KR100970824B1 - 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유동물에서의 종양의 진단 및 치료에 유용한 물질의 조성물, 및 포유동물에서의 종양의 진단 및 치료를 위한 상기 물질의 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
종양, 진단, 종양 관련 항원성 표적, TAT 폴리펩티드, 신호 펩티드

Description

종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TUMOR}
관련 출원
본 출원은, 2005년 6월 20일자로 출원된 미국 가출원 제60/692,092호 및 2006년 4월 21일자로 출원된 미국 가출원 제60/793,951호에 대해 35 U.S.C.§119(e) 하의 우선권을 주장하는 (상기 출원의 개시 내용은 참고로 본원에 도입됨), 37 C.F.R. §1.53(b)(1)하에서 제출된 비-가출원이다.
본 발명은 포유동물에서의 종양의 진단 및 치료에 유용한 물질의 조성물, 및 포유동물에서의 종양의 진단 및 치료를 위한 상기 물질의 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
악성 종양 (암)은 미국에서 심장 질환에 이어 두 번째로 높은 사망 원인이다 (문헌 [Boring et al., CA Cancer J. Clin . 43:7 (1993)]). 암은 정상적인 조직으로부터 유래된 비정상적인 세포 또는 신생물 세포 (증식하여 종양 덩어리를 형성함) 수의 증가, 이들 신생물성 종양 세포의 인접 조직으로의 침입, 및 전이라고 일컬어지는 과정에 의해 혈액 또는 림프계를 통해 결국 국부 림프절 및 원위부로 확 산되는 악성 세포의 발생을 특징으로 한다. 암성 상태의 세포는 정상적인 세포라면 성장하지 못하는 조건에서도 성장한다. 암 자체는 상이한 정도의 침입성 및 공격성을 특징으로 하는 매우 다양한 형태로 나타난다.
암의 진단 및 치료에 효과적인 세포 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구자들은 1종 이상의 정상적인 비-암성 세포(들)에 비해 1종 이상의 특정 유형(들)의 암세포 표면에서 특이적으로 발현되는 막횡단 폴리펩티드, 또 다르게는 막결합 폴리펩티드를 확인하고자 하였다. 흔히, 이러한 막결합 폴리펩티드는 비-암성 세포의 표면에 비해 암세포의 표면에서 더 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-관련 세포 표면 상의 항원 폴리펩티드를 확인하여 항체-기재 요법을 통해 암세포를 특이적으로 표적화하여 파괴할 수 있었다. 이와 관련하여, 항체-기재 요법은 특정 암의 치료에 매우 효과적인 것으로 입증되었음을 유의한다. 예를 들어, 헤르셉틴 (HERCEPTIN; 등록상표) 및 리툭산 (RITUXAN; 등록상표) (제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.; 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재))은 각각 유방암 및 비-호지킨 림프종을 치료하는데 성공적으로 사용되어 온 항체이다. 보다 구체적으로, 헤르셉틴(등록상표)은 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 원종양유전자 (proto-oncogene)의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는, 재조합 DNA-유래의 인간화된 모노클로날 항체이다. HER2 단백질의 과다발현은 원발성 유방암의 25 내지 30％에서 관찰된다. 리툭산(등록상표)은 정상적인 B 림프구 및 악성 B 림프구의 표면에서 발견되는 CD20 항원에 대해 제시되는, 유전자조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 이들 두 항체는 CHO 세포에서 재조합 방법에 의해 제조된다.
포유동물 암 요법에서의 상기 확인된 진전에도 불구하고, 포유동물에서 종양의 존재를 검출할 수 있는 추가의 진단제 및 신생물 세포의 성장을 효과적으로 억제하는 치료제 각각에 대한 요구가 높다. 따라서, 본 발명의 목적은 정상적인 세포 또는 다른 상이한 암세포에 비해 1종 이상의 유형(들)의 암세포(들)에서 더 풍부하게 발현되는 세포막-결합 폴리펩티드를 확인하는 것, 이러한 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는 핵산을 사용하는 것, 및 포유동물에서의 암의 치료적 처치 및 진단적 검출에 유용한 물질의 조성물을 제조하는 것이다.
발명의 요약
A. 실시양태
본 명세서에서, 본 출원인은 먼저 1종 이상의 유형의 정상적인 비-암세포의 표면 상에 비해 1종 이상의 유형의 암세포(들)의 표면 상에 더 높은 정도로 발현되는 세포 폴리펩티드 (및 이들을 코딩하는 핵산 또는 그의 단편)의 확인에 대해 기술한다. 본원에서는 이러한 폴리펩티드를 모두 종양-관련 항원성 표적 ( T umor-associated A ntigenic T arget) 폴리펩티드 ("TAT" 폴리펩티드)라 지칭하며, 이는 포유동물에서 암의 치료 및 진단에 효과적인 표적으로 작용할 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명은 종양-관련 항원성 표적 폴리펩티드 또는 그의 단편 ("TAT" 폴리펩티드)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
특정 국면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 전장 TAT 폴리펩티드, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 막횡단 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열의 특정된 임의의 다른 단편을 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 국면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 TAT 폴리펩티드의 코딩 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 막횡단 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열의 특정된 임의의 다른 단편의 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 국면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87 ％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 국면은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 실활된 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 이러한 폴리펩티드(들)의 막횡단 도메인(들)이 본원에 개시되어 있다. 이에 따라, 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드들의 가용성 세포외 도메인이 고려된다.
다른 국면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열을 갖는 TAT 폴리펩티드, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 막횡단 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열의 특정된 임의의 다른 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (b) 상기 뉴클레오티드 서열 (a)의 상보체에 혼성화되는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명의 한 실시양태는, 예를 들어 진단용 프로브, PCR 프라이머, 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로 유용한 혼성화 프로브로 사용하거나, 또는 임의로 항-TAT 폴리펩티드 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 폴리펩티드에 결합하는 다른 유기 소분자에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 전장 TAT 폴리펩티드의 단편을 코딩하는데 사용할 수 있는, 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 코딩 서열의 단편 또는 그의 상보체에 관한 것이다. 통상적으로, 이러한 핵산 단편의 길이는 뉴클레오티드 약 5개 이상, 다르게는 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개, 810개, 820개, 830개, 840개, 850개, 860개, 870개, 880개, 890개, 900개, 910개, 920개, 930개, 940개, 950개, 960개, 970개, 980개, 990개 또는 1,000개 이상이며, 여기서 용어 "약"은 문맥상 언급된 뉴클레오티드 서열 길이±언급된 길이의 10％를 의미한다. 또한, 이러한 핵산 단편은 일반적으로 TAT 폴리펩티드의 전장 코딩 서열 또는 그의 상보체로부터 유래된 연속적인 뉴클레오티드로 구성된다. TAT 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규한 단편 또는 그의 상보체는, 널리 공지된 다수의 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 상기 TAT 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 공지된 다른 뉴클레오티드 서열과 함께 정렬한 다음, 이 TAT 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들) 또는 그의 상보체가 신규한 것인지를 결정함으로써 통상적인 방식으로 결정할 수 있음을 유의한다. 본원에는 이러한 TAT 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규한 단편 또는 그의 상보체가 모두 포함된다. 또한, 이러한 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 TAT 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 폴리펩티드에 결합하는 다른 유기 소분자에 대한 결합 부위를 포함하는 TAT 폴리펩티드 단편도 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 확인된 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 TAT 폴리펩티드를 제공한다.
특정 국면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열을 갖는 TAT 폴리펩티드, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 막횡단 TAT 폴리펩티드 단백질의 세포외 도메인, 본원에 개시된 임의의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열의 특정된 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 TAT 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가의 국면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노 산 서열을 포함하는 단리된 TAT 폴리펩티드에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노 서얼을 갖는 TAT 폴리펩티드, (b) 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열, (c) 본원에 개시된 바와 같이 신호 서열이 있거나 없는 막횡단 TAT 폴리펩티드 단백질의 세포외 도메인, (d) 본원에 개시된 임의의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 또는 (e) 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 아미노산 서열의 특정된 임의의 다른 단편을 코딩하는 DNA 분자의 상보체에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 TAT 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 국면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 N-말단 신호 서열 및/또는 개시 메티오닌이 없으며 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단리된 TAT 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 상기 단리된 TAT 폴리펩티드의 제조 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 TAT 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 TAT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 국면은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 실활된 단리된 TAT 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 상기 단리된 TAT 폴리펩티드의 제조 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 TAT 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단 계, 및 상기 세포 배양물로부터 TAT 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 (E. coli) 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 또한 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드의 제조 방법도 제공되며, 이 방법은 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 (비-TAT) 폴리펩티드에 융합된 본원에 기재된 임의의 TAT 폴리펩티드를 포함하는 단리된 키메라 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로는, 예를 들어 에피토프 태그 서열 또는 이뮤노글로불린의 Fc 영역 등과 같은 이종 폴리펩티드에 융합된 본원에 기재된 임의의 TAT 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기에 기재하는 임의의 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체, 또는 항-TAT 폴리펩티드 항체의 그의 각 항원성 에피토프에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체이다. 본 발명의 항체는 임의로 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신 등과 같은 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소 등에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 임의로 CHO 세포 또는 박 테리아 세포에서 생성될 수 있으며, 바람직하게는 이들이 결합된 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나 또는 그의 사멸을 유도한다. 진단 목적을 위해서, 본 발명의 항체를 검출가능하게 표지하거나, 고체 지지체에 부착시키거나, 또는 그 밖의 처리를 수행할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 항체의 제조 방법도 추가로 제공되며, 이 방법은 원하는 항체의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 원하는 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기하는 임의의 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드 ("TAT 결합 올리고펩티드")를 제공한다. 임의로, 본 발명의 TAT 결합 올리고펩티드는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신 등과 같은 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소 등에 접합될 수 있다. 본 발명의 TAT 결합 올리고펩티드는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있으며, 바람직하게는 이들이 결합된 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나 또는 그의 사멸을 유도한다. 진단 목적을 위해서, 본 발명의 TAT 결합 올리고펩티드를 검출가능하게 표지하거나, 고체 지지체에 부착시키거나, 또는 그 밖의 처리를 수행할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 TAT 결합 올 리고펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 TAT 결합 올리고펩티드의 제조 방법도 추가로 제공되며, 이 방법은 원하는 올리고펩티드의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 원하는 올리고펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기에 기재하는 임의의 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 유기 소분자 ("TAT 결합 유기 분자")를 제공한다. 임의로, 본 발명의 TAT 결합 유기 분자는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신 등과 같은 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소 등에 접합될 수 있다. 본 발명의 TAT 결합 유기 분자는 바람직하게는 이들이 결합된 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나 또는 그의 사멸을 유도한다. 진단 목적을 위해서, 본 발명의 TAT 결합 유기 분자를 검출가능하게 표지하거나, 고체 지지체에 부착시키거나, 또는 그 밖의 처리를 수행할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 항-TAT 항체, 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 올리고펩티드 또는 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 유기 분자를 담체와 함께 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 임의로, 상기 담체는 제약상 허용되는 담체이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 용기 및 이 용기에 함유된 물질의 조성물을 포함하는 제품에 관한 것이며, 이 때 상기 물질의 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 항-TAT 항체, 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 올리고펩티드, 또는 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 유기 분자를 포함할 수 있다. 이 제품은 또한, 종양의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 상기 물질의 조성물의 사용법을 설명하는, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물을 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 항-TAT 폴리펩티드 항체, 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 올리고펩티드, 또는 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 유기 분자에 반응하는 증상의 치료에 유용한 의약을 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 TAT 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같은 항-TAT 폴리펩티드 항체, 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 올리고펩티드, 또는 본원에 기재된 바와 같은 TAT 결합 유기 분자의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 하나 이상의 본원에 개시된 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 또는 HVR-H3 서열을 포함하는 임의의 단리된 항체, 또는 임의의 상기 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 임의의 항체에 관한 것이다.
B. 추가의 실시양태
본 발명의 다른 실시양태는 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 세포를 TAT 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이 때 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 상기 TAT 폴리펩티드에 결합하여 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 세포의 성장을 억제한다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 암세포이며, 이 때 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 상기 TAT 폴리펩티드에 결합하여 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 사멸시킨다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체이다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체, TAT 결합 올리고펩티드 및 TAT 결합 유기 분자는 임의로 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신 등과 같은 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소 등에 접합될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체 및 TAT 결합 올리고펩티드는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 TAT 폴리펩티드-발현 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물을 치료적으로 처치하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 TAT 폴리펩티드에 결합하는 치료 유효량의 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자를 포유동물에게 투여함으로써 상기 종양을 효과적으로 치료적으로 처치하는 것을 포함한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체이다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체, TAT 결합 올리고펩티드 및 TAT 결합 유기 분자는 임의로 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 메이탄 시노이드 또는 칼리케아미신 등과 같은 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소 등에 접합될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체 및 올리고펩티드는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 TAT 폴리펩티드를 함유할 것으로 추정되는 샘플에 TAT 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 샘플을 TAT 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자에 노출시키는 단계, 및 상기 샘플에서 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 TAT 폴리펩티드의 결합 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 이 때 이와 같은 결합이 존재하는 것은 샘플에 TAT 폴리펩티드가 존재함을 나타낸다. 임의로, 상기 샘플은 TAT 폴리펩티드를 발현시킬 것으로 추정되는 세포 (암세포일 수 있음)를 함유할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자를 임의로 검출가능하게 표지하거나, 고체 지지체에 부착시키거나, 또는 그 밖의 처리를 수행할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태는 포유동물에서 종양의 존재를 진단하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 (a) 상기 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플, 및 (b) 상기와 동일한 조직 기원 또는 유형의 기지의 정상적인 비-암성 세포의 대조군 샘플에서 검출하는 단계를 포함하며, 이 때 시험 샘플에서의 TAT 폴리펩티드 발현 수준이 대조군 샘플에 비해 더 높다는 것은 상기 시험 샘플을 얻은 포유동물에 종양이 존재함을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시양태는 포유동물에서 종양의 존재를 진단하는 방법에 관 한 것으로, 이 방법은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포를 포함하는 시험 샘플을 TAT 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 시험 샘플에서 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자와 TAT 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이 때 복합체의 형성은 상기 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는 것이다. 임의로, 사용된 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자를 검출가능하게 표지하거나, 고체 지지체에 부착시키거나 또는 그 밖의 처리를 수행하고/하거나, 조직 세포의 시험 샘플을 암성 종양이 있을 것으로 추정되는 개체로부터 수득한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 TAT 폴리펩티드의 발현 또는 활성의 변경, 바람직하게는 발현 또는 활성의 증가와 관련된 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 유효량의 TAT 폴리펩티드 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 세포 증식성 장애는 암이며, TAT 폴리펩티드 길항제는 항-TAT 폴리펩티드 항체, TAT 결합 올리고펩티드, TAT 결합 유기 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 세포 증식성 장애의 효과적인 치료 또는 예방은 TAT 폴리펩티드 발현 세포를 직접 사멸시키거나 그의 성장을 억제시킨 결과이거나, TAT 폴리펩티드의 세포 성장-증대 활성을 길항한 결과일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자를 TAT 폴리펩티드 발현 세포에 결합시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 세포와 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자를 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자가 상기 TAT 폴리펩티드에 결합하기에 적합한 조건하에 접촉시켜 이들을 서로 결합시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서는, 세포와 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자의 결합의 위치 및/또는 양을 정성적 및/또는 정량적으로 측정하기에 유용한 분자 또는 화합물로 항체를 표지한다.
본 발명의 다른 실시양태는 (i) 암 또는 종양의 치료적 처치 또는 진단적 검출, 또는 (ii) 세포 증식성 장애의 치료적 처치 또는 예방에 유용한 의약의 제조에 있어서, (a) TAT 폴리펩티드, (b) TAT 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 이 핵산을 포함하는 벡터 또는 숙주 세포, (c) 항-TAT 폴리펩티드 항체, (d) TAT-결합 올리고펩티드 또는 (e) TAT-결합 유기 소분자의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 암세포의 성장이 적어도 부분적으로는 TAT 폴리펩티드의 성장-증대 효과에 의존하는 암세포의 성장 억제 방법에 관한 것으로 (여기서, TAT 폴리펩티드는 암세포 자체 또는 암세포에 대해 성장-증대 효과를 나타내는 폴리펩티드(들)을 생성하는 세포에 의해 발현될 수 있음), 이 방법은 TAT 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자와 상기 TAT 폴리펩티드를 접촉시킴으로써 TAT 폴리펩티드의 성장-증대 활성을 길항하고, 이로써 암세포의 성장을 억제하는 것을 포함한다. 암세포의 성장은 완전히 억제되는 것이 바람직하다. 보다 더 바람직하게는, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자와 TAT 폴리펩티드의 결합은 암세포의 사멸을 유도한다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체이다. 임의로, 본 발명의 방법에 사용되는 항체, TAT 결합 올리고펩티드 및 TAT 결합 유기 분자는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신 등과 같은 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소 등에 접합될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체 및 TAT 결합 올리고펩티드는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 포유동물에서 종양의 성장이 적어도 부분적으로는 TAT 폴리펩티드의 성장-증대 효과에 의존하는 종양의 치료적 처치 방법에 관한 것으로, 이 방법은 포유동물에게 TAT 폴리펩티드에 결합하는 치료 유효량의 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자를 투여하여 상기 TAT 폴리펩티드의 성장-증대 활성을 길항함으로써 종양을 효과적으로 치료적으로 처치하는 것을 포함한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체이다. 임의로, 본 발명의 방법에 사용되는 항체, TAT 결합 올리고펩티드 및 TAT 결합 유기 분자는 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신 등과 같은 독소, 항생제, 방사성 동위원소 또는 핵산분해 효소 등에 접합될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체 및 올리고펩티드는 임의로 CHO 세포 또는 박테리아 세포에서 생성될 수 있다.
C. 다른 추가의 실시양태
추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 출원에 대한 하기 세트의 잠재적인 청구항에 관한 것이다.
1. (a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 분자;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 분자;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 DNA 분자;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 DNA 분자;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열;
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역; 또는
(g) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)의 상보체
와의 핵산 서열 동일성이 80％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산.
2. (a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열;
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역; 또는
(g) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)의 상보체
를 갖는 단리된 핵산.
3. (a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 핵산;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 핵산;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열;
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역; 또는
(g) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)의 상보체
에 혼성화되는 단리된 핵산.
4. 제3항에 있어서, 혼성화가 엄격한 조건하에 일어나는 것인 핵산.
5. 제3항에 있어서, 길이가 뉴클레오티드 약 5개 이상인 핵산.
6. 제1항, 제2항 또는 제3항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
7. 제6항에 있어서, 상기 핵산이 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동적으로 연결된 것인 발현 벡터.
8. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
9. 제8항에 있어서, CHO 세포, 이. 콜라이 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포.
10. 제8항의 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단 계, 및 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
11. (a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단리된 폴리펩티드.
12. (a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 단리된 폴리펩티드.
13. 이종 폴리펩티드에 융합된 제11항 또는 제12항의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드.
14. 제13항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드가 에피토프 태그 서열 또는 이뮤노글로불린의 Fc 영역인 키메라 폴리펩티드.
15. (a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체.
16. (a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메 인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 항체 단편인 항체.
19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 항체.
20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 성장 억제제에 접합된 항체.
21. 제15항 또는 제16항에 있어서, 세포독성제에 접합된 항체.
22. 제21항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
23. 제21항에 있어서, 세포독성제가 독소인 항체.
24. 제23항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
25. 제23항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 항체.
26. 제15항 또는 제16항에 있어서, 박테리아에서 생성된 항체.
27. 제15항 또는 제16항에 있어서, CHO 세포에서 생성된 항체.
28. 제15항 또는 제16항에 있어서, 결합하는 세포의 사멸을 유도하는 항체.
29. 제15항 또는 제16항에 있어서, 검출가능하게 표지된 항체.
30. 제15항 또는 제16항의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산.
31. 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동적으로 연결된 제30항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
32. 제31항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
33. 제32항에 있어서, CHO 세포, 이. 콜라이 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포.
34. 제32항의 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
35. (a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드에 결합하는 단리된 올리고펩티드.
36. (a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 단리된 올리고펩티드.
37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 성장 억제제에 접합된 올리고펩티드.
38. 제35항 또는 제36항에 있어서, 세포독성제에 접합된 올리고펩티드.
39. 제38항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 올리고펩티드.
40. 제38항에 있어서, 세포독성제가 독소인 올리고펩티드.
41. 제38항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 올리고펩티드.
42. 제40항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 올리고펩티드.
43. 제35항 또는 제36항에 있어서, 결합하는 세포의 사멸을 유도하는 올리고펩티드.
44. 제35항 또는 제36항에 있어서, 검출가능하게 표지된 올리고펩티드.
45. (a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드에 결합된 TAT 결합 유기 분자.
46. 제45항에 있어서,
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 유기 분자.
47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 성장 억제제에 접합된 유기 분자.
48. 제45항 또는 제46항에 있어서, 세포독성제에 접합된 유기 분자.
59. 제48항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 유기 분자.
50. 제48항에 있어서, 세포독성제가 독소인 유기 분자.
51. 제50항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 유기 분자.
52. 제50항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 유기 분자.
53. 제45항 또는 제46항에 있어서, 결합하는 세포의 사멸을 유도하는 유기 분자.
54. 제45항 또는 제46항에 있어서, 검출가능하게 표지된 유기 분자.
55. (a) 제11항의 폴리펩티드;
(b) 제12항의 폴리펩티드;
(c) 제13항의 키메라 폴리펩티드;
(d) 제15항의 항체;
(e) 제16항의 항체;
(f) 제35항의 올리고펩티드;
(g) 제36항의 올리고펩티드;
(h) 제45항의 TAT 결합 유기 분자; 또는
(i) 제46항의 TAT 결합 유기 분자
를 담체와 함께 포함하는 물질의 조성물.
56. 제55항에 있어서, 상기 담체가 제약상 허용되는 담체인 물질의 조성물.
57. (a) 용기; 및
(b) 이 용기에 함유된 제55항의 물질의 조성물
을 포함하는 제품.
58. 제57항에 있어서, 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 상기 물질의 조성물의 사용법을 설명하는, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물을 추가로 포함하는 제품.
59. 세포를 단백질에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이 때 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 상기 단백질에 결합하여 상기 세포의 성장을 억제하는,
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 발현시키는 세포의 성장을 억제하는 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
61. 제59항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 방법.
62. 제59항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 방법.
63. 제59항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 성장 억제제에 접합된 것인 방법.
64. 제59항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 세포독성제에 접합된 것인 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
66. 제64항에 있어서, 세포독성제가 독소인 방법.
67. 제66항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
68. 제66항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 방법.
69. 제59항에 있어서, 상기 항체가 박테리아에서 생성된 것인 방법.
70. 제59항에 있어서, 상기 항체가 CHO 세포에서 생성된 것인 방법.
71. 제59항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인 방법.
72. 제71항에 있어서, 상기 암 세포가 방사선 치료 또는 화학요법제에 추가로 노출된 것인 방법.
73. 제71항에 있어서, 상기 암 세포가 유방암 세포, 결장직장암 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 중추신경계암 세포, 간암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 자궁경부암 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
74. 제71항에 있어서, 상기 단백질이 동일한 조직 기원의 정상적인 세포에 비해 상기 암 세포에 의해 보다 풍부하게 발현된 것인 방법.
75. 제59항에 있어서, 상기 세포의 사멸을 유발하는 방법.
76. 상기 단백질이
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메 인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 것인 방법.
77. 단백질에 결합하는 치료 유효량의 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 포유동물에게 투여하여 상기 포유동물을 효과적으로 치료하는 단계를 포함하는,
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질을 발현시키는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물의 치료적 처치 방법.
78. 제77항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
79. 제77항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 방법.
80. 제77항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 방법.
81. 제77항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 성장 억제제에 접합된 것인 방법.
82. 제77항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 세포독성제에 접합된 것인 방법.
83. 제82항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
84. 제82항에 있어서, 세포독성제가 독소인 방법.
85. 제84항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
86. 제84항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 방법.
87. 제77항에 있어서, 상기 항체가 박테리아에서 생성된 것인 방법.
88. 제77항에 있어서, 상기 항체가 CHO 세포에서 생성된 것인 방법.
89. 제77항에 있어서, 상기 종양이 방사선 치료 또는 화학요법제에 추가로 노출된 것인 방법.
90. 제77항에 있어서, 상기 종양이 유방 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 중추신경계 종양, 간 종양, 방광 종양, 췌장 종양 또는 자궁경부 종양인 방법.
91. 제77항에 있어서, 상기 단백질이 동일한 조직 기원의 정상적인 세포에 비해 상기 종양의 암성 세포에 의해 더 풍부하게 발현된 것인 방법.
92. 제77항에 있어서, 상기 단백질이
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 것인 방법.
93. 샘플을 단백질에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자에 노출시키는 단계, 및 상기 샘플에서 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 상기 단백질의 결합 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 이 때 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 상기 단백질의 결합이 상기 샘플에 상기 단백질이 존재함을 나타내는,
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 샘플에서 단백질의 존재 여부를 결정하는 방법.
94. 제93항에 있어서, 상기 샘플이 상기 단백질을 발현시키는 것으로 추정되는 세포를 포함하는 것인 방법.
95. 제94항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인 방법.
96. 제93항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 검출가능하게 표지된 것인 방법.
97. 제93항에 있어서, 상기 단백질이
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 것인 방법.
98. (a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플, 및 상기와 동일한 조직 기원의 기지의 정상적인 세포의 대조군 샘플에서 측정하는 것을 포함하며, 이 때 시험 샘플에서의 상기 단백질 발현 수준이 대조군 샘플에 비해 더 높다는 것이 시험 샘플을 얻은 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는, 포유동물에서 종양의 존재를 진단하는 방법.
99. 제98항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정 단계가 계내 혼성화 또는 RT-PCR 분석에 올리고뉴클레오티드를 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
100. 제98항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정 단계가 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯 분석에 항체를 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
101. 제98항에 있어서, 상기 단백질이
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 것인 방법.
102. 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플을
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 접촉시키는 단계, 및
시험 샘플에서 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 상기 단백질 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이 때 복합체의 형성이 상기 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는, 포유동물에서 종양의 존재를 진단하는 방법.
103. 제102항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 검출가능하게 표지된 것인 방법.
104. 제102항에 있어서, 조직 세포의 상기 시험 샘플이 암성 종양을 갖는 것으로 추정되는 개체로부터 얻은 것인 방법.
105. 제102항에 있어서, 상기 단백질이
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 것인 방법.
106. 유효량의 단백질의 길항제를 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하여 상기 세포 증식성 장애를 효과적으로 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는,
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질의 발현 또는 활성의 증가와 관련된 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
107. 제106항에 있어서, 상기 세포 증식성 장애가 암인 방법.
108. 제106항에 있어서, 상기 길항제가 항-TAT 폴리펩티드 항체, TAT 결합 올리고펩티드, TAT 결합 유기 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
109. 세포를 단백질에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 접촉시키는 단계, 및 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 상기 단백질에 결합되도록 하여 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 상기 세포에 결합시키는 단계를 포함하는, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질을 발현시키는 세포에 결합시키는 방법.
110. 제109항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
111. 제109항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 방법.
112. 제109항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 방법.
113. 제109항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 성장 억제제에 접합된 것인 방법.
114. 제109항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 세포독성제에 접합된 것인 방법.
115. 제114항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
116. 제114항에 있어서, 세포독성제가 독소인 방법.
117. 제116항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
118. 제116항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 방법.
119. 제109항에 있어서, 상기 항체가 박테리아에서 생성된 것인 방법.
120. 제109항에 있어서, 상기 항체가 CHO 세포에서 생성된 것인 방법.
121. 제109항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인 방법.
122. 제121항에 있어서, 상기 암 세포가 방사선 치료 또는 화학요법제에 추 가로 노출된 것인 방법.
123. 제121항에 있어서, 상기 암 세포가 유방암 세포, 결장직장암 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 중추신경계암 세포, 간암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 자궁경부암 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
124. 제123항에 있어서, 상기 단백질이 동일한 조직 기원의 정상적인 세포에 비해 상기 종양의 암성 세포에 의해 더 풍부하게 발현된 것인 방법.
125. 제109항에 있어서, 상기 세포의 사멸을 유발하는 방법.
126. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제5항 또는 제30항 중 어느 한 항에 청구된 핵산의 용도.
127. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제5항 또는 제30항 중 어느 한 항에 청구된 핵산의 용도.
128. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제5항 또는 제30항 중 어느 한 항에 청구된 핵산의 용도.
129. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제6항, 제7항 또는 제31항 중 어느 한 항에 청구된 발현 벡터의 용도.
130. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제6항, 제7항 또는 제31항 중 어느 한 항에 청구된 발현 벡터의 용도.
131. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제6항, 제7항 또는 제31항 중 어느 한 항에 청구된 발현 벡터의 용도.
132. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제8항, 제9항, 제32항 또는 제33항 중 어느 한 항에 청구된 숙주 세포의 용도.
133. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제8항, 제9항, 제32항 또는 제33항 중 어느 한 항에 청구된 숙주 세포의 용도.
134. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제8항, 제9항, 제32항 또는 제33항 중 어느 한 항에 청구된 숙주 세포의 용도.
135. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 청구된 폴리펩티드의 용도.
136. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 청구된 폴리펩티드의 용도.
137. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 청구된 폴리펩티드의 용도.
138. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체의 용도.
139. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체의 용도.
140. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체의 용도.
141. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 청구된 올리고펩티드의 용도.
142. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 청구된 올리고펩티드의 용도.
143. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 청구된 올리고펩티드의 용도.
144. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 청구된 TAT 결합 유기 분자의 용도.
145. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 청구된 TAT 결합 유기 분자의 용도.
146. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 청구된 TAT 결합 유기 분자의 용도.
147. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제55항 또는 제56항에 청구된 물질의 조성물의 용도.
148. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제55항 또는 제56항에 청구된 물질의 조성물의 용도.
149. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제55항 또는 제56항에 청구된 물질의 조성물의 용도.
150. 암의 치료적 처치 또는 진단적 검출을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제57항 또는 제58항에 청구된 제품의 용도.
151. 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제57항 또는 제58항에 청구된 제품의 용도.
152. 세포 증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 제57항 또는 제58항에 청구된 제품의 용도.
153. 단백질을 상기 단백질에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 세포의 성장이 적어도 부분적으로는
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질의 성장-증대 효과에 의존하는 세포의 성장 억제 방법.
154. 제153항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인 방법.
155. 제153항에 있어서, 상기 단백질이 상기 세포에 의해 발현된 것인 방법.
156. 제153항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 상기 단백질의 결합이 상기 단백질의 세포 성장-증대 활성을 길항하는 것인 방법.
157. 제153항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 상기 단백질의 결합이 상기 세포의 사멸을 유도하는 것인 방법.
158. 제153항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
159. 제153항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 방법.
160. 제153항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 방법.
161. 제153항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 성장 억제제에 접합된 것인 방법.
162. 제153항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 세포독성제에 접합된 것인 방법.
163. 제162항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
164. 제162항에 있어서, 세포독성제가 독소인 방법.
165. 제164항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
166. 제164항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 방법.
167. 제153항에 있어서, 상기 항체가 박테리아에서 생성된 것인 방법.
168. 제153항에 있어서, 상기 항체가 CHO 세포에서 생성된 것인 방법.
169. 제153항에 있어서, 상기 단백질이
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 것인 방법.
170. 단백질을 상기 단백질에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 접촉시켜 종양을 효과적으로 치료하는 단계를 포함하는, 상기 종양의 성장이 적어도 부분적으로는
(a) 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드
와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 단백질의 성장-증대 효과에 의존하는 포유동물에서의 종양의 치료적 처치 방법.
171. 제170항에 있어서, 상기 단백질이 상기 종양의 세포에 의해 발현된 것인 방법.
172. 제170항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자와 상기 단백질의 결합이 상기 단백질의 세포 성장-증대 활성을 길항하는 것인 방법.
173. 제170항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
174. 제170항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 방법.
175. 제170항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 방법.
176. 제170항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 성장 억제제에 접합된 것인 방법.
177. 제170항에 있어서, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자가 세포독성제에 접합된 것인 방법.
178. 제177항에 있어서, 상기 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
179. 제177항에 있어서, 세포독성제가 독소인 방법.
180. 제179항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
181. 제179항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 방법.
182. 제170항에 있어서, 상기 항체가 박테리아에서 생성된 것인 방법.
183. 제170항에 있어서, 상기 항체가 CHO 세포에서 생성된 것인 방법.
184. 제170항에 있어서, 상기 단백질이
(a) 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(b) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 아미노산 서열;
(c) 결합된 신호 펩티드가 있는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(d) 결합된 신호 펩티드가 없는, 서열 2로 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열;
(e) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 또는
(f) 서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열
을 갖는 것인 방법.
186. 표 11에 나타낸 임의의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
187. 제186항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
188. 제186항에 있어서, 항체 단편인 항체.
189. 제186항에 있어서, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 항체.
190. 제186항에 있어서, 성장 억제제에 접합된 항체.
191. 제186항에 있어서, 세포독성제에 접합된 항체.
192. 제191항에 있어서, 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
193. 제191항에 있어서, 세포독성제가 독소인 항체.
194. 제193항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
195. 제193항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 항체.
196. 제186항에 있어서, 박테리아에서 생성된 항체.
197. 제186항에 있어서, CHO 세포에서 생성된 항체.
198. 제186항에 있어서, 결합하는 세포의 사멸을 유도하는 항체.
199. 제186항에 있어서, 검출가능하게 표지된 항체.
200. 제186항에 있어서, 표 11에 나타낸 임의의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 임의의 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체.
201. 표 11에 나타낸 임의의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체.
202. TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포.
203. 표 11에 나타낸 임의의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 제2 항체가 TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 것을 차단하는 제1 항체의 능력을 결정하는 단계를 포함하며, 이 때 상기 제2 항체가 상기 TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 것을 40％ 이상으로 및 동일한 항체 농도로 차단하는 상기 제1 항체의 능력이 상기 제1 항체가 상기 제2 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 나타내는, 표 11에 나타낸 임의의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 항체를 확인하는 방법.
본 발명의 또다른 실시양태는 본 명세서를 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1A 내지 1E는 TAT10772 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타내며, 여기서 서열 1은 본원에서 "DNA772"로 명명된 클론이다.
도 2A 내지 2B는 도 1에 나타낸 서열 1의 코딩 서열로부터 유래되는 아미노산 서열 (서열 2)를 나타낸다.
도 3은 하기 가변 경쇄의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다: 경쇄 인간 하위군 I 컨센서스(consensus) 서열 (huKI; 서열 3), 뮤린 11D10 항-TAT10772 항체 (mu11D10-L; 서열 4) 및 11D10 항-TAT10772 그래프트된 "인간화" 항체 (11D10-그래프트; 서열 5).
도 4는 하기 가변 중쇄의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다: 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 서열 (hum III; 서열 6), 뮤린 11D10 항-TAT10772 항체 (mu11D10-H; 서열 7) 및 11D10 항-TAT10772 그래프트된 "인간화" 항체 (11D10-그래프트; 서열 8).
도 5는 하기 가변 경쇄의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다: 경쇄 인간 하위 군 I 컨센서스 서열 (huKI; 서열 3), 뮤린 3A5 항-TAT10772 항체 (mu3A5-L; 서열 9) 및 3A5 항-TAT10772 그래프트된 "인간화" 항체 (3A5-그래프트; 서열 10).
도 6A 내지 6B는 하기 가변 중쇄의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다: 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 서열 (hum III; 서열 6), 뮤린 3A5 항-TAT10772 항체 (mu3A5-H; 서열 11), 3A5 항-TAT10772 그래프트된 "인간화" 항체 "L 변이체" (3A5.L-그래프트; 서열 12) 및 3A5 항-TAT10772 그래프트된 "인간화" 항체 "F 변이체" (3A5.F-그래프트; 서열 13).
도 7은 선택적 친화도-성숙 11D10-유래 항체의 다양한 HVR-L1 서열 (서열 14 내지 34)을 나타낸다.
도 8은 선택적 친화도-성숙 11D10-유래 항체의 다양한 HVR-L2 서열 (서열 35 내지 58)을 나타낸다.
도 9는 선택적 친화도-성숙 11D10-유래 항체의 다양한 HVR-L3 서열 (서열 59 내지 73)을 나타낸다.
도 10은 선택적 친화도-성숙 11D10-유래 항체의 다양한 HVR-H1 서열 (서열 74 내지 93)을 나타낸다.
도 11은 선택적 친화도-성숙 11D10-유래 항체의 다양한 HVR-H2 서열 (서열 94 내지 112)을 나타낸다.
도 12는 선택적 친화도-성숙 11D10-유래 항체의 다양한 HVR-H3 서열 (서열 113 내지 118)을 나타낸다.
도 13은 선택적 친화도-성숙 3A5-유래 항체의 HVR-L1 서열 (서열 119)을 나 타낸다.
도 14는 선택적 친화도-성숙 3A5-유래 항체의 다양한 HVR-L2 서열 (서열 120 내지 121)을 나타낸다.
도 15는 선택적 친화도-성숙 3A5-유래 항체의 HVR-L2 서열 (서열 122)을 나타낸다.
도 16은 선택적 친화도-성숙 3A5-유래 항체의 HVR-H1 서열 (서열 123)을 나타낸다.
도 17은 선택적 친화도-성숙 3A5-유래 항체의 다양한 HVR-H2 서열 (서열 124 내지 127)을 나타낸다.
도 18A 내지 18B는 선택적 친화도-성숙 3A5-유래 항체의 다양한 HVR-H3 서열 (서열 128 내지 183)을 나타낸다.
도 19는 본 발명을 실시하는데 하기의 서열 인식자를 사용하기 위한 예시적인 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 나타낸다: 인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트(Kabat) CDR (서열 184), 인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 185-187), 인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트 CDR (서열 188), 인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 189-191), 인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트 CDR "L-변이체" (서열 192) 및 인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트 CDR "F-변이체" (서열 193).
도 20은 본 발명을 실시하는데 하기의 서열 인식자를 사용하기 위한 예시적 인 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 나타낸다: 인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트 CDR (서열 194), 인간 VL 카파 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트 CDR (서열 195), 인간 VL 카파 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트 CDR (서열 196) 및 인간 VL 카파 하위군 IV 컨센서스 프레임워크 마이너스 코바트 CDR (서열 197).
도 21A 내지 21B는 하기 항체에 대한 완전 가변 중쇄 서열을 나타낸다: 3A5v1 (서열 198), 3A5v2 (서열 199), 3A5v3 (서열 200), 3A5v4 (서열 201), 3A5v5 (서열 202), 3A5v6 (서열 203), 3A5v7 (서열 204), 3A5v8 (서열 205), 3A5v1b.52 (서열 206), 3A5v1b.54 (서열 207), 3A5v4b.52 (서열 208) 및 3A5v4b.54 (서열 209). 이들 항체 모두는 서열 3의 huKI 가변 경쇄 아미노산 서열을 함유한다.
도 22는 본원에 기재된 특정 항-TAT10772에 사용된 완전 가변 경쇄 서열 (서열 210-211)을 나타낸다.
도 23은 루테늄-표지된 키메라 3A5의 비오티닐화 5'-도메인 TAT10772 폴리펩티드 표적으로의 결합을 억제하는 다양한 인간화 3A5 항체의 능력을 나타낸다. "h2H7 ctr"은 TAT10772에 특이적으로 결합하지 않는 음성 대조군 항체이다.
도 24는 루테늄-표지된 키메라 3A5의 비오티닐화 CA125 폴리펩티드로의 결합을 억제하는 다양한 인간화 3A5 항체의 능력을 나타낸다. "h2H7 ctr"은 TAT10772에 특이적으로 결합하지 않는 음성 대조군 항체이다.
도 25는 OVCAR-3 세포로의 결합을 측정하기 위해 다양한 인간화 3A5 항체를 이용하는 ELISA 분석의 결과를 나타낸다. "h2H7 ctr"은 TAT10772에 특이적으로 결 합하지 않는 음성 대조군 항체이다.
도 26은 키메라 11D10-vc-MMAF 또는 키메라 3A5-vc-MMAF 항체로 처리한 OVCAR-3 세포 (TAT10772 폴리펩티드를 내재적으로 발현함)의 시험관내 증식을 나타낸다.
도 27은 키메라 11D10-vc-MMAE 또는 키메라 3A5-vc-MMAE 항체로 처리한 OVCAR-3 세포 (TAT10772 폴리펩티드를 내재적으로 발현함)의 시험관내 증식을 나타낸다.
도 28은 키메라 11D10-MC-MMAF 또는 키메라 3A5-MC-MMAF 항체로 처리한 OVCAR-3 세포 (TAT10772 폴리펩티드를 내재적으로 발현함)의 시험관내 증식을 나타낸다.
도 29는, 키메라 11D10-vc-MMAF 또는 키메라 3A5-vc-MMAF 항체로 처리한 TAT10772 폴리펩티드를 발현시키기 위해 벡터로 감염시킨 PC3 세포 (PC3/A5.3B2), 또는 TAT10772 폴리펩티드를 발현하지 않는 PC3 세포 (PC3/neo)의 시험관내 증식을 나타낸다.
도 30은 키메라 11D10-vc-PAB-MMAE 또는 키메라 3A5-vc-PAB-MMAE 항체로 처리한 TAT10772 폴리펩티드를 발현시키기 위해 벡터로 감염시킨 PC3 세포 (PC3/A5.3B2), 또는 TAT10772 폴리펩티드를 발현하지 않는 PC3 세포 (PC3/neo)의 시험관내 증식을 나타낸다.
도 31은 키메라 11D10-MC-MMAF 또는 키메라 3A5-MC-MMAF 항체로 처리한 TAT10772 폴리펩티드를 발현시키기 위해 벡터로 감염시킨 PC3 세포 (PC3/A5.3B2), 또는 TAT10772 폴리펩티드를 발현하지 않는 PC3 세포 (PC3/neo)의 시험관내 증식을 나타낸다.
도 32는 다양한 독소-접합된 키메라 3A5 항체, 대조군 항체 또는 비히클 단독을 처리한 PC3/A5.3B2-유래 종양의 생체내 평균 종양 부피 측정값 (피하 주사 모델)을 나타낸다.
도 33은 다양한 독소-접합된 키메라 3A5 항체, 대조군 항체 또는 비히클 단독을 처리한 OVCAR-3-유래 종양의 생체내 평균 종양 부피 측정값 (유지방 패드 이식 SCID 베이지 마우스 모델)을 나타낸다.
도 34는 다양한 독소-접합된 키메라 3A5 항체, 대조군 항체 또는 비히클 단독을 처리한 OVCAR-3-유래 종양의 생체내 평균 종양 부피 측정값 (유지방 패드 이식 SCID 베이지 마우스 모델)을 나타낸다.
도 35는 다양한 독소-접합된 키메라 3A5 항체, 대조군 항체 또는 비히클 단독을 처리한 OVCAR-3-유래 종양의 생체내 평균 종양 부피 측정값 (유지방 패드 이식 SCID 베이지 마우스 모델)을 나타낸다.
도 36은 다양한 독소-접합된 키메라 3A5 항체, 대조군 항체 또는 비히클 단독을 처리한 PC3/A5.3B2-유래 종양의 생체내 평균 종양 부피 측정값 (누드 마우스의 이종이식 종양, 마우스 당 1억개의 세포)을 나타낸다.
도 37은 다양한 독소-접합된 키메라 3A5 항체, 대조군 항체 또는 비히클 단독을 처리한 OVCAR-3-유래 종양의 생체내 평균 종양 부피 측정값 (유지방 패드 이식 SCID 베이지 마우스 모델)을 나타낸다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "TAT 폴리펩티드" 및 "TAT"는 바로 뒤에 지정된 숫자에 따라 다양한 폴리펩티드를 나타내는데, 완전한 명칭 (즉, TAT/숫자)은 본원에 기재된 특정 폴리펩티드 서열을 나타낸다. 용어 "TAT/숫자 폴리펩티드" 및 "TAT/숫자"에서 용어 "숫자"는 실제 본원에서 지정한 번호를 사용하여 나타내며, 이는 천연 서열 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 및 상기 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편 (본원에서 추가로 정의함)를 포함한다. 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드는 인간 조직 유형 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "TAT 폴리펩티드"는 본원에 개시된 개별 TAT/숫자 폴리펩티드 각각을 나타낸다. 본 명세서에서 "TAT 폴리펩티드"를 언급하고 있는 모든 개시 내용은 상기 폴리펩티드 각각을 개별적으로 또는 통칭하여 나타낸 것이다. 예를 들어, TAT 폴리펩티드의 제조, 그의 정제, 그의 유도, 그에 대한 항체의 형성, 그에 대한 TAT 결합 올리고펩티드의 형성, 그에 대한 TAT 결합 유기 분자의 형성, 그의 투여, 그를 함유하는 조성물, 그를 사용한 질환 치료 등에 대한 기재는 본 발명의 폴리펩티드 각각에 개별적으로 해당된다. 용어 "TAT 폴리펩티드"는 또한 본원에 개시된 TAT/숫자 폴리펩티드의 변이체도 포함한다.
"천연 서열 TAT 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 TAT 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 TAT 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조될 수도 있다. 용어 "천연 서열 TAT 폴리펩티드"는 구체적으로는 특정 TAT 폴리펩티드의 자연 발생적인 말단절단된 (truncated) 형태 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 자연 발생적인 변이체 형태 (예를 들어, 다르게 스플라이싱된 형태) 및 상기 폴리펩티드의 자연 발생적인 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 천연 서열 TAT 폴리펩티드는 첨부된 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙한 천연 서열 폴리펩티드 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 출발 및 정지 코돈은 (표시되어 있는 경우) 도면에 볼드체와 밑줄로 표시된다. 첨부된 도면에 "N" 또는 "X"로 표시된 핵산 잔기는 임의의 핵산 잔기이다. 첨부된 도면에 개시된 TAT 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 지정된 메티오닌 잔기로부터 시작되는 것으로 나타내었으나, 도면에서의 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 다른 메티오닌 잔기를 TAT 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로 이용할 수 있다는 점도 고려되어야 하며, 이 또한 가능하다.
TAT 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 도메인 및 세포질 도메인이 없는 TAT 폴리펩티드 형태를 나타낸다. 본래, TAT 폴리펩티드 ECD는 1％ 미만의 막횡단 도메인 및/또는 세포질 도메인을 가질 것이며, 바람직하게는 상기 도메인(들)을 0.5％ 미만으로 가질 것이다. 본 발명의 TAT 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인은 소수성 도메인의 유형을 밝히는데 있어 당업계에 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된 것임이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 경우에 따라 다를 수 있지만, 본원에서 처음 확인된 바와 같이 상기 도메인의 각 말단에 위치한 약 5개 이하의 아미노산 내에 존재할 가능성이 가장 크다. 따라서, 임의의 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인은 실시예 또는 명세서에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인 경계의 각 국면에 위치한 약 5개 이하의 아미노산을 함유할 수 있고, 연결된 신호 펩티드가 있거나 없는 이러한 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는 핵산이 본 발명에 포함된다.
본원에 개시된 다양한 TAT 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 본 명세서 및/또는 첨부된 도면에 나타낼 수 있다. 그러나, 신호 펩티드의 C-말단 경계는 경우에 따라 다를 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 바와 같이 신호 펩티드 C-말단 경계의 각 국면에 위치한 약 5개 이하의 아미노산 내에 존재할 가능성이 가장 크며, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 아미노산 서열 요소의 유형을 확인하는데 있어 당업계에 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인될 수 있음을 유의한다 (예를 들어, 문헌 [Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997)] 및 [von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)] 참조). 또한, 몇몇 경우에는 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열이 전체적으로 일정하게 절단되지 않아 분비된 폴리펩티드가 1종 이상 생성되는 것으로 인지된다. 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단 경계의 각 국면에 위치한 약 5개 이하의 아미노산 내에서 신호 펩티드가 절단된 성숙한 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 고려된다.
"TAT 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편 (예컨대, 전장 TAT 폴리펩티드의 완전한 코딩 서열의 일부만을 갖는 핵산에 의해 코딩된 단편)과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인, 본원에 정의된 바와 같은 TAT 폴리펩티드, 바람직하게는 활성 TAT 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 TAT 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어 전장 천연 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 TAT 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, TAT 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 서열의 특정된 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상일 것이다. 통상적으로, TAT 변이체 폴리펩티드의 길이는 아미노산 약 10개 이상, 다르게는 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개 이상이다. 임의로, TAT 변이체 폴리펩티드에는 천연 TAT 폴리펩티드 서열에 비해 하나를 넘지 않는 보존적 아미노산 치환이 포함되거나, 다르게는 천연 TAT 폴리펩티드 서열에 비해 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환이 포함될 것이다.
본원에서 확인된 TAT 폴리펩티드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성(％)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우에는 최대 서열 동일성(％)을 얻기 위해 갭 (gap)을 도입시킨 후에, 임의의 보존적 치환을 동일한 서열의 일부로서 고려하지 않은 상태에서, 특정 TAT 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의한다. 아미노산 서열 동일성(％)을 측정하기 위한 목적에 있어서, 정렬은 당업계의 기술범위에 속하는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린 (Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적에 있어서 아미노산 서열 동일성(％) 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 구하고, 이 때 상기 ALIGN-2 프로그램의 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 제공되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.에 의해 개발된 것으로, 하기 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 워싱턴 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서로 제출되어 있으며, 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 하기 표 1에 제공된 원시 코드로부터 컴파일할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 사용할 수 있도록 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산의 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％), 상기 서열 A의 상기 서열 B와의 아미노산 서열 동일성(％), 또는 상기 서열 B에 비한 상기 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％) (주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 비해 소정의 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 달리 표현할 수도 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y×100
여기서, X는 서열 A 및 B를 프로그램에 의해 정렬하였을 때 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 서열 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, 서열 B에 대한 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％)은 서열 A에 대한 서열 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 동일하지 않음을 이해해야 할 것이다. 상기 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성(％) 계산의 예로서, 표 2 및 표 3은 "TAT"로 지칭되는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭되는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성(％)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서 "TAT"는 가상의 대상 TAT 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 대상 "TAT" 폴리펩티드와 비교할 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가상의 아미노산 잔기를 나타낸다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성(％) 값은 앞 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다.
"TAT 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "TAT 변이체 핵산 서열"은, 본원에 정의된 바와 같은 TAT 폴리펩티드 (바람직하게는, 활성 TAT 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 분자를 의미하며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편 (예컨대, 전장 TAT 폴리펩티드의 완전한 코딩 서열의 일부만을 갖는 핵산에 의해 코딩된 단편)을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상이다. 통상적으로, TAT 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 TAT 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 서열이 있거나 없는 TAT 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상일 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상적으로, TAT 변이체 폴리뉴클레오티드의 길이는 뉴클레오티드 약 5개 이상, 다르게는 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개, 810개, 820개, 830개, 840개, 850개, 860개, 870개, 880개, 890개, 900개, 910개, 920개, 930개, 940개, 950개, 960개, 970개, 980개, 990개 또는 1,000개 이상이며, 여기서 용어 "약"은 문맥상 언급된 뉴클레오티드 서열 길이±언급된 길이의 10％를 의미한다.
본원에서 확인된 TAT-코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성(％)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우에는 최대 서열 동일성(％)을 얻기 위해 갭을 도입시킨 후에, 대상 TAT 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의한다. 핵산 서열 동일성(％)을 측정하기 위한 목적에 있어서, 정렬은 당업계의 기술 범위에 속하는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린 (DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적에 있어서 핵산 서열 동일성(％) 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 구하고, 이 때 ALIGN-2 프로그램의 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 제공되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.에 의해 개발된 것으로, 하기 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 워싱턴 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서로 제출 되어 있으며, 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 하기 표 1에 제공된 원시 코드로부터 컴파일할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 사용될 수 있도록 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 핵산 서열의 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 핵산 서열 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성(％), 상기 서열 D의 상기 서열 C와의 핵산 서열 동일성(％), 또는 상기 서열 D에 비한 상기 서열 C의 핵산 서열 동일성(％) (주어진 핵산 서열 D에 대해, 상기 서열 D와, 또는 상기 서열 D에 비해 소정의 핵산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C라는 어구로 달리 표현할 수도 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z×100
여기서, W는 서열 C 및 서열 D를 프로그램에 의해 정렬하였을 때 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 서열 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, 서열 D에 대한 서열 C의 핵산 서열 동일성(％)은 서열 C에 대한 서열 D의 핵산 서열 동일성(％)과 동일하지 않음이 이해될 것이다. 핵산 서열 동일성(％) 계산법의 예로서, 표 4 및 5는 "TAT-DNA"로 지칭되는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭되는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성(％)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서 "TAT-DNA"는 가상의 대상 TAT-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 대상 "TAT-DNA" 핵산 분자와 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가상의 뉴클레오티드를 나타낸다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성(％) 값은 바로 앞 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다.
다른 실시양태에서, TAT 변이체 폴리뉴클레오티드는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건 및 세척 조건하에 본원에 개시된 바와 같은 전장 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있다. TAT 변이체 폴리펩티드는 TAT 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
용어 "전장 코딩 영역"은, TAT 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 관련하여 사용되는 경우, 본 발명의 전장 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다 (첨부된 도면에서 종종 출발 및 정지 코돈 사이에 포함시켜 나타냄). 용어 "전장 코딩 영역"은, ATCC에 기탁된 핵산과 관련하여 사용되는 경우, ATCC에 기탁된 벡터에 삽입된 cDNA의 TAT 폴리펩티드-코딩 부분을 나타낸다 (첨부된 도면에서 종종 개시 및 정지 코돈 사이에 포함시켜 나타냄).
"단리된"은, 본원에 개시된 다양한 TAT 폴리펩티드를 기재하는데 사용되는 경우, 천연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 상기 폴리펩티드의 천연 환경의 오염 성분은 상기 폴리펩티드가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 15개 이상 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 (Coomassie Blue) 염색, 바람직하게는 은 염색을 이용하여 비-환원 또는 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만이 나타나는 정도로 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포내에 본래의 폴리펩티드를 포함하는데, 이는 TAT 폴리펩티드의 천연 환경의 성분이 1종 이상 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" TAT 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 다른 폴리펩티드-코딩 핵산은 상기 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 공급원 내에서 통상적으로 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 자연계에서 발견되는 형태 또는 환경과는 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는, 예를 들어 천연 세포의 경우와는 상이한 염색체 위치에 존재하며, 통상적으로는 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 함유된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 포함한다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보좀 결합 부위는 번역이 용이하도록 배치된 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 연속적으로 배치되는 것을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 연속적으로 배치될 뿐만 아니라 리딩 프레임에 맞게 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적으로 배치될 필요가 없다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서 라이게이션시킴으로써 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로, 프로브의 길이가 길수록 적절한 어닐링에 요구되는 온도가 더 높고, 프로브의 길이가 짧을수록 요구되는 온도가 더 낮다. 일반적으로, 혼성화는 상보적인 가닥들이 자신의 융점보다 낮은 환경에 존재할 때 다시 어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브에 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대 온도가 높아진다. 결과적으로, 상대 온도가 높아질수록 반응 조건은 보다 엄격해지는 경향이 있는 반면, 상대 온도가 낮을수록 반응 조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련된 보다 상세한 사항 및 설명은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조한다.
본원에 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고엄격 조건"은 (1) 세척시 이온 농도가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들어 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 사용하는 조건, (2) 혼성화시키는 동안 42 ℃에서 포름아미드, 예를 들어 0.1％ 소혈청 알부민/0.1％ 피콜(Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 함유하는 50％ (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 또는 (3) 42 ℃에서 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5×덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/mL), 0.1％ SDS 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하여 용액 중에서 밤새 혼성화한 다음, 42 ℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)로 10분 동안 세척한 후에, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1×SSC를 이용하여 10분 동안 고엄격 세척을 수행하는 조건으로 규정할 수 있다.
"중간 정도의 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있으며, 상기한 것보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 농도 및 SDS의 비율(％))의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5×SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5×덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 연어 정자의 20 mg/mL 절단된 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37 ℃로 밤새 인큐베이션한 후, 필터를 약 37 내지 50 ℃에서 1×SSC로 세척하는 조건이다. 당업자라면, 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞춰 필요한 온도, 이온 농도 등을 조정하는 방법을 인지하고 있을 것이다.
용어 "에피토프 태그가 부착된"은, 본원에 사용된 경우, "태그 폴리펩티드"에 융합된 TAT 폴리펩티드 또는 항-TAT 항체를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 나타낸다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 융합될 TAT 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않도록 아주 독특한 것이 바람직하다. 일반적으로, 적합한 태그 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 6개 이상이며, 보통은 약 8 내지 50개 (바람직하게는, 약 10 내지 20개)이다.
본원의 목적에 있어서, "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연 발생 TAT의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유하는 TAT 폴리펩티드 형태(들)을 나타내는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생 TAT에 존재하는 항원성 에피토프에 대한 항체 제조를 유도하는 능력이 아니라, 천연 또는 자연 발생 TAT에 의해 유발된 생물학적 기능 (억제 기능 또는 자극 기능)을 나타내며, "면역학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생 TAT에 존재하는 항원성 에피토프에 대한 항체의 제조를 유도하는 능력을 나타낸다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 TAT 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 이와 유사한 방식으로, 용어 "효능제"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 TAT 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자는, 구체적으로 효능제 또는 길항제의 항체 또는 항체 단편, 천연 TAT 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자 등을 포함한다. TAT 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법은 TAT 폴리펩티드를 후보 효능제 분자 또는 후보 길항제 분자와 접촉시키는 단계, 및 정상적으로 결합된 TAT 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
"치료하는", "치료" 또는 "완화"는 치료적 처치와 예방 조치 또는 방지 조치 모두를 나타내는데, 이는 표적화된 병리학적 증상 또는 장애를 예방하거나 경감 (감소)시키는 것이 목적이다. 치료가 필요한 대상에는 이미 장애를 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 장애에 걸리기 쉬운 대상 또는 장애가 예방되어야 하는 대상도 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 치료량의 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자가 투여된 후에, 암세포 수의 감소 또는 암세포의 부재; 종양 크기의 감소; 연부 조직 및 뼈로 암이 전이되는 것을 비롯한, 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및/또는 특정 암과 관련된 1종 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감; 이환율 및 사망률 감소; 및 삶의 질 개선 중 하나 이상이 환자에서 관찰가능하고/하거나 측정가능한 정도로 감소되거나 나타나지 않는 경우가 상기 대상체 또는 포유동물이 TAT 폴리펩티드-발현 암에 대해 성공적으로 "치료된" 경우이다. 항-TAT 항체 또는 TAT 결합 올리고펩티드는 기존 암세포의 성장을 방해하고/하거나 기존 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도일 때 세포정지 및/또는 세포독성을 나타낼 수 있다. 이러한 징후 또는 증상의 감소는 환자도 느낄 수 있다.
질환의 성공적인 치료 및 호전을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 공지된 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 측정할 수 있다. 암 요법의 경우, 효능은, 예를 들어 질환 진행에 소요되는 시간 (TTP)을 평가하고/하거나 반응률 (RR)을 측정함으로써 결정할 수 있다. 전이는 질병단계 결정 시험, 및 칼슘 수준 및 다른 효소에 대한 뼈 스캔 및 시험을 통해 측정함으로써 암이 뼈로 전이되었는지 여부를 결정할 수 있다. CT 스캔을 수행하여 골반 및 림프절 부위에 전이되었는지 여부를 알아볼 수도 있다. 흉부 X-선 및 공지된 방법에 의한 간 효소 수준의 측정을 이용하여 폐 및 간 각각에 전이되었는지 여부를 확인한다. 상기 질환을 모니터링하기 위한 다른 통상적인 방법은 경직장 초음파검사법 (TRUS) 및 경직장 침 생검법 (TRNB)을 포함한다.
"장기" 투여는 초기 치료 효과 (활성)가 연장된 기간 동안 유지되도록 단기 투여 방식과는 반대로 제제(들)을 연속적인 방식으로 투여하는 것을 나타낸다. "간헐적" 투여는 중단하지 않고 연속해서 투여하는 것이 아니라 주기적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 치료법이다.
암을 치료하거나, 암의 증상을 완화시키거나, 또는 암을 진단하기 위한 목적에 있어서, "포유동물"은 인간, 가축 및 축산용 동물, 동물원 동물, 경기용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯한 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 나타낸다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
1종 이상의 추가의 치료제와의 "병용" 투여는 동시에 (함께) 투여하는 것 및 임의의 순서대로 연속적으로 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "담체"는 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함하며, 이들은 사용되는 투여량 및 농도에서 이들에 노출된 세포 또는 포유동물에 무독성이다. 흔히, 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예로는 인산염, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 및/또는 트윈 (TWEEN; 등록상표), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스 (PLURONICS; 등록상표)와 같은 비이온성 계면활성제가 있다.
"고상(solid phase)" 또는 "고체 지지체"는 본 발명의 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자가 접착 또는 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고상의 예로는, 부분적으로 또는 완전하게, 유리 (예를 들어, 제어된 공극 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 고상이 있다. 특정 실시양태에서, 고상은 문맥상 분석용 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서의 고상은 정제용 컬럼 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 개별 입자의 비연속적 고상을 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예컨대, TAT 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체, 또는 TAT 결합 올리고펩티드)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 소형 소포체이다. 통상적으로, 리포좀의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다.
"소"분자 또는 유기 "소"분자는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의된다.
본원에 개시된 폴리펩티드, 항체, TAT 결합 올리고펩티드, TAT 결합 유기 분자 또는 이들의 효능제 또는 길항제의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. 언급된 목적과 관련하여, "유효량"은 경험적으로 및 통상적인 방식으로 결정할 수 있다.
용어 "치료 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애의 "치료"에 효과적인 항체, 폴리펩티드, TAT 결합 올리고펩티드, TAT 결합 유기 분자 또는 다른 약물의 양을 나타낸다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암세포 수의 감소; 종양 크기의 감소; 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및/또는 암과 관련된 1종 이상의 징후의 어느 정도까지의 완화를 가능하게 할 수 있다. 본원의 "치료"에 대한 정의를 참조한다. 약물이 기존 암세포의 성장을 방해하고/하거나 기존 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도일 때 세포정지 및/또는 세포독성을 나타낼 수 있다.
항-TAT 항체, TAT 폴리펩티드, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자의 "성장 억제량"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 종양 세포, 예를 들어 암세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물 세포의 성장을 억제하기 위한 목적에 있어서, 항-TAT 항체, TAT 폴리펩티드, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자의 "성장 억제량"은 경험적으로 및 통상적인 방식에 의해 결정할 수 있다.
항-TAT 항체, TAT 폴리펩티드, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자의 "세포독성량"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 종양 세포, 예를 들어 암세포의 파괴를 유발할 수 있는 양이다. 신생물 세포의 성장을 억제하기 위한 목적에 있어서, 항-TAT 항체, TAT 폴리펩티드, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자의 "세포독성량"은 경험적으로 및 통상적인 방식에 의해 결정할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는, 예를 들어 원하는 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는 한, 단일 항-TAT 모노클로날 항체 (효능제, 길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-TAT 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항-TAT 항체 및 항-TAT 항체의 단편 (하기 참조)을 포함한다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)은 본원에서 "항체"와 교환가능하게 사용된다.
"단리된 항체"는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정하였을 때 항체의 95 중량％를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 15개 이상 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시 블루 염색, 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만이 나타나는 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포내에 본래의 항체를 포함하는데, 이는 항체의 천연 환경의 성분이 1종 이상 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본적인 4-쇄 항체 단위는 두 개의 동일한 경쇄 (L)와 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 이종사량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J쇄라 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 이종사량체 단위로 구성되어 있어 10개의 항원 결합 부위를 함유하지만, 분비되는 IgA 항체는 중합체화되어 J쇄와 함께 기본적인 4-쇄 단위를 2 내지 5개 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있음). IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. L쇄는 각각 하나의 공유결합성 디술피드 결합에 의해 H쇄에 연결되어 있지만, 두 개의 H쇄는 H쇄 이소타입 (isotype)에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 또한, H쇄 및 L쇄 각각에는 일정한 간격을 두고 떨어져 있는 쇄내 디술피드 브릿지도 존재한다. H쇄 각각의 N-말단에는 가변 도메인 (VH)이 있고, 이 도메인에 이어, α및 γ쇄 각각의 경우에는 3개의 불변 도메인 (CH)이 있고, μ 및 ε 이소타입의 경우에는 4개의 CH 도메인이 있다. L쇄 각각의 N-말단에는 가변 도메인 (VL)이 있고, 반대쪽 말단에는 불변 도메인 (CL)이 있다. VL은 VH와 함께 정렬되어 있고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL은 함께 쌍을 이루어 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 여러 클래스에 속하는 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물 종의 L쇄는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 분류한, 카파 및 람다로 지칭되는 명백히 구별되는 2가지 유형 중 하나일 수 있다. 이뮤노글로불린은 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라 여러 클래스 또는 이소타입으로 분류될 수 있다. 5가지 클래스의 이뮤노글로불린, 즉 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭되는 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있다. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에 있어 상대적으로 작은 차이점에 기초하여 하위 클래스로 더 분류되는데, 예를 들어 인간은 하위 클래스 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현시킨다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 특정한다. 그러나, 이러한 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 대신에, V 영역은 길이가 아미노산 9 내지 12개이며 가변성이 극도로 높아 "초가변 영역"으로 지칭되는 보다 짧은 영역에 의해 분리되어 있으며, 15 내지 30개 아미노산으로 구성된 프레임워크 영역 (framework region, FR)으로 지칭되는 비교적 불변성인 스트레치로 구성되어 있다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 β-쉬트 형태를 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 이 FR은 β-쉬트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는 상기 β-쉬트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 초가변 영역들은 FR에 의해 서로 매우 가까이 위치하고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접 관여하지는 않지만, 항체-의존성 세포-매개성 세포독성(ADCC)에 항체가 참여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 나타내는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일 항원성 부위에 대해 제시된 모노클로날 항체는 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 제시된 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 제시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵생물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). 또한, "모노클로날 항체"는, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 (phage) 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되었거나 특정한 항체 클래스 또는 그의 하위 클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있으며, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유래되었거나 다른 항체 클래스 또는 그의 하위 클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라, 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서 대상 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구대륙 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
"무손상" 항체는 항원-결합 부위뿐만 아니라 CL, 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 이러한 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는 것이 바람직하다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체 (미국 특허 제5,641,870호의 실시예 2, 문헌 [Zapata et al., Protein Eng . 8(10):1057-1062 (1995)] 참조); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 있다.
항체를 파파인으로 분해하면 "Fab" 단편이라고 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 용이하게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. Fab 단편은 H쇄의 가변 영역 도메인 (VH) 및 어느 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 L쇄 전체로 구성된다. 각 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가의 항원-결합 부위, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면 거대 단일 F(ab')2 단편이 생성되며, 이는 대략 2가의 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 결합에 의해 연결된 Fab 단편에 상응하고 항원에 여전히 가교결합되어 있을 수 있다. 또한, Fab' 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯하여 CH1 도메인의 카르복시-말단에 여러 개의 잔기를 더 갖는다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은, 본래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편들이 쌍을 이루어 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드 결합에 의해 함께 연결되어 있는 H쇄 둘 모두의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되는데, 이 영역은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이기도 하다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 하나의 중쇄 가변 영역 도메인과 하나의 경쇄 가변 영역 도메인이 비-공유 결합에 의해 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 구성된다. 이들 두 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H쇄 및 L쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합시 사용되는 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 대해 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 가변 도메인은 하나 (또는 항원에 특이적인 CDR을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)이더라도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 능력이 있다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄로 연결되어 있는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. sFv 폴리펩티드는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하는 것이 바람직하며, 이 때 상기 링커는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 한다. sFv에 대한 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)] 및 [Borrebaeck 1995, 하기 문헌]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5 내지 10개의 잔기)를 갖는 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 제작하고, 이들이 쇄 내에서가 아닌 쇄 사이에서 V 도메인들의 쌍을 형성하도록 함으로써 2가의 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 생성하여 제조한 작은 항체 단편을 나타낸다. 이중특이적 디아바디는 항체 2개의 VH 도메인 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편으로 구성된 이종이량체이다. 디아바디는 유럽 특허 제404,097호; 국제 공개 제93/11161호; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 증진시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 통상적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하는데, 여기서 모든 초가변 루프 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부, 통상적으로는 적어도 인간 이뮤노글로불린의 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"종-의존성 항체", 예를 들어 포유동물의 항-인간 IgE 항체는 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화성이 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화성보다 더 높은 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합"하지만 (즉, 결합 친화성 (Kd) 값이 약 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1×10-8 M 이하, 가장 바람직하게는 약 1×10-9 M 이하임), 제2의 비-인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화성은 인간 항원에 대한 결합 친화성보다 약 50배 이상, 약 500배 이상 또는 약 1,000배 이상 더 낮다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 다양한 유형의 항체 중 임의의 항체일 수 있으나, 바람직하게는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
"카바트에서와 같이 넘버링된 가변 도메인 잔기" 또는 "카바트에서와 같이 넘버링된 아미노산 위치"라는 용어 및 그의 변형어는 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 항체의 편집체의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 체계를 지칭한다. 상기 넘버링 체계를 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축화 또는 그 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따르면 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어 카바트에 따르면 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열의 상동성의 영역에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 어구는 2개의 수치값 (일반적으로 본 발명의 항체와 관련된 하나 및 참조/비교자 항체와 관련된 다른 것) 사이의 유사성이 충분히 높은 정도여서 당업자가 상기 2개의 값 사이의 차이가 상기 값 (예를 들어 Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 내용 내에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 간주할 것을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교자 항체에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 50％ 미만, 바람직하게는 약 40％ 미만, 바람직하게는 약 30％ 미만, 바람직하게는 약 20％ 미만, 바람직하게는 약 10％ 미만이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어 항체)와 그의 결합 상대 (예를 들어 항원)의 단일 결합 부위 사이의 비공유 상호작용의 전체 합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는다면, 본원에서 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어 항원과 항체) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 비롯한 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 천천히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빨리 결합하고 보다 오래 결합을 유지한다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태는 하기에 기재된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 비표지된 항원의 적정 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 결합된 항체를 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 분석법에 의해 기재된 바와 같이 대상의 항체의 Fab 형태 및 그의 항원으로 수행된 방사성표지된 항원 결합 분석법 (RIA)에 의해 측정된다 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)]). 분석 조건을 수립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트 (다이넥스(Dynex))을 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs) 5 ㎍/mL으로 밤새 코팅하고, 이어서 PBS 중 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (대략 23 ℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단시킨다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 대상의 Fab (예를 들어 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서의 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함)의 일련 희석액과 혼합한다. 그 후, 대상의 Fab를 밤새 인큐베이션한다. 하지만, 인큐베이션은 오랜 시간 동안 계속하여 (예를 들어 65시간) 평형 도달을 보장할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어 1시간 동안) 인큐베이션하기 위해 포획 플레이트에 옮긴다. 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1％ 트윈-20으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 섬광액 (마이크로신트(MicroScint)-20; 패커드(Packard)) 150 ㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트(Topcount) 감마 계수기 (패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하의 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석법에 사용하기 위해 선택한다. 또다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 비아코어(상표명)-2000 또는 비아코어(상표명)-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.))를 사용하여 약 10 반응 단위 (RU)에서 고정화된 항원 CM5로 25 ℃에서 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어(BIAcore Evaluation Software) 버전 3.2)를 이용하여 계산된다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-아민코(Aminco) 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 비아코어(상표명)-2000 또는 비아코어(상표명)-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.)를 이용하여 25 ℃에서 고정화된 항원 CM 칩으로 약 10 반응 단위 (RU)에서 상기 기재된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 측정된다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산한다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 그러나, 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-이민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 한 실시양태에서, 비표지된 항원의 적정 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 결합된 항체를 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 분석법에 의해 기재된 바와 같이 항체의 Fab 형태 및 항원 분자로 수행된 방사성표지된 항원 결합 분석법 (RIA)에 의해 측정된다 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)]). 분석 조건을 수립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트 (다이넥스)을 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스 5 ㎍/mL으로 밤새 코팅하고, 이어서 PBS 중 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (대략 23 ℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단시킨다. 비-흡착 플레이트 (눈크 #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 대상의 Fab (예를 들어 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함)의 일련 희석액과 혼합한다. 그 후, 대상의 Fab를 밤새 인큐베이션한다. 하지만, 인큐베이션은 오랜 시간 동안 계속하여 (예를 들어 65시간) 평형 도달을 보장할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어 1시간 동안) 인큐베이션하기 위해 포획 플레이트에 옮긴다. 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1％ 트윈-20으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 섬광액 (마이크로신트-20; 패커드) 150 ㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트 감마 계수기 (패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하의 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석법에 사용하기 위해 선택한다. 또다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 비아코어(상표명) 2000 또는 비아코어(상표명) 3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.)를 이용하여 고정화된 항원 CM5로 25 ℃에서 약 10 반응 단위 (RU)에서 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산한다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 바람직하게는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-이민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 비아코어(상표명)-2000 또는 비아코어(상표명)-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.)를 이용하여 25 ℃에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 약 10 반응 단위 (RU)에서 상기 기재된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 측정된다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산한다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 바람직하게는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-이민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정된다.
본원에서 사용된 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"이라는 어구는 2개의 수치값 (일반적으로 본 발명의 항체와 관련된 하나 및 참조/비교자 항체와 관련된 다른 것) 사이의 차이가 충분히 높은 정도여서 당업자가 상기 2개의 값 사이의 차이가 상기 값 (예를 들어 Kd 값, HAMA 반응)에 의해 측정된 생물학적 특징의 내용 내에서 통계학적 유의성이 있는 것으로 간주할 것을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교자 항체에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 10％ 초과, 바람직하게는 약 20％ 초과, 바람직하게는 약 30％ 초과, 바람직하게는 약 40％ 초과, 바람직하게는 약 50％ 초과이다.
"항원"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 예정된 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원은 폴리펩티드이다. 본원의 목적을 위한 "수용자 인간 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 프레임워크로부터, 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크, 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 기존의 아미노산 변화가 존재할 경우, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하 또는 3개 이하의 기존의 아미노산 변화가 존재한다. 기존의 아미노산 변화가 VH에 존재할 경우, 바람직하게는 상기 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중 3개, 2개 또는 하나에서만이며, 예를 들어 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 한 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열에 대한 서열과 동일하다.
본 발명의 항체는 제2 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프에 결합하는데 있어 완전할 수 있다. 모노클로날 항체는 각각이 다른 것과 결합하는 것을 시험관내 항체 경쟁 결합 분석에서 표준으로 40％ 이상까지 또는 동일한 항체 농도로 차단하는 경우에 "동일한 에피토프"를 공유하는 것으로 간주한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 카바트와 그의 동료들에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL에 대해, 하위군은 카바트와 그의 동료들에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH에 대해, 하위군은 카바트와 그의 동료들에서와 같은 하위군 III이다.
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 카바트와 그의 동료들의 가변 중쇄 하위군 III의 아미노산 서열로부터 수득되는 컨센서스 서열을 포함한다.
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 카바트와 그의 동료들의 가변 경쇄 카파 하위군 I의 아미노산 서열로부터 수득되는 컨센서스 서열을 포함한다.
"비변형된 인간 프레임워크"는 예를 들어 수용자 인간 프레임워크에서 비-인간 아미노산으로의 인간 아미노산 치환(들)이 없는 수용자 인간 프레임워크와 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 프레임워크이다.
본원의 목적을 위한 "변경된 초가변 영역"은 그에 하나 이상의 (예를 들어 1 내지 약 16개) 아미노산 치환(들)을 포함하는 초가변 영역이다.
본원의 목적을 위한 "비-변형된 초가변 영역"은 그것이 유래된 비-인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역, 즉 그에 하나 이상의 아미노산 치환이 없는 것이다.
본원에서 사용될 경우 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 및/또는 형태 구조적으로 한정된 루프에서 초가변인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함한다: VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용중이며, 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 변이성을 기초로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Protenis of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 대신 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 각각의 상기 초가변 영역으로부터의 잔기를 하기에 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, 코바트 넘버링이 사용될 것이다. 초가변 영역 위치는 일반적으로 하기와 같다: 아미노산 24 내지 34 (HVR-L1), 아미노산 49 내지 65 (HVR-L2), 아미노산 89 내지 97 (HVR-L3), 아미노산 26 내지 35A (HVR-H1), 아미노산 49 내지 65 (HVR-H2) 및 아미노산 93 내지 102 (HVR-H3).
초가변 영역은 하기와 같은 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 아미노산 24 내지 36 (L1) 및 아미노산 46 내지 56 (L2). 가변 도메인 잔기는 상기 정의의 각각에 대해 카바트와 그의 동료들의 상기 문헌에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 인간 항체 제조 기술을 이용하여 제조된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"친화도 성숙된" 항체는 상기 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해, 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래하는 하나 이상의 그의 CDR에서 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
"TAT 결합 올리고펩티드"는 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. TAT 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성법을 이용하여 화학적으로 합성하거나, 또는 재조합 기술을 이용하여 제조 및 정제할 수도 있다. 통상적으로, TAT 결합 올리고펩티드의 길이는 아미노산 약 5개 이상, 다르게는 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 100개 이상이며, 이러한 올리고펩티드는 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. TAT 결합 올리고펩티드는 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대한 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있음을 유의한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 동 제5,750,373호, 동 제4,708,871호, 동 제4,833,092호, 동 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호, 동 제5,663,143호, PCT 국제 공개공보 제84/03506호 및 동 제84/03564호, 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)], [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)], [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)], [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)], [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378], [Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832], [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624], [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581], [Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
"TAT 결합 유기 분자"는 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 유기 분자로서, 본원에 정의된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체는 제외한다. TAT 결합 유기 분자는 공지된 방법을 이용하여 확인하고, 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 국제 공개공보 제00/00823호 및 동 제00/39585호 참조). 통상적으로, TAT 결합 유기 분자의 크기는 약 2,000 달톤 미만, 다르게는 약 1,500 달톤, 750 달톤, 500 달톤, 250 달톤 또는 200 달톤 미만이며, 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 유기 분자는 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대한 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있음을 유의한다 (예를 들어, PCT 국제 공개공보 제00/00823호 및 동 제00/39585호 참조).
대상 항원, 예를 들어 종양-관련 폴리펩티드 항원 표적에 "결합"하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 충분한 친화성을 갖는 상기 항원에 결합하여, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 상기 항원을 발현시키는 세포 또는 조직의 표적화에 진단제 및/또는 치료제로서 유용하게 하고, 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않도록 하는 것이다. 이러한 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자와 "비-표적" 단백질의 결합 정도는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA)에 의해 측정된 상기 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자와 그의 특정 표적 단백질의 결합 정도의 약 10％ 미만일 것이다. 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자와 표적 분자의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합," "그에 특이적으로 결합하는" 또는 "그에 특이적인"이라는 용어는 비-특이적 상호작용으로부터 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성은 갖지 않으면서 유사한 구조를 갖는 대조군 분자와의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자 (예를 들어, 과량의 표지되지 않은 표적)와의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우에 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면, 이를 특이적 결합으로 나타낸 다. 본원에 사용된 용어, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합," "그에 특이적으로 결합하는" 또는 "그에 특이적인"은 예를 들어 표적에 대한 Kd가 약 10-4 M 이상, 다르게는 약 10-5 M 이상, 다르게는 약 10-6 M 이상, 다르게는 약 10-7 M 이상, 다르게는 약 10-8 M 이상, 다르게는 약 10-9 M 이상, 다르게는 약 10-10 M 이상, 다르게는 약 10-11 M 이상, 다르게는 약 10-12 M 이상, 또는 그 이상인 분자에 의해 나타낼 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 나타낸다.
"TAT 폴리펩티드를 발현시키는 종양 세포의 성장을 억제하는" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자, 또는 "성장을 억제하는" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 적절한 TAT 폴리펩티드를 발현시키거나 과다발현시키는 암세포의 성장을 측정가능하게 억제하는 것이다. TAT 폴리펩티드는 암세포의 표면에서 발현되는 막횡단 폴리펩티드이거나, 또는 암세포에 의해 생성 및 분비되는 폴리펩티드일 수 있다. 성장을 억제하는 바람직한 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 TAT-발현 종양 세포의 성장을 적절한 대조군에 비해 20％ 초과, 바람직하게는 약 20％ 내지 약 50％, 보다 더 바람직하게는 50％ 초과 (예를 들어, 약 50％ 내지 약 100％)하여 억제하며, 여기서 대조군은 통상적으로 시험될 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 처치하지 않은 종양 세포이다. 한 실시양태에서, 성장 억제는 세포 배양물 중에서 약 0.1 내지 30 ㎍/mL 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있는데, 이 때 성장 억제는 종양 세포를 항체에 노출시킨지 1 내지 10일 후에 측정한다. 생체내 종양 세포의 성장 억제는 하기 실험 실시예 단락에 기재된 바와 같은 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg의 항-TAT 항체를 투여하였을 때 항체의 1차 투여일로부터 약 5일 내지 3개월, 바람직하게는 약 5일 내지 30일 이내에 종양 크기 또는 종양 세포의 증식이 감소된다면, 이는 상기 항체가 생체내에서 성장 억제 효과를 나타냄을 의미한다.
"아팝토시스 (apoptosis)를 유도하는" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 아넥신 V의 결합, DNA 단편의 형성, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편의 형성 및/또는 막 소포체 (아팝토시스체로 불림)의 형성에 의해 측정되는 예정된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 통상적으로, 이러한 세포는 TAT 폴리펩티드를 과다발현시키는 세포이다. 바람직하게는, 상기 세포는 종양 세포, 예를 들어 전립선 종양 세포, 유방 종양 세포, 난소 종양 세포, 위 종양 세포, 자궁내막 종양 세포, 폐 종양 세포, 신장 종양 세포, 결장 종양 세포, 방광 종양 세포이다. 다양한 방법을 이용하여 아팝토시스와 관련된 세포 사건을 평가할 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고, DNA 단편 형성은 DNA 분절을 통해 평가할 수 있으며, DNA 단편 형성과 함께 일어나는 핵/염색질 응집은 이배체 하위 세포의 임의의 증가에 의해서 평가할 수 있다. 바람직하게는, 아팝토시스를 유도하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 아넥신 결합 분석에서 처리되지 않은 세포에 비해 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배만큼 유도하는 것이다.
항체의 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 나타내며, 이는 항체의 이소타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 대식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 있다.
"항체-의존성 세포-매개성 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합되어 있는 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합한 후에 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있도록 하는 세포독성 형태를 나타낸다. 항체는 세포독성 세포의 무기로서, 위와 같은 세포 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 제464면 표 3에 요약되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 추가로, 대상 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)] 등에 개시된 것과 같은 동물 모델의 생체내에서 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타낸다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)로, 여기에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위 클래스의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 다르게 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는, 주로 그의 세포질 도메인이 여러 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (검토를 위해, 문헌 [M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR에 대한 검토를 위해, 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)], [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]을 참조한다. 추후로 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원에 사용된 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 역할을 하는 신생아 수용체 FcRn도 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 RcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리할 수 있다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적 세포가 용해되는 것을 나타낸다. 종래의 보체 활성화 경로는 보체와 동종인 항원에 결합된 (적절한 하위 클래스의) 항체에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같이 CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 통상적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프 악성 종양이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포암종을 비롯한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 비롯한 위암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요도암, 간종, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발성 흑색종 및 B-세포 림프종, 뇌암 뿐만 아니라 두경부암 및 관련 전이가 있다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 나타낸다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에 사용된 용어 "종양"은 악성인지 또는 양성인지에 관계없이 모든 신생물 세포가 성장 및 증식한 것을 나타내며, 모든 전암성 및 암성 세포와 전암성 및 암성 조직을 포함한다.
"세포 사멸을 유도하는" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 살아있는 세포를 사멸시키는 것이다. 상기 세포는 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 세포이며, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 정상적인 세포에 비해 TAT 폴리펩티드를 과다발현시키는 세포이다. TAT 폴리펩티드는 암세포의 표면에서 발현되는 막횡단 폴리펩티드이거나, 암세포에 의해 생성 및 분비되는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 암세포, 예를 들어 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 자궁내막암 세포, 침샘암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 결장암 세포, 갑상선암 세포, 췌장암 세포 또는 방광암 세포이다. 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재하에 시험관내 세포 사멸을 측정하여 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도되는 세포 사멸을 구별할 수 있다. 따라서, 세포 사멸 분석은 열-실활된 혈청 (즉, 보체가 없음)을 사용하여 면역 이펙터 세포의 부재하에 수행할 수 있다. 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자가 세포 사멸을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해서 요오드화 프로피듐 (PI), 트립판 블루 (문헌 [Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)] 참조) 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가되는 막의 일체성 손상 정도를 처리되지 않은 세포와 비교하여 평가할 수 있다. 세포 사멸을 유도하는 바람직한 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 PI 흡수 분석시 BT474 세포에서 PI 흡수를 유도하는 것이다.
"TAT-발현 세포"는 내인성 TAT 폴리펩티드 또는 형질감염된 TAT 폴리펩티드를 세포 표면에서 또는 분비된 형태로 발현시키는 세포이다. "TAT-발현 암"은 세포 표면에 TAT 폴리펩티드가 존재하는 세포 또는 TAT 폴리펩티드를 생성하여 분비하는 세포를 포함하는 암이다. "TAT-발현 암"에서는, 임의로는 그의 세포 표면에 충분한 수준의 TAT 폴리펩티드를 생성시켜 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자가 이에 결합하도록 함으로써 암에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 다른 실시양태에서는, "TAT-발현 암"에서 임의로 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자 길항제가 결합하기에 충분한 수준의 TAT 폴리펩티드를 생성하여 분비시킴으로써 암에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 후자와 관련하여, 길항제는 종양 세포에 의해 분비된 TAT 폴리펩티드의 생성 및 분비를 감소, 억제 또는 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. TAT 폴리펩티드를 "과다발현"하는 암은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포에 비해 그의 세포 표면에서 상당히 더 높은 수준의 TAT 폴리펩티드를 갖거나, 생성 및 분비하는 것이다. 이러한 과다발현은 유전자 증폭에 의해 야기될 수 있거나, 또는 전사 또는 번역 증가에 의해 유발될 수도 있다. TAT 폴리펩티드 과다발현은 세포 표면 상에 존재하거나 세포에 의해 분비되는 TAT 단백질의 증가 수준을 평가함으로써 (예를 들어, 재조합 DNA 기술을 이용하여 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로부터 제조할 수 있는 단리된 TAT 폴리펩티드에 대해 제조된 항-TAT 항체를 사용하는 면역조직화학 분석; FACS 분석 등을 통해 평가함) 진단 또는 예후 분석에서 결정할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 예를 들어 TAT-코딩 핵산 또는 그의 상보체에 상응하는 핵산-기재의 프로브를 사용하는 형광 계내 혼성화 (FISH; 국제 공개 제98/45479호 (1998년 10월에 공개됨) 참조), 서던 블롯팅, 노던 블롯팅 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 실시간 정량적 PCR (RT-PCR) 등을 통해 세포내에서 TAT 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 mRNA의 수준을 측정할 수 있다. 또한, 예를 들어 항체-기재 분석법을 이용하여 혈청과 같은 생체액 중에 방출된 항원을 측정함으로써 TAT 폴리펩티드 과다발현을 연구할 수도 있다 (또한, 미국 특허 제4,933,294호 (1990년 6월 12일자로 허여됨); 국제 공개 제91/05264호 (1991년 4월 18일자로 공개됨); 미국 특허 제5,401,638호 (1995년 3월 28일자로 허여됨); 및 문헌 [Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)] 참조). 상기 분석법들과는 별도로, 당업자는 다양한 생체내 분석법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 환자의 인체 세포를 임의로 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 표지한 항체에 노출시킬 수 있는데, 이러한 항체가 환자의 세포에 결합되는지 여부는, 예를 들어 방사능에 대해 외부 스캐닝하거나 항체에 노출시키기 이전에 환자로부터 채취한 생검을 분석함으로써 평가할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능을 갖는 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체-유사 분자를 지칭한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 부위 및 항원 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 (즉, "이종")과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 연속적인 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다.
용어 "표지"는, 본원에 사용된 경우, 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자에 직접 또는 간접적으로 접합되어 "표지된" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)일 수 있거나, 효소 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제; 핵산분해 효소와 같은 효소 및 그의 단편; 항생제; 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (이들의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기에 개시한 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 간주한다. 다른 세포독성제는 하기에 기재되어 있다. 항종양제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산 (CYTOXAN; 등록상표) 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라닌 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); δ-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀 (MARINOL; 등록상표)), β-라파콘; 라파콜; 콜치신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴 (HYCAMTIN; 등록상표), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르 (CAMPTOSAR; 등록상표), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르미신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함)); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스핀, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 γII 및 칼리케아미신 ωII) (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신, 예컨대 다이네미신 A; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신 (ADRIAMYCIN; 등록상표) 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신 물질, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 에포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠 (JHS Natural Products; 미국 오리곤주 유진 소재)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 네투아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신 (ELDISINE; 등록상표), 필데신 (FILDESIN; 등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔 (TAXOL; 등록상표) 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재), 아브락산 (ABRAXANE; 상표명), 파클리탁셀의 크레모포르-무함유 알부민-가공된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스 (American Pharmaceutical Partners), 미국 일리노이주 샴버그 소재), 및 탁소테레 (TAXOTERE; 등록상표) 도세탁셀 (롱-프랑 로라 (Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르 (GEMZAR; 등록상표)); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반 (VELBAN; 등록상표)); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈 (ONCOVIN; 등록상표)); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈 (NAVELBINE; 등록상표)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (젤로다 (XELODA; 등록상표)); 이들 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 이들 중 둘 이상의 조합, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 함께 옥살리플라틴 (엘록산틴 (ELOXATIN; 상표명))을 사용하는 치료 처방의 약어)가 있다.
본 명세서에는 또한 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬 제제가 포함되며, 종종 전신 또는 전체 치료 형태가 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수도 있다. 그 예로는 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스 (NOLVADEX; 등록상표) 타목시펜), 에비스타 (EVISTA; 등록상표) 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤 (FARESTON; 등록상표) 토레미펜; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절자 (ERD); 난소를 억제 또는 차단하는 기능을 하는 제제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 루프론 (LUPRON; 등록상표) 및 엘리가드 (ELIGARD; 등록상표) 류플로리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 다른 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세 (MEGASE; 등록상표) 메게스트롤 아세테이트, 아로마신 (AROMASIN; 등록상표) 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비조르 (RIVISOR; 등록상표) 보로졸, 페마라 (FEMARA; 등록상표) 레트로졸 및 아리미덱스 (ARIMIDEX; 등록상표) 아나스트로졸이 있다. 또한, 이러한 화학요법제의 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스 (BONEFOS; 등록상표) 또는 오스탁 (OSTAC; 등록상표), 디드로칼 (DIDROCAL; 등록상표) 에티드로네이트, NE-58095, 조메타 (ZOMETA; 등록상표) 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사막스 (FOSAMAX; 등록상표) 알렌드로네이트, 아레디아 (AREDIA; 등록상표) 파미드로네이트, 스켈리드 (SKELID; 등록상표) 틸루드로네이트 또는 악토넬 (ACTONEL; 등록상표) 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식과 관련된 신호전달 경로의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-α, Raf, H-Ras 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프 (THERATOPE; 등록상표) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴 (ALLOVECTIN; 등록상표) 백신, 류벡틴 (LEUVECTIN; 등록상표) 백신 및 백시드 (VAXID; 등록상표) 백신; 루르토테칸 (LURTOTECAN; 등록상표) 토포이소머라제 I 억제제; 아바렐릭스 (ABARELIX; 등록상표) rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제, GW572016으로도 공지되어 있음); 및 이들 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 있다.
"성장 억제제"는, 본원에 사용된 경우, 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 TAT-발현 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 따라서, 성장 억제제는 S-기에서의 TAT-발현 세포의 비율(％)을 상당히 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 세포 주기 진행을 (S-기 이외의 시기에서) 차단하는 제제, 예컨대 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 제제가 있다. 종래의 M-기 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 있다. G1 정지 여파로 S-기 정지를 초래하는 제제의 예로는 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C가 있다. 보다 자세한 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1] (특히 제13면)에서 찾을 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목 (yew tree)으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (탁소테레; 등록상표), 롱-프랑 로라 제품)은 파클리탁셀 (탁솔; 등록상표), 브리스톨-마이어스 스큅 제품)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관이 조립되는 것을 촉진하고 탈중합을 방해함으로써 미세관을 안정시켜, 세포의 유사분열을 억제한다.
"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 전체 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타세네디온이다.
용어 "사이토카인"은 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어로서, 이는 다른 세포 상에서 세포간 매개자로서 작용한다. 이러한 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 종래의 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 종양 괴사 인자-β; 뮐러(Mullerian)-억제 물질; 마우스 생식선자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 인슐린 유사 성장 인자-II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 및 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자가 있다. 본원에 사용된 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
용어 "포장 삽입물"은 시판되는 약품의 포장에 상업적으로 포함되는 지시사항을 표기하기 위해 사용되는 것으로, 이는 증상에 대한 정보, 용법, 용량, 투여법, 금기사항 및/또는 이러한 약품의 사용에 관한 주의사항을 함유한다.
Figure 112008004290412-pct00001
Figure 112008004290412-pct00002
Figure 112008004290412-pct00003
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Figure 112008004290412-pct00007
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Figure 112008004290412-pct00009
Figure 112008004290412-pct00010
Figure 112008004290412-pct00011
Figure 112008004290412-pct00012
Figure 112008004290412-pct00013
Figure 112008004290412-pct00014
Figure 112008004290412-pct00015
Figure 112008004290412-pct00016
Figure 112008004290412-pct00017
Figure 112008004290412-pct00018
아미노산 서열 동일성 (％) =
(ALIGN-2에 의해 두 폴리펩티드 서열 사이에서 동일하게 매치되는 것으로 결정된 아미노산 잔기의 수)÷(TAT 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수)
5/15 = 33.3％
Figure 112008004290412-pct00019
아미노산 서열 동일성 (％) =
(ALIGN-2에 의해 두 폴리펩티드 서열 사이에서 동일하게 매치되는 것으로 결정된 아미노산 잔기의 수)÷(TAT 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수)
5/10 = 50％
Figure 112008004290412-pct00020
핵산 서열 동일성 (％) =
(ALIGN-2에 의해 두 핵산 서열 사이에서 동일하게 매치되는 것으로 결정된 뉴클레오티드의 수)÷(TAT-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드의 총 수)
6/14 = 42.9％
Figure 112008004290412-pct00021
핵산 서열 동일성 (％) =
(ALIGN-2에 의해 두 핵산 서열 사이에서 동일하게 매치되는 것으로 결정된 뉴클레오티드의 수)÷(TAT-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드의 총 수)
4/12 = 33.3％
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. 항-TAT 항체
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 치료제 및/또는 진단제로서 사용할 수 있는 항-TAT 항체를 제공한다. 항체의 예로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 이종접합체 항체가 있다.
1. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원과 면역보강제를 여러번 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물에서 발생시키는 것이 바람직하다. 면역화될 종에서 면역원성을 나타내는 단백질에 관련 항원 (특히, 합성 펩티드가 사용되는 경우)을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 이관능성 또는 유도체화 제제를 사용하는 대두 트립신 억제제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 접합됨), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해 접합됨), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)에 관련 항원을 접합시킬 수 있다.
예를 들어, 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대한 용량임)을 3배 부피의 프로인트 (Freund) 완전 면역보강제와 합하여, 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물을 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 면역보강제에 포함된 펩티드 또는 접합체를 본래 양의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사함으로써 동물에게 추가접종을 수행한다. 7일 내지 14일 후에, 상기 동물을 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 역가가 정체 상태에 이를 때까지 동물에게 추가접종을 수행한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증대시킨다.
2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물 (예컨대, 햄스터)을 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합될 항체를 생성시키거나 또는 생성시킬 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수도 있다. 면역화시킨 후에, 림프구를 단리한 다음 적합한 융합제 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)를 사용하여 골수종 세포주와 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
위와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포 (융합 파트너로도 지칭됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 선별 배양 배지는 통상적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 융합 파트너인 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체 생성 세포에 의해 항체가 안정하게 높은 수준으로 생성되는 것을 지지하는 세포이며, 융합되지 않은 모 세포로부터 상기 골수종 세포를 선별하는 선별 배지에 민감하다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수가능함), 및 SP-2 및 유도체 (예를 들어, X63-Ag8-653 세포; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 매나서스 소재)으로부터 입수가능함)이다. 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)] 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 기재되어 있다.
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 상기 항원에 대해 제시된 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착분석법 (ELISA)에 의해 결정된다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캣차드 (Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.
하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생성하는 것으로 확인되면, 이 클론을 제한적 희석 절차에 의해 서브클로닝하여, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 또한, 예를 들어 하이브리도마 세포를 마우스에 복강내 주사함으로써 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A-세파로스 또는 단백질 G-세파로스를 사용함), 이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리하는 것이 적합하다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 이용하여 용이하게 단리하여 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능한다. 단리된 후에, DNA는 발현 벡터 내에 위치할 수 있으며, 이 벡터는 이후에 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 항체 단백질을 생성시키지 않는 골수종 세포에 형질감염시켜 이 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 박테리아에서 재조합 발현시키는 것에 대한 검토를 위해, 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 참조한다.
추가의 실시양태에서, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 제작된 항체 파지 라이브러리로부터 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 항체 및 인간 항체 각각을 단리하는 방법이 기재되어 있다. 후속 간행물들은 쇄 셔플링 (chain shuffling)에 의해 높은 친화성 (nM 범위)을 갖는 인간 항체를 제조하는 방법에 대해 기재하고 있으며 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 또한 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서 조합 감염과 생체내 재조합을 기재하고 있다 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]). 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 종래의 모노클로날 항체 하이브리도마 기술을 대체할 수 있는 방안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 동종 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 대체하거나 (미국 특허 제4,816,567호, 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 이뮤노글로불린 코딩 서열을 융합시킴으로써, 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드가 생성되도록 변형시킬 수 있다. 항체의 불변 도메인을 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열로 대체시키거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 이들 폴리펩티드로 대체시켜, 항원에 대한 특이성을 나타내는 한 항원-결합 부위, 및 상이한 항원에 대한 특이성을 나타내는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 2가의 키메라 항체를 생성할 수 있다.
3. 인간 및 인간화 항체
또한, 본 발명의 항-TAT 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린쇄 또는 이들의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 발견되지 않고, 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 통상적으로는 2개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 공통 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 적어도 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부, 통상적으로는 적어도 인간 이뮤노글로불린 영역의 일부를 포함하는 것이 가장 적합할 것이다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]).
비인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트 (import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻는다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 윈터 (Winter) 및 그의 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 둘 모두)을 선택하는 것은 항체가 인간 치료용으로 사용되는 경우에 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "가장-적합한 (best-fit)" 방법에 따라, 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리를 대상으로 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 스크리닝한다. 설치류의 V 도메인 서열과 가장 유사한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 이 서열내의 인간 프레임워크 영역 (FR)이 인간화 항체에 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)], [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군에 속하는 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 이와 동일한 프레임워크를 여러 상이한 인간화 항체에 대해 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)], [Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]).
또한, 항체를 항원에 대한 높은 결합 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지한 상태로 인간화시키는 것도 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 이상적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 이뮤노글로불린 모델은 시판되고 있으며, 이는 당업자에게 친숙한 것이다. 선별된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체구조를 설명하고 보여주는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이 디스플레이를 사용하여 정밀조사함으로써 후보 이뮤노글로불린 서열이 기능함에 있어 잔기의 가능한 역할, 즉 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 끼치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방법에서는, FR 잔기를 수용 서열과 임포트 서열로부터 선별하여 조합함으로써 원하는 항체 특징이 달성되도록, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성이 증가되도록 할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 있어서 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항-TAT 항체의 다양한 형태도 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 면역접합체를 생성시키기 위해 임의로는 1종 이상의 세포독성제(들)에 접합시킨 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있다. 별법으로, 인간화 항체는 무손상 IgG1 항체와 같은 무손상 항체일 수 있다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역화시킬 때, 내인성 이뮤노글로불린의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 제조하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 모두 결실시키면 내인성 항체 생성이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 생식세포주 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식세포주 돌연변이 마우스에 전달하면 항원 접종시 인간 항체가 생성될 것이다 (문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)], [Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)], 미국 특허 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,591,669호 (모두 겐파름 (GenPharm)의 특허임), 동 제5,545,807호 및 국제 공개 제97/17852호 참조).
별법으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 제조할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 섬사상 박테리오파지의 주요 또는 부수적인 외피 단백질 유전자로 프레임에 맞게 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 섬사상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성에 기초한 선별로부터 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별할 수 있다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)] 검토). V-유전자 절편의 여러 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 클랙슨 (Clackson) 등은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위적인 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 어레이를 단리하였다 (문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제작할 수 있으며, 다양한 항원 어레이 (자가 항원 포함)에 대한 항체는, 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 동 제5,573,905호를 참조한다.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해서도 생성될 수도 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 동 제5,229,275호 참조).
4. 항체 단편
특정 환경에서는 항체 전체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 신속한 제거를 허용하고 충실성 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다.
항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기술이 개발되어 있다. 종래, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해를 통해 유도된 것이었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 이. 콜라이로부터 분비될 수 있으므로, 이들 단편을 용이하게 대량으로 제조할 수 있다. 항체 단편은 상기에서 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수할 수 있고, 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편을 제조하기 위한 다른 기술은 당업자에게는 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (국제 공개 제93/16185호, 미국 특허 제5,571,894호 및 동 제5,587,458호 참조). Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이므로, 생체내에 사용되는 동안 비특이적 결합을 감소시키는데 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서 이펙터 단백질의 융합이 일어나도록 제작할 수 있다 ([Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조). 또한, 이러한 항체 단편은, 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적이거나 이중특이적일 수 있다.
5. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 대표적인 이중특이적 항체는 본원에 기재된 TAT 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 항체들 중 다른 것들에서는 TAT 결합 부위가 다른 단백질에 대한 결합 부위와 함께 조합될 수 있다. 별법으로, 항-TAT 완(arm)은 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3)와 같은 백혈구 상의 유발 분자, 또는 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 같은 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR)에 결합하는 완과 조합되어 세포의 방어 메카니즘을 TAT-발현 세포에 집중시켜 여기에 위치시킬 수 있다. 이중특이적 항체를 사용하여 TAT를 발현시키는 세포에 세포독성제를 위치시킬 수도 있다. 이들 항체들은 TAT-결합 완, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 (ricin) A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 햅텐)에 결합하는 완을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
국제 공개 제96/16673호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기재되어 있으며, 미국 특허 제5,837,234호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 개시되어 있다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα항체는 국제 공개 제98/02463호에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체가 교시되어 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 종래, 전장 이중특이적 항체의 제조는 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현을 바탕으로 한다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적인 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물로 생성되며, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 올바른 분자의 정제는 다소 번거로우며, 생성물 수율도 낮다. 유사한 절차가 국제 공개 제93/08829호 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 바람직하게는, 이러한 융합은 적어도 힌지, CH2 및 CH3 영역의 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인과 융합된다. 융합체 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA, 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 세포에 동시에 형질감염시킨다. 이것은 제작에 사용되는 3가지 폴리펩티드 쇄를 동일하지 않은 비율로 사용하여 원하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어 보다 높은 유연성을 제공한다. 그러나, 비율이 같은 2가지 이상의 폴리펩티드 쇄가 높은 수율로 발현되거나 상기 비율이 원하는 쇄 조합의 수율에 별로 영향을 주지 않는 경우, 2가지 또는 3가지 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하나의 완에 있는 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 완에 있는 (제2의 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성되어 있다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하면 용이하게 분리되기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물을 용이하게 분리할 수 있도록 한다는 것이 밝혀졌다. 이 접근법은 국제 공개 제94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 제조에 대한 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율(％)을 최대화시킬 수 있다. 바람직한 경계면은 적어도 CH3 도메인의 일부를 포함한다. 이 방법에서는, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 보충용 "공동 (cavity)"을 제2 항체 분자의 경계면에 생성시킨다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물의 수율보다 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합된 항체 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 중의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링시키고 다른 하나는 비오틴에 커플링시킬 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 제안된 바 있고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 제안된 바 있다 (국제 공개 제91/00360호, 동 제92/200373호 및 유럽 특허 제03089호). 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
또한, 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기술이 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 결합을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질 가수분해시켜 F(ab')2 단편을 제조하는 절차가 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 나트륨 아르세니트의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 결합 형성을 방해한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 다시 전환시키고, 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로 사용할 수 있다.
최근 과학기술의 발전으로 인해 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접 회수하는 것이 용이하게 되었으며, 이는 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 제조에 대해 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되었으며, 지정된 시험관내 화학적 커플링 방법을 수행하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수도 있었다.
또한, 재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접 제조하고 단리하는 다양한 기술이 기재되어 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 제조한다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]). 유전자 융합에 의해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시킨다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 후에, 이를 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성한다. 또한, 이 방법은 항체 동종이량체를 제조하는데 이용될 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 별법의 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아 동일한 쇄 상에서 상기 두 도메인의 쌍을 형성할 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 또다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략도 보고되어 있다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조).
결합가가 2를 초과하는 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체도 제조할 수 있다 (문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]).
6. 이종접합체 항체
이종접합체 항체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이종접합체 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 제안되었거나 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 제안되었다 (국제 공개 제91/00360호, 동 제92/200373호 및 유럽 특허 제03089호). 상기 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 비롯한 합성 단백질 화학 분야에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 예를 들어 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것이 있다.
7. 다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현시키는 세포에 의해 2가 항체보다 보다 신속하게 내재화될 수 있고/있거나 이화될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 다른 클래스; 예를 들어 4가 항체)일 수 있는데, 이러한 다가 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함하거나 이로 구성되어 있다. 이 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 이 Fc 영역의 아미노-말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원의 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함하거나 이로 구성되어 있다. 상기 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하는데, 여기서 상기 폴리펩티드 쇄(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있는데, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 바람직하게는 2개 이상 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 더 포함한다. 본원의 다가 항체는, 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로는 CL 도메인을 더 포함한다.
8. 이펙터 기능 유전자조작
이펙터 기능과 관련하여, 본 발명의 항체를 변형시켜, 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)를 증대시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입함으로써 이 영역에 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 제조된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 능력 및 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 (문헌 [Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조). 또한, 문헌 [Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 이종이관능성 가교-링커를 사용하여 항종양 활성이 증대된 동종이량체 항체를 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 유전자조작하여 보체 용해능 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조). 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 구제 수용체 결합 에피토프를, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 항체 (특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.
9. 면역접합체
또한, 본 발명은 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 항체 (즉, 방사성접합체)를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 이들의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, α-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 다양한 방사성핵종을 방사성접합된 항체의 제조에 사용할 수 있다. 그 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 있다. 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 제조한다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성핵종과 항체의 접합에 사용되는 대표적인 킬레이팅제이다 (국제 공개 제94/11026호 참조).
항체 및 1종 이상의 소분자 독소 (예컨대, 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 나타내는 이들 독소의 유도체)로 구성된 접합체도 본원에서 고려된다.
메이탄신 및 메이탄시노이드
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-TAT 항체 (전장 또는 단편)는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합체화를 억제하는 작용을 하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카산 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 제3,896,111호). 이어서, 특정 미생물도 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀, 및 그의 유도체 및 유사체는, 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 동 제4,248,870호; 동 제4,256,746호; 동 제4,260,608호; 동 제4,265,814호; 동 제4,294,757호; 동 제4,307,016호; 동 제4,308,268호; 동 제4,308,269호; 동 제4,309,428호; 동 제4,313,946호; 동 제4,315,929호; 동 제4,317,821호; 동 제4,322,348호; 동 제4,331,598호; 동 제4,361,650호; 동 제4,364,866호; 동 제4,424,219호; 동 제4,450,254호; 동 제4,362,663호; 및 동 제4,371,533호 (이들의 개시사항은 본 명세서에 참고로 도입됨)에 개시되어 있다.
메이탄시노이드-항체 접합체
메이탄신 및 메이탄시노이드의 치료 지수를 향상시키기 위한 시도로서, 메이탄신 및 메이탄시노이드를 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 접합시켰다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체 및 이들의 치료 용도는, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호; 동 제5,416,064호; 및 유럽 특허 제0 425 235 B1호에 기재되어 있다 (이들의 개시사항은 본 명세서에 참고로 도입됨). 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 지시된 모노클로날 항체 C242에 연결된 메이탄시노이드 (DM1로 명명됨)를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 이러한 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 나타내었다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 메이탄시노이드가 디술피드 링커를 통해 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 접합되어 있거나 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 또다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 접합되어 있는 면역접합체가 기재되어 있다. 이러한 TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은, 시험관내에서 세포 당 3×105개의 HER-2 표면 항원을 발현시키는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험하였다. 이러한 접합체 약물은 메이탄시노이드 무함유 약물과 유사한 정도의 세포독성을 나타내었는데, 이 때 세포독성은 항체 한 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 강화시킬 수 있었다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.
항-TAT 폴리펩티드 항체-메이탄시노이드 접합체 (면역접합체)
항-TAT 항체-메이탄시노이드 접합체는 상기 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 저하시키지 않으면서 항-TAT 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조한다. 독소/항체는 하나의 분자라도 네이키드 항체를 사용할 때보다 세포독성을 증대시킬 것으로 예상되지만, 항체 분자 하나 당 평균 3 내지 4개 접합되어 있는 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향을 끼치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효과를 나타낸다. 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 및 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 방향족 환이 변형되거나 메이탄시놀 분자의 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
항체-메이탄시노이드 접합체를 제조하는데 사용되는 다수의 연결기가 당업계에 공지되어 있으며, 이 연결기에는, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 또는 유럽 특허 제0 425 235 B1호 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)] 및 2004년 10월 8일자에 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호에 개시되어 있는 것이 포함되며, 상기 특허 및 문헌의 개시 내용은 본원에 참고로 명백히 도입된다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 2004년 10월 8일자에 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 이러한 연결기에는 상기 언급된 특허에 개시된 디술피드기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기 또는 에스테라제 불안정기가 포함되는데, 디술피드 및 티오에테르기가 바람직하다. 추가 연결기가 본원에 기재되고 예시되어 있다.
상기 항체와 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 특히 바람직한 커플링제에는 디술피드 연결을 제공하는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP)가 포함된다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시켜 형성할 수 있다. 이 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
아우리스타틴 및 돌로스타틴
특정 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩티드성 유사체 및 유도체에 접합된 본 발명의 항체인 아우리스타틴 (미국 특허 제5,635,483호; 동 제5,780,588호)을 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 나타나 있으며 (문헌 [Woyke et al (2001) Antimicrob . Agents and Chemother . 45(12):3580-3584]), 항생제 (US 5,663,149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al (1998) Antimicrob . Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 잔기는 펩티드성 약물 잔기의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착할 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 문헌 ["Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 28, 2004] (문헌의 개시 내용은 그 전체가 참고로 명백하게 도입됨)에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 잔기 DE 및 DF (즉, MMAE 및 MMAF)를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기재 약물 잔기는 둘 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 간의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에서 익히 공지된 액상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조할 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 잔기는 US 5,635,483; US 5,780,588; 문헌 [Pettit et al (1989) J. Am . Chem . Soc . 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti - Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc . Perkin Trans . 1 5:859-863]; 및 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]의 방법에 따라 제조할 수 있다.
칼리케아미신
또다른 대상 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항-TAT 항체를 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 군은 피코몰 아래의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 군의 접합체를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 제5,712,374호, 동 제5,714,586호, 동 제5,739,116호, 동 제5,767,285호, 동 제5,770,701호, 동 제5,770,710호, 동 제5,773,001호, 동 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드사 (American Cyanamid Company)의 특허임)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (문헌 [Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드사의 미국 특허). 항체에 접합시킬 수 있는 또다른 항-종양 약물은 안티폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 모두 세포내 작용 부위를 가지며, 이들은 혈장 막을 용이하게 통과하지 못한다. 따라서, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 제제를 세포내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 증대된다.
기타 세포독성제
본 발명의 항-TAT 항체에 접합시킬 수 있는 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호에 기재된, 총괄적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 제제의 집단 뿐만 아니라 에스페라미신 (미국 특허 제5,877,296호)이 있다.
사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, α-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다 (예를 들어, 국제 공개 제93/21232호 (1993년 10월 28일자로 공개됨) 참조).
본 발명은 또한 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제, 또는 데옥시리보뉴클레아제와 같은 DNA 엔도뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체도 고려한다.
종양의 선별적 파괴를 위해, 항체는 방사성이 높은 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소를 사용하여 방사성 접합된 항-TAT 항체를 제조할 수 있다. 방사성 동위원소의 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다. 접합체를 진단에 사용하는 경우, 접합체는 신티그램 촬영 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기공명 (NMR) 영상화 (자기공명 영상화 (MRI)로도 공지되어 있음)용 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 다른 표지는 공지된 방법으로 접합체에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성되거나, 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 수반하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 펩티드에 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (문헌 [Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 이용하여 요오드-123을 도입시킬 수 있다. 다른 방법은 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에 상세하게 기재되어 있다.
항체 및 세포독성제로 구성된 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체와 방사성 뉴클레오티드의 접합에 사용되는 대표적인 킬레이팅제이다 (국제 공개 제94/11026호 참조). 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다제 민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커가 사용될 수 있다 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호]).
본 발명의 화합물은 비제한적으로 가교-링커 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB로 제조된 ADC, 및 시판되고 있는 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (예를 들어, 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.)를 고려한다. 문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]을 참조한다.
별법으로, 항-TAT 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접한 접합체의 두 부위, 또는 접합체의 원하는 성질을 파괴하지 못하는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되어 있는 접합체의 두 부위를 코딩하는 영역을 각각 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서는, 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위하여 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후에 킬레이팅제를 사용하여 결합되어 있지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
10. 면역리포좀
본원에 개시된 항-TAT 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. "리포좀"은 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 소형 소포체이다. 리포좀의 구성 성분은 공통적으로 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다. 이 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호; 및 국제 공개 제97/38731호 (1997년 10월 23일자로 공개됨)에 기재된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증가된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 제조할 수 있다. 공극 크기가 특정된 필터를 통해 리포좀을 통과시켜 원하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 임의로는, 화학요법제를 리포좀에 함유시킨다 (문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조).
B. TAT 결합 올리고펩티드
본 발명의 TAT 결합 올리고펩티드는 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. TAT 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법을 이용하여 화학적으로 합성하거나, 재조합 기술을 이용하여 제조 및 정제할 수 있다. TAT 결합 올리고펩티드의 길이는 일반적으로 아미노산 약 5개 이상, 다르게는 아미노산 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 100개 이상이며, 이 올리고펩티드는 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합될 수 있다. TAT 결합 올리고펩티드는 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있음을 유의한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 동 제5,750,373호, 동 제4,708,871호, 동 제4,833,092호, 동 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호, 동 제5,663,143호; 및 PCT 국제 공개공보 제84/03506호 및 동 제84/03564호; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)]; [Cwirla, S.E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]; [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624]; [Marks, J.D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 공지된 기술이며, 이 기술로 큰 규모의 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 구성원을 확인할 수 있도록 한다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 외피 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 (문헌 [Scott, J.K. and Smith, G.P. (1990) Science 249:386]). 파지 디스플레이의 유용성은 무작위적으로 선택된 단백질 변이체 (또는, 무작위적으로 클로닝된 cDNA)의 거대 라이브러리가 높은 친화성을 갖는 표적 분자에 결합하는 서열들에 대해 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상의 펩티드 (문헌 [Cwirla, S.E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]) 또는 단백질 (문헌 [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624]; [Marks, J.D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이는 수백만의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 스크리닝하기 위해 사용되어 왔다 (문헌 [Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위적인 돌연변이의 파지 라이브러리를 분류하는 것은 다수의 변이체를 제조하여 증식시키는 전략, 표적 수용체를 사용하는 친화성 정제 절차, 및 결합 증가의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다 (미국 특허 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호 및 동 제5,663,143호).
대부분의 파지 디스플레이 방법이 섬사상 파지를 이용하지만, 람다형 파지 디스플레이 시스템 (국제 공개 제95/34683호; 미국 특허 제5,627,024호), T4 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Ren et al., Gene 215:439 (1998)]; [Zhu et al., Cancer Research, 58(15):3209-3214] [Jiang, et al., Infection ＆ Immunity, 65(11):4770-4777]; [Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997)]; [Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996)]; [Efimov, V.P. et al., Virus Genes, 10:173 (1995)]) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257 (1993)]; 미국 특허 제5,766,905호)이 또한 공지되어 있다.
현재까지 기본적인 파지 디스플레이 개념이 수많은 다른 개선 및 변형된 개념으로 발전되어 왔다. 이러한 개선은 선택된 표적 분자에 결합하는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 디스플레이 시스템의 능력 및 원하는 특성에 대하여 이들 단백질을 스크리닝하는 능력을 가질 수 있는 기능성 단백질을 디스플레이하는 능력을 증대시킨다. 파지 디스플레이 반응에 대한 조합 반응 장치가 개발되었으며 (국제 공개 제98/14277호), 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 이분자 상호작용 (국제 공개 제98/20169호; 동 제98/20159호) 및 억제된 나선 펩티드의 특성 (국제 공개 제98/20036호)을 분석 및 제어한다. 국제 공개 제97/35196호는 리간드가 표적 분자에 결합하는 제1 용액 및 친화성 리간드가 표적 분자에 결합하지 않는 제2 용액과 파지 디스플레이 라이브러리를 접촉시켜 결합 리간드를 선택적으로 단리함으로써 친화성 리간드를 단리하는 방법을 기재하고 있다. 국제 공개 제97/46251호는 친화성 정제된 항체를 사용하여 무작위적인 파지 디스플레이 라이브러리를 바이오패닝 (biopanning)한 다음, 결합 파지를 단리하고, 이어서 마이크로플레이트 웰을 사용하는 마이크로패닝 방법에 의해 고친화성 결합 파지를 단리하는 방법을 기재하고 있다. 친화성 태그로서 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphlylococcus aureus) 단백질 A를 사용하는 것도 보고되어 있다 (문헌 [Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). 국제 공개 제97/47314호는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하는 기질 제외 라이브러리의 사용을 기재하고 있다. 파지 디스플레이를 이용하여 디터전트 (detergent)로 사용하기에 적합한 효소를 선택하는 방법은 국제 공개 제97/09446호에 기재되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선택하는 다른 방법은 미국 특허 제5,498,538호, 동 제5,432,018호, 및 국제 공개 제98/15833호에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리를 제조하고 이 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 또한 미국 특허 제5,723,286호, 동 제5,432,018호, 동 제5,580,717호, 동 제5,427,908호, 동 제5,498,530호, 동 제5,770,434호, 동 제5,734,018호, 동 제5,698,426호, 동 제5,763,192호 및 동 제5,723,323호에 개시되어 있다.
C. TAT 결합 유기 분자
TAT 결합 유기 분자는 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합하는, 본원에 정의된 올리고펩티드 또는 항체가 아닌 다른 유기 분자이다. TAT 결합 유기 분자는 공지된 방법을 이용하여 확인하고, 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 국제 공개공보 제00/00823호 및 동 제00/39585호 참조). TAT 결합 유기 분자는 통상적으로 크기가 약 2,000 달톤 미만이거나, 다르게는 약 1,500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 상기 유기 분자는 과도한 실험 없이도 공지된 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있음을 유의한다 (예를 들어, PCT 국제 공개공보 제00/00823호 및 동 제00/39585호 참조). TAT 결합 유기 분자는, 예를 들어 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물 또는 산 클로라이드 등일 수 있다.
D. 원하는 특성을 갖는 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 및 TAT 결합 유기 분자의 스크리닝
TAT 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 및 유기 분자의 제조 기술은 상기에 기재되어 있다. 원한다면, 특정한 생물학적 특징을 갖는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 추가로 선택할 수 있다.
본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자의 성장 억제 효과는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 TAT 폴리펩티드를 내재적으로 발현시키거나 또는 TAT 유전자로 형질감염된 후에 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 적절한 종양 세포주 및 TAT-형질감염된 세포를 다양한 농도의 본 발명의 항-TAT 모노클로날 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자로 며칠간 (예를 들어, 2 내지 7일 동안) 처리하고, 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나 다른 몇몇 비색측정 분석법으로 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또다른 방법은 본 발명의 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자의 존재 또는 부재하에 처리된 세포에 의한 3H-티미딘 흡수를 비교하는 것이다. 처리 후, 세포를 수확하고, DNA로 혼입된 방사성의 양을 섬광계수기로 정량화한다. 적절한 양성 대조군에는 선택된 세포주의 성장을 억제하는 것으로 공지된 성장 억제 항체로 처리된 세포주가 포함된다. 생체내 종양 세포의 성장 억제는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 결정할 수 있다. 바람직하게는, 종양 세포는 TAT 폴리펩티드를 과다발현시키는 세포이다. 바람직하게는, 한 실시양태에서 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자는 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖의 항체 농도에서 시험관내 또는 생체내에서 TAT-발현 종양 세포의 세포 증식을 처리되지 않은 종양 세포에 비해 약 25 내지 100％, 보다 바람직하게는 약 30 내지 100％, 보다 더 바람직하게는 약 50 내지 100％ 또는 70 내지 100％만큼 억제할 것이다. 성장 억제는 세포 배양물 중에서 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖ 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있는데, 이 때 상기 성장 억제는 종양 세포를 항체에 노출시키고 1 내지 10일 후에 결정한다. 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg의 항-TAT 항체를 투여한 결과 항체의 1차 투여일로부터 약 5일 내지 3개월, 바람직하게는 약 5일 내지 30일 이내에 종양 크기 또는 종양 세포의 증식이 감소된다면, 이는 항체가 생체내에서 성장 억제 효과를 나타냄을 의미한다.
세포 사멸을 유도하는 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자를 선별하기 위해, 예를 들어 프로피듐 요오다이드 (PI), 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 나타낸 막 일체성이 손상된 정도를 대조군과 비교하여 평가할 수 있다. PI 흡수 분석은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재하에 수행할 수 있다. TAT 폴리펩티드-발현 종양 세포는 배지하고만 인큐베이션하거나, 또는 예를 들어 약 10 ㎍/㎖의 적절한 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자를 함유하는 배지와 인큐베이션한다. 상기 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 각 처리를 수행한 후, 세포를 세척하고, 35 ㎜의 체로 캡핑 (capping)된 12×75 튜브에 분취하여 (튜브 당 1 ㎖, 처리군 당 3개의 튜브) 세포 덩어리를 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/㎖)를 넣는다. FACSCAN (등록상표) 유동세포계수기와 FACSCONVERT (등록상표) 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) 제품)를 이용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 결정된 통계학적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자를 세포 사멸 유도 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자로서 선별할 수 있다.
대상 항체에 의해 결합되는 TAT 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다. 이 분석은 시험 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자가 공지된 항-TAT 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는데 이용할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 에피토프 맵핑 (mapping)은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 서열을 알라닌 스캐닝과 같은 방법에 의해 돌연변이화시킴으로써 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이 항체는 먼저 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 시험하여 적절하게 폴딩되는지를 확인한다. 다른 방법에서, TAT 폴리펩티드의 상이한 영역에 상응하는 펩티드는 시험 항체, 또는 특성이 규명된 에피토프 또는 공지된 에피토프를 갖는 시험 항체와의 경쟁 분석에 사용할 수 있다.
E. 항체-의존성 효소-매개성 전구약물 요법 (ADEPT)
본 발명의 항체는, 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제; 국제 공개 제81/01145호 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체를 접합시킴으로써, ADEPT에 사용될 수도 있다 (예를 들어, 국제 공개 제88/07378호 및 미국 특허 제4,975,278호 참조).
ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분에는, 전구약물을 보다 높은 활성의 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소가 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 효소로는 포스페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물 절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 각각 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 별법으로, 당업계에서 "아브자임 (abzyme)"으로도 공지되어 있는, 효소 활성을 갖는 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)] 참조). 항체-아브자임 접합체를 본원에 기재된 바와 같이 제조하여 아브자임을 종양 세포 집단에 전달할 수 있다.
본 발명의 효소는, 상기 논의된 이종이관능성 가교결합제를 사용하는 것과 같이, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 항-TAT 항체에 공유 결합시킬 수 있다. 별법으로, 적어도 본 발명 효소의 기능 활성 부위에 연결된 본 발명 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)] 참조).
F. 전장 TAT 폴리펩티드
본 발명은 또한, 본 출원에서 TAT 폴리펩티드로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는, 새로 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열도 제공한다. 특히, 다양한 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA (부분 및 전장 cDNA)가 하기 실시예에 보다 상세하게 개시된 바와 같이 확인 및 단리되었다.
하기 실시예에 개시된 바와 같이, 다양한 cDNA 클론이 ATCC에 기탁되어 있다. 이들 클론의 실제 뉴클레오티드 서열은 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예상되는 아미노산 서열은 당업계의 통상적인 기술을 이용하여 뉴클레오티드 서열로부터 결정될 수 있다. 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드 및 코딩 핵산과 관련하여, 본원 발명자들은 출원 당시에 이용할 수 있는 서열 정보로 확인할 수 있는 가장 좋은 리딩 프레임으로 여겨지는 것이 무엇인지를 여러 경우에 대해 확인하였다.
G. 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드 변이체
본원에 기재된 항-TAT 항체 및 전장 천연 서열 TAT 폴리펩티드 이외에도, 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드 변이체도 제조될 수 있는 것으로 여겨진다. 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 코딩 DNA에 도입하고/하거나 원하는 항체 또는 폴리펩티드를 합성함으로써 제조할 수 있다. 당업자라면 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 막 부착화 특성의 변경과 같은 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 번역후 과정을 변경시킬 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 기재된 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 변이는, 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 열거된 보존적 및 비보존적 돌연변이에 대한 임의의 기술 및 지침을 이용하여 만들 수 있다. 변이는 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드에 비해 항체 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키는 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈이 치환, 결실 또는 삽입된 것일 수 있다. 임의로, 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 변이시킨다. 어떤 아미노산 잔기가 원하는 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 만들어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환한 것, 예를 들어 류신을 세린으로 치환하는 것, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙한 천연 서열에 의해 나타나는 활성에 대해 생성된 변이체를 시험함으로써 결정할 수 있다.
본원은 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 항체 또는 단백질과 비교하였을 때, 이러한 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 절단된 것일 수 있거나 또는 내부 잔기가 결실된 것일 수 있다. 특정 단편은 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기를 갖지 않는다.
항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드 단편은 다수의 통상적인 기술 중 임의의 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 원하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 접근법은 효소 분해 방법에 의해, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정의되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 알려진 효소로 처리하거나, 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 분해하고 원하는 단편을 단리함으로써 항체 또는 폴리펩티드 단편을 제조하는 것을 포함한다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 원하는 항체 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키는 것을 포함한다. DNA 단편의 원하는 말단부를 특정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드 단편은 본원에 개시된 천연 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
특정 실시양태에서, 대상물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 6에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 6에서 예시적인 치환으로서 명명되거나 아미노산 클래스에 대해 하기에 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
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항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조를, 예를 들어 쉬트 또는 나선형으로 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데 있어 그의 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생적인 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족; Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 상기 한 클래스의 구성원을 다른 클래스의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환된 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나, 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존적) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드-매개 (부위 지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 만들 수 있다. 위치-지정 돌연변이유발 (문헌 [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이유발 (문헌 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)]), 제한 선택 돌연변이유발 (문헌 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]) 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 대해 실시하여 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석을 이용하여 연속된 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 통상적으로, 알라닌은 베타-탄소 뒤의 측쇄를 제거하므로 변이체의 골격 형태를 변경시킬 가능성이 적기 때문에, 상기 군 중에서 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]). 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 매몰된 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 (문헌 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 적당한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기를 일반적으로는 세린으로 치환하여 상기 분자의 산화 안정성을 개선시키고 잘못된 가교결합을 방지할 수 있다. 바꾸어 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드에 첨가하여 (특히, 상기 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에) 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.
특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성 변이체(들)은 이들을 생성시키는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 나타낼 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화성 성숙화 방법을 포함한다. 요컨대, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)를 각 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환첨가 생성되도록 돌연변이화시킨다. 이와 같이 생성된 항체 변이체는, 섬사상 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 1가 형태로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이 변이체를 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)에 대해 본원에 개시된 바와 같이 스크리닝한다. 변형에 사용되는 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 인간 TAT 폴리펩티드 간의 접촉점을 확인하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이에 이웃하는 잔기가 본원에서 검토된 기술에 따라 치환되는 잔기 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 추가의 개발을 위해 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 우수한 특성을 갖는 항체를 선별할 수 있다.
항-TAT 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터 단리하는 방법 (자연발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개성 (또는 위치 지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 항-TAT 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
H. 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드의 변형
항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 유형은 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 제제를 사용하는 유도체화는, 예를 들어 항-TAT 항체 정제 방법에 사용되는 수-불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 가교결합시키거나, 또는 이와 반대로 수행하는데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제로는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 비롯한 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 제제가 있다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)]), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 항체 또는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변경을 포함한다. 본원의 목적에 있어서 "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 천연 서열 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 (잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 결실시킴) 및/또는 천연 서열 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 질적 변화를 포함한다.
항체 및 다른 폴리펩티드의 글리코실화는 통상적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. 'N-연결된'이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)의 트리펩티드 서열은 효소를 사용하여 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 부착시키는데 사용되는 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재하게 되어 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 나타내지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록실리신을 사용할 수도 있다.
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 상기 기재된 트리펩티드 서열을 하나 이상 함유하도록 아미노산 서열을 변경시켜 편리하게 수행한다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 변경은 본래의 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가하거나 또는 치환시킴으로써 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이화시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통해 임의로 변경시킬 수 있다.
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 국제 공개 제87/05330호 (1987년 9월 11일자로 공개됨) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소를 사용하여 수행하거나, 또는 글리코실화에 대한 표적으로 사용되는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환을 이용하여 수행할 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 효소에 의한 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 열거된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 상기 항체 또는 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다. 항체 또는 폴리펩티드는 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼에서, 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합체화 반응에 의해 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에 넣어 제조할 수 있다. 이러한 기술이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 개시되어 있다.
또한, 본 발명의 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부착된 형태의 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그가 도입되면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화성 정제를 통해 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들에 대한 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그에 대한 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]), c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]), 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그에 대한 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드로는 Flag-펩티드 (문헌 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]), KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]), α-튜불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])가 있다.
다른 실시양태에서, 키메라 분자는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태 ("이뮤노어드헤신"으로 언급되기도 함)의 경우, 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자에 1개 이상의 가변 영역 대신 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 가용성 형태 (결실 또는 실활된 막횡단 도메인 형태)로 치환된 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 제조하는 방법에 대해서는 미국 특허 제5,428,130호 (1995년 6월 27일자로 허여됨)를 참조한다.
I. 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드의 제조
하기 설명은 주로 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드 코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드를 제조하는 것에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 고려하여 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드를 제조할 수 있음도 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 그의 일부는 고상 기술을 이용하는 직접적인 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 자동화 합성법은, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 펩티드 합성기를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 여러 부분을 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합함으로써 원하는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
1. 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 여겨지는 조직으로부터 제작한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 DNA는 인체 조직으로부터 제작된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 공지된 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성 방법)에 의해 수득할 수 있다.
라이브러리는 대상 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 설계된 프로브 (예를 들어, 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 표준 절차를 이용하여 수행할 수 있다. 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 이용하는 것이다 (문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)]).
cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화될 때 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격성 및 고엄격성을 비롯한 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 제공한다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 진뱅크 (GenBank)와 같은 공용 데이타베이스 또는 개인 소유의 다른 서열 데이타베이스에 기탁되고 이들 데이타베이스로부터 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내부 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준)은 당업계에 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 필요하다면 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 통상적인 프라이머 연장 절차를 통해 전구체를 검출하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 생성에 사용되는 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양한다. 당업자라면 과도한 실험 없이도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾아볼 수 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개 방법 및 전기천공법이 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행한다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법 또는 전기천공법은 일반적으로 원핵생물에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은, 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983] 및 국제 공개 제89/05859호 (1989년 6월 29일자로 공개됨)에 기재된 바와 같이, 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이와 같이 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 국면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 통상적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:949 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행한다. 그러나, 세포에 DNA를 도입하는 다른 방법, 예컨대 핵내 미세주입, 전기천공법, 무손상 세포와 박테리아 원형질체 융합, 또는 다가양이온 (예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴)도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환에 사용되는 여러가지 기술에 대해, 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 장내세균 (Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 이. 콜라이 균주 K5 772 (ATCC 53,635)는 공개적으로 입수가능하다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포는 에스케리시아 (Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 등의 장내세균 (Enterobacteriaceae), 및 바실러스 (Bacillus), 예컨대 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, DD 266,710호 (1989년 4월 12일자로 공개됨)에 기재된 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예컨대 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서, 이에 한정되지는 않는다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이가 발생하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예로는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan r 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 미국 특허 제4,946,783호 (1990년 8월 7일자로 허여됨)에 개시된 돌연변이 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주가 있다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
전장 항체, 항체 단편 및 항체 융합 단백질은, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 예컨대 치료 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 접합되어 있고 면역접합체 자체가 종양 세포의 파괴에 효과를 나타내는 경우에 박테리아에서 제조할 수 있다. 전장 항체의 순환 반감기는 더 길다. 이. 콜라이에서 제조하는 것은 보다 신속하고 저렴한 효율적인 방법이다. 항체 단편 및 폴리펩티드를 박테리아에서 발현시키는 것은, 예를 들어 최적의 발현 및 분비를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기재하고 있는 미국 특허 제5,648,237호 (카터(Carter) 등), 동 제5,789,199호 (졸리(Joly) 등) 및 동 제5,840,523호 (시몬스(Simmons) 등)를 참조한다 (이들 특허는 본 명세서에 참고로 도입됨). 발현 후, 항체는 가용성 분취액으로 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리하고, 이소타입에 따라 예를 들어 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는, 예를 들어 CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하기 위한 방법과 유사하게 수행할 수 있다.
원핵세포 이외에, 섬사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (문헌 [Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 유럽 특허 제139,383호 (1985년 5월 2일자로 공개됨)); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)]), 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; 문헌 [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906; 문헌 [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)]), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (유럽 특허 제402,226호); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (유럽 특허 제183,070호; 문헌 [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (유럽 특허 제244,234호); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) (문헌 [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예컨대 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) (유럽 특허 제394,538호 (1990년 10월 31일자로 공개됨)); 및 섬사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (국제 공개 제91/00357호 (1991년 1월 10일자로 공개됨)) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) (문헌 [Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983)]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983)]; [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)]) 및 에이. 니게르 (A. niger) (문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)])가 포함된다. 메틸 영양요구성 효모가 본 발명에 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로에케라 (Kloeckera), 피치아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이들 클래스에 속하는 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 찾아볼 수 있다.
글리코실화된 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 곤충 세포, 예컨대 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9 뿐만 아니라, 식물 세포, 예컨대 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 세포 배양물이 포함된다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 애기프티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)와 같은 숙주로부터 유래된 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염에 사용되는 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따른 본 발명의 바이러스로서 사용될 수 있다.
그러나, 가장 큰 대상은 척추동물 세포에 있으며, 척추동물 세포를 배양물 (조직 배양물)에서 증식시키는 것은 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포, 또는 현탁 배양물에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포; 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 (Sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)가 있다.
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 생성을 위한 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨 다음, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
3. 복제가능한 벡터의 선택 및 사용
항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 공개적으로 입수가능하다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 성분을 하나 이상 함유하는 적합한 벡터의 제작은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.
TAT는 재조합 방법에 의해 직접 생성될 수 있을 뿐만 아니라, 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생성될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터에 삽입된 항-TAT 항체-코딩 DNA 또는 TAT 폴리펩티드-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 내독소 II 리더로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모에서의 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호에 기재됨) 포함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (유럽 특허 제362,179호 (1990년 4월 4일자로 공개됨)) 또는 국제 공개 제90/13646호 (1990년 11월 15일자로 공개됨)에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 포유동물 신호 서열, 예컨대 동일하거나 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질 분비를 지시할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 둘 모두 이들이 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 원점은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 복제 원점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 복제 원점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선별가능한 마커로도 지칭되는 선별 유전자를 함유할 것이다. 통상적인 선별 유전자, 예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함 보충제, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예로는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 코딩 핵산을 흡수할 수 있는 세포를 확인할 수 있게 하는 것, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나제가 있다. 야생형 DHFR이 사용될 경우, 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141(1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)]). trp1 유전자는 트립토판을 이용하여 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]).
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 mRNA 합성을 지시하는 항-TAT 항체- 또는 TAT 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터가 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터로는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980)]; 유럽 특허 제36,776호), 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)])가 있다. 또한, 박테리아 시스템에 사용되는 프로모터는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)]), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가 이점을 갖는 유도가능한 프로모터의 다른 효모 프로모터로는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 사용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 유럽 특허 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포내의 벡터로부터의 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 포울폭스 바이러스 (UK 제2,211,504호 (1989년 7월 5일자로 공개됨)), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻은 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열-충격 프로모터로부터 얻은, 숙주 세포 시스템에서 교환가능한 프로모터에 의해 제어된다.
고등 진핵생물에 의한 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 일반적으로 프로모터에 대해 작용하여 전사를 증가시키는, DNA (약 10 내지 300 bp)의 시스-작용 요소이다. 다수의 인핸서 서열은 출원 당시 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래되는 것으로 알려져 있었다. 그러나, 통상적으로는 진핵세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 원점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 있다. 인핸서는 벡터에 있는 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래된 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' (때로는 3')의 번역되지 않은 영역으로부터 입수할 수 있다. 이들 영역은 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 번역되지 않은 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다.
재조합 척추동물 세포 배양시 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 합성에 사용하기 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; 유럽 특허 제117,060호 및 동 제117,058호에 기재되어 있다.
4. 숙주 세포의 배양
본 발명의 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 제조에 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 햄 (Ham) F10 (시그마; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글즈 배지 (DMEM, 시그마)와 같은 시판되는 배지가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)]; [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)]; 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 동 제4,560,655호; 또는 동 제5,122,469호; 국제 공개 제90/03430호; 동 제87/00195호; 또는 미국 특허 등록 제30,985호에 기재된 임의의 배지가 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 중 임의의 배지는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예컨대, 헤페스 (HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신 (GENTAMYCIN; 상표명) 약물), 미량 원소 (통상적으로, 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 이와 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물도, 당업자에게 공지되어 있는 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 이용되고 있는 조건이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
5. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및/또는 발현은 본원에서 제공된 서열을 바탕으로 적절하게 표지된 프로브를 사용하여, 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 계내 혼성화에 의해 샘플에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중나선, RNA 이중나선 및 DNA-RNA 하이브리드 이중나선 또는 DNA-단백질 이중나선을 비롯한 특정 이중나선을 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 즉, 항체를 표지하고, 상기 이중나선을 표면에 결합시켜, 표면 상에 이중나선이 형성될 때 이중나선에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색과 같은 면역학적 방법, 및 세포 배양액 또는 체액의 분석을 통해 측정함으로써 유전자 생성물의 발현을 직접 정량화할 수 있다. 면역조직화학 염색 및/또는 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있으며, 이들은 임의의 포유동물에서 제조될 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 TAT 폴리펩티드, 본원에서 제공하는 DNA 서열 기재의 합성 펩티드, 또는 TAT-DNA에 융합되어 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
6. 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드의 정제
항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막에 결합된 경우, 적합한 디터전트 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나, 또는 효소 절단에 의해 상기 막으로부터 방출시킬 수 있다. 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제 등과 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴할 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 절차의 예로는, 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, DEAE) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 세파덱스 (Sephadex) G-75를 사용하는 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼, 및 항-TAT 항체 및 TAT 폴리펩티드의 에피토프 태그가 부착된 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼 등이 있다. 다양한 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)], [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 정제 단계(들)의 선택은, 예를 들어 사용되는 제조 방법 및 생성된 특정 항-TAT 항체 또는 TAT 폴리펩티드의 특성에 따라 달라질 것이다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 주변세포질 공간에서 세포내 생성되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내 생성되는 경우에는 첫번째 단계로서, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과를 수행하여 숙주 세포 또는 그의 용해된 단편인 미립자 잔해를 제거한다. 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비된 항체를 단리하기 위한 절차는 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에 기재되어 있다. 요컨대, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30 분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터 얻은 상층액은 우선 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치와 같은 시판되는 단백질 농축 여과기를 이용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 임의의 상기 단계에 포함시켜 단백질분해를 억제할 수 있고, 항생제을 포함시켜 외래 오염물의 성장을 방지할 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A가 적합한지 여부는 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄-기재의 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 대개의 경우 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 공동 크기가 조절된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같이 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스를 사용하여 달성할 수 있는 경우보다 유속을 더 빠르게 하며 프로세싱 시간을 더 단축시킬 수 있다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX(상표명) 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker; 미국 뉴저지주 필립스버그 소재) 제품)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라, 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (SEPHAROSE; 상표명) 상에서의 크로마토그래피 또는 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술도 이용할 수 있다.
임의의 예비 정제 단계(들)에 이어서, 대상 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물에 대해 pH 약 2.5 내지 4.5의 용출 완충액을 바람직하게는 낮은 염농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 사용하는 낮은 pH의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
J. 제약 제제
본 발명에 따라 사용되는 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드, TAT 결합 유기 분자 및/또는 TAT 폴리펩티드의 치료 제제는, 원하는 순도의 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하고, 이를 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장하여 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 아세테이트, 트리스 (Tris), 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 알콜 또는 벤질 알콜; 메틸 파라벤 또는 프로파일 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 트레할로스 및 염화나트륨과 같은 등장화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 폴리소르베이트와 같은 계면활성제; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온; 금속 착제 (예를 들어, Zn-단백질 착제) 및/또는 트윈(등록상표), 플루로닉스(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 있다. 바람직하게는, 상기 제제는 5 내지 200 mg/mL의 농도, 바람직하게는 10 내지 100 mg/mL의 농도의 항체를 포함한다.
필요한 경우, 본 발명의 제제는 필요하다면 치료될 특정 징후에 사용되는 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 유해한 영향을 끼치지 않는 보완 활성을 나타내는 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 또는 TAT 결합 유기 분자 이외에도, 추가의 항체, 예를 들어 TAT 폴리펩티드 상의 다른 에피토프에 결합하는 제2 항-TAT 항체 또는 특정 암의 성장에 영향을 끼치는 성장 인자와 같은 몇몇 다른 표적에 대한 항체를 제제에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토카인, 성장 억제제, 항-호르몬제 및/또는 심장보호제를 더 포함할 수 있다. 이러한 분자들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 배합되는 것이 적합하다.
또한, 활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합체와 반응 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐에 넣어 제조할 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 상기 항체를 함유하는 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포 (LUPRON DEPOT; 등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야만 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
K. 항-TAT 항체, TAT 결합 올리고펩티드 및 TAT 결합 유기 분자를 사용한 진단 및 치료
암에서의 TAT 발현을 결정하기 위해서, 다양한 진단 분석법이 이용가능하다. 한 실시양태에서, TAT 폴리펩티드의 과다발현은 면역조직화학법 (IHC)으로 분석할 수 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀 포매(embedding) 조직 절편을 IHC로 분석하고, 다음과 같은 TAT 단백질 염색 강도 기준을 적용할 수 있다:
스코어 0: 어떠한 염색도 관찰되지 않거나, 10％ 미만의 종양 세포에서 막 염색이 관찰된다.
스코어 1+: 10％ 초과의 종양 세포에서 희미하게/가까스로 인지가능한 막 염색이 검출된다. 이러한 세포는 이들의 막 일부에서만 염색된다.
스코어 2+: 10％ 초과의 종양 세포에서 약한 수준 내지 중간 수준의 완전한 막 염색이 관찰된다.
스코어 3+: 10％ 초과의 종양 세포에서 중간 내지 강한 수준의 완전한 막 염색이 관찰된다.
TAT 폴리펩티드 발현에 대하여 0 또는 1+의 스코어를 나타내는 종양은 TAT를 과다발현하지 않는 것을 특징으로 할 수 있는 반면, 2+ 또는 3+의 스코어를 나타내는 종양은 TAT의 과다발현을 특징으로 할 수 있다.
별법으로 또는 추가로, 포르말린으로 고정화시키고 파라핀에 포매시킨 종양 조직에 대해 FISH 분석 (예컨대, 인폼 (INFORM; 등록상표) (벤타나 (Ventana; 미국 애리조나주 소재) 제품) 또는 파트비전 (PATHVISION; 등록상표) (비시스 (Vysis; 미국 일리노이주 소재) 제품))을 수행하여 종양에서 TAT가 과다발현되는 경우 그 정도를 결정할 수 있다.
TAT 과다발현 또는 증폭은, 예를 들어 검출할 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어 방사성 동위원소 또는 형광 표지) 태그가 부착된 분자 (예컨대, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자)를 투여하고, 상기 표지가 국소화되어 있는 위치에 대해 환자를 외부에서 스캐닝하는 생체내 진단 분석법을 이용하여 평가할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 다양한 비치료 분야에 적용할 수도 있다. 본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 및 유기 분자는 TAT 폴리펩티드-발현 암의 진단 및 질병단계 분류 (예를 들어, 방사성영상화)에 유용할 수 있다. 상기 항체, 올리고펩티드 및 유기 분자는 세포로부터 TAT 폴리펩티드를 정제하거나 면역침전시키는 경우, TAT 폴리펩티드를 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯 등을 통해 시험관내에서 검출하여 정량하는 경우, 다른 세포의 정제를 위한 한 단계로서 혼합된 세포 집단으로부터 TAT-발현 세포를 사멸시키고 제거하는 데에도 유용하다.
최근, 암 치료는 암의 단계에 따라 암성 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선요법 및 화학요법 중 하나 또는 이들의 병용 요법을 포함한다. 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자 요법은 화학요법의 독성 및 부작용을 잘 견디지 못하는 나이든 환자의 경우 및 방사선요법의 사용이 제한된 전이성 질환의 경우에 특히 바람직할 수 있다. 본 발명의 종양 표적화 항-TAT 항체, 올리고펩티드 및 유기 분자는 TAT-발현 암을 상기 질환의 초기 진단 후에 또는 재발시에 완화시키는데 유용하다. 치료에 사용하는 경우, 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 단독으로 사용하거나, 또는 예를 들어 호르몬, 항-혈관신생제 또는 방사성 표지된 화합물과 함께, 또는 수술, 냉동요법 및/또는 방사선요법과 함께 사용할 수 있다. 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자 치료 제제는 다른 형태의 통상적인 요법과 병행하면서 통상적인 치료 요법 전후에 연속적으로 투여할 수 있다. 탁소테레(등록상표, 도세탁셀), 탁솔(등록상표, 파클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미톡산트론과 같은 화학요법 약물은 암의 치료, 특히 매우 위험한 환자의 치료에 사용된다. 암을 치료하거나 완화시키기 위한 본 발명의 방법에서, 암 환자에게 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 투여하면서 1종 이상의 상기 화학요법제의 처치를 병행할 수 있다. 특히, 파클리탁셀 및 변형된 유도체 (예를 들어, 유럽 특허 제0600517호 참조)와의 병용 요법도 고려된다. 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 치료상 유효한 투여량의 화학요법제와 함께 투여될 것이다. 다른 실시양태에서, 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 화학요법제, 예를 들어 파클리탁셀의 활성 및 효능을 증대시키기 위한 화학요법과 병행하면서 투여한다. 의사용 탁상 편람 (PDR)에는 다양한 암의 치료에 사용되어 온 이들 제제의 투여량이 개시되어 있다. 치료상 효과적인 상기 언급된 화학요법제 약물의 투약법 및 투여량은 치료받을 특정 암, 질환의 정도 및 당업계의 담당의에게 공지된 다른 인자에 따라 달라질 것이며, 이는 담당의가 결정할 수 있다.
한 특정 실시양태에서, 세포독성제에 접합된 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 포함하는 접합체를 환자에게 투여한다. 바람직하게는, TAT 단백질에 결합된 면역접합체가 세포에 내재화되어 결합하는 암세포를 사멸시키는 면역접합체의 치료 효능이 증가한다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 암세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다. 이러한 세포독성제의 예는 상기에 기재하였으며, 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제가 있다.
항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자, 또는 이들의 독소 접합체는 공지된 방법, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여에 의해, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 초내, 경구, 국소 또는 흡입 투여 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 정맥내 또는 피하 투여하는 것이 바람직하다.
기타 치료 요법을 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자의 투여와 병용할 수 있다. 병용 투여 방법에는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하여 함께 투여하는 방법 및 임의의 순서로 연속해서 투여하는 방법이 포함되는데, 이 때 두 가지 (또는 모든) 활성 제제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시기가 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 병용 투여 요법으로 상승적인 치료 효과가 나타난다.
항-TAT 항체(들), 올리고펩티드 또는 유기 분자의 투여는 특정 암과 관련된 다른 종양 항원에 대해 지시된 항체의 투여와 병행하는 것이 바람직할 수도 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 치료적 처치 방법은 항-TAT 항체(들), 올리고펩티드 또는 유기 분자와 1종 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제를 함께 투여하는 것을 포함하는데, 여기에는 다양한 화학요법제로 구성된 혼합물을 함께 투여하는 것이 포함된다. 화학요법제로는 에스트라무스틴 포스페이트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 시클로포스파미드, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산 (예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제가 있다. 이러한 화학요법제의 제조법 및 투여 스케쥴은 제조사의 지시에 따르거나 당업자에 의해 실험적으로 결정된 바에 따라 이용될 수 있다. 이러한 화학요법에 사용되는 제제 및 투여 스케쥴은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에도 기재되어 있다.
항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 항-호르몬 화합물, 예를 들어 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물; 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물 (유럽 특허 제616 812호 참조); 또는 플루타미드와 같은 항-안드로겐 화합물과 배합될 수 있다 (상기 분자들은 이들에 대해 공지된 투여량으로 사용됨). 치료될 암이 안드로겐 비의존성 암인 경우, 환자는 미리 항-안드로겐 요법으로 치료받을 수 있으며, 암이 안드로겐 비의존성이 된 후에는 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자 (임의로는, 본원에 기재된 다른 제제)를 상기 환자에게 투여할 수 있다.
종종, 심장보호제 (본 요법과 관련된 심근부전증을 예방하거나 감소시키기 위함) 또는 1종 이상의 사이토카인을 환자에게 함께 투여하는 것이 유익할 수도 있다. 또한, 상기 치료법 이외에도, 환자에서 수술에 의해 암세포를 제거하고/하거나 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자 요법 전에, 이 요법과 동시에, 또는 이 요법 후에 방사선요법을 수행할 수 있다. 함께 투여되는 상기 임의의 제제에 적합한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 이는 상기 제제와 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 낮아질 수 있다.
질환을 예방하거나 치료하기 위해서, 의사는 공지된 기준에 따라 투여량 및 투여 방식을 선택할 것이다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도와 경과 상태, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 예방 목적으로 투여하는지 또는 치료 목적으로 투여하는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자에 대한 환자의 반응, 및 담당의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 환자에게 한번에 투여하거나, 또는 치료 기간 전반에 걸쳐 연속적으로 투여하는 것이 적합하다. 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 정맥내 주입 또는 피하 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 환자에게 예를 들어 1회 이상 개별 투여하거나 연속 주입에 의해 투여하기 위한 초기 후보 투여량은 체중 1 kg 당 항체 약 1 ㎍ 내지 약 50 mg (예를 들어, 약 0.1 내지 15 mg/kg/투여량)일 수 있다. 투약법은 항-TAT 항체 약 4 mg/kg의 초기 로딩 투여량을 투여한 후에 항-TAT 항체 약 2 mg/kg의 유지 투여량을 매주 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 투약법이 유용할 수도 있다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 mg/㎏ 이상의 범위일 것이다. 상태에 따라, 며칠 또는 그 이상에 걸쳐 반복하여 투여하는 경우에는, 질환의 징후가 원하는 만큼 저해될 때까지 지속적으로 처치한다. 이러한 치료법의 진행 과정은 의사 또는 다른 당업자에게 공지되어 있는 기준을 바탕으로 통상적인 방법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.
항체 단백질을 환자에게 투여하는 것과는 별개로, 본 출원은 항체를 유전자 요법에 의해 투여하는 것을 고려한다. 이처럼 항체를 코딩하는 핵산을 투여하는 것은 "치료 유효량의 항체 투여"라는 표현이 포괄한다. 예를 들어, 세포내 항체를 제조하는 유전자 요법의 이용에 대해서는 국제 공개 제96/07321호 (1996년 3월 14일자로 공개됨)을 참조한다.
환자의 세포내로 핵산 (임의로는, 벡터에 함유되어 있음)을 주입하기 위한 2가지 주요 접근법이 있다 (즉, 생체내 및 생체외 접근법). 생체내 전달의 경우에는, 통상적으로 환자에서 항체가 요구되는 부위에 핵산을 직접 주사한다. 생체외 처치의 경우에는, 환자의 세포를 꺼낸 후에 이들 단리된 세포내로 핵산을 도입하고 이와 같이 변형된 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 또는 예를 들어 다공성 막 안에 캡슐화시켜 환자에게 이식한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 동 제5,283,187호 참조). 핵산을 살아있는 세포에 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이러한 기술은 상기 핵산이 배양된 세포로 시험관내에서 전달되는지, 아니면 의도된 숙주의 세포로 생체내에서 전달되는지에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포에 시험관내 전달하는데 적합한 기술로는 리포좀 사용법, 전기천공법, 미세주입법, 세포 융합법, DEAE-덱스트란 사용법, 인산칼슘 침전법 등이 있다. 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 포진 제I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기재의 시스템 (유전자의 지질-매개성 전달에 유용한 지질은, 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용하는 형질감염이 포함된다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 대한 검토를 위해, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, 국제 공개 제93/25673호 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌도 참조한다.
본 발명의 항-TAT 항체는 본원의 "항체"의 정의에 포함되는 다양한 형태일 수 있다. 따라서, 항체에는 전장 또는 무손상 항체, 항체 단편, 천연 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 융합 항체, 면역접합체 및 이들의 기능적 단편이 포함된다. 융합 항체에서, 항체 서열은 이종 폴리펩티드 서열에 융합된다. 항체는 원하는 이펙터 기능을 제공하도록 Fc 영역에서 변형될 수 있다. 하기 단락에서 보다 상세히 논의하고 있는 바와 같이, 세포 표면에 결합되어 있는 네이키드 항체는 적절한 Fc 영역과 함께, 예를 들어 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 통해 또는 보체-의존성 세포독성에 의한 보체의 동원 또는 다른 몇몇 메카니즘을 통해 세포독성을 유도할 수 있다. 별법으로, 이펙터 기능을 제거하거나 감소시켜 부작용 또는 치료 합병증을 최소화시키는 것이 바람직한 경우에는 특정한 다른 Fc 영역을 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프와의 결합 또는 실질적인 결합에 대해 경쟁한다. 구체적으로 생체내 종양 표적화 특성 및 임의의 세포 증식 억제 특성 또는 세포 독성 특성을 비롯한 본 발명의 항-TAT 항체의 생물학적 특성을 갖는 항체도 고려된다.
상기 항체를 제조하는 방법을 이하에 상세하게 기재한다.
본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 및 유기 분자는 포유동물의 TAT-발현 암을 치료하거나 상기 암의 하나 이상의 징후를 완화시키는데 유용하다. 이러한 암으로는 전립선암, 요도관의 암, 폐암, 유방암, 결장암 및 난소암, 보다 구체적으로는 전립선 선암종, 신장 세포 암종, 결장직장 선암종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종 및 흉막 중피종이 있다. 암에는 상기 임의의 암의 전이성 암도 포함된다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 포유동물에서 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 암세포의 적어도 일부에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 시험관내 또는 생체내에서 세포 상의 TAT 폴리펩티드에 결합시에 TAT-발현 종양 세포를 파괴 또는 사멸시키거나, 상기 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적이다. 이러한 항체에는 네이키드 항-TAT 항체 (어떠한 제제도 접합되어 있지 않음)가 포함된다. 네이키드 항체가 보유한 세포독성 또는 세포 성장 억제 특성은 종양 세포 파괴에 대해 이들 항체를 훨씬 더 강력하게 하는 세포독성제의 사용으로 보다 강화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 항체를 세포독성제에 접합시켜 면역접합체를 형성함으로써 항-TAT 항체에 세포독성을 부여할 수 있다. 세포독성제 또는 세포 성장 억제제는 소분자인 것이 바람직하다. 칼리케아미신 또는 메이탄시노이드, 및 그의 유사체나 유도체와 같은 독소가 바람직하다.
본 발명은 본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 암을 치료하기 위한 목적에 있어서, 상기 조성물을 암의 치료가 필요한 환자에게 투여할 수 있는데, 이 때 상기 조성물은 면역접합체로서 또는 네이키드 항체로서 존재하는 1종 이상의 항-TAT 항체를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 이들 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를, 화학요법제를 비롯한 세포독성제 또는 성장 억제제와 같은 다른 치료제와 함께 포함할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자 및 담체를 포함하는 제제도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 제제는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 제제이다.
본 발명의 다른 국면은 항-TAT 항체를 코딩하는 단리된 핵산이다. H 및 L쇄 둘 모두, 특히 초가변 영역 잔기, 천연 서열 항체를 코딩하는 쇄, 및 상기 항체의 변이체, 변형체 및 인간화 형태를 코딩하는 핵산도 포함된다.
본 발명은 치료 유효량의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 TAT 폴리펩티드-발현 암을 치료하거나 상기 암의 하나 이상의 징후를 완화시키는데 유용한 방법도 제공한다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자 치료 조성물은 의사의 지시에 따라 단기간 (단기) 또는 장기 투여하거나 간헐적으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명은 TAT 폴리펩티드-발현 세포의 성장을 억제하고 상기 세포를 사멸시키는 방법도 제공한다.
또한, 본 발명은 1종 이상의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 포함하는 키트 및 제품을 제공한다. 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 함유하는 키트는 예를 들어 TAT 세포 사멸 분석에 사용하거나, 또는 세포로부터 TAT 폴리펩티드를 정제 또는 면역침전시키는데 사용한다. 예를 들어, TAT의 단리 및 정제를 위해 상기 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 함유할 수 있다. 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 TAT를 시험관내에서 검출 및 정량화하기 위한 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 함유하는 키트를 제공할 수도 있다. 검출에 유용한 이러한 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 형광 또는 방사성 표지와 같은 표지와 함께 제공할 수 있다.
L. 제품 및 키트
본 발명의 다른 실시양태는 항-TAT 발현 암의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이다. 이러한 제품은 용기 및 이 용기에 부착된 라벨 또는 이 용기에 포함된 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기의 예로는 병, 바이알, 주사기 등이 있다. 이러한 용기는 유리 또는 플라스틱 등과 같은 다양한 재료로부터 제조될 수 있다. 상기 용기에는 암 증상의 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균된 입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 이러한 용기는 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액제 백 또는 바이알일 수 있음). 이러한 조성물 중의 1종 이상의 활성 제제는 본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자이다. 라벨 또는 포장 삽입물에는 조성물이 암의 치료에 사용된다는 것이 표시되어 있다. 상기 라벨 또는 포장 삽입물은 암 환자에게 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자 조성물을 투여하기 위한 지침서를 더 포함할 것이다. 또한, 상기 제품은 제약상 허용되는 완충액, 예를 들어 박테리아 증식 억제 주사용수 (BWFI), 인산염-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2의 용기를 더 포함할 수 있다. 제품은 상업적인 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질 (기타 완충액, 희석제, 여과제, 바늘 및 주사기 포함)을 더 포함할 수 있다.
다양한 목적, 예를 들어 TAT 발현 세포 사멸 분석, 세포로부터 TAT 폴리펩티드를 정제 또는 면역침전시키는데 유용한 키트도 제공한다. TAT 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 상기 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 함유할 수 있다. 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 TAT 폴리펩티드를 시험관내 검출 및 정량하기 위한 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 함유하는 키트를 제공할 수도 있다. 제품의 경우와 마찬가지로, 키트는 용기 및 이 용기에 부착된 라벨 또는 이 용기에 포함된 포장 삽입물을 포함한다. 상기 용기에는 1종 이상의 본 발명의 항-TAT 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 포함하는 조성물이 들어 있다. 예를 들어 희석제 및 완충액, 대조군 항체를 함유하는 용기를 더 포함시킬 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물에 대한 설명서 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단 용도로 사용하기 위한 지침서를 제공할 수 있다.
M. TAT 폴리펩티드 및 TAT 폴리펩티드 코딩 핵산의 용도
TAT 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체)은 분자생물학 분야에서 혼성화 프로브로서의 용도를 비롯하여 염색체 및 유전자 맵핑 및 안티센스 RNA 및 DNA 프로브의 제조에 있어서 다양한 용도를 갖는다. 또한, TAT 코딩 핵산은 본원에 기재된 재조합 기술에 의한 TAT 폴리펩티드의 제조에도 유용할 것이며, 여기서 TAT 폴리펩티드는 예를 들어 본원에 기재된 항-TAT 항체의 제조에 사용될 수 있다.
전장 천연 서열 TAT 유전자 또는 그의 일부는 본원에 개시된 천연 TAT 서열에 대해 원하는 서열 동일성을 갖는 전장 TAT cDNA 또는 다른 cDNA (예를 들어, TAT의 자연 발생 변이체 또는 다른 종으로부터의 TAT를 코딩하는 cDNA)를 단리하기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 임의로, 프로브의 길이는 염기 약 20개 내지 약 50개일 것이다. 혼성화 프로브는 적어도 전장 천연 뉴클레오티드 서열의 부분적으로 신규한 영역 (여기서, 이 영역은 과도한 실험 없이 결정할 수 있음) 또는 천연 서열 TAT의 프로모터, 인핸서 요소 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 방법은 공지된 DNA 서열을 사용하여 TAT 유전자의 코딩 영역을 단리하여 염기 약 40개로 이루어진 선택된 프로브를 합성하는 것을 포함할 것이다. 혼성화 프로브는 32P 또는 35S와 같은 방사성 뉴클레오티드, 또는 아비딘/비오틴 커플링 시스템을 통해 상기 프로브에 커플링된 알칼리성 포스파타제와 같은 효소 표지를 비롯한 다양한 표지로 표지할 수 있다. 본 발명의 TAT 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝함으로써 상기 라이브러리 중에서 프로브가 혼성화되는 구성원을 결정할 수 있다. 혼성화 기술은 하기의 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다. 본원에 개시된 방법을 이용하여, 본원에 개시된 임의의 EST 서열을 프로브로서 유사하게 사용할 수 있다.
TAT-코딩 핵산의 다른 유용한 단편에는 표적 TAT mRNA (센스) 또는 TAT-DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따른 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 TAT-DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 주어진 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에 기초하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은 예를 들어 문헌 [Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988)] 및 [van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)]에 기재되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열의 결합은 이중나선의 분해 증대, 전사 또는 번역의 조기 종결 등을 비롯한 여러가지 수단 중 하나 또는 다른 수단에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중나선을 형성한다. 이러한 방법은 본 발명에 포함된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 TAT 단백질의 발현을 차단할 수 있으며, 여기서 TAT 단백질은 포유동물에서 암을 유도하는 역할을 수행할 수 있다. 추가로, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 골격 (또는 다른 당 연결부, 예컨대 국제 공개 제91/06629호에 기재된 당 연결부)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 더 포함하며, 여기서 이러한 당 연결부는 내인성 뉴클레아제에 대한 내성을 갖는다. 내성 당 연결부를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정하지만 (즉, 효소 분해에 대해 내성이 있음), 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.
안티센스 결합에 바람직한 유전자내 부위는 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 번역 개시/출발 코돈 (5'-AUG/5'-ATG) 또는 종결/정지 코돈 (5'-UAA, 5'-UAG 및 5-UGA/5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA)이 혼입된 영역을 포함한다. 이들 영역은 mRNA 또는 유전자에서 번역 개시 또는 종결 코돈으로부터 어느 방향 (즉, 5' 또는 3')으로든 약 25개 내지 약 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 나타낸다. 안티센스 결합에 바람직한 다른 영역으로는 인트론; 엑손; 인트론-엑손 접합부; 오픈 리딩 프레임 (ORF) 또는 번역 개시 코돈과 번역 종결 코돈 사이의 영역인 "코딩 영역"; mRNA에서 5'-5' 트리포스페이트 연결부를 통해 mRNA의 5' 방향 마지막 잔기에 연결된 N7-메틸화 구아노신 잔기를 포함하고 5' 캡 구조 그 자체 뿐 아니라 상기 캡에 인접한 처음 50개 뉴클레오티드를 포함하는 5' mRNA의 캡; 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향의 부위여서 mRNA의 5' 캡 부위와 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자에서 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 일부인 번역되지 않은 5' 영역 (5' UTR); 및 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향의 부위여서 mRNA의 번역 종결 코돈과 3' 말단 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자에서 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 일부인 번역되지 않은 3' 영역 (3' UTR)이 있다.
TAT 단백질의 발현 억제에 유용한 바람직한 안티센스 화합물의 구체적인 예로는 변형된 골격 또는 비-천연 뉴클레오시드간 연결부를 함유하는 올리고뉴클레오티드가 있다. 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드로는 골격에 인 원자를 보유하는 올리고뉴클레오티드 및 골격에 인 원자를 갖지 않는 올리고뉴클레오티드가 있다. 본원 명세서의 목적에 있어서, 그리고 당업계에서 이따금 언급되는 바와 같이, 뉴클레오시드간 골격에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오시드로 간주될 수도 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드 골격의 바람직한 예로는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트 (3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트 포함), 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 정상적인 3'-5' 연결부, 이들의 2'-5' 연결 유사체를 갖는 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트, 및 1개 이상의 뉴클레오티드간 연결부가 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 연결부인 역전된 극성을 갖는 것들 등이 있다. 역전된 극성을 갖는 바람직한 올리고뉴클레오티드는 3' 방향 마지막 뉴클레오티드간 연결부에 1개의 3'-3' 연결부, 즉 염기가 결실되어 있을 수 있는 1개의 역전된 뉴클레오시드 잔기 (핵산염기 (nucleobase)가 결실되어 있거나, 그 대신 히드록실기를 보유함)를 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태도 포함된다. 인-함유 연결부의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제3,687,808호, 동 제4,469,863호, 동 제4,476,301호, 동 제5,023,243호, 동 제5,177,196호, 동 제5,188,897호, 동 제5,264,423호, 동 제5,276,019호, 동 제5,278,302호, 동 제5,286,717호, 동 제5,321,131호, 동 제5,399,676호, 동 제5,405,939호, 동 제5,453,496호, 동 제5,455,233호, 동 제5,466,677호, 동 제5,476,925호, 동 제5,519,126호, 동 제5,536,821호, 동 제5,541,306호, 동 제5,550,111호, 동 제5,563,253호, 동 제5,571,799호, 동 제5,587,361호, 동 제5,194,599호, 동 제5,565,555호, 동 제5,527,899호, 동 제5,721,218호, 동 제5,672,697호 및 동 제5,625,050호 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 도입됨)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.
인 원자를 내부에 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결부, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결부 또는 1종 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결부에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들로는 모르폴리노 연결부 (부분적으로는 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성됨)를 갖는 골격; 실록산 골격; 술피드, 술폭시드 및 술폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 술파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 술포네이트 및 술폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 골격이 있다. 이러한 올리고뉴클레오시드의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,034,506호, 동 제5,166,315호, 동 제5,185,444호, 동 제5,214,134호, 동 제5,216,141호, 동 제5,235,033 호, 동 제5,264,562호, 동 제5,264,564호, 동 제5,405,938호, 동 제5,434,257호, 동 제5,466,677호, 동 제5,470,967호, 동 제5,489,677호, 동 제5,541,307호, 동 제5,561,225호, 동 제5,596,086호, 동 제5,602,240호, 동 제5,610,289호, 동 제5,602,240호, 동 제5,608,046호, 동 제5,610,289호, 동 제5,618,704호, 동 제5,623,070호, 동 제5,663,312호, 동 제5,633,360호, 동 제5,677,437호, 동 제5,792,608호, 동 제5,646,269호 및 동 제5,677,439호 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 도입됨)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.
다른 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드에서는, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결부 (즉, 골격)가 둘 모두 새로운 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 이러한 올리고머 화합물 중에서 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 올리고뉴클레오티드 모방체를 펩티드 핵산 (PNA)이라 지칭한다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-주쇄는 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵산염기는 보유되어 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,539,082호, 동 제5,714,331호 및 동 제5,719,262호 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 도입됨)가 있으나 이에 한정되지는 않는다. PNA 화합물에 관한 추가의 교시는 문헌 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 찾아볼 수 있다.
바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 포스포로티오에이트 골격 및/또는 헤테로원자 골격, 및 특히 상기 언급된 미국 특허 제5,489,677호에 기재된 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지되어 있음), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2- (여기서, 천연 포스포디에스테르 골격은 -O-P-O-CH2-로 나타냄) 및 상기 언급된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 골격이 혼입되어 있다. 또한, 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드도 바람직하다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 치환된 당 잔기를 함유할 수도 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 OH; F; O-알킬, S-알킬 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐 또는 N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음) 중 하나를 포함한다. 특히 바람직한 것은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 (여기서, n 및 m은 1 내지 약 10임)이다. 다른 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 (reporter)기, 인터칼레이터 (intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성 개선을 위한 기 또는 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성 개선을 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체 중 하나를 포함한다. 바람직한 변형체는 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지되어 있음) (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]), 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 추가의 바람직한 변형체는 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 하기 실시예에 기재된 O(CH2)2ON(CH3)2기 (2'-DMAOE라고도 공지되어 있음) 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당업계에 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE라고도 공지되어 있음), 즉 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)를 포함한다.
추가의 바람직한 변형체는 2'-히드록실기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 있어 비시클릭 당 잔기를 형성하는 잠긴 (Locked) 핵산 (LNA)을 포함한다. 연결부는 바람직하게는 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는 메틸렌 (-CH2-)n기 (여기서, n은 1 또는 2임)이다. LNA 및 그의 제조법은 국제 공개 제98/39352호 및 동 제99/14226호에 기재되어 있다.
다른 바람직한 변형체는 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴 (2'-O-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 2'-변형은 아라비노 (상향) 위치 또는 리보 (하향) 위치일 수 있다. 바람직한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 내에 위치한 당의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 유사한 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 잔기와 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 이러한 변형된 당 구조물의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제4,981,957호, 동 제5,118,800호, 동 제5,319,080호, 동 제5,359,044호, 동 제5,393,878호, 동 제5,446,137호, 동 제5,466,786호, 동 제5,514,785호, 동 제5,519,134호, 동 제5,567,811호, 동 제5,576,427호, 동 제5,591,722호, 동 제5,597,909호, 동 제5,610,300호, 동 제5,627,053호, 동 제5,639,873호, 동 제5,646,265호, 동 제5,658,873호, 동 제5,670,633호, 동 제5,792,747호 및 동 제5,700,920호 (이들 문헌은 각각 전문이 본원에 참고로 도입됨)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.
올리고뉴클레오티드는 핵산염기 (당업계에서는 종종 간단하게 "염기"로 언급되기도 함) 변형 또는 치환을 포함할 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵산염기는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G) 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵산염기는 다른 합성 및 천연 핵산염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3 또는 -CH2-C≡CH) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 변형된 핵산염기는 트리시클릭 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 또한, 변형된 핵산염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로고리로 대체되어 있는 핵산염기, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수도 있다. 추가의 핵산염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 핵산염기, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley ＆ Sons, 1990]에 개시된 핵산염기 및 문헌 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 핵산염기를 포함한다. 이들 핵산염기 중 몇 가지가 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성 증가에 특히 유용하다. 이들에는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린 (2-아미노프로필아데닌 포함), 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중나선 안정성을 0.6 내지 1.2 ℃ 만큼 증가시키는 것으로 밝혀진 바 있고 (문헌 [Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 이것이 바람직한 염기 치환이며, 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 함께일 경우에는 훨씬 더 바람직한 염기 치환이다. 변형된 핵산염기의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제3,687,808호 뿐 아니라 미국 특허 제4,845,205호, 동 제5,130,302호, 동 제5,134,066호, 동 제5,175,273호, 동 제5,367,066호, 동 제5,432,272호, 동 제5,457,187호, 동 제5,459,255호, 동 제5,484,908호, 동 제5,502,177호, 동 제5,525,711호, 동 제5,552,540호, 동 제5,587,469호, 동 제5,594,121호, 동 제5,596,091호, 동 제5,614,617호, 동 제5,645,985호, 동 제5,830,653호, 동 제5,763,588호, 동 제6,005,096호, 동 제5,681,941호 및 동 제5,750,692호 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 도입됨)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 또다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포내 분포 또는 세포에 의한 흡수를 증대시키는 하나 이상의 잔기 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결시키는 것이다. 본 발명의 화합물은 관능기, 예컨대 1급 또는 2급 히드록실기에 공유 결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 접합체 기로는 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약동학적 성질을 증대시키는 기 및 올리고머의 약력학적 성질을 증대시키는 기가 있다. 통상적인 접합체 기로는 콜레스테롤, 지질, 양이온 지질, 인지질, 양이온성 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료가 있다. 본 발명과 관련하여 약동학적 성질을 증대시키는 기로는 올리고머의 흡수를 개선시키는 기, 분해에 대한 올리고머의 내성을 증대시키는 기 및/또는 RNA와의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 기가 있다. 본 발명과 관련하여, 약력학적 성질을 증대시키는 기로는 올리고머 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기가 있다. 접합체 잔기로는 지질 잔기, 예컨대 콜레스테롤 잔기 (문헌 [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556]), 콜산 (문헌 [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060]), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올 (문헌 [Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309], [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770]), 티오콜레스테롤 (문헌 [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538]), 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (문헌 [Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118], [Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330], [Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54]), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654], [Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 (문헌 [Manoharan et al., Nucleosides ＆ 뉴클레오티드s, 1995, 14, 969-973]) 또는 아다만탄 아세트산 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654]), 팔미틸 잔기 (문헌 [Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237]) 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 잔기가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들어 아스피린, 와파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 항-당뇨병제, 항-박테리아제 또는 항생제에 접합될 수도 있다. 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이들의 제조법은 미국 특허 출원 제09/334,130호 (1999년 6월 15일자 출원) 및 미국 특허 제4,828,979호, 동 제4,948,882호, 동 제5,218,105호, 동 제5,525,465호, 동 제5,541,313호, 동 제5,545,730호, 동 제5,552,538호, 동 제5,578,717호, 동 제5,580,731호, 동 제5,580,731호, 동 제5,591,584호, 동 제5,109,124호, 동 제5,118,802호, 동 제5,138,045호, 동 제5,414,077호, 동 제5,486,603호, 동 제5,512,439호, 동 제5,578,718호, 동 제5,608,046호, 동 제4,587,044호, 동 제4,605,735호, 동 제4,667,025호, 동 제4,762,779호, 동 제4,789,737호, 동 제4,824,941호, 동 제4,835,263호, 동 제4,876,335호, 동 제4,904,582호, 동 제4,958,013호, 동 제5,082,830호, 동 제5,112,963호, 동 제5,214,136호, 동 제5,082,830호, 동 제5,112,963호, 동 제5,214,136호, 동 제5,245,022호, 동 제5,254,469호, 동 제5,258,506호, 동 제5,262,536호, 동 제5,272,250호, 동 제5,292,873호, 동 제5,317,098호, 동 제5,371,241호, 동 제5,391,723호, 동 제5,416,203호, 동 제5,451,463호, 동 제5,510,475호, 동 제5,512,667호, 동 제5,514,785호, 동 제5,565,552호, 동 제5,567,810호, 동 제5,574,142호, 동 제5,585,481호, 동 제5,587,371호, 동 제5,595,726호, 동 제5,597,696호, 동 제5,599,923호, 동 제5,599,928호 및 동 제5,688,941호 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 상기 언급된 변형 중 하나 초과가 단일 화합물에 혼입될 수도 있거나, 또는 심지어 올리고뉴클레오티드내의 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수도 있다. 또한, 본 발명은 키메라 화합물인 안티센스 화합물도 포함한다. "키메라" 안티센스 화합물 또는 "키메라"는 본 발명의 문맥상 각각이 하나 이상의 단량체 단위 (즉, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에는 뉴클레오티드)로 제조된, 화학적으로 구분되는 영역을 둘 이상 함유하는 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 통상적으로, 이들 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 변형되어 상기 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 분해에 대한 내성 증가, 세포에 의한 흡수 증가 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화성 증가를 부여하는 영역을 하나 이상 함유한다. 올리고뉴클레오티드의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 기능할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포내 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H의 활성화로 인해 RNA 표적이 절단됨으로써, 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드 억제 효율이 크게 증대된다. 결과적으로, 키메라 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 동일한 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드에 비해 더 짧은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유사한 결과를 얻을 수도 있다. 본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 2종 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 상기 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 모방체의 합성 구조물로서 형성될 수 있다. 바람직한 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 3' 말단에 1종 이상의 2' 변형된 당 (바람직하게는 2'-O-(CH2)2-O-CH3)이 혼입되어 뉴클레아제 내성을 부여하고, 4개 이상의 연속적인 2'-H 당을 갖는 영역이 혼입되어 RNase H 활성을 부여한다. 이러한 화합물들은 당업계에서 하이브리드 또는 갭머 (gapmer)라고도 지칭되어 왔다. 바람직한 갭머는 3'-말단 및 5'-말단에 4개 이상의 연속적인 2'-H 당을 갖는 하나 이상의 영역에 의해 분리된 2' 변형된 당 (바람직하게는, 2'-O-(CH2)2-O-CH3) 영역을 가지며, 바람직하게는 포스포로티오에이트 골격 연결부가 혼입되어 있다. 이러한 하이브리드 구조물의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,013,830호, 동 제5,149,797호, 동 제5,220,007호, 동 제5,256,775호, 동 제5,366,878호, 동 제5,403,711호, 동 제5,491,133호, 동 제5,565,350호, 동 제5,623,065호, 동 제5,652,355호, 동 제5,652,356호 및 동 제5,700,922호 (이들 문헌은 각각 전문이 본원에 참고로 도입됨)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따라 사용되는 안티센스 화합물은 공지된 고상 합성 기술을 통해 편리하고 통상적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장치는 여러 회사, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 등이 판매하고 있다. 이러한 합성을 위해 당업계에 공지된 임의의 다른 수단을 추가로 또는 별법으로 이용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체의 제조시에 유사한 기술을 이용하는 것이 공지되어 있다. 본 발명의 화합물은 흡수, 분포 및/또는 흡착을 보조하기 위해 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물들의 혼합물, 예를 들어 리포좀, 수용체 표적화된 분자, 경구용 제제, 직장용 제제, 국소용 제제 또는 다른 제제와 혼합되거나 캡슐화되거나 접합되거나 또는 달리 결합될 수도 있다. 이러한 흡수, 분포 및/또는 흡착을 보조하기 위한 제제의 제조법을 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 제5,108,921호, 동 제5,354,844호, 동 제5,416,016호, 동 제5,459,127호, 동 제5,521,291호, 동 제5,543,158호, 동 제5,547,932호, 동 제5,583,020호, 동 제5,591,721호, 동 제4,426,330호, 동 제4,534,899호, 동 제5,013,556호, 동 제5,108,921호, 동 제5,213,804호, 동 제5,227,170호, 동 제5,264,221호, 동 제5,356,633호, 동 제5,395,619호, 동 제5,416,016호, 동 제5,417,978호, 동 제5,462,854호, 동 제5,469,854호, 동 제5,512,295호, 동 제5,527,528호, 동 제5,534,259호, 동 제5,543,152호, 동 제5,556,948호, 동 제5,580,575호 및 동 제5,595,756호 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 도입됨)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예로는 유기 잔기, 예컨대 국제 공개 제90/10048호에 기재된 잔기 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 잔기, 예컨대 폴리-(L-리신)과 공유결합된 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 있다. 또한, 엘립티신과 같은 인터칼레이팅제 및 알킬화제 또는 금속 착체를 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착하여 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.
예를 들어 CaPO4-매개 DNA 형질감염법, 전기천공법을 비롯한 임의의 유전자 전달 방법을 이용하거나, 또는 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 도입시킬 수 있다. 바람직한 절차에서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입한다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포를 생체내 또는 생체외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉시킨다. 적합한 레트로바이러스 벡터로는 뮤린 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유래된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C (국제 공개 제90/13641호 참조)로 지칭되는 이중 카피 벡터로부터 유래된 레트로바이러스 벡터가 있으나 이에 한정되지는 않는다.
또한, 국제 공개 제91/04753호에 기재된 바와 같이, 리간드 결합 분자에 접합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수도 있다. 적합한 리간드 결합 분자로는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 사이토카인 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 접합은, 리간드 결합 분자가 그의 상응하는 분자 또는 수용체에 결합하는 능력을 실질적으로 방해하지 않거나, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합된 형태가 세포에 진입하는 것을 실질적으로 차단하지 않는다.
별법으로, 국제 공개 제90/10448호에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 이러한 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 바람직하게는 세포내에서 내인성 리파아제에 의해 해리된다.
일반적으로, 안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 뉴클레오티드 약 5개 이상, 다르게는 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개, 810개, 820개, 830개, 840개, 850개, 860개, 870개, 880개, 890개, 900개, 910개, 920개, 930개, 940개, 950개, 960개, 970개, 980개, 990개 또는 1,000개 이상이며, 여기서 용어 "약"은 문맥상 언급된 뉴클레오티드 서열 길이±언급된 길이의 10％를 의미한다.
또한, 상기 프로브를 PCR 기술에 사용하여 밀접하게 관련된 TAT 코딩 서열의 확인을 위한 서열 풀 (pool)을 생성시킬 수도 있다.
또한, TAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 TAT를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전적 장애가 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브를 제작할 수도 있다. 본원에서 제공하는 뉴클레오티드 서열은 계내 혼성화, 공지된 염색체 마커에 대한 연결부 분석 및 라이브러리를 사용하는 혼성화 스크리닝과 같은 공지된 기술을 이용하여 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑시킬 수 있다.
TAT에 대한 코딩 서열이 또다른 단백질에 결합하는 단백질을 코딩하는 경우 (예를 들어, TAT가 수용체인 경우), TAT는 이러한 결합 상호작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 이러한 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제도 확인할 수 있다. 또한, 상기 결합 상호작용에 관여하는 단백질을 사용하여 상기 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 억제제 또는 효능제를 스크리닝할 수도 있다. 또한, 수용체 TAT를 사용하여 상관 관계가 있는 리간드(들)를 단리할 수도 있다. 스크리닝 분석을 설계하여 천연 TAT 또는 TAT에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 리드 화합물을 발견할 수 있다. 이러한 스크리닝 분석은 화합물 라이브러리에 대한 고처리량 스크리닝을 수행하는 분석을 포함하며, 이는 특히 소분자의 약물 후보 확인에 적합할 것이다. 고려되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 상기 분석은 당업계에 특성화된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기재 분석을 비롯한 다양한 형식으로 수행될 수 있다.
또한, TAT 또는 그의 변형된 형태를 코딩하는 핵산을 사용하여 트랜스제닉 동물 또는 "넉아웃" 동물을 제조할 수 있으며, 이들은 즉 치료학적으로 유용한 시약의 개발 및 스크리닝에 유용하다. 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)은 트랜스진 (transgene)을 함유하는 세포를 갖는 동물로, 이 트랜스진은 태아기, 예를 들어 배아 단계에서 상기 동물 또는 상기 동물의 조상에 도입된다. 트랜스진은 세포의 게놈내로 통합되는 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 생성된다. 한 실시양태에서, TAT를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 TAT를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고, 이 게놈 서열을 사용하여 TAT를 코딩하는 DNA를 발현시키는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 제조할 수 있다. 특히, 마우스 또는 래트와 같은 트랜스제닉 동물을 제조하는 방법은 당업계에 통상적인 것이 되었으며, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 동 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상적으로, 조직 특이적 인핸서를 갖는 TAT 트랜스진의 혼입에 대해 특정 세포가 표적화된다. 배아 단계에서 동물의 생식선에 도입된 TAT를 코딩하는 한 카피의 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여 TAT를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은, 예를 들어 TAT의 과다발현과 관련된 병리학적 증상을 보호할 것으로 여겨지는 시약에 대한 시험 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 국면에 따라, 동물에 상기 시약을 처치하면, 트랜스진을 보유하는 처치하지 않은 동물에 비해 병리학적 증상의 발생은 저하되며, 이는 상기 병리학적 증상에 대한 잠재적인 치료학적 개입을 나타낸다.
별법으로, TAT의 비-인간 상동체를 사용하여 TAT를 코딩하는 내인성 유전자와 이 동물의 배아 줄기 세포에 도입된 변경된 TAT 코딩 게놈 DNA 사이의 상동성 재조합의 결과로서 결함이 있어나 변형된 TAT 코딩 유전자를 갖는 TAT "넉아웃" 동물을 제작할 수 있다. 예를 들어, TAT를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 TAT를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. TAT를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 또는 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또다른 유전자로 대체될 수 있다. 통상적으로, 벡터내에는 수천개의 염기의 변형되지 않은 인접한 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대한 설명은 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조). 상기 벡터는 (예를 들어 전기천공법에 의해) 배아 줄기 세포주에 도입되고, 도입된 DNA와 내인성 DNA가 상동성 재조합된 세포를 선별한다 (예를 들어 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조). 이어서, 선별된 세포를 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포에 주사하여 군집 (aggregation) 키메라를 형성시킨다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 이어서, 키메라 배아를 적합한 가임신 대리모 동물에게 이식하여 이 배아가 "넉아웃" 동물을 제조할 수 있다. 생식선 세포내에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 자손을 표준 기술로 확인하고, 이를 사용하여 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 사육할 수 있다. 넉아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 TAT 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발생을 특징으로 할 수 있다.
TAT 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 유전자 요법에도 사용될 수 있다. 유전자 요법의 적용시에, 치료상 효과적인 유전자 생성물의 생체내 합성을 달성하기 위해 유전자는 세포내로 도입되어, 예를 들어 결함있는 유전자를 대체한다. "유전자 요법"은 1회 처치에 의해 효과가 지속되는 통상적인 유전자 요법 및 치료상 효과적인 DNA 또는 mRNA의 단일 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 생체내에서 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 세포막을 통한 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수는 제한이 있어서 이러한 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 이들이 세포내로 도입되어 억제제로 작용할 수 있음이 이미 밝혀져 있다 (문헌 [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)]). 이러한 올리고뉴클레오티드를 변형시킴으로써, 예를 들어 이들의 음으로 하전된 포스포디에스테르기를 하전되지 않은 기로 치환시킴으로써 이들의 흡수를 증대시킬 수 있다.
핵산을 살아있는 세포로 도입하는데 사용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술들은 핵산이 배양된 세포로 시험관내 전달되는가 또는 의도되는 숙주의 세포로 생체내 전달되는가에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포로 시험관내 전달하는데 적합한 기술은 리포좀 사용법, 전기천공법, 미세주입법, 세포 융합법, DEAE-덱스트란 사용법, 인산칼슘 침전법의 사용을 포함한다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전달 기술로는 바이러스 (통상적으로는, 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 외피 단백질-리포좀 매개성 형질감염이 있다 (문헌 [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)]). 어떤 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 제제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 갖는 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우에는, 세포내이입 (endocytosis)에 관여하는 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 사용하여 표적화하고/하거나 흡수를 용이하게 할 수 있으며, 이러한 단백질의 예로는 특정 세포 유형에 대해 친화성을 나타내는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화가 일어나는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질이 있다. 수용체-매개성 세포내이입 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)] 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)])에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 관한 검토를 위해, 문헌 [Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)]을 참조한다.
본원에 기재된 TAT 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자는 염색체의 확인에 유용하다. 이와 관련하여, 계속해서 새로운 염색체 마커를 확인할 필요가 있는데, 이는 실제 서열 데이타를 바탕으로 하는 사용가능한 염색체 마킹 시약이 현재로서는 비교적 적기 때문이다. 본 발명의 TAT 핵산 분자는 각각 염색체 마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 TAT 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 적합 검사에 진단용으로 사용할 수 있으며, 이 때 본 발명의 TAT 폴리펩티드는 다른 조직에 비해 한 조직에서, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 정상적인 세포에 비해 질환에 걸린 조직에서 차등적으로 발현될 수 있다. TAT 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석용 프로브를 제조하는데 사용될 것이다.
본 발명은 TAT 폴리펩티드를 모방하는 화합물 (효능제) 또는 TAT 폴리펩티드의 효과를 방해하는 화합물 (길항제)을 확인하기 위한 화합물 스크리닝 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 관한 스크리닝 분석법을 설계하여 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 TAT 폴리펩티드에 결합하거나 또는 이와 복합체를 형성하거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질의 상호작용을 달리 방해하는, 예를 들어 세포에서의 TAT 폴리펩티드 발현을 억제하는 화합물을 확인한다. 이러한 스크리닝 분석은 화합물 라이브러리에 대해 고처리량 스크리닝을 수행하는 분석법을 포함하며, 이는 소분자 약물 후보의 확인에 특히 적합할 것이다.
상기 분석법은 당업계에서 특성화된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포-기재 분석을 비롯한 다양한 형식으로 수행될 수 있다.
길항제에 대한 모든 분석법의 공통점은 약물 후보와 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩되는 TAT 폴리펩티드의 2가지 성분이 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 이들의 접촉을 요구한다는 점이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리되거나 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 TAT 폴리펩티드 또는 약물 후보는 공유결합 부착 또는 비공유결합 부착에 의해 고상, 예를 들어 미량역가 플레이트에 고정화시킨다. 비공유결합 부착은 일반적으로 고체 표면을 TAT 폴리펩티드 용액으로 코팅하여 건조시킴으로써 수행한다. 별법으로, 고정화될 TAT 폴리펩티드에 특이적인 고정화된 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 부착화시킬 수 있다. 상기 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정화되지 않은 성분을 고정화된 성분, 예를 들어 부착화된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완료되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척을 통해 제거하고, 고체 표면에 부착화된 복합체를 검출한다. 본래 고정화되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 보유하는 경우, 표면에 고정화된 표지의 검출은 복합체 형성이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정화되지 않은 성분이 표지를 보유하지 않는 경우, 예를 들어 고정화된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합체 형성을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 TAT 폴리펩티드와 상호작용하지만 이에 결합하지는 않는 경우, 후보 화합물과 상기 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 공지된 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석법은 종래의 접근법, 예를 들어 가교결합법, 동시-면역침전법 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제법 등을 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 필즈(Fields) 및 그의 동료들의 문헌 [Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)], [Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)]에 기재되어 있거나, [Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991)])에 개시된 효모-기재의 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 다수의 전사 활성인자, 예컨대 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2가지 모듈형 도메인으로 구성되어 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성화 도메인으로 기능한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "2-하이브리드 시스템"이라고 지칭함)은 이러한 성질의 이점을 이용하며, 2종의 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성화된 프로모터의 제어하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 달라진다. 상호작용하는 폴리펩티드들을 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 이용하여 2가지 특정 단백질들 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 키트 (MATCHMAKER; 상표명)는 클론테크 (Clontech)에서 시판된다. 또한, 이 시스템을 확대 적용하여 특정 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을 뿐 아니라, 이러한 상호작용에 중요한 아미노산 잔기를 정확하게 알아낼 수 있다.
본원에서 확인된 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분과의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다: 일반적으로, 상기 유전자 생성물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 이들 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행한다. 또한, 제3의 반응 혼합물에 양성 대조군으로서 기능하는 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 대조군 반응물(들)에서는 복합체가 형성되었으나 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않은 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 파트너와의 상호작용을 방해함을 나타낸다.
길항제를 분석하기 위해, TAT 폴리펩티드를 특정 활성에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 첨가할 수 있으며, TAT 폴리펩티드의 존재하에 대상 활성을 억제하는 화합물의 능력은 이 화합물이 TAT 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타낸다. 별법으로, 경쟁 억제 분석에 적절한 조건하에 TAT 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 TAT 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 합함으로써 길항제를 검출할 수 있다. TAT 폴리펩티드를 예컨대 방사성 표지함으로써 수용체에 결합된 TAT 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 측정할 수 있도록 하였다. 당업자에게 공지된 여러 가지 방법, 예를 들어 리간드 패닝법 및 FACS 분류법 (문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)])에 의해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있다. 바람직하게는, 발현 클로닝법이 사용되는데, 여기서 폴리아데닐화된 RNA는 TAT 폴리펩티드에 대해 반응성을 나타내는 세포로부터 제조되며, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 풀로 분류하고, 이를 사용하여 TAT 폴리펩티드에 대한 반응성을 나타내지 않는 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시킨다. 유리 슬라이드에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 TAT 폴리펩티드에 노출시킨다. 요오드화 또는 부위-특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 도입을 비롯한 여러가지 수단에 의해 TAT 폴리펩티드를 표지할 수 있다. 슬라이드를 고정시키고 인큐베이션한 후에 자기방사법으로 분석한다. 양성 풀을 확인하여 서브-풀을 제조하고, 상호작용성 서브-풀 및 재스크리닝 방법을 이용하여 다시 형질감염시킴으로써, 결국 추정되는 수용체를 코딩하는 단일 클론을 수득한다.
수용체를 확인하는 다른 접근법에서, 표지된 TAT 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현시키는 세포막 또는 추출물 제제에 광친화성-연결될 수 있다. PAGE를 통해 가교결합된 물질을 분리하여 X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단하고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 미세-서열분석 (micro-sequencing)을 수행할 수 있다. 미세-서열분석으로부터 얻은 아미노산 서열을 사용하여 다의성을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브 한 세트를 설계함으로써 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 추정되는 수용체를 코딩하는 유전자를 확인한다.
다른 길항제 분석법에서, 후보 화합물의 존재하에 수용체를 발현시키는 포유동물의 세포 또는 막 제제를 표지된 TAT 폴리펩티드와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 상기 상호작용을 증대시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예로는 이뮤노글로불린과 TAT 폴리펩티드의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 특히 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 (idiotypic) 항체, 및 이러한 항체 또는 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태 뿐 아니라 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 별법으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 영향을 끼치지 않아서 TAT 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 TAT 폴리펩티드의 돌연변이화된 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 TAT 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조물인데, 예를 들어 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA에 혼성화되어 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중나선의 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이 2가지 방법은 모두 폴리뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA의 결합을 바탕으로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙한 TAT 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분을 사용하여 염기쌍 약 10 내지 40개 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 대해 상보적이도록 설계하여 (삼중나선 - 문헌 [Lee et al., Nucl . Acids Res., 6:3073 (1979)], [Cooney et al,, Science, 241:456 (1988)], [Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), TAT 폴리펩티드의 전사 및 생성을 방해한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 혼성화되어 mRNA 분자의 TAT 폴리펩티드로의 번역을 차단한다 (안티센스 - 문헌 [Okano, Neurochem., 56:560 (1991)], [Oligode옥시뉴클레오티드s as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)] 참조). 또한, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현될 수 있도록 함으로써 TAT 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치와 +10 위치 사이로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
잠재적인 길항제로는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 TAT 폴리펩티드의 성장 인자 결합 부위 또는 다른 관련 결합 부위에 결합하여 TAT 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 있다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 있으나 이에 한정되지는 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA에 서열-특이적 혼성화된 후에 이를 엔도뉴클레아제에 의해 절단함으로써 작용한다. 공지된 기술에 의해 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994)] 및 PCT 국제 공개공보 제97/33551호 (1997년 9월 18일자로 공개됨)을 참조한다.
전사 억제에 사용되는 삼중나선형 핵산 분자는 단일 가닥이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 훅스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 형성 규칙을 통해 삼중나선의 형성을 촉진하도록 설계되어 있는데, 이 때 일반적으로는 이중나선 중 한쪽 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 필요하다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 상기한 PCT 국제공개공보 제97/33551호를 참조한다.
이들 소분자들은 상기 논의된 임의의 스크리닝 분석법 및/또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술 중 하나 이상에 의해 확인할 수 있다.
본원에서는 단리된 TAT 폴리펩티드 코딩 핵산을 사용하고, 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재된 기술을 이용하여 TAT 폴리펩티드를 재조합 방법에 의해 생성할 수 있다. 즉, 생성된 TAT 폴리펩티드는 당업계에 공지되어 있는 것으로, 본원에 기재된 기술을 이용하여 항-TAT 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
암을 비롯한 다양한 장애를 치료하기 위해, 본원에서 확인된 TAT 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 뿐만 아니라, 상기 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
TAT 폴리펩티드가 세포내에 있고 항체 전체가 억제제로 사용되는 경우에는 내재화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 (lipofection) 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 바탕으로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고/하거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)]을 참조한다.
또한, 본 발명의 제제는 치료할 특정 징후에 따라, 필요하다면 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 유해한 영향을 끼치는 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수도 있다. 별법으로 또는 추가로, 상기 조성물은 그의 기능을 증대시키는 제제, 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 배합하는 것이 적합하다.
하기의 실시예는 단지 설명을 위해 제공된 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
실시예에서 언급된 시판 시약들은 달리 명시하지 않는 한 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁번호로 확인되는 세포들의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 매나서스 소재)이다.
실시예 1: 진익스프레스 (GeneExpress; 등록상표)를 사용한 조직 발현 프로파일링
유전자 발현 정보를 함유하는 사설 데이타베이스 (진익스프레스(등록상표), 진 로직 인크. (Gene Logic Inc.; 메릴랜드주 게티스버그 소재)를 분석하여, 그의 발현이 대상 특정 인간 종양 조직(들)에서 다른 인간 종양(들) 및/또는 정상적인 인간 조직에 비해 유의하고 검출가능하게 상향조절되는 폴리펩티드 (및 그의 코딩 핵산)를 확인하였다. 구체적으로, 진익스프레스(등록상표) 데이타베이스의 분석을 진익스프레스(등록상표) 데이타베이스와 함께 사용하기 위한, 진 로직 인크. (메릴랜드주 게티스버그 소재)를 통해 시판되는 소프트웨어, 또는 진익스프레스(등록상 표) 데이타베이스와 함께 사용하기 위한, 제넨테크, 인크.에서 작성되고 개발된 사설 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 분석에서 양성 히트의 등급화는 예를 들어 조직 특이성, 종양 특이성 및 정상적인 필수 조직 및/또는 정상적인 증식 조직에서의 발현 수준을 비롯한 몇몇 범주에 기초한다. 하기 분자(들)는 특정 인간 종양(들)에서 다른 인간 종양(들) 및/또는 정상적인 인간 조직에 비해 높은 조직 발현 및 유의하고 재현가능하게 검출가능한 발현의 상향조절을 보여주는 조직 발현 프로파일, 및 임의로 정상적인 필수 조직 및/또는 정상적인 증식 인간 조직에서 상대적으로 낮은 발현을 나타낸다.
상기 기재된 발현 분석을 이용하여, TAT10772 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA는 특정 유형의 인간 암성 결장 및 직장 종양에서 각각 상응하는 정상적인 인간 결장 및 직장 조직에 비해 유의하고, 재현가능하고, 검출가능하게 과발현되는지 여부를 결정하였다.
A. 난소
첫번째 실험에서는, 89개의 독립적인 정상적인 인간 난소 조직 샘플 군에서 TAT10772의 발현에 대해 분석하였다. 이들 분석의 결과는 분석된 모든 정상적인 인간 난소 조직 샘플에서의 TAT10772 mRNA의 발현 수준이 현저하게 일정하며, 매우 조밀하게 분포되어 있음을 입증하며, 정상적인 인간 난소 조직 샘플에는, TAT10772 발현이 전체적인 샘플 군에서의 TAT10772 발현의 평균 수준에 비해 6배 넘게 증가하는 것으로 입증된 것이 없었다.
정량적 비교의 목적을 위해, 다양한 독립적이고 상이한 유형의 암성 인간 난 소 조직 샘플에서도 TAT10772 발현에 대해 분석하였다. 이들 분석에서 얻은 결과는 암성 샘플에서의 TAT10772의 발현 수준이 매우 가변적임을 입증하며, 암성 샘플의 유의한 수는 정상적인 결장 조직 샘플 군에 대한 TAT10772 발현의 평균 수준에 비해 TAT10772 발현이 6배 이상 (약 580배만큼 높게) 증가한 것으로 나타났다. 보다 구체적으로, 정상적인 결장에 비해 하기 난소 암 유형에 대해 검출가능하고 재현가능한 TAT10772 과발현이 관찰되었다 (각각의 암 유형에 대해 괄호에 나타낸 수는 분석된 정상적인 난소 조직 샘플 군에 대한 TAT10772 발현의 평균 수준에 비해 TAT10772 발현이 6배 이상 증가했음을 나타내는 독립적인 샘플의 수/분석된 독립적인 종양 샘플의 총 수를 나타냄): 자궁내막양 선암 (13/17), 유두양을 비롯한 장액성 낭선암종 (52/57), 및 투명 세포 선암종 (7/10). 추가의 실험을 수행하여, 이러한 결과를 확인하였다.
B. 유방
또다른 실험에서, 22개의 독립적인 정상적인 인간 유방 조직 샘플 군에서 TAT10772의 발현에 대해 분석하였다. 이들 분석의 결과는 분석된 모든 정상적인 인간 유방 조직 샘플에서의 TAT10772 mRNA의 발현 수준이 현저하게 일정하며, 매우 조밀하게 분포되어 있음을 입증하며, 정상적인 인간 유방 조직 샘플에는, TAT10772 발현이 전체적인 샘플 군에서의 TAT10772 발현의 평균 수준에 비해 2배 넘게 증가하는 것으로 입증된 것이 없었다.
정량적 비교의 목적을 위해, 209개의 독립적인 인간 HER-2 음성 침윤성 관상 암종의 유방 조직 샘플에서도 TAT10772 발현에 대해 분석하였다. 이들 분석에서 얻은 결과는 암성 샘플에서의 TAT10772의 발현 수준이 매우 가변적임을 입증하며, 시험된 209개의 샘플 중 76개는 분석된 정상적인 직장 조직 샘플 군에 대한 TAT10772 발현의 평균 수준에 비해 TAT10772 발현이 2배 이상 (약 15배만큼 높게) 증가한 것으로 나타났다.
C. 췌장
또다른 실험에서, 51개의 독립적인 정상적인 인간 췌장 조직 샘플 군에서 TAT10772의 발현에 대해 분석하였다. 이들 분석의 결과는 분석된 모든 정상적인 인간 췌장 조직 샘플에서의 TAT10772 mRNA의 발현 수준이 현저하게 일정하며, 매우 조밀하게 분포되어 있음을 입증하며, 정상적인 인간 췌장 조직 샘플에는, TAT10772 발현이 전체적인 샘플 군에서의 TAT10772 발현의 평균 수준에 비해 2배 넘게 증가하는 것으로 입증된 것이 없었다.
정량적 비교의 목적을 위해, 65개의 독립적인 인간 췌장 선암종 조직 샘플에서도 TAT10772 발현에 대해 분석하였다. 이들 분석에서 얻은 결과는 암성 샘플에서의 TAT10772의 발현 수준이 매우 가변적임을 입증하며, 시험된 65개의 샘플 중 33개는 분석된 정상적인 직장 조직 샘플 군에 대한 TAT10772 발현의 평균 수준에 비해 TAT10772 발현이 2배 이상 (약 21배만큼 높게) 증가한 것으로 나타났다.
상기로 볼 때, TAT10772 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 TAT10772 폴리펩티드, 및 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 다양한 포유동물 조직 샘플에서 정량적 및 정성적으로 측정하여 이들 사이를 정량적 및 정성적으로 비교하는데 이용될 수 있는 우수한 표적이다. 따라서, TAT10772, 및 상기 폴리펩티드 를 코딩하는 핵산은 상기 기재된 바와 같이 그의 고유한 발현 프로파일이 포유동물에서의 특정 유형의 암성 종양의 진단에 이용될 수 있는 분자이다. 더욱이, 상기 분석은 TAT10772 폴리펩티드가 특정 인간 종양에서 그의 상응하는 정상적인 인간 조직에 비해 유의하고, 재현가능하고, 검출가능하게 과발현됨을 입증하기 때문에, TAT10772 폴리펩티드는 포유동물에서 이러한 종양의 치료적 처치에 이용될 수 있는 우수한 표적으로서 작용한다.
실시예 2: 암성 종양에서의 TAT 폴리펩티드의 상향조절을 검출하기 위한 마이크로어레이 (microarray) 분석
흔히 수천가지 유전자 서열을 함유하는 핵산 마이크로어레이는 질환에 걸린 조직에서 그의 상응하는 정상적인 조직에 비해 차등적으로 발현되는 유전자를 확인하는데 유용하다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여, 시험군 및 대조군 조직 샘플로부터의 시험군 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생성하였다. 이어서, 상기 cDNA 프로브를 고체 지지체 상에 고정화시킨 핵산 어레이에 혼성화시켰다. 상기 어레이는 그의 각 구성원의 서열 및 위치가 공개되도록 배열하였다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현되는 것으로 알려진 유전자를 선택하여 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 표지된 프로브와 특정 어레이 구성원의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현시킨다는 것을 나타낸다. 시험 샘플 (질환에 걸린 조직)로부터 얻은 프로브의 혼성화 신호가 대조군 샘플 (정상적인 조직)로부터 얻은 프로브의 혼성화 신호보다 강한 경우, 상기한 질환에 걸린 조직에서 과다발현된 유전자(들)을 확인하였다. 이러한 결과는 질환에 걸린 조 직에서 과다발현된 단백질이 질환 증상의 존재에 대한 진단용 마커로서 뿐만 아니라 질환 증상의 치료를 위한 치료용 표적으로서도 유용하다는 것을 암시한다.
핵산의 혼성화 방법 및 마이크로어레이 기술은 당업계에 공지되어 있다. 한 예를 들어, 혼성화용 핵산 및 프로브의 제조, 슬라이드 및 혼성화 조건에 대한 구체적인 내용은 모두 PCT 특허 출원 PCT/US01/10482 (2001년 3월 30일자로 출원됨)에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
본 실시예에서는 특정 암성 종양(들)에서 과다발현된 상기 폴리펩티드를 확인하기 위한 시도로서, 다양한 인간 조직으로부터 유래된 암성 종양에서의 유전자 발현이 상이한 조직 유형의 암성 종양 세포 및/또는 비-암성 인간 조직으로부터의 암성 종양 세포에 비해 상향조절된 유전자에 대해 연구하였다. 특정 실험에서, 동일한 조직 유형의 암성 인간 종양 조직 및 비-암성 인간 종양 조직을 수득하고 (흔히 동일 환자로부터 얻음), TAT 폴리펩티드 발현에 대해 분석하였다. 또한, 다양한 임의의 다른 인간 종양으로부터의 암성 인간 종양 조직을 수득하고, 간, 신장 및 폐 등의 상피로부터 유래된 비-암성 인간 조직을 모아 제조한 "보편적인 (universal)" 상피 대조군 샘플과 비교하였다. 모은 상피 조직으로부터 단리한 mRNA는 여러 상이한 상피 조직으로부터 발현된 유전자 생성물들의 혼합물을 나타내며, 이로써 상피 기원의 종양에서 유전자 발현 수준을 정량적으로 비교하기에 우수한 음성 대조군이 제공된다. 상기에서 모은 대조군 샘플을 사용하는 마이크로어레이 혼성화 실험은 2-색 분석에서 선형 플롯을 생성하였다. 이어서, 2-색 분석에서 생성된 직선의 기울기를 이용하여 각 실험에서의 (시험군:대조군 검출량) 비율을 표준화하였다. 이어서, 다양한 실험으로부터 얻은 표준화된 비율을 비교하고, 이를 이용하여 유전자 발현의 밀집 여부를 확인하였다. 따라서, 상기에서 모은 "보편적인 대조군" 샘플은 간단한 2개의 샘플을 비교할 때 비교적 효과적인 유전자 발현 측정 수단일뿐 아니라, 여러 실험을 통해 다수의 샘플을 비교할 수도 있게 한다.
본 실험에서는, 본원에 기재된 TAT 폴리펩티드-코딩 핵산 서열로부터 유래된 핵산 프로브를 사용하여 마이크로어레이를 제작하였으며, 이를 다양한 종양 조직으로부터 얻은 RNA를 사용하여 혼성화시켰다. 표준화된 비:실험적 비를 기준으로 한 값을 "컷오프(cutoff) 비"로 지칭한다. 상기 컷오프 비에 해당하는 값만이 유의한 것으로 결정된다. 비의 유의성은 각 실험과 관련된 노이즈 또는 스캐터의 양으로부터 추정되지만, 통상적으로는 상응하는 정상적인 조직 및/또는 모은 정상적인 상피의 보편적 대조군에 비해 종양 샘플에서 상대적으로 과다발현되는 후보 유전자를 확인하기 위해 1.8배 내지 2배 이상의 컷오프 비를 사용한다. 상기 방법에서 종양 샘플에서 상대적으로 과다발현되는 것으로 확인된 유전자에 대한 비는 2배 내지 40배, 또는 그 이상이다. 동일한 RNA를 각각의 색으로 표지하고 그 자신에 대해 혼성화시키는 대조 실험에서 배경보다 높은 신호를 갖는 모든 유전자를 실질적으로 비교하여 관찰된 비는 1.8배보다 유의하게 낮았다. 이러한 결과는 비가 1.8배를 초과하는 실험적 노이즈가 매우 낮고, 1.8배 이상의 관찰된 배율의 변화는 분석 및 비교된 샘플 사이에서 실제로 검출가능하고 재현가능한 발현의 차이를 나타낼 것으로 예상된다.
이러한 실험의 결과는 TAT10772 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA가 정상적인 인간 결장 조직 및 모은 표피 대조군 샘플 둘다에 비해 10개 중 8개의 독립적인 인간 난소 종양 샘플에서 유의하게 과발현됨 (즉, 2배 이상)을 입증하였다. 이들 데이타는 또한 관찰된 과발현이 정상적인 대응 인간 난소 샘플 뿐만 아니라 풀링된 인간 표피 대조군 샘플 둘다에 비해 다수의 인간 난소 종양 샘플에 걸쳐 유의하고, 검출가능하고, 재현가능함을 입증하였다. 상기 기재된 바와 같이, 이들 데이타는 본 발명의 TAT10772 폴리펩티드 및 코딩 핵산이 인간 난소 종양의 존재에 대한 진단용 마커로서 유용할 뿐만 아니라, 인간에서 상기 종양의 치료를 위한 잠재적인 치료 표적으로서 작용함을 입증하였다.
실시예 3: TAT mRNA 발현의 정량적 분석
상기 분석에서, 5' 뉴클레아제 분석 (예를 들어, 태크맨 (TaqMan; 등록상표)) 및 실시간 정량적 PCR (예를 들어, ABI 프리즘 (Prizm) 7700 서열 검출 시스템 (등록상표) (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer), 어플라이드 바이오시스템즈 디비전 (Applied Biosystems Division; 캘리포니아주 포스터 시티 소재)을 이용하여 암성 종양(들)에서 다른 암성 종양 또는 정상적인 비-암성 조직에 비해 유의하게 과발현된 유전자를 찾았다. 5' 뉴클레아제 분석 반응은 Taq DNA 폴리머라제 효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 유전자 발현을 실시간으로 모니터링하는 형광 PCR-기재 기술이다. 2가지 올리고뉴클레오티드 프라이머 (그의 서열은 대상 유전자 또는 EST 서열에 기초함)를 이용하여 PCR 반응에 전형적인 앰플리콘을 생성하였다. 제3 올리고뉴클레오티드, 또는 프로브를 2가지 PCR 프라이머 사이에 위치된 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 설계하였다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 신장되지 않으며, 리포터 형광 염료 및 켄쳐 형광 염료로 표지된다. 2가지 염료가 이들이 프로브 상에 있는 것처럼 함께 가깝게 위치될 경우 리포터 염료로부터의 임의의 레이저-유도된 방출은 켄칭 염료에 의해 켄칭된다. PCR 증폭 반응 동안, Taq DNA 폴리머라제 효소는 주형-의존적 방식으로 프로브를 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액에서 해리되며, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2 형광프로브의 켄칭 효과로부터 자유롭다. 리포터 염료의 한 분자는 합성된 각각의 새로운 분자에 대해 유리되며, 비켄칭된 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 및 정성적 해석의 근거를 제공한다. 2가지 상이한 인간 조직 샘플 사이의 유전자 발현 차이를 정량적으로 확인하는 상기 분석은 당업계에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Higuchi et al.. Biotechnology 10:413-417 (1992)]; [Livak et al., PCR Methods Appl., 4:357-362 (1995)]; [Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996)]; [Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(25):14717-14722 (1998)]; [Pitti et al., Nature 396(6712):699-703 (1998)] 및 [Bieche et al., Int. J. Cancer 78:661-666 (1998)] 참조).
5' 뉴클레아제 절차는 ABI 프리즘 7700TM 서열 검출과 같은 실시간 정량적 PCR 장치 상에서 구동된다. 시스템은 열순환기, 레이저, 전하-결합 소자 (CCD) 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 시스템은 열순환기 상에서 샘플을 96-웰 포맷으로 증폭한다. 증폭하는 동안, 레이저-유도된 형광 신호는 모든 96 웰에 대해 섬유 광학 케이블을 통해 실시간으로 수집되며, CCD에서 검출된다. 시스템은 기기를 구동 하고 데이타를 분석하는 소프트웨어를 포함한다.
스크린을 위한 출발 물질은 다양한 상이한 암성 조직으로부터 단리된 mRNA였다. mRNA는 예를 들어 형광측정상 정확하게 정량된다. 음성 대조군으로서, RNA를 시험될 암성 조직과 동일한 조직 유형의 다양한 정상적인 조직으로부터 단리하였다. 대개, 종양 샘플(들)은 동일한 조직 유형의 "매칭된" 정상적인 샘플(들)과 직접적으로 비교되며, 이는 종양 및 정상적인 샘플(들)이 동일한 개체로부터 수득됨을 의미한다.
5' 뉴클레아제 분석 데이타는 처음에 Ct, 또는 역치 사이클로서 표현된다. 이는 리포터 신호가 형광의 배경 수준 초과로 축적되는 사이클로서 정의된다. ΔCt 값은 암 mRNA 결과를 정상적인 인간 mRNA 결과와 비교할 경우 핵산 샘플에서 특정 표적 서열의 출발 카피의 상대적 수의 정량적 측정치로서 사용된다. 1 Ct 단위는 1 PCR 사이클 또는 정상적인 조직에 비해 대략 2배의 상대 증가에 상응하며, 2 단위는 4배의 상대 증가에 상응하며, 3 단위는 8배의 상대 증가에 상응하는 등이며, 2개 이상의 상이한 조직 사이의 mRNA 발현의 상대 배수 증가를 정량적 및 정성적으로 측정할 수 있다. 이에 관해, 상기 분석은 정상적인 대조군에 비해 인간 종양 샘플에서의 mRNA 발현의 2배의 이상 증가를 재현가능하게 검출하기에 충분히 기술적으로 감수성이라는 것이 당업계에 널리 수용되어 있다.
상기 기술을 이용하여, 본 출원에서 TAT10772 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA가, 종양 샘플(들)이 유래된 동일한 인간 조직 공여자로부터 유래된 다양한 "매칭된" 정상적인 인간 결장 종양 샘플 뿐만 아니라 상이한 인간 조직 공여자로부터의 정상적인 인간 결장 샘플 둘다에 비해 9개의 독립적인 인간 결장 종양 샘플 중 모든 9개에서 유의하고 재현가능하게 과발현된 (즉, 2배 이상) 것으로 결정되었다. 따라서, 상기 기재된 바와 같이, 상기 데이타는 본 발명의 TAT10772 폴리펩티드, 및 코딩 핵산이 인간 결장 종양의 존재에 대한 진단적 마커로서 유용할 뿐만 아니라, 인간에서 상기 종양의 치료를 위한 잠재적인 치료 표적으로서 작용함을 입증한다.
실시예 4: 계내 혼성화
계내 혼성화는 세포 또는 조직 제조물 내의 핵산 서열 검출 및 위치화를 위한 강력한 다용도의 기술이다. 이는 예를 들어 유전자 발현의 부위를 확인하고, 전사 조직 분포를 분석하고, 바이러스 감염을 확인 및 위치화하고, 특이적 mRNA 합성의 변화를 따르고, 염색체 맵핑을 보조하는데 유용할 수 있다.
계내 혼성화는 PCR로 생성된 33P-표지된 리보프로브를 이용하여, 문헌 [Lu and Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994)]에 의한 프로토콜의 최적화된 버전에 따라 수행된다. 간략히, 포르말린으로 고정된 파라핀이 삽입된 인간 조직을 절단하고, 프로테이나제 K (20 g/mL)에서 15분 동안 37 ℃에서 탈파라핀화, 탈단백질화시키고, [Lu and Gillett, 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 계내 혼성화를 위해 추가로 가공한다. 33P-UTP-표지된 안티센스 리보프로브를 PCR 생성물로부터 생성하고, 55 ℃에서 밤새 혼성화시켰다. 슬라이드를 코닥 (Kodak) NTB2 핵 자국 건판에서 디핑하고, 4주 동안 노출시켰다.
33 P-리보프로브 합성
33P-UTP (아머샴 BF 1002, SA<2000 Ci/mol) 6.0 ㎕ (125 mCi)를 고속 진공 건조시켰다. 건조된 33P-UTP를 함유하는 각각의 튜브에 하기 성분을 첨가하였다.
2.0 ㎕ 5x 전사 완충액
1.0 ㎕ DTT (100 mM)
2.0 ㎕ NTP 믹스 (2.5 mM: 10 μ; 각각 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 ㎕ H2O)
1.0 ㎕ UTP (50 μM)
1.0 ㎕ Rnasin
1.0 ㎕ DNA 주형 (1 ㎍)
1.0 ㎕ H2O
1.0 ㎕ RNA 폴리머라제 (통상적으로 PCR 생성물 T3 = AS, T7 = S에 대해)
튜브를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1.0 ㎕ RQ1 DNase를 첨가한 후, 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ TE (10 mM 트리스 pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0)를 첨가하고, 혼합물을 DE81 페이퍼 상에 피펫팅하였다. 잔류 용액을 마이크로콘 (Microcon)-50 한외여과 유닛에 로딩하고, 프로그램 10을 이용하여 스피닝하였다 (6분). 여과 유닛의 위치를 제2 튜브 위로 바꾸고, 프로그램 2를 이용하여 스피닝하였다 (3분). 최종적인 회수 스핀 후, 100 ㎕ TE를 첨가하였다. 최종 생성물 1 ㎕를 DE81 페이퍼 상에 피펫팅하고, 바이오플루오르 (Biofluor) II 6 mL에서 계수하였다.
프로브를 TBE/우레아 겔 상에서 구동시켰다. 프로브 1 내지 3 ㎕ 또는 RNA Mrk III 5 ㎕를 로딩 완충액 3 ㎕에 첨가하였다. 95 ℃ 열 블록 상에서 3분 동안 가열한 후, 프로브를 즉시 얼음 위에 놓았다. 겔의 웰을 플러싱하고, 샘플을 로딩하고, 180 내지 250 볼트에서 45분 동안 구동시켰다. 겔을 사란 랩에 감싸고, -70 ℃ 동결기에서 1시간 내지 밤새 증강 스크린으로 XAR 필름에 노출시켰다.
33 P-혼성화
A. 동결된 섹션의 예비처리
슬라이드를 동결기로부터 제거하고, 알루미늄 트레이 위에 놓고, 실온에서 5분 동안 해동시켰다. 트레이를 55 ℃ 인큐베이터에 5분 동안 놓아서 응축을 감소시켰다. 슬라이드를 퓸 후드에서 얼음 상에서 4％ 파라포름알데히드에서 10분 동안 고정시키고, 0.5 x SSC에서 실온에서 5분 동안 세척하였다 (25 mL 20 x SSC + 975 mL SQ H2O). 0.5 ㎍/mL 프로테이나제 K (250 mL 예비가열된 RNase-무함유 RNAse 완충액 중 10 mg/mL 원액 12.5 ㎕)를 37 ℃에서 10분 동안 탈단백질화시키고, 섹션을 0.5 x SSC에서 실온에서 10분 동안 세척하였다. 섹션을 70％, 95％, 100％ 에탄올에서 각각 2분 동안 탈수시켰다.
B. 파라핀이 삽입된 섹션의 예비처리
슬라이드를 탈파라핀화시키고, SQ H2O에 놓고, 2 x SSC에서 실온에서 2회, 각각 5분 동안 세척하였다. 섹션을 20 ㎍/mL 프로테이나제 K (RNase-무함유 RNAse 완충액 중 10 mg/mL의 500 ㎕; 37 ℃, 15분) - 인간 배아, 또는 8x 프로테이나제 K (Rnase 완충액 250 mL 중 100 ㎕, 37 ℃, 30분) - 포르말린 조직에서 탈단백질화시켰다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 0.5 x SSC에서 세정하고, 탈수시켰다.
C. 예비혼성화
슬라이드를 박스 완충액 (4 x SSC, 50％ 포름아미드) - 포화 필터 페이퍼로 라이닝된 플라스틱 박스에 펼쳤다.
D. 혼성화
슬라이드 당 1.0 x 106 cpm 프로브 및 1.0 ㎕ tRNA (50 mg/mL 원액)를 95 ℃에서 3분 동안 가열하였다. 슬라이드를 빙냉시키고, 슬라이드 당 48 ㎕ 혼성화 완충액을 첨가하였다. 볼텍싱 후, 50 ㎕ 33P 믹스를 슬라이드 상의 50 ㎕ 예비혼성화에 첨가하였다. 슬라이드를 55 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
E. 세척
세척을 2 x 10분 동안 2 x SSC, EDTA로 실온에서 (400 mL 20 x SSC + 16 mL 0.25M EDTA, Vf=4L) 수행한 후, 37 ℃에서 30분 동안 RNaseA 처리하였다 (250 mL Rnase 완충액 중 10 mg/mL의 500 ㎕). 슬라이드를 2 x 10분 동안 2 x SSC, EDTA로 실온에서 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 하기와 같았다: 55 ℃, 0.1 x SSC, EDTA (20 mL 20 x SSC + 16 mL EDTA, Vf=4L)에서 2시간.
F. 올리고뉴클레오티드
계내 분석을 본원에 개시된 다양한 DNA 서열 상에서 수행하였다. 상기 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 첨부된 도면에 나타난 바와 같은 핵산 (또는 그의 상보체)에 상보적이 되도록 수득하였다.
G. 결과
정상적인 인간 조직에서의 TAT10772의 발현에 대해, 기관지 점막층 및 점막하 샘에서 강한 발현이 관찰되었다. 그러나, 시험한 모든 다른 정상적인 인간 조직은 TAT10772 발현에 대해 음성적이었다. 반대로, 강한 TAT10772 발현은 시험된 15개의 인간 난소 종양 (선암종 및 표면 상피 종양) 중 13개에서 관찰되었다. 추가로, 강한 TAT10772 발현은 또한 9개의 인간 자궁 선암종 중 8개에서 관찰되었다.
실시예 5: TAT10772 에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 TAT10772에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 예시한다.
모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 [Goding, 상기 문헌]에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 면역원에는 정제된 TAT, TAT를 함유하는 융합 단백질 및 세포 표면 상에서 재조합 TAT를 발현시키는 세포가 포함된다. 당업자는 과도한 실험 없이 면역원을 선택할 수 있다.
프로인트 완전 면역보강제 중에서 유화시킨 TAT 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 마우스, 예컨대 Balb/c를 면역화시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (리비 이뮤노케미칼 리서치 (Ribi Immunochemical Research; 미국 몬타나주 해밀톤 소재)) 중에서 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사 하였다. 이어서, 선택된 면역보강제 중에서 유화시킨 추가 면역원을 10 내지 12일 후에 면역화된 마우스에 추가접종하였다. 그 후, 몇 주 동안 마우스에 추가 면역화 주사를 추가접종할 수도 있다. 안와 후방 채혈법으로 마우스로부터 혈청 샘플을 주기적으로 채취하여 ELISA 분석에서 시험함으로써 항-TAT 항체를 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출된 후, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 TAT를 최종적으로 정맥 주사하였다. 3 내지 4일 후에 마우스를 희생시킨 다음, 비장 세포를 수확하였다. 이어서, 비장 세포를 선택된 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 ATCC 기탁번호 CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1에 융합시켰다 (35％ 폴리에틸렌 글리콜 사용). 이 융합으로부터 비-융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포가 생성되었다.
하이브리도마 세포의 TAT에 대한 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. TAT에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업자의 기술 수준에 속하는 것이다.
양성 하이브리도마 세포를 유전적으로 순계 Balb/c 마우스에 복강내 주사하여 항-TAT 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 제조하였다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러 용기에서 성장시킬 수 있다. 복수에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이어 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 별법으로, 항체와 단백질 A 또는 단백질 G의 결합을 바탕으로 하는 친화성 크로로마토그래피도 이용할 수 있다.
상기 기재된 기술을 이용하여, 11개의 개별적이고 별개의 하이브리도마 세포주를 생성하였으며, 이들 각각은 TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하였다. 상기 11개의 하이브리도마 세포주는 본원에서 16F7.1.15 (모노클로날 항체 16F7 생성), 17A8.1.3 (모노클로날 항체 17A8 생성), 9F3.1.3 (모노클로날 항체 9F3 생성), 16E12.2.15 (모노클로날 항체 16E12 생성), 16A7.1.3 (모노클로날 항체 16A7 생성), 10G11.1.1 (모노클로날 항체 10G11 생성), 5B10 (모노클로날 항체 5B10 생성), 11D10.1.14 (모노클로날 항체 11D10 생성), 5F6.1.24 (모노클로날 항체 5F6 생성), 7G6.2.6 (모노클로날 항체 7G6 생성) 및 3A5.3 (모노클로날 항체 3A5.3 생성)로 지칭된다. 상기 11개의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체는 TAT10772 폴리펩티드를 발현시키는 세포의 웨스턴 블롯, ELISA 분석, FACS 분류 분석 및/또는 면역조직화학 분석과 같은 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 기술을 이용하여 TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 것으로 나타났다. 기능적 항-TAT10772 모노클로날 항체를 생성하는 11개의 하이브리도마 세포주 중에서, 2개 (하이브리도마 클론 11D10.1.14 및 3A5.3)는 하기에 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 부다페스트 조약 하에 버지니아주 매나서스에 소재하는 아메리칸 티슈 타입 콜렉션에 기탁되었다.
실시예 6: 경쟁적 결합 분석 및 에피토프 맵핑
기재된 모노클로날 항체에 의해 결합되는 TAT10772 에피토프를 표준 경쟁적 분석 결합에 의해 측정하였다 (문헌 [Fendly et al., Cancer Research 50:1550- 1558 (1990)]). 교차-차단 연구를 팬덱스 (PANDEX; 상표명) 스크린 기기를 이용하여 TAT10772을 발현하도록 유전자조작된 무손상 PC3 세포 상에서 직접적 형광에 의해 항체 상에서 수행하여 형광을 정량하였다. 각각의 모노클로날 항체를 수립된 절차 (문헌 [Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel and Schiigi (eds.) San Francisco: WJ. Freeman Co. (1980)])를 이용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)와 접합시켰다. TAT10772-발현 PC3 세포의 융합성 단층을 트립신화시키고, 1회 세척하고, 0.5％ 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.1％ NaN3을 함유하는 냉각된 PBS에 1.75 x 106개 세포/mL로 재현탁시켰다. 최종 농도 1％ 라텍스 입자 (IDC; 오레곤주 포트랜드 소재)를 첨가하여 판덱스(상표명) 플레이트 막의 응고를 감소시켰다. 현탁액 중 세포, 20 ㎕, 및 정제된 모노클로날 항체 20 ㎕ (100 ㎍/mL 내지 0.1 ㎍/mL)를 판덱스(상표명) 플레이트 웰에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 20 ㎕ 중 소정 희석량의 FITC-표지된 모노클로날 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 형광을 판덱스(상표명) 스크린 기기에 의해 정량하였다. 모노클로날 항체는 각각이 다른 것과 결합하는 것을 무관한 모노클로날 항체 대조군에 비해 40％ 이상으로 및 동일한 항체 농도로 차단하였을 경우에 에피토프를 공유하는 것으로 간주되었다. 상기 실험에서, 모노클로날 항체 16F7, 17A8, 9F3, 16E12, 16A7, 10G11, 5B10, 11D10, 5F6, 7G6 및 3A5는 각각 TAT10772 에피토프 B, B, B, B, B, B, A, B, B, C 및 D로 지정되었다. 상기 분석을 이용하여, 당업자는 상기 기재된 것과 동일 한 에피토프에 결합하는 다른 모노클로날 항체를 확인할 수 있다.
결실 분석을 수행하여 상기된 항원 에피토프의 서열 2로 나타낸 폴리펩티드 서열에서 대략적인 위치를 확인하였다. 상기 분석에 의해 TAT10772 항원 에피토프 A는 서열 2 (이는 150개 아미노산 점액소-유사 반복 서열을 대략 17개 포함하고 있으므로, 대체로 다중 유사 항원 에피토프 부위를 포함함)의 아미노산 6471 내지 6560 사이에 존재하고, TAT10772 항원 에피토프 B는 서열 2의 아미노산 6389 내지 6470 사이에 존재하고, TAT10772 항원 에피토프 C는 서열 2의 아미노산 6663 내지 6806 사이에 존재하고, TAT10772 항원 에피토프 D는 서열 2의 아미노산 3765 내지 6397 사이에 존재함을 입증하였다. 상기의 구체적으로 확인된 항원 에피토프 부위 (및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자) 중 임의를 포함하는 폴리펩티드는 본 발명 내에 포함된다.
별도 실험에서, 표준 유속세포 분석법에 의해 측정된 3A5에 대한 모노클로날 항체의 OVCAR-3, OVCA-432 및 SK-OV-3 세포로의 결합은, 표준 정량적 PCR 분석법에 의해 측정된 바와 같은 각각의 상기 3개의 특정 세포주에서 발현된 TAT10772 mRNA의 발현 수준에 상응하는 것으로 입증되었다. 보다 구체적으로, 표준 정량적 PCR 분석법으로 측정하였을 때, OVCAR-3, OVCA-432 및 SK-OV-3 세포는 각각 고, 중 및 저 수준의 TAT10772 mRNA를 발현하였다. 모노클로날 항체 3A5는 표준 유속세포 분석법을 사용하여 3A5가 상기 세포에 결합하는 능력을 정량화하였을 때, 정량적으로 결합하는 3A5는 상기 세포주에 존재하는 TAT10772 mRNA의 상대적인 양에 상응하는 것으로 관찰되었다. 이러한 데이타는 임의의 특정 세포 유형에서의 TAT10772의 양 이 상기 세포 유형에 의해 발현되는 TAT10772 폴리펩티드의 양의 정량적 측정값이며, 또한 임의의 특정 항-TAT10772 항체의 상기 세포 유형에 결합하는 능력의 측정값임을 제시하였다.
실시예 7: 면역조직화학 분석
TAT10772에 대한 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조하여, 하기하는 바와 같이 모노클로날 항체 3A5 및 11D10을 이용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 조직 섹션을 아세톤/에탄올 중에서 5분 동안 먼저 고정시켰다 (동결건조 또는 파라핀-포매). 이어서, 상기 세션을 PBS로 세척하고, 이어서 아비딘 및 비오틴 (벡터 키트(Vector kit))로 10분 동안 차단시킨 다음 각각을 PBS로 세척하였다. 이어서, 상기 섹션을 10％ 혈청으로 20분 동안 차단하고, 이어서 블롯팅하여 잉여량을 제거하였다. 이어서, 1차 항체를 상기 섹션에 10 ㎍/ml의 농도로 1시간 동안 첨가하고, 이어서 상기 섹션을 PBS로 세척하였다. 이어서, 비오티닐화 2차 항체 (항-1차 항체)를 상기 섹션에 30분 동안 첨가하고, 이어서 상기 섹션을 PBS로 세척하였다. 이어서, 상기 섹션을 벡터 ABC 키트 시약에 30분 동안 노출시키고, 이어서 상기 섹션을 PBS로 세척하였다. 이어서, 상기 섹션을 디아미노벤지딘 (피어스(Pierce))에 5분 동안 노출시키고, 이어서 PBS로 세척하였다. 이어서, 상기 섹션을 메이어 헤마톡실린(Mayers hematoxylin)으로 대조염색하고, 덮개로 덮어서 가시화하였다. 또한, 면역조직화학 분석은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989] 및 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있었다.
상기 분석에 의한 결과는 모노클로날 항체 11D10이 임의의 하기의 정상적인 인간 조직에 검출가능하게 결합하지 않는다는 것을 입증하였다: 대동맥, 뇌, 결장, 간, 신장, 소장, 위, 폐 (폐포 및 기관지 조직 둘다), 고환, 비장 갑상선, 난소, 자궁, 요로상피 및 태반. 그러나, 독립적인 인간 난소 선암종 샘플 13개 중 6개 및 독립적인 인간 자궁내막 선암종 샘플 7개 중 1개는 항체 11D10에 대한 강력한 결합을 나타냈다. 더욱이, 별도 실험에서, 항체 11D10은 인간 점액성 선암종 종양 샘플 9개 중 1개, 인간 자궁내막 선암종 종양 샘플 22개 중 13개, 인간 장액성 낭선암종 종양 샘플 26개 중 17개, 및 인간 투명 세포 종양 샘플 8개 중 3개에 강력하게 결합하였다.
또한, 상기 분석에 의한 결과는 모노클로날 항체 11D10과 마찬가지로 모노클로날 항체 3A5가 임의의 상기에 열거된 정상적인 인간 조직에 검출가능하게 결합하지 않음을 입증하였다. 그러나, 항체 3A5는 독립적인 인간 난소 선암종 (막 염색) 2개 중 2개, 인간 자궁내막 선암종 종양 샘플 20개 중 16개, 인간 장액성 낭선암종 종양 샘플 25개 중 24개 및 인간 투명 세포 종양 샘플 10개 중 5개에 강력하게 결합하였다.
실시예 8: 모노클로날 항체 3A5는 세포 상의 TAT10772 에 결합하여 내재화된다
본 실험은 모노클로날 항체 3A5가 세포 상의 TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 세포 내로 내재화됨을 입증한다. 구체적으로, OVCAR-3 세포는 모노클로날 항체 3A5 및 형광 덱스트란과 함께 18시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 세포-결합 3A5 를 플루오레신-표지 항-3A5 항체로 정량적으로 검출하였다. 이러한 분석은 3A5 항체가 인큐베이션된 세포의 리소좀 구획물을 비롯한 상기 세포의 세포하 성분으로 트래피킹(trafficking)되었음을 나타내면서 항체 3A5가 덱스트란과 같은 장소에 배치되었음을 입증하였다.
실시예 9: 뮤린 모노클로날 항체의 인간화
본 실시예는 TAT10772에 대한 뮤린 항체 11D10 및 3A5의 인간화에 대한 CDR-손상 방법의 적용성을 입증하였다.
인간화 공정 동안 3가지 유형의 TAT10772를 사용하였다. 전체 쉐드(shed) 항원 중 인간 TAT10772 쉐드 항원 CA125를 포함하며, 이는 유에스 바이올로지컬(US Biological) C0050-10으로부터 입수하였다. TAT10772-줄기에서 마지막 대부분은 C-말단 점액소 도메인으로, 그 뒤는 예상 막횡단 영역 (서열 2의 아미노산 6282 내지 6979)을 선도하는 C-말단 서열로 이루어진다. 5-도메인 TAT10772 (서열 2의 아미노산 4471 내지 5171)는 5 점액소 도메인을 코딩하는 세포외 도메인 플러스 예상 막횡단 영역을 선도하는 C-말단 서열의 재조합 일부이다. MUC16-줄기 및 5-점액소 도메인을 CHO 세포에서 발현시켜서 통상적인 방법으로 정제하였다.
잔기 수는 카바트에 따랐다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 단일 문자 아미노산 약어를 사용하였다. DNA 축퇴는 IUB 코드를 이용하여 표시하였다 (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B = C/G/T, H = A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y = C/T).
뮤린 11 D10 및 3A5 가변 도메인의 클로닝 , 및 키메라 11 D10 및 3A5 항체의 생성
표준 방법을 이용하여 11D10 또는 3A5를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 축퇴 프라이머와 함께 RT-PCR을 이용하여 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 도메인을 증폭시켰다. 정방향 프라이머는 VL 및 VH 영역의 N-말단 아미노산 서열에 특이적이었다. 각각의 LC 및 HC 역방향 프라이머를 설계하여 종간 고도로 보존되어 있는 불변 경쇄 (CL) 및 불변 중쇄 도메인 1 (CH1)에 대해 어닐링시켰다. 증폭된 VL 및 VH를 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 통상적인 서열분석 방법을 이용하여 삽입물의 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 11D10 VL (mu11D10-L) 및 VH (mu11D10-H) 아미노산 서열은 각각 도 3 및 4에 나타냈으며 (각각 서열 4 및 7); 3A5 VL (mu3A5-L) 및 VH (mu3A5-H) 아미노산 서열은 각각 도 5 및 6에 나타냈다 (각각 서열 9 및 11). 코바트 넘버링에 따라 HVR 영역을 도 3 내지 6에 볼드체로 나타냈다.
수용자 인간 컨센서스 프레임워크 상으로의 직접 초가변 영역 그래프트
본 작업에 사용하기 위한 파지미드는 1가 Fab-g3 디스플레이 벡터이며, phoA 프로모터의 제어하의 2개의 오픈 리딩 프레임으로 이루어져 있다. 제1 오픈 리딩 프레임은 수용자 경쇄의 VL 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열로 이루어지며, 제2 오픈 리딩 프레임은 수용자 중쇄의 VH 및 CH1 도메인에 이어서 부 파지 외피 단백질 P3에 융합된 stII 신호 서열로 이루어진다.
뮤린 11D 및 3A5 항체로부터의 VL 및 VH 도메인은 인간 VL 카파 I (huKI; 서열 3) 및 인간 VH 하위군 III (huIII; 서열 6) 컨센서스 서열과 함께 정렬된다. VHR 그래프트를 위해, 뮤린 항체로부터의 초가변 영역을 huKI 및 huIII 수용자 프레임워크로 그래프트하였다. 3A5에 대해, 아미노산 위치 78만이 상이한 2종의 수용자 VH 프레임워크 (본원에서는 각각 3A5.L 및 3A5.F로 명명함)를 시험하였다 (도 6A 내지 6B 참조).
뮤린 11D10 및 3A5 항체로부터 초가변 영역을 수용자 인간 컨센서스 프레임워크로 유전자조작하여 직접 HVR-그래프트인 11D10-그래프트, 3A5.L-그래프트 및 3A5.F-그래프트를 생성시켰다. VH 도메인에서, 하기 영역이 인간 컨센서스 수용자로 그래프트되었다: 위치 24-34 (HVR-L1), 49-56 (HVR-L2) 및 89-97 (HVR-L3). VH 도메인에서, 위치 26-35A (HVR-H1), 49-65 (HVR-H2) 및 93-102 (HVR-H3)가 그래프트되었다 (도 3 내지 도 6). 맥칼럼(MacCallum) 등 (문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)])은 항체 및 항원 복합체 결정 구조를 분석하였고, 경쇄의 위치 49 및 중쇄의 위치 49, 93 및 94가 항원 접촉 영역의 일부이므로, 항체를 인간화시키는 경우에 상기 위치를 HVR-L2, HVR-H2 및 HVR-H3의 정의 내에 포함시키는 것이 바람직할 것 같다.
각각의 초가변 영역에 대한 별개의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 직접-그래프트 변이체를 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발법으로 생성하였다. 정확한 클론을 DNA 서열분석으로 평가하였다.
초가변 영역의 무작위화
각 그래프트된 항체에 대해, 뮤린 초가변 영역 서열을 향한 편향성을 유지하는 전략을 이용하여 서열 다양성이 각각의 초가변 영역 내로 도입된다. 이는 문헌 [Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994)]에 의해 최초로 기재된 독성화 올리고뉴클레오티드 합성 전략을 이용하여 달성되었다. 돌연변이될 초가변 영역 내의 주어진 위치에 대해, 야생형 아미노산을 코딩하는 코돈은 각 위치에서 평균 50％ 돌연변이율을 초래하는 뉴클레오티드의 70-10-10-10 혼합물로 독성화하였다.
소프트하게 무작위화된 올리고뉴클레오티드는 뮤린 초가변 영역 서열 뒤에 패턴화되며, 직접 초가변 영역 그래프트에 의해 한정된 동일한 영역을 포함하였다. VH 도메인의 H2의 개시부에서의 아미노산 위치 (위치 49)는 코돈 RGC를 이용함으로써 A, G, S 또는 T에 대한 서열 다양성으로 한정하였다.
상기 개관된 소프트 무작위화 라이브러리에 더하여, 3A5.L-그래프트 및 3A5.F-그래프트의 각 초가변 영역의 각 위치는 NNS를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 모든 가능한 20개의 아미노산에 대해 전체적으로 무작위화하였다. 이는 2가지 유형의 라이브러리에서 수행하였다. 제1 라이브러리에서, 다중 라이브러리는 각각이 3A5 전체 무작위화의 초가변 영역 내에 위치한 단일 위치를 갖는 20개의 일원으로 이루어지도록 제조되었다. 초가변 영역 내의 각 위치를 포함하기 위해, 상기 유형의 63개의 라리브러리를 생성시키고, 각 초가변 위치 전체에 위치한 단일 돌연변이를 포함하는 풀링(pooling)된 "단일 위치 라이브러리(single position library)" (SP 라이브러리)로 합하였다. 제2 라이브러리는 모든 20종의 아미노산을 동시에 단일 초가변 영역 내의 모든 위치로 도입시켰다 (FR 라이브러리). 상기 라이브러리 유형 둘다에 대해, 3A5.L-그래프트 또는 3A5.F-그래프트의 별도의 초가변 영역을 각각 포함하는 6개의 라이브러리가 존재한다.
야생형 CDR 그래프트된 서열을 다시 선택하는 것을 피하기 위해, 정지 코돈 (TAA)을 쿤켈 돌연변이유발법에 의해 각 HVR의 중간에 도입시켜 상이한 HVR로 도입된 정지 코돈을 갖는 각각의 그래프트 (11D10-그래프트, 3A5.L-그래프트 및 3A5.F-그래프트)에 대해 6개의 상이한 주형을 생성시켰다. SR, FR 및 SP 라이브러리를 생성시키는 경우에, 무작위화 뉴클레오티드를 사용하여 다양성을 도입시킬 뿐만 아니라 상응하는 주형 내에서 정지 코돈을 손상시켰다. 3A5 라이브러리에 대해, 3A5.L 및 3A5.F 주형의 혼합물을 각 라이브러리의 구축 동안 사용하였다. 모든 3종의 라이브러리를 3A5의 인간화에 대해 생성시켰으나, 오로지 SR 라이브러리만이 11D10의 인간화에 대해 생성되었다.
파지 라이브러리의 생성
다양성을 각 초가변 영역으로 도입시키기 위해 설계된 무작위화 올리고뉴클레오티드 풀(pool)을, 올리고뉴크레오티드 660 ng, 50 mM 트리스 (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT 및 폴리뉴클레오티드 키나제 5 U를 함유하는 20 ㎕ 반응물 중에 37 ℃에서 1시간 동안 개별적으로 인산화시켰다.
SR 및 FR 라이브러리를 생성시키기 위해, 다양성을 단일 HVR로 도입시키기 위한 각각의 인산화된 올리고뉴클레오티드 풀을, 상응하는 정지 코돈을 함유하는 쿤넬 주형 20 ㎍과 합하였다. 상기 반응물을 최종 부피 500 ㎕의 50 mM 트리스 (pH 7.5), 10 mM MgCl2 중에서 수행하여 올리고뉴클레오티드 대 주형 비율 3을 얻었 다. 혼합물을 90 ℃에서 4분 동안, 50 ℃에서 5분 동안 어닐링한 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 이어서, 어닐링된 주형 (250 ㎕)을, 10O mM ATP 1 ㎕, 25 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 25 mM) 10 ㎕, 10O mM DTT 15 ㎕, 1OX TM 완충액 (0.5 M 트리스 (pH 7.5), 0.1 M MgCl2) 25 ㎕, T4 리가제 2400 U 및 T7 폴리머라제 30 U를 실온에서 3시간 동안 첨가함으로써 충전하였다. 이어서, 충전된 생성물을 문헌 [Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)]에 기재된 바와 같이 세척하고, SS320 세포 내로 전기천공하고, M13/KO7 헬퍼 파지의 존재하에서 번식시켰다. 라이브러리 크기는 1 내지 2 x 109 비의존성 클론 범위였다. 초기 라이브러리로부터의 무작위 클론을 서열분석하여 라이브러리 양을 평가하였다.
다중 (63) 표준 쿤켈 돌연변이유발 반응을 96-웰 PCR 플레이트 내에서 수행하여 3A5 SP 라이브러리를 생성하였다. 인산화 올리고뉴클레오티드 반응물 (상기) 2 ㎕를 최종 부피 10 ㎕의 50 mM 트리스 (pH 7.5), 10 mM MgCl2 중에 정지 코돈을 함유한 300 ng 쿤켈 주형에 첨가하였다. 혼합물을 90 ℃에서 2분 동안, 50 ℃에서 5분 동안 어닐링한 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 이어서, 어닐링된 주형을, 10 mM ATP 0.5 ㎕, 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 10 mM) 0.5 ㎕, 10O mM DTT 1 ㎕, 1OX TM 완충액 (0.5 M 트리스 (pH 7.5), 0.1 M MgCl2) 1 ㎕, T4 리가제 80 U 및 T7 폴리머라제 4 U를 총 20 ㎕ 부피로 실온에서 2시간 동안 첨가함으로써 충전하였다. 이어서, 상기와 같이 충전하여 라이게이션된 생성물을 XL1-블루 세포 내로 형질전환시키고, 5 ㎍/ml의 테트라사이클린 및 M13/KO7 헬퍼 파지 (MOI 10)를 함유한 2YT 0.5 ml 중에서 37 ℃에서 2시간 성장시키고, 이어서 풀링시키고, 50 ㎍/ml의 카르베나실린을 함유한 2YT 500 ml로 옮겨서 37 ℃에서 16시간 성장시켰다.
파지 선별
하기 개관하는 파지 선별에 대해, TAT10772-줄기 (2 ㎍/ml), CA125 (17 ㎍/ml), 5-도메인 TAT10772 (2 ㎍/ml) 또는 뉴트라비딘 (2 ㎍/ml)을 4 ℃에서 밤새 맥시소르프(MaxiSorp) 마이크로타이터 플레이트 (눈크) 상의 PBS 중에 고정화시켰다. 카세인 차단제 (피어스(Pierce))를 사용하여 플레이트를 1시간 이상 동안 차단하였다. 파지를 배양 상등물로부터 수확하고, 1％ BSA 및 0.05％ 트윈 20을 함유한 PBS (PBSBT) 중에 현탁시켰다. 하기 개관하는 바와 같이, 파지 선별을 수행하여, 0.05％ 트윈 20을 함유한 PBS (PBST)로 마이크로타이터 웰을 철저하게 세척하고, 결합된 파지를 100 mM HCl과 함께 웰을 30분 동안 인큐베이션함으로써 용출하였다. 파지를 1 M 트리스 (pH 8)로 중화시키고, XL1-블루 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지를 이용하여 증폭시키고, 50 ㎍/ml의 카르베나실린을 함유한 2YT 중에 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 웰을 함유한 표적으로부터 용출된 파지의 타이터를 웰을 팜유한 비-표적으로부터 회수한 파지의 타이터와 비교하여 풍부함을 평가하였다.
용액 분류법은 문헌 [Fuh et al. J. Mol. Biol. (2004)]에 기재되어 있으며, 비오티닐화 표적 농도의 제어를 통한 보다 빠른 온-레이트 및 비표지된 표적과의 경쟁에 의한 보다 느린 오프-레이트의 선별을 할 수 있게 하였다. 술포(Sulfo)-NHS-LC-비오틴 (피어스)를 사용하여 TAT10772-줄기 및 5-도메인 TAT10772를 비오티닐화하였다.
TAT10772-줄기를 11D10의 인간화를 위한 파지 표적으로서 사용하였다. TAT10772-줄기를 PBS 중 2 ㎍/ml로 바로 맥시소르프 마이크로타이터 플레이트 (눈크) 상에 파지 선별의 제1 라운드 동안 고정화시켰다. 연속적인 라운드의 선별은 용액 선별법을 사용한다 (문헌 [Fuh et al. J. Mol. Biol. (2004)). 비오티닐화-TAT10772-줄기를 파지 라이브러리와 함께 1 시간 동안 먼저 인큐베이션하고, 이어서 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 결합된 파지를 5분 동안 포획하였다. 선별 엄격성을 증가시키기 위해 시간을 증가시키기 위한 포획 단계 전에 과량의 비표지화 TAT10772-줄기 (100 nM 초과)를 첨가하였다. 하기 표는 용액-패닝 11D10 라이브러리를 위해 사용하는 조건을 요약하였다.
선별 라운드 [비오닐티화 TAT10772-줄기] 과량의 TAT10772-줄기의 인큐베이션
2 10 nM 25 ℃에서 20분 동안
3 10 nM 25 ℃에서 6.5시간 동안
4 10 nM 25 ℃에서 88.5시간 동안
5 1 nM 25 ℃에서 48시간 동안, 이어서 37 ℃에서 52시간 동안
CA125 및 5-도메인 TAT10772를 3A5의 인간화에 대한 파지 표적으로서 사용하였다. 눈크 맥시소르프 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된 고정화 5-도메인 TAT10772 (PBS 중 2 ㎍/ml) 또는 CA125 (PBS 중 17 ㎍/ml)에 대한 제1 라운드의 선별을 위해 라이브러리를 개별적으로 분류하였다. 증폭시킨 후에, 라이브러리를 이들의 라이브러리 유형 (FR/SR/SP)에 따라 풀링하고, 이들을 CA125 또는 5-도메인 TAT10772에 대해 패닝하고, 이들의 각 고정화된 표적에 대해 추가 제2 라운드 동안 분류하였다. 3개의 연속 라운드의 선별을 고정화 표적에 대해 지속적인 패닝에 의 해 또는 용액 분류 전략 (문헌 [Fuh et al. J. Mol. Biol. (2004)])을 이용하는 가용성 비오티닐화 5-도메인 TAT10772에 대한 선별에 의해 수행하였다. 용액 분류법의 경우, 파지 라이브러리를 1 nM 비오티닐화 5-도메인 TAT10772와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 과량의 비표지화 5-도메인 TAT10772 (100 nM 초과)를 22시간 이하 동안 첨가하여 선별 엄격성을 증가하였다. 뉴트라비딘-코팅된 플레이트를 이용하여 비오티닐화 5-도메인 TAT10772에 결합된 파지를 간단히 (5분) 포획하였다.
TAT10772 -줄기 파지 ELISA
맥시소르프 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중 2 ㎍/ml의 TAT10772-줄기로 밤새 코팅하고, 이어서 카세인 차단제로 차단하였다. 포획 상등물로부터의 파지를 조직 배양 마이크로타이터 플레이트 내에 1％ BSA를 함유한 PBST로 계대 희석하여 인큐베이션한 후에, 혼합물 80 ㎕를 표적 코팅된 웰로 15분 동안 옮겨 비결합된 파지를 포획하였다. 플레이트를 PBST로 세척하고, HRP 접합된 항-M13 (아머샴 파마시아 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech))을 40분 동안 첨가하였다 (PBSBT 중 1:5000). 플레이트를 PBST로 세척하고, 테트라메틸벤지딘 기질 (메릴랜드주 가이테르스버그 소재의 키르케가르드 앤드 페리 래보라토리즈(Kirkegaard and Perry Laboratories))를 첨가함으로써 전개시켰다. 450 nm의 흡광도를 용액 중 표적 농도 함수로 플랏팅하여 IC50을 결정하였다. 이를 파지의 표면 상에 디스플레이된 Fab 클론에 대한 친화도 추정값으로서 사용하였다.
Fab 및 IgG 생성 및 친화도 측정
친화도 측정을 위해 Fab 단백질을 발현하기 위해, 정지 코돈을 파지 디스플레이 벡터 내의 중쇄와 g3 사이에 도입시켰다. 클론을 이. 콜라이 34B8 세포로 형질전환시켜 콤플레이트(Complete) C.R.A.P. 배지 중에 30 ℃에서 성장시켰다 (문헌 [Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)]). 세포를 원심분리하여 수확하고, PBS, 100 μM PMSF, 100 μM 벤자미딘, 2.5 mM EDTA 중에 현탁시키고, 미세유동화기를 사용하여 파쇄 개방하였다. Fab를 단백질 G 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
비아코어(상표명)-2000을 이용한 표면 플라즈몬 공명법에 의해 친화도 결정을 수행하였다. 5-도메인 TAT10772 약 500 RU 또는 IgG 약 300 RU를 CM5 센서 칩 상의 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8) 중에서 고정화시키고, PBST 중에 상응하는 결합 파트너 (1 내지 1000 nM)의 연속 2배 희석액을 20 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 각 샘플을 5-분 결합 및 10-분 해리 시간으로 분석하였다. 각각의 주입 후, 10 mM 글리신 (pH 1.5)를 이용하여 칩을 재생성하였다. RU를 블랭크 유동 세포로부터 뺌으로써 결합 반응을 보정하였다. kon 및 koff의 동시 적합화 1:1 랭뮤어 모델을 동력학 분석에 이용하였다.
11 D10 의 인간화
11D10의 인간화에 사용된 인간 수용자 프레임워크는 컨센서스 인간 카파 I VL 도메인 및 인간 하위군 III 컨센서스 VH 도메인의 변이체로 이루어졌다. 뮤린 11D10의 VL 및 VH 도메인을 인간 카파 I 및 하위군 III 도메인과 함께 각각 정렬시 켰으며, 각 상보성 결정 영역 (CDR)을 확인하고, 인간 수용자 프레임워크 내로 그래프트하여, 파지 상에 Fab로서 디스플레이할 수 있는 HVR 그래프트 (504 그래프트)를 생성하였다 (도 3 및 4). 11D10 HVR 그래프트를 디스플레이하는 파지를 고정화 CA125에 결합시키기 위해 시험하는 경우에, 파지 결합을 관찰하였다. 11D10 HVR 그래프트 서열을 Fab로서 발현하는 경우에, 비아코어 분석은 CA125에 대한 결합을 입증하였다.
각 HVR이 개별적으로 소프트하게 무작위화된 11D10에 대해 SR 라이브러리를 생성시켰다. 제5 라운드의 선별 동안 6개의 SR 라이브러리를 고정화 TAT10772-줄기에 대해 개별적으로 각각 패닝하였다. 풍부함이 제3 라운드 후에 개시되는 것이 관찰되었으며, 제5 라운드 후에 DNA 서열 분석을 위해 클론을 선택하였다. 각 HVR을 표적화하는 서열 변화가 관찰되었다. 항-TAT10772 파지 ELISA를 이용하여 클론을 스크리닝하였다. 선별 클론을 비아코어에 의한 추가 분석을 위해 Fab로서 발현시켰다. 몇개의 클론을 스캣차드 분석에 IgG로서 재포맷하였다. OVCAR-3 세포를 이용한 FACS 분석은 시험한 모든 11D10 인간화 항체가 상기 세포를 효과적으로 FACS 분류할 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 결과로부터, 인간 프레임워크 상에 그래프트된 11D10의 친화도를 복구할 수 있는 다중 서열 변화가 존재하며, 이러한 항체가 CDR-복구에 의해 인간화되어 개시 뮤린 항체의 친화도를 충족시키거나 초과하는 친화도를 생성시킬 수 있다.
3A5의 인간화
2종의 인간 수용자 프레임워크, 3A5.L 및 3A5.F를 3A5의 인간화에 사용하였 으며, 컨센서스 인간 카파 I VL 도메인 및 인간 하위군 III 컨센서스 VH 도메인을 기초로 하였다. 뮤린 3A5의 VL 및 VH 도메인을 인간 카파 I 및 하위군 III 도메인과 함께 각각 정렬시켰다: 각 상보성 결정 영역 (CDR)을 확인하고, 인간 수용자 프레임워크 내로 그래프트하여, 파지 상에 Fab로서 디스플레이할 수 있는 HVR 그래프트를 생성하였다 (도 5 및 6). 3A5 HVR 그래프트를 디스플레이하는 파지를 고정화 CA125에 결합시키기 위해 시험하는 경우에, 둘다에 대한 파지 결합을 관찰하였다. Fab로서 발현하는 경우에, 비아코어 분석은 둘다의 5-도메인 TAT10772에 대한 결합을 입증하였다.
3A5 HVR 그래프트의 각 HVR로 개별적으로 다양성을 도입한 SR, FR 및 SP 라이브러리를 생성시켰다. 고상 및 용액 분류 전략 둘다를 이용하여 라이브러리를 CA125 및 5-도메인 TAT10772에 대해 패닝하였다. 용액 분류법은 고 친화도 클론이 비오티닐화 표적 농축물의 제작 및 파지 포획 시간 동안에 선택될 수 있게 하며, 비표지화 표적을 첨가하여 보다 빠른 오프 레이트를 갖는 클론을 제거할 수 있었다 (문헌 [Fuh et al. J. Mol. Biol. 340, 1073-1093 (2004)]). 모든 라이브러리에서 제2 라운드 후에 풍부함이 관찰되었다. OVCAR-3 세포를 이용한 FACS 분석은 시험한 모든 3A5 인간화 항체가 상기 세포를 효과적으로 FACS 분류할 수 있음을 입증하였다.
제5 라운드 후에, 각 라이브러리로부터의 DNA 서열 분석에 대해 클론을 선택하여 상기 CDR의 재설계가 항원 결합의 복구에 대해 중요함을 제시하면서 HVR-H3에서 표적화되는 서열 변화를 나타냈다.
인간화 클론의 서열 분석
모든 인간화 클론의 모든 경쇄 및 중쇄 HVR 영역에 대한 아미노산 서열을 수득하였다. 인간화 11D10 항체의 경우에, 수득한 HVR 서열을 도 7 내지 12에 나타냈다. 인간화 3A5 항체의 경우에, 수득한 HVR 서열을 도 13 내지 18에 나타냈다. 도 19 및 20은 각 가변 중쇄 및 가변 경쇄에 대한 예시적인 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 나타냈다. 본 발명은 하나 이상의 개시된 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 하나 이상의 개시된 HVR 서열과 함께 포함하는 항체를 포함한다.
선별된 인간화 3A5 항체 클론의 결합 분석
수개의 인간화 3A5 클론을 선별하여 IgG로서 발현시키고, 비아코어, 경쟁 결합 ELISA 및 OVCAR-3 세포 결합 분석에 의해 TAT10772에 결합하는 것을 특징규명하였다. 표준 ELISA 분석으로부터의 결과는 하기 표 7에 나타냈다. 고정화 3A5 변이체 IgG 항체에 대한 5'-도메인 TAT10772에의 결합을 측정하는 표준 비아코어 분석으로부터의 결과는 하기 표 8에 나타냈다. 시험한 모든 항체는 IgG이며 서열 211로 본원에 나타낸 가변 경쇄 서열을 함유한다는 것을 주지한다. VL의 S49Y의 복귀 돌연변이는 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌으며, 티로신이 상기 위치에서 보다 통상적으로 발견되는 경우에 최종 인간화 변이체로 도입되었다. 항체의 가변 중쇄 서열은 표 7 및 8에 나타냈다. 표 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 몇개의 클론은 요약한 바와 같이 키메라 항체의 단량체 친화도를 충족하거나 초과하였다.
Figure 112008004290412-pct00023
Figure 112008004290412-pct00024
또한, 수개의 인간화 3A5 항체를 경쟁 결합 ELISA (고정화 5'-도메인 TAT10772 및 CA125로의 결합 측정) 및 OVCAR-3 세포 결합 분석에서 시험하였으며, 여기서 이들 분석의 결과를 도 23 내지 25에 나타냈다. 도 23 내지 25에 나타낸 바와 같이, 시험한 모든 인간화 3A5 항체는 TAT10772 표적 폴리펩티드에 강력하게 결합하며, 상기 표적 폴리펩티드 상의 항원 부위에서 결합하기 위해 효과적으로 경쟁할 수 있었다.
인간화 3A5 변이체의 CDR - H2 의 잠재적 글리코실화 부위 제거
잠재적 제조 문제를 피하기 위해, 적합한 서열 변화를 확인하는 파지 선별법을 이용하여 인간화 3A5 변이체의 CDR-H2의 잠재적 글리코실화 부위를 제거하였다. 코돈 NNS를 이용하여 N52 및 S54 둘다를 개별적으로 완전히 무작위화시켜 모든 가능한 아미노산 치환을 허용하였다. 이러한 작은 20-원 파지 라이브러리를 5'-도메인 TAT10772에 결합시키기 위해 선별하였다. N52 및 S54 둘다가 발견되었지만, 다른 치환이 가장 많은 변화 N52S 및 S54A를 갖는 상기 위치 둘다에서 빈번하게 관찰되었다. 표준 스캣차드 분석에 의한 특정 데이타는 하기 표 9에 나타냈으며, 여기서 항체는 서열 211로 본원에 나타낸 가변 경쇄 서열 및 표 9에 나타낸 가변 중쇄 서열을 갖는 IgG로서 발현하였다. 기재된 변화 중 하나가 인간화 변이체 3A5.v1 또는 3A5.v4 (서열 206 내지 209 참조)로 도입된 경우에, 이들은 TAT10772에 대한 결합 친화도에 영향을 미치지 않았다.
Figure 112008004290412-pct00025
실시예 10: TAT10772 에 결합하는 독소- 접합된 항체의 제조
암의 치료에서 세포독성제 또는 세포증식억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위해 항체-약물 접합체 (ADC), 즉 면역접합체를 사용하면 (문헌 [Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212]; [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 제4,975,278호), 약물 잔기를 종양으로 표적화 전달시키고, 그 안에 세포내 축적시킬 수 있으며, 이 때 상기 비접합된 약제의 전신 투여는 제거되어야 할 종양 세포 뿐만 아니라 정상적인 세포에 대해서도 수용되지 못할 수준의 독성을 초래할 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., (1986) Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506]). 따라서, 최소 독성을 갖는 최대 효능이 추구된다. ADC를 설계하고 개선하려는 노력은 약물-결합 및 약물-방출 특성 뿐만 아니라 모노클로날 항체 (mAb)의 선택성에도 초점을 맞추었다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘다는 이러한 전략에 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87]). 상기 방법에 사용되는 약물로는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신을 들 수 있다 ([Rowland et al., (1986) 상기 문헌]). 항체-독소 접합체에 사용되는 독소로는 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신 (문헌 [Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al. (2002) Bioconiugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad . Sci . USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al. (1998) Cancer Res . 58:2928]; [Hinman et al. (1993) Cancer Res . 53:3336-3342])과 같은 소분자 독소를 들 수 있다.
본 발명의 항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 링커 (L)를 통해 하나 이상의 약물 잔기 (D), 예를 들어 항체 당 약 1 내지 약 20개의 약물 잔기에 접합시켰다. 화학식 Ab-(L-D)p의 ADC는
(1) 항체의 친핵성 기와 2가 링커 시약을 반응시켜 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성한 다음, 약물 잔기 D와 반응시키는 것; 및 (2) 약물 잔기의 친핵성 기와 2가 링커 시약을 반응시켜 공유 결합을 통해 D-L을 형성한 다음, 항체의 친핵성 기와 반응시키는 것
을 포함하는, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하는 수가지의 경로에 의해 제조할 수 있다. 추가 ADC 제조 방법을 본원에 기재하였다.
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 이루어질 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC') 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB")를 포함한다. 추가 링커 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 몇몇은 본원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)를 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연 아미노산 뿐만 아니라 소수 아미노산 및 비-천연 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 설계하여 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 분해에 이들의 선별성을 최적화시킬 수 있다.
항체 상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 리신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체를 글리코실화시키는 당 히드록실 또는 아미노 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드 기는 친핵성이며, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기를 포함하는, 연결기 잔기 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성시키기 위해 반응시킬 수 있다. 특정 항체는 환원성 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 다리를 갖는다. 항체는 환원성 시약, 예컨대 DTT (디티오트레이톨)로 처리하여 링커 시약과의 접합에 반응성이 되게 할 수 있다. 이와 같이, 각 시스테인 다리는 이론적으로 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가 친핵성 기는, 아민을 티올로의 전환시키는 리신의 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)과의 반응을 통해 항체로 도입될 수 있다. 반응성 티올 기는 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입시켜 항체로 도입시킬 수 있다 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 항체를 제조함으로써).
본 발명의 추가 약물 접합체는, 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자기성 잔기를 도입하는 항체 변형에 의해 제조할 수 있다. 글리코실화 항체의 당은, 예를 들어 페리오데이트 산화 시약으로 산화시켜서 링커 시약 또는 약물 잔기의 아민 기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기성 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 예를 들어 보로히드라이드 시약으로 환원하여 안정한 아민 결합을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화 항체의 탄수화물 부분을 글락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-페리오데이트와 반응시켜 약물 (헤르만손, 바이오컨쥬게이트 테크닉스(Hermanson, Bioconjugate Techniques)) 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 단백질 내 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기를 수득할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유한 단백질은 나트륨 메타-페리오데이트와 반응하여 제1 아미노산 대신에 알데히드를 생성시킬 수 있다 (문헌 [Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 이러한 알데히드는 약물 잔기 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
별도로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성으로 제조할 수 있다. DNA 길이는 서로 인접하거나 접합체의 바람직한 특성을 손상시키지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된 접합체의 두 부분을 코딩하는 각 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 종양 예비-표적화에 사용하기 위해 "수용체" (예, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있으며, 여기서 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여한 다음, 수세촉진제(clearing agent)를 사용하여 순환계로부터 비결합 접합체를 제거하고, 이어서 세포독성제 (예, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예, 아비딘)를 투여하였다.
독소를 정제된 항체에 결합시킴으로써 항체-약물 접합체를 생성시키기 위한 특정 기술은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 정제된 모노클로날 항체와 독소 DM1와의 접합은 하기와 같이 수행할 수 있다. 정제된 항체는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트로 유도하여 디티오피리딜 기를 도입하였다. NaCl (50 mM) 및 EDTA (1 mM)을 함유한 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.5) 44.7 ml 중 항체 (376.0 mg, 8 mg/mL)을 SPP (에탄올 2.3 ml 중 5.3 몰 당량)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 아르곤하 주변 온도에서 90분 동안 인큐베이션한 후에, 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl 및 2 mM EDTA로 평형시킨 세파덱스(Sephadex) G25 컬럼을 통과시켜 겔 여과하였다. 이어서, 분획물을 함유한 항체는 풀링하여 분석하였다. 항체-SPP-Py (337.0 mg, 방출성 2-티오피리딘 기를 함유)를 상기 35 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.5)으로 최종 농도 2.5 mg/ml로 희석하였다. 이어서, 3.0 mM 디메틸아세트아미드 (DMA, 최종 반응 혼합물 중 3％ v/v) 중 DM1 (1.7 당량, 16.1 mol)을 항체 용액에 첨가하였다. 반응을 아르곤하 주변 온도에서 20시간 동안 수행하였다. 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl (pH 6.5)로 평형시킨 세파크릴(Sephacryl) S300 겔 여과 컬럼 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) 상에 반응물을 로딩하였다. 유속은 5.0 ml/분이었으며, 65개 분획물 (각각 20.0 ml)을 수집하였다. 분획물을 풀링하여 분석하였으며, 여기서 252 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 항체 분자 (p') 당 결합된 DM1 약물 분자 수를 결정하였다.
예시적인 목적을 위해, 정제된 모노클로날 항체의 독소 DM1로의 접합은 또한 하기와 같이 수행할 수 있다. 정제된 항체를 (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC, 피어스 바이오테크놀로지, 인크(Pierce Biotechnology, Inc))로 유도하여 SMCC 링커를 도입하였다. 항체를 50 mM 인산칼륨/ 50 mM 염화나트륨/ 2 mM EDTA (pH 6.5) 20 mg/ml에서 SMCC (DMSO 중 20 mM, 6.7 mg/ml) 7.5 몰 당량으로 처리하였다. 반응 혼합물을 아르곤하 주변 온도에서 2시간 동안 교반한 후에, 50 mM 인산칼륨/ 50 mM 염화나트륨/ 2 mM EDTA (pH 6.5)으로 평형시킨 세파덱스 G25 컬럼을 통과시켜 여과하였다. 분획물을 함유한 항체를 풀링하여 분석하였다. 이어서, 항체-SMCC를 50 mM 인산칼륨/ 50 mM 염화나트륨/ 2 mM EDTA (pH 6.5)로 최종 농도 10 mg/ml로 희석하여 디메틸아세트아미드 중 DM1 (5 SMCC/항체 추정치 1.7 당량, 7.37 mg/ml) 10 mM 용액과 반응시켰다. 반응물을 아르곤하 주변 온도에서 16.5 시간동안 교반하였다. 이어서, 접합 반응 혼합물을 1 x PBS (pH 6.5)과 함께 세파덱스 G25 겔 여과 컬럼 (1.5 x 4.9 cm)을 통과시켜 여과하였다. 이어서, DM1/항체 비율 (p)을 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다.
더욱이, 선택한 항체 상의 유리 시스테인을 비스-말레이미도 시약 BM(PEO)4 (피어스 케미칼(Pierce Chemical))으로 변형시킬 수 있으며, 항체의 표면 상에 미반응된 말레이미도 기를 제거하였다. 제거는 BM(PEO)4를 50％ 에탄올/물 혼합물 중에 10 mM 농도로 용해시키고, 10배 몰 과량을 약 1.6 mg/ml (10 마이크로몰) 농도의 인산염 완충 염수 중 항체를 함유한 용액에 첨가하고, 1시간 동안 반응시킴으로써 수행할 수 있었다. 150 mM NaCl 완충액을 함유한 30 mM 시트레이트 (pH 6) 중에서 초과량의 BM(PEO)4를 겔 여과하여 제거하였다. 약 10배 몰 과량의 DM1을 디메틸 아세트아미드 (DMA) 중에 용해시키고, 항체-BMPEO 중간체에 첨가하였다. 또한, 디메틸 포름아미드 (DMF)를 사용하여 약물 잔기 시약을 용해시킬 수 있다. 반응 혼합물을 밤새 반응시킨 후에 겔 여과하거나 PBS로 투석시켜 미반응 약물을 제거하였다. PBS 중 S200 컬럼 상에서 겔 여과를 이용하여 고분자량의 응집체를 제거하고, 정제된 항체-BMPEO-DM1 접합체를 수득하였다.
세포독성 약물은 항체의 무수한 리신 잔기를 통해 빈번하게 항체에 전형적으로 접합한다. 대상 항체에 존재하거나 대상 항체에 유전자조작된 티올 기를 통한 접합이 또한 수행되었다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 유전자 조작 기술에 의해 단백질로 도입시켜 리간드에 대한 공유 부착 부위를 형성시켰다 (문헌 [Better et al. (1994) J. Biol . Chem . 13:9644-9650]; [Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132]; [Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255]; [Tu et al. (1999) Proc . Natl . Acad . Sci USA 96:4862-4867]; [Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214]; [Chmura et al. (2001) Proc . Nat . Acad. Sci . USA 98(15):8480-8484]; 미국 특허 제6,248,564호). 유리 시스테인 잔기가 대상 항체에 존재한다면, 독소는 상기 부위에 결합할 수 있다. 예를 들어, DMSO 중에 용해된 약물 링커 시약인 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 즉 MC-MMAE, 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 즉 MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE 또는 MC-val-cit-PAB-MMAF는 공지된 농도로 아세토니트릴 및 물로 희석하고, 인산염 완충 염수 (PBS) 중의 냉각 시스테인-유도된 항체에 첨가하였다. 약 1시간 후에, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 임의의 미반응 항체 티올 기를 캡핑(capping)하였다. 반응 혼합물을 원심분리성 한외여과에 의해 농축하고, 독소 접합된 항체를 정제하고, PBS 중 G25 수지를 통과하는 용출에 의해 탈염시키고, 멸균 조건하에 0.2 m 여과기를 통과시켜 여과하고, 보관을 위해 동결시켰다.
추가로, 하기 기술을 이용하여 본 발명의 항-TAT 항체를 아우리스타틴 및 돌로스타틴 독소 (예컨대, MMAE 및 MMAF)에 접합시킬 수 있다. 500 mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨 (pH 8.0) 중에 용해된 항체를 과량의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 처리하였다. 완충액을 37 ℃에서 약 30분 동안 인큐베이션한 후에, 세파덱스 G25를 통과시켜 용출시킴으로써 교환하고, 1 mM DTPA를 함유한 PBS로 용출시켰다. 용액의 280 nm의 흡광도에서의 환원성 항체 농도, 및 DTNB (위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히(Aldrich))와 반응시키고 412 nm에서의 흡광도 측정에 의한 티올 농도를 측정함으로써 티올/Ab 값을 확인하였다. PBS 중에 용해된 환원성 항체를 빙상에서 냉각시켰다.
DMSO 중에 용해된 약물 링커 시약인 (1) 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 즉 MC-MMAE, (2) MC-MMAF, (3) MC-val-cit-PAB-MMAE, 또는 (4) MC-val-cit-PAB-MMAF를 공지된 농도의 아세토니트릴 및 물 중에 희석하여, PBS 중 냉각 환원성 항체에 첨가하였다. 약 1시간 후에, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 임의의 미반응 항체 티올 기를 캡핑하였다. 반응 혼합물을 원심분리성 한외여과에 의해 농축하고, 접합된 항체를 정제하고, PBS 중 G25 수지를 통과하는 용출에 의해 탈염시키고, 멸균 조건하에 0.2 m 여과기를 통과시켜 여과하고, 보관을 위해 동결시켰다.
실시예 11: 시험관내 종양 세포 사멸 분석
대상 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 포유동물 세포는 표준 발현 벡터 및 클로닝 기술을 이용하여 수득하였다. 별법으로, 대상 TAT 폴리펩티드를 발현시키는 다수의 종양 세포주는 예를 들어 ATCC를 통해 공개적으로 입수가능하며, 표준 ELISA 또는 FACS 분석을 이용하여 통상적으로 확인할 수 있다. 이어서, 항-TAT 폴리펩티드 모노클로날 항체 (및 독소가 접합된 그의 유도체)를 사용하여 시험관내에서 TAT 폴리펩티드 발현 세포를 사멸시키는 항체의 능력을 측정하는 분석을 수행하였다.
예를 들어, 대상 TAT 폴리펩티드를 발현하는 세포를 상기된 바와 같이 수득하고, 96 웰 디쉬에 플레이팅하였다. 한 분석에서, 항체/독소 접합체 (즉, 네이키드(naked) 항체)를 4일 기간 동안 세포 인큐베이션 전체 시간에 포함하였다. 제 2 독립적인 분석에서, 세포를 항체/독소 접합체 (즉, 네이키드 항체)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 세척하고, 4일 기간 동안 항체/독소 접합체의 부재하에 인큐베이션하였다. 이어서, 프로메가(Promega) (카탈로그 번호 G7571)로부터의 셀타이터-글로 루미네슨트 셀 바이어빌러티 분석을 이용하여 세포 생존력을 측정하였다. 미처리 세포는 음성 대조군으로 작용하였다.
제1 실험에서 본 발명에 대해, (1) TAT10772 폴리펩티드-발현 세포주 OVCAR-3, (2) 세포주 세포 표면 상에 TAT10772 폴리펩티드를 안정하게 발현하도록 유전자조작된 PC3-유래 세포주 (PC3/A5.3B2), 및 (3) TAT10772 폴리펩티드를 발현하지 않는 PC3 세포주 (PC3/neo)를 사멸시키는 능력에 대해 다양한 농도의 키메라 3A5 및 키메라 11D10 항체의 MMAF 및 MMAE 접합체를 시험하였다. 이들 분석에 사용된 키메라 3A5 항체는 서열 211로 본원에 나타낸 가변 경쇄 아미노산 서열 및 서열 11로 본원에 나타낸 가변 중쇄 아미노산 서열을 함유하였다. 이들 분석에 사용된 키메라 11D10 항체는 서열 4로 본원에 나타낸 가변 경쇄 아미노산 서열 및 서열 7로 본원에 나타낸 가변 중쇄 아미노산 서열을 함유하였다. 이러한 실험의 결과는 도 26 내지 31에 나타냈으며, 각각의 독소 접합된 항체가 OVCAR-3 및 PC3/A5.3B2 세포 (즉, 세포 표면 상에 TAT10772 폴리펩티드를 발현하는 세포)에서 유의적인 수준의 세포 사멸을 일으키는 반면, PC3/neo 세포 (세포 표면 상에 TAT10772 폴리펩티드를 발현하는 않는 세포)에서 어떠한 항체에 대해서도 유의적인 세포 사멸을 관찰하지 못했음을 입증하였다. 이들 데이타는 시험한 항체가 상기 폴리펩티드를 발현하며 시험관내에서 상기 세포의 사멸을 일으키는 세포의 표면 상에서 TAT10772 폴리펩티드와 결합할 수 있음을 입증하였다.
실시예 12: 생체내 종양 사멸 분석
복강내 종양 모델
생체내에서 키메라 11D10 및 3A5 항-TAT10772 폴리펩티드 항체의 효능을 시험하기 위해, 110 SCID 마우스 당 2 x 107개의 OVCAR-3/luc 세포를 복강에 주사하고, 주사 후 20일 동안 성장시켰다. 주사 후 제20일째에, 마우스를 그룹 당 9마리 내지 10마리의 마우스의 상이한 9 그룹으로 분리하고, 종양 부피를 각 마우스에서 측정하였다. 주사 후 제23일, 제30일, 제37일 및 제44일째에, 마우스를 하기와 같이 처리하였다:
그룹 A - 비히클 단독
그룹 B - 2.5 mg/kg 키메라 11D10-MC-vc-PAB-MMAE
그룹 C - 2.5 mg/kg 키메라 11D10-MC-vc-PAB-MMAF
그룹 D - 2.5 mg/kg 키메라 11D10-MC-MMAF
그룹 E - 2.5 mg/kg 키메라 3A5-MC-vc-PAB-MMAE
그룹 F - 2.5 mg/kg 키메라 3A5-MC-vc-PAB-MMAF
그룹 G - 2.5 mg/kg 키메라 3A5-MC-MMAF
그룹 H - 2.5 mg/kg 항-두드러기쑥-MC-vc-PAB-MMAE
그룹 I - 2.5 mg/kg 항-두드러기쑥-MC-vc-PAB-MMAF
종양 부피를 주사 후 제27일, 제34일, 제41일, 제48일, 제55일 및 제69일째에 각 마우스에서 측정하여 종양 부피를 감소시키는데 있어 각 처리 효능을 측정하였다. 추가로, 동물 생존율 ％을 처리 후 250일 동안 매일 측정하였다.
이러한 생체내 분석의 결과에 의해 비히클 단독 (그룹 A) 또는 비-TAT10772-특이적 항-두드러기쑥 항체 (그룹 H 및 I)로 처리된 마우스는 처리 후 종양 부피의 감소를 관찰할 수 없었음을 입증하였다. 사실, 상기 동물의 종양은 단순히 시간 경과에 따라 계속하여 크기가 커졌다. 이러한 결과에 의해 독소-접합되었어도 TAT10772 폴리펩티드에 결합할 수 없는 항체는 특이적 (또는 심지어 비-특이적) 치료 효과를 제공하지 않음을 입증하였다. 반대로, 그룹 B 내지 G의 대부분의 동물은 처리 후 종양 부피에 있어서 유의적 및 재현적 감소를 입증하면서 키메라 11D10 및 3A5 둘다는 특이적 생체내 치료 효과를 제공함을 입증하였다. 사실, 그룹 B 내지 G의 대부분의 동물은 완전 종양 괴사를 입증하였다. 이들 데이타에 의해 키메라 항체 11D10 및 3A5는 TAT10772 폴리펩티드를 발현하는 종양의 치료에 특이적, 유의적 및 재현적 생체내 치료 효과를 제공함을 입증하였다.
생존율에 대해, 그룹 A, H 및 I의 모든 동물은 이식 후 제125일째에 사멸하였다. 그러나, 동시점에, 그룹 B의 동물 90％, 그룹 E 및 F의 동물 80％, 및 그룹 C, D 및 G의 동물 55％는 살아 있었으며, 이는 키메라 항체 11D10 및 3A5가 TAT10772 폴리펩티드를 발현하는 종양의 치료에 특이적, 유의적 및 재현적 생체내 치료 효과를 제공함을 입증하였다. 표준 콕스(Cox) 비례 위험 모델에 의한 결과는 하기 표 10에 나타냈으며, 여기서 8개 비-비히클 하위군 각각에 대한 개별 위험률 (H.R.)을 결정하였다 (비히클만 처리 그룹 A는 위험률 1.0으로 임의로 할당함).
Figure 112008004290412-pct00026
피하 주사 모델, 유지방 패드 이식 모델 및 이종이식 모델
3A5 키메라 항체의 치료 효능을 측정하는 추가 생체내 실험에 의한 결과는 도 32 내지 37에 나타냈다. 보다 구체적으로, PC3/C5.3B2 세포의 피하 주사에 이은 각종 항체 처리 (도 32), SCID 베이지 마우스의 유지방 패드로의 OVCAR-3 세포 이식에 이은 각종 항체 처리 (도 33 내지 35 및 37), 및 누드 마우스 당 10 × 106개의 PC3/A5.3B2 세포의 이종이식에 이은 각종 항체 처리 (도 36)에 의한 종양 형성을 비롯한, 각종 상이한 생체내 포맷의 생체내 종양 크기를 감소시키는 능력에 대해 독소-접합된 키메라 3A5 항체를 시험하였다. 이러한 실험의 결과는 시험한 각종 항-TAT10772 항체가 생체내에서 TAT10772-발현 종양의 치료 처리에 효과적임을 나타냈다.
실시예 13: 혼성화 프로브로서의 TAT의 용도
하기 방법은 TAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도, 즉 포유동물에서 종양의 존재를 진단하기 위한 혼성화 프로브로서의 용도를 기재한다.
본원에 개시된 전장 또는 성숙한 TAT의 코딩 서열을 포함하는 DNA는 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예컨대, TAT의 자연 발생적인 변이체를 코딩하는 것)를 스크리닝하기 위한 프로브로서도 사용할 수 있다.
상기 라이브러리 DNA 중 하나를 함유하는 필터를 다음과 같은 고엄격 조건에 따라 혼성화하고, 세척하였다. 방사성 표지된 TAT-유래 프로브는, 50％ 포름아미드, 5×SSC, 0.1％ SDS, 0.1％ 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 2× 덴하르트 용액 및 10％ 덱스트란 술페이트로 이루어진 용액 중에서 20시간 동안 42 ℃에서 필터에 혼성화시켰다. 필터를 42 ℃의 0.1×SSC 및 0.1％ SDS의 수용액 중에서 세척하였다.
이어서, 전장 천연 서열 TAT를 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 확인할 수 있다.
실시예 14: 이. 콜라이에서 TAT의 발현
본 실시예는 이. 콜라이에서의 재조합 발현에 의해 TAT의 글리코실화되지 않은 형태를 제조하는 방법을 설명한다.
우선, TAT를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 상응하는 제한효소 부위를 함유하여야 한다. 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하는 pBR322 (이. 콜라이로부터 유래됨; 문헌 [Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)])가 있다. 벡터를 제한효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (처음 6 개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), TAT 코딩 영역, 람다 전사 종결인자 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
이어서, [Sambrook et al. 상기 문헌]에 기재된 방법에 의해 라이게이션 혼합물을 사용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. LB 플레이트에서 성장할 수 있는 형질전환체를 확인한 후에 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA는 제한 분석법 및 DNA 서열분석법에 의해 단리 및 확인할 수 있다.
선별된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 밤새 배양한 배양액을 사용하여 더 큰 규모의 배양물에 접종시켰다. 이어서, 세포를 발현 프로모터가 작동 중인 동안 원하는 광학 밀도까지 성장시켰다.
몇 시간 이상 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 수확하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠릿을 당업계에 공지된 여러 가지 제제를 사용하여 용해시킨 후에, 단백질이 단단하게 결합하는 조건하에 금속 킬레이팅 컬럼을 이용하여 용해된 TAT 단백질을 정제하였다.
하기 절차를 이용하여 이. 콜라이에서 폴리-His 태그가 부착된 형태로 TAT를 발현시켰다. 우선, TAT를 코딩하는 DNA를 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 상응하는 제한효소 부위, 및 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼 상에서의 신속한 정제, 및 엔테로키나제를 사용하는 단백질 분해에 의한 제거를 제공하는 다른 유용한 서열들을 함유할 것이다. 이어서, PCR로 증폭시킨, 폴리-His 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시켜, 이. 콜라이 숙주 (균주 52 (W3110 fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq)를 기재로 한 숙주)를 형질전환시키는데 사용하였다. 우선, 형질전환체를 50 ㎎/mL의 카르베니실린을 함유하는 LB에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30 ℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지 (물 500 mL 중에서 (NH4)2SO4 3.57 g, 시트르산나트륨·2H2O 0.71 g, KCl 1.07 g, 디프코 (Difco) 효모 추출물 5.36 g, 쉐필드 하이카제 (Sheffield hycase) SF 5.36 g, 및 110 mM MPOS (pH 7.3), 0.55％ (중량/부피) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 제조함)로 50 내지 100 배 희석하고, 대략 20 내지 30시간 동안 30 ℃에서 진탕 배양하였다. 샘플을 분리하여 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 검증하고, 대규모 배양액을 원심분리하여 세포를 펠릿 형태로 얻었다. 세포 펠릿을 정제 및 리폴딩시킬 때까지 동결시켰다.
발효액 0.5 내지 1 L로부터 얻은 이. 콜라이 페이스트 (펠릿 6 내지 10 g)를 10배 부피 (중량/부피)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris (pH 8) 완충액에 다시 현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M 및 0.02 M이 되도록 첨가하고, 용액을 4 ℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서, 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 차단된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 벡크만 (Beckman) 초원심분리기에서 40,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 3배 내지 5배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켜 정화시켰다. 정화된 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 키아젠 (Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 5 mL에 로딩하였다. 컬럼을, 50 mM 이미다졸 (칼바이오켐 (Calbiochem), 우트롤 (Utrol) 등급)을 함유하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 단백질을 용출시켰다. 원하는 단백질을 함유하는 분취액을 모아 4 ℃에 보관하였다. 아미노산 서열에 기초하여 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다.
20 mM 트리스 (pH 8.6), 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성된 새롭게 준비한 리폴딩 완충액으로 샘플을 천천히 희석함으로써 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/mL가 되도록 선택하였다. 리폴딩 용액을 4 ℃에서 12 내지 36 시간 동안 부드럽게 교반하였다. 최종 농도가 0.4％ (대략 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 켄칭하였다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시키고, 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10％가 되도록 첨가하였다. 리폴딩된 단백질을, 10 내지 80％의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키면서 0.1％ TFA의 이동상 완충액을 사용하는 포로스 (Poros) R1/H 역상 컬럼 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. A280에서 흡광되는 분획의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 함유하는 분취액을 모았다. 일반적으로, 적절하게 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성 내부 영역이 있는 가장 조밀한 형태의 단백질이기 때문에, 대부분의 단백질들 중에서 적절하게 리폴딩된 단백질은 가장 낮은 농도의 아세토니트릴에서 용출된다. 응집된 단백질은 통상적으로 보다 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 원하는 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 샘플로부터 내독소를 제거하기도 한다.
원하는 폴딩된 TAT 폴리펩티드를 함유하는 분취액을 모으고, 질소 스트림을 용액에 부드럽게 첨가하여 아세토니트릴을 제거하였다. 제제화 완충액으로 평형화시키고, 멸균 여과시킨 G25 수퍼파인 (Superfine) (파마시아 (Pharmacia)) 수지를 이용하는 겔 여과법 또는 투석법을 이용하여 단백질을 0.14 M 염화나트륨 및 4％ 만니톨을 포함하는 20 mM HEPES (pH 6.8)로 제제화하였다.
상기 기술(들)을 이용하여 본원에 개시된 특정 TAT 폴리펩티드를 성공적으로 발현시키고 정제하였다.
실시예 15: 포유동물 세포에서 TAT의 발현
본 실시예는 포유동물 세포에서의 재조합 발현에 의해 TAT의 잠재적인 글리코실화 형태를 제조하는 방법을 설명한다.
벡터 pRK5 (유럽 특허 제307,247호 참조; 1989년 3월 15일자로 공개됨)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, [Sambrook et al. 상기 문헌]에 기재된 것과 같이 선택된 제한효소 부위를 사용하는 라이게이션 방법을 이용하여 TAT DNA를 pRK5에 라이게이션시킴으로써 TAT DNA를 삽입하였다. 생성된 벡터를 pRK5-TAT로 지칭하였다.
한 실시양태에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 조직 배양 플레이트에 포함된 소 태아 혈청, 및 임의로는 영양소 및/또는 항생제가 보충된 DMEM와 같은 배지 중에서 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 전면 성장시켰다. pRK5-TAT DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA (문헌 [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)]) 약 1 ㎍과 혼합하고, 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl2에 용해시켰다. 이 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4를 적가하여 25 ℃에서 10 분 동안 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고, 293 세포에 첨가하여 37 ℃에서 약 4 시간 동안 정치시켰다. 배양 배지를 흡인 제거하고 PBS 중의 20％ 글리세롤 2 mL를 30 초 동안 첨가하였다. 이어서, 293 세포를 혈청 무함유 배지로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고, 약 5일 동안 세포를 인큐베이션하였다.
형질감염으로부터 대략 24시간 후, 배양 배지를 제거하고, 배양 배지(단독) 또는 200 μCi/mL의 35S-시스테인 및 200 μCi/mL의 35S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 교체하였다. 12 시간 동안 인큐베이션한 후, 조정 배지를 수집하여 회전 필터에서 농축시키고, 15％ SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 선택된 기간 동안 필름에 노출시켜 TAT 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있었다. 형질감염된 세포를 함유하는 배양액을 추가로 인큐베이션하고 (혈청 무함유 배지에서), 배지를 선택된 생물학적 분석법으로 시험하였다.
다른 기술로서, 문헌 [Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 TAT를 293 세포에 일시적으로 도입할 수 있다. 293 세포를 스피너 플라스크에서 최고 농도까지 성장시키고, pRK5-TAT DNA 700 ㎍을 첨가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 스피너 플라스크로부터 농축시키고, PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠릿 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20％ 글리세롤로 90 초 동안 처리하고, 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/mL의 소 인슐린 및 0.1 ㎍/mL의 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크에 다시 도입하였다. 약 4 일 후에, 조정 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포 및 세포 용해물을 제거하였다. 이어서, 발현된 TAT를 함유하는 샘플을 농축시키고, 선택된 임의의 방법, 예컨대 투석 및/또는 컬럼 크로마토그래피로 정제할 수 있었다.
다른 실시양태에서는, TAT를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5-TAT를 공지된 시약, 예컨대 CaPO4 또는 DEAE 덱스트란을 사용하여 CHO 세포내로 형질감염시켰다. 상기 기재된 바와 같이, 세포 배양물을 인큐베이션하고, 기존 배지를 배양 배지(단독) 또는 35S-메티오닌과 같은 방사성 표지를 함유하는 배지로 교체하였다. TAT 폴리펩티드의 존재 여부를 결정한 후에, 배양 배지를 혈청 무함유 배지로 교체하였다. 바람직하게는, 약 6 일 동안 배양물을 인큐베이션한 후에, 조정 배지를 수확하였다. 이어서, 발현된 TAT를 함유하는 배지를 임의의 선택된 방법으로 농축시키고 정제하였다.
또한, 에피토프 태그가 부착된 TAT는 숙주 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. TAT를 pRK5 벡터로부터 서브클로닝하였다. 서브클론 인서트는 PCR을 통해 배큘로바이러스 발현 벡터에 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 프레임에 맞게 융합시켰다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착된 TAT 인서트를 DHFR과 같은 선별 마커를 함유하는 SV40 유래 벡터에 서브클로닝시킴으로써 안정한 클론을 선별하였다. 마지막으로, CHO 세포를 (상기 기재된 바와 같이) SV40 유래 벡터로 형질감염시켰다. 상기 기재된 바와 같이 표지하여 발현을 확인하였다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 있는 발현된 TAT를 함유하는 배양 배지를 농축시키고, Ni2+-킬레이트 친화성 크로로마토그래피와 같은 임의의 선택된 방법으로 정제하였다.
TAT는 또한 일시적 발현 절차에 의해 CHO 및/또는 COS 세포에서 발현시키거나, 다른 안정한 발현 절차에 의해 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다.
하기 절차를 이용하여 CHO 세포에서 안정하게 발현시켰다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태 (예를 들어, 세포외 도메인)에 대한 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 함유하는 IgG1 불변 영역 서열 및/또는 폴리-His 태그가 부착된 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 작제물 (이뮤노어드헤신)로서 발현된다.
PCR 증폭에 이어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons (1997)]에 기재된 표준 기술을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터는 대상 DNA의 5' 및 3'에 혼용가능한 제한 부위를 갖도록 제작하여 cDNA가 편리하게 셔틀링될 수 있도록 한다. CHO 세포에서의 발현에 사용되는 벡터는 문헌 [Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779) (1996)]에 의해 기재된 바와 같으며, 이는 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하여 대상 cDNA 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시킨다. DHFR 발현은 형질감염 후 플라스미드의 안정적 유지를 선별하기 위한 것이다.
원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 시판되는 형질감염 시약 수퍼펙트 (SUPERFECT; 등록상표) (키아젠), 도스퍼 (DOSPER; 등록상표) 또는 퓨진 (FUGENE; 등록상표) (베링거 만하임; Boehringer Mannheim)을 사용하여 대략 1,000만 개의 CHO 세포에 도입하였다. [Lucas et al. 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 세포를 증식시켰다. 대략 3×107개의 세포를 추후의 성장 및 생성을 위해 하기에 기재된 바와 같이 앰플로 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 함유하는 앰플을 수조에 넣어 해동한 후, 볼텍싱하여 혼합하였다. 내용물을 배지 10 mL가 함유된 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고, 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡인 제거하고, 세포를 10 mL의 선별 배지 (0.2 ㎛ 투석 여과된 5％ 소 태아 혈청을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20)에 다시 현탁시켰다. 이어서, 세포를 90 mL의 선별 배지를 함유하는 100 mL 스피너에 분주하였다. 1 내지 2일 후, 세포를 선별 성장 배지 150 mL로 채운 250 mL 스피너로 옮겨서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 2 내지 3일이 더 지난 후에 250 mL, 500 mL 및 2,000 mL 스피너에 3×105개 세포/mL를 시딩하였다. 세포 배지를 원심분리하고 생성 배지에 다시 현탁시켜 신선한 배지로 교체하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있지만, 실제로는 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일자로 허여됨)에 기재된 생성 배지를 사용하였다. 3 L 생성 스피너에 1.2×106개 세포/mL가 되도록 시딩하였다. 시딩 당일, 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1일, 스피너로부터 샘플을 채취하고, 여과된 공기를 살포하기 시작하였다. 제2일, 스피너로부터 샘플을 채취하고, 온도를 33 ℃로 올리고, 500 g/L 글루코스 30 mL 및 10％ 소포제 0.6 mL (예를 들어, 35％ 폴리디메틸실록산 에멀젼, 다우 코닝 (Dow Corning) 365 의약 등급 에멀젼)를 첨가하였다. 전체 생성 기간 동안, 필요하다면 pH가 약 7.2로 유지되도록 조정하였다. 10 일 후에 또는 생존률이 70％ 미만으로 떨어졌을 때, 세포 배양액을 원심분리하여 수확하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 여액을 4 ℃에 보관하거나, 즉시 컬럼 상에 로딩하여 정제하였다.
폴리-His 태그가 부착된 작제물의 경우, Ni-NTA 컬럼 (키아젠)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조정 배지에 첨가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM HEPES (pH 7.4) 완충액으로 평형화된 6 mL Ni-NTA 컬럼 상에 4 ℃에서 4 내지 5 mL/분의 유속으로 조정 배지를 펌핑하였다. 로딩 후, 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 함유하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 mL의 G25 수퍼파인 (파마시아) 컬럼으로 10 mM HEPES, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 함유하는 보관 완충액 (pH 6.8)에서 염을 제거하고 -80 ℃에서 보관하였다.
이뮤노어드헤신 (Fc 함유) 작제물은 다음과 같이 조정 배지로부터 정제하였다. 조정 배지를 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 5 mL 단백질 A 컬럼 (파마시아)에 펌핑하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 전체적으로 세척한 후, 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 1 mL의 분취액을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액 (pH 9)이 함유된 튜브에 수집함으로써 용출된 단백질을 즉시 중화시켰다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착된 단백질에 대해, 상기 기재된 바와 같이 보관 완충액 중에서 고도로 정제된 단백질로부터 염을 제거하였다. SDS-폴리아크릴 아미드 겔 및 에드만 (Edman) 분해법에 의한 N-말단 아미노산 서열분석을 통해 균질성을 측정하였다.
상기 기술(들)을 이용하여 본원에 개시된 특정 TAT 폴리펩티드를 성공적으로 발현시키고 정제하였다.
실시예 16: 효모에서의 TAT 의 발현
하기 방법은 효모에서의 TAT의 재조합 발현을 설명한다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터의 TAT의 세포내 생성 또는 분비에 사용하기 위한 효모 발현 벡터를 제작하였다. TAT를 코딩하는 DNA 및 프로모터를 TAT의 세포내 발현을 지시하는 선택된 플라스미드 내의 적합한 제한효소 부위에 삽입하였다. TAT를 분비시키기 위해서는, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 TAT 신호 펩티드 또는 다른 포유동물의 신호 펩티드, 또는 예를 들어 효모 α-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열, 및 링커 서열 (필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 TAT를 코딩하는 DNA를 선택된 플라스미드에 클로닝하여 TAT를 발현시켰다.
이어서, 효모 세포, 예컨대 효모 균주 AB110을 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 선택된 발효 배지에서 배양하였다. 형질전환된 효모 상층액을 10％ 트리클로로아세트산으로 침전시키고, SDS-PAGE로 분리한 후에 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석하였다.
이어서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 제거한 후에 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시킴으로써 재조합 TAT를 단리하고 정제하였다. TAT를 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 추가로 정제하였다.
상기 기술(들)을 이용하여 본원에 개시된 특정 TAT 폴리펩티드를 성공적으로 발현시키고 정제하였다.
실시예 17: 배큘로바이러스 -감염 곤충 세포에서의 TAT 의 발현
하기 방법은 배큘로바이러스-감염 곤충 세포에서의 TAT의 재조합 발현을 설명한다.
TAT의 코딩 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터에 함유된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역과 유사)를 포함하였다. 시판되는 플라스미드, 예컨대 pVL1393 (노바젠 (Novagen))으로부터 유래된 플라스미드를 비롯한 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 요컨대, TAT 코딩 서열 또는 TAT 코딩 서열의 원하는 부분, 예컨대 TAT 단백질이 세포외에 존재하는 경우에 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 성숙한 단백질을 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 5' 프라이머는 인접 (선택된) 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한효소로 분해하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
재조합 배큘로바이러스는, 리포펙틴 (지브코 (GIBCO)-BRL로부터 시판됨)을 사용하여 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (BACULOGOLD; 상표명) 바이러스 DNA (파민젠 (Pharmingen))를 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 함께 형질감염시켜 제조하였다. 28 ℃에서 4 내지 5일 동안 인큐베이션한 후, 방출된 바이러스를 수확하여 추후의 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 있는 발현된 TAT를, 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화성 크로로마토그래피로 다음과 같이 정제하였다. 추출물을 문헌 [Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993)]에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스-감염 Sf9 세포로부터 준비하였다. 요컨대, Sf9 세포를 세척하여 초음파처리 완충액 (25 mL HEPES (pH 7.9); 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10％ 글리세롤; 0.1％ NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고, 얼음 위에서 20초 동안 2회 초음파처리하였다. 초음파처리물을 원심분리에 의해 정화시키고, 상층액을 로딩 완충액 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 7.8)으로 50배 희석하고 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 층 부피가 5 mL인 Ni2+-NTA 아가로스 컬럼 (키아젠으로부터 시판됨)을 준비하여 물 25 mL로 세척하고, 로딩 완충액 25 mL로 평형화시켰다. 여과시킨 세포 추출물을 분 당 0.5 mL씩 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 로딩 완충액으로 A280 기준값까지 세척하고, 이 시점에서 분취액을 수집하기 시작하였다. 이어서, 2차 세척 완충액 (50 mM 포스페이트; 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준값에 다시 도달한 후, 컬럼을 2차 세척 완충액 중에서 0 mM에서 500 mM 이미다졸로의 농도 구배로 전개시켰다. 분취액 1 mL을 수집하고, SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리성 포스파타제에 접합된 Ni2+-NTA (키아젠)를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. His10 태그가 부착되어 있는 용출된 TAT를 함유하는 분취액을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그가 부착된 (또는 Fc 태그가 부착된) TAT의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 기술(들)을 이용하여 본원에 개시된 특정 TAT 폴리펩티드를 성공적으로 발현시키고 정제하였다.
실시예 18: 특이적 항체를 사용하는 TAT 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 TAT 폴리펩티드를 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 프로 (pro)-TAT 폴리펩티드, 성숙한 TAT 폴리펩티드 또는 전 (pre)-TAT 폴리펩티드를, 대상 TAT 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 사용하는 면역친화성 크로로마토그래피에 의해 정제하였다. 일반적으로, 면역친화성 컬럼은 항-TAT 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유결합에 의해 커플링시킴으로써 제작하였다.
폴리클로날 이뮤노글로불린은 황산암모늄 침전법 또는 고정화된 단백질 A (파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지 (Pharmacia LKB Biotechnology; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)) 상에서의 정제법을 통해 면역 혈청으로부터 수득하였다. 이와 마찬가지로, 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전법 또는 고정화된 단백질 A 상에서의 크로마토그래피에 의해 마우스 복수액으로부터 얻었다. 부분적으로 정제된 이뮤노글로불린을 CnBr-활성화 세파로스(상표명) (파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유결합에 의해 부착시켰다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 차단하고, 유도체 수지를 제조사의 지시에 따라 세척하였다.
이러한 면역친화성 컬럼은 TAT 폴리펩티드를 가용성 형태로 함유하는 세포로부터 분취액을 제조하여 TAT 폴리펩티드를 정제하는데 사용하였다. 이러한 제제는 디터전트의 첨가 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 세포 전체를 용해시키거나 차등 원심분리를 통해 수득한 하위세포 분획을 용해시켜 얻는다. 별법으로, 신호 서열을 함유하는 가용성 TAT 폴리펩티드는 세포가 성장하는 배지에 유용한 양으로 분비될 수 있다.
가용성 TAT 폴리펩티드-함유 제제를 면역친화성 컬럼을 통해 통과시키고, 컬럼을 TAT 폴리펩티드의 선택적인 흡수를 허용하는 조건 (예를 들어, 디터전트의 존재하의 고이온 농도 완충액)하에 세척하였다. 이어서, 컬럼을 항체/TAT 폴리펩티드 결합을 방해하는 조건 (예를 들어, 대략 pH 2 내지 3과 같은 낮은 pH 완충액 또는 고농도의 카오트로프 (chaotrope), 예컨대 우레아 또는 티오시아네이트 이온)하
재료의 기탁
하기 물질을 미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 10801 유니버시티 블러바드에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁하였다.
재료 ATCC 기탁 번호 기탁일
하이브리도마 세포주 3A5.3 PTA-6695 2005년 5월 4일
하이브리도마 세포주 11D10.1.14 PTA-6696 2005년 5월 4일
상기 기탁은 특허 절차 및 감독의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약 (부다페스트 조약)의 규정하에 수행되었다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아 있는 배양물의 보관을 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 관점하에서 ATCC에 의해 이용가능하게 될 것이며, 어느 것이 먼저 나오든, 적절한 미국 특허의 허여시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 공중에게 기탁물의 배양물의 후손의 영구적이며 비제한된 이용가능성을 보장하며, 35 USC '122 및 그에 따른 장관의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정 언급을 갖는 37 CFR '1.14 포함)에 따라 표제화된 미국 특허 상표청 장관에 의해 결정된 것에 대한 후손의 이용가능성을 보장하는 제넨테크, 인크.와 ATCC 사이의 동의를 이룬다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건하에 배양될 경우 기탁물의 배양물이 죽거나 소실되거나 파괴되어야 할 경우, 물질은 통지시 또다른 동일물로 즉시 대체될 것임을 동의하였다. 기탁물의 이용가능성은 임의의 정부의 권한하에서 그의 특허법에 따라 등록된 권리를 위반하여 본 발명을 실시하는 자격으로서 간주되지 않아야 한다.
앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 국면을 예시하기 위한 의도일 뿐, 본 발명은 기탁된 작제물의 범위로 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 임의의 작제물을 본 발명의 범위에 포함된다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 함유된 기술 내용이 본 발명의 최선의 양식을 비롯한 본 발명의 임의의 국면을 실시할 수 있도록 하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허청구 범위의 범주가 본 명세서에 나타낸 구체적인 예들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 본원에 나타내고 기술한 것 이외에도, 본 발명의 다양한 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게는 명백할 것이며, 이들은 첨부된 특허청구의 범위에 포함된다.
<110> Genentech, Inc. Dennis,Mark S. Mallet,William Polakis,Paul <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TUMOR <130> P5040R1-PCT <140> PCT/US2006/023099 <141> 2006-06-14 <150> US 60/793,951 <151> 2006-04-21 <150> US 60/692,092 <151> 2005-06-20 <160> 211 <210> 1 <211> 21112 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cctgtgactt ctcttctcac ccctggcctg gtgataacca cagacaggat 50 gggcataagc agagaacctg gaaccagttc cacttcaaat ttgagcagca 100 cctcccatga gagactgacc actttggaag acactgtaga tacagaagcc 150 atgcagcctt ccacacacac agcagtgacc aacgtgagga cctccatttc 200 tggacatgaa tcacaatctt ctgtcctatc tgactcagag acacccaaag 250 ccacatctcc aatgggtacc acctacacca tgggggaaac gagtgtttcc 300 atatccactt ctgacttctt tgagaccagc agaattcaga tagaaccaac 350 atcctccctg acttctggat tgagggagac cagcagctct gagaggatca 400 gctcagccac agagggaagc actgtccttt ctgaagtgcc cagtggtgct 450 accactgagg tctccaggac agaagtgata tcctctaggg gaacatccat 500 gtcagggcct gatcagttca ccatatcacc agacatctct actgaagcga 550 tcaccaggct ttctacttcc cccattatga cagaatcagc agaaagtgcc 600 atcactattg agacaggttc tcctggggct acatcagagg gtaccctcac 650 cttggacacc tcaacaacaa ccttttggtc agggacccac tcaactgcat 700 ctccaggatt ttcacactca gagatgacca ctcttatgag tagaactcct 750 ggagatgtgc catggccgag ccttccctct gtggaagaag ccagctctgt 800 ctcttcctca ctgtcttcac ctgccatgac ctcaacttct tttttctcca 850 cattaccaga gagcatctcc tcctctcctc atcctgtgac tgcacttctc 900 acccttggcc cagtgaagac cacagacatg ttgcgcacaa gctcagaacc 950 tgaaaccagt tcacctccaa atttgagcag cacctcagct gaaatattag 1000 ccacgtctga agtcaccaaa gatagagaga aaattcatcc ctcctcaaac 1050 acacctgtag tcaatgtagg gactgtgatt tataaacatc tatccccttc 1100 ctctgttttg gctgacttag tgacaacaaa acccacatct ccaatggcta 1150 ccacctccac tctggggaat acaagtgttt ccacatcaac tcctgccttc 1200 ccagaaacta tgatgacaca gccaacttcc tccctgactt ctggattaag 1250 ggagatcagt acctctcaag agaccagctc agcaacagag agaagtgctt 1300 ctctttctgg aatgcccact ggtgctacta ctaaggtctc cagaacagaa 1350 gccctctcct taggcagaac atccacccca ggtcctgctc aatccacaat 1400 atcaccagaa atctccacgg aaaccatcac tagaatttct actcccctca 1450 ccacgacagg atcagcagaa atgaccatca cccccaaaac aggtcattct 1500 ggggcatcct cacaaggtac ctttaccttg gacacatcaa gcagagcctc 1550 ctggccagga actcactcag ctgcaactca cagatctcca cactcaggga 1600 tgaccactcc tatgagcaga ggtcctgagg atgtgtcatg gccaagccgc 1650 ccatcagtgg aaaaaactag ccctccatct tccctggtgt ctttatctgc 1700 agtaacctca ccttcgccac tttattccac accatctgag agtagccact 1750 cgtctcctct ccgggtgact tctcttttca cccctgtcat gatgaagacc 1800 acagacatgt tggacacaag cttggaacct gtgaccactt cacctcccag 1850 tatgaatatc acctcagatg agagtctggc cacttctaaa gccaccatgg 1900 agacagaggc aattcagctt tcagaaaaca cagctgtgac tcagatgggc 1950 accatcagtg ctagacaaga attctattcc tcttatccag gcctcccaga 2000 gccatccaaa gtgacatctc cagtggtcac ctcttccacc ataaaagaca 2050 ttgtttctac aaccatacct gcttcctctg agataacaag aattgagatg 2100 gagtcaacat ccaccctgac ccccacacca agggagacca gcacctccca 2150 ggagatccac tcagccacaa agccaagcac tgttccttac aaggcactca 2200 ctagtgccac gattgaggac tccatgacac aagtcatgtc ctctagcaga 2250 ggacctagcc ctgatcagtc cacaatgtca caagacatat ccactgaagt 2300 gatcaccagg ctctctacct cccccatcaa gacagaatct acagaaatga 2350 ccattaccac ccaaacaggt tctcctgggg ctacatcaag gggtaccctt 2400 accttggaca cttcaacaac ttttatgtca gggacccatt caactgcatc 2450 tcaaggattt tcacactcac agatgaccgc tcttatgagt agaactcctg 2500 gagaggtgcc atggctaagc catccctctg tggaagaagc cagctctgcc 2550 tctttctcac tgtcttcacc tgtcatgacc tcatcttctc ccgtttcttc 2600 cacattacca gacagcatcc actcttcttc gcttcctgtg acatcacttc 2650 tcacctcagg gctggtgaag accacagagc tgttgggcac aagctcagaa 2700 cctgaaacca gttcaccccc aaatttgagc agcacctcag ctgaaatact 2750 ggccaccact gaagtcacta cagatacaga gaaactggag atgaccaatg 2800 tggtaacctc aggttataca catgaatctc cttcctctgt cctagctgac 2850 tcagtgacaa caaaggccac atcttcaatg ggtatcacct accccacagg 2900 agatacaaat gttctcacat caacccctgc cttctctgac accagtagga 2950 ttcaaacaaa gtcaaagctc tcactgactc ctgggttgat ggagaccagc 3000 atctctgaag agaccagctc tgccacagaa aaaagcactg tcctttctag 3050 tgtgcccact ggtgctacta ctgaggtctc caggacagaa gccatctctt 3100 ctagcagaac atccatccca ggccctgctc aatccacaat gtcatcagac 3150 acctccatgg aaaccatcac tagaatttct acccccctca caaggaaaga 3200 atcaacagac atggccatca cccccaaaac aggtccttct ggggctacct 3250 cgcagggtac ctttaccttg gactcatcaa gcacagcctc ctggccagga 3300 actcactcag ctacaactca gagatttcca cggtcagtgg tgacaactcc 3350 tatgagcaga ggtcctgagg atgtgtcatg gccaagcccg ctgtctgtgg 3400 aaaaaaacag ccctccatct tccctggtat cttcatcttc agtaacctca 3450 ccttcgccac tttattccac accatctggg agtagccact cctctcctgt 3500 ccctgtcact tctcttttca cctctatcat gatgaaggcc acagacatgt 3550 tggatgcaag tttggaacct gagaccactt cagctcccaa tatgaatatc 3600 acctcagatg agagtctggc cgcttctaaa gccaccacgg agacagaggc 3650 aattcacgtt tttgaaaata cagcagcgtc ccatgtggaa accaccagtg 3700 ctacagagga actctattcc tcttccccag gcttctcaga gccaacaaaa 3750 gtgatatctc cagtggtcac ctcttcctct ataagagaca acatggtttc 3800 cacaacaatg cctggctcct ctggcattac aaggattgag atagagtcaa 3850 tgtcatctct gacccctgga ctgagggaga ccagaacctc ccaggacatc 3900 acctcatcca cagagacaag cactgtcctt tacaagatgc cctctggtgc 3950 cactcctgag gtctccagga cagaagttat gccctctagc agaacatcca 4000 ttcctggccc tgctcagtcc acaatgtcac tagacatctc cgatgaagtt 4050 gtcaccaggc tgtctacctc tcccatcatg acagaatctg cagaaataac 4100 catcaccacc caaacaggtt attctctggc tacatcccag gttacccttc 4150 ccttgggcac ctcaatgacc tttttgtcag ggacccactc aactatgtct 4200 caaggacttt cacactcaga gatgaccaat cttatgagca ggggtcctga 4250 aagtctgtca tggacgagcc ctcgctttgt ggaaacaact agatcttcct 4300 cttctctgac atcattacct ctcacgacct cactttctcc tgtgtcctcc 4350 acattactag acagtagccc ctcctctcct cttcctgtga cttcacttat 4400 cctcccaggc ctggtgaaga ctacagaagt gttggataca agctcagagc 4450 ctaaaaccag ttcatctcca aatttgagca gcacctcagt tgaaataccg 4500 gccacctctg aaatcatgac agatacagag aaaattcatc cttcctcaaa 4550 cacagcggtg gccaaagtga ggacctccag ttctgttcat gaatctcatt 4600 cctctgtcct agctgactca gaaacaacca taaccatacc ttcaatgggt 4650 atcacctccg ctgtggagga taccactgtt ttcacatcaa atcctgcctt 4700 ctctgagact aggaggattc cgacagagcc aacattctca ttgactcctg 4750 gattcaggga gactagcacc tctgaagaga ccacctcaat cacagaaaca 4800 agtgcagtcc tttttggagt gcccactagt gctactactg aagtctccat 4850 gacagaaata atgtcctcta atagaacaca catccctgac tctgatcagt 4900 ccacgatgtc tccagacatc atcactgaag tgatcaccag gctctcttcc 4950 tcatccatga tgtcagaatc aacacaaatg accatcacca cccaaaaaag 5000 ttctcctggg gctacagcac agagtactct taccttggcc acaacaacag 5050 cccccttggc aaggacccac tcaactgttc ctcctagatt tttacactca 5100 gagatgacaa ctcttatgag taggagtcct gaaaatccat catggaagag 5150 ctctcccttt gtggaaaaaa ctagctcttc atcttctctg ttgtccttac 5200 ctgtcacgac ctcaccttct gtttcttcca cattaccgca gagtatccct 5250 tcctcctctt tttctgtgac ttcactcctc accccaggca tggtgaagac 5300 tacagacaca agcacagaac ctggaaccag tttatctcca aatctgagtg 5350 gcacctcagt tgaaatactg gctgcctctg aagtcaccac agatacagag 5400 aaaattcatc cttcttcaag catggcagtg accaatgtgg gaaccaccag 5450 ttctggacat gaactatatt cctctgtttc aatccactcg gagccatcca 5500 aggctacata cccagtgggt actccctctt ccatggctga aacctctatt 5550 tccacatcaa tgcctgctaa ttttgagacc acaggatttg aggctgagcc 5600 attttctcat ttgacttctg gacttaggaa gaccaacatg tccctggaca 5650 ccagctcagt cacaccaaca aatacacctt cttctcctgg gtccactcac 5700 cttttacaga gttccaagac tgatttcacc tcttctgcaa aaacatcatc 5750 cccagactgg cctccagcct cacagtatac tgaaattcca gtggacataa 5800 tcaccccctt taatgcttct ccatctatta cggagtccac tgggataacc 5850 tccttcccag aatccaggtt tactatgtct gtaacagaaa gtactcatca 5900 tctgagtaca gatttgctgc cttcagctga gactatttcc actggcacag 5950 tgatgccttc tctatcagag gccatgactt catttgccac cactggagtt 6000 ccacgagcca tctcaggttc aggtagtcca ttctctagga cagagtcagg 6050 ccctggggat gctactctgt ccaccattgc agagagcctg ccttcatcca 6100 ctcctgtgcc attctcctct tcaaccttca ctaccactga ttcttcaacc 6150 atcccagccc tccatgagat aacttcctct tcagctaccc catatagagt 6200 ggacaccagt cttgggacag agagcagcac tactgaagga cgcttggtta 6250 tggtcagtac tttggacact tcaagccaac caggcaggac atcttcatca 6300 cccattttgg ataccagaat gacagagagc gttgagctgg gaacagtgac 6350 aagtgcttat caagttcctt cactctcaac acggttgaca agaactgatg 6400 gcattatgga acacatcaca aaaataccca atgaagcagc acacagaggt 6450 accataagac cagtcaaagg ccctcagaca tccacttcgc ctgccagtcc 6500 taaaggacta cacacaggag ggacaaaaag aatggagacc accaccacag 6550 ctctgaagac caccaccaca gctctgaaga ccacttccag agccaccttg 6600 accaccagtg tctatactcc cactttggga acactgactc ccctcaatgc 6650 atcaatgcaa atggccagca caatccccac agaaatgatg atcacaaccc 6700 catatgtttt ccctgatgtt ccagaaacga catcctcatt ggctaccagc 6750 ctgggagcag aaaccagcac agctcttccc aggacaaccc catctgtttt 6800 caatagagaa tcagagacca cagcctcact ggtctctcgt tctggggcag 6850 agagaagtcc ggttattcaa actctagatg tttcttctag tgagccagat 6900 acaacagctt catgggttat ccatcctgca gagaccatcc caactgtttc 6950 caagacaacc cccaattttt tccacagtga attagacact gtatcttcca 7000 cagccaccag tcatggggca gacgtcagct cagccattcc aacaaatatc 7050 tcacctagtg aactagatgc actgacccca ctggtcacta tttcggggac 7100 agatactagt acaacattcc caacactgac taagtcccca catgaaacag 7150 agacaagaac cacatggctc actcatcctg cagagaccag ctcaactatt 7200 cccagaacaa tccccaattt ttctcatcat gaatcagatg ccacaccttc 7250 aatagccacc agtcctgggg cagaaaccag ttcagctatt ccaattatga 7300 ctgtctcacc tggtgcagaa gatctggtga cctcacaggt cactagttct 7350 ggcacagaca gaaatatgac tattccaact ttgactcttt ctcctggtga 7400 accaaagacc atagcctcat tagtcaccca tcctgaagca cagacaagtt 7450 cggccattcc aacttcaact atctcgcctg ctgtatcacg gttggtgacc 7500 tcaatggtca ccagtttggc ggcaaagaca agtacaacta atcgagctct 7550 gacaaactcc cctggtgaac cagctacaac agtttcattg gtcacgcatt 7600 ctgcacagac cagcccaaca gttccctgga caacttccat ttttttccat 7650 agtaaatcag acaccacacc ttcaatgacc accagtcatg gggcagaatc 7700 cagttcagct gttccaactc caactgtttc aactgaggta ccaggagtag 7750 tgaccccttt ggtcaccagt tctagggcag tgatcagtac aactattcca 7800 attctgactc tttctcctgg tgaaccagag accacacctt caatggccac 7850 cagtcatggg gaagaagcca gttctgctat tccaactcca actgtttcac 7900 ctggggtacc aggagtggtg acctctctgg tcactagttc tagggcagtg 7950 actagtacaa ctattccaat tctgactttt tctcttggtg aaccagagac 8000 cacaccttca atggccacca gtcatgggac agaagctggc tcagctgttc 8050 caactgtttt acctgaggta ccaggaatgg tgacctctct ggttgctagt 8100 tctagggcag taaccagtac aactcttcca actctgactc tttctcctgg 8150 tgaaccagag accacacctt caatggccac cagtcatggg gcagaagcca 8200 gctcaactgt tccaactgtt tcacctgagg taccaggagt ggtgacctct 8250 ctggtcacta gttctagtgg agtaaacagt acaagtattc caactctgat 8300 tctttctcct ggtgaactag aaaccacacc ttcaatggcc accagtcatg 8350 gggcagaagc cagctcagct gttccaactc caactgtttc acctggggta 8400 tcaggagtgg tgacccctct ggtcactagt tccagggcag tgaccagtac 8450 aactattcca attctaactc tttcttctag tgagccagag accacacctt 8500 caatggccac cagtcatggg gtagaagcca gctcagctgt tctaactgtt 8550 tcacctgagg taccaggaat ggtgaccttt ctggtcacta gttctagagc 8600 agtaaccagt acaactattc caactctgac tatttcttct gatgaaccag 8650 agaccacaac ttcattggtc acccattctg aggcaaagat gatttcagcc 8700 attccaactt taggtgtctc ccctactgta caagggctgg tgacttcact 8750 ggtcactagt tctgggtcag agaccagtgc gttttcaaat ctaactgttg 8800 cctcaagtca accagagacc atagactcat gggtcgctca tcctgggaca 8850 gaagcaagtt ctgttgttcc aactttgact gtctccactg gtgagccgtt 8900 tacaaatatc tcattggtca cccatcctgc agagagtagc tcaactcttc 8950 ccaggacaac ctcaaggttt tcccacagtg aattagacac tatgccttct 9000 acagtcacca gtcctgaggc agaatccagc tcagccattt caacaactat 9050 ttcacctggt ataccaggtg tgctgacatc actggtcact agctctggga 9100 gagacatcag tgcaactttt ccaacagtgc ctgagtcccc acatgaatca 9150 gaggcaacag cctcatgggt tactcatcct gcagtcacca gcacaacagt 9200 tcccaggaca acccctaatt attctcatag tgaaccagac accacaccat 9250 caatagccac cagtcctggg gcagaagcca cttcagattt tccaacaata 9300 actgtctcac ctgatgtacc agatatggta acctcacagg tcactagttc 9350 tgggacagac accagtataa ctattccaac tctgactctt tcttctggtg 9400 agccagagac cacaacctca tttatcacct attctgagac acatacaagt 9450 tcagccattc caactctccc tgtctcccct gatgcatcaa agatgctgac 9500 ctcactggtc atcagttctg ggacagacag cactacaact ttcccaacac 9550 tgacggagac cccatatgaa ccagagacaa cagccataca gctcattcat 9600 cctgcagaga ccaacacaat ggttcccagg acaactccca agttttccca 9650 tagtaagtca gacaccacac tcccagtagc catcaccagt cctgggccag 9700 aagccagttc agctgtttca acgacaacta tctcacctga tatgtcagat 9750 ctggtgacct cactggtccc tagttctggg acagacacca gtacaacctt 9800 cccaacattg agtgagaccc catatgaacc agagactaca gccacgtggc 9850 tcactcatcc tgcagaaacc agcacaacgg tttctgggac aattcccaac 9900 ttttcccata ggggatcaga cactgcaccc tcaatggtca ccagtcctgg 9950 agtagacacg aggtcaggtg ttccaactac aaccatccca cccagtatac 10000 caggggtagt gacctcacag gtcactagtt ctgcaacaga cactagtaca 10050 gctattccaa ctttgactcc ttctcctggt gaaccagaga ccacagcctc 10100 atcagctacc catcctggga cacagactgg cttcactgtt ccaattcgga 10150 ctgttccctc tagtgagcca gatacaatgg cttcctgggt cactcatcct 10200 ccacagacca gcacacctgt ttccagaaca acctccagtt tttcccatag 10250 tagtccagat gccacacctg taatggccac cagtcctagg acagaagcca 10300 gttcagctgt actgacaaca atctcacctg gtgcaccaga gatggtgact 10350 tcacagatca ctagttctgg ggcagcaacc agtacaactg ttccaacttt 10400 gactcattct cctggtatgc cagagaccac agccttattg agcacccatc 10450 ccagaacaga gacaagtaaa acatttcctg cttcaactgt gtttcctcaa 10500 gtatcagaga ccacagcctc actcaccatt agacctggtg cagagactag 10550 cacagctctc ccaactcaga caacatcctc tctcttcacc ctacttgtaa 10600 ctggaaccag cagagttgat ctaagtccaa ctgcttcacc tggtgtttct 10650 gcaaaaacag ccccactttc cacccatcca gggacagaaa ccagcacaat 10700 gattccaact tcaactcttt cccttggttt actagagact acaggcttac 10750 tggccaccag ctcttcagca gagaccagca cgagtactct aactctgact 10800 gtttcccctg ctgtctctgg gctttccagt gcctctataa caactgataa 10850 gccccaaact gtgacctcct ggaacacaga aacctcacca tctgtaactt 10900 cagttggacc cccagaattt tccaggactg tcacaggcac cactatgacc 10950 ttgataccat cagagatgcc aacaccacct aaaaccagtc atggagaagg 11000 agtgagtcca accactatct tgagaactac aatggttgaa gccactaatt 11050 tagctaccac aggttccagt cccactgtgg ccaagacaac aaccaccttc 11100 aatacactgg ctggaagcct ctttactcct ctgaccacac ctgggatgtc 11150 caccttggcc tctgagagtg tgacctcaag aacaagttat aaccatcggt 11200 cctggatctc caccaccagc agttataacc gtcggtactg gacccctgcc 11250 accagcactc cagtgacttc tacattctcc ccagggattt ccacatcctc 11300 catccccagc tccacagcag ccacagtccc attcatggtg ccattcaccc 11350 tcaacttcac catcaccaac ctgcagtacg aggaggacat gcggcaccct 11400 ggttcaagga agttcaacgc cacagagaga gaactgcagg gtctgctcaa 11450 acccttgttc aggaatagca gtctggaata cctctattca ggctgcagac 11500 tagcctcact caggccagag aaggatagct cagccacggc agtggatgcc 11550 atctgcacac atcgccctga ccctgaagac ctcggactgg acagagagcg 11600 actgtactgg gagctgagca atctgacaaa tggcatccag gagctgggcc 11650 cttacaccct ggaccggaac agtctctatg tcaatggttt cacccatcga 11700 agctctatgc ccaccaccag cactcctggg acctccacag tggatgtggg 11750 aacctcaggg actccatcct ccagccccag ccccacgact gctggccctc 11800 tcctgatgcc gttcaccctc aacttcacca tcaccaacct gcagtacgag 11850 gaggacatgc gtcgcactgg ctccaggaag ttcaacacca tggagagtgt 11900 cctgcagggt ctgctcaagc cattgttcaa gaacaccagt gttggccctt 11950 tgtactctgg ctgcagattg accttgctca ggcccgagaa agatggggca 12000 gccactggag tggatgccat ctgcacccac cgccttgacc ccaaaagccc 12050 tggactcaac agggagcagc tgtactggga gctaagcaaa ctgaccaatg 12100 acattgaaga gctgggcccc tacaccctgg acaggaacag tctctatgtc 12150 aatggtttca cccatcagag ctctgtgtcc accaccagca 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Arg Trp Glu Ser Gly Leu Ser His 5 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ala Arg Trp Glu Ser Gly Leu Ser Val 5 <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Ser 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Glu Tyr 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Rana catesbeiana <400> 157 Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Asp Phe 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Asp Ser 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Glu Ser 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Ser Asp 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu His 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Ala Arg Trp Ser Ser Gly Leu Asn Tyr 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Ala Arg Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Ala Arg Trp Thr Ser Gly Met Asp Ser 5 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Thr Tyr 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Ala Arg Trp Asp Thr Gly Leu Thr Tyr 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Asp His 5 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Asp Ser 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Ala Arg Trp Leu Ala Gly Leu Ser Asn 5 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Ala Arg Trp Thr Ala Gly Leu Asp Gln 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp His 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Asn 5 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Ser 5 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr 5 <210> 175 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Thr 5 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Rana catesbeiana <400> 176 Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Gly Pro 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Ala Arg Trp Met Ser Gly Leu Asp Ser 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu Ser 5 <210> 179 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu Tyr 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Ser 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Thr 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Val 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr 5 <210> 184 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg 35 40 45 Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 50 55 60 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 185 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 186 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 65 70 75 Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 187 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75 Thr Val Ser Ser <210> 188 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg 35 40 45 Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 50 55 60 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 189 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 190 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 65 70 75 Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 191 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75 Thr Val Ser Ser <210> 192 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75 Thr Val Ser Ser <210> 193 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45 Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75 Thr Val Ser Ser <210> 194 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 50 55 60 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys 65 70 75 Val Glu Ile Lys Arg 80 <210> 195 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15 Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 50 55 60 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Lys Val Glu Ile Lys 80 <210> 196 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 50 55 60 Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Lys Val Glu Ile Lys 80 <210> 197 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Lys Val Glu Ile Lys 80 <210> 198 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 199 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser His 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 200 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 201 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 202 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ala Gly Leu Thr Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 203 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Thr Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 204 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Ser 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 205 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Ser 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 206 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 207 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 208 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 209 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 210 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His 20 25 30 Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 211 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His 20 25 30 Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg

Claims (36)

  1. HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 3개의 경쇄 초가변 영역 및 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3의 3개의 중쇄 초가변 영역을 포함하고,
    (a) HVR-L1은 서열 14 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함하고,
    (b) HVR-L2는 서열 35 내지 58 중 어느 하나의 서열을 포함하고,
    (c) HVR-L3은 서열 59 내지 73 중 어느 하나의 서열을 포함하고,
    (d) HVR-H1은 서열 74 내지 93 중 어느 하나의 서열을 포함하고,
    (e) HVR-H2는 서열 94 내지 112 중 어느 하나의 서열을 포함하고,
    (f) HVR-H3은 서열 113 내지 118 중 어느 하나의 서열을 포함하며,
    서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 184 내지 193 중 어느 하나의 VH 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 추가로 포함하는 단리된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 서열 194 내지 197 중 어느 하나의 VL 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 추가로 포함하는 단리된 항체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 184 내지 193 중 어느 하나의 VH 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열 및 서열 194 내지 197 중 어느 하나의 VL 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 추가로 포함하는 단리된 항체.
  5. 제1항 있어서, 항체 단편인 항체.
  6. 제1항에 있어서, 키메라 또는 인간화 항체인 항체.
  7. 제1항에 있어서, 성장 억제제에 접합된 항체.
  8. 제1항에 있어서, 세포독성제에 접합된 항체.
  9. 제8항에 있어서, 세포독성제가 독소, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  10. 제8항에 있어서, 세포독성제가 독소인 항체.
  11. 제10항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드 및 칼리케아미신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  12. 제10항에 있어서, 독소가 메이탄시노이드인 항체.
  13. 제1항에 있어서, 박테리아에서 생성되는 항체.
  14. 제1항에 있어서, CHO 세포에서 생성되는 항체.
  15. 제1항에 있어서, 항체가 결합된 세포의 사멸을 유도하는 것인 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포가 난소 암 세포인 항체.
  17. 제1항에 있어서, 검출가능하게 표지된 항체.
  18. (a) ATCC 기탁 번호 PTA-6695 하에 기탁된 하이브리도마 세포주 3A5.3, 및
    (b) ATCC 기탁 번호 PTA-6696 하에 기탁된 하이브리도마 세포주 11D10.1.14
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항체의 상보성 결정 영역을 모두 포함하는 단리된 항체.
  19. (a) ATCC 기탁 번호 PTA-6695 하에 기탁된 하이브리도마 세포주 3A5.3, 및
    (b) ATCC 기탁 번호 PTA-6696 하에 기탁된 하이브리도마 세포주 11D10.1.14
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체.
  20. TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 제1항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포.
  21. 제1항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체인 제2 항체가 TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 것을 차단하는 제1 항체의 능력을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제2 항체가 TAT10772 폴리펩티드에 결합하는 것을 동일한 항체 농도에서 40％ 이상 차단하는 제1 항체의 능력이 제2 항체에 의해 결합되는 에피토프에 제1 항체가 결합할 수 있음을 나타내는 것인, 제2 항체에 의해 결합되는 TAT10772 항원 에피토프에 결합하는 제1 항체의 확인 방법.
  22. 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합하는 제1항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하며, 상기 단백질을 발현하는 세포의 성장을 억제하고, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 림프 악성 종양, 편평세포암, 폐암, 복막암, 간세포암, 위암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요도암, 간종, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발성 흑색종, B-세포 림프종, 뇌암, 두경부암 및 관련 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포가 난소 암 세포인 제약 조성물.
  24. 치료 유효량의 제1항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 치료하기 위한 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암성 종양이 난소 종양인 제약 조성물.
  26. TAT10772 단백질을 함유할 것으로 추정되는 샘플을 제1항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체에 노출시키는 단계, 및 상기 샘플에서 상기 항체와 단백질의 결합 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 항체의 상기 단백질에 대한 결합은 상기 샘플에서 TAT10772 단백질의 존재를 나타내는 것인, TAT10772 단백질을 함유할 것으로 추정되는 샘플에서 TAT10772 단백질의 존재 여부를 결정하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 샘플이 상기 단백질을 발현할 것으로 추정되는 세포를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 세포가 난소 암 세포인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 항체가 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플 및 동일한 조직 기원의 공지의 정상 세포의 대조군 샘플을 각각 제1항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계; 및 시험 샘플 및 대조군 샘플 중의 TAT10772 단백질과 상기 항체 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 시험 샘플에서 TAT10772 단백질 발현 수준이 대조군 샘플에 비해 더 높다는 것은 상기 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는 것인, 상기 포유동물에서의 종양 존재의 진단 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 조직 세포의 시험 샘플이 암성 종양을 가질 것으로 추정되는 개체로부터 수득된 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 암성 종양이 난소, 유방 또는 췌장 종양인 방법.
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