TW202210633A - 用於治療癌症之dbait分子與kras抑制劑的組合 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於用於治療癌症之Dbait分子與KRAS抑制劑之組合。

Description

用於治療癌症之DBAIT分子與KRAS抑制劑的組合
本發明係關於醫藥領域，特定言之腫瘤學領域。
RAS蛋白(由三種基因KRAS、NRAS及HRAS編碼之四種同功異型物KRAS4A、KRAS4B、NRAS及HRAS)充當驅動若干關鍵細胞過程(諸如細胞生長、增殖及存活)的分子開關。RAS為人類癌症中最頻繁突變之致癌基因之一。所有癌症中約三分之一癌症由RAS基因家族中之有害突變驅動，KRAS (Kirsten大鼠肉瘤2病毒致癌基因同源物)為人類腫瘤中最頻繁突變之致癌基因，從而導致腫瘤發生及腫瘤維持。20%之所有實性瘤含有致癌KRAS突變。KRAS-4B為人類癌症中之主要同功異型物，且其存在於大約90%胰臟癌，諸如胰管腺癌(PDAC)、30%至40%結腸癌及15%至20%肺癌(主要為非小細胞肺癌(NSCLC))中。其亦存在於膽道惡性病變、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝癌、骨髓性白血病及乳癌中。在由突變產生之胺基酸取代中，KRASG12C 突變更為頻繁且存在於約13%患有肺癌之人群(NSCLC中約40%)、3%患有結腸直腸癌之人群及1%至3%患有其他實性瘤之人群中。咸信KRASG12D 及KRASG12V 突變亞型驅動所有KRAS相關癌症中的約一半。在結腸直腸癌(CRC)中，KRASG12V 最為頻繁，繼之為KRASG12D 及KRASG13D 。胰管腺癌實際上攜帶KRASG12D 突變(約50%至80%)。
靶向療法之不同耐藥性機制之出現為現今癌症面臨的首要挑戰之一且限制KRAS抑制劑(KRASi)之長期功效。不同耐藥性機制可起因於治療前的既有突變，但愈來愈多的證據支持癌細胞之小型亞群可在選擇性藥物壓力下存活。此等存活細胞變為耐藥性存留細胞(Drug Tolerant Persister，DTP)，數週到數月幾乎沒有甚至沒有群體增長，因此提供潛在的具有「休眠」表型之腫瘤細胞庫。百分之二十的DTP經歷表型轉化以變為耐藥性擴增的存留細胞，其恢復其增殖且在患者之腫瘤再發的起源處獲得耐藥性之遺傳修飾(例如EGFR T790M)。癌症療法傳統地專注於消除快速生長之細胞群體，且在彼情況下，吾人面對一種新範式。存留細胞或耐藥性細胞(DTP)在靶向療法中之獲得性耐藥性機制之作用的首個證據由Sharma等人(Cell 2010, 141, 69-80)描述且進一步描述於若干公開案(Hata等人，Nat Med 2016, 22(3): 262-269. doi:10.1038/nm.4040.，Ramirez等人，Nat Comm 2016, DOI : 10.1038/ncomms10690，Guler等人，Can Cell 2017, 32, 221-237)中。此等工作證明，耐藥性機制可自來源於單個最近祖先細胞且在相同選擇性壓力下生長的存留細胞顯現。此異質性對『個人化』療法帶來相當大的臨床難題：即使針對一種DTP選擇有效療法，但不保證此藥物將對實際上可能尚未偵測到的其他DTP有效。存留細胞作為大量癌症群體之較小亞群，在臨床環境中難以研究，且臨床上不存在已通過此狀態之已知分子標記。然而，Hata等人提供證據表明臨床上相關耐藥性癌細胞可預先存在且自耐藥性細胞演變而來，且指出存留細胞為用於在臨床中預防或克服耐藥性之新治療機會的策略目標。
KRAS蛋白在人類癌症中起主要作用且多年來已認為係「不可成藥的」。儘管三十年來，進行了眾多關於靶向KRAS之療法的藥物發現研究，但目前尚未開發出KRAS抑制之臨床上可行的選擇方案。因此，需要新的治療方法來成功地解決癌細胞群體內之此等細胞及對療法具有耐藥性之癌細胞的出現。實際上，發現去除未能經歷細胞死亡之DTP庫，防止在轉變至DTEP期間出現突變之新方法對於治癒患者至關重要。
本發明之發明者首次鑑別出KRAS抑制劑與在用此KRAS抑制劑治療癌症期間存留癌細胞之出現相關。另外，本發明者進一步出人意料地鑑別出，DBait分子能夠抑制KRAS抑制劑之耐藥性之出現，且存留癌細胞，尤其對KRAS抑制劑具有耐藥性之存留癌細胞對DBait分子敏感(亦即DBait能夠以高效率導致其細胞死亡)。
本發明提供一種治療劑DBait，其用於與KRAS抑制劑組合治療癌症，特定言之以便預防或延遲對KRAS抑制劑之獲得性耐藥性之出現。實際上，DBait分子顯示對存留癌細胞之靶向作用，由此預防或延遲癌症復發及/或預防或延遲對KRAS抑制劑之獲得性耐藥性之出現。
因此，本發明係關於包含Dbait分子及蛋白KRAS抑制劑之醫藥組合物、組合或套組。更特定言之，醫藥組合物、組合或套組包含Dbait分子及靶向相同或不同的一或多種KRAS突變蛋白之一種或若干種KRAS抑制劑。
本發明亦係關於一種醫藥組合物、組合或套組，其包含Dbait分子及蛋白KRAS抑制劑，特定言之，靶向相同或不同的一或多種KRAS突變蛋白之一種或若干種KRAS抑制劑，其用於治療癌症。
本發明亦係關於一種Dbait分子，其用於與KRAS抑制劑組合治療癌症，特定言之，靶向相同或不同的一或多種KRAS突變蛋白之一種或若干種KRAS抑制劑；用於延遲及/或預防患者中對KRAS抑制劑(特定言之KRAS抑制劑)具有耐藥性之癌症的產生；或用於在治療癌症時針對癌症存留細胞，特定言之針對KRAS抑制劑之癌症存留細胞的靶向作用。
待治療之癌症為藉由KRAS突變，更特定言之KRAS-4B同功異型物突變驅動之癌症。特定言之，KRAS突變係KRASG12C 、KRASG12V 、KRASG12S 、KRASG12D 、KRASG13C 或KRASG13D 、KRASG12C 或KRASG12D 突變。在本發明之上下文中，KRAS突變較佳為KRASG12C 突變。
在一個態樣中，KRAS抑制劑為選自由特異性共價KRAS抑制劑及多價小分子泛KRAS抑制劑組成之群的直接KRAS抑制劑。
KRAS抑制劑可選自由以下組成之群：AMG-510/索妥昔布(sotorasib) (Amgen/Carmot Therapeutics)、MRTX-849/達格昔布(Adagrasib) (Mirati Therapeutics)、ARS-3248/JNJ-74699157 (Johnson & Johnson/Wellspring Biosciences)、化合物B (Sanofi/X-Chem Pharmaceuticals)、LY3499446 (Eli Lilly)、ARS-853、ARS-1620、及BI-2852、BI-1701963 (Boehringer Ingelheim)、mRNA-5671 (Moderna Therapeutics)、G12D抑制劑(Mirati)、RAS(On)抑制劑(Revolution medicines)及BBP-454 (BridgeBio Pharma)。
視情況而言，KRAS抑制劑為直接靶向及結合突變KRASG12C蛋白之KRASG12C抑制劑。
視情況而言，KRAS抑制劑使野生型KRAS蛋白保持原樣。
在一個態樣中，Dbait分子具有至少一個自由端及與人類基因體中之任何基因具有小於60%序列一致性之20-200 bp的DNA雙股部分。更特定言之，Dbait分子具有下式中之一者：
Figure 02_image001
(I)
Figure 02_image003
(II)
Figure 02_image005
(III) 其中N為去氧核苷酸，n為15至195之整數，帶下劃線之N係指具有或不具有經修飾之磷酸二酯主鏈之核苷酸，L'為連接子，C為選自親脂性分子或靶向細胞受體以實現受體介導的內吞作用之配體的促進內吞作用的分子，L為連接子，m及p獨立地為0或1之整數。
較佳地，Dbait分子具有下式：
Figure 02_image007
(II') 其中對於N、N 、n、L、L'、C及m之定義與式(I)、(II)及(III)相同。
在一極特定態樣中，Dbait分子具有下式：
Figure 02_image009
。
本發明進一步係關於根據本發明之醫藥組合物、組合或套組，其用於治療癌症。
本發明亦係關於如本文所定義之Dbait分子或包含其之醫藥組合物，其用於與KRAS抑制劑，特定言之如本文所定義之KRAS抑制劑組合治療癌症。
另外，本發明係關於如本文所定義之Dbait分子或包含其之醫藥組合物，用於延遲及/或預防患者中對KRAS抑制劑，特定言之如本文所定義之KRAS抑制劑具有耐藥性之癌症的發展。
在一個態樣中，癌症可選自由以下組成之群：頭頸癌、胰臟癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌、膽道癌、腎癌、卵巢癌、***癌、甲狀腺癌、食道癌、乳癌(特定言之TNBC)、膀胱癌、肺癌、肝癌、子宮體癌、子宮內膜癌、子宮頸癌或泌尿道癌、腹膜癌、多發性骨髓瘤、肉瘤、皮膚癌(黑色素瘤)，特定言之葡萄膜黑色素瘤、及造血癌，諸如白血病。
在一特定態樣中，癌症為對KRAS抑制劑具有耐藥性之癌症。
最終，本發明係關於如本文所定義之Dbait分子或包含其之醫藥組合物，其用於在治療癌症時針對癌症存留細胞，特定言之針對如本文所定義之KRAS抑制劑的癌症存留細胞之靶向作用。
本發明係關於Dbait分子強有力地減少來自存留癌細胞之增殖性細胞之出現的能力。
因此，本發明係關於包含Dbait分子及KRAS抑制劑之醫藥組合物、組合或套組(分裝部分之套組)，特定言之用於治療癌症。更特定言之，醫藥組合物、組合或套組包含Dbait分子及靶向相同或不同的一或多種KRAS之一種或若干種KRAS抑制劑。
本發明亦係關於一種包含Dbait分子及KRAS抑制劑之醫藥組合物，其用於治療癌症；係關於一種包含Dbait分子及KRAS抑制劑作為組合製劑以同時、分開或依序使用的組合或套組(分裝部分之套組)，特定言之用於治療癌症。本發明進一步係關於一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含投與治療有效量之Dbait分子及治療有效量之KRAS抑制劑，及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑。本發明係關於Dbait分子及KRAS抑制劑用於製造用以治療癌症之藥物的用途。本發明亦係關於根據本揭示案之醫藥組合物、組合或套組之用途，其係用於製造用以治療癌症之藥劑。
本發明係關於Dbait分子或包含Dbait分子之醫藥組合物，其用於與KRAS抑制劑組合治療癌症。更特定言之，本發明係關於Dbait分子或包含Dbait分子之醫藥組合物，其用於延遲及/或預防患者對KRAS抑制劑具有耐藥性之癌症的發展。本發明係關於用於延長患者之癌症治療中針對KRAS抑制劑之反應持續時間的Dbait分子。本發明亦係關於一種在患者中延遲及/或預防產生對KRAS抑制劑具有耐藥性之癌症及/或在患者之癌症治療中延長對KRAS抑制劑之反應持續時間的方法，該方法包含投與治療有效量之Dbait分子及治療有效量之KRAS抑制劑及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑。本發明係關於Dbait分子之用途，該分子係用於製造用以與KRAS抑制劑組合治療癌症之藥物，用於在患者中延遲及/或預防產生對KRAS抑制劑具有耐藥性之癌症及/或在患者之癌症治療中延長對KRAS抑制劑之反應持續時間。本發明係關於如本文所定義之Dbait分子或包含其之醫藥組合物的用途，其係用於製造用以與KRAS抑制劑組合治療癌症之藥劑。本發明係關於如本文所定義之Dbait分子或包含其之醫藥組合物之用途，其係用於製造用以延遲及/或預防患者中對KRAS抑制劑，特定言之如本文所定義之KRAS抑制劑具有耐藥性之癌症的發展的藥劑。
最後，更一般而言，本發明係關於用於藉由誘導存留細胞死亡來抑制或預防癌細胞自存留細胞增殖的Dbait分子，由此預防或延遲癌症復發及/或出現對癌症治療，尤其對KRAS抑制劑治療之獲得性耐藥性。另外，此針對癌症存留細胞之作用可允許達成對癌症治療之完全反應。實際上，Dbait分子將能夠消除癌症存留細胞。本發明亦係關於一種用於移除或減少癌症存留細胞群體及/或用於預防或延遲癌症復發及/或出現針對癌症治療，尤其針對KRAS抑制劑治療之獲得性耐藥性的方法，其包含投與治療有效量之Dbait分子，由此移除或減少癌症存留細胞群體。本發明係關於如本文所定義之Dbait分子或包含其之醫藥組合物之用途，其用於製造用以在癌症治療中針對癌症存留細胞，特定言之針對如本文所定義之KRAS抑制劑的癌症存留細胞之靶向作用的藥劑。Dbait治療將有益於靶向活的「存留」腫瘤細胞且因此可防止出現一或多種耐藥性純系，在用KRAS抑制劑組合治療之情況下尤其如此。
定義 如本文所使用之術語「套組(kit)」、「產品(product)」、「組合(combination)」或「組合製劑(combined preparation)」尤其定義「分裝部分之套組(kit-of-part)」，意義在於如上文所定義的組合搭配物可獨立地給藥或藉由使用與特別量之組合搭配物的不同固定組合(亦即同時或在不同的時間點)來給藥。分裝部分之套組之部分可隨後例如同時或按時間順序錯開投與，其在不同時間點且對於分裝部分之套組之任何部分具有相等或不同時間間隔。組合製劑中待投與之組合搭配物之總量的比率可變化。組合搭配物可藉由相同途徑或藉由不同途徑投與。
在本發明之上下文內，術語「治療」表示治癒性、症狀性、預防性治療以及維持治療。本發明之醫藥組合物、套組、產品及組合製劑可用於現在患有癌症或腫瘤之人類，包括癌症進展之早期或晚期階段。本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品及組合製劑將未必治癒患有癌症之患者，但將延遲或減緩疾病之進展或預防疾病之進一步進展，從而改善患者之病況。特定言之，本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品及組合製劑減少腫瘤之發展、減少腫瘤負荷、在哺乳動物宿主中產生腫瘤消退及/或預防癌轉移出現及癌症復發。根據本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品及組合製劑有利地預防、延遲存留腫瘤細胞及/或耐藥性擴增的存留細胞之出現或發展，減少或移除該等存留腫瘤細胞及/或耐藥性擴增的存留細胞。
「治療有效量」意指單獨或與醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑之其他活性成分組合以預防、移除或減少哺乳動物(包括人類)中之癌症之有害影響的本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑之所關注化合物的量。應理解，根據針對單獨使用或與其他治療組合使用之各化合物所定義的「治療有效量」，組合物中各化合物之投與劑量可低於本文所述之組合。熟習此項技術者根據患者、病理學、投與模式等將調適組合物之「治療有效量」。
每當在整個說明書中提及涉及本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑的術語「癌症之治療」或「治療癌症」及其類似術語時，其意謂：a)治療癌症之方法，該方法包含向需要此類治療之患者投與本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑；b)本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑用於治療癌症之用途；c)本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑用於製造用以治療癌症之藥劑的用途；及/或d)本發明之醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑，其用於治療癌症。
本文中涵蓋之醫藥組合物、套組、組合、產品或經組合製劑可包括醫藥學上可接受之載劑以及活性成分。術語「醫藥學上可接受之載劑」意謂涵蓋不干擾一或多種活性成分之生物活性之有效性且對其所投與之宿主無毒的任何載劑(例如載體、物質、溶劑等)。例如，對於非經腸投與，一或多種活性化合物可調配成用於在媒劑(諸如生理食鹽水、右旋糖溶液、血清白蛋白及林格氏溶液(Ringer's solution))中注射之單位劑型。
醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑可調配為於醫藥學上相容之溶劑中之溶液或調配為於適合之醫藥溶劑或媒劑中之乳液、懸浮液或分散液，或調配為以此項技術中已知之方式含有固體媒劑之丸劑、錠劑或膠囊。適用於經口投與之本發明調配物可呈離散單元形式，如膠囊、藥囊、錠劑或***錠，各含有預定量之一或多種活性成分；呈粉末或顆粒形式；呈於水性液體或非水性液體中之溶液或懸浮液形式；或呈水包油乳液或油包水乳液形式。適於非經腸投與之調配物宜包含活性成分之無菌油性或水性製劑，其較佳與接受者之血液等張。此類調配物每一者亦可含有其他醫藥學上相容且無毒性之輔助劑，諸如穩定劑、抗氧化劑、黏合劑、染料、乳化劑或調味劑物質。本發明之調配物包含活性成分以及因此醫藥學上可接受之載劑及視情況選用之其他治療成分。載劑在與調配物之其他成分相容且對其接受者無害的意義上必須為「可接受的」。醫藥組合物、套組、組合、產品或組合製劑有利地藉由注射或靜脈內輸注適合的無菌溶液或藉由消化道以口服劑量形式施用。安全且有效投與大部分此等治療劑之方法為熟習此項技術者所已知。另外，其投與描述於標準文獻中。
「KRAS」或「GTP酶KRas」係指在UniProt中以寄存編號P01116定義及在NCBI中以參考序列NP_203524.1定義之蛋白。
術語「KRAS抑制劑」或「K-RAS抑制劑」意謂抑制或降低一或多種KRAS蛋白(KRAS4A、K-RAS4B)及較佳一或多種突變KRAS蛋白(KRASG12C 、KRASG12V 、KRASG12S 、KRASG12D 、KRASG13C 、KRASG13D )之信號傳導路徑之活性或水準(例如量)的化合物。
藉由「存留細胞」、「存留癌細胞」、「耐藥性存留細胞」或「DTP」意欲係指在抗癌靶向療法治療，尤其用KRAS抑制劑治療時維持存活率之癌細胞的小型亞群。更特定言之，其係指在以比IC50高100倍之濃度使用KRAS抑制劑時，對高濃度KRAS抑制劑治療具有耐受性之癌細胞。此等細胞生長緩慢且幾乎靜止。
如本文所用，術語「耐藥性擴增的存留細胞(drug-tolerant expanded persister)」或「DTEP」係指能夠在高濃度之連續癌症藥物治療，特定言之用KRAS抑制劑治療下存活之癌細胞。
Dbait分子 如本文所用，術語「Dbait分子」亦稱為信號干擾DNA (siDNA)，係指經設計以抵抗DNA修復之核酸分子，較佳髮夾式核酸分子。Dbait分子具有至少一個自由端及與人類基因體中之任何基因具有小於60%序列一致性之20-200 bp的DNA雙股部分。
較佳地，用於本發明之結合或非結合之Dbait分子可藉由下式描述：
Figure 02_image001
(I)
Figure 02_image003
(II)
Figure 02_image012
(III) 其中N為去氧核苷酸，n為15至195之整數，帶下劃線之N係指具有或不具有經修飾之磷酸二酯主鏈之核苷酸，L'為連接子，C為選自親脂性分子及靶向細胞受體以實現受體介導的內吞作用之配體的促進內吞作用的分子，L為連接子，m及p獨立地為0或1之整數。
在較佳實施例中，式(I)、(II)或(III)之Dbait分子具有一個或若干個以下特徵： -  N為去氧核苷酸，其較佳選自由A (腺嘌呤)、C (胞嘧啶)、T (胸腺嘧啶)及G (鳥嘌呤)組成之群，且經選擇以避免出現CpG二核苷酸且與人類基因體中之任何基因具有小於80%或70%，甚至小於60%或50%序列一致性；及/或 -  n為15至195、19至95、21至95、27至95、15至45、19至45、21至45或27至45之整數；較佳地，n為27；及/或 - 帶下劃線之N係指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯主鏈的核苷酸，更佳為硫代磷酸酯主鏈；帶下劃線之N較佳地係指具有經修飾之磷酸二酯主鏈的核苷酸；及/或 - 連接子L'係選自由以下組成之群：六乙二醇、四去氧胸苷酸(T4)、1,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-2-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷；及2,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-1-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷；及/或 - m為1且L為甲醯胺基聚乙二醇，更佳為甲醯胺基三乙二醇或甲醯胺基四乙二醇；及/或 - C係選自由以下組成之群：膽固醇；單鏈或雙鏈脂肪酸，諸如十八烷基、油酸、二油醯基或硬脂酸；或配體(包括肽、蛋白、適體)，其靶向細胞受體，諸如葉酸、生育酚、糖(諸如半乳糖及甘露糖及其寡醣)、肽(諸如RGD及鈴蟾肽)及蛋白(諸如轉運蛋白及整合素)，較佳為膽固醇或生育酚，仍更佳為膽固醇。
較佳地，C-Lm為三乙二醇連接子(10-O-[1-丙基-3-N-胺甲醯基膽固醇基]-三乙二醇自由基。或者，C-Lm為四乙二醇連接子(13-O-[1-丙基-3-N-胺甲醯基膽固醇基]-四乙二醇自由基。
在一較佳實施例中，Dbait分子具有下式：
Figure 02_image007
(II') 其中對於N、N 、n、L、L'、C及m之定義與式(I)、(II)及(III)相同。
在一特定實施例中，Dbait分子為PCT專利申請案WO2005/040378、WO2008/034866、WO2008/084087及WO2011/161075中廣泛描述之分子，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
Dbait分子可由其治療活性所需之多種特徵定義，諸如其最小長度、至少一個自由端的存在及雙股部分、較佳DNA雙股部分的存在。如下文將論述，值得注意的係，Dbait分子之精確核苷酸序列不會影響其活性。此外，Dbait分子可含有經修飾及/或非天然主鏈。
較佳地，Dbait分子為非人類來源(亦即，其核苷酸序列及/或構形(例如，髮夾式)於人類細胞中不存在)，最佳為合成來源。由於Dbait分子之序列幾乎沒有(若存在)作用，所以Dbait分子較佳與已知基因、啟動子、強化子、5'-或3'-上游序列、外顯子、內含子及其類似物不具有顯著程度的序列同源性或一致性。換言之，Dbait分子與人類基因體中之任何基因具有小於80%或70%，甚至小於60%或50%序列一致性。測定序列一致性之方法為此項技術中所熟知且包括例如Blast。Dbait分子在嚴格條件下不與人類基因體DNA雜交。典型嚴格條件為使得其允許區別完全互補核酸與部分互補核酸。
另外，Dbait分子之序列較佳不含CpG以便避免熟知鐸樣受體介導之免疫反應。
Dbait分子之長度可為可變的，只要其足以允許適當結合包含Ku及DNA-PKcs蛋白之Ku蛋白複合物即可。已顯示，Dbait分子之長度必須大於20 bp，較佳為約32 bp，以確保與此類Ku複合物結合且允許DNA-PKcs活化。較佳地，Dbait分子包含20-200 bp、更佳24-100 bp、仍更佳26-100 bp且最佳24-200 bp、25-200 bp、26-200 bp、27-200 bp、28-200 bp、30-200 bp、32-200 bp、24-100 bp、25-100 bp、26-100 bp、27-100 bp、28-100 bp、30-100 bp、32-200 bp或32-100 bp之間。例如，Dbait分子包含24-160 bp、26-150 bp、28-140 bp、28-200 bp、30-120 bp、32-200 bp或32-100 bp之間。「bp」意欲分子包含指定長度之雙股部分。
在一特定實施例中，具有至少32 pb或約32 bp之雙股部分的Dbait分子包含與Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)相同的核苷酸序列。視情況而言，Dbait分子具有與Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)相同的核苷酸組成，但其核苷酸序列不同。隨後，Dbait分子包含具有3 A、6 C、12 G及11 T之雙股部分之一股。較佳地，Dbait分子之序列不含有任何CpG二核苷酸。
或者，雙股部分包含Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)之至少16、18、20、22、24、26、28、30或32個連續核苷酸。在一更特定實施例中，雙股部分由Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)之20、22、24、26、28、30或32個連續核苷酸組成。
如本文所揭示之Dbait分子必須具有至少一個自由端，呈雙股斷裂(DSB)之模擬物。該自由端可為自由鈍端或5'-/3'-突出端。「自由端」在本文中係指具有5'端及3'端或具有3'端或5'端的核酸分子，尤其雙股核酸部分。視情況而言，5'端及3'端中之一者可用於結合核酸分子或可連接至封端基團，例如一個或3'-3'核苷酸鍵聯。
在一特定實施例中，其僅含有一個自由端。較佳地，Dbait分子由具有雙股DNA主幹及環之髮夾式核酸製成。該環可為核酸或熟習此項技術者已知之其他化學基團或其混合物。核苷酸連接子可包括2至10個核苷酸，較佳3、4或5個核苷酸。非核苷酸連接子非窮盡性地包括無鹼基核苷酸、聚醚、多元胺、聚醯胺、肽、碳水化合物、脂質、聚烴或其他聚合化合物(例如，寡聚乙二醇，諸如具有2至10個乙二醇單元，較佳3、4、5、6、7或8個乙二醇單元之寡聚乙二醇)。較佳連接子係選自由以下組成之群：六乙二醇、四去氧胸苷酸(T4)及其他連接子，諸如1,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-2-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷及2,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-1-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷。因此，在一特定實施例中，Dbait分子可為髮夾式分子，該髮夾式分子具有雙股部分或主幹包含Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)之至少16、18、20、22、24、26、28、30或32個連續核苷酸且環為六乙二醇連接子、四去氧胸苷酸連接子(T4)、1,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-2-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷及2,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-1-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷。在一更特定實施例中，彼等Dbait分子可具有由Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)之20、22、24、26、28、30或32個連續核苷酸組成的雙股部分。
Dbait分子較佳包含2'-去氧核苷酸主鏈，且視情況包含一個或若干個(2、3、4、5或6個)經修飾之核苷酸及/或除腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶外之核鹼基。因此，Dbait分子基本上為DNA結構。特定言之，Dbait分子之雙股部分或主幹由去氧核糖核苷酸製成。
較佳Dbait分子在一股或各股之末端包含一個或若干個經化學修飾之核苷酸或基團，尤其以便保護其免於降解。在一特定較佳實施例中，Dbait分子之一或多個自由端在一股或各股之末端處藉由一個、兩個或三個經修飾磷酸二酯主鏈保護。較佳化學基團，尤其經修飾之磷酸二酯主鏈包含硫代磷酸酯。或者，較佳Dbait具有3'-3'核苷酸鍵聯或具有甲基膦酸酯主鏈之核苷酸。其他經修飾之主鏈在此項技術中是熟知的且包含胺基磷酸酯、嗎啉代核酸、2'-0,4'-C伸甲基/伸乙基橋聯鎖定核酸、肽核酸(PNA)及短鏈烷基，或具有可變長度之環烷基糖間鍵聯或短鏈雜原子或雜環糖間鍵聯，或熟習此項技術者已知之任何經修飾之核苷酸。在第一較佳實施例中，Dbait分子具有一或多個自由端，該一或多個自由端在一股或各股之末端處藉由一個、兩個或三個經修飾磷酸二酯主鏈保護，更佳至少在3'端處，但仍更佳在5'端及3'端處藉由三個經修飾磷酸二酯主鏈(特定言之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯)保護。
在一最佳實施例中，Dbait分子可為髮夾式核酸分子，該髮夾式核酸分子包含32 bp的DNA雙股部分或主幹(例如選自由SEQ ID No: 1-5組成之群，特定言之SEQ ID No: 4的序列)及連接DNA雙股部分之兩股或主幹的環，該環包含選自由以下組成之群的連接子或由其組成：六乙二醇、四去氧胸苷酸(T4)及1,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-2-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷及2,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-1-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷，該DNA雙股部分或主幹之自由端(亦即，與環相對)具有三個經修飾之磷酸二酯主鏈(特定言之硫代磷酸酯核苷酸間鏈)。
該等核酸分子藉由化學合成、半生物合成或生物合成、任何擴增方法，繼之以任何提取及製備方法及任何化學修飾製得。提供連接子以便可由標準核酸化學合成併入。更佳地，核酸分子藉由經特別設計之彙集合成製備：藉由標準核酸化學合成且併入適當連接子前驅體來製備兩個互補股，在其純化之後，將其共價偶合在一起。
視情況而言，核酸分子可與促進內吞作用或細胞攝取之分子結合。
特定言之，促進內吞作用或細胞攝取之分子可為親脂性分子，諸如膽固醇、單鏈或雙鏈脂肪酸，或為靶向細胞受體以實現受體介導的內吞作用之配體，諸如葉酸及葉酸酯衍生物或運鐵蛋白(Goldstein等人，Ann. Rev. Cell Biol. 1985 1:1-39；Leamon & Lowe, Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88: 5572-5576.)。分子亦可為生育酚、糖(諸如半乳糖及甘露糖及其寡醣)、肽(諸如RGD及鈴蟾肽)及蛋白質(諸如整合素)。脂肪酸可為飽和或不飽和的且在C4 -C28 中，較佳在C14 -C22 中，仍更佳在C18 (諸如油酸或硬脂酸)中。特定言之，脂肪酸可為十八烷基或二油醯基。脂肪酸可發現為與適當連接子(諸如甘油、磷脂醯膽鹼或乙醇胺及其類似物)連接或藉由用於連接在Dbait分子上之連接子連接在一起的雙鏈形式。如本文所用，術語「葉酸酯」意欲指葉酸酯及葉酸酯衍生物，包括喋酸衍生物及類似物。適用於本發明之葉酸之類似物及衍生物包括(但不限於)抗葉酸劑、二氫葉酸酯、四氫葉酸酯、醛葉酸、喋醯聚麩胺酸、1-去氮、3-去氮、5-去氮、8-去氮、10-去氮、1,5-去氮、5,10-二去氮、8,10-二去氮及5,8二去氮葉酸酯、抗葉酸劑及喋酸衍生物。其他葉酸酯類似物描述於US2004/242582中。因此，促進內吞作用之分子可選自由以下組成之群：單鏈或雙鏈脂肪酸、葉酸酯及膽固醇。更佳地，促進內吞作用之分子選自由以下組成之群：二油醯基、十八烷基、葉酸及膽固醇。在一最佳實施例中，核酸分子與膽固醇結合。
促進內吞作用之Dbait分子可較佳經由連接子與促進內吞作用之分子結合。此項技術中已知之任何連接子可用於將促進內吞作用的分子連接至Dbait分子。例如，WO09/126933在第38-45頁提供方便連接子之廣泛綜述。連接子可為非窮盡的脂肪族鏈、聚醚、多元胺、聚醯胺、肽、碳水化合物、脂質、聚烴或其他聚合化合物(例如寡聚乙二醇，諸如具有2至10個乙二醇單元，較佳3、4、5、6、7或8個乙二醇單元，仍更佳3個乙二醇單元)以及併入可藉由化學或酶促方式分解之任何鍵，諸如二硫鍵、經保護之二硫鍵聯，酸不穩定鍵聯(例如腙鍵聯)、酯鍵聯、原酸酯鍵聯、膦醯胺鍵聯、生物可裂解肽鍵聯、偶氮鍵聯或醛鍵聯。此類可裂解連接子詳述於WO2007/040469第12-14頁，WO2008/022309第22-28頁中。
在一特定實施例中，核酸分子可連接至一個促進內吞作用之分子。或者，促進內吞作用之若干個分子(例如兩個、三個或四個)可連接至一個核酸分子。
在一特定實施例中，促進內吞作用之分子，特定言之膽固醇與核酸分子之間的連接子為CO-NH-CH2 -(CH2 -CH2 -O)n ，其中n為1至10之整數，較佳n係選自由3、4、5及6組成之群。在一極特定實施例中，連接子為CO-NH-CH2 -(CH2 -CH2 -O)4 (甲醯胺基四乙二醇)或CO-NH-CH2 -(CH2 -CH2 -O)3 (甲醯胺基三乙二醇)。連接子可在不改變核酸分子之活性的任何便利位置連接至核酸分子。特定言之，連接子可在5'端處連接。因此，在一較佳實施例中，所涵蓋之結合之Dbait分子為具有髮夾式結構且較佳地經由連接子在其5'端處結合至促進內吞作用之分子的Dbait分子。
在另一特定實施例中，促進內吞作用之分子，特定言之膽固醇與核酸分子之間的連接子為二烷基-二硫鍵{例如(CH2 )r -S-S-(CH2 )s ，其中r及s為1至10之整數，較佳為3至8，例如6}。
在一最佳實施例中，經結合之Dbait分子為髮夾式核酸分子，該髮夾式核酸分子包含32 bp的DNA雙股部分或主幹及連接DNA雙股部分之兩股或主幹的環，該環包含選自由以下組成之群的連接子或由其組成：六乙二醇、四去氧胸苷酸(T4)、1,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-2-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷及2,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-1-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷，該DNA雙股部分或主幹之自由端(亦即，與環相對)具有三個經修飾之磷酸二酯主鏈(特定言之硫代磷酸酯核苷酸間鏈)且該Dbait分子經由連接子(例如甲醯胺基寡聚乙二醇，較佳甲醯胺基三乙二醇或甲醯胺基四乙二醇)在其5'端處結合至膽固醇。
在一特定實施例中，Dbait分子可為經結合之Dbait分子，諸如PCT專利申請案WO2011/161075中充分描述之彼等分子，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一較佳實施例中，NNN N-(N)n -N包含Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)之至少6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32個連續核苷酸或由Dbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc或Dbait32Hd之20、22、24、26、28、30或32個連續核苷酸組成。在一特定實施例中，NNN N-(N)n -N包含以下或由以下組成：Dbait32 (SEQ ID NO: 1)、Dbait32Ha (SEQ ID NO: 2)、Dbait32Hb (SEQ ID NO: 3)、Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)或Dbait32Hd (SEQ ID NO: 5)，更佳Dbait32Hc (SEQ ID NO: 4)。
因此，經結合之Dbait分子可選自由以下組成之群： 其中NNN N-(N)n -N為SEQ ID NO: 1； 其中NNN N-(N)n -N為SEQ ID NO: 2； 其中NNN N-(N)n -N為SEQ ID NO: 3； 其中NNN N-(N)n -N為SEQ ID NO: 4；或 其中NNN N-(N)n -N為SEQ ID NO: 5。
在一個較佳實施例中，Dbait分子具有下式：
Figure 02_image007
(II'), 其中 -NNN N-(N)n -N包含28、30或32個核苷酸，較佳32個核苷酸；及/或 - 帶下劃線之核苷酸係指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯主鏈的核苷酸，更佳為硫代磷酸酯主鏈；較佳地帶下劃線之核苷酸係指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯主鏈的核苷酸，更佳地為硫代磷酸酯主鏈；及/或 - 連接子L'係選自由以下組成之群：六乙二醇、四去氧胸苷酸(T4)、1,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-2-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷或2,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-1-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷；及/或 - m為1且L為甲醯胺基聚乙二醇，更佳為甲醯胺基三乙二醇或甲醯胺基四乙二醇；及/或 - C選自由以下組成之群：膽固醇；單鏈或雙鏈脂肪酸，諸如十八烷基、油酸、二油醯基或硬脂酸；或配體(包括肽、蛋白、適體)，其靶向細胞受體，諸如葉酸、生育酚、糖(諸如半乳糖及甘露糖及其寡醣)、肽(諸如RGD及鈴蟾肽)及蛋白質(諸如轉運蛋白及整合素)，較佳為膽固醇。
在一極特定實施例中，Dbait分子(在本文中亦稱為AsiDNA)具有下式：
Figure 02_image015
(IIa) (SEQ ID NO: 6) 其中C為膽固醇基，Lm為甲醯胺基四乙二醇，且L'為1,19-雙(二氧磷基)-8-肼雜-2-羥基-4-氧雜-9-側氧基-十九烷；亦由下式表示：
Figure 02_image009
「s」係指兩個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵。
KRAS抑制劑 本發明之KRAS抑制劑為用於治療癌症之KRAS抑制劑，較佳為由KRAS突變驅動之癌症。特定言之，KRAS突變係選自KRASG12C 、KRASG12V 、KRASG12S 、KRASG12D 、KRASG13C 或KRASG13D 、KRASG12C 或KRASG12D 突變。在本發明之上下文中，KRAS突變較佳為KRASG12C 突變。
在一特定態樣中，已知KRAS抑制劑與癌症治療期間之獲得性耐藥性相關。在一極特定態樣中，本發明之發明者首次鑑別出KRAS抑制劑與在用此KRAS抑制劑治療癌症期間存留癌細胞之出現相關。
KRAS抑制劑直接地或間接地抑制突變KRAS蛋白。KRAS抑制劑抑制、防止或減少一或多種KRAS蛋白及較佳突變KRAS蛋白之信號傳導路徑之活性或水準(例如量)。
在一個態樣中，KRAS抑制劑例如藉由共價靶向且結合突變KRAS來直接靶向突變KRAS。在另一態樣中，KRAS抑制劑間接靶向突變體KRAS，針對KRAS活化所需的關鍵步驟起作用，此係例如藉由靶向及抑制KRAS與膜結合所需之相關蛋白之相互作用，藉由抑制KRAS驅動之惡性表型及或經由KRAS合成致死相互作用。
KRAS抑制劑可靶向相同KRAS突變蛋白(例如KRAS抑制劑僅靶向KRASG12C 突變蛋白)或不同KRAS突變蛋白(例如KRAS抑制劑靶向若干KRASG12C 、KRASG12D 及KRASG13C 突變蛋白)。
在一個較佳態樣中，KRAS抑制劑為選擇性靶向一個或若干個突變蛋白且使野生型KRAS蛋白保持原樣的KRAS抑制劑。
在一較佳態樣中，KRAS抑制劑為選自由特異性共價KRAS抑制劑(形成不可逆共價鍵之親電子KRAS抑制劑)及多價小分子泛KRAS抑制劑組成之群的直接KRAS抑制劑。
在一個較佳態樣中，直接KRAS抑制劑為直接靶向且結合突變KRAS蛋白之KRAS抑制劑，其選自由以下組成之群：AMG-510/索妥昔布(Amgen/Carmot Therapeutics，CAS編號2252403-56-6，4-((S)-4-丙烯醯基-2-甲基哌嗪-1-基)-6-氟-7-(2-氟-6-羥基苯基)-1-(2-異丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮)、MRTX-849/達格昔布(Mirati Therapeutics，CAS編號2326521-71-3，2-((S)-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)甲氧基)-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌嗪-2-基)乙腈)、ARS-3248/JNJ-74699157 (Johnson & Johnson/Wellspring Biosciences)、化合物B (Sanofi/X-Chem Pharmaceuticals)、LY3499446 (Eli Lilly)、ARS-853、ARS-1620、BI-2852、BI-1701963 (Boehringer Ingelheim)、mRNA-5671 (Moderna Therapeutics)、G12D抑制劑(Mirati)、RAS(On)抑制劑(Revolution medicines)及BBP-454 (BridgeBio Pharma)。在一個較佳態樣中，直接KRAS抑制劑為直接靶向且結合突變KRASG12C 且與Cys-12 (在KRAS中位置12處具有G12C突變之胺基酸為半胱胺酸而非甘胺酸)之親核硫原子形成不可逆共價鍵的KRASG12C 抑制劑。
在一特定實施例中，KRASG12C 抑制劑選擇性地靶向突變KRAS蛋白且使野生型KRAS保持原樣。
直接KRAS抑制劑為小有機分子。術語不包括生物大分子(例如蛋白質、核酸等)。較佳的小有機分子之尺寸範圍為至多2000 Da，且最佳至多約1000 Da。
KRAS抑制劑之實例可見於以下專利申請案之非窮盡性清單中：WO2017058805、WO2016172692、WO2015054572、WO2017058902、WO2017058728、WO2017058807、WO2016172187、WO2018011351、WO2016164675、WO2018119183、WO2016049524、WO2017058792、WO2016168540、WO2014152588、WO2017015562、WO2018064510、WO2017172979、WO2019110751、WO2018140514、WO2019055540、WO2018068017、WO2018206539、WO2018195439、WO2015179434、WO2016179558、WO2018140600，其揭示內容以引用的方式併入本文中；或見於以下綜述中，其揭示內容以引用的方式併入本文中：Nagasaka等人, Cancer Treat Rev. 2020年3月;84:10197；Khan等人, Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2020年2月;1867(2):118570；Liu等人, Acta Pharm Sin B. 2019年9月;9(5):871-879；Wu等人, Curr Top Med Chem. 2019;19(23):2081-2097。
在本發明之另一態樣中，針對KRAS驅動之癌症的間接KRAS治療策略可與根據本發明之Dbait組合使用。
在一個態樣中，間接KRAS療法可選自靶向KRAS信號傳導路徑，例如靶向涉及膜結合之KRAS的KRAS療法，例如法呢基轉移酶抑制劑(FTI)、香葉基香葉基轉移酶抑制劑(GGTI)、異戊二烯基結合蛋白(PDEδ)抑制劑，諸如Deltarasin或Deltazinone 1，其干擾PDEδ與KRAS之結合且損害KRAS在內膜的定位；或利用KRAS調節之代謝路徑，例如藉由抑制甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)的KRAS療法；或SHP2致死性方法(與KRAS致癌基因的合成致死相互作用物)，其靶向包括KRASG12C 在內的各種突變，例如SHP099或RMC-4550；或抗KRAS免疫療法，例如抗體(中和單株抗體)、涉及FBP1靶向之基於NK細胞的癌症免疫療法，或工程化T細胞受體(例如抗KRASG12D工程化T細胞受體)；或mRNA KRAS疫苗策略。
其他療法 視情況而言，用如本文所揭示之核酸分子及KRAS抑制劑治療可與放射療法、放射性同位素療法及/或另一抗腫瘤化學療法、免疫療法或激素療法組合使用。較佳地，抗腫瘤化學療法係藉由DNA損傷抗腫瘤劑直接地或間接地進行之治療。
如本文所用，術語「抗腫瘤化學療法」或「化學療法」係指使用化學物質或生物化學物質，特定言之使用一種或若干種抗腫瘤劑進行之癌症治療性治療。特定言之，其亦包括激素療法及免疫療法。術語「激素療法」係指目的為阻斷、添加或移除激素之癌症治療。例如，在乳癌中，女性激素***及孕酮可促進一些乳癌細胞生長。因此，在此等患者中，給予激素療法以阻斷***且通常使用之非窮盡性藥物清單包括：他莫昔芬(Tamoxifen)、法樂通(Fareston)、安美達錠(Arimidex)、阿諾新(Aromasin)、復乳納(Femara)、諾雷德(Zoladex)/亮丙瑞林(Lupron)、美加西(Megace)及氟羥甲睪酮(Halotestin)。術語「免疫療法」係指一種使用免疫系統排斥癌症之癌症治療性治療。治療性治療刺激患者之免疫系統去攻擊惡性腫瘤細胞。
在一特定態樣中，如本文所揭示之核酸分子及KRAS抑制劑與DNA損傷治療組合使用。DNA損傷治療可為放射療法或使用DNA損傷抗腫瘤劑之化學療法，或其組合。DNA損傷治療係指誘導DNA股斷裂，較佳在癌細胞中相對特異性地誘導DNA股斷裂之治療。
DNA股斷裂可藉由電離輻射(放射療法)達成。放射療法包括(但不限於)γ射線、X射線及/或將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞。其他放射療法包括微波及UV照射。放射療法之其他方法亦涵蓋於本發明中。
DNA股斷裂可藉由放射性同位素療法，特定言之藉由投與放射性同位素，較佳靶向放射性同位素來達成。靶向可歸因於同位素之化學特性，諸如放射性碘，該放射性碘由甲狀腺特異性地吸收，吸收量比其他身體器官高一千倍。或者，靶向可藉由向放射性同位素連接具有靶向特性之另一分子(諸如半抗原或抗體)來達成。可使用多種合適放射性同位素中之任一者，其包括(但不限於)銦-111、鎦-171、鉍-212、鉍-213、砈-211、銅-62、銅-64、銅-67、釔-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、鈧-47、銀-111、鎵-67、鐠-142、釤-153、鋱-161、鏑-166、鈥-166、錸-186、錸-188、錸-189、鉛-212、鐳-223、錒-225、鐵-59、硒-75、砷-77、鍶-89、鉬-99、銠-105、鈀-109、鐠-143、钜-149、鉺-169、銥-194、金-198、金-199及鉛-211。
DNA損傷抗腫瘤劑較佳選自由以下組成之群：拓樸異構酶I或II之抑制劑、DNA交聯劑、DNA烷基化劑、抗代謝劑及有絲***紡錘體之抑制劑。
拓樸異構酶I及/或II之抑制劑包括(但不限於)依託泊苷(etoposide)、拓朴替康(topotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)、安吖啶(amsacrine)、茚托利辛(intoplicine)、蒽環黴素(anthracyclines)，諸如阿黴素(doxorubicine)、表阿黴素(epirubicine)、柔紅黴素(daunorubicine)、伊達比星(idanrubicine)及米托蒽醌(mitoxantrone)。拓樸異構酶I及II之抑制劑包括但不限於茚托利辛(intoplecin)。
DNA交聯劑包括(但不限於)順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin)。
抗代謝劑阻斷負責核酸合成之酶或變為併入至DNA中，此產生不正確基因密碼且導致細胞凋亡。其非窮盡性實例包括(但不限於)葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷去胺酶抑制劑，且更特定言之甲胺喋呤(Methotrexate)、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱(Fludarabine phosphate)、噴司他丁(Pentostatine)、5-氟尿嘧啶、吉西他濱(Gemcitabine)及卡培他濱(capecitabine)。
DNA損傷抗腫瘤劑可為烷基化劑，包括(但不限於)氮芥、伸乙亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲、金屬鹽及三氮烯。其非窮盡性實例包括尿嘧啶氮芥、氮芥、環磷醯胺(CYTOXAN(R))、異環磷醯胺、美法侖(Melphalan)、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基硫代磷胺、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、福莫司汀(Fotemustine)、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、噻替派(thiotepa)、鏈脲黴素(Streptozocin)、達卡巴嗪(Dacarbazine)及替莫唑胺(Temozolomide)。
有絲***紡錘體之抑制劑包括(但不限於)紫杉醇、多西他賽(docetaxel)、長春瑞濱(vinorelbine)、拉洛他賽(larotaxel) (亦稱為XRP9881；Sanofi-Aventis)、XRP6258 (Sanofi-Aventis)、BMS-184476 (Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-188797 (Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-275183 (Bristol-Meyer-Squibb)、奧他賽(ortataxel) (亦稱為IDN 5109，BAY 59-8862或SB-T-101131；Bristol-Meyer-Squibb)、RPR 109881A (Bristol-Meyer-Squibb)、RPR 116258 (Bristol-Meyer-Squibb)、NBT-287 (TAPESTRY)、PG-紫杉醇(亦稱為CT-2103、PPX、聚麩胺酸紫杉醇、聚麩胺酸鹽紫杉醇或XyotaxTM)、ABRAXANE® (亦稱為白蛋白結合型紫杉醇(Nab-Paclitaxel)；ABRAXIS BIOSCIENCE)、替司他賽(Tesetaxel) (亦稱為DJ-927)、IDN 5390 (INDENA)、他克普辛(Taxoprexin) (亦稱為二十二碳六烯酸紫杉醇；PROTARGA)、DHA-紫杉醇(亦稱為Taxoprexin® )及MAC-321 (WYETH)。亦參見Hennenfent & Govindan之綜述(2006, Annals of Oncology, 17, 735-749)。
視情況而言，針對KRAS驅動之癌症的間接KRAS治療策略可與直接KRAS抑制劑及根據本發明之Dbait的使用組合使用。
其他KRAS療法或KRAS信號傳導療法可靶向藉由根據本發明之Dbait及KRAS抑制劑靶向之相同KRAS突變體路徑。或者，其他KRAS療法或KRAS信號傳導療法可靶向藉由根據本發明之Dbait及KRAS抑制劑靶向的不同KRAS突變體路徑。
待治療之癌症或腫瘤 術語「癌症」、「癌性」或「惡性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調控之細胞生長為特徵之生理病況。癌症之實例包括例如白血病、淋巴瘤、母細胞瘤、癌瘤及肉瘤。
本發明之範疇亦涵蓋各種癌症，包括(但不限於)以下：癌瘤，其包括膀胱癌(包括加速性及轉移性膀胱癌)、乳癌、結腸癌(包括結腸直腸癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細胞及非小細胞肺癌以及肺腺癌)、卵巢癌、***癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、泌尿道癌、淋巴系統癌、直腸癌、喉癌、胰臟癌(包括外分泌性胰臟癌)、食道癌、胃癌、膽囊癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌(包括鱗狀細胞癌)；淋巴系造血腫瘤，其包括白血病、急性淋巴細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤(包括皮膚或外周T細胞淋巴瘤)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤、組織細胞性淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓系造血腫瘤，其包括急性及慢性骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群、骨髓性白血病及前髓細胞性白血病；中樞及周邊神經系統腫瘤，其包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；間質來源之腫瘤，其包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；其他腫瘤，其包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎瘤；黑色素瘤，不可切除性III期或IV期惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、膽道癌、子宮內膜癌、子宮癌、腹膜癌、腎癌、***癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、多形性膠質母細胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌及頭頸癌、視網膜母細胞瘤、胃癌、生殖細胞瘤、骨癌、骨腫瘤、成人型惡性骨纖維組織細胞瘤；兒童型惡性骨纖維組織細胞瘤、肉瘤、小兒肉瘤；骨髓發育不良症候群；神經母細胞瘤；睾丸生殖細胞瘤、眼內黑色素瘤、骨髓發育不良症候群；骨髓發育不良/骨髓增生性疾病、滑膜肉瘤。
在一個態樣中，癌症可選自由以下組成之群：肺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、黑色素瘤及頭頸癌、腎癌、卵巢癌、胰臟癌、***癌、甲狀腺癌、肺癌、食道癌、乳癌、膽道惡性疾病、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腦癌、結腸直腸癌、肝癌及子宮頸癌。
在一特定態樣中，癌症選自由以下組成之群：肺癌，特定言之非小細胞肺癌(NSCLC)、白血病，特定言之急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病、淋巴瘤，特定言之外周T細胞淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、頭頸部鱗狀細胞癌、晚期黑色素瘤伴BRAF突變、結腸直腸癌、胃腸基質瘤、乳癌，特定言之HER2+ 乳癌、甲狀腺癌，特定言之晚期甲狀腺髓樣癌、腎癌，特定言之腎細胞癌、***癌、神經膠質瘤、胰臟癌，特定言之胰臟神經內分泌癌或胰臟導管腺肉芽腫(PDAC)、結腸癌、膽道惡性疾病、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌及肝癌，特定言之肝細胞癌。
在一個態樣中，癌症藉由KRAS突變、特定言之KRAS-4B同功異型物突變驅動。突變係選自KRASG12C 、KRASG12V 、KRASG12S 、KRASG12D 、KRASG13C 或KRASG13D 。在一更特定態樣中，突變係KRASG12C 或KRASG12D 突變。
例如，癌症可為肉瘤及骨肉瘤，諸如卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcome)、AIDS相關之卡波西氏肉瘤、黑色素瘤，特定言之葡萄膜黑色素瘤，以及頭頸癌、腎癌、卵巢癌、胰臟癌、***癌、甲狀腺癌、肺癌、食道癌、乳癌(特定言之TNBC)、膀胱癌、小腸癌、結腸直腸癌、肝癌、膽道癌、子宮癌、闌尾癌、及子宮頸癌、睪丸癌、胃腸道癌、泌尿道癌及子宮內膜癌及腹膜癌。
較佳地，癌症可為胰臟癌、胃癌、結腸癌、小腸癌、膽道癌、肺癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、泌尿道癌、多發性骨髓瘤、肉瘤、皮膚癌(黑色素瘤)，特定言之葡萄膜黑色素瘤，及頭頸癌、腎癌、卵巢癌、胰臟癌、***癌、甲狀腺癌、肺癌、食道癌、乳癌(特定言之TNBC)、膀胱癌、結腸直腸癌、肝癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮內膜癌及腹膜癌。
癌症可為癌瘤或腺癌，諸如肺腺癌、結腸腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及結腸直腸腺癌、直腸癌瘤、胰管腺癌及乳腺浸潤性導管癌。
在本發明之一較佳實施例中，癌症係實性瘤。在一個態樣中，當KRAS抑制劑選自由以下組成之群時：AMG-510/索妥昔布(Amgen)、MRTX-849/達格昔布(Mirati Therapeutics)、ARS-3248/JNJ-74699157 (Johnson & Johnson/Wellspring Biosciences)、化合物B (Sanofi/X-Chem Pharmaceuticals)、LY3499446 (Eli Lilly)、ARS-853、ARS-1620、BI-2852、BI-1701963 (Boehringer Ingelheim)、mRNA-5671 (Moderna Therapeutics)、G12D抑制劑(Mirati)、RAS(On)抑制劑(Revolution medicines)或BBP-454 (BridgeBio Pharma)，且待治療之癌症係由KRASG12C 突變驅動。
例如，當突變為KRASG12C 時，待治療之癌症較佳選自肺癌及肺腺癌，特定言之非小細胞肺癌、結腸直腸癌及結腸腺癌，特定言之轉移性或晚期結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌，特定言之早期乳癌及TNBC、甲狀腺癌，特定言之髓質甲狀腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌及神經膠質瘤。
例如，當突變為KRASG12V 時，待治療之癌症較佳選自胰臟腺癌、肺腺癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌及直腸腺癌。
例如，當突變為KRASG12S 時，待治療之癌症較佳選自結腸腺癌、肺腺癌、結腸直腸腺癌、直腸腺癌及乳腺浸潤性導管癌。
例如，當突變為KRASG12D 時，待治療之癌症較佳選自胰臟腺癌、結腸腺癌、肺腺癌、結腸直腸腺癌及直腸腺癌。
例如，當突變係KRASG13C 時，待治療之癌症較佳選自肺腺癌及結腸腺癌。
例如，當突變為KRASG13D 時，待治療之癌症較佳選自結腸腺癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌、直腸腺癌及子宮內膜腺癌。
在一個態樣中，當KRAS抑制劑係選自BI 1701963或安凡瑟替(onvansertib)之泛KRAS抑制劑時，待治療之癌症係由KRASG12C 、KRASG12V 、KRASG12S 、KRASG12D 、KRASG13C 或KRASG13D 突變驅動。
本發明中所描述之醫藥組合物及產品、套組、組合或組合製劑可適用於抑制實性瘤之生長、減小腫瘤體積、預防腫瘤之轉移性傳播及微小轉移瘤之生長或發展、預防腫瘤再發及預防腫瘤復發。本發明中所描述之醫藥組合物及產品、套組、組合或組合製劑尤其適用於治療不良預後患者或耐放射性或耐化療腫瘤。在一特定實施例中，癌症為高級別或晚期癌症或為轉移性癌症。
方案、劑量及投與途徑 本發明之組合製劑中所採用之各組合搭配物之有效劑量可視所採用之特定化合物或醫藥組合物、投與模式、所治療之病況、所治療之病況之嚴重程度而變化。因此，本發明之組合製劑的給藥方案係根據多種因素選擇，包括投與途徑及患者狀態。具有一般技術之醫師、臨床師或獸醫可容易地確定及開處方用於預防、對抗或遏止病況進展所需要之單一活性成分的有效量。達成在產生功效但不具有毒性之範圍內的活性成分濃度之理想精確度需要基於活性成分對目標部位之可用性的動力學之方案。
本發明組合之藥理學活性可例如在臨床研究中或更佳在測試程序中展現。適合臨床研究為例如患有晚期腫瘤之患者之開放標籤非隨機劑量遞增研究。此類研究可證明本發明組合之活性成分的協同作用。對增生性疾病之有益作用可直接經由此等研究之結果或熟習此項技術者本身已知之研究設計的變化而確定。特定言之，此類研究適合於比較使用活性成分之單藥療法的作用與本發明之組合的作用。較佳地，組合搭配物(a)以固定劑量投與且組合搭配物(b)之劑量遞增直至達到最大耐受劑量。或者，組合搭配物(b)以固定劑量投與且組合搭配物(a)之劑量遞增直至達到最大耐受劑量。
在一些實施例中，「組合療法」意欲包涵以依序方式投與此等治療劑，其中各治療劑在不同時間投與，以及同時或以基本上同步方式投與此等治療劑或該等治療劑中之至少兩種。較佳地，Dbait分子及KRAS抑制劑同時或同步投與。
術語「同時」在本文中用以係指兩種或更多種治療劑之投與係在足夠接近之時間內給予，其個別治療作用在時間上重疊。因此，同時投與包括當中斷投與一或多種其他藥劑之後繼續投與一或多種藥劑時的給藥方案。
Dbait分子及KRAS抑制劑可具有相同或不同投與方案。在某些實施例中，可在投與第二治療劑之前(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之前)、基本上與投與第二治療劑同時、或在投與第二治療劑之後(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之後)投與第一藥劑，或其任何組合。例如，在一個實施例中，第一藥劑可在第二治療劑之前(例如1週)投與。在另一實施例中，第一藥劑可在第二治療劑之前(例如1天之前)投與，且隨後與第二治療劑同時投與。
Dbait分子及KRAS抑制劑可藉由相同途徑或藉由不同途徑投與。例如，所選組合中之第一治療劑可藉由靜脈內注射投與，而組合中之其他治療劑可經口投與。或者，例如，所有治療劑可經口投與或所有治療劑可藉由靜脈內注射投與。治療劑亦可交替投與。投與途徑可為經口、非經腸、靜脈內、瘤內、皮下、顱內、動脈內、局部、經直腸、經皮、皮內、經鼻、肌肉內、骨內及其類似途徑。
治療可包括一個或若干個循環，例如二至十個循環，尤其兩個、三個、四個或五個循環。循環可連續或分離。例如，各循環間隔一至八週、較佳三至四週之時間段。
將在以下實例中描述本發明之其他態樣及優點，該等實例應被視為說明性且非限制性的。
實例 本發明之發明者首次活體外鑑別且證明KRAS抑制劑與在用此KRAS抑制劑治療癌症期間存留癌細胞之出現相關。
實例1 材料及方法 藥物 在整個實驗中使用不同藥物。KRASG12C 特異性抑制劑AMG-510及MRTX-849購自Selleckchem且在二甲亞碸(DMSO)中分別稀釋成10 mM及1 mM之儲備濃度。其概述於下表1中。
表1：處理細胞之藥物以及其功能、供應商、所用溶劑及其最終濃度。
名稱 功能 供應商 溶劑 最終濃度
AMG-510 KRASG12Ci Selleckchem 二甲亞碸(DMSO) 10 mM
MRTX849 KRASG12Ci Selleckchem 二甲亞碸(DMSO) 1 mM
AsiDNA由Avecia (USA)製造且在純水中稀釋成943 µM之儲備濃度。
細胞培養 用非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株NCI-H23，KRASG12C 突變體細胞株(異種接合突變)進行細胞培養。NCI-H23細胞株購自ATCC。細胞根據供應商說明生長且在37℃下維持在5% CO2下之潮濕氛圍中。一週兩次更新培養基，且視細胞株而定，當匯合達到70-80%時，使細胞通過。各細胞株一般在繼代中保持不超過2個月。
耐藥性群體之選擇 將細胞以每個燒瓶5.105 個細胞接種在T75燒瓶中，或以每個培養皿105 個細胞接種在25 cm2 培養皿中，且在37℃下培育24小時，隨後添加含有或不含AsiDNA (劑量在500 nM至2500 nM範圍內)之KRASG12C i (AMG-510 20 µM或1 µM MRTX-849)。AsiDNA與KRASG12C 抑制劑(AMG-510或MRTX-849)同時且連續地添加或自KRASG12C i處理開始兩週後添加。每種條件處理至少3至6個獨立群體。一週兩次更新藥物以維持高耐藥性選擇壓力。收集，洗滌細胞，且使用自動化細胞計數器(EVE™-Nanoentek)，約每週一次在用0.4%錐蟲藍(Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA)染色後計數。
βgal染色 使用衰老偵測套組根據製造商說明書(Abcam；ab65351)鑑別慢循環/衰老耐藥性細胞。簡言之，將細胞接種於12孔培養盤中且在37℃下培育隔夜。細胞接著用PBS洗滌兩次，在10分鐘期間在室溫下用0.5 ml固定溶液固定，用PBS洗滌兩次且接著在37℃下使用0.5 ml染色溶液混合物染色隔夜。接著在顯微鏡下分析顯現藍色之細胞。
流式細胞量測術 在T25燒瓶中，以4.105 個細胞/燒瓶接種NCI-H23，且隨後用100 nM或5 µM之AsiDNA™™處理24小時。對於胞內染色(pPERK及CDK p16/CDK p21、mTOR、Bcl-2染色)，洗滌細胞，接著在4℃下在PBS/70%乙醇中固定至少1小時。接著洗滌細胞，在室溫下用PBS/0.2% TritonX-100溶液滲透30分鐘，且在室溫下用PBS/2%牛血清白蛋白(BSA)溶液飽和10分鐘。接著，用PBS洗滌細胞且分別與FITC結合之抗pPERK (Biorbyt, UK, 1:120)、Alexa647結合之抗CDK p16 (Cell signaling, Danvers MA, USA, 1:50)、Alexa488結合之抗CDK p21 (Cell signaling, Danvers MA, USA, 1:50)、Alexa488結合之抗mTOR (Cell signaling, Danvers MA, USA, 1:50)、Alexa647結合之抗Bcl-2 (Cell signaling, Danvers MA, USA, 1:50)培育1小時，隨後進行流式細胞量測術分析(Guava EasyCyte 12H, Luminex, Germany)。用PE結合之抗運鐵蛋白受體抗體(Thermofisher, Waltham MA, USA, 1:20)染色細胞表面受體。經染色之細胞隨後用PBS洗滌且用Guava EasyCyte 12H流式細胞儀(Luminex, Germany)獲取螢光強度。使用FlowJo軟體(Tree Star, CA, USA)分析資料。收穫細胞且在處理結束之後直接洗滌，且接著在4℃下培育1小時。
結果 為選擇活體外對KRASG12C 抑制劑AMG-510及MRTX-849之耐藥性，本發明者對KRASG12C +/- 突變體NSCLC癌細胞株NCI-H23以高劑量/IC90 劑量(對應於細胞生長之大約90%抑制)進行連續處理(圖1)。每種條件下之各群體一直被視為獨立的。細胞最初對此等抑制劑(AMG-510或MRTX-849)極敏感，在處理的前兩週期間在培養皿中僅剩餘極少殘餘細胞(圖1B及C)。此等殘餘細胞與親本NCI-H23細胞表型極不同，其中衰老相關表型標誌包括非增殖特徵及細胞擴大(圖1A-第10天)、β-gal陽性染色(圖1D)以及p16及p21表現增加(圖1E及F)。有趣地，此「衰老樣」表型僅僅為短暫的，因為細胞失去此較大形狀(第14天)，β-gal陽性染色降低(90%之NCI-H23細胞在處理第10天處於衰老狀態，在第17天為50%且在第27天僅僅為10%)，較高p16及p21表現(分別在第10天及第14天)出現下降。NCI-H23細胞在處理之後三至四週開始重新開始增殖。因此，NCI-H23細胞在第一處理時段期間變得衰老，隨後保持此細胞狀態。為了檢驗此等變化是否與處理下細胞之增殖轉換以產生耐藥性相關，每週將細胞計數一至兩次(圖1B及C)。吾等注意到自AMG-510處理之兩至三週開始，細胞重新開始***且進入增殖狀態。清晰易懂地，此再生長似乎在衰老標記物開始降低之數天之後出現。所有此等變化均在AMG-510或MRTX-849處理下獲得，指示新生耐藥性(圖1B-正方形，圖1C-三角形)，其自具有DTC表型之衰老樣潛伏存留細胞演變。
為證實DTC對KRASG12C i之耐藥性的意義，本發明者檢查其他DTC特異性生物標記物，如內質網(ER)應激(PERK/pPERK路徑)及鐵死亡(運鐵蛋白受體1)之增加(圖1G)。NCI-H23細胞用AMG-510 (20 µM)連續處理以誘導DTC，且相較於親本細胞，在衰老細胞中分析PERK/pPERK受體及運鐵蛋白受體1。與親本細胞株相比，衰老細胞顯示pPERK及運鐵蛋白受體兩者之增加(圖1G)，指示KRASG12C i誘導耐藥性細胞之存留性。
為測試AsiDNA預防對KRASG12C 抑制劑之耐藥性之潛力，本發明者將低劑量之AsiDNA (500 nM及2500 nM-次細胞毒性劑量)與AMG-510組合使用，或將低劑量之AsiDNA (2500 nM)與MRTX-849組合使用，且相較於單一療法(經單獨AMG-510或MRTX-849處理之細胞)定量細胞增殖。AsiDNA在最初幾日未改變AMG-510或MRTX-849之細胞毒性效應，表明AsiDNA不干擾AMG-510或MRTX-849對KRASG12C 癌細胞之功效。有趣地，與用單獨AMG-510或MRTX-849處理之細胞相比，該等細胞逃離休眠且重新開始快速增殖(圖1B-正方形，及圖1C-三角形)，經AMG-510或MRTX-849+AsiDNA同時且連續處理之細胞在超過一個月處理之後死亡且未重新開始增殖(圖1B-圓形及三角形，及圖1C-正方形)。
總言之，本發明者證明NCI-H23癌細胞在KRASG12C i下進入「耐藥性」狀態。因此，此等耐藥性細胞(CTC)經歷表型及基因表現轉換，變得具有增殖性，且造成快速KRASG12C i療法耐藥性，其為易受AsiDNA影響之特徵。對KRASG12C i之耐藥性可由AsiDNA消除，從而觸發不可逆的衰老樣狀態，隨後導致細胞死亡。
實例2 材料及方法 藥物 KRASG12C 特異性抑制劑AMG-510購自Selleckchem且在二甲亞碸中稀釋成10 mM之儲備濃度。AsiDNA由Avecia (USA)製造且在純水中稀釋成943 µM之儲備濃度。
細胞培養 用NCI-H23，即KRASG12C 突變體細胞株(異種接合突變)進行細胞培養。NCI-H23細胞株購自ATCC。細胞根據供應商說明書生長且在37℃下維持在5% CO2下之潮濕氛圍中。一週兩次更新培養基，且視細胞株而定，當匯合達到70-80%時，使細胞通過。各細胞株一般在繼代中保持不超過2個月。
耐藥性群體之選擇 將細胞以每個燒瓶5.105 個細胞接種在T75燒瓶中，且在37℃下培育24小時，隨後添加含有或不含AsiDNA(劑量在100 nM至2500 nM範圍內)之AMG-510 (20 µM)。AsiDNA與KRASG12C 抑制劑同時且連續地添加或自AMG-510處理開始兩週後添加。每種條件處理至少3至6個獨立群體。一週兩次更新藥物以維持高耐藥性選擇壓力。收集，洗滌細胞，且使用自動化細胞計數器(EVE™-Nanoentek)，約每週一次在用0.4%錐蟲藍(Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA)染色後計數。
免疫螢光分析 對於免疫染色，將細胞以2.104 個細胞/載片接種在Lab-Tek® II Chamber Slide™ (Nunc, Rochester, USA)上且在37℃下培育24小時。接著用100 nM或5 µM AsiDNA處理細胞以分析AsiDNA誘導之假DNA損傷之量。在處理後二十四小時，細胞在4%多聚甲醛/PBS 1x中固定20分鐘，用0.5% Triton X-100滲透10分鐘，用2% BSA/PBS 1x阻斷15分鐘。所有抗體經螢光染料偶合。使用以下抗體：Alexa488結合之γH2AX (1:200)且在室溫下培育1小時。將DNA用6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5分鐘。接著在顯微鏡下(Nikon Eclipse TS100, Nikon corp. Tokyo, Japan)下分析細胞。
細胞存活分析(IC50 ) 使用XTT來評定細胞存活率隨氧化還原電勢之變化。活躍***之細胞將水溶性XTT轉化為水不溶性橙色甲䐶產物。將細胞以2.103 個細胞/孔接種於96孔盤上，且隨後用AMG-510以20 µM之起始濃度及用AsiDNA™以100 nM之起始濃度處理一週。使用細胞增殖套組II (XTT) (Roche, Basel, Switzerland)，且在6小時期間應用XTT混合物，隨後在微量盤讀取器中進行吸光度分析。使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Prism 5, San Diego, CA, USA)計算統計及IC50 分析。
結果 為證實AsiDNA抑制對AMG-510之耐藥性，本發明者在含有或不含AsiDNA之情況下以較低劑量(2500 nM至100nM)進行其他系列AMG-510耐藥性選擇。AsiDNA甚至以100 nM之最低劑量藉由抑制自DTC階段之增殖而完全抑制對AMG-510之獲得性耐藥性(圖2A-淺灰色三角形)。為進一步驗證CTC是否對AsiDNA高度敏感，本發明者在處理開始之後14天比較其對親本細胞之敏感性(圖2B)。如所預期，與顯示IC50 低超過100倍(280 nM)的DTC相比，NCI-H23親本細胞對此等劑量之AsiDNA不敏感，估算之IC50 約為33 µM，支持DTC可能由於不同機制而對AsiDNA高度敏感之觀點(圖2B)。
在另一組實驗中，本發明者評價與親本細胞相比經KRASG12C i誘導之DTC是否對AsiDNA高度敏感(圖3)。簡言之，NCI-H23細胞用AMG-510處理10天以選擇大部分由DTC構成之群體，隨後AMG-510處理停滯且DTC用增加劑量之單獨AsiDNA或AMG-510處理。DTC對AsiDNA極敏感，該AsiDNA消除增殖且觸發DTC死亡(圖3A-右下方部分)，估算之IC50 為183 nM，與親本細胞相比低1000倍，支持DTC對AsiDNA高度敏感之觀點。
為解密DTC對AsiDNA之超敏性機制，本發明者分析與親本細胞相比在DTC中經AsiDNA誘導之靶接合。與親本NCI-H23細胞相比，其中AsiDNA自5 µM之劑量開始誘導泛核γH2AX，在100 nM下無活性(圖3B)，而DTC即使在100 nM之低劑量下亦顯示出清晰γH2AX染色(圖3B)，此可至少部分解釋經AMG-510誘導之DTC對AsiDNA之超敏性。
實例3 材料及方法 藥物 在整個實驗中使用不同藥物。KRASG12C 特異性抑制劑AMG-510及MRTX-849購自Selleckchem且在二甲亞碸(DMSO)中分別稀釋成10 mM及1 mM之儲備濃度。其概述於上文實例1之表1中。
AsiDNA由Avecia (USA)製造且在純水中稀釋成943 µM之儲備濃度。
細胞培養 用胰臟癌細胞株MIA PaCa-2進行細胞培養。MIA PaCa-2細胞株購自ATCC。細胞根據供應商說明書生長且在37℃下維持在5% CO2下之潮濕氛圍中。一週兩次更新培養基，且視細胞株而定，當匯合達到70-80%時，使細胞通過。各細胞株一般在繼代中保持不超過2個月。
耐藥性群體之選擇 將細胞以每個燒瓶5.105 個細胞接種在T75燒瓶中，且在37℃下培育24小時，隨後添加含有或不含AsiDNA (5000 nM)之KRASG12C i (1 µM AMG-510或1 µM MRTX-849)。AsiDNA與KRASG12C 抑制劑(AMG-510或MRTX-849)同時且連續地添加或自KRASG12C i處理開始兩週後添加。每種條件處理至少3至6個獨立群體。一週兩次更新藥物以維持高耐藥性選擇壓力。收集，洗滌細胞，且使用自動化細胞計數器(EVE™-Nanoentek)，約每週一次在用0.4%錐蟲藍(Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA)染色後計數
細胞存活分析(IC50 ) 使用XTT評定細胞存活率隨氧化還原電勢之變化。活躍***之細胞將水溶性XTT轉化為水不溶性橙色甲䐶產物。將細胞以2.103 個細胞/孔接種於96孔盤上，且隨後用AsiDNA™以20或50 µM之起始濃度處理一週。使用細胞增殖套組II (XTT) (Roche, Basel, Switzerland)，且在6小時期間應用XTT混合物，隨後在微量盤讀取器中進行吸光度分析。使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Prism 5, San Diego, CA, USA)計算統計及IC50 分析。
結果 除肺癌之外，KRASG12C i亦與若干種其他依賴KRASG12C 之癌症(如胰臟癌)之治療高度相關。為了檢查胰臟癌對KRASG12C i之耐藥性是否亦與DTC相關，本發明者用AMG-510 (1 µM)或MRTX-849 (1 µM)連續治療KRASG12C 突變之MIA PaCa-2胰臟癌模型(圖4A)。如在肺癌細胞中，用AMG-510或MRTX-849連續治療大約在治療開始之後1個月誘導獲得性耐藥性之出現(圖4A-黑色曲線)。實際上，在KRASG12C i處理開始之後約30至35天，DTC表型轉換成增殖狀態(圖4A)。為了證實AsiDNA亦可消除胰臟癌對KRASG12C i之耐藥性，本發明者測試伴隨組合治療KRASG12C i+AsiDNA在耐藥性預防中之功效。用AsiDNA及KRASG12C i伴隨治療迅速且完全抑制獲得性耐藥性出現(圖4A-灰色曲線)。本發明者亦評價在胰臟癌中與親本細胞相比經KRASG12C i誘導之DTC是否對AsiDNA高度敏感(圖4B)。簡言之，MIA PaCa-2細胞用KRASG12C i處理20天以選擇大部分由DTC構成之群體，隨後KRASG12C i處理停滯且DTC僅用增加劑量之AsiDNA處理。與親本MIA PaCa-2細胞相比(圖4B-黑色曲線)，DTC對AsiDNA高度敏感(圖4B-灰色曲線)。
此等結果表明，DTC誘導之KRASG12C i耐藥性至少為肺癌及胰臟癌細胞共有且可由AsiDNA以類似方式靶向。另外，此等結果強調AsiDNA消除對所有不同KRASG12C i之耐藥性的潛力。
無。
圖1. 對KRASG12C 之耐藥性自耐藥性存留細胞(DTC)演變且AsiDNA消除對KRASG12C 抑制劑之耐藥性的出現。(A)在AMG-510 (20 µM)處理開始之後的不同時間點，NCI-H23細胞之代表性顯微影像。自第7天至第14天，在AMG-510處理之後的不同時間點分析衰老樣細胞增大表型。(B-C) 藉由在(B) AMG-510 (20 µM；正方形)單獨連續處理或與AsiDNA (三角形，500 nM；圓形，2500 nM)組合處理或在(C) MRTX849單獨連續處理(1 µM，三角形)或與AsiDNA (正方形，2500 nM)組合處理之期間進行細胞計數來評定NCI-H23細胞生長。將AsiDNA同時添加至AMG-510 (B)或MRTX849 (C)中，且連續添加。(D)評估總細胞數目之β-gal陽性細胞%。(E-F)對未經處理(親本)及經AMG-510處理之NCI-H23細胞中p16 (E)及p21 (F)蛋白之胞內水準之動力學的流式細胞量測術分析。(G)對NCI-H23親本細胞及AMG-510誘導之DTC中pPERK (左)及細胞表面運鐵蛋白受體(右)之胞內水準的流式細胞量測術分析。 圖2. 即使在極低劑量下，AsiDNA抑制對KRASG12C 抑制劑之耐藥性。(A) NCI-H23細胞用AMG-510單獨(20 µM-黑色正方形)連續處理或與不同劑量(範圍介於100 nM至2500 nM)之AsiDNA組合處理。藉由細胞計數評定處理期間之細胞生長。(B) 藉由細胞計數，將在(A)中用AsiDNA處理且在第14天拾取的AMG-510誘導之DTC對AsiDNA之敏感性與NCI-H23親本細胞對AsiDNA之敏感性進行比較。使用GraphPadPrism軟體計算IC50。 圖3：KRASG12Ci誘導之耐藥性存留細胞對AsiDNA高度敏感。(A-左側部分)用AMG-510 (20 µM)連續處理NCI-H23細胞，且(A-右側部分)在處理1週後藉由XTT分析評定DTC (正方形)及親本細胞(圓形)對增加劑量之AMG-510或AsiDNA的敏感性。使用GraphPadPrism軟體計算IC50 。(B)在用AsiDNA (100 nM及5000 nM)處理的24小時期間NCI-H23親本或NCI-H23 DTC中γH2AX染色之代表性顯微影像。DAPI，灰色；γH2AX，白色。 圖4：AsiDNA預防胰臟癌中對KRASG12C i之耐藥性。(A) 在有AsiDNA (灰色圓形)或無AsiDNA (黑色正方形)情況下MIA PaCa-2細胞用AMG-510 (1µM-左側部分)或MRTX-849 (1µM-右側部分)進行連續處理，且藉由細胞計數每週評定細胞存活。(B)在處理1週後藉由XTT分析評定DTC (灰色正方形)及親本細胞(黑色圓形)對增加劑量之AsiDNA™的敏感性。使用GraphPadPrism軟體計算IC50 。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
無。

Claims (16)

  1. 一種醫藥組合物、組合或套組，其包含Dbait分子及蛋白KRAS抑制劑。
  2. 如請求項1所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該Dbait分子具有至少一個自由端及與人類基因體中之任何基因具有小於60%序列一致性之20-200 bp的DNA雙股部分。
  3. 如請求項1至請求項2中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該Dbait分子具有下式中之一者：
    Figure 03_image001
    (I)
    Figure 03_image003
    (II)
    Figure 03_image005
    (III) 其中N為去氧核苷酸，n為15至195之整數，帶下劃線之N係指具有或不具有經修飾之磷酸二酯主鏈之核苷酸，L'為連接子，C為選自親脂性分子或靶向細胞受體以實現受體介導的內吞作用之配體的促進內吞作用的分子，L為連接子，m及p獨立地為0或1之整數。
  4. 如請求項1至請求項3中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該Dbait分子具有下式：
    Figure 03_image007
    (II') 其中對於N、N 、n、L、L'、C及m之定義與式(I)、(II)及(III)相同。
  5. 如請求項1至請求項4中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該Dbait分子具有下式：
    Figure 03_image009
    。
  6. 如請求項1至請求項5中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該KRAS抑制劑為選自由特異性共價KRAS抑制劑及多價小分子泛KRAS抑制劑組成之群的直接KRAS抑制劑。
  7. 如請求項1至請求項6中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該KRAS抑制劑係選自由以下組成之群：AMG-510/索妥昔布(sotorasib) (Amgen/Carmot Therapeutics)、MRTX-849/達格昔布(Adagrasib) (Mirati Therapeutics)、ARS-3248/JNJ-74699157 (Johnson & Johnson/Wellspring Biosciences)、化合物B(Sanofi/X-Chem Pharmaceuticals)、LY3499446 (Eli Lilly)、ARS-853、ARS-1620、BI-2852、BI-1701963 (Boehringer Ingelheim)、mRNA-5671 (Moderna Therapeutics)、G12D抑制劑(Mirati)、RAS(On)抑制劑(Revolution medicines)及BBP-454 (BridgeBio Pharma)。
  8. 如請求項1至請求項7中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該KRAS抑制劑為直接靶向且結合突變KRASG12C蛋白之KRASG12C抑制劑。
  9. 如請求項1至請求項8中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其中該KRAS抑制劑使野生型KRAS蛋白保持原樣。
  10. 如請求項1至請求項9中任一項所述之醫藥組合物、組合或套組，其用於治療癌症。
  11. 一種如請求項1至請求項5中任一項所述之Dbait分子，其用於與特定言之如請求項6至請求項9中任一項所述之KRAS抑制劑組合治療癌症。
  12. 一種如請求項1至請求項5中任一項所述之Dbait分子，其用於延遲及/或預防患者中產生對KRAS抑制劑，特定言之如請求項6至請求項9中任一項所述之KRAS抑制劑的癌症耐藥性。
  13. 如請求項10所述之醫藥組合物、組合或套組或如請求項11至請求項12中任一項所述之Dbait分子，其中該癌症係由KRAS突變驅動之癌症，更佳選自KRASG12C、KRASG12V、KRASG12S、KRASG12D、KRASG13C、KRASG13D、KRASG12C及KRASG12D之突變。
  14. 如請求項10所述之醫藥組合物、組合或套組或如請求項11至請求項12中任一項所述之Dbait分子，其中該癌症係由KRASG12C突變驅動。
  15. 如請求項10所述之醫藥組合物、組合或套組或如請求項11至請求項12中任一項使用之Dbait分子，其中該癌症係選自由以下組成之群：頭頸癌、胰臟癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌、膽道癌、腎癌、卵巢癌、***癌、甲狀腺癌、食道癌、乳癌(特定言之TNBC)、膀胱癌、肺癌、肝癌、子宮體癌、子宮內膜癌、子宮頸癌或泌尿道癌、腹膜癌、多發性骨髓瘤、肉瘤、皮膚癌(黑色素瘤)，特定言之葡萄膜黑色素瘤、及造血癌，諸如白血病。
  16. 一種如請求項1至請求項5中任一項所述之Dbait分子，其用於針對癌症治療中之癌症存留細胞(cancer persister cell)，特定言之針對如請求項6至請求項9中任一項所定義之KRAS抑制劑的癌症存留細胞之靶向作用。
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