치는 것으로 판단되고, 이로써 인간에게 투여하기 위한 조성물에 사용될 수 없다고 입증되었다면, 이때 성분은 항체의 제약 조성물에 사용되기에는 제약상 허용되지 않는 것이다.

항체의 용액 조성물은 전형적으로는 물-기반의 것이 될 것이며, 이는 물 이외에도 부형제, 예컨대, 완충화 시스템, 다회 용도인 경우, 보존제, 킬레이팅제, 조성물의 장성을 인간 조직의 것과 비슷하도록 조정하기 위한 등장화제 및/또는 가용화제 또는 가용화제들, 또는 안정화제 또는 안정화제들, 예컨대, 세정제, 계면활성제 등을 함유할 수 있다. 용액으로 장기간 보관하는 데 적합하게 안정한 제제를 달성한다는 것은 매우 큰 도전 과제가 될 수 있다. 예를 들어, pH, 다양한 부형제 포함 (또는 비포함), 및 부형제의 유형 및 농도를 달리함으로써 실험 디자인 방법 사용하여 가용성, 및 화학적 및 물리적 안정성을 개선시킬 수 있다. 약물을 제제화하는 것에 관한 일반 정보의 출처는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy. W]이다. 문헌 [Wang, et al., Antibody Structure, Instability, and Formulation, 96 J. Pharm. Sci. 1-26 (2007)]은 항체 제제화에 대해 도움이 되는 일반 출처이다.

이제 본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 실시양태는 첨부된 도면을 참조로 하여, 단지 비제한적인 실시예 및 검정법에 의해 기술될 것이다.

실시예 1

Ab327을 수득하기 위한 항체 생성, 조작 및 인간화

마우스 발바닥 면역화 및 항-IL-21 가변 영역의 클로닝 후, 마우스 항-인간 IL-21 항체인 15H12를 단리시켰다. 표준 면역화 방법을 사용하여 상업적으로 입수된 인간 IL-21을 이용하여 Balb/c 마우스를 면역화시켰다. 최종 비-애주번트 부스트 후 3 내지 5일 경과하였을 때, 림프절 및/또는 비장을 수거하고, 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 비오티닐화된 또는 형광단 표지된 IL-21을 사용하여 표준 분류 방법에 의해 항원 특이 세포를 강화시키고, 마우스 가변 도메인 클로닝 전 2주 동안 피더 세포와 함께 공동 배양하였다. 항-IL-21 포획 ELISA를 사용하여 항체를 확인하고, 이는 시험관내 검정법에서 IL-21을 차단 및 중화시키며, 그의 K_D는 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21 둘 모두에 대하여 약 5 pM인 것으로 나타났다. Fab 항체 단편을 염소 항-인간 카파 항체로 포획하고, 비오틴 표지된 IL-21에 결합할 수 있는 능력에 대하여 스크리닝하고, 결과적으로 알칼리성 포스파타제 표지된 뉴트라비딘에 의해 검출하였다. 마우스 및 인간 IL-21, 둘 모두에 결합하도록 항체를 추가로 최적화하여 마우스 항체 15M2를 수득하였다. 이를 달성하기 위해, 15H12의 단리된 뮤린 VH 및 VL의 CDR을 돌연변이유발법에 의해 무작위화시키고, 생성된 항체는 ELISA를 사용하여 인간 및 마우스 IL-21에의 결합에 대하여 스크리닝하였다. 이어서, 친화도 증강 돌연변이를 조합하여 15M2를 수득하고, 이어서, 이를 프레임워크 라이브러리 접근법을 사용하여 인간화시켰다. 프레임워크 라이브러리를 위해, 15M2의 CDR을 함유하는, 12개의 인간 VH 프레임워크 생식세포계열 유전자 (1-24, 1-46, 1-69, 2-5, 3-15, 3-23, 3-53, 3-72, 4-04, 4-39, 5-51, 및 6-01) 및 8개의 인간 VL 프레임워크 유전자 (A-19, A-26, A-27, B-2, B-3, L-2, L-12, 및 O-2)를 합성하고, 중쇄 및 경쇄 인간 IgG4 발현 벡터로 클로닝하였다. 96개의 중쇄 및 경쇄 조합 모두로 293 HEK를 일시적으로 형질감염시킨 후, ELISA에 의해 상청액을 플레이트 상에 직접 코팅된 인간 IL-21에의 결합에 대하여, 및 항-인간 카파 항체를 이용한 상청액으로부터의 인간 IgG의 포획 후 용액 중의 비오티닐화된 IL-21에의 결합에 대하여 검정하였다. 발생가능성 및 ELISA 활성을 고려하여, 추가로 최적화시키기 위해 항체 15M2로부터 유래된 CDR을 가지는 인간화 항체를 1-46 중쇄 인간 프레임워크 및 O2 인간 경쇄 프레임워크를 이용하여 선택하였다. 그의 인간 IL-21에 대한 K_D는 약 0.5 pM이었다.

인간화 항체 분석을 통해 경쇄 CDR 탈아미드화 부위 (Asn92) 및 중쇄 CDR 이성질체화 부위 (Asp55)를 확인하였다. 상기의 화학적 분해 핫스팟을 제거하기 위해, 중쇄 Asp55Glu 및 경쇄 Asn92His 돌연변이, 둘 모두를 함유하는 조작된 항체를 생성하였다. 상기 돌연변이로 인해 친화도는 일부, 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21에 대하여 약 2 pM K_D까지 손실되었다. 친화도 손실은 Asp55Glu 돌연변이에 기인하는 것으로 확인되었다. 그 결과, 경쇄 중의 Asn92His 돌연변이와 함께 중쇄 중 Asp55 잔기는 유지시켰다. 합리적인 조작 원리가 중쇄 중의 가까운 이웃 Ser56 잔기를 조작함으로써 추가의 친화도 최적화를 가이드하였다. 이로부터, 동시에 Asp55 이성질체화를 감소시키고, 친화도를 개선시킨 Ser56Val 돌연변이를 함유하는 조작된 항체를 선택하였다. 최종 항체의 친화도는 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21에 대하여 대략 0.5 pM이다. 불변 영역은 인간 IgG4가 되도록 선택하였고, 항체 절반부 형성을 막기 위해 (S225P), 및 이펙터 기능을 감소시키기 위해 (F231A/L232A) 점 돌연변이를 포함하였다. 인 실리코 에피박스(Epivax) 분석 결과, 어떤 식별가능한 뚜렷한 면역원성 핫스팟도 나타나지 않았다. 최종 조작된 인간화 항체 ("Ab327")에 대한 서열 정보는 하기 표 1에 제시되어 있다.

<표 1>

Ab327의 가용성 및 안정성 특징

10 mM 시트레이트, pH 6 (C6) 및 10 mM 시트레이트, pH 6 + 150 mM NaCl (C6N) 제제, 둘 모두에서 가용성 및 안정성에 관한 Ab327의 물리 화학적 특성을 평가하였다. C6 제제의 경우, 가용성은 ≥122.9 mg/mL이고, C6N 제제 중의 가용성은 ≥ 130.9 mg/mL였다. 10 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, 0.02% 트윈 80, pH 6 제제 (C6NT) 중 100 mg/mL에서 Ab327의 점도는 5.8 cP인 것으로 측정되었다.

10 mM 시트레이트, pH 6 완충제 중 25℃에서 4주 후, 화학적 및 물리적 이질성 변화는 Ab327의 경우, 분석적 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 의해 관찰된 바, 주요 피크 면적의 변화는 5% 미만으로 낮았다. 같은 조건하에서, 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 <0.5% 고분자량 (HMW) 응집체 성장이 관찰되었다. 시트레이트, pH 6 안정성 샘플은 40℃에서 4주 후 세포 기반 검정법에서 생체활성의 어떤 손실도 보이지 않았다.

C6 중 4℃, 25℃, 및 40℃에서 4주 후 항체를 CDR 화학적 분해 핫스팟의 특징 규명을 위하여 펩티드 맵핑 LC-MS에 의해 분석하였다. LC-MS 분석 결과, 4℃ 대조군 샘플과 비교하였을 때, 40℃에서 중쇄 CDR 잔기 Asp55의 유의적인 이성질체화는 보이지 않았다. 4℃ 대조군 샘플과 비교하였을 때, 25℃에서 4주 후 다른 공통 CDR 분해가 0.5% 초과로 성장한 것이 확인되었고, 6개의 CDR 간에 통틀어 총 5% 미만이었다.

C6에서의 1 mg/mL 급속 냉동-해동 연구 및 50 mg/mL 저속 냉동-해동 연구를 이용하여 Ab327의 물리적 안정성을 평가하였다. 두 연구 모두를 수행하는 동안, 트윈 80의 존재는 10 ㎛ 크기의 입자의 형성을 감소시켰다. 고농도 연구에서, 150 mM NaCl 염의 존재는 HMW 응집체 형성을 감소시켰다. 저농도 연구의 경우, HMW 응집체는 염 및 트윈 80의 존재하에서 0.7%였다. 결론적으로, 본 시험 결과 Ab327은 인간에서의 연구로 진행하는 데 우수한 용액 특성 (점도, 가용성, 및 안정성 포함)을 가지는 것으로 보였다.

Ab327의 기능적 특성

ELISA에 의한, 인간 IL-21 및 다른 인간 공통-감마 쇄 수용체 패밀리 구성원에의 Ab327의 결합

본 연구의 목적은 공통-감마 (γc) 쇄 수용체 시토카인의 다른 구성원과의 비교로서 인간 IL-21에의 Ab327의 결합 특이성을 측정하고자 하는 것이었다. 시토카인 수용체 γc-쇄 패밀리는 6개의 구성원, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21로 이루어진다. 상기 패밀리의 구성원들은 모두γc 서브유니트를 함유하는 수용체 복합체를 통하여 신호를 전달한다. ELISA를 사용하여 다른 인간 γc 쇄 시토카인 패밀리 구성원에의 결합에 대한 Ab327의 특이성을 측정하였다. 간략하면, Ab327은 염소 항-인간 카파 IgG로 코팅된 ELISA 플레이트 상에 포획되었다. 이어서, 100 nM-780 pM으로 적정된 비오틴으로 표지된 시토카인을 37℃에서 1시간 동안 플레이트에 첨가하고, 알칼리성 포스파타제로 표지된 뉴트라비딘을 사용하여 임의의 결합된 시토카인을 검출하였다. 당나귀 항-염소 IgG로 포획된 IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15에 대한 염소 폴리클로날 항체, 및 IL-2에 대한 상업적으로 이용가능한 마우스 모노클로날 항체는 비오티닐화된 시토카인 결합 및 뉴트라비딘을 이용한 검출 후 양성 신호를 나타내었다. 그러나, Ab327의 경우, 인간 IL-21을 제외하면, 어떤 검출가능한 신호도 관찰되지 않았다 (560 nm에서의 광학 밀도 (OD) 측정으로 제시된 바와 같이, ELISA에 의해 Ab327, 및 인간 공통-감마 쇄 수용체에 결합하는 다른 리간드의 결합을 보여주는 하기 표 2 참조. 도 1 또한 참조). 본 결과는 Ab327이 IL-21에 특이적이며, 이는 다른 인간 γc 쇄 수용체 패밀리 시토카인에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.

<표 2>

인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트 , 및 토끼 IL-21에 대한 Ab327의 결합 친화도

Ab327은 인간 IL-21에 결합하고, 그를 중화시키는 조작된, 인간화 모노클로날 IgG4 항체이다. 본 연구의 목적은 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 및 토끼 IL-21 (서열은 하기에 제시되어 있다)에 대한 Ab327의 결합 친화도를 측정하는 것이었다. 37℃에서 KinExA 3000 장치를 사용하여 이들 각종의 IL-21 종에 대한 Ab327의 겉보기 결합 친화도 (K_D)를 측정하였다. 고정된 항체 농도 프로토콜 및 IL-21의 2배 연속 희석액을 사용하여 KinExA 용액 평형 결합 실험을 수행하였다. 샘플을 분석 전 6-36시간 37℃에서 평형화시켰다. 평형화된 샘플 중 유리 항체를, 딜라이트(Dylight) 649-접합된 항-인간 IgG Fc 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였다. KinExA 프로(KinExA Pro) 소프트웨어를 사용하여 생성된 유리 항체 퍼센트 대 항원 농도 데이터를 "친화도, 표준" 결합 모델로 피팅하고, 최적합 결합 친화도 값 (K_D)을 측정하였다.

표준 편차와 함께 3회의 독립 실험으로부터의 평균 K_D (인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및 래트) 또는 단일 측정으로부터의 상기 (토끼 IL-21)은 하기 표 3에 요약되어 있다 (Ab327의 겉보기 용액 평형 결합 친화도 (K_D)).

<표 3>

Ab327은 37℃에서 각각 0.8±0.5x10^-12 M 및 0.3±0.1x10^-12 M의 평균 (n=3) 친화도로 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21에 결합하였다. Ab327은 각각 2.4±1.3x10^-7 M, 2.3±0.2x10^-7 M, 및 >2x10^-7 M의 친화도로 마우스, 래트, 및 토끼 IL-21에 결합하였다. 토끼 IL-21에의 결합은 등가의 마우스 및 래트 IL-21 샘플에 대하여 관찰된 것보다 작은 결합 신호에 기초하여 추정하였다. 상기 결과에 근거하여, Ab327은 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21에 대해서는 대략 피코몰 수준의 친화도를 가지는 반면, 마우스, 래트, 및 토끼 IL-21에 대해서는 상대적으로 약한 친화도를 가진다.

Ab327은 시험관내 IM9 범-STAT- 루시페라제 리포터 검정법에서 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21을 억제시켰다.

IL-21은 신호 전달 인자 및 전사 활성 인자(Signal Transducer and Activator of Transcription: STAT)의 IL-21-의존적 활성화를 매개하는 JAK-패밀리 단백질 티로신 키나제를 활성화시킨다. IM9 세포를 사용하여 STAT 경로를 활성화시킬 수 있는 IL-21의 능력을 평가하였다. 다발성 골수종을 앓는 환자의 혈액으로부터 유래되고, 천연적으로 IL-21 수용체 (IL-21R) 및 그의 공-수용체 (γc)를 발현하는 EBV-형질전환된 B 림프아구성 세포주인 IM9 세포를 범-STAT-루시페라제 리포터 구축물로 안정적으로 형질감염시켰다. IM9-범 STAT-루시페라제 리포터 검정법을 사용한 본 실험의 목적은 Ab327이 STAT의 IL-21-의존적 활성화를 억제시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이었다.

IM9-범 STAT-루시페라제 세포 (범-STAT 루시페라제 리포터를 포함하는 IM9 세포 서브클론 1B10/3G2)를 플라스크 중 배지 ((RPMI1640, 10% FBS, 1X pen/strep, 범-STAT-루시페라제 리포터 선별을 위해 100 ㎍/mL 제오신(Zeocin)) 중에서 통상적으로 배양하였다. 검정을 위해, 세포를 TC-처리된 플레이트 중에 50,000개의 세포/50 ㎕/웰로 시딩하고, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 상이한 종으로부터의 재조합 IL-21 단백질의 존재하에서 Ab327로 처리하였다. 0 내지 6,670 pM 용량 범위의 Ab327을 평가하였다 (최종 농도는 Ab327의 MW = 150 kDa에 기초하였다). 상이한 종으로부터의 재조합 IL-21을 최종 농도가 66.67 pM (MW = 15 kDa에 기초)이 되도록 각 웰에 첨가하였다. 인간 IL-21R:Fc 키메라 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 번호 991-R2)를 양성 대조군으로서 사용하고, 인간 IgG4를 음성 대조군으로서 사용하였다. 0 내지 47,520 pM 용량 범위의 양성 및 음성 대조군을 평가하였다. 시험은 삼중으로 수행하였다. 96 웰 플레이트를 4시간 동안 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂)에 놓았다. 100 ㎕/웰의 원-글로(One-Glo) 루시페라제 용액을 첨가하여 검정을 종결시켰다. 루미노미터 (퍼킨 엘머 빅토르3(Perkin Elmer Victor3))을 사용하여 플레이트를 판독하였다.

결과는 IC50 (반수 최대 억제 농도)으로 표현하였고, 데이터의 4-파라미터 S자형 피트 (시그마(Sigma) 플롯)를 사용하여 계산한다. 3개의 독립 실험으로부터의 평균 IC50 및 표준 편차는 하기 표 4에 기록되어 있다.

<표 4>

시험된 범위 내에서, Ab327은 용량에 의존하는 방식으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21-유도성 STAT 활성을 완전히 억제시켰다. Ab327에 의한 억제가 양성 대조군 (hIL-21R:Fc)에 대하여 관찰된 것보다 더 컸고, Ab327의 IC50은 46.7 ± 2.4인데 반해, 양성 대조군의 경우, 271 ± 15.6이었다. 이소형 대조군 항체 (hIgG4)는 범-STAT 활성을 억제시키지 못했다 (데이터를 제시하지 않음). 결론적으로, Ab327은 시험관내에서 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-21 활성을 효과적으로 중화시켰지만, 상기 조건하에서 마우스, 래트, 또는 토끼 IL-21 (서열은 상기 제시됨)은 중화시키지 못했다 (N.N.D. = 중화 비검출).

Ab327은 시험관내에서 1차 인간 B 세포의 인간 IL-21-유도성 증식을 중화시켰다.

B 세포의 주요 기능은 병원체를 중화시키고, 제거하는 항체를 생산하는 것이다. 항체 생산 B 세포는 배 중심 (GC) 반응 동안 나이브 B 세포로부터 생성된다. GC는, B 세포가 특이 항원과 조우하고, 성장, 생존, 선택, 및 분화를 위해 T 소포 헬퍼 세포로부터 지시 신호를 받았을 때에 확립된다. B 세포는 상기 신호들 중에서 CD40 및 다수의 시토카인에 의해 자극을 받게 되고, 여기서, IL-21은 증식, 이소형 전환, 형질 세포 분화, 및 항체 분비를 촉진시키는 데 있어 중요한 인자이다. 본 목표는 Ab327이 1차 인간 B 세포의 IL-21-유도성 증식을 억제시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이었다.

다섯 명의 건강한 기증자로부터의 연막을 인디아나 혈액 센터(Indiana Blood Center)로부터 입수하였다. 피콜-플라크(Ficoll-Paque) 구배 분리에 의해 연막으로부터 PBMC를 단리시키고, 항-CD19 자기 비드 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 이용하여 CD19+ B 세포에 대해 양성 선별을 수행하였다. 회수된 집단의 순도는 전형적으로 > 90%였다. 배양된 세포의 증식 반응을 평가하기 위하여, 적절한 자극 인자 (1 mM 피루브산 나트륨, 비필수 아미노산, 10 mM HEPES (pH 7.0), 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신를 함유하는 RPMI-1640/10% FBS)를 포함하는 96 웰 바닥이 평평한 배양 플레이트에서 정제된 CD19+ 세포를 0.5x10⁶개의 세포/mL (0.1x10⁶개의 세포/웰)로 37℃ 및 5% CO₂에서 5일 동안 배양하였다. 단리된 B 세포를 (MW = 15k Da에 기초하여) 3.33 nM의 인간 IL-21 및 2 ㎍/mL 항-인간 CD40 (BD 파르미겐(BD Pharmingen))의 조합과 함께 인큐베이션시켰다. 일정 용량 범위의 Ab327 (0.1 nM 내지 26.7 nM), 인간 IL-21R:Fc 키메라 (0.1 nM 내지 213.3 nM, R&D 시스템즈) 또는 인간 IgG4 (0.1 nM 내지 26.7 nM)를 평가하였다. 배양 개시 시점에 모든 자극제 및 치료를 첨가하였다. 5일 동안 배양한 후, 액체 섬광 계수기를 이용하여 [메틸-3H] 티미딘 흡수를 측정하였다.

결과는 최대 증식의 퍼센트로서 표현하였고, 여기서, 항체 부재하의 IL-21-매개 자극을 100%인 것으로 하였다. 데이터의 4-파라미터 S자형 피트를 사용하여 Ab327에 의해 IL-21-유도성 반응의 50%가 억제된 농도 (IC50)를 계산하였다. Ab327은 용량에 의존하는 방식으로 1차 인간 B 세포의 IL-21-유도성 증식을 억제시켰다. 이러한 억제는 양성 대조군인 인간 IL-21R-Fc 구축물에 대해 관찰된 값보다 훨씬 더 컸으며, 상기 인간 IL-21R-Fc 구축물은 사용된 최고 농도 (26.7 nM)에서도 IL-21-유도성 증식을 완전하게 억제시키지 못했다 (도 2 참조). Ab327에 대해 계산된 IC50은 1.15 ± 0.25 nM (5회 독립 실험의 평균 ± SD)이었다. 음성 대조군 항체 (이소형 대조군 hIgG4)는 1차 B 세포의 IL-21-유도성 증식을 억제시키지 못했다. 하기 표 5는 Ab327이 시험관내에서 1차 인간 B 세포의 인간 IL-21-유도성 증식을 중화시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 수치는 인간 B 세포의 증식 백분율 ±SDEV를 보여주는 것이다. 결론적으로, Ab327은 시험관내에서 1차 인간 B 세포의 IL-21-유도성 증식을 억제시켰다.

<표 5>

^*억제제 농도 (nM)

^** 각 처리에 대한 중량 변화율(%)

Ab327은 시험관내에서 1차 인간 B 세포의 인간 IL-21-유도성 형질 세포 분화를 중화시켰다.

형질모세포로의 B 세포 분화는 항원 및 T 세포에 의해 제공되는 신호의 통합 (CD40-CD40L 상호작용 및 시토카인 생산)에 의해 조절된다. 인간 B 세포 분화에 중요한 시토카인 중 하나는 IL-21이며, 이는 형질 세포 생성 및 활성화된 나이브(naive) 및 기억 B 세포로부터의 항체 분비를 유도한다. IL-21은 활성화된 B 세포 상에서의 CD25 (IL-2R) 발현을 유도하고, 상기 세포를 IL-2의 분화 촉진 효과에 대해 감작화시켜 IL-2와 IL-21 사이에서 공동으로 작동적으로 상호작용이 이루어질 수 있도록 하여 형질모세포 생성 및 항체 분비를 증폭시키는 것으로 밝혀졌다. 본 목표는 Ab327이 시험관내에서 1차 인간 B 세포의 형질 세포로의 IL-21-유도성 분화를 억제시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이었다.

연막을 상기 기술된 바와 같이 입수하였다. 적절한 자극 인자 (1 mM 피루브산 나트륨, 비필수 아미노산, 10 mM HEPES (pH 7.0), 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신를 함유하는 RPMI-1640/10% FBS)를 포함하는 96 웰 바닥이 평평한 배양 플레이트에서 정제된 B 세포를 0.75x10⁶개의 세포/mL (0.15x10⁶개의 세포/웰)로 37℃ 및 5% CO₂에서 6일 동안 배양하였다. 단리된 B 세포를 3.33 nM 인간 IL-21, 1 ㎍/mL 항-인간 CD40 (BD 파르미겐), 100 U/mL의 인간 IL-2 (프로류킨(Proleukin), 한나스 파마슈티칼 서플라이 컴퍼니(Hanna's Pharmaceutical Supply Co.)) 및/또는 26.7 nM Ab327 또는 26.7 nM의 인간 IgG4 항체 (음성 대조군)의 조합과 함께 인큐베이션시켰다. 배양 후 6일째, 세포를 염색 완충제 (2% FBS/PBS)로 세척하고, 인간 CD38, IgD, CD19, CD27에 대해 특이적인 항체 (모두 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)로부터 입수)와 함께 4℃에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. FC-500 유세포 분석기 (벡크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 5-색상 유세포 분석법 분석을 수행하였다. 고수준의 CD38 및 저수준의 IgD를 발현하는 세포로서 형질 세포를 확인하였다 (하기 표 6 참조).

기증자 사이에 변동성이 높기 때문에, 하기 제시하는 결과는 IL-21의 첨가에 의해 유도된 형질 세포 (CD38 고수준 + IgD 저수준인 세포)의 상대적인 개수의 증가 배수로서 표현하였고, 여기서, 배지 + 항-CD40 + IL-2 중의 각 기증자로부터 유래된 형질 세포에 대한 값을 일 (1)로 설정하였다. 데이터는 5명의 건강한 기증자로부터의 1차 인간 B 세포에 대해 미치는 효과에 대한 "증가 배수"로서 제시되어 있다.

<표 6>

항-CD40 및 IL-2의 조합과 함께 배양된 신선한 B 세포는 CD38 고수준/IgD 저수준의 형질 세포를 거의 함유하지 않았다. 그에 반해, IL-21의 존재하에서 항-CD40 및 IL-2로 정제된 B 세포를 공동 자극시켰을 때에는 그 결과로서 형질 세포로 상당한 분화가 일어났다. 음성 대조군 항체 (이소형 hIgG4)는 IL-21 활성을 억제시키지 못했다. Ab327은 1차 인간 B 세포의 IL-21-유도성 형질 세포 분화를 억제시켰다 (n=5 기증자, p=0.008, 독립표본 t-검정 Ab327 대 IgG4 이소형 항체). 결론적으로, Ab327은 시험관내에서 인간 IL-21-유도성 형질 세포 분화를 억제시켰다.

Ab327은 마우스에서 인간 IL-21 활성을 중화시켰다.

IL-21을 마우스 내로 주사하면, 특이 마커를 사용하여 뚜렷하게 확인되는 (B 및 T 세포의 서브집단을 포함하는) 비장내 여러 세포 유형이 신속하게 및 일시적으로 확장된다. 본 실험의 목표는 Ab327이 마우스에서 인간 IL-21의 생물학적 활성을 억제시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이었다.

1일째 Ab327 (1 mg/마우스) 또는 이소형 (hIgG4, 1 mg/마우스) 대조군 항체를 8 내지 10주령된 암컷 C57Bl6 마우스 (n=5/군)에 복강내로 주사하였다. 2일째 및 3일째, 마우스는 1일당 마우스 1마리당 50 ㎍의 재조합 인간 IL-21 또는 PBS를 i.p. 주사로 받았다. 4일째, 비장 세포의 세포 현탁액을 제조하고, 적혈구 용해 후, 세포의 총 개수를 측정하였다. 유세포 분석법에 의해 세포 표면 마커 Gr-1 및 Sca-1을 사용하여 IL-21-반응성 세포의 상대적인 백분율을 측정하였다. IL-21-반응성 세포 (Gr-1 저 Sca-1+ 세포)의 백분율에 비장 중 세포의 총 개수를 곱하여 비장당 IL-21-반응성 세포의 총 개수를 계산하였다.

하기 표 7의 결과는 5마리의 마우스 각각의 비장 중 IL-21 반응성 세포의 총 개수 (x10⁶개)로 제시된 것이다.

<표 7>

인간 IL-21의 주사로 IL-21 반응성 세포가 증가하였다. 음성 대조군 항체를 받은 동물과 비교하였을 때, Ab327의 존재가 상기 세포의 개수를 감소시켰다 (p<0.0001, 독립표본 t-검정 Ab327 + IL-21 대 IgG4 + IL-21 및 IgG4 + PBS 대 IgG4 + IL-21). 각 군내에서 Ab327 및 음성 대조군 항체에의 노출을 정량적 ELISA에 의해 확인하였다. Ab327이 생체내에서 인간 IL-21의 생물학적 활성을 효과적으로 중화시켰다는 결론을 얻었다.

Ab327은 NGS 마우스에서 인간 T 세포 활성화의 생체내 모델에서의 효능을 입증하였다.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)가 심하게 면역손상된 NSG 마우스 (NOD-scid IL-2Rγ 널; Hippen KL, et al. Blocking IL-21 signaling ameliorates xenogeneic GVHD induced by human lymphocytes. Blood 2012; 119: 619) 내로 생착된 인간 T-세포 활성화 모델에서 인간 IL-21을 중화시키는 것이 질환 진행을 막는다는 것이 앞서 밝혀졌다. NSG 마우스에는 T, B 및 NK 세포가 부족하고, 또한 대식세포 및 수지상 세포의 기능도 감소되어 있다. 인간 PBMC를 이식하면, 현성 인간 T-세포 활성화 및 그의 마우스 피부, 간, 장, 폐, 및 신장 내로의 침윤이 일어나게 된다. 이는 소모성 증후군을 동반하고, 결국에는 사망에 이르게 한다 (Hippen, 2012). 이 모델의 장점은 질환이 인간 면역 세포 및 인간 시토카인에 의해 유도되며, 이로써, 다른 종에 대한 교차 반응성이 부족한 항체에 대한 정보를 생체내에서 얻을 수 있다는 점이다. 본 연구의 목적은 예방 모드 (생착 시점을 시작으로 투여) 또는 치료 모드 (생착 후 21일째를 시작으로 투여)로 투여되었을 때, 인간 T-세포 활성화 모델에서의 Ab327의 생체내 효능 및 질환 변경 활성을 입증하고자 하는 것이었다.

생착 이전에, 암컷 NSG 마우스를 기준선 체중 측정값에 기초하여 군으로 나누었다 (n=10/군). 0일째, 샌디에고 혈액 은행(San Diego Blood bank)으로부터 입수한 연막으로부터 단리된 10⁷개의 인간 PBMC를 마우스에 정맥내로 주사하였다. 예방 모드의 경우 (도 3), 생착 시점에 및 이후 매주 1회에 걸쳐 마우스에 1 또는 10 mg/kg Ab327, 또는 10 mg/kg hIgG4 이소형 대조군 항체를 피하로 투약하였다. 주 2-3회에 걸쳐 체중을 측정하고, 일반적인 외관 및 건강을 모니터링하였다. 19일째, 꼬리 절개에 의해 혈액을 수득하고, 유세포 분석법에 의해 인간 CD45+ 세포 생착에 대하여 분석하였다. 치료 모드의 경우 (도 4), 어떤 처리도 받지 않은 동물을 유세포 분석법 데이터 및 체중에 기초하여 매칭되는 코호트 군으로 재배정하였다. 생착 후 21일째, 10 mg/kg Ab327 또는 10 mg/kg hIgG4 이소형 대조군 항체를 마우스에 피하로 투약하고, 이후 매주 1회에 걸쳐 이를 수행하였다. 4마리의 비-생착 마우스는 "비처리 대조군 또는 비-생착" 마우스로서 포함하였다. 기준선 체중의 백분율로서 체중 변화를 계산하였다 ((x)일째 체중/0일째 체중 * 100). 결과는 시간 경과에 따른 기준선으로부터의 체중 변화율(%)로서 제시되어 있다.

예방 모드의 경우, 인간 이소형 대조군 항체로 처리된 마우스 (도 3 참조, 개방형 사각형 표시)에서는 일찍이 세포 이식 후 20일째에 소모성 표현형이 발생하였다. 이식 후 45일째, 이소형 대조군에서의 평균 체중 소모량은 기준선으로부터 10%를 초과하였고, 대다수의 마우스는 고통스러운 상태에 있었고, 이에 본 연구를 종결지었다. 생착 당일에 개시된 (예방 모드) 10 mg/kg/주 Ab327을 이용한 처리 (도 3, 닫힌 사각형 표시)는 소모성 표현형을 완전하게 폐지시켰다. 비-생착 마우스와 유사하게 마우스의 체중은 계속해서 증가하였다. 그의 체중은 이소형 대조군과 통계학상 유의하게 상이하였다 (각각 p=0.000846 및 p < 0.001 Ab327 대 이소형 및 비-생착 마우스 대 이소형, 2원 ANOVA, 반복 측정). 1 mg/kg/주 용량의 Ab327 (도 3, 닫힌 삼각형 표시)은, 체중 손실 진행을 저속화시킨 것으로 보였다는 점에서 부분적인 효과를 미쳤다. 그러나, 상기 군에서 마우스의 체중은 이소형 대조군과 통계학상 상이하지 않았다. 하기 표 8은 45일 동안 IL-21 항체 또는 이소형 대조군 항체로 처리된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)가 생착된 심하게 면역손상된 NSG 마우스 (NOD-scid IL-2Rγ 널)에서의 기준선으로부터의 평균 체중 변화율(%) ± SDEV를 보여주는 것이다. 치료는 PBMC 생착과 동시에 시작하였다. Ab327 10 mg/kg 군과 이소형 대조군 사이에는 유의적인 차이가 있었다.

<표 8>

^** 각 처리에 대한 체중 변화율(%)

^*** 생착 후 경과일수

상기 언급한 바와 같이, 인간 PBMC 투여는 생착 후 대략 20일째를 시작으로 소모성 질환을 일으켰다. 인간 IL-21 차단이 계속해서 진행되는 악화되어가고 있는 질환을 중단시킬 수 있는지 (치료 모드) 여부를 조사하기 위해, 마우스를 생착 후 21일째를 시작으로 10 mg/kg/주 Ab327 또는 hIgG4 이소형 대조군으로 처리하였다. 도 4에 제시되어 있는 바와 같이, 인간 IgG4 이소형 대조군 항체 (개방형 사각형 표시)를 투약받은 마우스는 계속해서 체중 손실이 일어났다. 한편, 질환 발병 후 개시된 (생착 후 21일째, 도 4, 닫힌 사각형 표시) Ab327 처리는 소모성 표현형을 약화시키는 데 효과적이었다. 상기 군에서 평균 체중은 이소형 대조군과 통계학상 유의하게 상이하였다 (p=0.042, 2원 ANOVA, 반복 측정). 체중 손실 및 질환 중증도에 있어서의 차이는 인간 세포의 마우스 내로의 생착의 차이에 기인하는 것이 아니었다. 연구 종료시 비장 중의 인간 세포 뿐만 아니라, 말초 인간 CD45+ 세포는 이소형 대조군 처리된 동물과 비교하였을 때 Ab327 처리된 마우스에서 약간 더 높았다. 요약컨대, Ab327은 생체내 T-세포 활성화의 이종계 모델에서의 효능 및 질환 변경 활성을 입증하였다. 하기 표 9는 IL-21 항체 또는 이소형 대조군 항체로 처리된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)가 생착된 심하게 면역손상된 NSG 마우스 (NOD-scid IL-2Rγ 널)에서의 21일째로부터의 평균 체중 변화율(%) ± SDEV를 보여주는 것이다. 처리는 21일째 시작하였다. Ab327 10 mg/kg 군과 이소형 대조군 사이에는 유의적인 차이가 있었었다.

<표 9>

^** 각 처리에 대한 체중 변화율(%)

^*** 생착 후 경과일수

Ab327의 약동학적 성질

수컷 시노몰구스 원숭이에서 단일 정맥내 또는 피하 3 mg/kg 투약 후 Ab327의 약동학적 성질을 특징 규명하였다. 투약 후 1,008시간째 (6주)까지 혈청 샘플을 수집하였다. 2가지 ELISA 방법 (총 인간 IgG 또는 항원 포획)를 사용하여 항체를 정량화한 후, 농도-시간 프로파일을 작성하였다. 총 인간 IgG 방법은 ELISA 포맷을 사용하여 항-IL-21 항체의 농도를 측정한다. 마이크로타이터 플레이트 상에 고정화된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG (코팅 Ab)와 함께 표준, 대조군, 및 시험 샘플을 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 마우스 항-인간 IgG4-HRP (호스래디쉬 퍼옥시다제)를 웰에 첨가하였다. 일단 비결합 효소를 세척하여 제거하고 나면, 슈어블루(SureBlue)® TMB (테트라메틸벤지딘) 기질 용액을 웰에 첨가하였다. 산성 용액을 첨가하여 발색을 중단시키고, 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였고, 여기서, 파장 보정은 650 nm로 설정하였다.

항원 포획 방법은 ELISA 포맷을 사용하여 항-IL-21 항체의 농도를 측정한다. 스트렙트아비딘 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상에 고정화된 인간 IL-21-비오틴과 함께 표준, 대조군, 및 시험 샘플을 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 마우스 항-인간 IgG4-HRP (호스래디쉬 퍼옥시다제)를 웰에 첨가하였다. 일단 비결합 효소를 세척하여 제거하고 나면, 슈어블루® TMB (테트라메틸벤지딘) 기질 용액을 웰에 첨가하였다. 산성 용액을 첨가하여 발색을 중단시키고, 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였고, 여기서, 파장 보정은 650 nm로 설정하였다. 검정 범위는 5-500 ng/mL였다.

약동학적 결과 (평균)는 하기 표 10 및 표 11에 제시되어 있다. 각 군 중의 동물의 마리수는 2마리였다.

<표 10>

IV 투여 값

약어 = t1/2 - 반감기, AUC0-t - 0부터 마지막 측정가능한 농도까지의 곡선하 면적, AUC0-inf - 0부터 무한대까지의 곡선하 면적, 외삽 AUC(%) - 마지막 측정가능한 농도로부터 무한대까지의 외삽에 기인한 AUC0-inf의 백분율, CLss - 전신 청소율 추정치, Vss - 항정 상태(steady-state)에서 분포 부피 추정치. *말기 반감기는 72-168시간에 계산하였다.

<표 11>

피하 투여 값

약어 = t1/2 - 반감기, Tmax - 최대 농도일 때의 시간, Cmax - 최대 농도, AUC0-t - 0부터 마지막 측정가능한 농도까지의 곡선하 면적, AUC0-inf - 0부터 무한대까지의 곡선하 면적, 외삽 AUC(%) - 마지막 측정가능한 농도로부터 무한대까지의 외삽에 기인한 AUC0-inf의 백분율, CLss/F - 청소율/생체이용률, F% - 참조로서 평균 3 mg/kg i.v. 투약을 이용한 생체이용률 = (AUC0-inf s.c./AUC0-inf i.v.)/(투약-iv/투약-s.c.)*100. *말기 반감기는 96-336시간에 계산하였다.

시노몰구스 원숭이에게로의 Ab327의 단일 정맥내 또는 피하 투여 후, 농도-시간 프로파일은 항-약물 항체 (ADA) 형성을 시사하였고, ADA는 4마리 원숭이 중 4마리에서 확인되었다. 평균 말기 반감기는 105-249시간이었고, ADA의 유의적인 영향을 피하기 위해 72-168시간의 기울기로부터 계산하였다. 평균 청소율은 0.43-0.48 ml/h/kg으로, 이는 전형적인 모노클로날 항체 청소율 범위인 0.2-0.4 ml/h/kg의 바로 밖에 있다.

피하 투여 후, 생체이용률은 72-74%로, 이는 모노클로날 항체에 대한 전형적인 범위 (50-100%) 안에 있다. ADA 형성에도 불구하고, 원숭이에서의 Ab327의 약동학적 성질은 가용성 리간드에 결합하는 모노클로날 항체에 대해 예상되는 것과 비교적 유사하였고, 여기서, 청소율은 정상인 것보다 약간 더 높았다.

본 연구에 근거하여, Ab327은 인간에서 인간화 IgG4 항체에 대해 예상되는 범위 내의 약동학적 성질을 가질 것이라고 결론지었다. 원숭이 청소율의 상대 알로메트릭 스케일링에 기초하면, 예상된 인간 청소율은 0.3 mL/hr/kg (70 kg 인간에서 0.02 L/h)이고, 생체이용률은 인간에서 50-75%인 것으로 예상된다.

항-마우스 IL-21 항체 처리가 NOD 마우스의 침샘에서 림프구 침윤을 완화시켰다 .

Ab327은 설치류 IL-21을 중화시키지 않기 때문에, 임상전 질환 모델에서 사용하기 위해 대용 분자를 개발하였다. 항체 Ab728은 마우스 IL-21에 특이적으로 결합하는 뮤린 IgG1 모노클로날 항체이다. 뮤린 IL-21의 Ab728에의 결합 친화도는 1 pM이다. Ab728은 생체내 및 시험관내 검정법에서 뮤린 IL-21을 완전하게 중화시킬 수 있었다.

비-비만성 당뇨병 (NOD) 마우스는 그의 침샘에서 림프구 침윤이 자발적으로 발생하기 때문에 쇼그렌 증후군의 모델로서 널리 사용된다. 이전 연구 결과, IL-21 shRNA 렌티바이러스를 가진 NOD 마우스의 턱밑샘 중의 IL-21 수준의 국소 억제가 쇼그렌 증후군-유사 증상의 발생을 지연시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다 (Liu H, et al. Local suppression of IL-21 in submandibular glands retards the development of Sjoegren's syndrome in non-obese diabetic mice. J Oral Pathol Med 2012; 41:728). 본 실험의 목표는 Ab327의 대용물인 Ab728의 전신 투여가 NOD 마우스에서 쇼그렌 증후군 발생을 예방 또는 약화시킬 수 있는지 여부를 조사하는 것이었다.

암컷 NOD 마우스를 7주령째를 시작으로 Ab728 또는 이소형 대조군 mIgG1 (20 mg/kg/주)로 처리하였다. 18주령째에 마우스를 희생시키고, 침샘을 수거하였다. 침샘 조각을 1.6% PFA 20% 수크로스를 이용하여 4℃에서 밤새도록 고정시키고, OCT에 포매시키고, 면역형광에 의해 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 또 다른 조각은 mRNA 연구를 위하여 액체 질소에서 냉동시켰다.

NOD 마우스에서 대략 8주령째부터 계속해서 턱밑 침샘 및 눈물샘에서 국소 염증이 발생하였다. 병소는 일부 인간 침샘에서 발견되는 침윤물과 구조 및 세포 조성이 유사한 것으로 보였고, T 및 B 세포도 존재하였다. 항-IL-21 처리가 NOD 침샘에서 림프구 침윤을 완화시키는지 여부를 조사하기 위해, 면역형광 염색을 수행하였다. 간략하면, 8 ㎛의 냉동된 침샘 절편을 PBS로 세척하고, 정제된 1차 항체와 함께 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시킨 후, 적절히 표지된 2차 항체와 함께 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 1차 항체는 BD 바이오사이언시즈로부터의 항-CD3 (T 세포) 및 항-B220 (B 세포)이었다. 2차 항체는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-래트 IgG 및 딜라이트 594 염소 항-아르메니아 햄스터(Armenian hamster) (잭슨 이뮤노리서치 라보라토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories)로부터)였다. 세포의 핵을 식별하기 위해 DAPI를 사용하였다.

mIgG1 대조군 항체로 처리된 NOD 마우스에서는 쇼그렌 증후군 환자에서 발견되는 림프구 병소와 유사하게 고도로 조직화된 T 및 B 림프구 (도 6)와 함께 관주위 응집체로서 배열된 전형적인 림프단핵구성 침윤물이 존재하는 것으로 나타났다. Ab728 처리는 관찰되는 병소의 개수 뿐만 아니라, 그 크기도 효과적으로 감소시켰다.

쇼그렌 증후군에서 림프구양 응집체의 발생은 림프구양 케모카인 CXCL13 및 그의 동족 수용체 CXCR5의 이소성 생산에 의해 조절되며, 이는 B 세포 및 CD4+ T 소포 헬퍼 (TFH) 세포의 배 중심 구조로의 재순환 및 위치 결정을 조절하는 것으로 여겨진다. IL-21이 TFH 및 배 중심 구조의 유지에 관여하는 것으로 밝혀졌다. IL-21은 또한 CD8+ T 림프구의 활성화를 제어하고, 이는 퍼포린 및 그랜자임을 통해 표적 세포를 파괴시키는 것으로 여겨진다. 항-IL-21 처리가 상기 마커의 발현을 감소시키는지 여부를 조사하기 위해, 트리졸(Trizol)에서 균질화한 후, RN이지 미니 키트(RNeasy Mini kit) (퀴아젠 인크.((Qiagen, Inc.))에 의해 냉동된 침샘으로부터 전체 RNA를 단리시켰다. 분광광도법에 의한 260 nm에서의 흡광도로부터 RNA 농도를 측정하였다. 하이-캐퍼시 cDNA 역전사 키트(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit) (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems))를 이용하여 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 모든 반응은 삼중으로 수행하여 검정되는 mRNA의 상대 흡광도를 측정하였다. IL-21 (Mm00517640_m1), CXCR5 (Mm00432086_m1), CXCL13 (Mm04214185_s1), CCR9 (Mm02620030_s1), 그랜자임 B (Mm00442834_m1) 및 CD8 (Mm01182107_g1)에 대한 프라이머 프로브 세트는 PE 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수하였다. 유전자 발현 수준에서의 변동성을 정규화하기 위해 GusB (Mm00446956_m1)를 내인성 대조군으로서 측정하였다. 델타 Ct(Delta Ct) 방법을 이용하여 발현 데이터를 분석하였다. 개별 Ct 값은 삼중 측정치의 평균으로서 계산하였다.

mIgG1 대조군 항체 처리된 마우스와 비교하였을 때, Ab728 처리된 마우스에서 CXCL13, CXCR5, IL-21, CD8 및 그랜자임 B mRNA 전사체가 통계학상 유의하게 하향조절되었다. 도 5는 마우스의 침샘에서의 mRNA 분석을 보여주는 것이다. 처리가 질환에 관여하는 단백질의 발현을 조절한다는 것을 알 수 있다. 요약컨대, 항-마우스 IL-21 항체 (Ab728) 투여가 침샘으로의 림프구 침윤을 감소시켰고, NOD 마우스의 SS-유사 증상의 발생을 지연시켰다.

항- mIL -21 ( Ab728 ) 처리가 NOD 마우스에서 당뇨병을 예방한다.

Ab728은 마우스 IL-21에 특이적으로 결합하는 뮤린 IgG1 모노클로날 항체이다. 뮤린 IL-21의 대용 Ab728에의 결합 친화도는 1 pM이다. Ab728은 생체내 및 시험관내 검정법에서 뮤린 IL-21을 완전하게 중화시킬 수 있었다.

인간 I형 당뇨병은 췌장의 랑게르한스섬에서의 인슐린-생산-베타 세포의 자가 반응성 파괴로부터 발생되는 자가면역 질환으로서, 이는 추후 인슐린 생산의 손실을 초래한다. 비-비만성 당뇨병 (NOD)을 앓는 마우스 계통에서 유사 질환이 발생하며, 이는 또한 자가면역 반응의 개시 및 전파에 관여하는 기전 연구를 위한 모델 시스템으로서의 역할을 한다. 조직학적 연구 결과, 수컷 및 암컷 마우스, 둘 모두가 섬 주변에서 (췌도염 주변) 단핵구 침윤물을 보이기 시작하는 때인 대략 3 내지 4주령째까지는 섬에서 면역 세포 침윤물이 거의 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 상기 침윤물은 진행하여 섬으로 침습하고 (췌도염), 이어서, 대략 12주령째를 시작으로 과혈당증 및 완전히 진행된 당뇨병이 발생하게 된다.

이전 연구 결과, NOD 마우스 에서 IL-21 신호전달의 결실이 질환 발생을 거의 완전하게 폐기시키는 것으로 나타났다 (Spolski R, et al. IL-21 signaling is critical for the development of type I diabetes in the NOD mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:14028, 2008). 본 실험의 목적은 Ab728의 전신 투여가 NOD 마우스에서 당뇨병 발생을 예방 또는 약화시킬 수 있는지 여부를 조사하는 것이었다.

암컷 NOD 마우스를 질환 진행에서 상이한 기간에 Ab728 또는 이소형 대조군 mIgG1 (20 mg/kg/주)로 처리하였다. 한 군의 마우스는 7주령째에 (예방 연구, 도 7a) 처리를 시작하였고, 또 다른 군의 동물은 13주령째에 (후기 임상전 단계, 도 7b) 처리를 시작하였다. 상기 두 상황 모두에서, 마우스가 37주령째가 될 때까지 당뇨병 발생을 위해 마우스를 진행시켰다. 당뇨병 발생을 추적하기 위해, 매주 혈당 수준을 모니터링하고, 2회 연속 측정에서 혈당이 250 mg/dl를 초과할 경우, 동물은 당뇨병인 것으로 간주하였다. 정량적 ELISA에 의해 Ab728에의 노출을 확인하였다.

mIgG1 대조군 항체로 처리된 NOD 마우스의 경우, 13-15주령째에 당뇨병이 발생하기 시작하였고, 마우스 중 75%가 37주령째까지 현성 당뇨병으로 진행되었다 (예방의 경우, 마우스 12마리 중 9마리, 후기 임상전 단계의 경우, 마우스 8마리 중 6마리 - 도 7a 및 도 7b 참조). 그에 반해, 항-IL-21 처리는 당뇨병 진행을 유의하게 지연시켰다. 7주령째에 처리를 시작하였을 때에는 마우스 12마리 중 단 1마리에서만 당뇨병이 발생하였고 (8%, 도 7a, p=0.0007), 후기 임상전 단계 동안 처리를 시작하였을 때에는 마우스 11마리중 단 1마리에서만 현성 당뇨병으로 진행되었다 (9%, 도 7b, p=0.002).

요약컨대, 항-마우스 IL-21 항체 (Ab728)의 투여가 NOD 마우스에서 당뇨병 발생을 효과적으로 예방하였다.

서열

Ab327 아미노산 서열

실시예 및 검정법에서는 하기 서열을 사용하였다.

인간 IL- 21 - 유니프로트KB(UniprotKB)/스위스-프로트(Swiss-Prot) 데이터베이스 엔트리 번호 Q9HBE4

CYNO IL- 21 - - 서열은 사내(in-house)에서 클로닝되었으며; 공개 데이터베이스에서 이용불가능하였다

마우스 IL- 21 - 유니프로트KB/스위스-프로트 데이터베이스 엔트리 번호 Q9ES17

래트 IL- 21 - 유니프로트KB/스위스-프로트 데이터베이스 엔트리 번호 A3QPB9

토끼 IL-21 - (시판용 시약 - R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 7274-RB/CF)

Ab327을 발현하는 DNA

<110> Eli Lilly and Company <120> IL-21 ANTIBODIES <130> X20141 <150> 61/968550 <151> 2014-03-21 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Page 1 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser 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Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Page 3 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 4 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 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agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatggg 300 cccctggcta tggactactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag gccgccgggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctctgggt 1329 <210> 6 Page 5 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 6 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattac acatcaagat tacactcagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag tttcacacgc ttcggacgtt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaaag aactgtggcg gcgccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatccgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgc 639 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 7 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 8 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 9 Page 6 Gln Gln Phe His Thr Leu Arg Thr 1 5 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 10 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 11 Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 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sequence. <400> 14 Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp 1 5 10 15 Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Asp Pro Glu Phe Leu Pro Ala 20 25 30 Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Ile Ser Cys Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile 50 55 60 Ile Asn Leu Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Ser Pro Ser Thr Gly 65 70 75 80 Ala Glu Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser 85 90 95 Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu 100 105 110 Page 8 Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser 115 120 125 Glu Asp Ser 130 <210> 15 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This protein was recombinantly produced and is identical to the mus musculus sequence. <400> 15 His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu Arg 1 5 10 15 His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp Leu 20 25 30 Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly 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Met Ala 85 90 95 Lys Cys Pro Ser Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Lys Thr Pro Lys Glu Phe 100 105 110 Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu 115 120 125 Ser <210> 17 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This protein was recombinantly produced and is identical to the oryctolagus cuniculus sequence. <400> 17 His Lys Ser Ser Ser Lys Gly Gln Asp Arg Tyr Met Ile Arg Met His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Asp Ile Val Asp Gln Leu Gln Ser Asp Val Asn Asp Leu 20 25 30 Asp Pro Asp Phe Leu Pro Ala Pro Gln Asp Val Gln Lys Gly Cys Glu 35 40 45 Gln Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Pro Ala Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Asn Gly Lys Arg Ile Ser Ser Leu Ile Lys Gln Leu Lys 65 70 75 80 Arg Lys Leu Pro Ser Thr Lys Ser Lys Lys Thr Gln Lys His Arg Pro 85 90 95 Page 10 Thr Cys Pro Ser Cys Tyr Ser Tyr Glu Lys Lys Asn Leu Lys Glu Phe 100 105 110 Leu Glu Arg Leu Lys Ser Leu Ile Gln Lys Met Ile His Gln His Leu 115 120 125 Leu Glu His Leu Arg 130 Page 11

Claims

중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하며, 여기서 LCVR은 CDRL1에 서열식별번호(SEQ ID NO): 7, CDRL2에 서열식별번호: 8, 및 CDRL3에 서열식별번호: 9를 포함하고, HCVR은 CDRH1에 서열식별번호: 10, CDRH2에 서열식별번호: 11, 및 CDRH3에 서열식별번호: 12를 포함하는 것인, 인간 IL-21에 결합하는 항체.
제1항에 있어서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 1을 가지는 HCVR을 포함하고, 경쇄는 서열식별번호: 2를 가지는 LCVR을 포함하는 것인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지고, 여기서 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 서열이고, 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 서열인 항체.
제1항에 있어서, 각 중쇄의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 서열이고, 각 경쇄의 아미노산 서열이 서열식별번호: 4의 서열인 항체.
서열식별번호: 3의 서열인 아미노산 서열을 갖는 항체 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자.
제5항에 있어서, 항체 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 서열식별번호: 5의 서열인 DNA 분자.
서열식별번호: 4의 서열인 아미노산 서열을 갖는 항체 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자.
제7항에 있어서, 항체 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 서열식별번호: 6의 서열인 DNA 분자.
서열식별번호: 3의 서열인 아미노산 서열을 갖는 항체 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 서열식별번호: 4의 서열인 아미노산 서열을 갖는 항체 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자.
제9항에 있어서, 항체 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 서열식별번호: 5의 서열이고, 항체 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 서열식별번호: 6의 서열인 DNA 분자.
제5항 또는 제6항의 DNA 분자, 및 제7항 또는 제9항의 DNA 분자로 형질전환된 포유동물 세포이며, 여기서 형질전환된 포유동물 세포는 2개의 항체 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 중쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 서열이고, 2개의 경쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4의 서열인, 형질전환된 포유동물 세포.
제9항 또는 제10항의 DNA 분자로 형질전환된 포유동물 세포이며, 여기서 형질전환된 포유동물 세포는 2개의 항체 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 중쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 서열이고, 2개의 경쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4의 서열인, 형질전환된 포유동물 세포.
2개의 항체 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체를 제조하는 방법이며, 여기서 2개의 중쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 서열이고, 2개의 경쇄 각각의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4의 서열이며,
a. 항체가 발현되도록 하는 조건하에서 제11항의 포유동물 세포를 배양하는 단계, 및
b. 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 항체를 제조하는 방법.
제13항의 방법에 의해 수득가능한 항체.
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유효 용량의 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 환자에서 자가면역 병태의 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
유효 용량의 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 환자에서 원발성 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 그레이브스병, 또는 1형 당뇨병의 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
유효 용량의 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 환자에서 원발성 쇼그렌 증후군 또는 쇼그렌 증후군의 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
유효 용량의 제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 환자에서 전신 홍반성 루푸스의 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
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