KR101133799B1 - 폴리뉴클레오타이드의 생체내 전달을 위한 다가접합체 - Google Patents

폴리뉴클레오타이드의 생체내 전달을 위한 다가접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 세포 불투과성 분자를 포유동물 세포에 전달하기에 유용한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 표적화, 항-옵소닌화, 항-응집 및 형질감염 활성을 작은 생체적합성 생체내 전달 비히클 내로 도입하는 다가접합체 시스템이 기재되어 있다. 구성요소들을 연결하는 다수의 가역적 연결의 사용은 생리학적 반응 활성 조절을 제공한다.

Description

폴리뉴클레오타이드의 생체내 전달을 위한 다가접합체{POLYCONJUGATES FOR IN VIVO DELIVERY OF POLYNUCLEOTIDES}
본원은 2006년 8월 18일 출원된 미국 가출원 제60/822,833호 및 2007년 5월 3일 출원된 미국 가출원 제60/915,868호를 우선권 주장한다.
폴리뉴클레오타이드 및 다른 막 불투과성 화합물의 생존 세포 내로의 전달은 세포의 복합체 막 시스템에 의해 고도로 제한된다. 안티센스 및 유전자 요법에서 사용되는 약물은 비교적 큰 친수성 중합체이고 종종 고도로 음으로 하전되어 있기도 하다. 이 물성들 둘다가 세포막을 통한 약물의 직접적 확산을 방해한다. 이러한 이유로, 폴리뉴클레오타이드 전달의 주요 장벽은 폴리뉴클레오타이드의 세포 내부로의 전달이다. 다수의 형질감염제가 폴리뉴클레오타이드를 시험관내 세포로 전달하기 위해 개발되었다. 그러나, 폴리뉴클레오타이드의 생체내 전달은 독성, 혈청 상호작용, 및 시험관 내에서 효과적인 형질감염제의 약한 표적화에 의해 곤란해진다. 시험관 내에서 잘 작동하는 형질감염제, 양이온성 중합체 및 지질은 전형적으로 세포막을 불안정화시키고 큰 입자를 형성한다. 형질감염제의 양전하는 핵산 결합 및 세포 결합을 촉진한다. 막의 불안정화는 세포막을 통한 막 불투과성 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진한다. 이 성질은 형질감염제가 생체 내에서 비효과 적이게 하거나 독성을 띠게 한다. 양전하는 혈청 성분과의 상호작용을 초래하고, 이것은 폴리뉴클레오타이드-형질감염제 상호작용의 불안정화 및 낮은 생체이용률 및 표적화를 야기한다. 양전하는 생체내 독성을 이끌어낼 수도 있다. 시험관 내에서 효과적인 형질감염제의 막 활성은 종종 생체 내에서 독성을 이끌어 낸다.
생체내 전달의 경우, 형질감염 복합체(전달될 핵산과 결합된 형질감염제)는 그 직경이 100 nm 미만, 바람직하게는 50 nm 미만인 정도로 작아야 한다. 훨씬 더 작은 복합체, 즉 직경이 20 nm 미만 또는 10 nm 미만인 복합체가 보다 유용할 것이다. 100 nm보다 큰 형질감염 복합체는 생체 내에서 혈관 세포 이외의 다른 세포에 거의 접근하지 못한다. 시험관내 복합체는 양으로 하전되어 있기도 하다. 이 양전하는 상기 복합체와 세포의 부착 및 막 융합, 불안정화 또는 파괴에 필요하다. 생체내 형질감염 복합체 상의 양전하는 불리한 혈청 상호작용 및 이에 따라 낮은 생체이용률을 야기한다. 거의 중성 또는 음으로 하전된 복합체는 생체내 분포 및 표적화 능력에 있어서 보다 더 우수하다. 그러나, 시험관내 형질감염 복합체는 전하-전하 (정전기) 상호작용을 통해 핵산과 결합한다. 음으로 하전된 중합체 및 지질은 음으로 하전된 핵산과 상호작용하지 않는다. 또한, 이 정전기적 복합체는 생리학적 염 농도 또는 혈청 성분에 노출된 경우 응집되거나 분리되는 경향을 나타낸다. 마지막으로, 시험관 내에서 효과적인 형질감염 복합체는 종종 생체 내에서 독성을 나타낸다. 형질감염에 사용되는 중합체 및 지질은 세포막을 파괴하거나 불안정화시킨다. 이 활성과 핵산 전달의 균형은 생체 내에서보다 시험관 내에서 보다 용이하게 달성된다.
여러 연구진이 생체내 세포로의 유전자 전달을 개선시키기 위한 개선을 점진적으로 수행하였지만, 통상적으로 형질감염제의 생체내 투여와 관련된 독성 없이 전달제와 함께 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포에 효과적으로 전달하는 제제가 필요하다. 본 발명은 생물학적 불안정성 접합체 전달 시스템을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 세포로 전달하고 방출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
도 1: 폴리비닐에테르 중합체의 중합을 위한 반응식.
도 2: 본 발명의 마스킹제의 여러 실시양태를 보여주는 도면.
도 3: 폴리뉴클레오타이드-중합체 가역적 접합체, 및 말레아메이트(maleamte)에 의한 상기 접합체의 가역적 마스킹을 보여주는 도면.
도 4: A) CDM-PEG(좌측) 또는 B) CDM-PEG + CDM-Pip-LBA로 마스킹된 PBAVE 중합체가 간세포로 표적화되어 전달되는 것을 보여주는 현미경사진.
도 5: 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체가 생체내 간세포로 전달되는 것을 보여주는 현미경사진.
도 6: 퍼록시좀 증식자-활성화 수용체 알파(ppara) 작은 방해 RNA(siRNA)의 다가접합체 매개 전달 후 생체내 표적 유전자 넉다운(knockdown)을 보여주는 그래프.
도 7: (A) DNA-DW1360-CDM-PEG/NAG, (B) DNA + DW1360-CDM-PEG/NAG(중합체에 접합되지 않은 폴리뉴클레오타이드), (C) DNA-DW1360-CDM-PEG/글루코스, 및 (D) DNA-DW1360-CDM-PEG/만노스를 사용하여 이중 가닥 DNA를 간으로 전달하는 것을 보여주는 현미경사진. Cy3-표지된 DNA = 각 패널의 상부 좌측 사분원, ALEXA？-488 팔로이딘(phalloidin)으로 염색된 액틴 = 상부 우측 사분원, 핵 = 하부 좌측 사분원, 및 합성 사진 = 하부 우측 사분원.
도 8: siRNA 다가접합체의 정맥내 주입 후 마우스의 간에서 표적 유전자 발현의 넉다운을 보여주는 그래프 및 블롯. (A) 아포지단백질 B(apoB) siRNA 다가접합체의 처리 후 간에서의 apoB mRNA 농도의 감소. (B) apoB siRNA 다가접합체-처리 마우스에서 apoB-100 단백질의 혈청 농도. (C) ppara siRNA 다가접합체의 정맥내 주입 후 간에서의 ppara mRNA 농도의 감소.
도 9: apoB-1 siRNA 다가접합체 투여 반응을 보여주는 그래프. (A) apoB-1 siRNA 다가접합체의 연속 희석물의 주사 후 apoB mRNA의 넉다운. (B) 다양한 양의 siRNA의 주입 후 apoB mRNA의 넉다운.
도 10: apoB-1 siRNA 다가접합체-처리 마우스에서의 콜레스테롤 농도를 보여주는 그래프.
도 11: (A) ApoB siRNA, (B) GL3 음성 대조군 siRNA 또는 (C) 생리식염수 단독의 다가접합체 매개 전달 후 마우스 간에서의 지질 축적을 보여주는 현미경사진.
도 12: 0일째 날에 apoB-1 siRNA 접합체를 투여한 후 2 내지 15일째 날에서의 유전자 발현의 억제(A), 및 이로 인한 혈청 콜레스테롤의 감소(B)의 억제를 보여주는 그래프.
도 13: DW1360에 가역적으로 접합되고 CDM-PEG 및 CDM-NAG로 마스킹된 항체의 투여를 통해 항체를 간세포로 생체내 전달하는 것을 보여주는 현미경사진. 상부 좌측 사분원은 표지된 항체를 보여주고, 상부 우측 사분원은 액틴을 보여주며, 하부 좌측 사분원은 핵을 보여주고, 하부 우측 사분원은 합성 이미지를 보여준다.
도 14: 시판되는 시험관내 형질감염제 또는 다양한 양의 ApoB siRNA 다가접합체를 사용하여 전달한 apoB siRNA로 형질감염시킨 일차 간세포에서의 유전자 넉다운을 보여주는 그래프이다.
도 15: 시험관내 Hepa-1c1c7 세포를 siRNA-접합체로 형질감염시키는 것을 보여주는 그래프이다: 접합체 단독 = 마스킹된 siRNA-PLL.
도 16: PBAVE의 존재 하에 DPH의 형광도를 보여주는 그래프.
도 17: A) 쇼덱스 SB-80 칼럼 상에서의 PEG 표준물의 회수 프로파일, B) 쇼덱스 SB-803 칼럼에 대한 보정 곡선, 및 C) PBAVE 중합체에 대한 분자량 계산을 보여주는 그래프.
도 18: A) Cy3-표지된 핵산 표준물 및 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 회수 프로파일, B) 세파크릴 S-500 크기 배제 크로마토그래피에 대한 보정 곡선, 및 C) 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체에 대한 분자량 계산을 보여주는 그래프.
도 19: 올리고뉴클레오타이드-중합체-CDM/PEG/NAG 접합체(A, C) 또는 올리고뉴클레오타이드-중합체-CDM/PEG/글루코스 접합체(B, D)를 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 마우스 갈락토스 수용체 양성 종양(A-B) 또는 갈락토스 수용체 음성 종 양(C-D)에 생체내 전달하는 것을 보여주는 현미경사진.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드에 가역적으로 접합된 가역적으로 마스킹된 막 활성 중합체를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 생체내 세포로 전달하기 위한 조성물을 특징으로 한다. 상기 중합체는 하나 이상의 제1 가역적 공유결합을 통해 하나 이상의 마스킹제에 부착되고 하나 이상의 제2 가역적 공유결합을 통해 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 부착된다. 상기 제1 가역적 공유결합 및 제2 가역적 공유결합은 동일 또는 유사한 조건 하에 절단되는 가역적 결합을 포함할 수 있거나 상이한 조건 하에 절단될 수 있다, 즉 상기 공유결합은 오르쏘고날(orthogonal) 결합을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포유동물에 투여된다.
바람직한 실시양태에서, 폴리비닐에테르 랜덤 공중합체를 포함하는 막 활성 중합체가 개시되어 있다. 폴리비닐에테르 공중합체는 2가지, 3가지 또는 그 이상의 종류의 다양한 단량체로부터 합성될 수 있다. 단량체는 보호된 아미노 비닐 에테르 예컨대, 프탈이미도-함유 비닐 에테르, 부틸 비닐 에테르, 도데실 비닐 에테르, 옥타데실 비닐 에테르를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 폴리비닐에테르 랜덤 공중합체는 3가지 단량체, 즉 아민 함유 단량체, 부틸 비닐 에테르 및 옥타데실 비닐 에테르를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 막 활성 중합체의 1가지 이상의 생물리학적 특성은 마스킹제에 의해 가역적으로 차폐되거나 변경된다. 마스킹제는 입체 안정화제(steric stabilizer), 표적화 기 및 전하 변경제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 마스킹제는 중합체와 혈청 성분 또는 비-표적 세포의 비-특이적 상호작용을 억제함으로써 중합체-폴리뉴클레오타이드 접합체의 생체분포 또는 표적화를 개선시킬 수 있다. 마스킹제는 중합체 또는 중합체-폴리뉴클레오타이드 접합체의 응집도 감소시킬 수 있다. 표적 기를 보유하는 마스킹제는 세포 표면 접합체 시스템을 수용체에 표적화시킴으로써 세포-특이적 표적화 또는 세포 내부이입(internalization)을 증강시킬 수 있다. 마스킹제는 중합체와 폴리뉴클레오타이드의 접합 전 또는 후에 막 활성 중합체에 접합될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 기재된 접합체 시스템을 사용하여 세포로 전달할 수 있는 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 블록킹(blocking) 폴리뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 플라스미드, 발현 벡터, 올리고뉴클레오타이드, siRnA 마이크로RNA(miRNA), mRNA, shRNA 및 라이보자임을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 마스킹제 및 폴리뉴클레오타이드는 가역적 연결을 통해 막 활성 중합체에 공유결합된다. 중합체의 마스킹, 및 폴리뉴클레오타이드와 중합체의 결합은 중요하지만, 이 결합은 중합체의 형질감염 활성 또는 폴리뉴클레오타이드의 활성을 방해할 수 있다. 마스킹제 및 폴리뉴클레오타이드를 적절한 시점에서 절단되는 가역적 연결을 통해 중합체에 결합시킴으로써 중합체의 활성을 복원시키고 폴리뉴클레오타이드를 방출시킨다. 가역적 공유결합은 생리학적 불안정성 결합, 세포내 생리학적 불안정성 결합, pH 불안정성 결합, pH 고불안정성 결합, pH 초고불안정성 결합, 효소에 의해 절단가능한 결합 및 다이설파이드 결합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있는 가역적 또는 불안정성 결합을 포함한다. 중합체를 폴리뉴클레오타이드 및 마스킹제에 연결시키는 2개의 가역적 연결의 존재는 폴리뉴클레오타이드와 전달 중합체의 동시 전달 및 마스킹제에 의한 전달 중합체의 선별적 표적화 및 불활성화를 제공한다. 연결의 가역성은 막 활성 중합체로부터의 폴리뉴클레오타이드의 방출 및 막 활성 중합체의 선별적 활성화를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들은 a) 하나 이상의 가역적 연결을 통해 하나 이상의 표적화 기, 입체 안정화제 또는 전하 변경제에 공유결합되고, b) 하나 이상의 가역적 연결을 통해 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 공유결합된 전달 중합체를 포함하는 조성물을 개시한다. 한 실시양태에서, 표적화 기, 입체 안정화제 또는 전하 변경제의 가역적 공유결합은 폴리뉴클레오타이드의 가역적 공유결합에 대해 오르쏘고날하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들은 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달하고 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 방출하기 위한 중합체 접합체 시스템으로서, 그 자체가 마스킹제에 가역적으로 접합된 막 활성 중합체에 가역적으로 접합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 중합체 접합체 시스템을 개시한다. 접합 결합은 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 접합 결합은 동일 또는 상이한 조건 하에 절단될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들은 막 불투과성 분자를 세포로 전달하고 상기 분자를 세포 내에서 방출하기 위한 중합체 접합체 시스템을 개시한다. 상기 중합체 접합체 시스템은 막 활성 중합체에 가역적으로 연결된 막 불투과성 분자를 포함하고, 이때 다수의 마스킹제가 가역적 공유결합을 통해 막 활성 중합체에 결합되어 있다. 막 활성 중합체는 생체 내에 투여된 경우 독성을 나타낼 수 있거나 표적화되지 않을 수 있다. 마스킹제의 가역적 결합은 막 상호작용, 혈청 상호작용, 세포 상호작용, 독성 또는 중합체의 전하를 가역적으로 억제하거나 변경시킨다. 바람직한 가역적 공유결합은 불안정성 결합, 생리학적 불안정성 결합, 또는 포유동물 세포내 조건 하에 절단가능한 결합을 포함한다. 바람직한 불안정성 결합은 pH 불안정성 결합을 포함한다. 바람직한 pH 불안정성 결합은 말레아메이트 결합을 포함한다. 또 다른 바람직한 불안정성 결합은 다이설파이드 결합을 포함한다. 막 불투과성 분자는 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 항체 및 막 불투과성 약물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 과량의 중합체의 존재 하에 중합체에 부착된다. 과량의 중합체는 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 제제화에 도움을 줄 수 있다. 과량의 중합체는 접합체의 제제화 과정 동안에 접합체의 응집을 감소시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체는 이 접합체의 세포 또는 유기체로의 투여 전에 과량의 중합체로부터 분리될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체는 과량의 중합체와 함께 세포 또는 유기체로 동시 투여될 수 있다. 과량의 중합체는 상기 중합체와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 중합체 접합체는 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 막 불투과성 분자의 시험관내 전달에 사용될 수 있다. 시험관내 전달의 경우, 중합체의 가역적 마스킹은 일부 비효과적 폴리아민 예컨대, 폴리라이신의 형질감염 활성을 증강시킨다. 가역적 마스킹은 다른 막 활성 중합체의 독성을 감소시키거나 그의 막 파괴 특성을 엔도좀으로 제한함으로써 상기 막 활성 중합체의 활용성을 증강시킬 수도 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들은 표적 기와 폴리뉴클레오타이드의 공유결합, 제2 표적 기와 막 활성 중합체의 공유결합, 및 폴리뉴클레오타이드 및 막 활성 중합체의 유기체 내로의 주입을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 생체내 세포에 전달하는 시스템을 개시한다.
본 발명의 추가 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 하기 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
본 발명은 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 세포 불투과성 분자를 포유동물 세포에 전달하기에 유용한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에는 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 막 불투과성 분자를 생체내 세포에게 전달하기 위한 다가접합체 시스템이 개시되어 있다. 다가접합체 시스템은 표적화, 항-옵소닌화(anti-opsonization), 항-응집 및 형질감염 활성을 50 nm 미만의 작은 전달 비히클 내로 도입한다. 상기 시스템의 핵심 요소는 성분들을 연결하는 결합의 가역성이다.
본원에 기재된 생체내 폴리뉴클레오타이드 전달 접합체의 제1 요소는 폴리뉴클레오타이드와 막 활성 중합체의 생리학적으로 가역적인 공유결합을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드와 막의 공유결합은 폴리뉴클레오타이드가 생체내 투여되거나 혈청의 존재 하에 생체외 투여된 경우 중합체로부터 용이하게 분리되게 하므로, 폴리뉴클레오타이드를 막 활성 중합체와 함께 표적 세포로 동시 전달할 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오타이드와 중합체의 공유결합은 폴리뉴클레오타이드를 불활성 상태로 만든다. 그러므로, 폴리뉴클레오타이드와 막 활성 중합체의 결합은 생리학적으로 가역적인 연결 또는 결합을 통해 달성된다. 생리학적으로 가역적인 결합을 이용함으로써 폴리뉴클레오타이드를 중합체로부터 절단하여 폴리뉴클레오타이드가 세포 성분들과의 기능적 상호작용에 참여하도록 상기 폴리뉴클레오타이드를 방출할 수 있다. 적절한 가역적 결합을 선택함으로써 원하는 위치 예컨대, 세포의 세포질로 전달된 후에만 폴리뉴클레오타이드를 방출하는 접합체를 형성할 수 있다.
본원에 기재된 생체내 폴리뉴클레오타이드 전달 접합체의 제2 성분은 막 활성 중합체의 가역적 변경을 포함한다. 막 활성 중합체의 가역적 변경은 비-생산 혈청 및 비-표적 세포 상호작용을 감소시키고 독성을 감소시킨다. 마스킹제는 원하는 기능 예컨대, 표적 세포 상호작용의 증강 또는 접합체의 세포내이입의 증강을 상기 접합체에 부여할 수도 있다. 중합체는 생리학적으로 가역적인 공유결합을 통해 마스킹제를 중합체에 공유결합시킴으로써 마스킹한다. 마스킹제는 입체 안정화제, 표적화 기 또는 전하 변경제일 수 있다. 마스킹제는 중합체를 비-특이적 상호작용으로부터 차폐할 수 있거나, 순환 시간을 증가시킬 수 있거나, 특이적 상호작용을 증강시킬 수 있거나, 독성을 억제할 수 있거나, 또는 중합체의 전하를 변경시킬 수 있다. 이 변경들 각각은 중합체의 막 활성을 변경시켜 변경된 중합체가 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진할 수 없게 만들 수 있다. 그러므로, 마스킹제와 막 활성 중합체의 결합은 생리학적으로 가역적인 결합을 통해 달성된다. 생리학적으로 가역적인 연결을 이용하여 마스킹제를 중합체로부터 절단함으로써 중합체의 마스킹을 제거하고 마스킹이 제거된 중합체의 활성을 복원할 수 있다. 적절한 가역적 연결을 선택함으로써 원하는 세포 유형 또는 세포내 위치에 전달하거나 원하는 세포 유형 또는 세포내 위치로 표적화된 후 막 활성 중합체의 활성을 복원시키는 접합체를 형성할 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 접합체 전달 시스템을 포함한다:
N-L1-P(L2-M)y
상기 식에서,
N은 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 세포 불투과성 분자이고,
L1은 가역적 연결이며,
P는 중합체이고,
L2는 제2 가역적 연결이며,
M은 마스킹제이고,
y는 0보다 큰 정수이다.
마스킹제 M은 중합체 P의 성질 또는 상호작용을 차폐하거나 변경한다. 바람 직한 중합체는 막 활성 중합체이다. 또 다른 바람직한 중합체는 형질감염 중합체이다. 다수의 마스킹제가 단일 중합체에 연결될 수 있다. 다수의 마스킹제가 다수의 가역적 연결을 통해 중합체에 연결될 수 있다. 가역적 연결 L2의 절단 시, 마스킹된 성질 또는 상호작용은 중합체 P로 복원된다. 마스킹제 M은 활성 예컨대, 세포 수용체 결합 활성을 중합체 P에 부가할 수 있다. 가역적 연결 L1은 가역적 연결 L2와 동일하거나 상이할(오르쏘고날할) 수 있다. 가역적 연결 L1 또는 L2의 가역적 결합은 원하는 생리학적 조건 하에 절단이 일어나도록, 예컨대, 절단이 원하는 조직, 기관 및 하위-세포 위치에서 또는 약학적으로 허용가능한 외래 물질의 첨가에 반응하여 일어나도록 선택된다. 폴리뉴클레오타이드 N 및 마스킹제 M은 중합체 P의 길이에 따라 임의의 위치에서 중합체 P에 부착될 수 있다.
중합체
중합체는 단량체로 지칭되는 보다 작은 단위체들의 반복적 결합에 의해 구축된 분자이다. 중합체는 선형, 분지형 망, 별모양, 빗모양 또는 사다리형 중합체일 수 있다. 중합체의 주쇄는 그 결합이 중합체 길이의 증가에 요구되는 원자들로 구성된다. 예를 들어, 폴리-L-라이신의 경우, 카보닐 탄소, α-탄소 및 α-아민 기가 중합체의 길이에 요구되므로 주쇄 원자이다. 중합체의 측쇄는 그 결합이 중합체 길이의 증가에 요구되지 않는 원자들로 구성된다.
중합체는 단일 단량체가 사용된 단독중합체일 수 있거나 2가지 이상의 다양한 다량체가 사용된 공중합체일 수 있다. 공중합체는 교대(alternating), 랜덤(통 계학적), 블록 및 그래프트(빗모양)에 의한 것일 수 있다. 교대 중합체는 정해진 반복 순서 예컨대, -[A-B]n-로 단량체를 함유한다. 전형적으로, 교대 중합체의 단량체는 서로 반응하여 교대 공중합체를 생성하는 대신에 단독중합체를 생성하지는 않는다.
랜덤 공중합체의 단량체는 임의의 주어진 쇄에 따라 정해진 순서 또는 정렬을 갖지 않는다(예컨대, -An-Bm-). 이러한 중합체의 일반적 조성은 투입 단량체의 비를 반영한다. 그러나, 한 단량체와 또 다른 단량체의 정확한 비는 쇄마다 상이할 수 있다. 단량체의 분포도 단일 중합체의 길이에 따라 상이할 수 있다. 또한, 단량체의 화학적 성질은 랜덤 공중합체 내로의 단량체의 혼입 속도 및 중합체 내에서의 단량체의 분포를 반영할 수 있다. 따라서, 랜덤 중합체 내의 단량체의 비는 단량체의 투입 비에 의존하지만, 상기 투입 비는 혼입 단량체의 비와 정확히 일지하지 않을 수 있다.
블록 중합체는 한 중합체(폴리A)의 분절 또는 블록 후 제2 중합체(폴리B)의 분절 또는 블록을 갖는다, 즉 -폴리A-폴리B-이다. 결과는 다양한 중합체 쇄가 헤드-투-테일(head-to-tail) 구조로 연결된다는 것이다. 따라서, 블록 중합체는 상이한 단량체 조성을 갖는 블록들의 선형 정렬이다. 일반적으로, 중합체 블록은 중합체 B와 상이한 단량체로 구성된 중합체 A를 가진 단독중합체이지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 다이블록 공중합체는 폴리A-폴리B이고, 트라이블록공중합체는 폴리A-폴리B-폴리A이다. A가 친수성 기이고 B가 소수성 기인 경우, 생성된 블록 공 중합체는 중합체성 계면활성제로서 간주될 수 있다. 그래프트 중합체는 하기 화학식 2에 나타낸 바와 같이 한 단량체의 쇄가 다른 단량체의 측쇄 상에 그래프트되어 있는 블록 공중합체의 한 유형이다:
Figure 112009009685988-pct00001
상기 식에서,
n, m, x, y 및 z는 정수이다.
단량체
매우 다양한 단량체가 중합 공정에 사용될 수 있다. 단량체는 양이온성, 음이온성, 양쪽이온성, 친수성, 소수성, 친유성, 양극성 또는 양쪽성을 나타낼 수 있다. 단량체는 그 자체가 중합체일 수 있다. 단량체는 중합 전 또는 후에 변경될 수 있는 화학적 기를 함유할 수 있다. 이러한 단량체는 아민(일차, 이차 및 삼차), 아마이드, 카복실산, 에스터, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드록실아민, 알킬 할라이드, 알데하이드 및 케톤을 포함하는 군으로부터 선택된 반응성 기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 반응성 기는 폴리뉴클레오타이드의 접합 후에 변경될 수 있거나 수용액 중에서 변경될 수 있다.
여러 부류의 중합 공정이 중합 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 중합은 쇄 중합 또는 단계 중합일 수 있다.
단계 중합
단계 중합에서, 중합은 단계적 방식으로 일어난다. 중합체 성장은 단량체, 올리고머 및 중합체 사이의 반응에 의해 일어난다. 동일한 반응이 전체에 걸쳐 일어나기 때문에 개시제가 필요 없고, 말단 기가 여전히 반응성을 갖도록 하기 위해 종결 단계가 없다. 중합 속도는 작용성 기가 소모됨에 따라 감소한다.
중합체는 동일한 단량체 내에 2가지 반응성 기(A 및 B)를 갖는 단량체(이종이작용성 단량체)를 사용함으로써 단계 중합을 실시하여 생성할 수 있고, 이때 A는 반응성 기를 포함하고 B는 A-반응성 기(A와 공유결합을 형성하는 반응성 기)를 포함한다. A-B의 중합은 -[A-B]n-를 생성한다. 반응성 기 A 및 B는 하나의 공유결합 또는 다수의 공유결합에 의해 서로 연결되어 중합체 단량체를 형성할 수 있다. 중합체는 A-A + B-B가 -[A-A-B-B]n-를 생성하도록 동종이작용성 단량체를 사용하여 단계 중합을 실시하여 생성할 수도 있다. 일반적으로, 이 반응은 아실화 또는 알킬화를 수반할 수 있다. 단량체의 2가지 반응성 기는 하나의 공유결합 또는 다수의 공유결합에 의해 연결될 수 있다.
반응성 기 A가 아민인 경우, 반응성 기 B는 아민-반응성 기이고 아이소티오시아네이트, 아이소시아네이트, 아실 아지드, N-하이드록시-석신이미드, 설포닐 클로라이드, 알데하이드(포름알데하이드 및 글루타르알데하이드를 포함함), 케톤, 에폭사이드, 카보네이트, 이미도에스터, 카보디이미드로 활성화된 카복실레이트, 알킬포스페이트, 아릴할라이드(다이플루오로-다이니트로벤젠), 무수물, 산 할라이드, p-니트로페닐 에스터, o-니트로페닐 에스터, 펜타클로로페닐 에스터, 펜타플루오로페닐 에스터, 카보닐 이미다졸, 카보닐 피리디늄 및 카보닐 다이메틸아미노피리디늄을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 관점에서 반응성 기 A가 아민인 경우, 반응성 기 B는 아실화제, 알킬화제 또는 아민화제일 수 있다.
반응성 기 A가 설프하이드리릴 (티올)인 경우, 반응성 기 B는 티올-반응성 기이고 요오도아세틸 유도체, 말레이미드, 아지리딘 유도체, 아크릴오일 유도체, 플루오로벤젠 유도체 및 다이설파이드 유도체(예컨대, 피리딜 다이설파이드 또는 5-티오-2-니트로벤조산(TNB) 유도체)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
반응성 기 A가 카복실레이트인 경우, 반응성 기 B는 카복실레이트-반응성 기이고 디아조아세테이트 및 아민(이때, 카보다이이미드가 사용됨)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 첨가제 예컨대, 카보닐다이이미다졸, 다이메틸아미노 피리딘(DMAP), N-하이드록시석신이미드 또는 알코올(카보다이이미드 및 DMAP를 사용함)을 사용할 수 있다.
반응성 기 A가 하이드록실인 경우, 반응성 기 B는 에폭사이드, 옥시란, 활성화된 카바메이트, 활성화된 에스터 및 알킬 할라이드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있는 하이드록실-반응성 기이다.
반응성 기 A가 알데하이드 또는 케톤인 경우, 반응성 기 B는 하이드라진, 하이드라지드 유도체, 아민(환원제 예컨대, NaCNBH3에 의해 환원될 수 있거나 환원될 수 없는 쉬프(Schiff) 염기를 형성함) 및 하이드록실 화합물을 포함하는 군으로부 터 선택될 수 있는 알데하이드- 또는 케톤-반응성 기이다.
중합체는 A-A + 또 다른 물질이 -[A-A]n-을 생성하도록 이작용성 단량체 및 또 다른 물질을 사용하여 단계 중합을 실시하여 생성할 수 있다.
반응성 기 A가 설프하이드릴(티올) 기인 경우, 이 반응성 기는 산화제 예컨대, 요오드(I2), 소듐 페리오데이트(NaIO4) 또는 산소(O 2 )에 의해 다이설파이드 결합으로 전환될 수 있다. 반응성 기 A가 아민인 경우, 이 반응성 기는 2-이미노티올레이트(트라우트(Traut) 시약)과의 반응에 의해 티올로 전환될 수 있고, 상기 티올은 산화 및 다이설파이드 형성을 겪는다. 다이설파이드 유도체(예컨대, 피리딜 다이설파이드 또는 TNB 유도체)를 다이설파이드 결합 형성을 촉진하는 데 사용될 수도 있다.
상기 예들 중 임의의 예에서 반응성 기 A 또는 B는 광반응성 기 예컨대, 아릴 아지드(할로겐화된 아릴 아지드를 포함함), 다이아조, 벤조페논, 알킨 또는 다이아지리딘 유도체일 수도 있다.
아민, 하이드록실, 설프하이드릴 또는 카복실레이트 기의 반응은 아마이드, 아미딘, 다이설파이드, 에테르, 에스터, 엔아민, 이민, 우레아, 아이소티오우레아, 아이소우레아, 설폰아마이드, 카바메이트, 알킬아민 결합(이차 아민) 및 탄소-질소 단일 결합(이때, 탄소는 하이드록실 기, 티오에테르, 다이올, 하이드라존, 다이아조 또는 설폰을 함유함)으로서 기재된 화학적 결합을 생성한다.
쇄 중합
쇄-반응 중합에서, 중합체의 성장은 단량체 단위체를 제한된 수의 성장하는 쇄에 연속적으로 부가함에 의해 일어난다. 개시 기작과 성장 기작은 상이하고 전형적으로 쇄-종결 단계이다. 쇄 중합 반응은 라디칼, 음이온성 또는 양이온성을 나타낼 수 있다. 쇄 중합용 단량체는 비닐, 비닐 에테르, 아크릴레이트, 메트아크를레이트, 아크릴아마이드 및 메트아크릴아마이드 기를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 쇄 중합은 환 또는 고리 개방 중합에 의해 달성될 수도 있다. 퍼록사이드, 하이드록시 퍼록사이드 및 아조 화합물 예컨대, 2,2'-아조비스(-아미디노프로판) 다이하이드로클로라이드(AAP)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 여러 상이한 유형의 자유 라디칼 개시제가 사용될 수 있다.
형질감염 활성
용어 "형질감염"은 폴리뉴클레오타이드 또는 생물학적 활성 화합물이 기능성을 갖도록 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 생물학적 활성 화합물을 세포 외부로부터 세포 내부로 전달하는 것을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드를 시험관내 세포에 전달하기 위한 형질감염제의 예로는 리포좀, 지질, 폴리아민, 인산칼슘 침전물, 히스톤 단백질, 폴리에틸렌이민, 다가양쪽성 전해질 복합체 및 이들의 조합물을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 많은 시험관내 형질감염제가 양이온성을 나타내는데, 이는 상기 형질감염제가 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 핵산과 결합하거나 복합체를 형성하게 한다.
막 활성 중합체
막 활성 중합체는 생물학적 막에 대해 하기 효과 중 하나 이상의 효과를 유 도할 수 있는 양극성 중합체이다: 막 불투과성 분자가 세포로 들어가게 하거나 막을 관통하게 하는 막 변형 또는 파괴, 막에서의 공극 형성, 막의 융합, 또는 막의 파괴 또는 용해. 본원에서 사용된 바와 같이, 막 또는 세포막은 지질 이중층을 포함한다. 본 발명의 막 활성 중합체는 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 막 불투과성 분자가 세포 외부로부터 세포 내부, 바람직하게는 세포의 세포질로 전달되는 것을 촉진하는 중합체를 포함한다. 막의 변형 또는 파괴는 하기 분석법 중 하나 이상의 분석법에서의 중합체 또는 화합물의 활성에 의해 기능적으로 정의될 수 있다: 적혈구 용해(용혈작용), 리포좀 누출, 리포좀 융합, 세포 융합, 세포 용해 및 엔도좀 방출. 세포막의 용해를 야기할 수 있는 막 활성 중합체는 막 용해성 중합체로도 지칭된다. 엔도좀 또는 라이소좀의 파괴를 야기할 수 있는 막 활성 중합체는 엔도좀용해성 중합체로 간주된다. 세포막에 대한 막 활성 중합체의 효과는 일시적일 수 있다. 중합체의 막 활성은 이중층 구조의 변성 또는 변형을 야기하는, 막에 대한 중합체의 친화성으로부터 유래한다. 막 활성 중합체는 합성 또는 비-천연 양극성 중합체일 수 있다. 막 활성 중합체는 시험관내 형질감염 활성을 가질 수 있다. 막 활성 중합체는 양이온성 중합체, 음이온성 중합체, 양극성 중합체, 양쪽성 중합체, 표면 활성 중합체 또는 이들의 조합물일 수 있다.
세포로의 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 막 불투과성 분자의 전달은 막에서의 공극 형성 또는 엔도좀 또는 라이소좀 기능의 파괴를 포함하는, 원형질막 또는 내부 소포체 막(예컨대, 엔도좀 또는 라이소좀)을 파괴하거나 불안정화시키는 막 활성 중합체에 의해 매개된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 막 활성 중합체는 HIV TAT 단백질로부터 유래한 아르기닌-풍부 펩티드, 안테나페디아(antennapedia) 펩티드, VP22 펩티드, 트랜스포탄(transportan), 아르기닌-풍부 인공 펩티드, 작은 구아니디늄-풍부 인공 중합체 등과 같은 화합물들로 대표되는 세포 투과 펩티드 또는 중합체로 지칭되는 일군의 중합체와는 구별된다. 세포 투과 화합물은 외관상 세포내이입의 요구 및 막의 통합성 파괴 없이 몇몇 분자들을 막을 통해 지질 이중층의 한 쪽으로부터 지질 이중층의 다른 쪽으로 전달하는 것으로 보이지만, 그의 기작은 잘 이해되어 있지 않고 활성 자체가 논의되고 있다.
엔도좀용해성 중합체
엔도좀용해성 중합체는 pH 변화에 반응하여 엔도좀의 파괴 또는 용해를 야기할 수 있거나 통상의 막-불투과성 화합물 예컨대, 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질이 세포 내부 막-봉입 소포체 예컨대, 엔도좀 또는 라이소좀으로부터 빠져 나오게 할 수 있다. 엔도좀 방출은 세포내봉입될 수 있으나 세포막을 관통하여 확산할 수 없는 매우 다양한 분자의 전달에 중요하다. 엔도좀용해성 중합체는 생리학적으로 관련된 pH 범위(통상 pH 5.5 내지 8)에 걸쳐 그의 물리-화학적 성질에서의 변경을 겪는다. 이 변경은 중합체의 가용성에서의 변경, 다른 화합물과의 상호작용 능력에서의 변경, 및 소수성 또는 친수성에서의 변경일 수 있다. 예시적 엔도좀용해성 중합체는 pH 적정가능성 기 또는 pH 불안정성 기 또는 결합을 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, pH 적정가능성 기는 생리학적 조건 하의 pH, 즉 pH 4 내지 8의 함수로서 물 중에서 양성자를 가역적으로 수용하거나 공여한다. pH 적정가능 성 기의 pKa 값은 4 내지 8이다. 따라서, pH 적정가능성 기는 엔도좀의 보다 낮은 pH 환경에서 전하를 얻거나 상실한다. 생리학적 pH에서 적정가능한 기는 산-염기 적정을 수행하고 상기 기가 pH 4 내지 8 내에서 완충하는 지를 실험적으로 확인함으로써 실험적으로 결정할 수 있다. 상기 pH 범위 내에서 완충작용을 나타낼 수 있는 기의 예로는 카복실산, 이미다졸, N-치환된 이미다졸, 피리딘, 페놀 및 폴리아민을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. pH 적정가능성 기를 가진 중합체는 소위 양성자 스폰지 효과로 내부 소포체를 파괴할 수 있다. 따라서, 마스킹제가 pH 불안정성 결합을 통해 중합체에 부착된 가역적으로 마스킹된 막 활성 중합체는 엔도좀용해성 중합체인 것으로 간주될 수 있다.
엔도좀용해성 화합물의 하위세트는 융합원성 펩티드를 포함하는 융합원성 화합물이다. 융합원성 펩티드는 올리고머성 화합물과 같은 물질이 엔도좀으로부터 세포질로 방출되는 것을 촉진할 수 있다. 융합원성 펩티드는 산성 pH 하에 구조를 변경되어 엔도좀 막을 효과적으로 불안정화시킴으로써 엔도좀 내용물의 세포질 전달을 증강시키는 것으로 생각된다. 예시적 융합원성 펩티드는 폴리믹신(polymyxin) B, 인플루엔자 HA2, GALA, KALA, EALA, 멜리틴 및 멜리틴-유래 펩티드, 알츠하이머 β-아밀로이드 펩티드 등을 포함한다.
다가양쪽성 전해질
다가양쪽성 전해질은 음이온성 단량체 단위체 및 양이온성 단량체 단위체를 함유하는 중합체이다. 보다 구체적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, 다가양쪽성 전해질은 다수의 음이온성 단량체 단위체 및 다수의 양이온성 단량체 단위체를 함 유한다. 다가양쪽성 전해질 중합체는 경우에 따라 비-이온성 단량체 단위체를 함유할 수 있다. 수용액 중에서 다가양쪽성 전해질은 그의 등전점 근처에서 침전된다. 다가양쪽성 전해질은 중합체성 단량체를 포함하는 음이온성 단량체 및 양이온성 단량체를 중합시켜 형성할 수 있다. 별법으로, 다가양쪽성 전해질은 중합체 상의 하전된 기들 중 하나 이상의 기(그러나, 전부는 아님)를 변경시켜 형성할 수 있다. 하전된 기가 가역적으로 변경된 경우, 가역적 다가양쪽성 전해질이 형성된다.
양극성
양극성 또는 양친매성 중합체는 당업계에 잘 공지되어 있고 인식되어 있으며 친수성(극성, 수용성) 및 소수성(비-극성, 친유성, 수-불용성) 기 또는 부분을 갖는다. 친수성 기는 정성적인 면에서 화학적 부분이 수-친화적임을 의미한다. 전형적으로, 이러한 화학적 기는 수용성을 나타내고 물에 대한 수소결합 공여자 또는 수용자이다. 친수성 기는 양으로 하전된(음이온성) 또는 음으로 하전된(야이온성) 기일 수 있거나 양 및 음 둘다로 하전된 기일 수 있다. 양극성 화합물은 다가음이온, 다가양이온, 양쪽성이온 또는 다가양쪽성 전해질일 수 있다. 친수성 기의 예로는 하기 화학적 부분을 가진 화합물을 포함한다: 탄수화물, 폴리옥시에틸렌, 특정 펩티드, 올리고뉴클레오타이드, 및 아민, 아마이드, 알콕시 아마이드, 카복실산, 황 또는 하이드록실을 함유하는 기. 소수성 기는 정성적인 면에서 화학적 부분이 수-회피성을 나타냄을 의미한다. 전형적으로, 이러한 화학적 기는 수용성을 나타내지 않고 수소결합을 형성하는 경향을 나타내지 않는다. 친유성 기는 지방, 오일, 지질 및 비-극성 용매 중에서 용해되고 수소결합을 형성하는 능력을 거의 갖 지 않거나 전혀 갖지 않는다. 탄화수소(2개 이상의 탄소 원자를 포함함), 특정 치환된 탄화수소, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체 및 특정 펩티드가 소수성 기의 예이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 양극성 중합체와 관련하여, 부분은 하나의 공유결합이 절단되고 수소로 치환된 경우 유도된 분자로서 정의된다. 예를 들어, 부틸 아민에서, 탄소와 질소 사이의 결합이 절단되고 수소로 치환되면 암모니아(친수성) 및 부탄(소수성)이 생성된다. 그러나, 1,4-다이아미노부탄이 질소-탄소 결합에서 절단되어 수소로 치환되는 경우, 생성된 분자는 암모니아(2x) 및 부탄이다. 그러나, 1,4-다이아미노부탄은 소수성 부분의 형성이 2개의 결합의 절단을 요구하기 때문에 양쪽성을 나타내는 것으로 간주되지 않는다.
천연 발생 중합체는 천연 상태에서 발견될 수 있는 중합체이다. 그 예로는 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 콜라겐 및 폴리사카라이드(전분, 셀룰로스, 글리코스아미노글리칸, 키틴, 아가, 아가로스)를 포함한다. 천연 중합체는 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 있거나 합성될 수 있다. 합성 중합체는 "사람"에 의한 화학적 공정에 의해 제제화되거나 제조되고 천연 발생 생물학적 공정에 의해 생성되지 않는다. 비-천연 중합체는 천연 발생(동물 또는 식물) 물질 또는 단량체(예컨대, 아미노산, 뉴클레오타이드 및 사카라이드)로부터 제조되지 않은 합성 중합체이다. 중합체는 완전 또는 부분적 천연, 합성 또는 비-천연 중합체일 수 있다.
중합체는 하나 이상의 불안정성 또는 절단가능한 결합을 가질 수 있다. 불안정성 결합이 생리학적 조건 또는 세포의 생리학적 조건 하에 절단될 수 있는 경우, 중합체는 생분해가능하다. 절단가능한 결합은 주쇄 또는 측쇄에 존재할 수 있 다. 절단가능한 결합이 주쇄에 존재하는 경우, 상기 결합의 절단은 중합체 길이의 감소 및 2개 이상의 분자의 형성을 초래한다. 예를 들어, 보다 작은 폴리비닐에테르 중합체는 불안정성 결합을 통해 연결되어 큰 폴리비닐에테르 중합체를 형성할 수 있다. 절단가능한 결합이 측쇄에 존재하는 경우, 상기 결합의 절단은 중합체로부터의 측쇄 원자의 상실을 초래한다.
일군의 양극성 폴리비닐 랜덤 공중합체가 본원에 개시된다. 상기 폴리비닐 공중합체는 2가지, 3가지 또는 그 이상의 종류의 다양한 단량체로부터 합성될 수 있다. 바람직한 단량체는 하전된 비닐 에테르, 보호된 이온성 기를 함유하는 비닐 에테르, 프탈이미드-보호된 아민 비닐 에테르, 아실 비닐 에테르, 알킬 비닐 에테르, 저급 알킬 비닐 에테르, 고급 알킬 비닐 에테르, 부틸 비닐 에테르, 도데실 비닐 에테르, 옥타데실 비닐 에테르, 콜레스테롤 비닐 에테르 및 다른 탄화수소-함유 소수성 비닐 에테르를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일군의 특히 유용한 중합체는 3가지 단량체, 즉 프탈아미드 단량체, 작은 소수성 단량체 및 큰 소수성 단량체로 중합된 아민-함유 폴리비닐에테르 랜덤 공중합체를 포함한다. 프탈이미드 단량체의 탈보호는 아민 단량체를 생성한다. 작은 소수성 단량체는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄소-수소 쇄를 포함한다. 큰 소수성 단량체는 약 10 내지 약 22개의 탄소 원자 또는 약 12 내지 약 18개의 탄소 원자를 갖는 탄소-수소 쇄를 포함한다. 중간 소수성 단량체는 약 6 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 탄소-수소 쇄를 포함한다. 바람직한 아미노 폴리비닐에테르 중합체는 아미노/부틸/옥타데실 폴리비닐에테르 또는 아미노/부틸/도데실 폴리비닐에 테르를 포함한다.
폴리(비닐에테르) 랜덤 공중합체의 생물리학적 성질은 선택된 구체적인 단량체, 이 단량체가 중합체로 혼입되는 속도 및 중합체의 크기에 의해 결정된다. 중합 반응에서 단량체의 공급 비를 교대로 변경함으로써 다양한 중합체를 제조할 수 있다. 중합체 내로의 단량체의 혼입 비는 단량체의 공급 비와 동일할 수 있지만, 상기 비들은 상이할 수 있다. 단량체가 공급 비로 혼입되든 아니면 상이한 비로 혼입되든, 원하는 단량체 혼입 비를 달성하기 위해 단량체의 공급 비를 변경할 수 있다. 바람직한 아미노 폴리비닐에테르는 수용성 막 활성 아민/부틸/옥타데실 또는 아민/부틸/도데실 랜덤 삼원중합체이다. 폴리아민 예컨대, 폴리에틸렌이민, 폴리라이신, 폴리비닐아민 및 폴리알릴아민으로부터 아민 함량과 소수성 단량체 함량이 유사한 중합체를 합성할 수 있거나, 또는 이 중합체의 측쇄의 변경을 통해 다른 중합체 예컨대, 폴리비닐알코올을 합성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 막 활성 중합체는 1 mg/㎖ 이상의 농도로 물 중에서 용해될 수 있다. 본 발명의 바람직한 막 활성 중합체는 표면 활성을 갖는다. 본 발명의 막 활성 중합체의 크기는 바람직하게는 약 5 내지 약 100 kDa, 보다 바람직하게는 약 7.5 내지 약 50 kDa, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 30 kDa이다.
마스킹제
세포 외부로부터 세포의 세포질로 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 중합체는 종종 독성을 나타내거나 생체 내에서 좋지 않은 생체분포를 갖는다. 따라서, 독성 또는 좋지 않은 생체분포를 초래하는 중합체의 성질을 마스킹할 필요가 있다. 이 성질을 마스킹하기 위한 중합체의 변경은 중합체의 형질감염 활성 또는 막 활성을 불활성화시킬 수도 있기 때문에, 마스킹제는 생리학적으로 가역적인 결합을 통해 중합체에 연결될 수 있다. 상기 결합의 절단은 중합체의 차폐된 또는 마스킹된 성질을 복원한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 마스킹제는 중합체에 연결된 경우 상기 중합체의 1가지 이상의 성질(생물리학적 또는 생화학적 특성)을 차폐하거나, 억제하거나 불활성화시키는 분자를 포함한다. 마스킹제는 마스킹제의 부재 하에 갖지 않는 활성 또는 기능을 중합체에 부가할 수도 있다. 마스킹될 수 있는 중합체의 성질은 막 활성, 엔도좀용해 활성, 전하, 유효 전하, 형질감염 활성, 혈청 상호작용, 세포 상호작용 및 독성을 포함한다. 마스킹제는 생리학적 조건 하에 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 응집을 억제하거나 방해할 수도 있다. 본 발명의 마스킹제는 입체 안정화제, 표적화 기 및 전하 변경제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 다수의 마스킹제가 단일 중합체에 가역적으로 연결될 수 있다. 중합체의 성질을 불활성화시키기 위해, 하나보다 많은 수의 마스킹제를 중합체에 연결할 필요가 있을 수 있다. 충분한 수의 마스킹제를 중합체에 연결하여 원하는 수준의 불활성화를 달성한다. 마스킹제의 부착에 의한 원하는 수준의 중합체 변경은 적절한 중합체 활성 분석법을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다 예를 들어, 중합체가 소정의 분석법에서 막 활성을 보유하는 경우, 충분한 수준의 마스킹제를 중합체에 연결하여 상기 분석법에서 원하는 수준의 막 활성 억제를 달성한다. 충분한 수의 마스킹제를 중합체에 가역적으로 연결하여 생리학적 조건 하에 중합체의 응집을 억제할 수 있다. 1가지보다 많은 종류의 마스킹제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 입체 안정화제 및 표적화 기를 중합체에 연결할 수 있다. 입체 안정화제 및 표적화 기는 전하 변경제로서도 작용할 수 있거나 작용할 수 없다. 본 발명의 마스킹제는 중합체에 가역적으로 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 마스킹제는 연결의 복구가 중합체의 마스킹된 활성을 복원하는 경우 중합체에 가역적으로 연결되어 있다. 마스킹제는 중합체 상의 반응성 기와 가역적 공유결합을 형성함으로써 중합체에 연결된다. 반응성 기는 아민, 알코올, 티올, 하이드라지드, 알데하이드, 카복실산 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 중합체 상의 반응성 기 또는 하전된 기 중 하나 내지 전부가 가역적으로 변경될 수 있다. 한 실시양태에서, 2가지 이상의 마스킹제가 중합체에 가역적으로 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 마스킹제는 중합체 상의 반응성 기의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%에 가역적으로 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 마스킹제는 중합체 상의 하전된 기의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%에 가역적으로 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 중합체 상의 하전된 기에 대한 중합체에 가역적으로 연결된 마스킹제의 비율은 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 중합체는 그의 하나 이상의 성질이 하나 이상의 마스킹제의 부착에 의해 억제되거나 불활성화되는 경우 마스킹되어 있다. 중합체는 마스킹제를 중합체에 연결하는 결합의 절단이 중합체의 마스킹된 성질을 복원하는 경우 가역적으로 마스킹되어 있다.
본 발명의 바람직한 마스킹제는 수용액 중에서 중합체를 변경할(중합체와 가 역적 결합을 형성할) 수 있다. R1이 메틸(-CH3)이고 R2가 프로피온산 기(-(CH2)2CO2H) 또는 상기 산으로부터 유래한 에스터/아마이드인 말레산 무수물 유도체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 입체 안정화제는 입체 안정화제를 함유하지 않는 중합체에 비해 입체 안정화제가 부착되어 있는 중합체의 분자내 또는 분자간 상호작용을 방해하는 천연, 합성 또는 비-천연 비-이온성 친수성 중합체이다. 입체 안정화제는 중합체가 정전기적 상호작용에 참여하는 것을 방해한다. 정전기적 상호작용은 양전하와 음전하 사이의 인력으로 인한 2개 이상의 물질의 비-공유결합이다. 입체 안정화제는 혈액 성분과의 상호작용을 억제하여 옵소닌화, 식균작용 및 세망내피 시스템에 의한 흡수를 억제할 수 있다. 따라서, 입체 안정화제는 이것이 부착된 분자의 순환 시간을 증가시킬 수 있다. 입체 안정화제는 중합체의 응집을 억제할 수도 있다. 바람직한 입체 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG는 약 1 내지 500개의 에틸렌 글리콜 단량체, 2 내지 20개의 에틸렌 글리콜 단량체, 5 내지 15개의 에틸렌 글리콜 단량체 또는 약 10개의 에틸렌 글리콜 단량체를 가질 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG의 평균 분자량은 약 85 내지 20,000 달톤(Da), 약 200 내지 1000 Da, 약 200 내지 750 Da 또는 약 550 Da일 수 있다. 다른 적절한 입체 안정화제는 폴리사카라이드, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 폴리(비닐 알코올), 폴리비닐피롤리돈, 2-하이드록시프로필 메트아크릴레이트(HPMA) 및 수용성 셀룰 로스 에테르를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
표적화 기 또는 리간드는 표적 세포, 표적 조직 또는 특정 유형의 세포에 중합체를 표적화하거나 전달하는 데 사용된다. 표적화 기는 분자와 표적 세포의 결합을 증강시킨다. 따라서, 표적화 기는 이 기가 부착된 접합체의 약동력학적 또는 생체분포 성질을 증강시켜 상기 접합체의 세포내 분포 및 세포 흡수를 개선할 수 있다. 하나 이상의 표적화 기가 직접적으로 또는 스페이서와의 연결을 통해 막 활성 중합체에 연결될 수 있다. 표적화 기 예컨대, 리간드와 세포 또는 세포 수용체의 결합은 세포내이입을 개시할 수 있다. 표적화 기는 일가, 이가, 삼가, 사가 또는 그 이상의 원자가를 가질 수 있다. 표적화 기는 세포 표면 분자에 대한 친화성을 가진 화합물, 세포 수용체 리간드, 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 대한 친화성을 가진 항체 유사체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 표적화 기는 세포 수용체 리간드를 포함한다. 다양한 리간드가 약물 및 유전자를 세포 및 특정 세포 수용체에 표적화하는 데 사용되어 왔다. 세포 수용체 리간드는 탄수화물, 글리칸, 사카라이드(갈락토스, 갈락토스 유도체, 만노스 및 만노스 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 비타민, 폴레이트, 바이오틴, 앱타머 및 펩티드(RGD-함유 펩티드, 인슐린, 표피 성장 인자(EGF) 및 트랜스페린을 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 표적화 기의 예는 아시알로당단백질(ASGP) 또는 갈락토스 잔기를 사용하여 ASGP 수용체를 표적화하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 간세포는 ASGP 수용체를 함유한다. 따라서, 갈락토스-함유 표적화 기는 간세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 갈락토스 함유 표 적화 기는 갈락토스, N-아세틸갈락토스아민, 올리고사카라이드 및 사카라이드 클러스터(예컨대, Tyr-Glu-Glu-(아미노헥실 GalNAc)3, 라이신-기재 갈락토스 클러스터 및 콜란(cholane)-기재 갈락토스 클러스터)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 적절한 추가 접합체는 ASGP-수용체(ASGP-R) 상에서 발견되는 탄수화물 인식 도메인(CRD)에 결합할 수 있는 올리고사카라이드를 포함할 수 있다. 올리고사카라이드 및/또는 탄수화물 복합체를 함유하는 예시적 접합체 잔기는 미국 특허 제6,525,031호에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 전하 변경제는 중합체 상의 이온성 기의 전하를 변경시키는 기이다. 전하 변경제는 중합체 상의 하전된 기를 중화시킬 수 있거나 중합체 이온의 전하를 역으로 변경, 즉 양전하로부터 음전하로 변경시킬 수 있거나 음전하로부터 양전하로 변경시킬 수 있다. 다가이온의 전하 변경은 다가이온의 전하를 감소시킬 수 있거나, 반대 전하의 다가이온을 형성할 수 있거나, 다가양쪽성 전해질을 형성할 수 있다. 전하 변경은 원하는 순(net) 전하 또는 제타 전위를 가진 중합체를 형성하는 데 사용될 수도 있다. 순 전하 또는 제타 전위가 거의 중성에 가까운 접합체가 폴리뉴클레오타이드의 생체내 전달에 바람직하다. 바람직한 전하 변경제는 하전된 기 또는 이온성 기를 역으로 변경시킨다. 가역적 전하 변경제는 CDM, DM, CDM-티오에스터, CDM-마스킹제, CDM-입체 안정화제, CDM-리간드, CDM-PEG 및 CDM-갈락토스를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
제타 전위는 현탁액 중의 임의의 입자에 의해 나타나고 표면 전하와 밀접하 게 관련되어 있는 물성이다. 수성 매질에서, 샘플의 pH는 제타 전위에 영향을 미치는 가장 중요한 인자들 중 하나이다. 전하가 염기/산의 양성자화/탈양성자화를 기초로 한 것일 때, 상기 전하는 pH에 의존한다. 따라서, 제타 전위 값은 의미있기 위해서는 용액 상태, 특히 pH를 포함해야 한다. 전형적인 입자의 경우, 제타 전위의 크기는 콜로이드 시스템의 잠재적 안정성을 표시한다. 현탁액 중의 입자 전부가 큰 음의 또는 양의 제타 전위를 갖는 경우, 이 입자들은 서로 반발하는 경향을 있을 것이고 입자들이 서로 뭉치는 경향은 없다. 그러나, 입자들이 낮은 제타 전위 값을 갖는 경우, 입자들이 서로 뭉쳐 응집되는 것을 방해하는 힘이 없을 것이다. 전형적인 입자의 경우 안정한 현탁액과 불안정한 현탁액 사이의 일반적인 구분 경계는 일반적으로 +30 또는 -30 mV이다. 제타 전위가 +30 mV보다 큰 양의 값이거나 -30 mV보다 더 큰 음의 값인 입자는 통상적으로 안정한 것으로 간주된다. 본 발명자들은 본원에서 CDM-마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체가 생리학적 염 및 pH 9에서 +30 내지 -30 mV 사이의 제타 전위를 가질지라도 (동적 광학 산란, 분석 한외여과 또는 원자력 현미경에 의한 측정 시) 20 nm 미만 또는 10 nm 미만의 안정한 작은 입자를 형성할 수 있음을 입증한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드-접합체의 순 전하 또는 제타 전위는 마스킹제 또는 전하 변경제의 부착에 의해 조절될 수 있다. 중합체 전하, 특히 양전하는 혈청 성분 또는 비-표적 세포와의 원치 않는 상호작용을 초래할 수 있다. 입체 안정화제를 사용한 전하의 차폐 또는 전하의 변경을 통해 겉보기 표면 전하가 거의 중성인 접합체를 용이하게 제조할 수 있다. 중합체 상의 하전된 기를 변경함으로써 pH 9에서 측정된 제타 전위가 +30 내지 -30 mV, +20 내지 -20 mV, +10 내지 -10 mV 또는 +5 내지 -5 mV인 혈청 안정성 입자를 제조할 수 있다. pH 7에서 접합체의 순 전하는 pH 9에서의 순 전하보다 더 큰 양의 값을 가질 것으로 기대된다. 순 전하 또는 표면 전하는 폴리뉴클레오타이드 복합체의 생체내 전달에 있어서 중요한 인자이다.
불안정성 연결
연결 또는 연결기(linker)는 원하는 한 화학적 기 또는 분절을 하나 이상의 공유결합을 통해 원하는 또 다른 화학적 기 또는 분절에 연결시키는 2개의 원자 사이의 연결이다. 예를 들어, 연결은 폴리뉴클레오타이드 또는 마스킹제를 중합체에 연결할 수 있다. 연결의 형성은 2개의 분리된 분자를 하나의 분자 내로 연결할 수 있거나 동일한 분자 내의 2개의 원자를 연결할 수 있다. 연결은 중성 전하를 가질 수 있거나 양전하 또는 음전하를 가질 수 있다. 가역적 또는 불안정성 연결은 가역적 또는 불안정성 결합을 함유한다. 연결은 경우에 따라 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 유연성 및/또는 길이를 연결에 부가할 수도 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기, 아르알키닐 기(이들 각각은 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있음) 및 헤테로사이클을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 스페이서 기는 당업계에 잘 공지되어 있고 상기 목록은 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
가역적 또는 불안정성 결합은 동일한 분자 내의 다른 공유결합을 파괴하거나 절단하지 않을 조건 하에 선별적으로 파괴되거나 절단될 수 있는, 수소 원자와의 공유결합 이외의 공유결합이다. 보다 구체적으로, 가역적 또는 불안정성 결합은 적절한 조건 하에 동일한 분자 내의 다른 비-불안정성 공유결합보다 (열역학적으로) 덜 안정한 또는 (속도론적으로) 더 빨리 절단되는 공유결합이다. 한 분자 내의 불안정성 결합의 절단은 2개 이상의 분자를 형성시킬 수 있다. 당업자는 결합의 절단 또는 불안정성이 결합 절단의 반감기(t1/2) 또는 결합의 절반이 절단되는 데 필요한 시간의 관점에서 일반적으로 논의하고 있다. 오르쏘고날 결합은 하나는 절단되지만 나머지 결합은 절단되지 않는 조건 하에 절단되는 결합이다. 2개의 결합은 소정의 환경 하에 결합의 절단 반감기가 10배 이상 서로 상이한 경우 오르쏘고날한 것으로 간주된다. 따라서, 가역적 또는 불안정성 결합은 한 분자 내의 다른 결합보다 더 빨리 선별적으로 절단될 수 있는 결합을 포함한다.
전자 공여 또는 전자 끄는 기의 존재는 이 기의 전자 효과가 결합 절단의 속도에 영향을 미치도록 한 분자 내에서 절단가능한 결합에 충분히 가깝게 위치할 수 있다. 전자 끄는 기(EWG)는 분자의 또 다른 원자, 결합 또는 부분으로부터 전자 밀도를 끄는 분자의 원자 또는 부분이고, 이때 원하는 결합에 대한 전자 밀도의 감소가 있다(공여자). 전자 공여 기(EDG)는 분자의 또 다른 원자, 결합 또는 부분에 전자를 공여하는 분자의 원자 또는 부분이고, 이때 원하는 결합에 대한 전자 밀도의 증가가 있다(수용자). 전자 끄는 기/공여 기는 영향을 미치기에 충분히 가깝게 인접한 위치, 즉 전형적으로 절단될 결합의 약 3개 결합 내에 존재할 필요가 있다.
결합 절단 속도를 증가시키는 또 다른 방법은 작용기를 불안정성 결합으로서 동일한 분자 내에 혼입하는 것이다. 한 분자 내에서 작용기는 분자내 반응이 분자간 반응에 비해 유리하도록 서로 인접하여 존재할 수 있다. 한 분자 내에서 작용기가 서로 인접하여 존재한다는 것은 효과적으로 작용기의 국소적 고농도를 초래할 수 있다. 일반적으로, 분자내 반응은 분자간 반응보다 훨씬 더 빠르다. 5 또는 6개의 원자에 의해 분리되어 있는 반응성 기는 5-원 또는 6-원 고리 전이 상태의 형성으로 인해 특히 불안정성 결합을 형성할 수 있다. 그 예는 카복실산 유도체(산, 에스터, 아마이드), 및 동일한 분자 내에서 서로 반응하여 에스터, 카복실산 및 카보네이트 에스터, 포스페이트 에스터, 티올 에스터, 산 무수물 또는 아마이드를 형성하는 알코올, 티올, 카복실산 또는 아민을 갖는 기들을 포함한다. 입체 상호작용은 결합에 대한 절단 속도를 변경할 수도 있다.
적절한 조건은 불안정성 결합의 유형에 의해 결정되고 유기화학 분야에 잘 공지되어 있다. 불안정성 결합은 pH, 산화성 또는 환원성 조건 또는 시약, 온도, 염 농도, 효소의 존재, 또는 첨가된 물질의 존재에 민감할 수 있다. 예를 들어, 특정 펩티드, 에스터 또는 사카라이드 연결기는 적절한 효소의 존재 하에 절단될 수 있다. 또 다른 예에서, 증가한 또는 감소한 pH는 pH 불안정성 결합에 적합한 조건일 수 있다. 또 다른 예에서, 산화 조건은 산화적 불안정성 결합에 적합한 조건일 수 있다. 또 다른 예에서, 환원 조건은 환원적 불안정성 결합에 적합한 조건일 수 있다. 예를 들어, 2가지 알킬 티올로부터 제조된 다이설파이드는 탄소-탄소 결합의 절단 없이 티올의 존재 하의 환원에 의해 절단될 수 있다. 이 예에서, 탄 소-탄소 결합은 환원 조건에 대해 불안정성을 나타내지 않는다.
불안정성 기가 변환될 속도는 불안정성 기를 함유하는 분자의 화학적 성분을 변경함으로써 조절할 수 있다. 예를 들어, 불안정성 기에 가까운 특정 화학적 잔기(예를 들어, 전자 수용자 또는 공여자)의 부가는 화학적 변환이 일어날 특정 조건(예를 들어, pH)에 영향을 미칠 수 있다.
분자는 하나보다 많은 수의 가역적 또는 불안정성 결합을 함유할 수 있다. 하나보다 많은 수의 가역적 또는 불안정성 결합이 분자 내에 존재하고 모든 가역적 또는 불안정성 결합이 동일한 유형(동일한 조건 하에 거의 동일한 속도로 절단됨)인 경우, 분자는 다수의 가역적 또는 불안정성 결합을 함유한다. 하나보다 많은 가역적 또는 불안정성 결합이 분자 내에 존재하고 가역적 또는 불안정성 결합이 상이한 유형(불안정성에 적합한 조건, 또는 불안정성 결합의 화학적 작용기를 기초로 함)인 경우, 분자는 오르쏘고날 가역적 또는 불안정성 결합을 함유한다. 오르쏘고날 가역적 또는 불안정성 결합은 제2 유형의 가역적 결합이 절단되거나 파괴되지 않은 상태로 남아있게 하면서 제1 유형의 가역적 또는 불안정성 결합을 절단하는 능력을 제공한다. 즉, 2개의 불안정성 결합은 하나의 결합이 다른 하나의 결합이 온전한 상태로 남아 있는 조건 하에 절단될 수 있는 경우 서로 오르쏘고날하다. 오르쏘고날 보호기는 유기화학 분야에서 잘 공지되어 있고 오르쏘고날 결합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 생리학적 불안정성 결합은 통상적인 조건 또는 포유동물 체내의 환경과 유사한 조건 하에 절단될 수 있는 불안정성 결합이다. 생 리학적 불안정성 결합 기는 이 기가 특정 생리학적 조건 하에 존재하는 경우 화학적으로 변환되도록(예를 들어, 절단되도록) 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포의 생리학적 불안정성 결합은 포유동물의 세포내 조건 하에 절단될 수 있는 불안정성 결합이다. 포유동물의 세포내 조건은 포유동물 세포의 환경 또는 이와 유사한 환경에서 발견되는 화학적 조건 예컨대, pH, 온도, 산화 조건, 환원 조건, 산화제, 환원제 및 염 농도를 포함한다. 포유동물의 세포내 조건은 포유동물 세포에 통상적으로 존재하는 효소 활성 예컨대 단백질분해 또는 가수분해 효소의 활성의 존재도 포함한다. 세포의 생리학적 불안정성 결합은 약학적으로 허용가능한 외래 물질의 투여에 반응하여 절단될 수도 있다. 45분 미만의 반감기로 절단되는 생리학적 불안정성 결합은 고불안정성 결합으로 간주된다. 15분 미만의 반감기로 절단되는 생리학적 불안정성 결합은 초고불안정성 결합으로 간주된다.
화학적 변환(불안정성 결합의 절단)은 약학적으로 허용가능한 물질을 세포에 첨가함에 의해 개시될 수 있거나 상기 불안정성 결합을 함유하는 분자가 적절한 세포내 및/또는 세포외 환경에 도달할 때 자연발생적으로 일어날 수 있다. 예를 들어, pH 불안정성 결합은 분자가 산성화된 엔도좀으로 들어가는 경우 절단될 수 있다. 따라서, pH 불안정성 결합은 엔도좀에 의해 절단될 수 있는 결합인 것으로 간주될 수 있다. 효소에 의해 절단될 수 있는 결합은 효소 예컨대, 엔도좀, 라이소좀 또는 세포질에 존재하는 효소에 노출된 경우 절단될 수 있다. 다이설파이드 결합은 분자가 세포질의 환경 중에서 환원성이 보다 높은 환경으로 들어가는 경우 절 단될 수 있다. 따라서, 다이설파이드는 세포질에 의해 절단될 수 있는 결합인 것으로 간주될 수 있다.
pH 불안정성 결합: 본원에서 사용된 바와 같이, pH 불안정성 결합은 산성 조건(pH < 7) 하에 선별적으로 절단되는 불안정성 결합이다. 이러한 결합은 엔도좀 불안정성 결합으로도 지칭되는데, 이는 세포의 엔도좀 및 라이소좀의 pH가 7 미만이기 때문이다. 용어 "pH 불안정성"은 pH 불안정성 결합, pH 고불안정성 결합 및 pH 초고불안정성 결합을 포함한다. pH 불안정성 결합은
a) 산성 환경(pH 4 초과 내지 7 미만) 하에 불안정하여 다이올 및 케톤을 형성하는 케탈,
b) 산성 환경(pH 4 초과 내지 7 미만) 하에 불안정하여 다이올 및 알데하이드를 형성하는 아세탈,
c) 산성 환경(pH 4 초과 내지 7 미만) 하에 불안정하여 아민 및 알데하이드 또는 케톤을 형성하는 이민 또는 이미늄,
d) 산성 환경 하에 불안정한 규소-산소-탄소 결합,
e) 규소-질소 (실라잔) 결합,
f) 규소-탄소 결합(아릴실란, 비닐실란 및 알릴실란),
g) 말레산 무수물 유도체 및 아민으로부터 합성된 말레아메이트-아마이드 결합,
h) 오르쏘 에스터,
i) 하이드라존,
j) 산 촉매 가수분해를 겪도록 디자인된 활성화된 카복실산 유도체(에스터, 아마이 드), 및
k) 비닐 에테르
를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
유기실란은 (규소-산소-탄소 결합의) 형성이 용이하고 산성 조건 하에 보호기의 제거가 용이하기 때문에 유기 합성에서 산소 보호기로서 오랫동안 사용되어 왔다. 예를 들어, 실릴 에테르 및 실릴에놀에테르는 둘다 상기 결합을 보유한다. 규소-산소-탄소 결합은 실라놀 및 알코올(또는 에놀)을 형성하는 산성 조건 하에 가수분해되기 쉽다. 규소 원자 및 알코올 탄소 상의 치환은 입체 효과 및 전자 효과로 인해 가수분해의 속도에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 유기실란, 알코올, 또는 유기실란 및 알코올 둘다 상의 치환을 변경하여 원하는 효과를 촉진함으로써 규소-산소-탄소 결합의 가수분해 속도를 조절할 수 있게 한다. 또한, 하전된 또는 반응성 기 예컨대, 아민 또는 카복실레이트는 규소 원자에 연결될 수 있고, 이것은 전하 및/또는 반응성을 불안정성 화합물에 부여한다.
실라잔의 가수분해는 실라놀 및 아민을 형성시킨다. 실라잔은 본질적으로 규소-산소-탄소 결합보다 더 가수분해에 민감하지만, 가수분해의 속도는 산성 조건 하에 증가한다. 규소 원자 및 아민 상의 치환은 입체 효과 및 전자 효과로 인해 가수분해의 속도에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 규소 또는 아민 상의 치환을 변경함으로써 원하는 효과를 촉진하여 실라잔의 가수분해 속도를 조절할 수 있게 한다.
pH 불안정성 결합의 또 다른 예는 산 불안정성 에놀 에테르 결합의 사용이 다. 이 불안정성 결합이 절단되는 속도는 형성된 카보닐 화합물 및 방출된 알코올의 구조에 의존한다. 예를 들어, β-할로에테르로부터 합성될 수 있는 에틸 아이소프로페닐 에테르의 유사체의 반감기는 pH 5에서 약 2분이다. 페놀 에테르로부터 합성될 수 있는 에틸 사이클로헥세닐 에테르의 유사체의 반감기는 pH 5에서 약 14분이다.
무수물과 아민의 반응은 아마이드 및 산을 형성한다. 전형적으로, 역 반응(무수물 및 아민의 형성)은 매우 느리고 에너지 관점에서 불리하다. 그러나, 무수물이 환형 무수물인 경우, 아민과의 반응은 아마이드 및 산이 동일한 분자 내에 존재하는 분자, 즉 아마이드 산을 생성한다. 동일한 분자 내에 두 반응성 기(아마이드 및 카복실산)가 존재함으로써 역 반응을 가속화시킨다. 특히, 일차 아민과 말레산 무수물 및 말레산 무수물 유도체인 말레암산의 반응 생성물은 그의 비-환형 유사체보다 1x109 내지 1x1013배 더 빨리 아민 및 무수물로 다시 전환된다(Kirby 1980).
아민과 무수물의 반응은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 아마이드 및 산을 형성한다:
Figure 112009009685988-pct00002
아민과 환형 무수물의 반응은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이 아마이드 산을 형성한다:
Figure 112009009685988-pct00003
아민 및 무수물을 형성하는 아마이드 산의 절단은 pH-의존적이고 산성 pH에서 크게 가속화된다. 이 pH-의존적 반응성은 가역적 pH 감수성 결합 및 연결기를 형성하는 데 이용될 수 있다. 시스-아코니트산은 이러한 pH 감수성 연결기 분자로서 사용되어 왔다. 먼저, γ-카복실레이트를 분자에 커플링한다. 제2 단계에서, α 또는 β 카복실레이트를 제2 분자에 커플링하여 상기 2개 분자의 pH 감수성 커플링을 형성한다. pH 5에서 이 연결기의 반감기는 8 내지 24시간이다. 시스-아코니트산 무수물 및 말레산 무수물의 구조는 각각 하기 화학식 3 및 4로 표시된다:
Figure 112009009685988-pct00004
Figure 112009009685988-pct00005
절단이 일어나는 pH에서 화학적 성분을 불안정성 잔기에 첨가함으로써 조절한다. 말레암산이 아민 및 말레산 무수물로 전환되는 속도는 말레산 무수물 시스템의 치환(R2 및 R3)에 크게 의존한다. R2가 메틸인 경우, 전환 속도는 R2 및 R3이 수소인 경우보다 50배 더 높다. R2 및 R3 둘다에 알킬 치환이 존재하는 경우(예를 들어, 2,3-다이메틸말레산 무수물), 속도 증가가 비-치환된 말레산 무수물보다 10,000배 더 현저히 빠르다. 2,3-다이메틸말레산 무수물을 사용한 아민의 변경으로부터 형성된 말레아메이트 결합은 절단되어 pH 5에서 반감기가 4 내지 10분인 무수물 및 아민으로 복귀된다. R2 및 R3이 수소보다 더 큰 기인 경우 아마이드-산이 아민 및 무수물로 전환되는 속도가 R2 및/또는 R3이 수소인 경우보다 더 빠를 것으로 예상된다.
pH 고불안정성 결합: pH 고불안정성 결합은 pH 5에서 절단에 대한 반감기가 45분 미만이다. pH 고불안정성 결합의 형성은 화학 분야에서 잘 공지되어 있다.
pH 초고불안정성 결합: pH 초고불안정성 결합은 pH 5에서 절단에 대한 반감기가 15분 미만이다. pH 초고불안정성 결합의 형성은 화학 분야에서 잘 공지되어 있다.
폴리뉴클레오타이드와 중합체의 연결
폴리뉴클레오타이드를 세포로 전달하는 대부분의 종래 방법은 양이온성 전달제 예컨대, 양이온성 중합체 또는 양이온성 지질을 사용한 음이온성 핵산의 복합체 형성에 의존한다. 보다 큰 폴리뉴클레오타이드 예를 들어, 플라스미드를 갖는 정전기적 복합체는 생리학적 용액 중에서 응집되는 경향이 있고 그 크기가 500 nm보다 더 커진다. 보다 작은 폴리뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드는 그의 작은 크기 때문에 잠재적 전달제를 갖는 불안정한 정전기적 복합체를 형성한다. 폴리뉴클레오타이드를 팩키징하는 효과적인 방법은 폴리뉴클레오타이드를 전달 비히클에 공유결합시키는 것이다. 그러나, 중합체에의 부착은 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 활성을 억제할 수 있다. 본 발명자들은 폴리뉴클레오타이드가 세포로 전달된 후 절단되는 가역적 연결기를 통해 폴리뉴클레오타이드를 중합체에 부착시킴으로써 기능적 활성 폴리뉴클레오타이드를 생체내 세포에 전달할 수 있음을 발견하였다. 가역적 연결기는 특정 생리학적 조건(예를 들어, 세포의 세포질의 환원 환경) 하에 존재하는 경우 화학적 변환(예를 들어, 절단)을 겪도록 선택된다. 폴리뉴클레오타이드와 전달 또는 막 활성 중합체의 연결은 폴리뉴클레오타이드가 생체내 세포에 전달되는 것을 증강시킨다. 가역적 결합의 절단에 의한 중합체로부터의 폴리뉴클레오타이드의 방출은 활성에 적합한 세포 성분과 폴리뉴클레오타이드의 상호작용을 촉진한다.
폴리뉴클레오타이드 이외에, 다른 막 불투과성 분자 또는 막 투과성이 낮은 분자도 본원에 기재된 다가접합체 전달 비히클을 사용하여 생체내 세포에 전달할 수 있다. 막 활성 중합체에 가역적으로 부착되기에 적합한 분자는 단백질, 항체, 항체 단편, 전사 인자, 소분자 약물, 항암제, 및 전사에 영향을 미치는 합성 분자를 비롯한 다른 합성 분자를 포함한다.
막 불투과성 분자와 막 활성 중합체의 연결은 적합한 크기의 생체내 전달 비히클의 형성을 가능하게 한다. 본원에 기재된 분자 접합체는 본질적으로 중합체성을 갖고 다른 중합체의 경우 관찰된 것과 유사한 크기 및 표적화 성질을 갖는다. 혈관내 (시스템) 전달의 경우, 상기 비히클은 원하는 실질 세포에 도달하기 위해 내피 장벽을 관통할 수 있을 필요가 있다. 가장 큰 내피 창(fenestrae)(내피 장벽 내의 공극)이 간에 존재할 수 있고 그 평균 직경은 약 100 nm이다. 다른 기관에서의 경-내피 공극은 훨씬 더 작다. 예를 들어, 근육 내피는 반경이 4 nm인 다수의 작은 공극 및 반경이 20 내지 30 nm인 적은 수의 큰 공극을 갖는 구조체로서 기술될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 전달 비히클의 크기도 세포 흡수 과정에 중요하다. 세포내이입을 통한 세포 내부이입은 직경이 약 100 nm, 즉 세포내이입 소포체의 크기인 복합체로 한정되는 것으로 생각된다. 기재된 접합체의 크기는 100 nm 미만, 보다 바람직하게는 50 nm 미만, 보다 더 바람직하게는 20 nm 미만 또는 10 nm 미만이다.
신장 한외여과는 친수성 단백질, 중합체 및 중합체-단백질 접합체가 혈액으로부터 제거되는 주 경로들 중 하나이다. 이 과정에 영향을 미치는 파라미터 중에는 화학적 조성, 크기 및 전하가 있다. 약 70 kDa보다 큰 구형 단백질은 신장 한 외여과에 의해 거의 제거되지 않는다. 따라서, 입체 안정화제 예컨대, PEG의 접합은 이 안정화제가 부착된 중합체의 유효 분자 크기를 증가시킴으로써 신장 제거율을 감소시킨다. 분자량이 8 kDa 미만인 PEG의 한외여과는 제한되지 않지만, 분자량이 8 내지 30 kDa인 PEG의 한외여과는 분자 크기에 의해 결정된다. 분자량이 30 kDa을 초과하는 경우, PEG 제거는 급격히 감소한다. 이러한 이유로, 전체 크기가 약 10 kDa보다 큰, 약 20 kDa보다 큰 또는 약 30 kDa보다 큰 마스킹된 중합체-폴리뉴클레오타이드 접합체가 바람직하다. 중합체의 증가한 분자량은 신장 한외여과를 감소시키는 것 이외에 증강된 수동 투과 및 보유 기작에 의한 투과성 조직 예컨대, 종양 내로의 축적을 촉진할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 또는 "다가핵산"은 2개 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 중합체를 지칭하는 당업계의 용어이다. 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 중합체의 단량체 단위체이다. 120개 미만의 단량체 단위체를 갖는 폴리뉴클레오타이드는 종종 올리고뉴클레오타이드로 지칭된다. 천연 핵산은 데옥시리보스- 또는 리보스-포스페이트 골격을 갖는다. 비-천연 또는 합성 폴리뉴클레오타이드는 시험관내 또는 세포 무함유 시스템에서 중합되고 동일한 또는 유사한 염기를 함유하나 천연 리보스- 또는 데옥시리보스-포스페이트 골격과는 다른 유형의 골격을 보유할 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다. 폴리뉴클레오타이드는 당업계의 임의의 공지된 기법을 이용하여 합성할 수 있다. 당업계에 공지된 폴리뉴클레오타이드 골격은 PNA(펩티드 핵산), 포스포로티오에이트, 포스포로다이아미데이트, 모르폴리노, 및 천연 핵산의 포스페이트 골격의 다른 변이체를 포함한다. 염기는 천연 화합물인 아데닌, 타이민, 구아닌, 사이토신, 우라실, 이노신 및 천연 유사체를 포함하는 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체는 새로운 반응성 기 예컨대, 아민, 알코올, 티올, 카복실레이트 및 알킬할라이드(이들로 한정되지 않음)가 뉴클레오타이드 상에 배치된 변이체를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 용어 "염기"는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체들 중 임의의 유사체를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 및 DNA, RNA 및 다른 천연 및 합성 뉴클레오타이드의 조합물을 포함한다.
DNA는 cDNA, 시험관 내에서 중합된 DNA, 플라스미드 DNA, 플라스미드 DNA의 부분, 바이러스로부터 유래한 유전물질, 선형 DNA, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC 및 인공 염색체), 발현 벡터, 발현 카세트, 키메라 서열, 재조합 DNA, 염색체 DNA, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 DNA, 또는 이 기들의 유도체 형태일 수 있다. RNA는 메신저 RNA(mRNA), 시험관 내에서 중합된 RNA, 재조합 RNA, 올리고뉴클레오타이드 RNA, 전달 RNA(tRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 리보좀 RNA(rRNA), miRNA, 라이보자임, 외부 가이드 서열, 작은 비-메신저 RNA(snmRNA), 비번역되는 RNA(utRNA), snoRNA(안티센스 기작에 의해 작용되는 변형된 24-머 snmRNA), 작은 비-코딩 RNA(tncRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 이 기들의 유도체 형태일 수 있다. 또한, DNA 및 RNA는 단일, 이중, 삼중 또는 사중 가닥일 수 있다. 이중, 삼중 및 사중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA 둘다를 함유할 수 있거나 천연 및/또는 합성 핵산의 다른 조합물을 함유할 수 있다.
블록킹 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA의 기능 또는 발현을 방해하는 폴리뉴클레오타이드이다. 블록킹 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되지 않지만 세포 내에서의 그의 존재 또는 발현은 세포 유전자 또는 RNA의 발현 또는 기능을 변경시킨다. 블록킹 폴리뉴클레오타이드는 특정의 세포 RNA, 통상적으로 mRNA의 기능 또는 번역을 서열-특이적 방식으로 파괴하거나 억제한다. 따라서, RNA의 억제는 RNA가 전사되는 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 블록킹 폴리뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNA 방해 폴리뉴클레오타이드, dsRNA, siRNA, miRNA, hRNA, 라이보자임, 햄머헤드 라이보자임, 외부 가이드 서열(미국 특허 제5,962,426호), snoRNA, 삼중-나선 형성 올리고뉴클레오타이드 RNA 중합효소 II에 의해 전사되는 블록킹 폴리뉴클레오타이드 코딩 DNA, RNA 중합효소 III에 의해 전사되는 블록킹 폴리뉴클레오타이드 코딩 DNA를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 블록킹 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 또는 RNA와 DNA의 조합물일 수 있거나, 비-천연 또는 합성 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
블록킹 폴리뉴클레오타이드는 시험관 내에서 중합될 수 있거나, 재조합 제조될 수 있거나, 키메라 서열 또는 이의 유도체를 함유할 수 있다. 블록킹 폴리뉴클레오타이드는 표적 RNA 또는 유전자가 억제되도록 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 합성 뉴클레오타이드 또는 임의의 적합한 조합물을 함유할 수 있다.
RNA 방해(RNAi) 폴리뉴클레오타이드는 포유동물 세포의 RNA 방해 경로 기구 와의 상호작용을 통해 RNA 방해를 유도하여 서열 특이적 방식으로 형질전환유전자(transgene)의 mRNA 전사체를 파괴하거나 상기 mRNA 전사체의 번역을 억제할 수 있다. 2가지 주요 RNAi 폴리뉴클레오타이드는 작은 (또는 짧은) 방해 RNA(siRNA) 및 miRNA이다. 그러나, 다른 폴리뉴클레오타이드도 RNA 방해를 매개하는 것으로 밝혀져 있다. RNAi 폴리뉴클레오타이드는 siRNA, miRNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA), shRNA, 및 RNA 방해를 유도할 수 있는 RNA를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. siRNA는 전형적으로 15 내지 50개의 염기쌍, 바람직하게는 21개 내지 25개의 염기쌍을 함유하며 세포 내에서 발현된 표적 유전자 또는 RNA 내의 코딩 서열과 동일하거나(완전히 상보적임) 또는 거의 동일한(부분적으로 상보적임) 뉴클레오타이드 서열을 갖는 이중 가닥 구조체를 포함한다. siRNA는 다이뉴클레오타이드 3' 오버행(overhang)을 가질 수 있다. siRNA는 2개의 어닐링된 폴리뉴클레오타이드로 구성될 수 있거나, 헤어핀 구조체를 형성하는 단일 폴리뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 접합체의 siRNA는 2개의 올리고뉴클레오타이드 단편으로부터 조립되고, 이때 하나의 단편은 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 단편은 siRNA 분자의 센스 영역의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥은 연결기 분자 예컨대, 폴리뉴클레오타이드 연결기 또는 비-뉴클레오타이드 연결기를 통해 안티센스 가닥에 연결된다. miRNA는 그의 mRNA 표적물의 파괴 또는 번역 억제를 유도하는 약 22개 뉴클레오타이드 길이의 작은 비-코딩 RNA 유전자 생성물이다. miRNA와 표적 mRNA 사 이의 상보성이 부분적인 경우, 표적 mRNA의 번역이 억제되는 반면, 상기 상보성이 광범위한 경우, 표적 mRNA가 절단된다. miRNA의 경우, 복합체는 전형적으로 miRNA와 부분적 상보성만을 공유하는 mRNA의 3'UTR에 통상적으로 위치하는 표적 부위에 결합한다. "시드(seed) 영역", 즉 표적물과의 완전한 염기 짝짓기를 형성하는 miRNA의 5'말단 상에 존재하는 약 7개의 연속 뉴클레오타이드로 구성된 스트레치(stretch)는 miRNA 특이성에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. RISC/miRNA 복합체와 mRNA의 결합은 단백질 번역의 억제 또는 mRNA의 절단 및 분해를 이끌어 낼 수 있다. 최근 데이터는 시드 영역에서만 완전한 염기 짝짓기를 보여주는 대신에 miRNA와 그의 표적물 사이에 전체 길이에 걸쳐 완전한 상동성이 있는 경우 mRNA 절단이 우세하게 일어남을 입증한다(Pillai et al. 2007).
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 mRNA에 존재하는 서열에 상보적인 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 특이적 방식으로 mRNA에 결합(mRNA와 염기 짝짓기)한다. 이 결합은 다른 세포 효소가 mRNA에 결합하는 것을 방해하여 mRNA의 번역 억제 또는 파괴를 이끌어 낼 수 있다.
외부 가이드 서열은 전구체 tRNA-유사 복합체(미국 특허 제5,624,824호)를 형성함으로써 표적 RNA의 RNase P-매개 절단을 유도하는 짧은 안티센스 올리고리보뉴클레오타이드이다.
라이보자임은 전형적으로 표적 mRNA에 상보적인 서열을 함유하는 RNA 올리고뉴클레오타이드로서, mRNA를 절단하는 효소로서 작용하는 RNA 서열이다. mRNA의 절단은 번역을 방해한다.
블록킹 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단, 3'-말단, 또는 5'-말단 및 3'-말단 둘다에서 말단 캡 잔기를 포함할 수 있다. 상기 캡 잔기는 도립된 데옥시 어베이직(abasic) 잔기, 도립된 데옥시 티미딘 잔기, 티미딘 잔기 또는 3' 글리세릴 변이체일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
RNA 중합효소 II 및 III에 의해 전사되는 DNA는 세포 내에서 전사되어 siRNA로서 작용할 수 있는 shRNA, 분리된 센스 및 안티센스 가닥 선형 siRNA, 라이보자임, 또는 안티센스 RNA로서 작용할 수 있는 선형 RNA를 생성할 수 있다. RNA 중합효소 III에 의해 전사되는 DNA는 U6 프로모터, H1 프로모터 및 tRNA 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된 프로모터를 함유한다. RNA 중합효소 II 프로모터는 U1, U2, U4 및 U5 프로모터, snRNA 프로모터, miRNA 프로모터 및 mRNA 프로모터를 포함한다.
공지된 miRNA 서열의 목록은 연구 기관 예컨대, 웰컴 트러스트 생거 인스티튜트(Wellcome Trust Sanger Institute), 펜 센터 포 바이오인포매틱스(Penn Center for Bioinformatics), 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터(Memorial Sloan Kettering Cancer Center) 및 유럽 분자생물학 연구실 등에 의해 유지되는 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 공지된 효과적인 siRNA 서열 및 동족 결합 부위도 관련 문헌에 기재되어 있다. RNAi 분자는 당업계에 공지된 기법에 의해 용이하게 디자인되고 제조된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프의 발견 가능성을 증가시키는 평가 수단도 있다(Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004).
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 변경될 수 있다. 화학적으로 변경된 폴리뉴클레오타이드의 사용은 생체내 뉴클레이즈 분해에 대한 내성, 세포 흡수, 활성, 및 서열-특이적 혼성화를 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리뉴클레오타이드의 다양한 성질을 개선할 수 있다. 이러한 화학적 변형의 비-제한적 예는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 사이의 결합, 2'-데옥시 리보뉴클레오타이드, "보편적 염기" 뉴클레오타이드, 5-C-메틸 뉴클레오타이드 및 도립된 데옥시 어베이직 잔기 도입을 포함한다. 이러한 화학적 변경은 다양한 폴리뉴클레오타이드 구축물(construct)에 사용된 경우 이 화합물의 혈청 안정성을 급격히 증가시키면서 동시에 세포 내에서 폴리뉴클레오타이드 활성을 보존하는 것으로 밝혀져 있다. 화학적으로 변경된 siRNA는 인간에서 인터페론 활성을 활성화시킬 가능성을 최소화할 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화학적으로 변경된 RNAi 폴리뉴클레오타이드는 2개의 가닥을 갖는 이중체(duplex)를 포함하고, 상기 2개의 가닥 중 하나 또는 둘다는 화학적으로 변경될 수 있고, 이때 각 가닥은 약 19 내지 약 29개(예를 들어, 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29개)의 뉴클레오타이드를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오타이드는 세포 또는 재구성된 시험관내 시스템 내에서 RNAi를 매개하는 능력을 유지하면서 하나 이상의 변경된 뉴클레오타이드를 포함한다. RNAi 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 변경될 수 있 고, 이때 화학적 변경은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 개수)의 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오타이드는 RNAi 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 뉴클레오타이드의 총수의 비율로서 변경된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RNA 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 뉴클레오타이드 위치의 약 5 내지 약 100%(예를 들어, 뉴클레오타이드 위치의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 변경된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 소정의 RNAi 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 변경된 뉴클레오타이드의 실제 비율은 RNAi 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 뉴클레오타이드의 총수에 의존한다. RNAi 폴리뉴클레오타이드가 단일 가닥인 경우, 변경률(%)은 단일 가닥 RNAi 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 뉴클레오타이드의 총수를 기준으로 한 것일 수 있다. 마찬가지로, RNAi 폴리뉴클레오타이드가 이중 가닥인 경우, 변경률(%)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘다에 존재하는 뉴클레오타이드의 총수를 기준으로 한 것일 수 있다. 또한, 소정의 RNAi 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 변경된 뉴클레오타이드의 실제 비율은 RNAi 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 퓨린 및 피리미딘의 총수에 달려 있다. 예를 들어, RNAi 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 모든 피리미딘 뉴클레오타이드 및/또는 모든 퓨린 뉴클레오타이드가 변형된다.
RNAi 폴리뉴클레오타이드는 유전자에 의해 코딩된 RNA의 발현을 조절한다. 다수의 유전자가 서로 어느 정도의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에 RNAi 폴 리뉴클레오타이드는 충분한 서열 상동성을 갖는 일군의 유전자들을 표적화하도록 디자인될 수 있다. RNAi 폴리뉴클레오타이드는 상이한 유전자 표적물 사이에 공유될 수 있는 서열에 대한 상보성을 갖는 서열 또는 특정한 유전자 표적물에 대해 유일한 서열을 함유할 수 있다. 그러므로, RNAi 폴리뉴클레오타이드는 여러 유전자들 사이에 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존 영역을 표적화하여 한 유전자 패밀리에 속하는 여러 유전자들(예를 들어, 다양한 유전자 아이소폼(isoform), 스플라이스 변이체, 돌연변이체 유전자 등)을 표적화하도록 디자인될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RNAi 폴리뉴클레오타이드는 단일 유전자의 특정한 RNA 서열에 대해 유일한 서열을 표적화하도록 디자인될 수 있다.
용어 "상보성"은 보편적인 와슨-크릭 또는 다른 비-보편적인 종류의 결합에 의해 또 다른 폴리뉴클레오타이드 서열과 수소결합을 형성하는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 언급할 때, 폴리뉴클레오타이드 분자와 그의 표적물(이펙터 결합 부위) 또는 상보적 서열의 결합을 위한 결합 자유 에너지는 상기 폴리뉴클레오타이드의 관련 기능 예를 들어, 효소 mRNA 절단 또는 번역 개시가 진행되게 하기에 충분하다. 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지의 측정은 당업계에 잘 공지되어 있다(Frier et al. 1986, Turner et al. 1987). 상보성(%)은 제2 폴리뉴클레오타이드 서열과 수소결합(예를 들어, 와슨-크릭 염기 짝짓기)을 형성할 수 있는, 제1 폴리뉴클레오타이드 분자의 연속 가닥 내 염기의 비율을 표시한다(예를 들어, 10개의 염기 중 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 염기가 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 서열과 수소결합을 형성하는 경우, 상보성 은 각각 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%임). "완전히 상보적인"이라 함은 폴리뉴클레오타이드 서열의 연속 가닥 내 염기 전부가 제2 폴리뉴클레오타이드 서열의 동일한 수의 연속 염기와 수소결합을 할 것임을 의미한다.
유전자 발현을 억제하거나, 하향-조절하거나 또는 넉다운시킨다는 것은 유전자로부터 전사된 RNA의 수준, 또는 RNA로부터 번역된 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유니트의 수준에 의해 측정된 유전자의 발현도가 본 발명의 블록킹 폴리뉴클레오타이드-접합체의 부재 하에 관찰된 발현도보다 낮은 수준으로 감소함을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의해 전달된 폴리뉴클레오타이드를 사용한 유전자 발현의 억제, 하향-조절 또는 넉다운은 바람직하게는 조절 불활성 핵산, 즉 뒤섞인 서열 또는 불활성화 불일치(mismatch)를 갖는 핵산의 존재 또는 폴리뉴클레오타이드와 마스킹된 중합체의 접합의 부재 하에 관찰된 수준보다 낮다.
전달된 폴리뉴클레오타이드는 내재 유전물질로부터 떨어져 세포질 또는 핵 내에 머무를 수 있다. 별법으로, DNA는 내재 유전물질과 재조합될(내재 유전물질의 일부가 될) 수 있다. 재조합은 DNA가 상동 재조합 또는 비-상동 재조합에 의해 염색체 DNA 내로 삽입될 수 있게 한다.
폴리뉴클레오타이드는 내재 뉴클레오타이드 서열을 발현하도록, 내재 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제, 제거, 증강 또는 변경시키도록, 또는 세포와 천연적으로 관련되어 있는 특정한 생리학적 특징에 영향을 미치도록 세포에 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 전체 또는 부분 단백질 또는 RNA를 발현하도록 코딩된 발현 카세트를 함유할 수 있다. 발현 카세트는 서열을 발현할 수 있는 천연 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합적으로 제조된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "재조합"은 분자 생물학적 기법에 의해 서로 연결된 폴리뉴클레오타이드의 분절로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 지칭한다. 상기 카세트는 원하는 서열의 발현에 영향을 미치는 임의의 다른 서열과 함께 원하는 유전자의 코딩 서열을 함유한다. 발현 카세트는 전형적으로 프로모터(전사 개시를 가능하게 함) 및 전사될 서열을 포함한다. 경우에 따라, 발현 카세트는 전사 인핸서(enhancer), 비-코딩 서열, 스플라이싱 신호, 전사 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. RNA 발현 카세트는 전형적으로 번역 개시 코돈(번역 개시를 허용함) 및 하나 이상의 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 경우에 따라, 발현 카세트는 번역 종결 신호, 폴리아데노신 서열, 내부 리보좀 도입 부위(IRES) 및 비-코딩 서열을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드는 표적 세포에서 특정 기능을 수행하지 않으나 폴리뉴클레오타이드의 생성에 사용되는 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 숙주 유기체 내에서 폴리뉴클레오타이드의 복제 또는 선별에 필요한 서열을 포함하나 이로 한정되지 않는다.
용어 "유전자"는 일반적으로 치료 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 라이보자임), 폴리펩티드 또는 전구체의 생성에 필요한 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능적 성질(예컨대, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달도입)이 보유되는 한 전장 코딩 서열 또는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 용어는 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록 5' 말단 및 3' 말단으로부터 약 1 kb 이상의 거리에 존재하는 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함하는 유전자의 코딩 영역을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치하며 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비-번역 서열로서 지칭된다. 코딩 영역의 3' 또는 다운스트림에 위치하며 mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 비-번역 서열로서 지칭된다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 인트론, 개재 영역 또는 개재 서열로 지칭되는 비-코딩 서열이 개재되어 있는 코딩 서열을 함유한다. 인트론은 핵 RNA로 전사되는 유전자의 분절이다. 인트론은 인핸서와 같은 조절 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차 전사체로부터 제거되거나 스플라이싱되므로, 인트론은 성숙 RNA 전사체에 존재하지 않는다. mRNA는 번역 과정 동안에 신생 폴리펩티드의 아미노산의 서열 또는 순서를 특정하도록 기능한다. 또한, 유전자는 프로모터, 인핸서, 전사 인자 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, IRES, 사일런서(silencer), 절연 서열, 매트릭스 부착 영역을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 영역 또는 서열을 포함할 수 있다. 이 서열은 유전자의 코딩 영역에 인접한 부위(10,000개 이내의 뉴클레오타이드 만큼 떨어진 부위) 존재할 수 있거나 원거리 부위(10,000개보다 많은 뉴클레오타이드 만큼 떨어진 부위)에 존재할 수 있다. 이 비-코딩 서열은 유전자의 전사 및/또는 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다. 유전자의 공유 변경은 전사의 속도(예를 들어, 게놈 DNA의 메틸 화), mRNA의 안정성(예를 들어, 3' 폴리아데노신 테일의 길이), 번역 속도(예를 들어, 5' 캡), 핵산 복구, 핵 수송 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 핵산의 공유 변경의 한 예는 LABELIT？ 시약(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 미니스 코포레이션)의 작용을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 발현"은 데옥시리보핵산 유전자의 전사를 통해(예를 들어, RNA 중합효소의 효소 작용을 통해) 유전자 내에 코딩된 유전 정보를 RNA(예를 들어, 작은 RNA, siRNA, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 전환시키고 (단백질 코딩 유전자의 경우) mRNA의 번역을 통해 단백질로 전환시키는 과정을 지칭한다. 유전자 발현은 상기 과정의 많은 단계에서 조절될 수 있다. 상향-조절 또는 활성화는 유전자 발현 생성물(즉, RNA 또는 단백질)의 생성을 증가시키는 조절을 지칭하고, 하향-조절 또는 억제는 생성을 감소시키는 조절을 지칭한다. 상향-조절 또는 하향-조절에 관여하는 분자(예를 들어, 전사 인자)는 종종 각각 활성화자 및 억제자로 지칭된다.
폴리뉴클레오타이드는 연구 목적으로 사용될 수 있거나 치료 효과일 수 있는 세포내 변화를 일으키는 데 사용될 수 있다. 치료 목적의 폴리뉴클레오타이드 전달은 통상적으로 유전자 요법으로 지칭된다. 폴리뉴클레오타이드의 전달은 표적 세포에 존재하는 유전물질을 변경시킬 수 있다. 용어 "안정한 형질감염" 또는 "안정하게 형질감염된"은 일반적으로 외래 폴리뉴클레오타이드를 형질감염되는 세포의 게놈 내로 도입 및 삽입하는 것을 지칭한다. 용어 "안정한 형질감염체"는 게놈 DNA 내에 폴리뉴클레오타이드가 안정하게 삽입되어 있는 세포를 지칭한다. 안정한 형질감염은 진핵세포 분열 과정 동안 복제되는 에피좀(episome) 벡터(예를 들어, 파필로마 바이러스 복제 기점을 함유하는 플라스미드 DNA 벡터, 인공 염색체)를 사용하여 달성할 수도 있다. 용어 "일시적 형질감염" 또는 "일시적으로 형질감염된"은 폴리뉴클레오타이드가 형질감염되는 세포의 게놈 내로 삽입되지 않는, 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 도입을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 발현가능한 유전자를 함유하는 경우, 발현 카세트는 염색체 내 내생(endogenous) 유전자의 발현을 좌우하는 통제적 조절을 받는다. 용어 "일시적 형질감염체"는 폴리뉴클레오타이드를 흡수하였으나 상기 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA 내로 삽입되어 있지 않은 세포를 지칭한다.
제제화
폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체는 폴리뉴클레오타이드를 중합체에 공유결합시킴에 의해 형성된다. 상기 중합체는 반응성 기 A를 함유하도록 중합되거나 변경된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 반응성 기 B를 함유하도록 중합되거나 변경된다. 반응성 기 A 및 B는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 가역적 공유결합을 통해 결합될 수 있도록 선택된다.
폴리뉴클레오타이드와 중합체의 접합은 과량의 중합체의 존재 하에 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 중합체가 접합 과정 동안 반대 전하를 가질 수 있기 때문에, 과량의 중합체의 존재는 접합체의 응집을 감소시키거나 제거할 수 있다. 별법으로, 과량의 운반체 중합체 예컨대, 다가양이온을 사용할 수 있다. 상 기 과량의 중합체는 접합체를 동물 또는 세포 배양물에 투여하기 전에 접합된 중합체로부터 제거될 수 있다. 별법으로, 상기 과량의 중합체는 동물 또는 세포 배양물에 접합체와 동시 투여될 수 있다.
유사하게, 중합체는 과량의 중합체 또는 마스킹제의 존재 하에 마스킹제에 접합될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 중합체가 접합 과정 동안 반대 전하를 가질 수 있기 때문에, 과량의 중합체의 존재는 접합체의 응집을 감소시키거나 제거할 수 있다. 별법으로, 과량의 운반체 중합체를 사용할 수 있다. 상기 과량의 중합체는 접합체를 동물 또는 세포 배양물에 투여하기 전에 접합된 중합체로부터 제거될 수 있다. 별법으로, 상기 과량의 중합체는 동물 또는 세포 배양물에 접합체와 동시 투여될 수 있다. 중합체는 폴리뉴클레오타이드를 중합체에 접합시키기 전 또는 후에 변경될 수 있다.
형질감염제
폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달하는 과정은 통상적으로 형질감염 또는 형질감염 과정으로 지칭되어 왔다. 본원에서 사용된 용어 "형질감염"은 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 생물학적 활성 화합물이 생물학적 활성을 가지도록 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 생물학적 활성 화합물을 세포 외부로부터 세포 내부로 도입하는 것을 지칭한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 연구 목적으로 사용될 수 있거나 치료 효과일 수 있는 세포내 변화를 일으키는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 전달은 표적 세포에 존재하는 유전물질을 변경시킬 수 있다. 형질감염제 또는 전달 비히클은 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 결합하거 나 복합체를 형성하여 상기 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드가 세포 내로 도입되는 것을 매개하는 화합물 또는 화합물들이다.
시험관내 형질감염제들 또는 전달 비히클들은 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 결합하거나 복합체를 형성하여 상기 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드가 세포 내로 도입되는 것을 매개하는 화합물들 또는 화합물들의 조성물이다. 형질감염제의 예는 단백질과 중합체의 복합체(폴리플렉스(polyplexe)), 지질과 리포좀(리포플렉스), 중합체와 지질의 조합물(리포폴리플렉스), 인산칼슘 침전물 및 덴드리머(dendrimer)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전형적으로, 형질감염제는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 음전하에 결합하는 순 양전하를 가진 성분을 갖는다. 양이온성 형질감염제는 큰 핵산을 응축할 수도 있다. 형질감염제는 작용기를 폴리뉴클레오타이드와 연결시키는 데 사용될 수도 있다. 작용기는 세포 표적화 신호, 핵 편재화 신호, 엔도좀 또는 다른 세포내 소포체(예컨대, 막 활성 화합물)로부터의 내용물 방출을 증강시키는 화합물, 및 그들이 부착된 화합물 또는 복합체의 거동 또는 상호작용을 변경시키는 다른 화합물(상호작용 변경제)을 포함한다.
본 발명의 접합된 폴리뉴클레오타이드는 다양한 치료, 진단, 표적 확인, 게놈 발견, 유전공학 및 약물유전체학 분야에서 사용될 수 있는 유용한 시약 및 방법을 제공한다. 접합된 폴리뉴클레오타이드는 동일한 비-접합 폴리뉴클레오타이드에 비해 개선된 세포 흡수 성질을 나타낸다.
비경구 투여 경로는 주사기 및 바늘 또는 카테터를 사용한 혈관내(정맥내, 동맥내), 근육내, 실질내, 피부내, 피부하, 피하, 종양내, 복강내, 수막강내, 경막하, 경막외 및 림프내 주입을 포함한다. 본원에서 혈관내는 체내의 조직 또는 기관에 연결되어 있는 혈관을 지칭하는 관 구조체 내부를 의미한다. 상기 관 구조체의 강(cavity) 내부에는 채액이 신체 일부로 흐르거나 신체 일부로부터 흐른다. 체액의 예는 혈액, 뇌척수액(CSF), 림프액 또는 담즙을 포함한다. 혈관의 예는 동맥, 세동맥, 모세혈관, 별세정맥, 굴모양혈관, 정맥, 림프관, 담관, 및 침샘 또는 다른 외분비샘의 관을 포함한다. 혈관내 경로는 동맥 또는 정맥과 같은 혈관을 통한 전달을 포함한다. 혈액 순환 시스템은 약물을 전신으로 퍼트린다. 점막을 이용하는 투여 경로는 비강, 기관지, 폐 내로의 흡입, 또는 눈을 포함한다. 실질내 투여는 간, 폐, 심장, 근육(골격근 또는 횡경막), 비장, 췌장, 뇌(뇌실내를 포함함), 척수, 신경절, 림프절, 지방 조직, 갑상선 조직, 부신, 신장, 전립선 및 종양과 같은 조직 내로의 직접적 주입을 포함한다. 경피 투여 경로는 패치 및 이온삼투요법에 의해 영향을 받는다. 다른 상피 경로는 경구 투여 경로, 비강 투여 경로, 호흡기 투여 경로, 직장 투여 경로 및 질 투여 경로를 포함한다.
접합체는 약학적으로 허용가능한 담체 용액 중의 접합체로서 주입될 수 있다. "약학적으로 허용가능한"은 성질 또는 물질이 약리학적/독성학적 관점에서 포유동물에게 허용될 수 있음을 지칭한다. "약학적으로 허용가능한"은 분자 물질, 조성물 및 성질이 생리학적으로 허용될 수 있고 포유동물에 투여된 경우 전형적으로 알레르기 반응 또는 다른 불리한 또는 독성 반응을 나타내지 않음을 의미한다. 바람직하게는, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간에서 사용되도록 규제 연방 또는 주립 정부 관청에 의해 승인받았거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되어 있는 약전에 기재되어 있음을 의미한다.
치료 효과
본 발명자들은 특정 조직에서의 리포터 유전자 및 내재 유전자를 발현시키거나 상기 유전자들의 유전자 발현을 억제하는 폴리뉴클레오타이드 전달을 개시한다. 폴리뉴클레오타이드의 전달 후 측정된 리포터(마커) 유전자의 발현 수준은 다른 폴리뉴클레오타이드의 전달 후 유전자의 유사한 발현 수준의 합리적 기대치를 의미한다. 당업자에 의해 유리한 것으로 인정되는 치료 수준은 질환마다 상이하다. 예를 들어, A형 혈우병과 B형 혈우병은 각각 X-링크 응고 인자 VII 및 IX의 결핍에 의해 야기된다. 이들의 임상적 과정은 인자 VIII 또는 IX의 정상적 혈청 수준의 비율에 의해 크게 영향 받는다: < 2%: 심각함; 2 내지 5%: 중간 정도임; 및 5 내지 30%: 경미함. 따라서, 심각한 환자에서 순환 인자의 통상적 수준에서 1% 내지 2%의 증가는 유리한 것으로 간주될 수 있다. 6%보다 많은 수준은 자연적인 출혈을 방해하지만 수술 또는 상해에 부차적인 출혈은 방해하지 않는다. 유사하게, 치료 효과를 제공하기 위한 유전자의 억제는 100%일 필요가 없다. 유전자 요법의 당업자는 충분한 수준의 마커 유전자 결과에 의거하여 질환에 특이적인 유전자의 유리한 발현 수준을 합리적으로 예상할 것이다. 예를 들어, 혈우병에서 마커 유전자가 부피 면에서 인자 VIII의 통상적 수준의 2%에 필적하는 수준으로 단백질을 생성하도록 발현된 경우, 인자 VIII을 코딩하는 유전자도 유사한 수준으로 발현될 것임을 합리적으로 예측할 수 있다. 따라서, 리포터 또는 마커 유전자 예컨대, 루시퍼레이즈 및 β-갈락토시데이즈는 일반적으로 세포내 단백질의 발현에 유용한 패러다임으로서 작용한다. 유사하게, 리포터 또는 마커 유전자에 의해 분비된 알칼리성 포스파테이즈(SEAP)는 일반적으로 분비 단백질에 유용한 패러다임으로서 작용한다.
질환, 병태 또는 증상을 약화시키거나 예방하는 데 있어서 전달된 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 단백질의 치료 효과는 세포 내에 머무르거나 세포막에 부착된 상태로 남아있거나 세포로부터 분비되고 분리되는 단백질에 의해 달성될 수 있고, 이때 상기 단백질은 일반적인 순환 및 혈액 내로 들어갈 수 있다. 치료 단백질일 수 있는 분비 단백질은 호르몬, 사이토카인, 성장인자, 응고 인자, 항-프로테이즈 단백질(예를 들어, 알파-항트립신) 및 혈액에 존재하는 다른 단백질을 포함한다. 막 상의 단백질은 단백질 또는 지단백질을 흡수하기 위한 수용체를 세포에 제공함으로써 치료 효과를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 저밀도 지단백질(LDL) 수용체는 간세포에서 발현되어 혈액 콜레스테롤 수준을 낮춤으로써 졸중 또는 심근경색을 야기할 수 있는 죽상경화성 병변을 예방할 수 있다. 세포 내에 머무르는 치료 단백질은 페닐케톤뇨증에서와 같이 순환하는 독성 대사물질을 제거하는 효소일 수 있다. 상기 단백질은 암세포의 증식성 또는 암성(예컨대, 전이성)을 낮출 수도 있다. 세포내의 단백질은 바이러스의 복제도 방해할 수 있다.
간은 순환하는 단백질(예를 들어, 혈우병에서 응고 인자)의 대사(예를 들어, 다양한 고콜레스테롤혈증에서 지단백질 대사)에 있어서 그의 중추적인 역할 때문에 유전자 요법에 가장 중요한 표적 조직들 중 하나이다. 100가지 이상의 다양한 유 전 질환이 간에 대한 유전자 요법에 의해 잠재적으로 치유될 수 있다. 또한, 후천적 질환 예컨대, 만성 간염 및 간경화는 흔하고 폴리뉴클레오타이드-기재 간 요법에 의해 치료될 수도 있다. 이소성(heterotropic) 유전자 발현을 수반하는 유전자 요법은 간으로의 유전자 전달에 의해 치료될 수 있는 질환의 수를 더 증가시킬 것이다. 예를 들어, 진성 당뇨병은 생리학적으로 글루코스-조절 인슐린 분비를 가능하게 하는 인슐린 유전자를 간세포 내에서 발현시킴으로써 치료할 수 있다.
또한, 생체내 세포로의 폴리뉴클레오타이드의 전달은 대사 또는 질환에 관여하는 유전자의 발현 증가 또는 감소 이외에 면역 시스템을 자극하거나, 면역 시스템을 자극하여 암세포 또는 불활성 종양유전자(oncogene)를 파괴하거나, 종양 억제 유전자를 활성화시키거나 전달하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 전달되어 병원체에 대한 면역원성을 유도하거나 병원성 유전자의 발현을 차단할 수도 있다.
다양한 정의
본원에서 사용된 바와 같이, "생체내"는 특정 과정이 유기체 내부에서 일어남을 의미하고, 보다 구체적으로 특정 과정이 생존 유기체의 일부 또는 죽은 유기체와 대조적인 완전한 생존 다세포 유기체(동물) 예컨대, 포유동물의 생존 조직 내에서 또는 생존 조직에 대해 수행됨을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "시험관내"는 특정 과정이 질환 또는 과정을 연구하기 위한 실험 연구에서 사용된 생존 다세포 유기체(예를 들어, 시험관 또는 배양 플레이트) 외부에서 생성된 인공 환경 하에 수행됨을 의미한다. 본원에서 사용 된 바와 같이, 시험관내는 특정한 과정이 배양물 중에서 생장하는 온전한 세포에서 수행됨을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제자리에서"는 특정 과정이 온전한 조직에서 수행됨을 지칭한다. 그러나, 상기 조직은 생존 유기체에 존재할 수 있거나 유기체로부터 제거될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "생체외"는 특정 과정이 유기체로부터 제거된 생존 세포 또는 조직(이 세포 또는 조직은 나중에 생존 세포 또는 조직을 유기체로 되돌려 보내짐)에 대해 유기체 외부의 인공 환경에서 수행함을 지칭한다.
가교결합제는 2개의 분자를 서로 연결시키는 데, 즉 2개의 분자 사이의 연결을 형성하는 데 사용된 이작용성 분자이다. 이작용성 분자는 동종이작용성 또는 이종이작용성을 보유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표면 활성 중합체"는 물의 표면 장력 및/또는 다른 상과의 계면 장력을 낮추어 액체/증기 계면에 강하게 흡착된다.
항체는 특정 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린이다. 이 용어는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 항체 결합 부위는 항원에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄 가변(variable) 및 초가변(hypervariable) 영역으로 구성된 항체 분자의 구조적 일부이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 그의 다양한 문법적 형태로 온전한 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분을 포괄한다. 예시적 항체 분자는 온전한 면역글로불린 분자, 실질적으로 온전한 면역글 로불린 분자, 및 파라토프(paratope)를 함유하는 면역글로불린 분자의 일부(당업계에서 Fab, Fab', F(ab').sub.2 및 F(v)로서 공지된 부분(이 부분은 본원에 기재된 치료 방법에서 사용하기에 바람직함)을 포함함)이다. 항체 분자의 Fab 및 F(ab').sub.2 부분은 잘 공지된 방법으로 실질적으로 온전한 항체 분자를 파파인 및 펩신 각각으로 단백질분해 반응시켜 제조한다. 용어 "모노클로날 항체"는 그의 다양한 문법적 형태로 특정 항원과 면역반응할 수 있는 1가지 항체 결합 부위만을 가진 항체를 지칭한다. 따라서, 모노클로날 항체는 전형적으로 이 항체가 면역반응하는 임의의 항원에 대해 1가지 결합 친화성을 나타낸다. 그러므로, 모노클로날 항체는 상이한 항원에 대해 각각 면역특이적인 복수의 항체 결합 부위를 가진 항체 분자, 예컨대, 이중특이적(키메라) 모노클로날 항체를 포함할 수 있다.
실시예 1: 폴리뉴클레오타이드 합성 및 조립
하기 합성 RNA 올리고뉴클레오타이드(Dharmacon, 미국 콜로라도주 라파예트 소재)를 사용하였다. 센스 가닥 RNA는 전달 비히클에의 접합을 가능하게 하기 위해 5'에서 6개 탄소 스페이서를 가진 일차 아민을 함유하였다. 2'ACE에 의해 보호된 RNA 올리고뉴클레오타이드는 제조자의 지시에 따라 어닐링 단계 전에 탈보호하였다. siRNA는 하기 서열을 갖는다:
Figure 112009009685988-pct00006
Figure 112009009685988-pct00007
각각의 표적 서열에 대한 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 등몰량의 상기 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함께 혼합하고 94℃에서 5분 동안 가열하고 90℃에서 3분 동안 냉각시킨 후 단계마다 0.3℃씩 250회 온도를 감소시키고 각 단계에서 3초 동안 유지함으로써 어닐링하였다.
실시예 2: 폴리비닐에테르 랜덤 공중합체
A. 비닐 에테르 단량체의 합성
테트라 n-부틸 암모늄 브로마이드(0.5 g)를 상 전이 촉매로 사용하여 100℃ DMF(75 ㎖) 중에서 2-클로로에틸 비닐 에테르(25 g, 0.24 mol)와 포타슘 프탈이미드(25 g, 0.135 mol)를 반응시켜 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드를 제조하였다. 이 용액을 6시간 동안 가열한 후, 물 중에서 분쇄하고 여과하였다. 그 다음, 이 고체를 메탄올로부터 2회 재결정화하여 백색 결정을 수득하였다.
B. 아민 + 저급 알킬 폴리비닐에테르 중합체
아민 기에 대한 알킬 기의 비가 다양하고 0 내지 4개의 탄소를 가진 알킬 기를 가진 비닐에테르 단량체로부터 일련의 공중합체를 합성하였다(도 1, R과 R'는 동일하거나 상이할 수 있음). 막 활성은 소수성 단량체의 크기(알킬쇄 길이) 및 비에 좌우된다(Wakefield 2005). 프로필- 및 부틸-유래 중합체는 모델 리포좀을 사용할 때 막 용해성을 나타내는 것으로 밝혀졌으나, 메틸 및 에틸 함유 중합체는 그러하지 아니하다. 본 발명자들은 이 중합체들을 메틸-, 에틸-, 프로필- 또는 부틸-아미노비닐 에테르(또는 각각 PMAVE, PEAVE, PPAVE 또는 PBAVE)로 지칭하였다. 이 중합체는 생리학적 농도의 염 중에서 DNA와 복합체를 형성하기에 충분한 전하를 보유한다. 대조적으로, 작은 막 용해성 양이온성 펩티드 예컨대, 멜리틴은 너무 약해서 등장 생리식염수 용액 중에서 DNA를 응축할 수 없다. 합성 양극성 중합체의 보다 큰 크기는 상기 중합체의 DNA 결합 능력을 증강시킬 뿐만 아니라 상기 중합체가 몰 기준으로 멜리틴보다 더 높은 용해성을 나타나게 만든다. 보다 적은 수의 중합체 분자로 막을 용해시키는 능력은 생체내 핵산 전달을 촉진할 것이다. 본 발명자들은 형광단-표지 DNA를 사용하여 합성된 중합체의 전하 밀도를 측정하였고 생리식염수 중에서의 상기 DNA의 안정성을 확인하였다.
C. 수용성, 양극성 및 막 활성 폴리비닐에테르 폴리아민 사원중합체의 합성
X 몰%의 아민-보호 비닐에테르(예를 들어, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드)를 질소 환경 하에 오븐 건조 둥근 바닥 플라스크 내의 무수 디클로로메탄에 첨가하였다. 이 용액에 Y 몰%의 알킬(예를 들어, 에틸, 프로필 또는 부틸) 비닐에테르를 첨가한 후, Z 몰%의 알킬(도데실, 옥타데실) 비닐에테르(도 1)를 첨가하였다. 기재된 구체적인 중합체는 2가지 또는 3가지 상이한 단량체로부터 유래되었지만, 본 발명은 비닐 에테르 단량체의 구체적 조성물로 한정되지 않는다. 더 많은 종류의 단량체 또는 상이한 단량체를 포함하는 중합체가 용이하게 예측되었다. 상기 용액을 드라이아이스 아세톤 배쓰 내에서 -78℃로 냉각시켰다. 이 용액에 10 몰%의 BF3EtOEt를 첨가하고 반응을 -78℃에서 2 내지 3시간 동안 진행시킨 후, 메탄올 암모늄 하이드록사이드 용액으로 켄칭하였다. 중합체를 감압 하에 건조한 후 30 ㎖의 1,4-다이옥산/메탄올(2/1)에 용해시켰다. 프탈이미드 당 20 몰 당량의 하이드라진을 첨가하여 아민으로부터 보호기를 제거하였다. 용액을 3시간 동안 환류시킨 후, 감압 하에 건조하였다. 고체를 20 ㎖의 0.5 M HCl에 용해시키고 15분 동안 환류한 후, 20 ㎖의 증류수로 희석하고 추가 1시간 동안 환류시켰다. 이어서, 용액을 NaOH로 중화시키고 실온으로 냉각시키고 3,500 분자 셀룰로스 튜빙으로 옮기고, 24시간 동안 증류수에 대해 투석하고(2x20 ℓ), 동결 건조하였다. 중합체의 분자량은 표준 방법에 따라 분석 크기 배제 칼럼을 이용하여 평가하였다. 표시된 비닐 에테르 단량체를 함유하는 중합체가 본 실시예에 기재되어 있지만, 본 발명은 이 구체적인 단량체로 한정되지 않는다.
하이드라진 및 HCl을 사용한 연속 처리로 프탈이미드 기를 제거한 후, 중합체를 3,500 분자 셀룰로스 튜빙으로 옮기고, 24시간 동안 증류수에 대해 투석하고(2x20 ℓ), 동결 건조하였다. 이어서, 중합체를 물에 용해시키고 세파덱스 G-15 칼럼 상에 놓았다. 세파덱스 G-15로부터 배제된 중합체를 단리하고 동결건조로 농축하였다. 그 다음, 상기 중합체의 분자량을 에프로겐 인코포레이티드(Eprogen Inc.)의 CATSEClOO, CATSEC300 및 CATSEC1000 칼럼을 연속적으로 사용한 GPC로 측정하였다. 런닝 완충제는 50 mM NaCl, 0.1% TFA 및 10% MeOH이었다. 폴리비닐피리딘 표준물을 보정 곡선으로서 사용하였다. 중합체의 분자량은 10,000 내지 100,000 Da이었고, 중합체 제제의 대부분은 20,000 Da을 초과하였다.
D. DW1360의 합성
아민/부틸/옥타데실 폴리비닐에테르 삼원중합체를 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드(3.27 g, 15 mmol), 부틸 비닐에테르(0.40 g, 4 mmol) 및 옥타데실비닐에테르(0.29 g, 1 mmol) 단량체로부터 합성하였다. 상기 단량체들을 30 ㎖의 무수 다이클로로메탄에 용해시켰다. 이어서, 이 용액을 -78℃ 드라이아이스/아세톤 배쓰에 첨가하였다. 2분 후, BF3 ?OEt2(0.042 g, 0.3 mmol)를 첨가하고 반응을 -78℃에서 3시간 동안 진행시켰다. 그 다음, 메탄올 또는 리튬 보로하이드라이드 용액 중의 암모늄 하이드록사이드의 50/50 혼합물을 첨가하여 중합을 정지시켰다. 이어서, 용매를 회전 증발로 제거하였다. 이어서, 중합체를 30 ㎖의 1,4-다이옥산/메 탄올(2/1)에 용해시켰다. 이 용액에 하이드라진(0.44 g, 138 mmol)을 첨가하고 혼합물을 3시간 동안 가열하여 환류시켰다. 그 다음, 용매를 회전 증발로 제거하고, 생성된 고체를 20 ㎖의 0.5 M HCl에 용해시키고 15분 동안 환류시키고, 20 ㎖의 증류수로 희석하고 추가 1시간 동안 환류시켰다. 그 후, 이 용액을 NaOH로 중화시키고, 실온으로 냉각시키고, 3,500 분자 셀룰로스 튜빙으로 옮기고, 24시간 동안 증류수에 대해 투석하고(2x20 ℓ), 동결 건조하였다.
유사하게, 다양한 비율의 아민, 부틸 및 옥타데실 기를 함유하는 다른 중합체를 합성하였다. 또한, 다른 단량체도 혼입될 수 있다. 구체적으로, t-부틸 비닐 에테르, 도데실 비닐 에테르 및 올레산 비닐에테르가 중합체 내로 혼입되었다.
한 실시양태에서, 아민 단량체 : 저급 알킬 단량체 : 고급 알킬 단량체의 공급 비를 15 : 4 : 1로 하여 상기 단량체들을 사용하여 아민/저급 알킬/고급 알킬 폴리비닐에테르 삼원중합체를 합성하였다. 상기 조건 하에 아민 단량체 : 저급 알킬 단량체 : 고급 알킬 단량체의 혼입 비는 약 5.4 내지 7.5 : 3 내지 3.5 : 1인 것으로 확인되었다. 또 다른 실시양태에서, 아민 단량체 : 저급 알킬 단량체 : 고급 알킬 단량체의 공급 비를 4 내지 8 : 3 내지 5 : 1로 하여 상기 단량체들을 사용하여 아민/저급 알킬/고급 알킬 폴리비닐에테르 삼원중합체를 합성하였다. 바람직한 실시양태에서, 중합체는 수용성(25℃에서 약 1 mg/㎖ 이상) 및 표면 활성을 나타낸다.
한 실시양태에서, 중합체를 분획화하여 분자량이 약 5 내지 약 50 kDa, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 30 kDa인 중합체를 생성한다.
E. 다른 삼원중합체
폴리-L-라이신(PLL), 폴리비닐아민(PVA) 및 폴리알릴아민(PAA)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기재 중합체를 변경시켜 유사한 중합체를 합성할 수 있다. 이 중합체들로 구성된 상이한 주쇄에 알킬 기를 부착함으로써 아민 : 저급 알킬 : 고급 알킬의 비가 약 6 : 3 : 1인 삼원중합체를 제조할 수 있다.
F. 리포좀 용해
100 mM의 카복시플루오레세인(CF) 및 10 mM의 HEPES를 함유하는 완충제(pH 7.5) 1 ㎖로 10 mg의 난(egg) 포스파티딜콜린을 수화시켰다. 그 다음, 리포좀을 100 nm 공극 폴리카보네이트 필터(미국 캘리포니아주 플리잔톤에 소재하는 뉴클레오포어(Nucleopore))를 통해 압출하였다. 10 mM HEPES(pH 8.0) 및 0.1 M NaCl로 용출하는 세파로스 4B-200을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피로 포획되지 않은 CF를 제거하였다. CF-로딩 리포좀의 200 ㎕ 분취액을 1.8 ㎖의 등장 완충제에 첨가하였다. 0.25 ㎍의 중합체 또는 멜리틴을 소포체 현탁액에 첨가한 지 30분 후 형광도(λex=488, λem=540)를 측정하였다. 각 실험의 말기에 40 ㎕의 1% 트라이톤 X-100 용액을 첨가하여 소포체를 파괴하여 최대 용해를 측정하였다.
실시예 3: 마스킹제
A. 2-프로피온산-3-메틸말레산 무수물(카복시다이메틸말레산 무수물 또는 CDM)의 합성
트라이에틸-2-포스포노프로피오네이트(7.1 g, 30 mmol)를 50 ㎖의 무수 테트 라하이드로푸란 중의 수소화나트륨(0.58 g, 25 mmol) 현탁액에 첨가하였다. 소수 기체의 발생이 정지된 후, 10 ㎖의 무수 테트라하이드로푸란 중의 다이메틸-2-옥소글루타레이트(3.5 g, 20 mmol)를 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 이어서, 10 ㎖의 물을 첨가하고 테트라하이드로푸란을 회전 증발로 제거하였다. 생성된 고체와 물의 혼합물을 50 ㎖의 에틸 에테르로 3회 추출하였다. 에테르 추출물을 모아 황산마그네슘을 사용하여 건조하고 농축하여 밝은 황색 오일을 수득하였다. 이 오일을, 2 : 1 에테르 : 헥산으로 용출하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 4 g(82% 수율)의 순수한 트라이에스터를 수득하였다. 이어서, 상기 트라이에스터를 4.5 g(5 당량)의 포타슘 하이드록사이드가 함유된 물과 에탄올의 50/50 혼합물 50 ㎖에 용해시켜 2-프로피온산-3-메틸말레산 무수물을 형성하였다. 이 용액을 1시간 동안 가열하여 환류시켰다. 이어서, 에탄올을 회전 증발로 제거하고 용액을 염산으로 pH 2까지 산성화시켰다. 그 다음, 이 수용액을 200 ㎖의 에틸 아세테이트로 추출하고, 단리하고, 황산마그네슘으로 건조하고, 농축하여 백색 고체를 수득하였다. 이어서, 이 고체를 다이클로로메탄 및 헥산으로부터 재결정화하여 2 g(80% 수율)의 2-프로피온산-3-메틸말레산 무수물을 수득하였다.
티오에스터, 에스터 및 아마이드는 옥살릴 클로라이드를 사용하여 CDM을 그의 산 클로라이드로 전환한 후 티올, 에스터 또는 아민 및 피리딘을 첨가함으로써 CDM으로부터 합성될 수 있다. CDM 및 이의 유도체는 표적화 리간드, 입체 안정화제, 하전된 기 및 다른 반응성 기를 부가하는 당업계의 표준 방법으로 용이하게 변경시킨다. 생성된 분자를 사용하여 아민을 가역적으로 변경시킬 수 있다.
B. 갈락토스-함유 표적화 기
가장 널리 연구된 간세포 표적화 리간드는 간세포 상의 ASGP-R에 결합하는 갈락토스를 기초로 한 것이다. 갈락토스의 부착은 올리고사카라이드 키토산, 폴리스티렌 유도체 및 폴리아크릴아마이드 HPMA를 비롯한 몇몇 고도의 수용성 비-하전된 중합체의 간세포 표적화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 갈락토스 표적화 기는 락토스, 갈락토스-글루코스 다이사카라이드를 사용하여 글루코스 잔기의 변경을 통해 용이하게 발생시켰다. 락토바이온산(LBA, 글루코스가 글루콘산으로 산화되어 있는 락토스 유도체)은 표준 아마이드 커플링 기법을 이용하여 말레산 무수물 유도체 내로 용이하게 혼입하였다. 도 2는 갈락토스를 말레산 무수물 CDM에 커플링시킨 2가지 LBA 유도체의 구조를 보여준다.
말레아메이트 변경은 양으로 하전된 아민 기를 음으로 하전된 기로 전환시킨다. 이 전하 변경은 중합체와 음으로 하전된 세포 및 혈청 성분의 비-특이적 상호작용을 감소시킬 수 있다. 그러나, 너무 많은 음전하는 스카빈저(scavenger) 수용체와의 상호작용을 증강시킬 수 있다. 순 중성 갈락토스-함유 말레산 무수물 유도체는 양으로 하전된 3급 아민 기를 마스킹제 내로 삽입하여 양쪽성이온을 생성함으로써 발생시킬 수 있다. 이러한 화합물, 즉 CDM-Pip-LBA는 CDM, 프로필아미노피페라진 및 LBA로부터 생성되었다(도 2).
C. 입체 안정화제 CDM-PEG 및 표적화 기 CDM-NAG(N-아세틸 갈락토스아민) 합성효소(도 2)
옥살릴 클로라이드(2 g, 10 중량 당량) 및 다이메틸포름아마이드(5 ㎕)를 50 ㎖ 중의 CDM(Rozema 2003)(300 mg, 0.16 mmol) 용액에 첨가하였다. 과량의 옥살릴 클로라이드 및 메틸렌 클로라이드가 회전 증발에 의해 제거되는 시점에서 반응을 밤새 진행시켜 CDM 산 클로라이드를 수득하였다. 이 산 클로라이드를 1 ㎖의 메틸렌 클로라이드에 용해시켰다. 이 용액에, CDM-PEG의 경우 1.1 몰 당량의 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(평균 분자량 450)를, 또는 CDM-NAG의 경우 (아미노에톡시)에톡시-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노사이드(즉, 아미노 비스에톡실에틸 NAG)를 첨가하였고, 10 ㎖의 메틸렌 클로라이드 중의 피리딘(200 ㎕, 1.5 당량)을 첨가하였다. 이어서, 용액을 1.5 시간 동안 교반하였다. 그 다음, 용매를 제거하고, 생성된 고체를 5 ㎖의 물에 용해시키고, 0.1% TFA/물/아세토니트릴 구배를 사용하는 역상 HPLC를 이용하여 정제하였다(도 2).
실시예 4: 폴리뉴클레오타이드와 중합체의 가역적 결합
S-아세틸 기를 사용한 아미노 siRNA 올리고뉴클레오타이드의 변경은 아민-함유 다가양이온의 존재 하에 염기성 용액(pH ≥ 9) 중에서 방출될 수 있는 안정한 보호된 티올을 생성시켰다. 티오에스터 기의 제거를 위한 표준 탈보호 조건은 하이드록실아민과의 항온처리를 필요로 한다. 그러나, 이 탈보호 조건은 siRNA 다이설파이드 이량체를 상당히 형성시킨다. 전형적으로, 알킬 아민과 티오에스터 사이의 반응은 일반적으로 느리지만, 다가음이온성 siRNA와 다가양이온성 아민 사이의 복합체에 있어서, 작용기 사이의 반응은 본질적으로 분자내 반응이 되고 많이 가속화되었다(도 3에서 단계 2a 참조). 탈보호를 촉진하는 것 이외에, 다가양이온 상의 활성화된 다이설파이드 기와 방출된 티올의 반응이 크게 증강되었다(단계 2b). 활성화된 다이설파이드 피리디닐다이티올(PD)은 다이설파이드 형성을 보장하고 시판되는 시약에 의해 다가양이온에 용이하게 부착되었다. 이 입자내 반응의 결과는 90%를 초과하는, 다이설파이드와 다가양이온의 접합이었다.
실시예 5: 폴리뉴클레오타이드와 중합체의 가역적 접합
A. SATA -변경 폴리뉴클레오타이드
4℃의 물 중에서 5' 아민-변경 siRNA와 1 중량 당량의 SATA 시약(Pierce) 및 0.36 중량 당량의 NaHCO3를 16시간 동안 반응시켜 N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)-변경 폴리뉴클레오타이드를 합성하였다. 보호된 티올 변경 siRNA를, 9 부피의 에탄올 첨가 및 -78℃에서의 2시간 동안의 항온처리로 침전시켰다. 침전물을 단리하고 1x siRNA 완충제(Dharmacon)에 용해시키고 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
중합체, 즉 본 실시예에서 PBAVE 또는 DW1360(5 mM TAPS 중의 30 mg/㎖, pH 9)를, 1.5 중량%의 4-석신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-[2-피리딜다이티오]-톨루엔(SMPT, Pierce)을 첨가하여 변경시켰다. SMPT를 첨가한 지 1시간 후, 0.8 mg의 SMPT-중합체를 5 mM TAPS(pH 9)가 함유된 400 ㎕의 등장성 글루코스 용액에 첨가하였다. 이 용액에 50 ㎍의 SATA-변경 siRNA를 첨가하였다. PBAVE 농도가 일정한 투여량-반응 실험의 경우, 상이한 양의 siRNA를 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 16시간 동안 항온처리하였다. 이 방식으로, 가역적 다이설파이드 결합을 통해 폴리뉴클레오타이드를 중합체에 접합시켰다. 중합체와 siRNA 사이의 접합을 위한 다이 설파이드 결합은 세포질의 환원 환경 하에 가역성을 제공한다. siRNA-중합체 접합체는, 5.6 mg의 HEPES 유리 염기를 상기 용액에 첨가한 후 3.7 mg의 CDM-NAG와 1.9 mg의 CDM-PEG의 혼합물을 첨가하여 마스킹하였다. 그 다음, 주입 전에 용액을 실온(RT)에서 1시간 동안 항온처리하였다.
B. 접합된 폴리뉴클레오타이드의 정량
접합된 siRNA의 양을 정량하기 위해, 1 ㎍의 siRNA를 함유하는 siRNA-중합체 접합체의 10 ㎕ 분취액을 2 ㎕의 1 M DTT와 함께 또는 첨가제 없이 실온에서 16시간 동안 처리하였다. 100 ㎍의 폴리아크릴산 및 300 ㎍의 NaCl을 샘플에 첨가하여 정전기적 상호작용을 중화시켰다. 2시간 동안 항온처리한 후, 샘플을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고 siRNA를 에티듐 브로마이드로 염색하여 가시화하였다. siRNA 밴드를 코닥 몰레큘라 이미징 소프트웨어(Kodak Molecular Imaging Software) v4.0을 이용하여 정량하였다. 접합되지 않은 siRNA의 양은 접합률(%)을 측정하기 위한 DTT 처리 시 방출된 양으로 표준화하였다. 접합된 siRNA의 양은 전형적으로 70 내지 90%이었다.
티올이 다이설파이드로서 보호되거나 전혀 보호되지 않은 다른 다이설파이드 접합 기법도 이용할 수 있다. 또한, 중합체는 다른 활성화된 다이설파이드 기, 티올 기 또는 보호된 티올 기로 변경시킬 수 있다.
실시예 6: CDM-마스킹제와 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 가역적 결합
폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체는 중합체를 가역적으로 변경시키도록 예를 들어, 말레산 무수물로 변경시킬 수 있다(도 3, 단계 4). siRNA-중합체 접합체 는 5.6 mg의 HEPES 유리 염기를 용액에 첨가한 후 3.7 mg의 CDM-NAG와 1.9 mg의 CDM-PEG의 혼합물을 첨가하여 마스킹하였다. 그 다음, 상기 용액을 생체내 주입 전에 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
실시예 7: 마스킹된 접합체의 표적화 활성
양극성 폴리비닐에테르 25/75(부틸 : 아민은 25 : 75임) PBAVE의 간 표적화를 할 수 있는 CDM-PIP-LBA(갈락토스-함유) 시약의 능력을 입증하기 위해, 중합체를 형광단 Cy3으로 표지한 후, CDM-Pip-LBA의 존재 또는 부재 하에 CDM-PEG를 사용하여 변경시켰다. 400 ㎕의 등장성 글루코스 중의 100 ㎍ 마스킹된 중합체를 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하였다. 주입한 지 1시간 후 간 샘플을 제거하고 동결된 간 절편을 준비하고 면역조직화학적 분석을 위해 처리하였다(도 4). 도 4에 나타낸 바와 같이, CDM-Pip-LBA 표적화 중합체는 간세포 내에 광범위하게 위치되어 있는 반면(B), 표적화되지 않은 중합체는 간의 대식세포에 주로 편재되어 있다(A).
CDM-LBA-변경 PBAVE는 고도의 음이온성을 나타내고 대식세포에서 주로 발견되었다(도시되지 않음). CDM-Pip-LBA(양쪽성 마스킹제)-변경 중합체는 중성에 근접하였고 전체적으로 간, 보다 중요하게는 특히 간세포에 표적화된 중합체 양의 증가를 나타내었다(도 4B). CDM-PEG 마스킹제를 비롯한 입체 안정화제로 전하 예컨대, 음전하를 차폐할 수도 있다.
실시예 8: 간세포에의 폴리뉴클레오타이드의 표적화
올리고뉴클레오타이드-중합체 접합체는 전술한 바와 같이 제조하여 CDM-Pip-LBA로 마스킹하였다. 20 ㎍의 SATA/Cy3-변경 siRNA를 1.8 mg의 PD-변경 PLL에 접 합시키고 CDM-Pip-LBA로 변경시켰다. 400 ㎕의 생리식염수 중의 마스킹된 접합체를 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하였다. 동일한 주입 용액에는 오레곤 그린(Oregon Green)으로 표지된 100 ㎍의 CDM-Pip-LBA-변경 25/75-PBAVE가 있었다. 상기 접합체는 생리학적 조건 하에 가용성 및 비-응집성을 나타내었다. 주입한 지 1시간 후, 간을 회수하고, 동결된 간 절편을 준비하여 면역조직화학적 분석을 위해 처리하였다. TO-PRO-3？을 사용하여 세포 핵을 염색하였다. 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입한 후, 표지된 올리고뉴클레오타이드 및 PBAVE가 간세포에 관찰되었다(도 5의 상부 좌측 패널).
실시예 9: 접합체의 생체내 활성
마우스 간의 내재 유전자, 즉 퍼록시좀 증식자 활성화 수용체 알파(PPARα)의 억제를 위한 siRNA를 전달하는 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 능력을 평가하였다. 400 ㎕의 등장성 글루코스 중의 PPARα siRNA-PLL 접합체(20 ㎍ siRNA, 1.8 mg PD-PLL) 및 25/75-PBAVE(100 ㎍)를 꼬리 정맥을 통해 C57B 마우스(n=4)에게 주입하였다. 주입한 지 48시간 후 RNA를 간으로부터 준비하였다. PPARα mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 이용하여 측정하였다. mRNA 수준을 항-루시퍼레이즈 siRNA가 주입된 동물로 표준화하였다. mRNA 수준의 변화를 내재 GAPDH로 표준화하였다. 3회의 독립된 실험을 수행하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, PPARα mRNA 수준의 20% 억제가 달성되었다.
실시예 10: 접합체의 생체내 전달/활성
6 내지 8주령의 수컷 마우스(품종 C57BL/6, 20 내지 25 g)를 할란 스프라그 다울리( Harlan Sprague Dawley)(미국 인디애나폴리스주 인디애나폴리스 소재)로부터 얻었다. 주사 전에 마우스를 10일 이상 동안 사육하였다. 할란 테크라드 로덴트 다이어트(Harlan Teklad Rodent Diet)(미국 위스콘신주에 소재하는 할란)를 이용하여 음식 공급을 무제한적으로 수행하였다. 총 부피 0.4 ㎖의 주입 HEPES-완충(5 mM pH 7.5) 등장 글루코스를 마우스의 꼬리 정맥 내로 관주하였다. DNA 또는 siRNA 접합체를 마우스에게 주입하였다. 안와후 채혈 및 간 회수로 혈청을 회수하기 전에 4시간 동안 마우스를 금식시켰다. 웨스턴 분석법에 사용하기 위한 혈청을 채취하여 동일 부피의 EDTA 함유 컴플리트 프로테아제 억제제 칵테일(Complete Protease Inhibitor Cocktail)(미국 인디애나주 인디애나폴리스에 소재하는 로슈)에 첨가하고 -20℃에서 저장하였다. 회수 직후 TRI-REAGENT？(미국 오하이오주 신시내티에 소재하는 몰레큘라 리서치 센터(Molecular Research Center))를 제조자의 지시에 따라 사용하여 간으로부터 총 RNA를 단리하였다.
간세포 표적화 분석을 위해, Cy3으로 표지된 21-머 dsDNA 10 ㎍를 함유하는 다가접합체를 총 부피 0.2 ㎖로 전술한 바와 같이 제제화하고 정맥내 주입으로 수컷 ICR 마우스(20 내지 25 g, 할란 스프라크 다울리) 내로 전달하였다. 주입한 지 1시간 후, 마우스를 희생시키고 간 샘플을 절개하였다. 일부 실험에서, 폐, 신장, 비장, 뇌 및 췌장으로부터도 조직 샘플을 절개하였다. 조직 샘플을 4% 파라포름알데하이드/PBS 중에서 6시간 동안 고정시킨 후, 4℃의 30% 수크로스/PBS 용액 내에 밤새 넣어 두었다. 이어서, 고정된 조직 샘플을 OCT 동결 배지(미국 펜실베니아주 피츠버그에 소재하는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))가 함유된 블록 홀더 내에 넣고 액체 질소 중에서 급속 동결하였다. 마이크롬 HM 505N 크라이오스타트(cryostat)를 사용하여 동결된 조직 절편(8 내지 10 ㎛)을 준비하고 수퍼프로스트-플러스(Superfrost-Plus) 현미경 슬라이드(피셔 사이언티픽) 상에 올려 놓았다. 조직 절편을 PBS 중의 ALEXA？-488 팔로이딘(13 nM, 미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재하는 인비트로겐) 및 TO-PRO-3？(40 nM, 인비트로겐)으로 20분 동안 대비염색하였다. 슬라이드를 벡타쉴드(Vectashield)(미국 캘리포니아주 버링감에 소재하는 벡터 레이버레이토리스) 내에 장착하고 LSM510 공초점 현미경(칼 제이스(Carl Zeiss))으로 분석하였다.
Cy3-표지 21-머 dsDNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체를 주입시킨 지 1시간 후 마우스로부터 채취한 간 절편의 공초점 현미경사진이 도 7에 나타나 있다(각 패널에서 상부 좌측 사분원). 액틴은 세포 외곽선을 표시하기 위한 상부 우측 사분원에 나타나 있다. 핵은 하부 좌측 사분원에 나타나 있다. 합성 사진은 하부 우측 사분원에 나타나 있다. 중합체가 NAG 표적화 잔기를 포함하는 경우 간세포에서의 Cy3-표지 21-머 dsDNA의 축적과 함께 쿱퍼(Kupffer) 세포에 의한 최소한의 섭취 또는 간의 굴모양 혈관 내에서의 축적이 관찰되었다(도 7A). 분포는 다양한 간엽 전체에 거의 균질하였다. 다른 기관의 관찰은 간보다 20배 이상 더 낮은 것으로 평가된 수준에서 비장 및 신장에서의 약간의 Cy3-형광도를 보여주 었다. 접합되지 않은 폴리뉴클레오타이드와 중합체를 주입한 경우 또는 절단 비히클 상의 CDM-NAG를 CDM-글루코스로 치환시킨 경우 간세포 섭취가 현저히 감소되었고 비장 및 신장에 의한 섭취가 증가되었는데(도 7B 및 7C), 이 결과는 ASGP-R에 대한 글루코스의 낮은 친화성과 일치한다. 전달 비히클 상의 CDM-NAG를 CDM-만노스로 치환시킨 경우 대식세포 및 간 내피세포 표적화가 증가되었다(도 7D).
정량 PCR 및 인베이더 ( Invader ) 분석법
정량 PCR을 준비하기 위해, SUPERSCRIPT III？(인비트로겐) 및 올리고-dT 프라이머를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 총 RNA(500 ng)를 역전사하였다. 정량 PCR은 모델 7500 패스트 리얼-타임 PCR 시스템(Model 7500 Fast Real-Time PCR system)(미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스)을 이용하여 수행하였다. TAQMAN？ 유니버살 PCR 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 GAPDH mRNA 프라이머 및 프로브를 사용한 3회 반복 바이플렉스(biplex) 반응에서 apoB 및 ppara에 대한 TAQMAN？ 유전자 발현 분석법을 이용하였다. GAPDH 프라이머 및 프로브(미국 아이오와주 코랄빌에 소재하는 IDT)의 서열은 다음과 같다:
Figure 112009009685988-pct00008
주문 디자인된 INVADER？ mRNA 분석법을 제조자(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 써드 웨이브 테크놀로지스)의 지시에 따라 이용하여 ppara mRNA 수준에 대한 직접적인 측정을 수행하였다. 유비퀴틴에 대한 프로브 세트를 제조자의 지시에 따라 사용하여 바이플렉스 반응을 3회 반복하여 수행하였다.
ApoB 웨스턴, 사이토카인 분석법 및 간 독성 및 대사 패널
3 내지 8% 폴리아크릴아마이드/SDS 겔 상의 전기영동으로 혈청 단백질(0.1 ㎕)을 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막으로 전기영동에 의해 옮긴 후 토끼 폴리클로날 항-ApoB 항체(1 : 5000 비로 희석됨)(미국 매인주 사코에 소재하는 바이오디자인 인터내셔날)와 함께 항온처리하였다. 그 후, 블롯을 호스라디쉬 퍼록시데이즈(시그마)에 접합된 염소 항-토끼 항체(1 : 8000 비로 희석됨)와 함께 항온처리하고, 증강된 화학발광성 검출 키트(미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 아머샴 바이오사이언스)를 사용하여 항체 결합을 검출하였다. 시약을 제조자(미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 R&D 시스템스)의 지시에 따라 사용하여 샌드위치 ELISA로 마우스 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 혈청 수준을 측정하였다. 제조자(미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 PBL 바이오메디칼)의 지시에 따라 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 마우스 IFN-α의 혈청 수준을 측정하였다. 마쉬필드 임상 실험실 수의학 진단부(Marshfield Clinic Laboratories Veterinary Diagnostic Division)(미국 위스콘신주 마쉬필드 소재)에서 자동화 시스템을 이용하여 ALT, AST, 콜레스테롤 및 트라이글리세라이드의 혈청 수준을 측정하였다.
siRNA 접합체-처리 마우스에서 사이토카인 및 간 효소의 혈청 수준
Figure 112009009685988-pct00009
n=5, 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 표시된다.
실시예 11. 마우스의 간에서 표적 유전자의 넉다운
siRNA 및 넉다운 표적 유전자 발현을 생체 내로 전달하는 본 발명의 시스템의 능력을 입증하기 위해, apoB-1 siRNA를 함유하는 접합체(800 ㎍의 중합체, 50 ㎍의 siRNA)를 C57B1/6 마우스 내로 주입하였다. 생체내 표적화 연구에서와 같이, siRNA 접합체를 꼬리 정맥 관주로 투여하였다. 주입한 지 2일 후 주입한 마우스로부터 간을 회수하고 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)을 이용하여 apoB mRNA 수준을 분석하였다. 상대적 apoB mRNA 수준에서의 임의의 차이가 하우스킵핑(housekeeping) 유전자 발현에 대한 비특이적 효과로 인한 것일 가능성을 감소시키기 위해 GAPDH mRNA의 수준 및 총 투입 RNA의 양(㎍)을 기준으로 apoB mRNA 수준을 측정하였다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, 주입한 지 2일 후 측정되었을 때 apoB-1 siRNA 접합체로 처리된 마우스는 비-apoB 대조군 siRNA로 처리된 마우스 또는 생리식염수만을 주입한 마우스에 비해 유의하게 감소된 apB mRNA 수준을 보였다(n=5, p<0.00001). 구체적으로, apoB-1 siRNA 접합체로 처리된 마우스에서의 평균 apoB mRNA 수준은 생리식염수로만 처리된 군에 비해 GAPDH mRNA 수준을 기준으로 76±14%만큼 감소한 반면, 대조군 siRNA를 주입한 마우스의 apoB mRNA 수준은 영향을 받지 않았다. apoB mRNA 수준을 총 RNA를 기준으로 측정한 경우 유사한 결과를 얻었다. 혈청 중의 apoB-100 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석은 간 apoB mRNA 수준에서의 감소를 반영하였다(도 8B).
apoB 넉다운의 특이성을 확인하기 위해, apoB mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 siRNA로 별도의 마우스 군을 처리하였다. apoB-2 siRNA 접합체를 제공받은 마우스도 apoB mRNA 수준에서 유의한 감소를 보였다(60±6% 감소, n=5, p<0.00001, 도 8A). 혈청 중의 apoB-100 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석은 간 apoB mRNA 수준의 감소를 반영하였다(도 8B). ApoB mRNA 발현은 apoB 유전자를 발현하는 또 다른 조직인 공장에서 감소되었는데, 이는 접합체가 이 조직을 표적화하지 않았음을 암시한다. 이 조직-특이적 활성은 간세포 표적화와 일치한다.
본 발명자들은 간에서의 지방산 대사를 조절하는 데 중요한 유전자인 ppara(Kersten 1999, Schoonjans 1996)를 표적화하는 siRNA를 포함하는 접합체도 제조하였다. ppara를 표적화하는 2가지 상이한 siRNA의 전달은 mRNA 수준을 정량하기 위한 2가지 독립된 방법에 의해 분석되었을 때 ppara mRNA 수준의 유의한 넉다운을 초래하였다(도 8C). ppara-1 siRNA를 제공받은 마우스에서의 ppara mRNA 수준은 IINVADER？ 및 RT-qPCR에 의해 분석되었을 때 대조군 siRNA를 제공받은 마우스를 기준으로 각각 40±9% 및 64±9%만큼 감소되었다. ppara mRNA 수준의 유의한 감소가 ppara mRNA 서열의 분리된 영역을 표적화하는 ppara-2 siRNA를 포함하는 전 달 비히클을 주입한 마우스에서 관찰되었다.
전달 시스템의 잠재적 독성은 간 효소 및 사이토카인의 혈청 수준을 측정함으로써 평가하였다. 주입한 지 48시간 후, 생리식염수로 처리된 마우스와 비교하였을 때 대조군 siRNA 또는 apoB-1 siRNA 접합체를 제공받은 마우스에서 ALT 및ST 수준의 약간의 상승이 관찰되었다. 그러나, 증가된 수준은 유의하지 않았고(p<0.05), 조직 절편의 조직학적 검사는 간 독성의 징후를 보이지 않았다. 유사하게, ELISA를 사용한 혈청 중의 TNF-α 및 IL-6 수준의 분석은 TNF-α 및 IL-6 수준 둘다 siRNA-중합체 접합체를 주입한 지 6시간 후 약간 상승하였지만 48시간까지 기준치로 복귀되었다. 6시간 경과 시점에서 관찰된 증가는 유의한 면역 자극을 초래하지 않을 것으로 예상되지만 리포폴리사카라이드(Matsumoto 1998, Matsuzaki 2001)를 사용한 자극 시 관찰된 수준보다 4배 이상 더 낮았고 아데노바이러스의 주입(Lieber 1997, Benihoud 2007) 후 관찰된 수준보다 1 내지 3배 더 낮았다. INF-α의 혈청 수준에서의 유의한 차이는 어느 시점에서도 검출되지 않았지만, apoB-1 siRNA 접합체를 주입한 지 6시간 후 약간 증가하였다. 이 결과는 표적화된 전달 시스템이 우수한 내성을 나타냄을 보여준다.
실시예 12. 투여량-반응 및 표현형 분석
본 발명자들은 2가지 방식, 즉 마우스에게 전달된 siRNA 접합체의 양을 감소시킴으로써 또는 중합체의 양을 일정하게 유지하되 접합된 siRNA의 양을 감소시킴으로써 투여량-반응 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 이 실험의 결과를 비교함으로써 절단 비히클의 2가지 성분들, 즉 엔도좀용해성 중합체 및 siRNA 자체 중 어 느 것이 전달을 제한하는 지를 확인하고자 하였다.
apoB-1 siRNA 접합체의 단순 연속 희석물을 마우스 내로 주입하자 간 apoB mRNA의 넉다운 양이 점진적으로 감소하였다(도 9A). 가장 높은 주입 투여량(800 ㎍의 중합체, 50 ㎍의 siRNA, 즉 2.5 mg/kg)에서 간의 apoB mRNA 수준이 생리식염수만을 주입한 마우스에 비해 주입한 지 2일째 날에 GAPDH mRNA를 기준으로 84±5% 감소하였다. apoB mRNA 수준이 총 RNA를 기준으로 측정된 경우 유사한 결과가 얻어졌다. 2배 미만의 siRNA 접합체(400 ㎍의 중합체, 25 ㎍의 siRNA)의 주입은 상대적 apoB mRNA 수준에서의 50±8%의 감소를 초래하였다. 4배 미만의 주입은 생리식염수 대조군에 비해 apoB 넉다운을 초래하지 않았다. 중합체의 양을 일정하게 유지하되 전달 비히클에 접합된 apoB-1 siRNA의 양을 감소시킴으로써 연속 희석물로부터 얻은 결과와 정량적으로 유사한 결과를 얻었다(도 9B). 이 발견은 절단 비히클에 존재하는 엔도좀용해성 중합체의 양이 관찰된 넉다운에 대한 제한 인자라기보다는 상기 중합체에 접합된 siRNA의 양 또는 효능이 관찰된 넉다운에 대한 제한 인자임을 암시한다.
apoB 결핍의 특징은 VLDL 조립의 손상 및 간으로부터의 콜레스테롤 수송으로 인한 감소된 혈청 콜레스테롤 수준이다(Burnett Zimmermann 200602). 도 10에 나타낸 apoB의 넉다운 수준이 이 마우스에서 생리학적 반응을 이끌어내기에 충분한 지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 마우스의 총 혈청 콜레스테롤 수준을 측정하였다. 본 발명자들은 최대로 전달된 siRNA 투여량(50 ㎍)에서 대조군 siRNA 또는 생리식염수만을 제공받은 마우스에 비해 평균 혈청 콜레스테롤 수준의 유의한 감 소(30±7%, n=5, p<0.001)를 관찰하였다(도 10). 유사한 결과가 apoB-2 siRNA 접합체로 처리된 동물에서 얻어졌다. 전달된 siRNA의 양의 감소는 이 동물에서 측정된 감소한 apoB mRNA 넉다운과 일치하는, 관찰된 콜레스테롤 저하 양의 점진적인 감소를 이끌어내었다.
간에서의 VLDL 조립의 손상 및 이에 따른 VLDL 유출의 감소는 간의 트라이글리세라이드 수준도 변경시킬 것으로 예상되는데, 이는 트라이글리세라이드도 VLDL 입자 내로 도입되기 때문이다(Gibbons 2004). 사실상, 가족성 저베타인지단백혈증을 앓는 환자에서 발견되는 형태와 유사한 말단절단된 apoB 형태를 발현하는 형질전환 마우스도 간의 트라이글리세라이드를 수송하는 감소된 능력을 나타낸다(Chen 2000). 트라이글리세라이드 수송에 대한 apoB 넉다운의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 apoB-1 siRNA 접합체를 주입한 마우스로부터 얻은 간 절편의 오일 레드 염색을 수행하였다. 상기 간 절편의 검사는 간 지질 함량이 대조군 마우스에 비해 현저히 증가하였음을 보여준다(도 11). 패널 A는 ApoB siRNA로 처리된 마우스를 보여준다. 패널 B는 음성 대조군 GL3 siRNA로 처리된 마우스를 보여준다. 패널 C는 생리식염수 단독으로 처리된 마우스를 보여준다. 감소한 혈청 트라이글리세라이드 수준은 이 마우스에서도 검출되는데, 이는 감소한 간 트라이글리세라이드 유출 능력에 대한 추가 증거이다. 또한, 이 결과는 apoB-1 siRNA 접합체의 단순한 정맥내 주입이 간세포로의 폴리뉴클레오타이드의 기능적 전달 및 이에 따른 예상된 표현형적 효과를 수반한 간에서의 apoB 발현의 넉다운을 야기함을 보여준다.
간 지방 축적의 분석을 위해, siRNA-접합체-처리 마우스 및 대조군 마우스로 부터 얻은 간 샘플을 OCT 동결 배지 중에서 동결시키고, 동결된 조직 절편(8 내지 10 ㎛)을 전술한 바와 같이 제조하였다. 공기 건조된 조직 절편을 4% 포름알데하이드/PBS 중에서 20분 동안 고정시키고, 증류수로 수회 세정한 후, 60% 아이소프로판올로 짧게 세정하였다. 0.5 g의 오일 레드 O를 100 ㎖의 아이소프로판올 중에서 밤새 혼합하고 와트만(Whatman) #1 필터지를 이용하여 여과함으로써 오일 레드 O 스톡 용액을 제조하였다. 오일 레드 O 사용 용액은 20 ㎖의 물을 30 ㎖의 오일 레드 O 스톡 용액과 혼합하고 0.2 ㎛ 날진(Nalgene) 여과 유니트(피셔 사이언티픽)를 사용하여 여과함으로써 제조하였다. 고정된 절편을 즉석 제조한 오일 레드 O 사용 용액으로 15분 동안 염색하고, 60% 아이소프로판올로 짧게 세정하였다. 핵의 대조염색은 슬라이드를 해리스(Harris) 개질 헤마톡실린 용액(미국 미조리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마) 내로 7회 침지하고 증류수로 세정함으로써 수행하였다. 그 후, 세정된 슬라이드를 겔 마운트(Gel Mount)(미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 바이오메디아 코포레이션)를 사용하여 장착하였다. 염색된 슬라이드를 디지털 카메라(액시오캠(Axiocam), 칼 제이스(Carl Zeiss))가 장착된 제이스 액시오플랜(Zeiss Axioplan) 2 현미경으로 분석하였다. 디지털 화상을 액시오비젼(AxioVision) 소프트웨어(칼 제이스)를 이용하여 포착하였다.
실시예 13. CDM 또는 다이설파이드 불안정성 결합에 의한 막 활성 중합체에의 접합에 의한 siRNA의 전달
다이설파이드 접합체: 센스 가닥 상에 5'-아미노 기를 가진 루시퍼레이즈에 대해 표적화된 siRNA 50 ng을 HEPES 염기(pH 7.5)의 존재 하에 N-석신이미딜-S-아 세틸티오아세테이트 1 ㎍과 반응시켰다. 별도로, 아미노-보호 단량체와 부틸 비닐 에테르 단량체의 50/50 혼합물로부터 합성된 폴리비닐에테르 50 ㎍을 HEPES(pH 7.5)의 존재 하에 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터 5 ㎍과 반응시켰다. 이어서, 변경된 siRNA와 변경된 중합체를 조합하여 상기 siRNA를 상기 중합체에 공유결합시켰다. 6 내지 24시간 후, 중합체-siRNA 접합체를 HEPES 염기의 존재 하에 2-프로피온산-3-메틸말레산 무수물 200 ㎍과 반응시켰다. 루시퍼레이즈 유전자를 안정하게 발현하는 마우스 간세포 HEPA 세포주에 입자를 첨가하였다. CDM-변경 중합체(siRNA를 갖지 않음)를 함유하는 샘플을 대조군으로서 세포에 첨가하였다. 중합체-폴리뉴클레오타이드 접합체에 노출된 세포에서 루시퍼레이즈 발현이 중합체 단독에 노출된 세포에 비해 75% 억제되었는데, 이는 세포로의 기능성 siRNA의 전달을 의미한다.
CDM 접합체: 센스 가닥 상에 5'-아미노 기를 가진 루시퍼레이즈에 대해 표적화된 siRNA 50 ng을 HEPES(pH 7.5)의 존재 하에 CDM 티오에스터 2 ㎍과 반응시켰다. 아미노-보호 단량체와 부틸 비닐 에테르 단량체의 50/50 혼합물로부터 합성된 폴리비닐에테르 50 ㎍을 상기 siRNA에 첨가하였다. 6 내지 24시간 후, 중합체-siRNA 접합체를 HEPES 염기의 존재 하에 2-프로피온산-3-메틸말레산 무수물 200 ㎍과 반응시켰다. 루시퍼레이즈 유전자를 안정하게 발현하는 마우스 간세포 HEPA 세포주에 입자를 첨가하였다. CDM-변경 중합체(siRNA를 갖지 않음)를 함유하는 샘플을 대조군으로서 세포에 첨가하였다. 중합체-폴리뉴클레오타이드 접합체에 노출된 세포에서 루시퍼레이즈 발현이 중합체 단독에 노출된 세포에 비해 86% 억제되었는 데, 이는 세포로의 기능성 siRNA의 전달을 의미한다.
막 활성 중합체-siRNA 접합체를 사용한 HEPA-Luc 세포의 형질감염 후 루시퍼레이즈 활성의 억제율(%)
다이설파이드 접합 CDM 접합
75% 86%
실시예 14. apoB 넉다운의 수명 및 이의 표현형적 효과
본 발명자들은 단회 투여량의 apoB-1 siRNA 접합체를 투여한 후 마우스에서 apoB 넉다운 및 콜레스테롤 저하의 지속을 확인하기 위해 시간 경과에 따른 실험을 수행하였다. apoB-1 siRNA 접합체(800 ㎍의 중합체, 50 ㎍의 siRNA)의 주입은 2일째 날에 평균 apoB mRNA 수준을 대조군 마우스에 비해 87±8%까지 감소시켰는데(도 12), 이는 전 단락에 기재된 본 발명자들의 실험 결과와 일치한다. apoB 발현의 감소는 총 혈청 콜레스테롤 수준에서의 42±5% 감소를 동반하였다(도 12B). apoB mRNA 발현의 감소는 10일에 걸쳐 유의한 상태로 유지되었고 15일째 날에 거의 대조군 수준으로 회복되었다. 혈청 콜레스테롤의 감소는 4일에 걸쳐 유의한 상태로 유지되었고(n=5, p<0.01) 10일까지 대조군 수준으로 완전히 회복되지 않았다. 이 결과는 siRNA 접합체의 단회 주입 후 지속된 apoB 넉다운 및 표현형의 발생이 달성될 수 있고 apoB 발현이 시간에 따라 정상으로 회복됨에 따라 표현형이 복귀될 수 있음을 보여준다.
실시예 15. 중합체-모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PMO) 접합체를 사용한 세포로의 PMO의 전달
siRNA를 중합체에 연결시키는 데 사용된 CDM-티오에스터 기재 가교결합을 이용하여 다른 유형의 올리고뉴클레오타이드를 중합체에 가역적으로 접합시킬 수도 있다. 구체적으로, 본 발명자들은 세포로의 PMO 전달을 연구하였다. 노출된 상태 또는 상보적 DNA 가닥과 혼성화된 상태의 5 nmol의 아미노-PMO(돌연변이체 루시퍼레이즈 전사체 내의 돌연변이체 스플라이스 부위를 차단함)를 어느 것과도 반응시키지 않거나 HEPES(pH 7.9)의 존재 하에 2 ㎍의 CDM 티오에스터와 반응시켰다. 이 반응물에 50% 아미노비닐에테르, 45% 부틸 비닐에테르 및 5% 도데실비닐에테르(DW550)로부터 합성된 200 ㎍의 폴리비닐 에테르를 첨가하였다. 3시간 이상의 시간 후, 중합체 + PMO 또는 중합체-PMO 접합체를 HEPES의 존재 하에 500 ㎍의 CDM과 반응시켜 pH를 7.5보다 높게 유지하였다. CDM 이외에, 상기 접합체를 CDM 및 다양한 분자량의 PEG 모노메틸 에테르의 산 클로라이드로부터 유래된 CDM의 PEG 에스터와 반응시켰다. 그 다음, 상기 접합체를 HeLa 세포용으로 이용되는 조건 하에 생장된 HeLa Luc/705 세포(미국 오레곤주 필로매쓰에 소재하는 진 툴스(Gene Tools))에 첨가하였다. 상기 세포를 3x106 세포/웰의 밀도로 24-웰 배양 접시에 플레이팅하고 24시간 동안 항온처리하였다. 배지를 2.5 nmol의 아미노-PMO 착물이 함유된 1.0 ㎖의 DMEM으로 교체하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 항온처리기 내에서 4시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 배지를 10% 태아 소 혈청이 함유된 DMEM으로 교체하였다. 그 다음, 세포를 48시간 동안 더 항온처리하였다. 이어서, 세포를 수거한 후, 세포용해물을 루시퍼레이즈 발현에 대해 분석하였다. 이 결과 는 형질감염제가 DW550 폴리비닐에테르 중합체-PMO 접합체인 경우 하전되지 않은 폴리뉴클레오타이드의 전달이 증가됨을 입증한다.
세포로의 하전되지 않은 폴리뉴클레오타이드의 전달
형질감염제 비히클 루시퍼레이즈의 유도 배수
연결 없음
DW550 + 노출된 PMO 2
DNA와 혼성화된 DW550 + PMO 2
중합체-PMO 접합체
DW550-CDM-노출된 PMO 7.5
DW550-CDM-혼성화된 PMO 10
실시예 16. 근육으로의 siRNA의 접합체 전달
40 ㎍의 PPARα siRNA 또는 대조군(GL3) siRNA를 PBAVE 중합체에 접합시키고 전술한 바와 같이 마스킹하였다. 250 ㎕의 접합체를 마우스(n=3)의 장딴지근 내로 주입하였다. 주입 속도는 약 25 ㎕/초이었다. PPARα 발현은 전술한 바와 같이 측정하였다.
마스킹된 접합체의 직접적 주입 후 근육에서의 PPARα 억제
siRNA 접합체 GAPDH mRNA를 기준으로 한 PPARa mRNA 수준 총 mRNA를 기준으로 한 PPARa mRNA 수준
GL3 1.00±0.26 1.00±0.15
PPARα 0.62±0.07 0.54±0.13
실시예 17. siRNA 발현 카세트의 생체내 전달
U6 프로모터의 조절 하에 SEAP siRNA를 발현하는 20 ㎍의 PCR-발생 선형 SEAP siRNA 발현 카세트와 400 ㎍의 막 활성 중합체 DW1453(75 몰%의 아미노, 21 몰%의 저급 알킬(부틸) 및 4 몰%의 고급 알킬(C18, 옥타데실) 기로 구성되어 있고 LBA를 사용하여 갈락토스로 변경시킴)의 복합체를 형성하였다. 락토바이오닐화는 43 mg의 LBA를 60 mg의 중합체에 첨가한 후 34 mg의 EDC 및 24 mg의 NHS를 첨가함으로써 수행하였다. 루시퍼레이즈 siRNA(GL3)를 발현하는 카세트도 대조군으로서 제제화하였다. 0.65 중량 당량의 글루타르알데하이드를 첨가하여 DNA를 중합체에 접합시켰다. 밤새 접합시킨 후, 복합체를 40 몰%의 NHS-아세테이트로 변경시켜 상기 중합체 상의 전하를 감소시켰다.
500 ㎍의 락토바이오닐화된 DW1453을 14 중량 당량의 HEPES 염기의 존재 하에 1 중량 당량의 마스킹제 CDM-PEG(평균 10 유니트)로 변경시키고 분비되는 알칼리성 포스파테이즈(SEAP)를 발현하는 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하였다. 마스킹된 중합체를 주입한 지 10분 후, 공동-표적화된 DNA-DW1453 중합체 접합체를 주입하였다. 1일째 날 및 14일째 날에 채혈하여 SEAP 수준에 대해 분석하였다.
siRNA 1일째 날의 활성을 기준으로 한 14일째 날의 SEAP 활성
SEAP siRNA 48 ± 13
GL3 siRNA 87 ± 17
활성은 4마리 동물의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 18. 항체의 전달
35 ㎍의 토끼 IGG(시그마) 항체를 2 중량%의 SPDP(피어스)로 변경시켰다. 2 중량%의 이미노티올란을 첨가하여 DW1360(pH 9의 5 mM TAPS 중의 30 mg/㎖)을 변경시켰다. 530 ㎍의 이미노티올란-PBAVE를 pH 9의 5 mM TAPS가 함유된 400 ㎕의 등장성 글루코스 용액에 첨가하였다. 이 용액에 35 ㎍의 SPDP-변경 항체를 첨가하였 다. 16시간 후, 항체-중합체 접합체를 CDM-NAG와 CDM-PEG의 2:1 혼합물 7 중량 당량으로 변경시켰다. 상기 접합체를 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하였다. 주입한 지 20분 후, 마우스를 희생시키고, 간을 회수하고 현미경 분석을 위해 처리하였다. 간 조직의 검사는 간세포에서의 항체의 유의한 축적을 보여준다(도 13). 상부 좌측 사분원은 표지된 항체를 나타내고, 상부 우측 사분원은 액틴을 나타내고, 하부 좌측 사분원은 핵을 나타내며, 하부 우측 사분원은 합성 상을 나타낸다.
실시예 19. 시험관내 형질감염제로서 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체
이미 공지된 바와 같이((Klaunig 1981), 2-단계 콜라게네이즈 관주 방법을 이용하여 성체 마우스(품종 C57BL/6)로부터 일차 간세포를 회수하였다. 트립판 블루 배제에 의해 측정된 간세포 생존능은 85 내지 90%이었다. 간세포를 콜라겐 코팅 12-웰 플레이트 내의 10% 태아 소 혈청 함유 배지 1 ㎖ 중에 1.5x105 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅한 지 24시간 후, 제조자의 프로토콜에 따라 TRANSIT-SIQUEST？(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 미니스 바이오)를 사용하여 배지 변경 없이 3중 반복 웰 내의 세포를 siRNA 또는 다양한 양의 siRNA 접합체로 형질감염시켰다. 형질감염으로부터 24시간 후 간세포를 회수하고 TRIREAGENT？ 시약(미국 오하이오주 신시내티에 소재하는 몰레큘라 리서치 센터)을 사용하여 총 RNA를 단리하였다.
기재된 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 시험관내 형질감염 성질을 입증하기 위해, apoB-특이적 siRNA를 시판되는 siRNA 형질감염제 또는 기재된 폴리뉴클레오타이드 접합체를 사용하여 일차 간세포에 전달하였다. 상기 접합체를 사용한 일차 간세포의 형질감염은 apoB mRNA가 80% 넉다운될 만큼 매우 효과적이었다(도 14). 표적 유전자 넉다운에 의해 측정된 siRNA 전달 수준은 시판되는 시약 SIQUEST？를 사용하여 달성한 수준에 필적할만하였다. 예측된 바와 같이, 세포에 첨가된 접합체 양의 감소는 apoB 넉다운을 점진적으로 감소시켰다.
실시예 20. 시험관내 형질감염제로서 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체
TRANSIT LT1？(미니스 바이오)을 사용하여 초파리 및 레닐라(renilla) 루시퍼레이즈를 코딩하는 플라스미도 Hepa-1c1c 세포를 형질감염시켰다. 플라스미드 형질감염으로부터 4시간 후, 9 ㎍의 PD-PLL과 접합시킨 후 CDM-Pip-LBA(45 g)로 변경시킨 100 ng의 루시퍼레이즈 siRNA를 세포에 첨가하였다. 일부 샘플의 경우, CDM-Pip-LBA로 변경된 25/75-PBAVE(5 ㎍)도 세포에 첨가하였다. siRNA의 첨가로부터 48시간 후, 세포를 수거하고 초파리 및 레닐라 루시퍼레이즈에 대해 분석하였다. 초파리 발현의 양을 각 샘플에 대해 레닐라로 표준화시키고 각 군에 대해 siRNA에 노출되지 않은 세포로 표준화시켰다. PLL-siRNA 접합체 단독은 siRNA를 시험관내 세포에 전달할 수 없다(백색 막대, 도 15). 말레아메이트로 마스킹된 막 용해성 중합체 PBAVE의 첨가는 시판되는 형질감염제와 동등한 활성을 이끌어냈다(흑색 막대). 일반적으로, siRNA 및 DNA 형질감염은 과량의 시약을 필요로 하는 듯하다. siRNA와 상호작용하는 데 필요한 양보다 많은 과량의 방출 중합체는 시험관내 기능적 전달 및 생채내 기능적 전달(엔도좀으로부터의 방출)을 증강시킬 수 있다. siRNA-중합체 접합체와 중합체의 유사한 크기 및 전하로 인해, 상기 접합체 및 중합체는 생채내 간세포를 동시적으로 표적화할 수 있다. 이 예상을 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 PLL에 접합된 Cy3-표지 siRNA와 오레곤 그린-표지 25/75-PBAVE의 동시 주입이 사실상 간세포에 동시 편재되지 않음을 관찰하였다(상기 참조).
전달 중합체와 siRNA의 접합체의 시험관내 활성은 시판되는 시약 TRANSIT TKO？로 형질감염된 비접합 siRNA와 동등하다(도 15). 요오도아세트아마이드 알킬화 화학반응에 기초한 siRNA와 중합체의 비가역적 결합을 이용하여 병행한 실험(도 15에서 점선 막대로 표시된 IA-접합체)은 접합이 가역적이지 않은 경우 siRNA-중합체 접합체가 활성을 나타내지 않음을 보여주는데, 이는 siRNA의 기능적 전달을 위해서는 다이설파이드 결합이 감소되어야 함을 암시한다(겔 분석에 의한 확인 시 관찰된 20% 넉다운은 접합되지 않은 올리고의 약 10%에 기인함). 말레아밀레이트화된 접합체에 대해 관찰된 활성은 중합체가 더 이상 양으로 하전되어 있지 않아 정전기적 힘에 의해 올리고뉴클레오타이드와 상호작용하지 않을지라도 siRNA-접합체가 혈청 중의 뉴클레이즈에 의한 분해에 대해 내성을 가짐을 암시한다. 뉴클레이즈에 대해 내성을 갖는 변경된 siRNA 유사체도 사용될 수 있다.
실시예 21. 마스킹제 및 폴리뉴클레오타이드가 막 활성 중합체에 부착되기 위한 불안정성 결합
A. PEG 스페이서를 가진 pH 불안정성 결합
ASGP-R 리간드 표적 기의 한 실시양태는 다음과 같이 제조될 수 있다:
Figure 112009009685988-pct00010
Figure 112009009685988-pct00011
하기 화학식 I의 화합물(화합물 I)을 전구체로서 사용하여 하기 화학식 II의 화합물(화합물 II), 즉 PBAVE 중합체와 같은 아민-함유 막 활성 중합체를 가역적으로 변경시킬 수 있는 표적화 기 마스킹제를 생성하였다. 말레산 무수물과 중합체 상의 아민 기의 반응은 갈락토스와 중합체 사이에서 pH 불안정성 결합을 형성시킨다. 화합물 II를 사용한 PBAVE 중합체의 변경은 하기 화학식 III의 화합물(화합물 III)을 생성시킨다:
Figure 112009009685988-pct00012
화합물 III을 사용한 PBAVE 아미노 기의 변경(중합체 아민에 대한 화합물 III의 비는 0.75:1임) 및 CDM-PEG500을 사용한 PBAVE 아미노 기의 변경(중합체 아민에 대한 CDM-PEG의 비는 0.25임)은 생체내 간세포에 표적화되는 성질을 나타내는 접합체를 생성시켰다. 다양한 스페이서 길이의 에틸렌 기(n = 1, 2, 3 또는 7)는 표적 유전자 발현의 넉다운에 의해 입증된 바와 같이 siRNA를 간세포로 전달하는 데 모두 효과적이었다.
B. 알킬 스페이서를 가진 pH 불안정성 결합
하기 화학식 V에 나타낸 바아 같이 알킬 스페이서 기도 사용될 수 있다. 그러나, 알킬 스페이서는 마스킹제의 소수성을 증가시켜 마스킹제와 접합체의 가용성을 낮춘다.
Figure 112009009685988-pct00013
C. 다가 표적화 기
높은 원자가를 가진 표적화 기도 사용될 수 있다. 다가 갈락토스 표적화 기의 예시적 실시양태는 하기에 표시되어 있다. 이가 갈락토스 리간드(화학식 VI의 화합물) 및 삼가 갈락토스 리간드(화학식 VII의 화합물)는 ASGP-R에 대한 보다 높은 친화성을 가질 수 있다.
Figure 112009009685988-pct00014
Figure 112009009685988-pct00015
D. 음성 대조군 표적화 리간드
표적 세포에 대해 상당히 낮은 친화성을 가진 관련 표적화 기를 음성 대조군으로서 사용하여 바람직한 표적화 기의 효능을 측정할 수 있다. 예를 들면, 간세포의 ASGP-R은 갈락토스에 결합하지만 글루코스에는 결합하지 않는다. 따라서, 글루코스 표적화 기(화학식 VIII의 화합물)를 세포 표적화 분석법에서 음성 대조군으로서 사용할 수 있다.
Figure 112009009685988-pct00016
E. 만노스 표적화 기
대식세포 및 간 쿱퍼 세포는 만노스 사카라이드에 결합하는 수용체를 갖는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 만노스 잔기(하기 화학식 IX의 화합물)를 가진 표 적화 기를 상기 세포들을 표적화하는 데 사용할 수 있다.
Figure 112009009685988-pct00017
F. 불안정성이 다양한 결합
불안정성(절단 속도)이 다양한 결합을 이용하여 마스킹제 또는 폴리뉴클레오타이드를 막 활성 중합체에 연결할 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전달을 위해, 폴리뉴클레오타이드가 접합체로부터 방출되는 속도를 감소시킴으로써 넉다운의 지속을 증가시킬 수 있다. 다이설파이드 결합은 전형적인 포유동물 세포에서 환원 환경 하에 절단 속도를 다양하게 함으로써 형성할 수 있다. 중합체로부터의 마스킹제의 보다 느린 방출은 생체 내에서의 접합체의 순환 시간을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 5-메틸-2-이미노티올란(M2IT, 결합 X)은 SMTP 결합(하기 화학식 XI의 화합물)보다 4배 더 느린 절단 속도를 나타낸다.
Figure 112009009685988-pct00018
Figure 112009009685988-pct00019
하기 화학식 XII의 화합물에 대한 절단 속도는 이치환된 말레산 무수물 결합보다 약 30배 더 느릴 것으로 예상된다.
Figure 112009009685988-pct00020
실시예 22. PBAVE 및 폴리뉴클레오타이드-PBAVE 접합체의 특징규명
A. 양극성 분석
1,6-다이페닐-1,3,5-헥사트리엔(DPH, 인비트로겐) 형광도(λex = 350 nm; λem = 452 nm)는 소수성 환경 하에 증강된다. 이 형광단을 사용하여 PBAVE(DW1360) 중합체를 분석하였다. 0.5 μM(최종 농도)의 DPH를 플라스미드 DNA 40 ㎍의 존재 또는 부재 하에 50 mM HEPES 완충체(pH 8.0) 0.5 ㎖ 중의 PBAVE 10 ㎍에 첨가하였다. 그 다음, DPH의 형광도를 측정함으로써 소수성 환경 하의 DPH 축적에 대해 용액을 시험하였다. 접합체의 존재 하의 증가한 DPH 형광도는 중합체에 의한 소수성 환경의 형성을 나타낸다. 과량의 DNA의 첨가는 DPH 형광도를 유의하게 변경시키지 못하였다(도 16).
B. 분자량
DW1360의 분자량은 HPLC 크기 배제 크로마토그래피 및 표준물로서의 폴리에틸렌글리콜 세트(어메리칸 폴리머 스탠다드 코포레이션(American Polymer Standard Corp.))를 사용하여 측정하였다. 상기 중합체는 메탄올 중의 0.2 M LiClO4 및 5% AcOH와 함께 쇼덱 SB-803 HQ 컬럼을 사용한 GPC HPLC 상에서 분리하였다. 상기 컬럼으로부터의 PBAVE 중합체의 회수는 크기 평균이 약 12.8 kDa임을 보여준다(도 17).
C. 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 분자량
마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 분자량은 FPLC 크기 배제 크 로마토그래피 및 표준물로서의 Cy3-표지 핵산을 사용하여 측정하였다. 상기 접합체 및 표준물은 1x22 cm 세파크릴 S-500 컬럼을 사용한 시마쥬(Shimadzu) FPLC 상에서 분리하고 50 mM HEPES(pH 8.0)로 1 ㎖/분의 속도로 용출하였다. 컬럼으로부터의 접합체의 용출은 크기 평균이 약 77 kDa임을 보여준다(도 18).
D. 접합체의 화학양론적 비
PBAVE 중합체의 평균 분자량은 약 13 kDa인 것으로 실험적으로 측정되었다. 마스킹된 폴리뉴클레오타이드-중합체 접합체의 평균 분자량은 약 77 kDa인 것으로 실험적으로 측정되었다. PBAVE 중합체의 전하(아민) 당 평균 분자량은 약 200 Da인 것으로 실험적으로 측정되었다. CDM 마스킹제의 평균 분자량은 약 550 Da인 것으로 계산되었다. PBAVE 중합체의 평균 변경도는 사용가능한 아민의 약 75%인 것으로 실험적으로 측정되었다. 접합된 siRNA의 평균 분자량은 약 14 kDa인 것으로 계산되었다. 이 값들을 이용하였을 때 CDM에 의해 마스킹된 PBAVE 중합체 마스킹제의 평균 분자량은 약 30 kDa인 것으로 계산되었다. 따라서, 마스킹된 중합체에 대한 siRNA의 화학양론적 비는 약 1:2인 것으로 평가되었다.
E. 입자 크기 분류 및 제타 전위
생체 내로 주입된 접합체의 크기는 제타플러스 파티클 사이저(ZetaPlus Particle Sizer) 190(브룩해븐 인스트루먼츠 코포레이션(Brookhaven Instruments Corporation))을 이용하여 532 nm에서의 광 산란으로 측정하였다. 피크의 단봉 분석은 100 내지 30 nm에서 변하였다. 다봉 분석을 이용하여 가장 많은 수(95% 초과)의 입자가 있는 피크는 50 nm 미만, 보다 전형적으로 20 nm 미만이었다. 다가 접합체 크기도 분석 한외원심분리 또는 원자력 현미경을 이용하여 측정할 수 있다. 동일한 방식으로 브룩해븐 인스트루먼츠 코포레이션의 제타팔스를 사용하여 접합체의 제타 전위를 측정하였다. CDM에 의해 마스킹된 접합체의 제타 전위는 0 내지 -30 mV, 보다 우세하게는 0 내지 -20 mV에서 변하였다. 제타 전위는 5 mM TAPS로 pH 9에서 완충된 등장성 글루코스 중에서의 측정치이었다. 동일한 조건 하에 0 내지 -10 mV 및 0 내지 -5 mV의 제타 전위를 이용하여 안정한 비-응집 접합체도 형성하였다. pH 7에서 상기 접합체는 아민들 중 일부의 양성자화로 인해 약간의 양전하를 획득할 것으로 예측되었다.
실시예 23. 누드 마우스 내의 인간 간암종 이종이식물로의 접합체의 생체내 전달
기재된 접합체가 종양 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있는 지를 검증하기 위해, 인간 간암 HepG2 세포를 옆구리에 피하 이식한 마우스 내로 CDM-NAG-변형 올리고뉴클레오타이드-DW1360 접합체를 주입하였다. 6주령의 암컷 무흉선 누드 마우스를 할란 스프라rm 다울리(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 얻었다. 300 ㎕ PBS 중의 2x106개의 HepG2 세포를 마우스의 좌측 옆구리에 피하 주입하였다. 2주 후, 대조군 결장암종 HT-29 세포(300 ㎕ PBS 중의 2x106개)를 우측 옆구리에 피하 주입하였다. 이 주입은 보다 빠른 생장 속도를 보상하기 위한 것이었다. 피하 종양이 폭 및 길이에서 약 8 mm까지 생장하였을 때, 200 ㎕ 전달 완충제 중에 10 ㎍ Cy3-표지 21-머 dsDNA를 함유하는 CDM-NAG 및 CDM-PEG-변경 접합체를 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
NAG 표적화 접합체의 축적이 피하 간암 종양 덩어리의 큰 비율에서 관찰되었다(30 내지 60%, n=4, 도 19A). 섭취를 보이는 종양 세포의 대표적인 영역이 도 19A에 나타나 있다. 매우 낮은 수준의 종양 표적화가 글루코스 표적화 접합체를 제공받은 마우스에서 관찰되었다(도 19B, 종양 덩어리의 5% 미만, n=3). 갈락토스 수용체를 갖지 않은 대조군 결장암종 종양에서는 NAG 또는 글루코스-변경 접합체 둘다에서 종양 세포 신호가 관찰되지 않았다(도 19C 및 19D, n=2). 유사한 결과가 이종이식물을 확립하기 위해 HuH-7 간암종 세포를 사용한 경우에도 관찰되었다.
실시예 24. 접합 전 가역적 PEG 변경을 이용한 중합체의 변경
400 ㎍의 중합체 DW1360(75 : 20 : 5의 아민 : 부틸 : 옥타데실 비닐 에테르 공급 비로부터 형성됨)을 1.5 중량%의 SMPT로 변경시켰다. 1시간 후, CDM-NAG(N-아세틸갈락토스아민)과 CDM-PEG(평균 11 유니트)의 2 : 1 중량 혼합물 2 중량 당량을 5.6 mg의 HEPES 염기의 존재 하에 상기 중합체에 첨가하였다. 이 용액에 20 ㎍의 SATA/Cy3-변경 22-머 DNA 올리고뉴클레오타이드를 첨가하였다. 밤새 항온처리한 후, CDM-NAG와 CDM-PEG의 2 : 1 중량 혼합물 5 중량 당량을 상기 접합체에 첨가하였다. 400 ㎕의 생리식염수 중의 마스킹된 접합체를 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입하였다. 접합 전 CDM-NAG 및 CDM-PEG를 사용한 중합체의 변경은 접합 효율을 감소시키지 않는 것으로 확인되었다. 주입으로부터 1시간 후, 간을 회수하고, 동결된 간 절편을 준비하고 면역조직화학적 검사를 위해 처리하였다. TO-PRO-3？을 사용하여 세포 핵을 염색하였다. 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입한 후, 표지된 올리 고뉴클레오타이드가 간세포에서 관찰되었다.
실시예 25. CDM-시약 변경 후 접합체 중의 아민 기의 정량
올리고뉴클레오타이드-DW1360 접합체 중합체를 전술한 바와 같이 합성한 후, HEPES 염기 14 중량 당량 및 CDM-NAG와 CDM-PEG(평균 11 유니트)의 2 : 1 중량 혼합물 7 중량 당량으로 처리하였다. 1시간 후, 말레산 무수물 유도체로 처리된 접합체의 아민 함량을, NaHCO3 100 mM 중의 트라이니트로벤젠 설폰산(TNBS)으로 처리하여 측정하였다. 말레아메이트로 변경되지 않은 접합체로 표준화된 경우, 변경된 아민의 양은 총량의 약 75%임이 확인되었다. 이 변경도는 첨가된 말레산 무수물의 양을 변화시킴에 의해 달라질 수 있다.
실시예 26. 올리고뉴클레오타이드-중합체 접합체 및 이의 말레산 무수물 유도체의 전기영동
올리고뉴클레오타이드-중합체 DW1360 접합체를 전술한 바와 같이 제조하였다. 이어서, 올리고뉴클레오타이드 1 ㎍을 함유하는 접합체를 다양한 양의 CDM-PEG(평균 11 유니트) 및 CDM-NAG로 변경시켰다. 그 다음, 접합체를 아가로스 겔(2 중량%) 상에 놓고 전기영동하였다. 에티디움 브로마이드를 사용한 염색 시 말레산 무수물 유도체의 당량에 따라 접합체의 전하가 양성에서 중성으로 변하고 중성에서 음성으로 변함이 확인되었다.
상기 설명은 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것일 뿐이다. 나아가, 많은 변경 및 변화가 당업자에게 용이하게 인식될 것이기 때문에, 본 발명을 도시되고 기재된 정확한 구성 및 작업으로 한정해서는 안 된다. 따라서, 모든 적절한 변경물 및 균등물이 본 발명의 범위에 속한다.

Claims (24)

  1. 하기 화학식 1의 접합체를 포함하는, 분자를 세포에 전달하기 위한 조성물:
    화학식 1
    N-L1-P(L2-M)y
    상기 식에서,
    N은 막 불투과성 분자 또는 막 투과성이 낮은 분자이고,
    L1은 생리학적 불안정성 결합을 함유하는 제1 가역적 연결이고,
    P는 중합체이고,
    L2는 오르쏘고날(orthogonal) 생리학적 불안정성 결합을 함유하는 제2 가역적 연결이며,
    M은 마스킹제(masking agent)이고,
    y는 0보다 큰 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    분자가 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 펩티드, 항체 및 막 불투과성 약물로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드가 변경된 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA, 작은 방해 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA) 및 발현 카세트로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    중합체가 10 kDa보다 큰, 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    중합체가 막 활성 중합체인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    막 활성 중합체가 폴리아민인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    막 활성 폴리아민이 폴리비닐에테르 랜덤 공중합체로 구성되어 있는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    폴리비닐에테르 랜덤 공중합체가 3가지 이상의 다양한 단량체를 함유하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    3가지 이상의 다양한 단량체가 아민-함유 비닐 에테르 단량체, C2-6 알킬 비닐 에테르 단량체 및 C12-18 알킬 비닐 에테르 단량체로 구성되어 있는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    C2-6 알킬 비닐 에테르 단량체가 부틸 비닐 에테르 단량체로 구성되어 있고, C12-18 알킬 비닐 에테르 단량체가 옥타데실 비닐 에테르 단량체 또는 도데실 비닐 에테르 단량체로 구성되어 있는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    중합체가 생분해성 중합체인, 조성물.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    제1 가역적 연결 및 제2 가역적 연결이 세포 생리학적 불안정성 결합, pH 불안정성 결합, pH 고불안정성 결합, pH 초고불안정성 결합, 말레아메이트(maleamate) 결합, 효소에 의해 절단될 수 있는 결합 및 다이설파이드 결합으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 생리학적 불안정성 결합을 함유하는, 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    y가 2 이상인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    마스킹제가 동일하거나 상이한, 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    마스킹제가 입체 안정화제, 표적화 기 및 전하 변경제로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    하나 이상의 마스킹제가 세포 표면 분자에 대한 친화성을 가진 화합물, 세포 수용체 리간드, 세포 표면 분자에 대한 친화성을 가진 항체, 사카라이드, 갈락토스, 갈락토스 유도체, 만노스, 만노스 유도체, 비타민, 폴레이트, 바이오틴, 앱타머, 펩티드, 인슐린 및 표피 성장 인자(EGF)로 구성된 군으로부터 선택된 표적화 기로 구성되어 있는, 조성물.
  18. 제14항에 있어서,
    마스킹제가 다이메틸말레산 무수물, 카복시 다이메틸말레산 무수물(CDM), CDM-티오에스터, CDM 유도체, CDM-입체 안정화제, CDM-PEG(polyethylene glycol), CDM-리간드, CDM-갈락토스, CDM-락토비온산(LBA), CDM-Pip(propylaminopiperazine)-LBA 및 CDM-NAG(N-acetyl galactosamine)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
  19. 제1항에 있어서,
    제1항에서의 중합체와 동일하거나 상이한 중합체를 과량으로 추가로 포함하는 조성물.
  20. 제1항에 있어서,
    접합체가 pH 7에서 +30 내지 -30 mV의 제타 전위를 갖는, 조성물.
  21. 제1항에 있어서,
    접합체의 직경이 20 nm 미만인, 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
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