CN111337674A - 一种用于预测心血管事件风险的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于预测心血管事件风险的试剂盒，包括任选的用于检测对氧磷酶‑1活性的试剂。本发明试剂盒通过检测血清中对氧磷酶‑1活性来评估体内脂蛋白抗氧化水平，预测待测人群发生心血管事件的风险；若对氧磷酶‑1活性高，则体内脂蛋白抗氧化水平高，发生心血管事件的风险低；若对氧磷酶‑1活性低，则体内脂蛋白抗氧化水平低，发生心血管事件的风险高。本发明试剂盒可用于临床心血管事件风险的辅助筛查，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及心血管事件风险筛查技术领域，尤其涉及一种用于预测心血管事件风险的试剂盒。
背景技术
心血管事件风险，是指导致动脉内皮损害、左心室肥厚和动脉粥样硬化，直到发生冠心病事件和心力衰竭等以及死亡的可能性。
心血管疾病，又称为循环***疾病，是一系列涉及循环***的疾病，循环***指人体内运送血液的器官和组织，主要包括心脏、血管(动脉、静脉、微血管)，可以细分为急性和慢性，一般都与动脉硬化有关。
目前，亟需研究出能够预测心血管事件风险的试剂盒。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种用于检测血清中对氧磷酶-1(PON1)活性的试剂盒，来评估体内脂蛋白抗氧化水平，以预测待测人群发生心血管事件的风险。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于预测心血管事件风险的试剂盒，包括任选的用于检测对氧磷酶-1活性的试剂。
其中，所述用于检测对氧磷酶-1活性的试剂包括Tris-HCl缓冲液和特异性底物。
其中，所述Tris-HCl缓冲液中含有激活剂，其中激活剂的浓度为0.1-100mmol/L。
其中，所述激活剂为MgCl2。
其中，所述特异性底物为4-硝基苯基乙酸酯，所述特异性底物浓度为0.05-50mmol/L。
对氧磷酶-1可选择的底物种类广泛，不同的底物测定条件差异很大。目前，最常用的几种底物分别为对氧磷、乙酸苯酯、4-硝基苯基乙酸酯。但对氧磷和乙酸苯酯都具有毒性，特别是对氧磷毒性极大，吸入或是皮肤接触均可产生毒性，危险性大；此外，对氧磷会污染生化分析仪，需要使用高浓度NaOH来进行清洗，这就意味着要独立于其他试剂来操作，并要求清洗，增加了成本。
在人类疾病的研究中不同底物，检测对氧磷酶-1活性结果上减少的幅度相近。但在比较对氧磷，乙酸苯酯和4-硝基苯基乙酸酯的人体研究中，以4-硝基苯基乙酸酯为底物，对氧磷酶-1活性检测结果是唯一显示出非终末期慢性肾衰竭患者和健康人的显著性差异。故4-硝基苯基乙酸酯可以在较窄范围的群体值之间表现出较高的活性，意味着较小的分析误差。乙酸苯酯被对氧磷酶-1水解形成苯酚，苯酚的特异性吸收峰在270nm，一般生化仪不具备这个波长的检测，会对检测带来限制。故选用4-硝基苯基乙酸酯作为对氧磷酶-1活性检测的底物。
底物溶剂：含0.5-10％(w/v)吐温水溶液，该溶液能溶解4-硝基苯基乙酸酯，且安全性和稳定性均较高。
本发明的第二方面，提供检测对氧磷酶-1活性的试剂在制备预测心血管事件风险用试剂中的用途。
其中，所述试剂包括Tris-HCl缓冲液和特异性底物。
其中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10-1000mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6-10，所述Tris-HCl缓冲液中含有激活剂，其中激活剂为MgCl2，激活剂的浓度为0.1-100mmol/L，所述底物为4-硝基苯基乙酸酯，所述底物浓度为0.05-50mmol/L。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明试剂盒通过检测血清中对氧磷酶-1活性来评估体内脂蛋白抗氧化水平，预测待测人群发生心血管事件的风险；若对氧磷酶-1活性高，则体内脂蛋白抗氧化水平高，发生心血管事件的风险低；若对氧磷酶-1活性低，则体内脂蛋白抗氧化水平低，发生心血管事件的风险高。本发明试剂盒可用于临床心血管事件风险的辅助筛查，临床应用前景良好。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1为不同缓冲液体系下反应速度的散点图；
图2为反应速度随Tris-HCl缓冲液浓度的变化曲线；
图3为反应速度随Tris-HCl缓冲液pH值的变化曲线；
图4为反应速度随Tris-HCl缓冲液中Mg2+浓度的变化曲线；
图5为反应速度随底物浓度的变化曲线；
图6为反应速度值随反应时间的变化曲线。
具体实施方式
实施例1对氧磷酶-1活性水平与冠心病的关系
一、临床资料
选取胸科医院早期冠心病患者血清标本20例，其中男性12例，女性8例，年龄范围为 58～70岁，平均年龄61.9岁；健康对照30例，其中男生16例，女生14例，年龄范围为55～70岁，平均年龄60.4岁。
二、对氧磷酶-1活性水平的检测
1)缓冲液(R1)的配制
先用电子天平称取Tris 3.0225g，溶于400ml水中，混合均匀，配制成Tris溶液；用量筒量取110ml水，并用移液管量取1ml浓盐酸，将浓盐酸缓缓加入水中，混合均匀，配制成盐酸溶液；在pH计的测量下，用配制的盐酸溶液滴定上述Tris溶液，直至pH变化到8.50，滴定完成；
将滴定后的Tris溶液倒入500ml容量瓶，加水定容至500ml，配制成Tris-HCl溶液；称取MgCl2 9.521g溶于100ml水中，混合均匀，配制成1000mmol/L MgCl2溶液，用移液枪量取1mL MgCl2溶液，加入Tris-HCl溶液中，R1配制完成，R1的浓度为0.05mol/L、pH＝8.5，其中Mg2+浓度为2.5mmol/L。
2)底物(R2)的配制
称取4-硝基苯基乙酸酯9.975mg，加入10％吐温80水溶液40ml，混合均匀，配制成底物浓度为1.377mmol/L的底物溶液。
3)检测仪器：ADALITS Pchem1
4)检测方法
分别抽取早期冠心病患者及健康对照的血清，分离血清，作为检测样本。
取缓冲液(R1)210μl，样本5μl，在37℃下，孵育300s，加入底物溶液(R2)70μl，孵育60s后，开始在240s连续监测吸光度变化，采用如下公式进行对氧磷酶-1活性的检测。
此处反应温度为37℃，高于37℃底物容易发生非酶性水解，导致结果偏高。
A、摩尔消光系数(朗伯-比尔定律)：
A＝ε×c×l (2-1)
其中A：吸光度，
ε：摩尔消光系数(L/mol·cm)，
c：样本浓度(mol/L)，
l：比色杯光径(cm)。
B、酶活性计算公式：
其中ΔA：吸光度差值，
V：反应液总体积(ml)，
ε：摩尔消光系数(L/mol·cm)
Vs：样本体积(ml)，
l：比色杯光径(cm)。
肺癌患者与健康对照血清中对氧磷酶-1活性检测结果如表1。
表1
由表1可知，冠心病患者的血清中对氧磷酶-1活性为254.2±30.47U/L，健康对照的血清中对氧磷酶-1活性为299.78±19.98U/L，对氧磷酶-1活性在早期冠心病患者中显著降低，与健康对照组相比，对氧磷酶-1活性差异具有统计学意义(p＜0.001)。
由以上结果可以看出，与正常人群相比，早期冠心病患者的对氧磷酶-1活性显著降低(p ＜0.0001)，说明冠心病与对氧磷酶-1活性呈负相关，对氧磷酶-1低活性会显著提高患冠心病的可能性，因此，可以通过检测待测人群的对氧磷酶-1活性，将近期冠心病的易感人群筛查出来。
实施例2、本发明检测血液中对氧磷酶-1活性的试剂盒的组成及其使用方法
检测试剂盒：
0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5，MgCl2 2.5mmol/L
0.2754mmol/L的4-硝基苯基乙酸酯溶液
使用方法：
分别抽取早期冠心病患者及健康对照的血液，分离血清，作为检测样本。
取缓冲液(R1)210μl，样本5μl，在37℃下，孵育300s，加入底物溶液(R2)70ul，孵育60s后，开始在240s连续监测吸光度变化，根据公式2-1、2-2进行对氧磷酶-1活性计算。
综上，本发明试剂盒通过检测血清中对氧磷酶-1活性来评估体内脂蛋白抗氧化水平高低，预测待测人群发生心血管事件的风险；若对氧磷酶-1活性高，则体内脂蛋白抗氧化水平高，发生心血管事件的风险低；若对氧磷酶-1活性低，则体内脂蛋白抗氧化水平低，发生心血管事件的风险高。
四、采用试剂盒进行对氧磷酶-1活性检测时，各参数的选择
4-硝基苯基乙酸酯在对氧磷酶-1催化作用下，生成对硝基苯酚，对硝基苯酚在405nm处具有特征性吸收峰，而4-硝基苯基乙酸酯在此波长下吸收极弱。故，通过测定酶促反应后，在405nm处吸光度的增加来反映对氧磷酶-1活性的高低。而对氧磷酶-1活性较高时，催化 4-硝基苯基乙酸酯生成对硝基苯酚的反应速度较快，分析误差较小。
1、缓冲体系的选择
配制相同浓度(50mmol/L)、pH＝8的Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液和磷酸缓冲液，其他条件不变，用3份不同血清分别进行对氧磷酶-1活性检测，重复测量5次，检测各缓冲液每分钟吸光度变化(ΔA/min)。具体数据如表2,测定结果以反应速度(ΔA/min)为纵坐标，3 份不同血清为横坐标，见图1。
由表2、图1，Tris-HCl缓冲液的反应速度在不同血清中均大于甘氨酸缓冲液和磷酸盐缓冲液，故选择Tris-HCl缓冲液体系为较优缓冲体系。
表2不同缓冲液体系的反应速度
2、缓冲体系浓度的选择
选取缓冲液浓度分别为10mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L、800mmol/L、1000mmol/L Tris-HCl缓冲液，其他条件不变，用混合血清进行检测，重复2次，检测缓冲液在不同浓度下的每分钟吸光度变化(ΔA/min)。具体数据如表3，测定结果以反应速度(ΔA/min)为纵坐标，缓冲液浓度值为横坐标，见图2。
表3不同浓度Tris-HCl缓冲液体系下的反应速度
由表3、图2，相比10mmol/L,Tris-HCl缓冲液反应速度达50mmol/L时，略有上升，后趋于恒定，反应速度不随缓冲液浓度变化而变化，故平衡生产成本和信号强度，选择50mmol/L 为较优浓度。
3、缓冲体系pH的选择
选取缓冲体系pH分别为pH6.0、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH10.0、pH11.0， 50mmol/LTris-HCl缓冲液，其他条件不变，用混合血清进行检测，重复2次，检测缓冲液在不同浓度下的每分钟吸光度变化(ΔA/min)。具体数据如表4，测定结果以反应速度(ΔA/min) 为纵坐标，缓冲液pH值为横坐标，见图3。
表4不同pH值的Tris-HCl缓冲液体系的反应速度
由表4、图3，Tris-HCl缓冲液在pH6-10之间的信号强度变化不大，在pH＝8.5时反应速度最快，故选择pH6～10为较优pH范围，其中pH＝8.5为最优pH值。
4、缓冲体系中激活剂浓度的选择
发明人在实验中偶然反应，以MgCl2、CuCl2、CaCl2和CdCl2等二价金属离子为代表的激活剂会影响到对氧磷酶-1活性，激活剂浓度的高低会影响到反应速度和反应效果，对激活剂浓度的选择非常重要。
选取激活剂浓度分别为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、50mmol/L和100mmol/L，其他条件不变，用混合血清进行检测，重复2次，检测缓冲液在不同浓度下的每分钟吸光度变化(ΔA/min)。具体数据如表5,测定结果以反应速度(ΔA/min)为纵坐标，激活剂浓度值为横坐标，见图4。
表5不同Mg2+浓度的Tris-HCl缓冲液体系的反应速度
由表5、图4，当激活剂浓度达0.05mmol/L时即可催化反应进行，浓度达0.1mmol/L时可使反应速率大幅提升，当浓度达2.5mmol/L反应速率趋于饱和，故激活剂的较优浓度为0.1～100mmol/L，综合考量选择2.5mmol/L为较优浓度。
5、底物浓度的选择
将底物浓度分别调整为0.01mmol/L、0.05mmol/L、1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L，其他条件不变，分别检测低值和高值混合血清，重复2 次，检测缓冲液在不同浓度下的每分钟吸光度变化(ΔA/min)。低值混合血清下的具体数据如表6,高值混合血清下的具体数据如表7,以底物浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，最后结果可见图5。
表6不同底物浓度的反应速度(低值混合血清)
表7不同底物浓度的反应速度(高值混合血清)
由表6、表7、图5，底物浓度在浓度在0.05～50mmol/L间时反应速率相当，100mmol/L 时由于浓度过高，导致反应在极短时间内完成，生化仪上无法计算反应速率，故底物浓度选择0.05～50mmol/L。
6、反应时间的选择
用混合血清进行检测，加入R1孵育5分钟后，再加入底物溶液后，每隔一分钟记录一次读数，将读数时间拓长到30分钟。以时间(min)为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，最后结果可见图6。反应在加入R2后1-20分钟内保持稳定的线形(R2＝0.998)，超过20分钟后，反应速率趋于平稳，选择反应时间为10～25分钟。
7、不同测定方法的比较
紫外分光光度计：机器开机后预热至37℃，量取3ml缓冲液，先加入36μl底物溶液，混合均匀(作为空白)，再加入60μl血清，测A值改变，延迟45s记录第一次，每隔15s记录一次，总记录3min的变化数值。
全自动生化仪：取缓冲液(R1)210μl，样本5μl，在37℃下，孵育300s，加入底物溶液(R2)70ul，孵育60s后，开始在240s连续监测吸光度变化。按照上述测定方法，在全自动生化仪上设置参数。以市售非定值脂类质控品作为定标品，值设定为276.00U/L，搜集的血清标本制成高值混合血清和低值混合血清，分别用生化仪和紫外分光光度计检测，样本分别重复检测2次，测定结果如表8
表8
综上，采用紫外分光光度计与全自动生化仪，所测定结果区别很小，可采用全自动生化仪进行测定，测定更加方便。
上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。
Claims (9)
1.一种用于预测心血管事件风险的试剂盒，其特征在于，包括任选的用于检测对氧磷酶-1活性的试剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测对氧磷酶-1活性的试剂包括Tris-HCl缓冲液和特异性底物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10-1000mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6-10。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中含有激活剂，其中激活剂的浓度为0.1-100mmol/L。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述激活剂为MgCl2。
6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性底物为4-硝基苯基乙酸酯，所述特异性底物浓度为0.05-50mmol/L。
7.检测对氧磷酶-1活性的试剂在制备预测心血管事件风险用试剂中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述试剂包括Tris-HCl缓冲液和特异性底物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10-1000mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6-10，所述Tris-HCl缓冲液中含有激活剂，其中激活剂为MgCl2，激活剂的浓度为0.1-100mmol/L，所述特异性底物为4-硝基苯基乙酸酯，所述特异性底物浓度为0.05-50mmol/L。
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2018
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