KR101502680B1

KR101502680B1 - 난소과립종양세포 진단용 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101502680B1
Application number: KR1020130035380A
Authority: KR
Inventors: 배지현; 김재홍; 이강석; 김용학; 오훈규
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2013-04-01
Filing date: 2013-04-01
Publication date: 2015-03-17
Also published as: WO2014163344A1; KR20140120003A

Abstract

본 발명은 난소과립종양세포 진단용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 및 FOXL2 세린(serine) 33 잔기의 인산화에 특이적으로 결합함으로써 난소과립종양세포의 진단에 사용될 수 있는 상기 펩타이드를 이용한 항체, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 및 이에 특이적으로 결합하는 항체는 인산화된 FOXL2의 33번째 아미노산인 세린(serine)에 특이적으로 결합할 수 있어, 난소과립종양세포의 진단에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

난소과립종양세포 진단용 펩타이드 및 이의 용도{PEPTIDE FOR DIAGNOSING GRANULOSA-CELL TUMORS OF THE OVARY AND USES THEREOF}

본 발명은 난소과립종양세포 진단용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 및 FOXL2 세린(serine) 33 잔기의 인산화에 특이적으로 결합함으로써 난소과립종양세포의 진단에 사용될 수 있는 상기 펩타이드를 이용한 항체, 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

FOXL2는 winged-helix/forkhead (FH) 도메인 전사인자로서 알려져 있으며, 현재 FOXL2에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다. 즉, 2010년 유럽 분자생물 연구소에서 주도한 연구결과, 저명한 학술지인 Cell에 발표한 연구논문에서는 성별이 오로지 XY 염색체에 의해 결정된다는 과학적 사실을 뒤엎은 연구 결과를 보고 하였다. 연구진은 female mouse의 FOXL2 유전자를 Knock-out한 마우스의 female의 난소가 고환과 같은 구조를 가진 조직으로 변하며 남성 호르몬인 테스토스테론을 분비하는 결과를 확인하였고, 이러한 과정에서 특히 난소에서 존재하는 난소과립세포가 서서히 정자의 성숙에 관여하는 세토리(setori cell)로 변화하는 것을 확인하였다.

또한, FOXL2가 난소의 어느 세포에 발현하는지와 함께 그 발현의 단계별 추이를 살펴본 결과, FOXL2 mRNA는 발생단계부터 미성숙과 성숙한 생쥐의 난소에서 모두 발현하며 특히 작거나 중간 크기의 난포에 존재하는 미분화된 과립세포(granulosa cell)에 한정적으로 발현하는 것을 확인함으로써, FOXL2가 난포의 성장을 조절하는 인자임을 보고하였다.

한편, 20대에 잘 발생하는 질환으로, 난소과립세포 종양(granulosa cell tumor; GCT)과 난포막 세포 종양theca cell tumor)이 있으며, 이 중 난소과립세포 종양은 에스트로겐을 생산해서 초경정 질 출혈 전 월경 불순이나 폐경 후 질 출혈 등의 증상이 있다. 과립막 세포 종양의 3/4가 병기에 속하며 종양의 성장 속도가 느리고 재발도 매우 늦어서 무병기간이 10년 이상이다. 치료에 있어서는 자궁절제술 또는 양측난관 난소 적출술이 있다. 이러한 난소과립종양세포는 전체 난소암의 5% 이하이나 20대 전에 진단 및 치료 시 90% 이상의 환자가 조기 치료의 가능성이 있기 때문에, 난소과립종양세포를 조기에 진단하는 것은 매우 중요하다.

이와 관련하여, 2009년도 6월 New England Journal of Medicine 지에 발표된 연구 결과에 의하면, whole-transcriptome paired-end RNA sequencing을 통하여 97%의 adult-type GCT 환자에게서 FOXL2라는 유전자에 point mutation(402C->G)이 있음이 보고되었다. 이를 통해, FOXL2의 단일, 재발성 체세포 돌연변이 (402C->G)가 성인형 GCT의 발병기전에서 잠재적 조정자로 판단될 수 있다는 것만 알려져 있을 뿐(미국공개특허 US2011/0195070 참조), 난소과립 종양세포 발달에 대한 구체적인 메커니즘 및 이를 이용하여 난소과립종양세포를 진단하는 조성물 또는 키트에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여, 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립세포종양 질환 진단용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

더욱이, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립세포종양 질환 진단용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원결합 단편을 이용하여 난소과립세포종양 질환의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원결합 단편은 인산화된 FOXL2의 33번째 아미노산인 세린(serine)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립세포종양 질환 진단용 조성물을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립세포종양 질환 진단용 키트를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원결합 단편을 이용하는 난소과립세포종양 질환의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 및 이에 특이적으로 결합하는 항체는 인산화된 FOXL2의 33번째 아미노산인 세린(serine)에 특이적으로 결합할 수 있어, 난소과립종양세포의 진단에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 FOXL2의 비포유류와 포유류 간의 S33 잔기의 염기서열 보전 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 FOXL2 S33 인산화에 따른 단백질 안정도 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 FOXL2 단백질 안정도에 관여하는 유비퀴틴화 및 수모화 양상을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 FOXL2의 유비퀴틴화에 관련되어진 잔기 확인 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 FOXL2 S33 인산화에 따른 유비퀴틴화 및 수모화 양상을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 FOXL2 S33 인산화에 따른 유비퀴틴화 및 수모화 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 7은 FOXL2 C134W(GCT)의 S33 인산화정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 FOXL2 C134W와 S33 잔기의 직접적 인산화 관련성 확인 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 FOXL2 S33 인산화 특이적 항체 제작을 위한 도메인 맵핑 과정을 나타낸 도면이다.
도 10은 FOXL2 S33 인산화 특이적 항체의 특이성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 FOXL2 S33 인산화 특이적 항체의 특이성을 위한 정제과정을 나타낸 도면이다.
도 12는 GCT 환자 조직샘플에서의 FOXL2 S33 인산화 특이적 항체-FOXL2 인산화정도를 면역조직염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

FOXL2는 forkhead(FH) 도메인을 가진 전사인자로 생식선으로부터의 발달 과정, 세포주기조절뿐만 아니라 대사과정 등 생물학적인 과정에서 다양한 영향을 미친다. FOXL2가 결여된 난소에서는 난소과립세포의 분화가 비정상적으로 조절되며, FOXL2이 돌연변이중 C134W돌연변이는 난소과립종양세포에서 97% 존재하고 있음이 보고되었다.

본 발명자들은 FOXL2 단백질의 번역 후 변형(posttranslational modification) 분석을 통해, FOXL2 세린(serine) 33 잔기의 인산화를 확인하였고, 상기 FOXL2 S33 인산화에 따른 유비퀴틴화 및 수모화 메커니즘을 확인하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면 인산화가 FOXL2 안정도에 영향을 주는 것을 확인하였고(실시예 4 참조), S33가 인산화되면 K25 유비퀴틴화가 증가되고, K36 수모화가 감소되며, S33가 비인산화되면 K36 수모화가 증가되고 K25 유비퀴틴화가 감소됨을 확인하였다(실시예 5 참조).

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 97%의 GCT환자에게서 발견되어진 것으로 보고된 FOXL2 C134W돌연변이를 과발현 할 경우, S33 잔기 인산화정도가 WT(wild type) 보다 더 인산화되어 있는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, FOXL2 C134W 돌연변이의 과-인산화가 S33잔기와 직접적으로 관련이 있다는 것도 확인하였다(실시예 6 참조)

본 발명자들은 FOXL2 S33 특이적 항체를 제작하기 위해 FOXL2 S33 잔기에 인산화가 되어진 펩타이드 서열을 제작하였으며, 이에 본 발명은 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 다시 말해 인산화된 FOXL2의 33번째 아미노산인 세린(serine)에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제하는 것이 바람직하지만 이들 방법으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편의 면역도가 강함을 확인하고(실시예 7 참조), C134W 돌연변이를 가진 GCT 조직에서 더 강한 염색강도를 확인함으로써(실시예 8 참조), 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편이 난소과립종양세포를 특이적으로 결합하는 항체임을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립종양세포 진단용 조성물을 제공한다. 이때, 본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 난소과립종양세포의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.

더욱이, 본 발명은 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립종양세포 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 난소과립종양세포 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명은 난소과립세포종양 질환의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 난소과립세포종양 질환의 환자에서 채취된 조직 또는 혈액 등의 샘플과 직접 접촉하는 단계를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비

1-1. FOXL2 돌연변이 클로닝

다양한 FOXL2 돌연변이 형을 클로닝하기 위하여 하기의 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 재조합 PCR을 수행한 후, 증폭된 PCR 산물을 EcoRl과 Xhol 제한효소를 사용하여 pCMV-Myc 벡터에 ligation 과정을 거쳐 이콜라이에 형질전환 하였다. 한편, FOXL2 C134W+S33A 돌연변이는 C134W 돌연변이를 주형으로 S33A 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 클로닝 하였다.

돌연 변이형	Forward primer(5'→3')		Reverse primer(5'→3')
FOXL2	서열번호 1	CTAGAATTCAAATGATGGCCAGCTACCCC	서열번호 2	CTACTCGAGTCAGAGATCGAGGCGCGAATG
S33A	서열번호 3	CCGGCCCCAGGCAAGGGCGGTGGGGGT	서열번호 4	ACCCCCACCGCCCTTGCCTGGGGCCGG
S33D	서열번호 5	CCGCCGGATCCAGGCAAGGGCGGT	서열번호 6	ACCGCCCTTGCCTGGATCCGGCGG
S263A	서열번호 7	CAGGCCATGGCGCTGCCCCCCGGC	서열번호 8	GCCGGGGGGCAGCGCCATGGCCTG
K25R	서열번호 9	GGTCGCACAGTCAGAGAGCCAGAA	서열번호 10	TTCTGGCTCTCTGACTGTGCGACC
K36R	서열번호 11	CCAGGCAGAGGCGGTGGGGGTGGC	서열번호 12	GCCACCCCCACCGCCTCTGCCTGG
K48R	서열번호 13	GCCCCGGAGAGACCGGACCCG	서열번호 14	CGGGTCCGGTCTCTCCGGGGC
K54R	서열번호 15	CCGGACCCGGCGCAGAGACCC	서열번호 16	GGGTCTCTGCGCCGGGTCCGG
K87R	서열번호 17	ATCATCGCGAGATTCCCGTTC	서열번호 18	GAACGGGAATCTCGCGATGAT
C134W	서열번호 19	GCCTGGGAAGACATGTTCGA	서열번호 20	ATGTCTTCCCAGGCCGGGTC

1-2. 세포 배양

본 실시예의 실험을 위해서 Human granulosa 세포 (KGN)를 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 함유된 DMEM/F12 media에 배양하였다. KGN 세포는 Yosihiro Nishi와 Toshihiko Yanase로부터 제공받았다.

1-3. 세포주( cell line ) 제작

FOXL2가 안정적으로 세포에서 발현하는 클론을 제작하기 위해, pcDNA6 플라스미드에 FOXL2 WT(wile type), S33D, S33A, C134W의 컨스트럭을 EcoRI, XhoI의 제한효소를 이용하여 클로닝 하였다. 이후 1×10⁷의 KGN 세포에 10μg의 DNA를 트랜스펙션(transfection) 한 후 3~4주간 블라스티사이딘(blasticidin)으로 선별하였다.

1-4. 세포 내 단백질 과발현을 위한 트랜스펙션

세포에서 플라스미드를 도입 단백질을 과발현하기 위해서 KGN 세포 1×10⁶ 당 3μg의 도입하고자 하는 플라스미드를 도입하였고, 이러한 도입을 하기 위해서 Invitro transfection Transfection kit인 Neon electro transfection kit를 형질 도입하였다.

실시예 2. 실험방법

2-1. 웨스턴 블로팅

배양 세포를 수거하여 NP-40(Nonidet P-40) 용액을 이용 세포에서 단백질을 추출하였다. 추출되어진 단백질의 정량을 위해서 Bicinchoninic acid(BCA)TM protein assay를 실시하였다. 정량되어진 단백질을 SDS-PAGE 방법을 이용 전기영동하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) membrane에 transfer하여 확인하고자 하는 각각의 항체를 이용하여 배양하였다. 이후 2차 항체를 이용 ChemDoc 기계를 이용하여 확인하였다.

2-2. 면역 침전법

세포를 샘플링 하여 NP-40 lysis 버퍼에 lysis 한 후 단백질 양을 정량하였다. 이후 침전시키고자 하는 특정 단백질의 항체와 그 대조군인 항체의 normal IgG를 독립적으로 배양하여 항체와 결합하는 proteinase agrose G와 같이 배양하였다. 배양 되어진 샘플과 비드를 NP-40 버퍼로 3번 세척(washing)하고 웨스턴 블로팅 방법을 이용하여 샘플을 로딩한 후, 결합을 보고자 하는 다른 단백질의 항체로 밴드를 확인하였다.

2-3. Ubiqutination SUMOrylation 방법

과발현 되어진 샘플을 프로테오좀 억제제인 MG132를 50μM로 처리하여 배양한 후 NP-40 버퍼로 단백질을 샘플링 하였다. 이후 면역 침전법을 사용하여 과발현 한 단백질을 침전 한 다음 웨스턴 블로팅 방법을 사용하여 샘플을 로딩하여 유비퀴닌(Ubiqutine) 항체와 수모(SUMO) 항체로 배양하고, chemdoc 기계로 밴드를 확인하였다.

2-4. 통계학적 분석

각 실험 시 triplicate로 3회 반복 실시하여 평균값 및 표준 오차를 계산하였다. 각 실험에서 통계학적 분석은 SAS statistical software(SAS Enterprise Guide, USA)를 이용하여 Student's t-test를 통해 분석하였으며, p<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 해석하였다.

실시예 3. FOXL2 단백질의 인산화 분석

액체 크로마토그래피(liquid chromatography)를 이용하여 FOXL2 단백질의 번역 후 변형(posttranslational modification)을 분석한 결과, FOXL2의 33번째 아니노산인 세린(serine)의 인산화를 확인할 수 있었다.

또한, FOXL2 세린 33(S33) 잔기의 진화에서의 중요성을 확인하기 위해, FOXL2 종 간의 염기서열 계열분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 포유류에서 세린 33 잔기가 보전적으로 위치하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 단백질 안정도 실험

FOXL2 S33 잔기 인산화가 FOXL2 단백질의 안정도에 영향을 주는지 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

FOXL2의 비인산화 돌연변이인 S33A 단백질과 S33D 단백질을 실시예 1-4의 트랜스펙션 방법을 이용하여 과발현시키고 18시간 후, 단백질 합성 저해제인 사이클로헥사마이드(cyclohexamide)를 10μg 처리하여 0, 6, 12, 24 시간 단위로 샘플링하여 실시예 2-1의 웨스턴 블로팅을 수행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 비인산화 돌연변이는 단백질 안정도가 증가하였으며 과인산화 돌연변이는 단백질 안정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 인산화가 FOXL2 안정도에 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 유비퀴틴화(ubiqutination) 및 수모화(SUMOrylation)

5-1. 단백질 안정도에 관여하는 유비퀴틴화 및 수모화 양상 확인

FOXL2 단백질의 안정도에 관여하는 유비퀴틴화 및 수모화 양상을 실시예 2-1의 웨스턴 블로팅과 실시예 2-2의 면역침전법을 이용하여 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, FOXL2 인산화에 따라서 비인산화 돌연변이는 FOXL2의 유비퀴틴화가 감소하며 수모화가 증가하여 단백질 안정도를 높이며 과인산화 돌연변이인 S33D는 유비퀴틴화가 증가하며 수모화가 감소하여 단백질 안정도를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 유비퀴틴화가 증가하면, 단백질 분해가 증가함으로써 단백질 안정도가 감소하는 것을 알 수 있었다.

5-2. FOXL2 S33 잔기의 인산화에 관여된 유비퀴틴화 및 수모화 확인

FOXL2의 S33 잔기의 인산화에 관여 되어진 유비퀴틴화 및 수모화에 관련되어진 잔기(residue)를 확인할 뿐만 아니라 인산화에 의해서 조절되는 유비퀴틴화 및 수모화의 상관관계를 알아보기 위해서 하기와 같이 실험을 수행하였다.

즉, 유비퀴틴화 및 수모화에 관련 되어진 잔기인 K 잔기돌연변이 (K25, K36, K48, K54, K87)을 제작하고(실시예 1 참조), FOXL2 유비퀴틴화에 관련되어진 MDM2 E3 ligase를 과발현하여 단백질의 양을 실시예 2-1의 웨스턴 블로팅 방법을 사용 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, K25 잔기의 돌연변이의 경우에 단백질양의 차이가 없음을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, K25 잔기가 직접적으로 FOXL2 단백질의 유비퀴틴화에 관련하여 단백질 안정도를 감소하는 것을 알 수 있었다.

추가적으로, FOXL S33 잔기의 인산화가 되어지면 K25 잔기가 직접적으로 유비퀴틴화가 되고 FOXL2 S33 잔기가 비 인산화 되면 K36 잔기가 직접적으로 수모화 되는지를 확인하기 위해서 실시예 2-3의 Ubiqutination SUMOrylation 방법을 수행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, K25의 돌연변이가 일어나면 유비퀴틴화가 되지 않으며 K36 잔기의 돌연변이가 일어나면 수모화가 되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, S33가 인산화되면 K25 유비퀴틴화가 증가되고, K36 수모화가 감소되며, S33가 비인산화되면 K36 수모화가 증가되고 K25 유비퀴틴화가 감소됨을 알 수 있으며, FOXL2 S33 잔기의 인산화에 따른 유비퀴틴화 및 수모화 메커니즘을 도 6에 나타내었다.

실시예 6. 난소과립종양세포(GCT)에서 인산화 정도 확인

FOXL2의 S33 잔기의 인산화에 따른 FOXL2에 의해서 유발되어지는 질병과의 관계를 알아보기 위해서 하기와 같이 실험을 수행하였다.

즉, 실시예 1에 의해 제작된 FOXL2의 돌연변이들을 과발현하고, FOXL2 S33 잔기의 인산화 정도를 실시예 2-1의 웨스턴 블로팅 방법을 사용하여 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 최근 97%의 GCT환자에게서 발견되어진 것으로 보고된 C134W돌연변이를 과발현 할 경우에, S33 잔기 인산화정도가 WT(wild type) 보다 더 인산화되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

추가적으로, FOXL2 C134W 돌연변이와 S33 잔기의 인산화 관계를 알아보기 위해, 실시예 5의 방법과 동일한 방법을 통해 유비퀴틴화 및 수모화 양상을 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, FOXL2 C134W 돌연변이가 유비퀴틴화가 증가하고 수모화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 단, C134W 에 S33A 돌연변이가 있는 샘플에서는 그러한 변화를 확인하지 못하였다.

상기 결과로부터, FOXL2 C134W 돌연변이의 과-인산화는 S33잔기와 직접적으로 관련이 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. FOXL2 S33 인산화 항체 제작 및 정제

7-1. FOXL2 S33 인산화 특이적 펩타이드 합성

FOXL2 S33 특이적 항체를 제작하기 위해, FOXL2 S33 잔기에 인산화가 되어진 펩타이드 서열을 제작하였으며, 상기 펩타이드의 구체적인 제작과정은 도 9에 개략적으로 나타내었다. 한편 정확한 항체 제작을 위한 대조군을 위해서 S33 잔기가 인산화 되지 않은 항체를 제작하여 사용 하였다.

도 9에 따라 맵핑 되어진 FOXL2 S33 잔기 펩타이드는 NH2-PEGPPPS(phospsorylation)PGKG-COOH(서열번호 21)의 아미노산 서열을 가진다.

또한, 보다 정확한 정제를 위해서 도 9에 따라 맵핑 되어진 FOXL2 잔기 펩타이드는 NH2-PEGPPPSPGKG-COOH(서열번호 22)의 아미노산 서열을 가지며 후술할 실시예 7-3의 항체 정제에 사용하였다.

7-2. FOXL2 S33 인산화 특이적 항체 제작

실시예 7-1에서 합성된 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 Rabbit(R1, R2)에 5mg씩 주입(injection) 하여서 항원 항체반응을 유도하여 항체를 제작하였다. 항체 제작 프로토콜에 따라 항체를 제작하고, 각각의 rabbit에서 혈청을 얻어서 각각의 항체의 면역반응을 확인하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, FOXL2 S33 인산화 항체의 면역도가 더 강한 것을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 정확한 항체가 제작됨을 알 수 있었다.

7-3. 항체 정제

실시예 7-2에 의해 제작된 항체는 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)로 특이성이 떨어지기 때문에, 이러한 특이성을 증대시키기 위해서 실시예 7-2에 의해 제조된 항체를 정제하였고, 구체적인 과정은 도 11에 나타내었다. 즉, 제작되어진 Serum에서 Proteinase A 아가로즈 비드를 사용 비특이적 비드결합을 제거하였다. 서열번호 22의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 이용하여 커플링(coupling)하여 proteinase A agarose bead affinity column을 제작한 후, non-phospho peptide Flow Through을 정제하였다. 상기 정제과정을 통해 특이적 FOXL2 특이적 항체만을 선별하여 정제하고, 서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드의 proteinase A agarose bead affinity column을 제작한 후 phospho peptide Flow Through을 정제하였다. 상기 정제과정을 통해 특이적 S33 phospho-FOXL2 특이적 항체만을 선별하여 정제하였다.

실시예 8. 난소과립종양세포(GCT)의 면역조직화학적 분석

분당차병원 및 대구카톨릭의대에서 GCT조직과 다른 난소암 조직을 샘플링 하여 FOXL2 S33 항체로 면역조직염색하여 염색강도를 측정하였다.

보다 구체적으로, 대장 조직을 포르말린으로 고정 후 파라핀에부터 포매된 보관조직을 조직표본으로 5μm 두께의 연속 절편으로 만들고 이들 중 하나의 절편으로 면역조직화학적 염색방법에 이용하였다. 면역조직화학적 염색은 먼저 희석된 항원 결정기 회복용액으로 Coplin 용기를 채운 후 항온조에 위치시키고 뚜껑을 덮은 후 95~99℃ 온도로 미리 가열하여 40분간 조직을 배양하였다. 슬라이드를 꺼내어 실온에서 20분간 식힌 다음 peroxidase-blocking 시약과 완충용액과 함께 5분간 배양 하였다. 세척 후 실시예 7에 의해 제조된 FOXL2 S33 인산화 특이적 항체와 대조군으로 FOXL2 WT 특이적 항체를 30분간 배양하고, 이후 DAKO 염색시약 kit를 이용하여 항체 특이적 면역조직염색법을 실시하였다. 이후 염색조직절편을 올림푸트 CKX41 현미경으로 사진을 촬영하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, C134W돌연변이를 가진 GCT 조직에서 더 강한 염색강도를 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 FOXL2 S33 인산화 특이적 항체 또는 이의 항원결합 단편이 난소과립종양세포에 특이적으로 결합하여 난소과립세포종양을 진단하는 효과가 우수함을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation CATHOLIC UNIVERSITY OF DAEGU INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> PEPTIDE FOR DIAGNOSING GRANULOSA-CELL TUMORS OF THE OVARY AND USES THEREOF <130> PB13-11198 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 primer F1 <400> 1 ctagaattca aatgatggcc agctacccc 29 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 primer R1 <400> 2 ctactcgagt cagagatcga ggcgcgaatg 30 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S33A primer F1 <400> 3 ccggccccag gcaagggcgg tgggggt 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S33A primer R1 <400> 4 acccccaccg cccttgcctg gggccgg 27 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S33D primer F1 <400> 5 ccgccggatc caggcaaggg cggt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S33D primer R1 <400> 6 accgcccttg cctggatccg gcgg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S263A primer F1 <400> 7 caggccatgg cgctgccccc cggc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S263A primer R1 <400> 8 gccggggggc agcgccatgg cctg 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K25R primer F1 <400> 9 ggtcgcacag tcagagagcc agaa 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K25R primer R1 <400> 10 ttctggctct ctgactgtgc gacc 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K36R primer F1 <400> 11 ccaggcagag gcggtggggg tggc 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K36R primer R1 <400> 12 gccaccccca ccgcctctgc ctgg 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K48R primer F1 <400> 13 gccccggaga gaccggaccc g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K48R primer R1 <400> 14 cgggtccggt ctctccgggg c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K54R primer F1 <400> 15 ccggacccgg cgcagagacc c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K54R primer R1 <400> 16 gggtctctgc gccgggtccg g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K87R primer F1 <400> 17 atcatcgcga gattcccgtt c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 K87R primer R1 <400> 18 gaacgggaat ctcgcgatga t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 C134W primer F1 <400> 19 gcctgggaag acatgttcga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 C134W primer R1 <400> 20 atgtcttccc aggccgggtc 20 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S33 phospho peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> PHOSPHORYLATION, <400> 21 Pro Glu Gly Pro Pro Pro Ser Pro Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2 S33 non-phospho peptide <400> 22 Pro Glu Gly Pro Pro Pro Ser Pro Gly Lys Gly 1 5 10

Claims

삭제
서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합하고 서열번호 21의 아미노산에서 인산화된 세린(serine) 잔기를 특이적으로 인식하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립세포종양 질환 진단용 조성물.
제2항에 있어서, 서열번호 21의 아미노산에서 인산화된 세린(serine) 잔기는, 인산화된 FOXL2(forkhead box L2)의 33번째 아미노산인 세린(serine)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합하고 서열번호 21의 아미노산에서 인산화된 세린(serine) 잔기를 특이적으로 인식하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 난소과립세포종양 질환 진단용 키트.
난소과립세포종양 질환의 진단을 위한 정보 제공방법으로서, 상기 방법은
서열번호 21의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합하고 서열번호 21의 아미노산에서 인산화된 세린(serine) 잔기를 특이적으로 인식하는, 항체 또는 이의 항원결합 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.