CN102585010A - 一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法，该免疫微球由抗hbFGF蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小50nm；所述的免疫微球制备的方法，是根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长人bFGF(hbFGF)基因表达序列，将基因序列通过限制酶切割***谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中并进行细菌表达，利用亲合层析柱纯化获得GST-hbFGF融合蛋白，以凝血酶切割该融合蛋白，经亲合层析柱去除凝血酶后获得人bFGF，再将佐剂溶合抗原后免疫小鼠，经分离纯化得到hbFGF多克隆抗体，将抗体通过化学偶联法偶联活化后的微球，得到检测hbFGF的免疫胶乳微球；所述的检测hbFGF的应用，是指通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测hbFGF样品，最低检测限为hbFGF蛋白50pg/ml，相关系数R²＝0.83；该免疫胶乳微球用于检测重组人碱性成纤维细胞生长因子灵敏度较高，且操作简单、重复性强。

Description

一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球，及其该微球的制备方法。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)广泛存在于神经组织、成纤维细胞、巨噬细胞中，作为人体一种广谱有丝***原，具有极强的生物活性：①对来源于中胚层和神经外胚层的各种细胞均有促增殖作用、趋化作用和促细胞迁移运动作用；②能促进剖面毛细血管新生，改善了微循环和组织的营养状况，同时促进成纤维细胞、成肌细胞的增殖，使肉芽迅速生长；③增强源于中胚层的免疫细胞的活性，提高剖面的抗感染能力。研究表明，bFGF在体内参与多种组织的创伤修复过程，是体内重要的创伤愈合因子之一。创伤后bFGF的含量高低能直接反映创面修复中的血管生成水平，为检测和监测创伤修复和组织愈合情况等提供依据。

在临床上，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可用于治疗颅脑、脊髓、周围神经损伤，中毒，感染，脑出血，脑梗塞，脑萎缩，脑发育不良，角膜溃疡，神经性耳聋，面瘫，粘膜、皮肤损伤，烧伤，慢性溃疡，软组织损伤，内脏损害，骨折，一些内分泌疾病，断肢再植和各种手术后的伤口愈合等。bFGF可以促进损伤愈合，大大缩短病程，改善预后，但迄今对于损伤创面中原发bFGF含量的检测方法不多，且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前，有关bFGF免疫检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少，迫切需要开发高效、准确、快速的新型免疫检测技术和产品。

发明内容

本发明的目的在于：进一步填补bFGF免疫检测技术的研发空白，从而提供一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明的一种用于检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球，其特征在于，该免疫微球由抗hbFGF蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小50nm，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组人碱性成纤维细胞生长因子50pg/ml，相关系数R²＝0.83，如图1所示。

本发明的一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：

(1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长人bFGF(hbFGF)基因表达序列；

(2)将人bFGF基因片段通过限制酶切割***谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；

(3)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-hbFGF融合蛋白；

(4)利用凝血酶在柱切割GST-hbFGF融合蛋白，洗脱物经亲合层析柱去除凝血酶后，获得人bFGF；

(5)将佐剂溶合抗原(GST-hbFGF融合蛋白)后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗hbFGF多克隆抗体；

(6)将鼠抗hbFGF多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组hbFGF蛋白的免疫胶乳微球。

所述步骤2中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体是pGEX-4T-3，构建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-3-hbFGF。

所述步骤3中的亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B。

所述步骤4中的亲合层析柱为Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow。

所述步骤6中的微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面载基团为羧基。该微球的活化是首先用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化微球，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之用。

本发明的优点在于：本发明的一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球及其制备方法，采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用化学偶联方法偶联抗hbFGF多克隆抗体获得，取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均匀，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组人碱性成纤维细胞生长因子50pg/ml，相关系数R²＝0.83。

本发明的目的、特征及优点将通过优选的实施例结合附图加以说明。

图面说明

图1是羧基化聚苯乙烯微球扫描电镜照片

图2是hbFGF基因原序列

图3是以E.coli为表达宿主优化后的hbFGF基因序列

图4是菌落PCR验证hbFGF基因***片段电泳

图5是质粒Xba I酶切电泳

图6是hbFGF表达载体测序

图7是hbFGF蛋白SDS-PAGE(A)和Western Blotting(B)检测

图8是抗血清效价测定图

图9是Bio-Rad

酶标仪实物图

图10是ELISA法检测hbFGF实物图

图11是ELISA法检测hbFGF蛋白结果

具体实施方式

实施例1

用本发明所述的制备方法构建全长hbFGF基因表达序列，制备的具体步骤如下：

1、设计全长hbFGF基因序列，结果如图2所示；

2、根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰，采用全基因合成技术构建全长hbFGF基因，共339对碱基，克隆至载体pGEM-T Easy，结果如图3所示；

3、通过菌落PCR验证hbFGF基因片断***的正确性，结果如图4所示；

4、将克隆hbFGF基因菌实施扩增培养，提取质粒后进行酶切和琼脂糖电泳分析，结果如图5所示；

5、DNA测序，保证基因的全部序列100％准确，结果如图6所示；

实施例2

用本发明所述的制备方法表达和纯化提取hbFGF蛋白，具体的操作步骤如下：

1、将hbFGF基因片段通过限制酶切割***pGEX-4T-3载体中，构建细菌融合表达载体pGEX-4T-3-hbFGF；

2、将融合表达载体pGEX-4T-3-hbFGF转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，细胞生长条件为200转/分，温度37℃；

3、当菌体生长OD₅₉₅值为0.5-0.8时，加入1.0mM的诱导剂IPTG，在25℃诱导2-3小时。在4℃时，以5,000×g离心5分钟，收集菌体；

4、菌体经PBS缓冲液清洗3次后，超声破碎。破碎细胞在4℃时，以15,000×g离心1小时，收集上清；

5、将上清循环通过Glutathione Sepharose 4B亲合层析柱，4℃过夜。未结合蛋白用10倍床体积的1×PBS冲洗；

6、将结合的GST-hbFGF融合蛋白用凝血酶在柱切割并用洗脱液洗脱，收集洗脱物；

7、将上述洗脱物通过Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow亲合层析柱吸附凝血酶，经洗脱后获得hbFGF。

对表达和纯化提取的hbFGF蛋白做SDS-PAGE和Western Blotting分析，结果如图7所示。

实施例3

用本发明所述的制备方法制备抗hbFGF多克隆抗体，具体的制备步骤如下：

1、将hbFGF融合蛋白抗原与弗氏佐剂混合后，充分乳化。采用背部多点注射法免疫BALB/c小鼠。每次免疫的抗原量约10μg，免疫三次。每次免疫两周后经尾动脉取血检测抗体效价。

2、以适宜浓度的抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；

3、洗涤后，加入待检的血清样品，100μl/孔，37℃1小时；设阴性对照孔；

4、洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体试剂，100μl/孔，37℃避光显色20分钟；用2.5M H₂SO₄终止反应后，阅读各孔的A490值。

对制备的hbFGF抗体，经ELISA法检测，抗体能与hbFGF特异性结合，其相关系数达到显著水平，效价＞1∶6000，结果如图8所示。

实施例4

hbFGF抗体制备完成后，通过化学偶联单分散羧基化聚苯乙烯微球，制备用于检测hbFGF蛋白的免疫胶乳微球，具体的制备和检测步骤如下：

1、将单分散羧基化聚苯乙烯微球用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体；

2、加入抗hbFGF多克隆抗体，温育1-2小时；

3、洗涤后，收集免疫微球；

4、通过Bio-Rad

酶标仪(如图9所示)，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测hbFGF样品(如图10所示)。

经ELISA方法验证，用于检测hbFGF的免疫胶乳微球最低检测限为重组人碱性成纤维细胞生长因子50pg/ml，相关系数R²＝0.83，结果如图11所示。由此可见，本发明所制备的用于检测hbFGF的免疫胶乳微球检测灵敏度较高，且操作简单、重复性强，显示了良好的应用前景。

Claims (6)

1.一种检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球，其特征在于，该免疫微球由抗hbFGF蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小50nm，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组人碱性成纤维细胞生长因子50pg/ml，相关系数R²＝0.83。

2.一种权利要求1所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：

(1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长人bFGF(hbFGF)基因表达序列；

(2)将人bFGF基因片段通过限制酶切割***谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；

(3)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-hbFGF融合蛋白；

(4)利用凝血酶切割GST-hbFGF融合蛋白，洗脱物经亲合层析柱去除凝血酶后，获得人bFGF；

(5)将佐剂溶合抗原(GST-hbFGF融合蛋白)后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗hbFGF多克隆抗体；

(6)将鼠抗hbFGF多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组hbFGF蛋白的免疫胶乳微球。

3.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤2中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体是pGEX-4T-3，构建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-3-hbFGF。

4.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤3中的亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B。

5.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤4中的亲合层析柱为Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow。

6.按权利要求2所述的检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的免疫胶乳微球的制备方法，其特征还在于，所述步骤6中的微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面载基团为羧基。该微球的活化是首先用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化微球，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之用。

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