KR100903755B1 - 신경 선조세포 집단 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신경 선조세포, 분화된 뉴런, 신경교세포, 및 성상교세포 집단을 제공한다. 분화를 개시하고, 신경 선조세포 집단을 확립하는 성장 조건의 칵테일에서 줄기 세포 집단 (예를 들면, 배아 줄기 세포)을 배양함으로써 집단을 수득한다. 선조세포를 도파민성 뉴런을 포함한 다양한 상이한 신경 표현형으로 배양물에서 더욱 분화시킬 수 있다. 분화된 세포 집단 또는 신경 전구세포를 약물 스크리닝 및 신경 질환의 치료에 이용하기 위해 대량으로 생성할 수 있다.

Description

신경 선조세포 집단 {NEURAL PROGENITOR CELL POPULATIONS}
본 발명은 일반적으로 배아 세포 및 신경 선조세포의 세포 생물학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 특별한 배양 조건 및 선발 기술을 사용하여, 뉴런 및 신경교 계통의 세포를 형성하기 위한 인간 만능 (pluripotent) 줄기 세포의 방향성 분화에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 참고
본 출원은 미국 가특허출원 60/205,600 (2000.05.17 출원) 및 60/257,608 (2000.12.22 출원)에 대한 우선권을 주장한다. 미국에서 수행할 목적으로, 우선권 출원은 전체로 본원에 참고로 포함된다.
중추 신경계를 치유하는 것은 의학이 여전히 극복해야 할 미개척 분야 중의 하나이다. 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 헌팅톤 무도병(Huntington's disease) 및 발작과 같은 상태는 고통받는 사람들에게 파괴적인 결과를 가질 수 있다. 머리 또는 척수에 대한 외상은 매일의 생활의 경계에서 어떤 사람을 순간적으로 불구의 신분으로 이끌 수 있다.
신경계 질환을 그렇게 다루기 어렵게 하는 것은 종종 지속되는 손상의 비가역성이다. 상기 상태에 대한 주요한 희망은 신경망을 재구성하고, 신경계의 기 능을 정렬된 상태로 되돌릴 수 있는 세포 집단을 개발하는 것이다.
이러한 이유로, 신경 선조세포에 관심이 증대되고 있다. 현재까지, 만능 신경 선조세포가 신경 제한 세포 또는 신경교 제한 세포에 대한 분화 경로의 초기에 관계된다고 일반적으로 생각되었다. 이것은 차례로 성숙 뉴런, 또는 성숙 성상교세포 및 희돌기교세포를 야기한다고 생각되었다. 신경릉의 만능 신경 선조세포는 또한 뉴런, 평활근 및 슈반세포로 분화한다. 다양한 계통-제한 전구세포는 스스로 재생하고, 중추신경계, 예를 들면, 척수의 선택된 자리에 위치한다고 가정한다. 발생하는 신경관의 세포계통이 Kalyani 등 (Biochem. Cell Biol. 6:1051, 1998)의 연구 문헌에서 검토되었다.
가상적인 만능 신경상피세포 (NEP 세포)를, 발생하는 척수에서 확인하였다. Kalyani 등 (Dev. Biol. 186:202, 1997)은 래트에서 NEP 세포를 보고하였다. Mujtaba 등 (Dev. Biol. 214:113, 1999)은 마우스에서 NEP 세포를 보고하였다. NEP 세포의 분화는 특징적인 표면 마커를 갖는 제한 전구세포의 형성을 초래한다고 생각된다.
가상적인 신경 제한 전구세포 (NRP)는 Mayer-Proschel 등 (Neuron 39:773, 1997)이 규명하였다. 상기 세포는 신경 세포 부착 분자의 폴리시알화된 이성체인 세포 표면 PS-NCAM을 발현한다. 이들은 보고에 의하면 다양한 뉴런 형태를 생성하는 능력을 가지나, 신경교세포를 형성하지는 않는다.
가상적인 신경교 제한 전구세포 (GRP)는 Rao 등 (Dev. Biol. 188: 48, 1997)에 의해 확인되었다. 상기 세포는 신경교세포를 형성하는 능력을 명백히 나타 내나 뉴련을 형성하지는 않는다.
Ling 등 (Exp. Neurol. 149:411, 1998)은 래트 태아 중뇌의 배아 부위로부터 선조세포를 분리하였다. 세포를 EGF에서 키우고, 폴리-라이신 코팅된 플레이트상에서 도말하고, 그 위에서 이들은 배양 배지내에 IL-l, lL-11, LIF, 및 GDNF를 함유함으로써 증진되는, 티로신 히드록실라아제 양성 (도파민성) 세포와 함께 뉴런 및 신경교를 형성하였다.
Wagner 등 (Nature Biotechnol. 17:653, 1999)은 불사화 만능 신경 줄기 세포주로부터 유래된 배쪽 중뇌 도파민성 표현형을 가진 세포를 보고하였다. 세포를 Nurr1 발현 벡터로써 트랜스펙션한 후, VM 1형 성상교세포와 함께 배양하였다. 수득된 세포의 80% 이상은 내재하는 도파민성 뉴런을 닮은 표현형을 가지도록 요구되었다.
Mujtaba 등 (이하 동일)은 마우스 배아 줄기 (mES) 세포로부터 NRP 및 GRP 세포의 분리를 보고하였다. NRP는 PS-NCAM 면역반응성이었고, 단순 배지에서 자가 재생을 하였고, 복수 뉴런 표현형으로 분화하였다. 이들은 명백히 신경교세포를 형성하지 않았다. GRP는 A2B5-면역반응성이었고, 보고에 의하면 성상교세포 및 희돌기세포로 분화하였으나, 뉴런으로 분화하지는 않았다.
최근의 많은 발견으로 배아 세포가 인간 치료에 유용한 세포 및 조직의 만능 공급원이 될 수 있다는 기대를 증가시켰다. 만능 세포는 본질적으로 체내에서 모든 유형의 세포로 분화하는 능력을 가지고 있다고 믿어진다 (R.A. Pedersen, Scientif. Am. 280(4):68, 1999). 배아 줄기세포에 관한 초기의 연구는 모델로 서 내교배 마우스 계통을 사용하여 행하였다 (Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997; 및 Pedersen, Reprod. Fertil. Dev. 6:543, 1994 에서 검토함).
마우스 ES 세포와 비교하여, 원숭이 및 인간 만능 세포는 훨씬 더 연약하고, 동일한 배양 조건에 대해 반응하지 않는다. 단지 최근에 영장류 배아 세포를 생체외에서 배양하는 발견이 이루어졌다.
Thomson 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995)은 모델로서 붉은털원숭이 및 어른 영장류를 이용하여, 영장류로부터 배아 줄기세포를 성공적으로 처음으로 배양하였다. 이어서 이들은 인간 포배로부터 인간 배아 줄기 (hES) 세포주를 유도하였다 (Science 282:114, 1998). Gearhart 및 동료는 태아 생식 조직으로부터 인간 배아 생식 (hEG) 세포주를 유도하였다 (Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). hES 및 hEG 세포 양자는 인간 만능 줄기 (hPS) 세포의 장기간 추구한 특징을 가진다: 이들은 분화없이 시험관 내에서 계속적으로 증식할 수 있고, 정상적인 핵형을 보유하고, 분화하여 모든 성인 세포형을 생산하는 능력을 보유한다.
Reubinoff 등 (Nature Biotechnol. 18:399, 2000)은 인간 포배의 체세포 분화를 보고하였다. 세포는 구조적 조직의 일관된 패턴없이 배양에서 자발적으로 분화하였다. 4-7 주 동안 고 밀도로 배양 후에, 다세포 집합체는 단층면을 초과하여 형성하였다. 배양물내의 상이한 세포는 β-액틴, 데스민 및 NCAM의 발현을 포함한 수많은 상이한 표현형을 발현하였다.
배양물 또는 기형종 내의 만능 줄기세포의 자발적인 분화는 매우 이종의 표 현형 혼합물의 세포 집단을 생성하며, 상이한 세포 계통의 스펙트럼을 나타낸다. 대부분의 치료용 목적으로, 분화 세포가 이들이 발현하는 표현형 및 이들이 생성하는 자손형의 면에서, 비교적 균일한 것이 바람직하다.
따라서, 인간 유래의 만능 세포로부터 더욱 동종의 분화 세포 집단을 생성하는 기술이 절실히 요구되고 있다.
개요
본 발명은 만능 세포로부터 뉴런 또는 신경교 계통 세포로 분화한 영장류 세포의 효율적인 생산 시스템을 제공한다. 중추 신경계 (뉴런, 성상교세포 또는 희돌기세포)의 부가적인 전구세포, 성숙 세포을 생성하는 공급원을 제공하는, 각 계통의 전구체를 함유하는 세포 집단이 기재된다. 본 발명의 특정 구현예는 양 계통의 세포를 생성하는 능력을 가진다. 본 발명의 전구 세포 및 성숙 세포는 신경계 기능을 회복하기 위해 약물 테스트 및 치료를 포함한, 수많은 중요한 적용에 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예는 시험관 내 배양에서 증식하고, 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포를 분화시킴으로써 수득되는 세포 집단으로서, 여기에서 집단내의 세포의 약 30% 이상은 뉴런 세포, 신경교세포 또는 양자를 형성하도록 한다. 두번째 구현예는 시험관 내 배양에서 증식하고, 약 60% 이상의 신경 선조세포를 함유하는 세포 집단으로서, 여기에서 세포의 약 10% 이상이 뉴런 세포로 분화할 수 있고, 세포의 약 10% 이상이 신경교세포로 분화할 수 있다. 세번째 구현예는 시험관 내 배양에서 증식하고, 약 60% 이상의 신경 선조세포를 함유하는 세포 집단으로서, 여기에서 세포의 약 10% 이상은 A2B5를 발현하고, 세포의 약 10% 이상은 NCAM을 발현한다.
본 발명의 특정 세포 집단은 영장류 만능 줄기세포, 예를 들면, 인간 배아 줄기세포를 분화함으로써 수득된다. 일부는 성장 인자 수용체에 결합하는 두 개 이상의 리간드를 함유하는 배지에서 줄기세포를 분화함으로써 수득된다. 일부는 성장 인자를 함유한 배지에서 pPS 세포를 분화하고, NCAM 또는 A2B5 의 발현을 위해 분화 세포를 분류한 후, 분류된 세포를 수합함으로써 수득된다. 특정 세포 집단은 세포의 70% 이상이 NCAM 또는 A2B5를 발현하도록 농축된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 성숙 뉴런, 성상교세포, 희돌기세포, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하고, 본 발명의 전구세포 집단을 추가로 분화함으로써 수득되는 세포 집단이다. 일부 그러한 집단은 신경 전구세포를 cAMP 활성자, 신경영양인자, 또는 그러한 인자의 조합을 포함한 배지내의 신경 전구세포를 배양함으로써 수득된다. 하기에 기재된 바와 같이, 그러한 방법에 의해 생산된 뉴런은 활동 전위를 나타낼 수 있고, 동기(gated) 나트륨 및 칼륨 통로를 보여줄 수 있고, 신경전달물질 또는 이들의 동등물로써 투여될 경우에 칼슘 유동을 보여줄 수 있다. 예를 들면, 티로신 히드록실라아제에 대한 염색으로 검출가능한 도파민성 뉴런의 실질적인 비율을 포함한 세포의 집단이 포함된다.
또한 하나의 세포 집단으로부터 원하는 표현형에 대한 세포를 선발함으로써 수득되는, 분리된 신경 전구세포, 뉴런, 성상교세포 및 희돌기세포가 본 발명에서 구현된다.
pPS 세포의 확립된 세포주로부터 유도할 경우에, 본 발명의 세포 집단 및 분리된 세포는 전형적으로 이들이 유래된 세포주와 동일한 게놈을 가질 것이다. 이것은 염색체 DNA가 pPS 세포와 신경세포 사이에 90% 이상 동일하다는 것을 의미하는데, 이는 신경세포가 정상적인 유사 분열의 과정을 통해 미분화 세포주로부터 수득된다면 추론될 수 있다. 트랜스진 (예를 들면, TERT)을 도입하거나 내재 유전자를 결손하기 위해 재조합 방법으로 처리된 신경세포는 모든 조작되지 않은 유전 원소가 보존되기 때문에, 여전히 이들이 유래된 세포주와 동일한 게놈을 가지는 것으로 생각된다.
본 발명의 추가의 구현예는 신경세포 독성 또는 조절용 화합물을 스크리닝하는 방법인데, 여기에서 상기 화합물 및 본 발명의 신경세포 또는 세포 집단을 함유하는 배양물이 제조되고, 상기 화합물과 접촉함으로 인해 발생하는 세포의 임의의 표현형 또는 대사과정의 변화가 측정된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 상기 명세서에서 기재되고 예시된 바와 같이, 신경 선조세포 또는 분화 세포에서 더욱 잘 발현되는 mRNA에 포함된 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 방법이다. 핵산 서열은 차례로 신경세포에서 농축되거나 억제된 유전자 산물에 대한 재조합 또는 합성 폴리뉴클레오티드, 단백질 및 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 신경세포에서 농축되거나 억제된 마커를 확인하기 위해 면역원 또는 흡착제로서 본 발명의 세포를 사용함으로써 항체를 또한 수득할 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예는 개인의 중추 신경계 (CNS) 기능을 재구성 또는 보충하는 방법인데, 여기에서 개인은 본 발명의 분리된 세포 또는 세포 집단으로써 투여된다. 분리된 세포 및 세포 집단은 임상 및 가축 치료용 약물 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 세포를 함유하는 약물은 그러한 치료용으로 사용하기 위해 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 적당한 줄기세포 집단에 관한 상기 명세서에서 요약된 기술을 사용하여, 본 발명의 신경 전구세포 및 충분히 분화된 세포를 수득하는 방법이다. 영장류 배아 줄기세포로부터 1%, 3% 또는 5%의 빈도로 도파민성 세포를 함유하는 세포 집단 및 상기 빈도로 도파민성 세포를 생성할 수 있는 선조세포의 집단을 생산하는 방법이 포함된다. 이것은 파킨슨병에서 발생하는 도파민 뉴런 기능의 손실의 면에서 특히 중요하다. 상기 명세서에서 기재된 조성물, 방법 및 기술은 진단, 약물 스크리닝, 및 치료용 적용에 사용하기에 상당한 전망을 가진다.
본 발명의 상기 및 다른 구현예는 하기의 기재로부터 명백할 것이다.
도 1은 인간 배아 줄기세포로부터 유래된 신경 마커를 갖는 세포의 성장을 나타내는 그래프이다. 상단 패널은 CNTF, bFGF, 및 NT3의 존재하에 유지된 후, NCAM의 발현을 위해 분류된 세포의 성장을 보여준다. 하단 패널은 EGF, bFGF, PDGF, 및 IGF-1의 존재하에 유지된 후, A2B5의 발현을 위해 분류된 세포의 성장을 보여준다. 4종류의 상이한 hES 세포주를 사용하였다: H1, H7, H9, 및 H13. A2B5 선발된 집단을 7회 계대하였고, 추가로 뉴런 및 신경교세포로 분화될 수 있다.
도 2는 A2B5 양성 세포를 수득하는 전형적인 절차를 요약하는 모식도이다. 사용된 약어: MEF-CM = 마우스 배아 섬유아세포를 이용하여 배양함으로써 조절된 배지; +/- SHH = 음향 고슴도치의 존재 또는 부존재; D/F12 = DMEM/F12 배지; N2 및 B27, 배양 보충물 (Gibco); EPFI = 분화 물질 EGF, PDGF, bFGF, 및 IGF-1; PLL = 폴리-L 라이신 기질; PLL/FN = 폴리-L 라이신 및 피브로넥틴의 기질.
도 3은 녹색 형광 단백질을 발현하는 세포로써 투여된 신생아 래트의 뇌의 형광 현미경사진의 중간톤 재현이다. 왼쪽 패널: 부모 hES 세포주. 중간 패널: 부모 세포주로부터 형성된 배상체 세포. 오른쪽 패널: NCAM의 발현을 위해 분류된 분화 세포. 미분화 hES 세포 및 배상체 세포는 투여 부위에 남아 있고, 괴사의 증거를 보여준다. 대조적으로, 분화 NCAM+ 세포는 단세포로서 나타나고, 주입 위치로부터 멀리 이동하였다.
도 4는 도파민성 세포의 마커인 티로신 히드록실라아제 (TH)의 세포 염색을 보여주는 형광 현미경사진의 사진복사 재현이다. 인간 ES 세포로부터 제조된 배상체를 4일 동안 10㎛ 레틴산 중에 유지하고, 신경 지지의 칵테일에 도말한 후, 10ng/ml NT-3 및 10ng/ml BDNF를 함유한 배지로 계대하였다. 본 발명의 특정 집단은 TH-양성 세포의 1% 이상을 함유한다.
도 5는 다양한 신경전달물질에 대한 신경-제한 전구세포의 반응을 보여주는 일련의 그래프이다. 패널 A는 두 개의 상이한 덮개 유리상의 단세포의 방출 데 이타의 비율을 보여준다. 양 세포는 GABA, 증가된 칼륨, 아세틸콜린 및 ATP에 반응하였다. 패널 B는 특정 신경전달물질에 반응하는 시험한 세포의 빈도를 보여준다. 패널 C는 관찰된 신경전달물질의 조합을 보여준다.
도 6은 신경-제한 전구세포의 전기생리를 보여주는 일련의 그래프이다. 패널 A는 -100mV의 휴지 전위에서 -80 및 80mV의 시험 전위로 탈분극된 두 개의 세포에서 관찰된 나트륨 및 칼륨 전류를 보여준다. 패널 B는 관찰된 내부 (Na+) 및 외부 (K) 피크 전류-전압 관계를 보여준다. 패널 C는 탈분극 자극에 반응하는 동일한 세포수 n에 의해 생성된 활동 전위를 보여준다. 이 측정은 인간 ES 세포로부터 유래된 신경 전구세포가 신경전달에 특징인 활동 전위를 생성할 수 있다는 것을 보여준다.
본 발명은 치료용 투여 및 약물 스크리닝에 대해 사용하기에 적합한 신경 선조세포를 제조하고 규명하는 시스템을 제공한다.
만능 줄기세포를 선택된 분화 물질의 존재하에 배양할 경우에, 신경세포의 표현형 특성을 갖는 세포의 현저하게 높은 비율을 가진 세포 집단이 유래된다는 것을 발견하였다. 선택적으로, 신경세포의 비율은 분화 세포를 세포-표면 마커에 따라 분류함으로써 증진될 수 있다. 만능 줄기 세포 (예를 들면, 배아 줄기세포)의 특정 유형이 배양물 중에서 1 년 이상 증식할 수 있으므로, 상기 명세서에 기재된 발명은 신경 전구세포의 거의 무제한의 공급을 제공한다. 본 발명의 특정 세포 집단은 뉴런 또는 신경교세포 계통의 세포를 생성할 수 있으므로, 배양물 중에서 수많은 계대를 통해 복제할 수 있다.
도 1은 분화 물질을 이용하여 배양한 후, 이들이 폴리시일화 NCAM, 또는 A2B5 항원결정부를 가지는 가에 따라 선발된 세포의 성장 곡선을 보여준다. 상기 세포 집단의 각각은 수많은 세포 배가를 통해 증식될 수 있다.
A2B5 발현에 대해 양성으로 선발된 분화 세포는 NCAM 없이 A2B5를 발현하는 것으로 보이는 세포, 및 A2B5 및 NCAM을 동시에 발현하는 세포를 함유한다. 하기에 기재된 하나의 실험에서, 상기 세포의 성숙은 13% 희돌기세포 및 38% 뉴런을 생산하였다. 상기 세포는 이들의 표현형을 잃지 않고 장기간 배양에서 증식하기 때문에, 집단은 다능 세포의 비축을 제공할 수 있다. CNS 기능장애를 갖는 대상에 투여시, 집단은 필요한 대로, 뉴런 및 신경교세포 계통 양자를 재집단화할 수 있는 세포를 함유할 수 있다.
원한다면, 성숙 인자, 예를 들면, 신경영양 인자와 함께 배양함으로써, 또는 전구세포 재생을 지속하는 하나 이상의 인자를 제거함으로써 신경 전구세포는 생체외에서 추가로 분화될 수 있다. 뉴런, 성상교세포, 및 희돌기세포는 상기 방식으로 전구세포를 배양함으로써 수득될 수 있는 신경 계통의 성숙한 분화 세포이다. 상기 방법에 의해 수득된 뉴런은 상기 세포 유형에 특징적인 과정을 연장하였고, 신경미세섬유 및 MAP-2와 같은 신경-특이적 마커에 대한 염색을 보여주고, 신경접합단백(synaptophysin)에 대한 염색에 의해 검출된, 시냅스 형성에 대한 증거를 보여준다. 도 5는 상기 세포가 다양한 신경전달물질에 반응한다는 것을 보여준 다. 도 6은 상기 세포가 표준 패치-클램프(patch-clamp) 시스템에서 측정된 활동 전위를 생성할 수 있다는 것을 보여준다. 상기의 모든 면에서, 세포는 명백히 충분한 신경 기능을 할 수 있다.
특히 흥미 있는 것은 도파민성 뉴런을 공급하는 상기 시스템의 능력이다 (도 4). 상기 유형의 세포는 파킨슨병의 치료에 특히 바람직한데, 이에 대해 가장 최근의 양식은 태아 뇌 조직의 동종이계(同種異系)이식이다. 임상적인 치료로서 태아 조직의 사용은 공급 및 절차적인 문제를 수반하나, 이전에 기재된 다른 공급원은 충분히 풍부하게 올바른 종류의 세포를 공급할 수 없다. 본 발명의 신경 전구세포는 뉴런의 수 %가 도파민성 표현형을 가지는 분화 세포를 생성할 수 있다. 이것은 파킨슨병에서 세포 대체 요법에 대한 충분한 비율일 것으로 생각되며, 치료용으로 본 발명의 전구 집단의 개발을 보증한다.
본 발명의 만능 줄기 세포 및 계통-제한 전구세포의 일부는 배양에서 폭넓게 증식하므로, 상기 명세서에 기재된 시스템은 연구, 약제 개발 및 CNS 이상의 치료적 관리에서의 사용을 위한 뉴런 및 신경교세포의 무제한 공급을 제공한다. 본 발명의 세포의 제조 및 이용은 추가로 하기 기재에서 설명할 것이다.
정의
상기 명세서의 목적을 위해, 용어 "신경 선조세포" 또는 "신경 전구세포"는 뉴런 세포 (예를 들면, 뉴런 전구세포 또는 성숙 뉴런) 또는 신경교세포 (예를 들면, 신경교 전구세포, 성숙 성상교세포, 또는 성숙 희돌기세포)인 자손을 생성할 수 있는 세포를 의미한다. 전형적으로, 세포는 신경 계통에 특징적인 표현형 마커의 일부를 발현한다. 전형적으로, 이들은 특정 방식으로 탈분화 또는 재프로그래밍되지 않는다면, 이들 스스로 시험관 내에서 배양할 경우에 다른 배아 생식 층의 자손을 생산하지 않는다.
"뉴런 선조세포" 또는 "뉴런 전구세포"는 성숙 뉴런인 자손을 생성할 수 있는 세포이다. 상기 세포는 신경교세포를 생성하는 능력을 가지거나 가지지 않을 수 있다.
"신경교 선조세포" 또는 "신경교 전구세포"는 성숙 성상교세포 또는 성숙 희돌기세포인 자손을 생성할 수 있는 세포이다. 상기 세포는 뉴런 세포를 생성하는 능력을 가지거나 가지지 않을 수 있다.
"다능 신경 선조세포 집단"은 뉴런 세포 (예를 들면, 뉴런 전구세포 또는 성숙 뉴런)인 자손, 및 신경교세포 (예를 들면, 신경교 전구세포, 성숙 성상교세포, 또는 성숙 희돌기세포)인 자손, 및 종종 다른 유형의 세포를 생성하는 능력을 가지는 세포 집단이다. 상기 용어는 다능 신경 선조세포인 개개 세포가 존재할 수 있지만, 집단 내의 개개 세포가 자손의 양자 유형을 형성하는 능력을 가질 것을 요구하지 않는다.
세포 개체발생의 내용에서, 형용사 "분화된"은 상대적인 용어이다. "분화 세포"는 비교되는 세포보다 발생학적 경로를 따라 아래로 더욱 진전된 세포이다. 그리하여, 만능 배아 줄기 세포는 계통-제한 전구세포, 예를 들면, 혈구형에 대해 만능인 조혈세포; 간세포에 대해 만능인 간세포 선조세포; 및 상기에 열거된 다양한 유형의 신경 선조세포로 분화할 수 있다. 이것은 차례로 경로를 따 라 아래로 추가로 다른 유형의 전구세포, 또는 특정 조직 유형에서 특징적인 역할을 하는 최종 단계 분화 세포로 분화할 수 있고, 추가로 증식하는 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 뉴런, 성상교세포, 및 희돌기세포는 모두 말단 분화된 세포의 예이다.
본 명세서에서 사용된 "분화 물질"은 신경 계통 (전구세포 및 말단 분화된 세포를 포함)의 분화 세포를 생산하기 위해 본 발명의 배양 시스템에 사용된 화합물의 하나의 집합을 말한다. 화합물의 작용 방식에 관하여 제한할 의도는 아니다. 예를 들면, 물질은 표현형의 변화를 유도하거나 돕고, 특정 표현형을 가진 세포의 성장을 촉진시키거나 다른 것의 성장을 지연시키거나, 미지의 기작을 통해 다른 물질과 함께 작용함으로써 분화 과정을 도울 수 있다.
명백히 다르게 지정되지 않는다면, 본 발명의 기술은 뉴런 또는 신경교세포로 분화할 수 있는 임의의 유형의 선조세포에 대한 제한 없이 보유할 수 있다.
원형 "영장류 만능 줄기 세포" (pPS 세포) 는 수정 후 임의 시점에서 전배아, 배아 또는 태아 조직으로부터 유래된 만능 세포이며, 적합한 조건 하에서 표준 기술로 허용되는 시험에 따라, 8-12 주의 SCID 마우스 중에 기형종을 형성할 수 있는 능력과 같이, 3 가지 배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 유도체인 몇몇 상이한 세포 유형의 자손을 생산할 수 있는 특징을 갖는다.
pPS 세포의 정의에는, [Thomson 등, Science 282:1145, 1998] 에 기재된 바와 같은 인간 배아 줄기 (hES) 세포; 붉은털원숭이 줄기 세포 [Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995], 어른 영장류 줄기 세포 [Thomson 등, Biol. Reprod. 55:254, 1996] 및 인간 배아 생식 (hEG) 세포 [Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998] 과 같은 다른 영장류의 배아 줄기 세포가 포함된다. 기타 유형의 만능 세포도 또한 용어에 포함된다. 이들이 배아 조직, 태아 조직 또는 기타 공급원으로부터 유래되었는지 여부와 무관하게, 모든 3 가지 배엽의 유도체인 자손을 생성할 수 있는 영장류 기원의 임의의 세포가 포함된다. pPS 세포는 악성 공급원으로부터는 유래되지 않는다. 세포의 핵형이 정상인 것이 바람직하지만 항상 필요하지는 않다.
pPS 세포 배양물은 집단내의 줄기 세포 및 이들의 유도체의 실질적인 비율이 배아 또는 성인 기원의 분화된 세포로부터 이들을 뚜렷이 구별짓는 미분화 세포의 형태적 특성을 나타내는 경우 "미분화된" 것으로 기재된다. 미분화 pPS 세포는 당업자에게 용이하게 인식되고, 전형적으로 높은 핵/세포질 비, 뚜렷한 인 (nucleoli)을 갖는 세포 콜로니의 현미경 사진의 2차원에 나타난다. 집단내의 미분화 세포의 콜로니는 종종 분화된 주변 세포에 의해 둘러싸일 수 있다고 생각된다.
"기저층 세포(feeder cell)" 또는 "기저층(feeder)"은 제 2 형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하기 위해, 또 다른 유형의 세포와 공동 배양되는 한 유형의 세포를 설명하는데 사용되는 용어이다. 예를 들면, 특정 유형의 pPS 세포는 일차 마우스 배아 섬유아세포, 불사화 마우스 배아 섬유아세포, 또는 hES 세포부터 분화한 인간 섬유아세포 유사 세포에 의해 지지될 수 있다. pPS의 성장을 유지하기 위해 신선한 기저층 세포를 첨가하지 않고 분열된 후에 1회 이상을 통해 성장했다면 pPS 세포 집단은 기저층 세포가 "본질적으로 없는" 것으로 불린다.
용어 "배상체 (embryoid body)"는 "집합체"와 유사한 용어이다. 용어는 pPS 세포가 단층 배양에서 과도하게 자랄 경우 나타나거나, 현탁 배양에서 유지되는 분화 및 미분화 세포의 집합체를 말한다. 배상체는 상이한 세포형, 전형적으로 상이한 생식 층의 혼합물이며, 형태적인 기준 및 면역세포화학법에 의해 검출가능한 세포 마커에 의해 구별가능하다.
"성장 환경" 이란 해당 세포가 시험관 내에서 증식, 분화, 또는 성숙할 환경이다. 환경의 특색에는 세포가 배양되는 배지, 존재가능한 임의의 성장 인자 또는 분화-유도 인자, 및 존재한다면, 지지 구조 (예를 들면, 고체 표면 상의 기질) 가 포함된다.
세포는 폴리뉴클레오티드가 인공적인 조작의 임의의 적당한 수단에 의해 세포내로 전달될 경우에, 또는 세포가 폴리뉴클레오티드를 물려받은 원래 변형된 세포의 자손인 경우에, "유전적으로 변형된", "트랜스펙션된", 또는 "유전적으로 형질전환된"으로 일컬어진다. 폴리뉴클레오티드는 종종 해당 단백질을 코딩하는 전사가능한 서열을 함유하는데, 이는 세포로 하여금 증가된 수준에서 단백질을 발현하게 한다. 유전적인 변형은 변형된 세포의 자손이 동일한 변형을 가진다면, "유전성"이라 일컬어진다.
본 명세서에서 사용되는 "항체" 라는 용어는 다클론성 및 단클론성 항체를 둘 다 말한다. 용어의 범위에는 온전한 면역글로불린 분자 뿐만 아니라, 당분야에 공지된 기술로 제조될 수 있고, 원하는 항체 결합 특이성을 보유하는 면역글 로불린 분자의 단편 및 유도체 (예를 들면, 단일쇄 Fv 구축물, 디아바디 (diabody) 및 융합 구축물)도 신중히 포함된다.
일반 기술
본 발명의 실시예 유용한 일반 기술의 상술을 위해, 실시자는 세포 생물학, 조직 배양 및 발생학의 표준 교과서 및 개론을 참고할 수 있다. 하기가 포함된다: [Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E.J. Robertson 편저, IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P.M. Wasserman 등 편저, Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P.D. Rathjen 등, Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998)].
신경계 이상의 상술, 및 다양한 유형의 신경 세포, 마커, 및 관련 가용성 인자의 규명을 위해, 독자는 [CNS Regeneration: Basic Science and Clinical Advances, M.H. Tuszynski & J.H. Kordower, 편저, Academic Press, 1999]를 참조한다.
분자 유전학 및 유전 공학의 방법은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Sambrook 등, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait 편저, 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney 편저, 1987); Methods in Enzymology (Academic Press) 시리즈: Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos 편저, 1987); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (F.M. Ausubel 등 편저, 1987 & 1995); 및 Recombinant DNA Methodology II (R. Wu 편저, Academic Press 1995)] 에 기재되어 있다. 본 명세서에 언급되는 유전 조작용 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, 및 ClonTech 과 같은 상업적 공급자에서 시판된다.
항체 생성, 정제 및 변형에 사용되는 일반 기술, 및 면역조직화학을 포함하는 면역분석법의 고안 및 수행은 [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell 편저); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan 등 편저, 1991); 및 R. Masseyeff, W.H. Albert 및 N.A. Staines 편저, Methods of Immunological Analysis (Weinheim: VCH Verlags GmbH, 1993)] 를 참고한다.
줄기 세포의 공급원
본 발명은 하기 무제한의 실시예를 포함할 수 있는, 다양한 유형의 줄기 세포를 사용하여 수행할 수 있다.
미국 특허 제 5,851,832 호는 뇌 조직으로부터 수득된 다능 신경 줄기 세포를 보고한다. 미국 특허 제 5,766,948 호는 신생 대뇌반구에서 신경모세포의 생산을 보고한다. 미국 특허 제 5,654,183 호 및 제 5,849,553 호는 포유동물 신경 능 줄기 세포의 이용을 보고한다. 미국 특허 제 6,040,180 호는 포유동물 다능 CNS 줄기 세포의 배양물로부터 분화된 뉴런의 시험관 내 생성을 보고한다. WO 98/50526 및 WO 99/01159 는 신경상피 줄기 세포, 희돌기세포-성상교세포 전구세포, 및 계통-제한 뉴런 전구세포의 생성 및 분리를 보고한다. 미국 특허 제 5,968,829 호는 배아 전뇌로부터 수득되고, 글루코오스, 트랜스페린, 인슐린, 셀렌, 프로게스테론, 및 몇 가지 다른 성장 인자를 함유한 배지와 함께 배양된 신경 줄기 세포를 보고한다.
다르게 요구된 경우를 제외하고, 본 발명은 임의의 척추동물 종의 줄기 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 비인간 영장류, 동물, 가축, 및 다른 비인간 포유동물뿐만 아니라 인간 유래의 줄기 세포를 포함한다.
본 발명의 사용에 적합한 줄기 세포 중에 임신 후에 형성된 조직으로부터 유래된 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포, 예를 들면, 포배, 또는 임신 동안 임의의 시간에 채취한 태아 또는 배아 조직이 있다. 비제한적인 예에는 배아 줄기 세포 또는 배아 생식 세포의 일차 배양물 또는 확립된 세포주가 있다.
배아 줄기 세포
배아 줄기 세포는 영장류 종의 일원의 포배로부터 분리될 수 있다 (Thomson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아 줄기 (hES) 세포는 Thomson 등 (미국 특허 제 5,843,780 호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998) 및 [Reubinoff 등, Nature Biotech. 18:399, 2000]이 기재한 기술을 사용하여 인간 포배기 세포로부터 제조될 수 있다.
간단하게, 인간 포배를 인간 생체 내의 착상 전 배아로부터 수득한다. 대안적으로, 시험관 내 수정 (IVF) 배아를 사용하거나, 1 세포 인간 배아를 포배 단계로 증식시킬 수 있다 (Bongso 등, Hum Reprod 4:706, 1989). 배아를 G1.2 및 G2.2 배지 중에서 포배기까지 배양한다 (Gardner 등, Fertil. Steril. 69:84, 1998). 발생한 포배로부터 프로나아제 (Sigma)에 짧게 노출시켜 투명층을 제거한다. 포배를 1:50 배 희석한 토끼 항-인간 비장 세포 항혈청 중에 30 분 동안 노출시킨 후, 5 분 동안 DMEM 중에서 3 회 세척하고, 1:5 배 희석한 기니아피그 보충물 (Gibco) 에 3 분 동안 노출시켜, 내부 세포 덩어리를 면역수술로 분리한다 (Solter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975). DMEM 중에서 2 회 더 세척한 후, 용해된 영양아층 (trophectoderm) 세포를 손상되지 않은 내부 세포 덩어리 (ICM) 로부터 부드러운 피펫팅으로 제거하여, mEF 기저층 세포상에 ICM 을 도말한다.
9 내지 15 일 후, 내부 세포 덩어리에서 유래된 증식물을 1 mM EDTA 가 들어있고 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 (PBS) 에 노출시키거나, 디스파아제 또는 트립신에 노출시키거나 또는 마이크로피펫으로 기계적으로 분리시켜 응괴로 분리한 후, 신선한 배지 중에서 mEF 상에 재도말한다. 미분화된 형태를 나타내는 자라는 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선별하여, 기계적으로 응괴로 분리하고 재도말한다. ES 유사 형태는 명백히 높은 핵 대 세포질 비 및 뚜렷한 인을 갖는 밀집 콜로니를 특징으로 한다. 생성된 ES 세포를 이어서 간단한 트립신화, 둘베코 PBS (2mM EDTA를 함유)에 노출, IV 형 콜라게나아제 (∼200U/mL; Gibco)에 노출, 또는 마이크로피펫으로 개개의 콜로니를 선별함으로써 1-2 주 간격으로 통상적으로 분열시킨다. 약 50 내지 100 세포의 응괴 크기가 적당하다.
배아 생식 세포
인간 배아 생식 (hEG) 세포는 최종 생리 기간의 약 8 - 11 주 후 채취한 인간 태아 물질 중에 존재하는 원시 생식 세포로부터 제조될 수 있다. 적합한 제조 방법은 [Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998] 및 미국 특허 제 6,090,622 호 에 기재되어 있다.
간단하게, 생식 융기를 등장 완충액으로 헹군 후, 0.05% 트립신/0.53 mM 소듐 EDTA 용액 (BRL) 0.1 mL 중에 놓고 < 1mm3 의 큰 덩어리로 절단한다. 이어서, 조직을 100 ㎕ 팁을 통해 피펫팅하여 세포를 더욱 분리시킨다. 37℃ 에서 대략 5 분 동안 인큐베이션 후, 대략 3.5 mL 의 EG 성장 배지를 첨가한다. EG 성장 배지는 DMEM, 4500 mg/L D-글루코오스, 2200 mg/L mM 중탄산나트륨; 15% ES 검정된 소 태아 혈청 (BRL); 2 mM 글루타민 (BRL); 1mM 소듐 피루베이트 (BRL); 1000 - 2000 U/mL 인간 재조합 백혈병 억제 인자 (LIF, Genzyme); 1-2 ng/ml 인간 재조합 bFGF (Genzyme); 및 10μM 포스콜린 (10% DMSO 중) 이다. 대안적인 접근으로, 히알루로니다아제/콜라게나아제/DNAse를 이용하여 EG 세포를 분리한다. 장간막을 갖는 생식기 또는 생식 융기를 태아 물질로부터 절단하고, 생식 융기를 PBS 중에 헹군 후, 0.1ml HCD 절단 용액 (0.01% 히알루로니다아제 V형, 0.002% DNAse I, 0.1% 콜라게나아제 IV형, 모두 EG 성장 배지에서 제조된 Sigma 사 제품)에 위치한다. 조직을 잘게 썰고, 37℃에서 1시간 또는 밤새 인큐베이션하고, 1-3mL의 EG 성장 배지 중에 재현탁하고, 기저층 세포에 도말한다.
LIF, bFGF 또는 포스콜린이 없는 변형된 EG 성장 배지 중에서 3 일 동안 배양된 후 5000 라드 γ선-조사로 불활성화된 서브콘플루언트한 기저층 세포 (예를 들면, STO 세포, ATCC 번호 CRL 1503)로 96 웰 조직 배양 플레이트를 제조하고, 일차 생식 세포 (PGC) 현탁액의 약 0.2 mL 을 각각의 웰에 첨가한다. 각 웰을 조사된 STO 마우스 섬유아세포로 미리 제조된 24-웰 배양 접시의 하나의 웰로 옮기는 제 1 계대는 EG 성장 배지 중에서 7 - 10 일 후에 수행한다. EG 세포와 일치하는 세포 형태가 관찰될 때까지, 전형적으로 7-30 일 또는 1-4 계대 후, 매일 배지를 교체하면서 세포를 배양한다.
미분화 상태로 pPS 세포의 증식
pPS 세포를 분화를 촉진시키지 않고 증식을 촉진시키는 배양 조건하에, 배양물 중에 계속적으로 증식시킬 수 있다. 전형적인 혈청-함유 ES 배지는 80% DMEM (예를 들면, Knock-Out DMEM, Gibco), 20% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone) 또는 혈청 대체물 (WO 98/30679), 1% 비필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 및 0.1mM β-머캅토에탄올로써 제조한다. 사용전에 바로, 인간 bFGF를 4ng/mL로 첨가한다 (WO 99/20741, Geron Corp.).
전통적으로, ES 세포를 기저층 세포층, 전형적으로 배아 또는 태아 조직으로부터 유래된 섬유아세포에서 배양한다. 임신 13 일째의 CF1 마우스로부터 배아를 수확하고, 2mL 트립신/EDTA로 옮기고, 잘게 썰고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. 10% FBS를 첨가하고, 찌꺼기를 가라앉게 하고, 세포를 90% DMEM, 10% FBS, 및 2 mM 글루타민 중에서 증식시킨다. 기저층 세포층을 제조하기 위해, 세포를 조사하여 증식을 억제하나 ES 세포를 지지하는 인자의 합성을 허용한다 (약 4000 rad γ-조사). 배양 플레이트를 0.5% 젤라틴으로 밤새 코팅하고, 웰 당 375,000 조사한 mEF와 함께 도말하고, 도말 후 5 시간 내지 4일 동안 사용하였다. 배지를 pPS 세포를 접종하기 직전에 신선한 hES 배지로 교체한다.
Geron의 과학자들은 pPS 세포가 대안적으로 기저층 세포 없이도 미분화 상태로 유지될 수 있다는 것을 발견하였다. 기저층이 없는 배양 환경은 적당한 배양 기질, 특히 세포외 매트릭스, 예를 들면, Matrigel
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또는 라미닌을 포함한다. pPS 세포를 cm2 당 >15,000 세포 (최적으로는 cm2 당 90,000 내지 170,000 세포)로 도말한다. 전형적으로, 효소 절단은 세포가 완전히 분산되기 전에 중단된다 (즉, 콜라게나아제 IV로써 약 5분). 약 10-2000 세포 덩이를 이어서 추가의 분산 없이 기질상에 직접 도말한다.
기저층이 없는 배양은 조사된 일차 마우스 배아 섬유아세포, 텔로머화된 마우스 섬유아세포, pPS 세포로부터 유래된 섬유아세포 유사 세포를 배양함으로써 전형적으로 조절된 영양 배지에 의해 지지된다. 배지는 무혈청 배지, 예를 들면, 20% 혈청 대체물 및 4 ng/mL bFGF로써 보충된 KO DMEM에서 약 5-6 ×104 cm-2 의 밀도로 기저층을 도말함으로써 조절될 수 있다. 1-2 일 동안 조절된 배지를 추가의 bFGF로써 보충하고, 1-2 일 동안 pPS 세포 배양물을 지지하기 위해 사용하였다.
현미경 하에서, ES 세포는 높은 핵/세포질 비, 뚜렷한 인 및 구분하기 어려운 세포 연접을 갖는 밀집 콜로니 형성을 나타낸다. 영장류 ES 세포는 단계-특 이적 배아 항원 (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표시되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커를 발현한다 (Thomson 등, Science 282:1145, 1998). 마우스 ES 세포를 SSEA-1에 대한 양성 대조군, 및 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81에 대한 음성 대조군으로서 사용할 수 있다. SSEA-4는 인간 배아 암종 (hEC) 세포상에 일정하게 존재한다. pPS 세포의 시험관 내에서의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 손실 및 SSEA-1의 발현의 증가를 야기한다. SSEA-1은 또한 hEG 세포에서 발견된다.
신경 전구세포 및 말단 분화된 세포의 제조를 위한 물질 및 절차
본 발명의 특정 신경 전구세포는 원하는 표현형을 갖는 세포로 농축된 특별한 성장 환경에서 (원하는 세포의 성장, 또는 다른 세포 유형의 저해 또는 사멸에 의해) 줄기 세포를 배양, 분화, 또는 재프로그래밍함으로써 수득된다. 상기 방법은 이전 섹션에 기재된 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포를 포함한, 많은 유형의 줄기 세포에 적용할 수 있다.
전형적으로, 분화는 적당한 기질, 및 분화 물질이 첨가된 영양 배지를 함유하는 배양 환경에서 발생한다. 적당한 기질에는 양성 전하, 예를 들면, 폴리-L-라이신 및 폴리오르니틴으로 예시되는 염기성 아미노산으로 코팅된 고체 표면이 포함된다. 기질을 피브로넥틴으로 예시되는 세포외 매트릭스 성분으로 코팅할 수 있다. 다른 허용되는 세포외 매트릭스에는 Matrigel
Figure 112002037326782-pct00002
(Engelbreth-Holm-Swarm 종양 세포 유래의 세포외 매트릭스) 및 라미닌이 포함된다. 또한 조합 기질, 예를 들면, 피브로넥틴, 라미닌, 또는 양자와 조합된 폴리-L-라이신이 적합 하다.
적당한 분화 물질에는 다양한 종류의 성장 인자, 예를 들면, 표피 성장 인자 (EGF), 전환성장인자 α(TGF-α), 임의의 형태의 섬유아세포 성장 인자 (FGF-4, FGF-8, 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 = bFGF로 예시됨), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-1 및 기타), 고농도의 인슐린, 음향 고슴도치, 뉴로트로핀군의 일원 (예를 들면, 신경 성장 인자 = NGF, 뉴로트로핀 3 = NT-3, 뇌 유래 신경영양인자 = BDNF), 골형성단백질 (특히 BMP-2 및 BMP-4), 레틴산 (RA) 및 gp130과 복합하는 수용체에 대한 리간드 (예를 들면, LIF, CNTF, 및 IL-6)가 포함된다. 또한 전기한 인자에 대한 각각의 세포-표면 수용체에 결합하는 대안적인 리간드 및 항체가 적합하다. 전형적으로, 상기 또는 하기 실시예에서 열거한 2, 3, 4, 또는 그 이상의 물질을 함유할 수 있는 다수의 분화 물질이 사용된다. EGF, bFGF, PDGF, 및 IGF-1을 함유한 칵테일이 전형적이다 (실시예 1 및 2).
인자를 원하는 세포 유형의 증식 또는 생존을 지지하는 임의의 배지인, 영양 배지내의 세포에 공급한다. 혈청보다 오히려 유리 아미노산으로서 영양분을 공급하는 단순배지를 사용하는 것이 종종 바람직하다. 또한 신경 세포의 지속적인 배양을 위해 개발된 첨가제로써 배지를 보충하는 것이 유리하다. Gibco에서 시판하는 N2 및 B27 첨가제가 전형적이다.
줄기 세포가 pPS 세포인 경우에, 세포 (기저층 세포 지지 또는 무기저층 배양으로부터 수득됨)를 분화 물질의 적당한 칵테일의 존재하에 배양함으로써 분화한 다.
분화에 영향을 미치는 하나의 방법에서, pPS 세포를 적당한 지지체, 예를 들면, 부착 유리 또는 플라스틱 표면, 예를 들면, 폴리아민으로 코팅된 덮개 유리상에 직접 도말한다. 이어서 세포를 원하는 세포 계통으로의 분화를 촉진시키도록 적응된 적당한 영양 배지 중에서 배양한다. 이것을 "직접 분화" 방법이라 한다.
또 다른 방법에서, pPS 세포를 먼저 이종의 세포 집단으로 분화하도록 한다. 전형적인 변이에서, 배상체가 이들을 현탁액 중에 배양함으로써 pPS 세포로부터 형성된다. 선택적으로, 이전에 열거한 하나 이상의 분화 물질 (예를 들면, 레틴산)이 배지내에 포함되어 배상체내에서 분화를 촉진시킬 수 있다. 배상체가 충분한 크기로 도달한 후에 (전형적으로 3-4일), 이들을 분화 배양물의 기질상에 도말한다. 배상체를 세포를 분산시키지 않고 기질상에 직접 도말할 수 있다. 이것은 신경세포 전구체를 배상체로부터 세포외 매트릭스상에 이동하게 한다. 상기 배양물의 적당한 배지상으로의 이은 계대는 신경 선조세포를 선발하는 것을 돕는다.
상기 절차에 따라 제조된 세포는 추가로 증식할 수 있는 것으로 알려졌다 (실시예 1). 30%, 50%, 75% 또는 그 이상의 세포가 폴리시알화 NCAM 또는 A2B5 항원결정부, 또는 양자를 발현한다. 전형적으로, 약 10%, 20%, 30% 또는 50% 이상의 세포가 NCAM을 발현하고, 약 10%, 20%, 30% 또는 50% 이상의 세포가 A2B5를 발현하는데, 이는 이들이 각각 뉴런 계통 및 신경교 계통의 세포를 형성하는 능력을 가지고 있다는 것을 의미한다.
선택적으로, 분화 세포는 특정 집단이 농축되는 표현형 특징에 기초하여 분류될 수 있다. 전형적으로, 이것은 각각의 세포를 신경 세포에 특징적인 마커에 결합하는 항체 또는 리간드와 접촉시키고, 이어서 특이적으로 인지된 세포를 집단내의 다른 세포로부터 분리하는 것을 포함한다. 하나의 방법은 특정 항체가 고체 표면에 결합되는 면역팬닝 (immunopanning)이다. 세포는 표면과 접촉하고, 마커를 발현하지 않는 세포를 세척하여 제거한다. 결합 세포를 이어서 더욱 거센 용출로 회수한다. 상기의 변이는 친화성 크로마토그래피 및 항체 매개 자성 세포 분류이다. 전형적인 분류 절차에서, 세포는 특정 일차 항체와 접촉하고, 이어서 자성 비드에 결합된 이차 항-면역글로불린 시약을 이용하여 포획한다. 부착하는 세포를 이어서 자장내의 비드를 수합함으로써 회수한다.
또 다른 방법은 전형적으로 형광으로 표지된 이차 항-면역글로불린을 통해 마커를 발현하는 세포를 특정 항체로써 표지하는, 형광-활성 세포 분류이다. 이어서 세포를 적당한 분류 장치를 이용하여 결합된 표지의 양에 따라 개별적으로 분리한다. 임의의 상기 방법은 대상 마커를 보유하는 양성으로 선발된 세포 집단, 및 양성으로 선발되도록 충분한 밀도 또는 접근성으로 마커를 보유하지 않는 음성으로 선발된 세포 집단의 회수를 가능하게 한다. 음성적인 선발은 또한 세포를 특정 항체와 연속적으로 인큐베이션, 및 항체가 결합된 세포를 용해하는 보충물의 제조에 의해 수행될 수 있다. 분화된 세포 집단의 분류는 어느 때에나 일어날 수 있으나, 일반적으로 분류는 분화 과정의 시작 직후에 가장 잘 수행된다고 알려져 있다.
폴리시알화 NCAM에 대해 양성으로 선발된 세포는 60%, 70%, 80%, 또는 90% NCAM 양성인 집단을 제공할 수 있다고 알려져 있다 (실시예 1). 이것은 이들이 뉴런을 포함한, 어떤 형태의 신경 세포를 형성할 수 있다는 것을 의미한다.
또한 A2B5에 대해 양성으로 선발된 세포는 60%, 70%, 80%, 또는 90% A2B5 양성인 집단을 제공할 수 있다고 알려져 있다 (실시예 2). 이것은 이들이 뉴런 및 신경교세포를 포함한, 어떤 형태의 신경 세포를 형성할 수 있다는 것을 의미한다. A2B5 양성 세포는 다시 두개의 별개의 집단으로 분류될 수 있다: A2B5 양성 및 NCAM 음성인 집단, 및 A2B5 양성 및 NCAM 양성인 집단.
상기 절차에 따라 제조된 분화 또는 분리된 세포는 임의의 적당한 배양 배지에서 추가로 유지되거나 증식될 수 있다. 전형적으로, 배지는 세포를 분화시키기 위해 초기에 사용된 성분의 대부분을 포함할 것이다.
원한다면, 상기 절차에 따라 제조된 신경 전구세포는 추가로 성숙 뉴런, 성상교세포, 또는 희돌기세포로 분화될 수 있다. 이것은 세포를 성숙 인자, 예를 들면, 포스콜린 또는 세포내 cAMP 수준을 증가시키는 다른 화합물, 예를 들면, 콜레라독소, 이소부틸메틸크산틴, 디부틸아데노신 시클릭 모노포스페이트, 또는 다른 인자, 예를 들면, c-키트 리간드, 레틴산, 또는 뉴로트로핀 중에 세포를 배양함으로써 수행할 수 있다. 뉴로트로핀-3 (NT-3) 및 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF)가 특히 효과적이다. 다른 후보는 GDNF, BMP-2, 및 BMP-4 이다. 대안적으로 또는 추가로, 신경 전구세포 증식을 촉진시키는 인자의 일부 또는 모두, 예를 들면, EGF 또는 FGF를 제거함으로써 성숙을 증진시킬 수 있다.
치료용 및 다른 적용에 사용하기 위해, 전구세포 또는 성숙 신경 세포 집단이 미분화 pPS 세포가 실질적으로 없는 것이 종종 바람직하다. 집단으로부터 미분화 줄기 세포를 제거하는 하나의 방법은 이들을 미분화 세포에서 우선적인 발현을 유도하는 프로모터의 조절하에 이펙터 유전자 (effector gene)의 벡터로써 트랜스펙션시키는 것이다. 적당한 프로모터에는 TERT 프로모터 및 OCT-4 프로모터가 포함된다. 이펙터 유전자는 세포 (예를 들면, 독소 또는 세포사멸의 매개자를 코딩함)에 직접 용해성일 수 있다. 대안적으로, 이펙터 유전자는 세포를 외부 물질, 예를 들면, 항체 또는 약물전구체의 독성 효과에 민감하게 할 수 있다. 갠시클로비어 (ganciclovir)에 감수성으로 발현되는 세포를 야기하는 단순포진 (Herpes Simplex) 티미딘 키나아제 (tk) 유전자가 전형적이다. 적당한 pTERT-tk 구축물을 국제 특허 공보 WO 98/14593 (Morin 등)에서 제공한다.
신경 전구세포 및 말단 분화 세포의 규명
세포를 수많은 표현형 기준에 따라 규명할 수 있다. 기준에는 이에 제한되지 않고, 형태학적 특징의 현미경 관찰, 발현 세포 마커의 검출 또는 정량화, 효소 활성, 또는 신경전달물질 및 이의 수용체, 및 전기생리학적 기능이 포함된다.
본 발명에 구현된 특정 세포는 뉴런 세포 또는 신경교세포에 특징적인 형태학적 특성을 가진다. 특징은 그러한 세포의 존재를 평가하는 당업자에 의해 용이하게 인지된다. 예를 들면, 뉴런의 특징은 작은 세포체, 및 액손 및 수상돌기를 연상시키는 복수의 과정이다. 본 발명의 세포는 또한 이들이 다양한 종류의 신경 세포에 특징적인 표현형 마커를 발현하는가에 따라 규명될 수 있다.
대상 마커에는 이에 제한되지 않고, 뉴런의 특징인 β-튜불린 III, 신경소관연합단백질 (microtubule-associated protein) 2 (MAP-2), 또는 신경미세섬유; 성상교세포에 존재하는 신경교 근원섬유 산성 단백질 (glial fibrillary acidic protein :GFAP); 희돌기세포의 특징인 갈락토세레브로시드 (GalC) 또는 미엘린 염기성 단백질 (MBP); 미분화 hES 세포의 특징인 Oct-4; 신경 전구세포 및 기타 세포의 특징인 네스틴; 및 이미 기재된 A2B5 및 폴리시알화 NCAM 이 포함된다. A2B5 및 NCAM 이 신경 계통 세포를 연구할 때 지시 마커인 반면, 상기 마커는 때로는 다른 세포 유형, 예를 들면, 간 또는 근육 세포에서도 나타날 수 있다는 것을 인지해야 한다. β-튜불린 III는 이전에는 신경 세포에 특이적인 것으로 생각되었으나, hES 세포의 아집단이 또한 β-튜불린 III 양성이라는 것을 발견하였다. MAP-2는 다양한 유형의 충분히 분화된 뉴런의 더욱 엄격한 마커이다.
본 명세서에 열거되고 당업계에 공지된 조직 특이적 마커는 임의의 적당한 면역학적 기술, 예를 들면, 세포 표면 마커에 대한 유동 면역세포화학법, 세포내 또는 세포 표면 마커에 대한 (예를 들면, 고정된 세포 또는 조직 단편의) 면역조직화학법, 배지내로 분비된 세포 추출물 또는 산물에 대한 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석법 및 효소면역측정법을 이용하여 검출할 수 있다. 하나의 세포에 의한 항원의 발현은 현저하게 검출가능한 양의 항체가, 선택적으로 세포의 고정 후, 및 선택적으로 표지를 증폭시키기 위해 표지된 이차 항체 또는 다른 접합물 (예를 들면, 바이오틴-아비딘 접합물)을 사용하여, 표준 면역세포화학법 또는 유동 세포측 정 분석법에서 항원에 결합한다면 "항체-검출가능한"으로 일컬어진다.
조직 특이적인 유전자 산물의 발현은 또한 노던 블롯 분석, 돗-블롯 혼성화 분석, 또는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 사용한 역전사 개시 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 검출할 수 있다. 더욱 상세한 것은 미국 특허 제 5,843,780 호를 참조. 본 명세서에 열거된 특정 마커의 서열 데이타는 공유 데이타베이스, 예를 들면, GenBank (URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)로부터 수득될 수 있다. mRNA 수준에서의 발현은 전형적인 제어된 실험에서 표준 절차에 따라 세포 시료상에서 분석을 수행한 것이 명확히 구별가능한 혼성화 또는 증폭 산물을 생산한다면 본 명세서에 기재된 분석법 중의 하나에 따라 "검출가능한"으로 일컬어진다. 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출된 조직 특이적 마커의 발현은 수준이 대조군 세포, 예를 들면, 미분화 pPS 세포, 섬유아세포, 또는 다른 무관한 세포 유형의 2배 이상, 바람직하게는 10배 또는 50배 이상이면 양성으로 고려된다.
신경 세포, 특히 말단 분화 세포의 특징은 또한 신경전달물질의 생합성, 방출, 및 재흡수에 관련된 수용체 및 효소, 및 시냅스 전달의 탈분극 및 재분극 사건에 관련된 이온 통로이다. 시냅스 형성의 증거는 신경접합단백의 염색에 의해 수득될 수 있다. 특정 신경전달물질에 대한 감수성의 증거는 γ-아미노 부티르산 (GABA), 글루타메이트, 도파민, 3,4-디히드록시페닐알라닌 (DOPA), 노르아드레날린, 아세틸콜린, 및 세로토닌에 대한 수용체를 검출함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 특정 전구세포 집단의 분화 (예를 들면, NT-3 및 BDNF를 이용)는 20%, 30%, 또는 40% 이상 MAP-2 양성인 세포 집단을 생성할 수 있다. 실질적인 비율, 예를 들면, 5%, 10%, 25%, 또는 그 이상의 NCAM 또는 MAP-2 양성 세포는 신경전달물질, 예를 들면, 아세틸콜린, 글리신, 글루타메이트, 노르에피네프린, 세로토닌, 또는 GABA를 합성할 수 있을 것이다.
본 발명의 특정 집단은 면역세포화학법 또는 mRNA 발현에 의해 측정할 때, 0.1%의 NCAM 또는 MAP-2 양성 세포, 및 (세포수 기준으로) 아마도 1%, 3%, 또는 5% 또는 그 이상의 티로신 히드록실라아제 (TH) 양성 세포를 포함한다. 이것은 일반적으로 당업계에서 도파민 합성 세포에 대한 마커로서 고려된다.
분화 집단에 존재하는 성숙 뉴런을 추가로 밝히기 위해, 세포를 기능성 기준에 따라 시험할 수 있다. 예를 들면, 신경전달물질, 또는 생체내에서 뉴런에 영향을 주는 것으로 알려진 다른 환경 조건에 반응하여, 칼슘 유동을 임의의 표준 기술에 의해 측정할 수 있다. 먼저, 집단 내의 뉴런 유사 세포를 형태학적 기준, 또는 NCAM과 같은 마커로 확인한다. 이어서 신경전달물질 또는 조건을 세포에 적용하고, 반응을 모니터링한다 (실시예 6). 또한 세포를 표준 패치-클램프 기술을 행하여, 활동 전위에 대한 증거의 존재 여부, 및 등전위 및 반응 사이의 지연 시간이 어떠한지를 결정할 수 있다. 본 발명의 신경 전구세포 집단의 분화는 뉴런의 형태학적 특성을 갖는 아집단을 포함하는 배양물을 생성할 수 있고, NCAM 또는 MAP-2 양성이며, 하기 빈도로 반응을 보여준다: 약 40%, 60% 또는 80% 이상의 세포가 GABA, 아세틸콜린, ATP, 및 고농도 나트륨에 반응하고; 약 5%, 10% 또는 20% 이상의 세포가 글루타메이트, 글리신, 아스코르브산, 도파민, 또는 노르 에피네프린에 반응한다. NCAM 또는 MAP-2 양성 세포의 실질적인 비율 (약 25%, 50% 또는 75% 이상)은 또한 패치-클램프 시스템에서 활동 전위의 증거를 보여줄 수 있다.
기능성 뉴런, 희돌기세포, 성상교세포, 및 이의 전구세포와 일치하는 다른 바람직한 특징은 또한 표준 방법에 따라 수행되어 본 발명에 따른 세포 집단의 질을 확인할 수 있고, 세포의 증식 및 분화의 조건을 최적화할 수 있다.
신경 전구세포의 텔로머화
신경 세포가 특정 약물 스크리닝 및 치료적 적용에서 복제하는 능력을 가지며, 분화된 뉴런 및 신경교세포의 생성 보유고를 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포는 이들이 제한된 발생 계통 세포 또는 말단 분화 세포로 진행되기 전 또는 후에, 이들의 복제능을 증가시키기 위해 임의로 텔로머화될 수 있다. 텔로머화된 pPS 세포를 상술한 분화 경로로 진행시키거나; 분화된 세포를 직접 텔로머화시킬 수 있다.
세포는 적당한 벡터, 상동 재조합 또는 기타 적절한 기술로 트랜스펙션 (transfection) 또는 형질도입 (transduction) 시켜서, 이들이 전형적으로 내재 프로모터하에 일어나는 것을 넘어선 텔로머라아제 발현을 증가시키는 이종 프로모터하에, 텔로머라아제 촉매 성분 (TERT) 을 발현하도록 유전적으로 변형시킴으로써 텔로머화된다. 국제 특허 출원 WO 98/14592 에 제공되는 인간 텔로머라아제의 촉매 성분 (hTERT) 이 특히 적합하다. 특정 적용을 위해, 마우스 TERT (WO 99/27113) 와 같은 종 동족체도 사용할 수 있다. 인간 세포에서 텔로머라아제 의 트랜스펙션 및 발현은 [Bodnar 등, Science 279:349, 1998 및 Jiang 등, Nat. Genet. 21:111, 1999] 에 기재되어 있다. 또 다른 예에서, hTERT 클론 (WO 98/14592) 을 hTERT 코딩 서열원으로 사용하여, MPSV 프로모터의 조절 하에 PBBS212 벡터의 EcoRI 부위 내로 삽입하거나, LTR 프로모터의 조절 하에, 시판되는 pBABE 레트로바이러스 벡터의 EcoRI 부위 내로 삽입한다.
분화되거나 미분화된 pPS 세포는 8-16 시간 동안 벡터 함유 상층액을 이용하여 유전적으로 변형된 후, 1-2 일 동안 성장 배지로 교환된다. 유전적으로 변형된 세포는 0.5-2.5 ㎍/mL 의 푸로마이신을 사용하여 선발 및 재배양된다. 이어서, 이들을 RT-PCR, 텔로머라아제 활성 (TRAP 분석), hTERT 의 면역세포화학적 염색 또는 복제능에 의해, hTERT 발현에 대해 평가한다. 하기 분석 키트가 연구 목적으로 시판된다: TRAPeze
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XL 텔로머라아제 검출 키트 (카탈로그 번호 s7707; Intergen Co., Purchase NY); 및 TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAplus (카탈로그 번호 2,013,89; Roche Diagnostics, Indianapolis IN). 또한 TERT 발현을 RT-PCR에 의해 mRNA에서 평가할 수 있다. LightCycler TeloTAGGG hTERT 정량화 키트 (카탈로그 번호 3,012,344; Roche Diagnostics)가 연구 목적으로 시판된다. 연속적으로 복제하는 콜로니는 증식을 지지하는 조건 하에서 더 배양하여 농축되며, 바람직한 표현형을 갖는 세포는 임의로 한계 희석에 의해 클로닝될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, pPS 세포는 다능 또는 지정 신경 전구세포로 분화된 후, TERT 를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 본 발명의 다른 구현예에 서, pPS 세포는 TERT 를 발현하도록 유전적으로 변형된 후, 신경 전구세포 또는 말단 분화 세포로 분화된다. TERT 발현을 증가시키기 위한 성공적인 변형은 TRAP 분석 또는 세포의 복제능 개선도 여부의 측정에 의해 결정될 수 있다.
기타 세포의 불사화 방법에는, 예를 들면, myc, SV40 거대 T 항원, 또는 MOT-2를 코딩하는 DNA 로 세포를 형질전환시키는 것이 고려된다 (미국 특허 제 5,869,243 호, 국제 특허 출원 WO 97/32972 및 WO 01/23555). 종양유전자 또는 종양바이러스 산물로의 트랜스펙션은, 치료 목적으로 세포를 사용하는 경우에는 부적합하다. 예를 들어, CNS 기능을 증강시키기 위해 개인에게 분화된 세포를 투여하는 약제 스크리닝 및 치료 절차에서, 증식하고 이들의 핵형을 유지할 수 있는 세포를 갖는 것이 유리한 경우, 본 발명의 적용에서 텔로머화된 세포가 특히 의미 있는 것이다.
신경 전구세포 및 말단 분화된 세포의 용도
본 발명은, 신경 전구세포 및 성숙 뉴런 및 신경교세포를 다수 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 세포 집단은 중요한 다수의 연구, 개발 및 상업적 목적에 사용될 수 있다.
본 발명의 세포는 기타 계통의 세포에서 바람직하게 발현되는 cDNA 로 비교적 덜 오염된 cDNA 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 5분 동안 1000rpm 에서 원심분리로 다능 신경 선조세포를 수합한 후, 표준 기술 (Sambrook 등, 이하 동일)에 의해 펠렛으로부터 mRNA를 제조한다. cDNA 로 역전사시킨 후, 제제를 하기 세포 유형, 즉 뉴런 또는 신경교세포 계통의 세포, 성숙 뉴런, 성상교세포, 희돌기세포, 또는 원하지 않는 특이성의 다른 세포 유형의 일부 또는 전부 유래의 cDNA로써 제거할 수 있다. 이것은 말단 분화 세포와 비교하여 뉴런 전구세포에서 우선적으로 발현되는 전사체를 반영하는, 선택된 cDNA 라이브러리를 생성한다. 유사한 방식으로, 뉴런 또는 신경교 전구세포, 또는 성숙 뉴런, 성상교세포, 및 희돌기세포에서 우선적으로 발현되는 전사체를 나타내는 cDNA 라이브러리를 제조할 수 있다.
본 발명의 분화된 세포는 또한 다능 신경 선조세포, 뉴런 또는 신경교세포 계통으로 지정된 세포, 및 성숙 뉴런, 성상교세포, 및 희돌기세포의 마커에 특이적인 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 세포 집단이 pPS 세포 배양물, 및 CNS 조직으로부터 직접 추출된 뉴런 또는 신경교세포 배양물과 비교하여 특정 세포 유형이 농축되기 때문에, 그러한 항체를 증가시키는 개선된 방법을 제공한다.
면역원 형태로 본 발명의 세포를 척추 동물에 주사함으로써 다클론 항체를 제조할 수 있다. 단클론 항체의 제조는 표준 참고문헌에 기재되어 있다 [Harrow & Lane (1988), 미국 특허 제 4,491,632 호, 제 4,472,500 호 및 제 4,444,887 호 및 Methods in Enzymology 73B:3 (1981)]. 특이 항체 분자 (바람직하게는 단쇄 가변 부위의 형태로) 를 수득하는 기타 방법에는 면역적격 (immunocompetent) 세포 또는 바이러스 입자의 라이브러리를 표적 항원에 접촉시켜, 양성 선택된 클론을 배양하는 것이 관여된다 (Marks 등, New Eng. J. Med. 335:730, 1996, 국제 특허 출원 WO 94/13804, WO 92/01047, WO 90/O2809 및 McGuiness 등, Nature Biotechnol. 14:1449, 1996 참고). 본 발명의 pPS 를 이 용하여 양성 선택을 실시하고, 보다 광범위하게 분포된 항원을 갖는 세포 (예컨대, 분화된 배아 세포) 또는 성인에서 유래된 줄기 세포를 이용하여 음성 선택을 실시함으로써, 목적하는 특이성을 수득할 수 있다. 이들 항체는 다시, 목적하는 표현형을 갖는 신경 세포를 혼합된 세포 집단으로부터 확인 또는 분리하거나, 조직 시료를 이용한 면역진단 동안 함께 염색하거나, 말단 분화 뉴런, 신경교세포, 및 기타 계통의 세포로부터 전구세포를 분리하는 목적에 사용될 수 있다.
유전자 발현 분석
본 발명의 세포는, 신경 전구세포에 특징적인, 전사체 및 새로이 합성된 단백질의 발현 패턴 동정에 유용하며, 분화 경로를 지정하거나 세포간 상호작용을 촉진하는 것을 도울 수 있다. 분화된 세포의 발현 패턴을 수득하여, 대조 세포주, 예를 들면 미분화된 pPS 세포, 기타 유형의 지정된 전구세포 (예를 들면, 다른 계통으로 분화된 pPS 세포, 뉴런 또는 신경교세포 계통으로 지정된 세포), 신경릉, 신경구, 또는 척수로부터 수득된 것과 같은 다른 유형의 가상적인 신경 줄기세포, 또는 말단 분화된 세포, 예를 들면, 성숙 뉴런, 성상교세포, 희돌기세포, 평활근 세포 및 슈반세포와 비교한다.
단백질 수준에서 발현을 비교하는 적합한 방법에는, 상술한 면역분석 또는 면역조직화학 기술이 포함된다. 전사 수준에서 발현을 비교하기에 적합한 방법에는, mRNA 의 시차 발현법 (Liang, Peng 등, Cancer Res. 52:6966, 1992), cDNA 라이브러리의 전체 염기서열 결정 및 매트릭스 배열 발현 시스템이 포함된다.
유전자 발현을 분석하는데 있어서 마이크로배열의 사용은 [Fritz 등, Science 288:316, 2000; "Microarray Biochip Technology", L Shi, www.Gene-Chips.com]에서 일반적으로 검토된다. 마이크로배열 분석을 수행하기 위한 시스템 및 시약은, 하기의 회사로부터 시판되고 있다; Affymetrix, Inc., Santa Clara CA; Gene Logic Inc., Columbia MD; HySeq Inc., Sunnyvale CA; Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale CA; Nanogen, San Diego CA; 및 Synteni Inc., Fremont CA (Incyte Genomics, Palo Alto CA 가 인수).
목적 부위에서 탐침을 합성하거나 탐침 단편을 예비 합성하여 고체 지지체에 부착시킴으로써, 특정 부위에 탐침을 부착시켜 고체상 배열을 제조한다 (미국 특허 제 5,474,895 호 및 제 5,514,785 호). 탐침 분석은 전형적으로, 혼성화에 적합한 조건 하에서 해당 핵산 서열을 잠재적으로 함유하는 유체와 배열을 접촉시킨 후, 임의의 형성된 혼성물을 측정함으로써 수행된다.
Genteic Microsystems 배열 생성기 및 Axon GenePix™ Scanner 를 사용하여 전형적 방법이 수행된다. 분석될 마커 서열을 코딩하는 cDNA 단편을 먼저 증폭하여 마이크로배열을 제조하고, 유리 슬라이드상에 직접 스팟팅한다. 관심상의 두 가지 세포로부터의 mRNA 제제를 비교하기 위해, 하나의 제제는 Cy3-표지된 cDNA 로 전환시키고, 다른 하나는 Cy5-표지된 cDNA 로 전환시킨다. 두개의 cDNA 제제를 마이크로배열 슬라이드에 동시에 혼성화시킨 후 세척하여, 비특이적 결합을 제거한다. 이어서, 슬라이드를 각 표지에 적절한 파장에서 스캐닝하여, 생성 형광을 정량하고, 결과를 포맷팅하여 배열상의 각 마커에 대한 mRNA 의 상대적 풍부함의 지표로 삼는다.
본 발명에서의 분화된 세포의 특징분석 및 영향에 사용되는 발현 산물의 동정에는, 본 발명의 만능 뉴런 전구세포, 또는 뉴런 또는 신경교 경로에 따라 분화할 수 있는 세포와 같은, 제 1 세포 유형 내에서의 RNA, 단백질, 또는 기타 유전자 산물의 발현 수준 분석; 이어서 대조 세포 유형 내에서의 동일 산물의 발현 수준 분석; 두 가지 세포 유형 간의 상대적 발현 수준 비교 (전형적으로 시료 내의 총 단백질 또는 RNA 에 의해, 또는 하우스 키핑 유전자와 같이 두 세포 유형 모두에서 유사한 수준으로 발현이 기대되는 다른 유전자 산물과의 비교에 의해 표준화됨); 및 비교 발현 수준에 기초한 해당 산물의 동정이 관여된다.
약물 스크리닝
본 발명의 신경 전구세포는, 신경 전구세포 및 이들의 다양한 자손의 특징에 영향을 미치는 인자 (예를 들면, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드) 또는 환경 조건 (예를 들면, 배양 조건 또는 조작)의 스크리닝에 사용될 수 있다.
일부 적용에서, pPS 세포는 (미분화된 또는 분화된) 신경 세포로의 성숙을 촉진, 또는 장기간 배양에서 상기 세포의 증식 및 유지를 촉진하는 인자의 스크리닝에 사용된다. 예를 들면, 후보 성숙 인자 또는 성장 인자는 이들을 상이한 웰 내의 세포에 첨가한 후, 세포의 추가 배양 및 용도에 대해 바람직한 기준에 따라, 나타나는 임의의 표현형 변화를 측정함으로써 시험된다.
본 발명의 다른 스크리닝 적용은 신경 조직 또는 신경 전달에 대한 이들의 효과에 대해 약제 화합물의 시험에 관한 것이다. 화합물이 신경 세포 상에서 약리 효과를 가지도록 고안되었거나, 다른 곳에 효과를 가지도록 고안된 화합물이 의도치 않는 신경계에 대한 부작용을 가지기 때문에 스크리닝을 수행할 수 있다. 본 발명의 임의의 신경 전구세포 또는 말단 분화 세포, 예를 들면, 도파민성, 세로토닌계, 콜린계, 감각성, 및 운동 뉴런, 희돌기세포, 및 성상교세포를 이용하여 스크리닝을 수행할 수 있다.
독자는 일반적으로 하기 표준 교과서를 참조한다; "In vitro Methods in Pharmaceutieal Research", Academic Press, 1997 및 미국 특허 제 5,030,015 호. 후보 약제 화합물의 활성 평가에는 일반적으로, 본 발명의 분화된 세포를 다른 약물과 조합하여 또는 단독으로 후보 화합물과 배합하는 것이 관여된다. 발명가는 화합물에 기인한 세포의 형태, 마커 표현형 또는 기능성 활성의 임의 변화를 측정한 후 (비처리 세포 또는 불활성 화합물 처리 세포와 비교하여), 관측된 변화와 화합물의 효과를 관련짓는다.
세포 독성은 먼저, 세포 생존능, 생존, 형태 및 특정 마커 및 수용체의 발현에 대한 효과에 의해 측정될 수 있다. 염색체 DNA에 약물의 효과는 DNA 합성 또는 치유를 측정함으로써 결정할 수 있다. [3H]-티미딘 또는 BrdU 혼입은, 특히 세포 주기의 지정되지 않은 시점에서 또는 세포 복제에 요구되는 수준 초과시, 약물 효과와 일치한다. 원하지 않는 효과에는 또한, 중기 스프레딩에 의해 측정되는 딸 크로마티드 교환의 비정상적 속도가 포함될 수 있다. 추가의 정보에 대해서, 독자는 하기를 참고한다: A. Vickers, pp 375-410, "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997.
세포 기능의 효과를 표준 분석법의 사용으로 평가하여 세포 배양 또는 적당한 모델에서, 신경 세포의 표현형 또는 활성, 예를 들면, 수용체 결합, 신경전달물질 합성, 방출 또는 흡수, 전기생리, 및 뉴런 과정 또는 미엘린 시스 (sheath)의 성장을 관찰할 수 있다.
치료 용도
본 발명은 또한 기능에 본질적인 오류, 질병 상태의 효과, 또는 상처의 결과로 인한, 치료를 필요로 하는 대상체의 중추신경계 (CNS) 기능을 복구하기 위한 신경 전구세포의 용도를 제공한다.
치료용 투여에 대한 신경 전구세포의 타당성 결정을 위해, 먼저 세포를 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 한 단계에 있어서는, 생체 내에서 세포가 생존하면서 그들의 표현형을 유지하는 능력을 평가한다. 신경 전구세포를, 면역결핍 동물 (예를 들면, 누드 마우스, 또는 화학적으로 또는 광조사에 의해 면역결핍화된 동물)의 뇌강 또는 척수와 같은, 관찰이 가능한 부위에 투여한다. 수일 내지 수주 이상의 기간 후에 조직을 취하여, pPS 유래 세포의 존재 여부를 평가한다.
이는, 미리 표지된 (예를 들면, BrdU 또는 [3H]티미딘 이용) 검출 가능한 표지 (예를 들면, 녹색 형광 단백질 또는 β-갈락토시다제) 를 발현하는 세포를 투여하거나, 항상성 세포 마커 (예를 들면, 인간 특이적 항체를 이용)의 이은 검출에 의해 수행할 수 있다. 설치류 모델에서 신경 전구세포를 시험하는 경우, 투여 된 세포의 존재 및 표현형은, 인간 특이적 항체를 이용하는 면역조직화학 또는 ELISA, 또는 인간 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적인 증폭을 유도하는 프라이머 및 혼성화 조건을 이용하는 RT-PCR 분석에 의해서 평가될 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 평가하는데 적합한 마커를 본 명세서의 다른 부분에서 제공한다.
신경계 기능의 복구를 시험하는 다양한 동물 모델은 ["CNS Regeneration; Basic Science and Clinical Advances", M.H. Tuszynski & J.H. Kordower, 편저, Academic Press, 1999]에 기재된다.
본 발명의 분화된 세포는 또한 이를 필요로 하는 인간 환자의 조직 재구성 또는 재생에 사용될 수 있다. 세포를 원하는 조직 부위로 이식되거나 이동하도록 하는 방식으로 투여하여, 기능적으로 결핍된 부위를 재구성하거나 재생한다.
본 발명에 구현된 특정 신경 선조세포는 신경계의 급성 또는 만성 손상의 치료를 위해 고안된다. 예를 들면, 흥분성 독성이 간질, 발작, 허혈, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함한 다양한 상태에 관련되어 있다. 본 발명의 특정 분화 세포는 또한 수초발육부전 질환, 예를 들면, 펠리제우스-메르츠바하(Pelizaeus -Merzbacher)병, 다발성 경화증, 백질이영양증, 신경염 및 신경병증을 치료하는데 적합할 수 있다. 재수초 형성 과정을 촉진시키기 위해 희돌기세포 또는 희돌기세포 전구체로 농축된 세포 배양물이 상기 목적에 적합하다.
예증을 통해, 치료될 병에 따라, 신경 줄기 세포를 중추신경계의 유조직 또는 수막강내 부위로 직접 이식한다. 이식을 단세포 현탁액 또는 ㎕ 당 25,000- 500,000 세포의 밀도의 작은 집합체를 이용하여 수행한다 (미국 특허 제 5,968,829 호). 운동 뉴런 또는 이들의 전구체의 이식의 효율성은 [MacDonald 등, Nat. Med. 5:1410, 1999]에 기재된 바와 같이 급성으로 상처를 입은 척수에 대한 래트 모델에서 평가할 수 있다. 성공적인 이식은 손상 2-5 주 후에 존재하는 이식에 의해 유래된 세포를 보여주고, 성상교세포, 희돌기세포, 및/또는 뉴런으로 분화하고, 손상 말단으로부터 척수를 따라 이동하며, 입구(gate), 조화, 및 체중 유지의 개선을 보여줄 것이다.
본 발명에 따른 신경 선조세포 및 말단 분화 세포는 인간 투여를 위해 충분히 멸균 조건하에 제조된 등장성 부형제를 함유하는 약학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 의약 제형의 일반적인 원리에 대해, 독자는 하기를 참고한다: Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan 편저, Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.
조성물은 선택적으로 원하는 목적, 예를 들면, 일부 신경성 이상을 개선하기 위해 CNS 기능의 재구성을 위해 표기된 지시에 따라 적당한 용기내에 포장될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예의 무제한의 예증으로서 제공된다.
실험 절차
이 섹션은 하기 실시예에서 사용된 기술 및 시약의 일부의 상세한 것을 제공한다.
hES 세포를 일차 마우스 배아 섬유아세포, 또는 무기저층 시스템에서 유지한다. hES 세포를 조사된 마우스 배아 섬유아세포, 또는 Matrigel
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(배양 배지에서 1:10 내지 1:30)로 코팅된 플레이트상에서 작은 덩어리로 접종한다. 기저층 세포상의 hES 세포 배양물을 80% KO DMEM (Gibco) 및 20% Serum Replacement (Gibco)로 구성되고, 1% 비필수 아미노산, 1 mM 글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올 및 4 ng/mL 인간 bFGF (Gibco)로 보충된 배지에서 유지한다. 기저층 세포가 없는 배양물을 배아 섬유아세포와 함께 배양함으로써 이전에 조절된 동일한 배지에서 유지하고, 4 ng/mL bFGF (매일 교환)로 재보충하였다.
세포를 연속 계대로 팽창하였다. ES 콜로니의 단층 배양물을 37℃에서 5-20 분 동안 1mg/mL 콜라게나아제로써 처리하였다. 이어서 배양물을 부드럽게 긁어서 세포를 제거하였다. 덩어리를 부드럽게 분리하고, 신선한 기저층 세포상에 작은 덩어리로서 재도말하였다.
배상체를 하기와 같이 제조한다. hES 세포의 콘플루언트 단층 배양물을 1mg/mL 콜라게나아제 중에서 5-20 분 동안 인큐베이션 후, 세포를 플레이트에서 긁어 내어 회수하였다. 이어서 상기 세포를 덩어리로 분리시켜, 비부착성 세포 배양 플레이트 (Costar) 중에 80% KO ("녹아웃") DMEM (Gibco) 및 20% 열불활성화되지 않은 FBS (Hyclone) 로 구성되고, 1% 비필수 아미노산, 1 mM 글루타민, 0.1mM β-머캅토에탄올로 보충된 배지 중에 도말하였다. 상기 세포를 웰 (6 웰 플레 이트) 당 2mL 배지 중에 1:1 또는 1:2 비로 접종하였다. 매 2 일 마다 EB 에 웰당 2mL 배지를 첨가하여 공급하였다. 배지의 체적이 4mL/웰을 초과하는 경우, EB 를 수합하여 신선한 배지 중에 재현탁하였다. 현탁 4-8 일 후, 선택된 분화 인자의 존재하에 EB 를 기질 상에 도말하여 추가로 분화시켰다.
신경 전구세포로의 분화는 전형적으로 PBS 중의 20㎍/mL의 최종 농도에서 피브로넥틴 (Sigma)으로써 코팅된 웰상에서 수행한다. 1mL/웰 (9.6 cm2)을 사용하여, 플레이트를 4℃에서 밤새 또는 상온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 피브로넥틴을 제거하고, 플레이트를 사용전에 즉시 PBS 또는 KO DMEM으로써 세척하였다.
NCAM 및 A2B5 발현에 대한 면역세포화학을 하기와 같이 수행한다: 살아있는 세포를 37℃에서 15분 동안 1% 염소 혈청으로써 배양 배지 중에 희석된 일차 항체에서 인큐베이션하고, 배지로써 1회 세척한 후, 15분 동안 표지된 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후에, 세포를 2% 파라포름알데히드 중에 15-20분 동안 고정한다. 다른 마커에 대해, 배양물을 PBS 중의 4% 파라포름알데히드로써 15-20분 동안 고정하고, PBS로써 3회 세척하고, 100% 에탄올에서 2분 동안 침투시키고, 0.1M PBS로써 세척하였다. 이어서 배양물을 상온에서 1시간 이상 동안 5% NGS (정상 염소 혈청)을 갖는 0.1M PBS의 블록킹 용액에서 인큐베이션한다. 이어서 배양물을 상온에서 2시간 이상 동안 1% NGS를 함유한 0.1M PBS로 희석된 일차 항체에서 인큐베이션한다. 이어서 이들을 동일한 완충액에서 이차 항체로써 30분 인큐베이션하기 전에 PBS에서 세척한다. 사용된 항체는 표 1에 보여준 것을 포함한다.
신경 세포 표현형 마커용 항체
항체 이소타입 실제 희석 항원결정부 특이성 공급원
5A5 마우스 IgM 1:1 폴리시알화 NCAM 발생학적 연구 하이브리도마 뱅크
A2B5 마우스 IgM 1:1 강글리오시드 ATCC-CRL1520 클론 105
β-튜불린 IgG 1:1000 Sigma T-8660
GFAP 토끼 다클론 IgG 1:500 DAKO 2-334
GalC 마우스 IgG3 1:25 Boehringer 1351-621
비드 면역분류(bead immunosorting)를 하기 시약 및 장치를 사용하여 수행한다: 자성 세포 분리기; Midi MACsTM 칼럼; 0.5% BSA 및 2mM EDTA를 함유한 PBS CMF 완충액; NCAM 또는 A2B5에 대한 일차 항체; 래트 항-마우스 IgG (또는 IgM) 미세비드; 예비분리 필터; 래트 항-마우스 카파 PE; 및 FACScan 장치. 세포를 트립신/EDTA (Gibco)를 이용하여 수확하고 분리하였다. 트립신을 제거한 후에, 세포를 MACsTM 완충액 중에 재현탁하였다. 세포를 이어서 상온에서 6-8분 동안 일차 항체로써 표지하고, 세포를 300 ×g에서 10분 동안 원심분리하고, 완충액을 흡입함으로써 MACsTM 완충액에서 2회 세척하였다. 이어서 세포를 107 세포 당 80㎕ (최소 부피) 중에 재현탁한다. 107 세포 당 20㎕ (최소 부피) MACs ramTM IgG 미세비드를 6-12℃에서 15분 동안 첨가한다. 이어서 시료를 자성 분리 전에 MACsTM 완충액에서 2회 세척한다. 자성 세포 분리기내의 칼럼을 이용하여, 세포 현탁액을 약 3-5 mL 완충액 중의 칼럼 (LS + Midi)에 적용한다. 음성 세포를 3 mL의 MACsTM 완충액으로 3회 세척하여 통과시킨다. 이어서 칼럼을 자장으로부터 제거하고, 양성 세포를 5 mL의 MACsTM 완충액으로 용출한다.
분리 후에, A2B5+ 또는 NCAM+ 세포를 N2 (Gibco 17502-014), B27 (Gibco 17504-010) 및 표시된 인자로 보충된 DMEM/F12 (Biowhittaker) 중의 폴리-라이신 및 라미닌으로 코팅된 플레이트상에 유지한다. 인자의 공급원을 표 2에 보여준다.
신경 세포 배양에 사용된 인자
성장인자 공급원 실제 농도
인간 EGF R & D Systems 10 ng/mL
인간 bFGF Gibco 10 - 25 ng/mL
인간 CNTF R & D Systems 1 - 10 ng/mL
인간 PDGF R & D Systems 1 ng/mL
인간 IGF-1 R & D Systems 1 ng/mL
전사 수준에서 발현의 RT-PCR 분석을 하기와 같이 수행한다: RNA 를 제조자의 지시에 따라 RNAeasy KitTM (Qiagen) 을 이용하여 세포로부터 추출하였다. 이어서 최종 산물을 DNase 로 절단하여 오염성 게놈 DNA 를 제거하였다. 10mM Tris pH 7.5, 10mM MgCl2 및 5mM DDT 를 함유하는 완충액 중의 RNA 가드 (Pharmacia Upjohn) 및 DNAse I (Pharmacia Upjohn) 중에서, RNA 를 37℃, 30-45 분 동안 인큐베이션하였다. 시료로부터 단백질을 제거하기 위하여, 페놀 클로로포름 추출을 수행하고, 3M 아세트산나트륨 및 100% 냉 에탄올로 RNA 를 침전시켰다. 이 RNA 를 70% 에탄올로 세척하고, 펠렛을 풍건 및 DEPC-처리수에 재현탁하였다.
역전사효소 (RT) 반응을 위해서, 500ng 의 전체 RNA 를 최종농도 1 ×First Strand Buffer (Gibco), 20mM DDT 및 25 ㎍/mL 랜덤 헥사머 (Pharmacia Upjohn) 와 배합하였다. 이 RNA 를 70℃ 에서 10 분 동안 변성시킨 후, 상온에서 10 분 동안 어닐링시켰다. dNTP 를 0.5 ㎕ 의 Superscript II RT (Gibco) 와 더불어 1 mM 의 최종 농도로 첨가하여, 42℃ 에서 50 분 동안 인큐베이션 후, 80℃ 에서 10 분 동안 열불활성화시켰다. 이어서 PCR 분석을 위해 처리하기 전까지 시료를 -20℃ 에 저장하였다. 표준 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 은 목적하는 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 하기의 반응 혼합물 중에서 수행하였다: cDNA 1.0㎕, 10 ×PCR 완충액 (Gibco) 2.5㎕, 10 ×MgCl2 2.5㎕, 2.5 mM dNTP 3.0㎕, 5μM 3'-프라이머 1.0㎕, 5μM 5'-프라이머 1.0㎕, Taq 0.4㎕, DEPC-수 13.6㎕.
실시예 1: NCAM-양성 세포
본 실험은 인간 배아 줄기 세포 (hES)가 NCAM-양성 선조세포로의 지정된 분화를 할 수 있는지를 결정하는데 중점을 두고 있다. hES 세포를 mEF-지지 배양물 또는 무기저층 배양물로부터 수확하고, 이어서 20% FBS를 함유한 배지를 사용하여 현탁액 배양물 중에 배상체 (EB) 형성을 통해 분화시킨다. 이어서 EB를 N2 보충물 (Gibco) 및 25 ng/mL 인간 bFGF로 보충된 DMEM/F12 배지 중의 피브로넥틴상에 있는 그대로 도말하였다. 약 2-3일 동안 배양한 후에, NCAM-양성 세포 및 A2B5-양성 세포를 면역염색법으로 동정하였다.
자성 비드 분류 및 면역팬닝은 NCAM-양성 세포를 농축하는데 성공적이었다. 세포의 출발 집단은 전형적으로 25-72% NCAM-양성 세포를 함유하였다. 면역-분리 후에, NCAM-양성 비율을 43-72%로 농축하였다. 결과를 표 3에 보여준다.
NCAM 양성 세포의 분화 및 분류 조건
분화에 사용된 hES 세포주 분화 배양에 사용된 인자 분류 유형 NCAM에 대해 양성으로 염색된 세포
분류 전 양성 분류 음성 분류
H13p28 CFN 비드 분류 33 92 41
H13p28 CFN 팬닝 25 n/a n/a
H9p32 CFN 팬닝 64 72 51
H1p32 CFN 비드 분류 27 77 9
H9p19 CFN 비드 분류 58 76 32
H9p31 545.184 CFN 비드 분류 50 91 67
H1p40 545.185 CFN 비드 분류 A 65 89 31
H1p40 545.185 CFN 비드 분류 B 63 81 33
H7NGp28/4 545.187 CFN 비드 분류 A 53 92 45
H7NGp28/4 545.187 CFN 비드 분류 A 72 87 50
H1p39 545.189 CFNIP 비드 분류 16 43 6
H7p32 667.004 CFNIP 비드 분류 25 73 10
H1p43 667.010 CFNIP 비드 분류 47 86 31
H1p44 667.012 CFNIP 비드 분류 52 89 34
H1p46 667.020 EPFI 비드 분류 60 23 8
H1p47 667.031 EPFI-EPFI 비드 분류 53 91 27
H1p47 667.033 CFN-F 비드 분류 41 76 24
H9p40MG 667.038 EPFI 비드 분류 55 80 25
인자 약어: C-모양 신경 영양 인자 (CNTF) F-염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) N-뉴로트로핀 3 (NT3) I-인슈린 유사 성장 인자 (IGF-1) P-혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) T-갑상선 호르몬 T3 Ra-레틴산 Fk-포스콜린
제시된 처음 10개의 실험에서, 분류로부터 회수된 NCAM 양성 세포를 N2 및 B27 및 2 mg/mL BSA, 10 ng/mL 인간 CNTF, 10 ng/mL 인간 bFGF 및 1 ng/mL 인간 NT-3을 함유하는 DMEM/F12 중의 폴리-L-라이신/라미닌상에 도말하였다. 이은 실험에서, 세포를 N2 및 B27 보충물 및 10 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1 ng/mL PDGF 및 1 ng/mL IGF-1을 갖는 DMEM/F12 에서 유지하였다.
도 1 (상단 패널)은 NCAM 양성 세포의 성장 곡선을 보여준다. 이 실험에서 연구된 세포를 현탁액 중에 4일 동안 20% FBS에서 배상체를 형성한 후, N2 및 B27 보충물 및 25 ng/mL bFGF를 함유한 DMEM/F12 중의 피브로넥틴 매트릭스상에서 2-3일 동안 도말하였다. 이어서 세포를 NCAM 발현에 대해 양성으로 분류하고, CNTF, bFGF, 및 NT3를 함유한 배지내에서 유지하였다. 분류된 세포는 미분류 집단에 비해 증가된 생존을 보여주지 않았다. NCAM 양성 세포의 일부는 또한 β-튜불린 III을 발현한다고 알려져 있는데, 이는 상기 세포가 뉴런을 형성하는 능력을 갖는다는 것을 나타낸다. 이들은 또한 뉴런 세포의 특징적인 형태를 갖는다. 신경교 선조세포를 나타낼 수 있는 상기 집단 내에 A2B5 양성 세포가 또한 존재하였다. 그러나, 성상교세포의 마커인 GFAP에 대해서는 양성 세포가 거의 없었다. 상기 세포 집단이 배양액 중에서 증식하지만, NCAM 양성 세포의 비율 (및 뉴런을 형성하는 능력)은 몇 번의 계대 후에 감소되었다.
실시예 2: A2B5-양성 세포
본 실험의 세포를 표면 마커 A2B5에 대해 면역 선발하였다. hES 세포를 유도하여 20% FBS 중의 EB를 형성하였다. 현탁액 중에서 4일 후에, EB를 10 ng/mL 인간 EGF, 10 ng/mL 인간 bFGF, 1 ng/mL 인간 IGF-1 및 1 ng/mL 인간 PDGF-AA로 보충된 N2 및 B27을 함유하는 DMEM/F12 중의 피브로넥틴상에 도말하였다. 상기 조건에서 2-3일 후에, 25-66%의 세포가 A2B5를 발현한다. 이 집단은 자성 비드 분류에 의해 48-93% 순도로 농축된다 (표 4).
A2B5-양성 세포의 분화 및 분류 조건
분화에 사용된 hES 세포주 분화 배양에 사용된 인자 분류 유형 NCAM에 대해 양성으로 염색된 세포
분류 전 양성 분류 음성 분류
H7p32 667.004 CFNIP 비드 분류 25 77 10
H1p43 667.010 CFNIP 비드 분류 62 n/a 50
H1p44 667.012 CFNIP 비드 분류 56 89 32
H1p46 667.020 EPFI 비드 분류 27 48 2
H1p47 667.032 EPFI 비드 분류 57 93 30
H9p40MG 667.038 EPFI 비드 분류 66 93 41
H9p42 667.041 EPFI 비드 분류 27 70 6
인자 약어: C-모양 신경 영양 인자 (CNTF) F-염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) N-뉴로트로핀 3 (NT3) I-인슈린 유사 성장 인자 (IGF-1) P-혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) T-갑상선 호르몬 T3 Ra-레틴산 Fk-포스콜린
도 2는 A2B5-양성 세포를 수득하는 전형적인 절차를 보여준다. 사용된 약어: MEF-CM = 마우스 배아 섬유아세포를 이용하여 배양함으로써 조절된 배지; +/- SHH = 음향 고슴도치의 존재 또는 부존재; D/F12 = DMEM/F12 배지; N2 및 B27, 배양 보충물 (Gibco); EPFI = 성장 인자 EGF, PDGF, bFGF, 및 IGF-1; PLL = 폴리-L 라이신 기질; PLL/FN = 폴리-L 라이신 및 피브로넥틴의 기질.
도 1 (하단 패널)은 분류된 A2B5-양성 세포의 성장 곡선을 보여준다. 세포를 폴리-L-라이신 코팅된 플레이트상에서 동일한 배지 제형에서 유지하였다. 연속적으로 계대할 경우에 세포는 증식한다.
실시예 3: A2B5-양성 세포의 성숙
포스콜린의 첨가로 A2B5-양성 세포를 유도하여 분화시켰다. 상기 세포를 표 5에 제시된 상이한 배양 계대를 통해 평가하였다.
성숙한 신경 세포의 표현형 특징
A2B5 분류 후 계대수 성숙 방법 뉴런 유사 형태 보임 하기에 대해 양성으로 염색된 세포:
β-튜불린 GFAP GalC A2B5 NCAM
1 PICNT+Fk 4일 보임 38±9% 13±7% 79±3% 28±6%
3 PICNT+Fk 2일 보임 +++ + +++++ ++
7 +/-EF +/-혈청 보임 + + ++ +++ -
인자 약어: C-모양 신경 영양 인자 (CNTF) F-염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) N-뉴로트로핀 3 (NT3) I-인슈린 유사 성장 인자 (IGF-1) P-혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) T-갑상선 호르몬 T3 Ra-레틴산 Fk-포스콜린
세포를 A2B5 발현에 대해 분류하지만, 집단은 희돌기세포 및 성상교세포뿐만 아니라, 대부분의 뉴런을 생성하는 능력을 증명하였다. 이것은 놀랍다: 이전에는 A2B5 발현 세포는 신경교 전구세포이고, 희돌기세포 및 성상교세포를 생성하는 반면, NCAM 발현 세포는 뉴런 전구세포이고, 성숙 뉴런을 생성한다고 생각되었다. 상기 실험은 pPS 세포가 배양에서 반복적으로 증식하고, 뉴런 및 신경교를 생성할 수 있는 세포 집단으로 분화할 수 있다는 것을 증명하였다.
실시예 4: 분화된 세포의 포유동물 뇌로의 이식
신경 전구세포의 이식을 두 가지 hES 세포주 유래의 세포를 이용하여 수행하였다: H1으로 표시된 세포주, 및 H7NHG로 표시된 유전적으로 변형된 세포주. H7NHG 세포주는 세포로 하여금 녹색 형광 단백질 (GFP)를 계속적으로 발현하게 하는 발현 카세트를 가지고 있다.
신생 Sprague Dawley 래트는 하기 세포 집단 중의 하나의 일방적인 선조체내 이식을 받았다:
- 미분화 hES 세포
- hES 세포 유래 배상체
- NCAM 발현에 대해 분류된 신경 전구세포 (실시예 1)
- A2B5 발현에 대해 분류된 신경 전구세포 (실시예 2)
대조군 동물은 그 위에서 미분화 hES 세포가 유지된, 광 조사된 마우스 배아 섬유아세포의 이식을 받았다. 세포 집단이 이식 후에 발생하는가를 결정하기 위해, 일부 동물을 희생하기 48시간 전에 시작하는 BrdU의 복강주사를 이용하여 펄스하였다. 이식 후 14일에, 래트를 4% 파라포름알데히드로써 관류(灌流)시키고, 조직을 면역조직화학적 분석을 위해 가공하였다.
도 3은 GFP를 발현하는 세포를 투여한 동물의 단편에서 관찰되는 형광을 보여준다. 생존하는 세포를 모든 이식된 군에서 검출하였다. 미분화 세포는 큰 세포 덩어리로서 나타났는데, 이는 주변 조직의 괴사 및 공포화(vacuolation) 부위의 조절되지 않는 성장을 제안한다 (왼쪽 패널). HI 세포로써 이식된 동물의 AFP의 면역염색은 미분화 hES 세포가 이식 후에 벽측 내배엽으로 변형되었다는 것을 보여주었다. 배상체는 거의 이동하지 않고 이식 코아에 남아 있었고, 또한 괴사 부위에 의해 둘러 싸였다 (중간 패널). 대조적으로, 분류된 NCAM-양성 세포는 단세포로서 나타났고, 이식 부위에서 먼 곳으로 약간의 이동을 보여주었다.
실시예 5: 성숙 뉴런으로의 분화
말단 분화된 뉴런을 생성하기 위해, 분화의 1단계는 10μM 레틴산 (RA)의 존재 또는 부재의 FBS 배지내의 배상체를 형성함으로써 유도하였다. 현탁액에서 4일 후에, 배상체를 10 ng/mL 인간 EGF, 10 ng/mL 인간 bFGF, 1 ng/mL 인간 PDGF-AA, 및 1 ng/mL 인간 IGF-1으로 보충된 단순 배지의 피브로넥틴 코팅된 플레이트상에서 도말하였다. 배상체가 플레이트에 부착하였고, 세포는 단층을 형성하면서, 플라스틱 상에서 이동하기 시작했다.
3일 후에, 뉴런 형태의 많은 세포를 관찰하였다. 신경 전구세포는 BrdU 혼입, 네스틴 염색에 대해 양성인 세포로서 확인되었고, 계통 특이적 분화 마커의 부재로서 확인되었다. 가상의 뉴런 및 신경교 선조세포는 폴리시알화 NCAM 및 A2B5에 대해 양성으로 확인되었다. 유세포 분석법 (flow cytometry)에 의해 측정한 바에 의하면, 세포의 41-60% 가 NCAM을 발현하였고, 20-66% 가 A2B5를 발현하였다. NCAM-양성 세포의 아집단은 β-튜불린 III 및 MAP-2를 발현하는 것으로 알려졌다. GFAP 또는 GalC와 같은 신경교 마커와 함께 위치하는 것은 없었다. A2B5 양성 세포는 뉴런 및 신경교를 생성하는 것으로 나타났다. A2B5 세포의 아집단은 β-튜불린 III 또는 MAP-2를 발현하였고, 별개의 아집단이 GFAP를 발현하였다. 뉴런 형태를 갖는 세포의 일부는 A2B5 및 NCAM 양자에 대해 이중으로 염색되었다. NCAM 양성 및 A2B5 양성 집단은 신경교보다 더욱 많은 뉴런을 함유하였다.
세포분열물질을 포함하지 않으나, 10 ng/mL 뉴로트로핀-3 (NT-3) 및 10 ng/mL 뇌 유래 신경영양인자 (BDNF)를 함유한 배지에서 세포를 재도말함으로써 세 포 집단을 더욱 분화시켰다. 상당한 과정을 거친 뉴런을 약 7일 후에 관찰하였다. 레틴산 (RA)에서 유지된 배상체 유래의 배양물은 RA (약 5%) 없이 유지된 것보다 더욱 많은 MAP-2 양성 세포 (약 26%)를 보여 주었다. GFAP 양성 세포는 패치에서 보였다. GalC 양성 세포가 확인되었으나, 세포는 복잡한 과정을 거친 것보다 크고, 평평하였다.
분화의 상이한 단계에서 발현된 세포 유형 및 마커의 요약을 표 6에 제공한다.
표현형 마커 (면역세포화학법)
미분화 hES 콜로니 NCAM-양성 선조세포 A2B5 양성 선조세포
Tra-1-60 + 네스틴 서브세트 네스틴 서브세트
Tra-1-81 + A2B5 서브세트 NCAM 서브세트
SSEA-4 + β-튜불린 III 서브세트 β-튜불린 III 서브세트
β-튜불린 III+ + Map-2 서브세트 Map-2 서브세트
네스틴 - GFAP - GFAP 거의 없음
Map-2 - GalC - GalC -
신경미세섬유(NF) - AFP - AFP -
GFAP - 근육 특이적 액틴 - 근육 특이적 액틴 -
GalC -
α-페토단백 -
근육 특이적 액틴 -
NCAM -
A2B5 -
뉴런 성상교세포 희돌기세포
β-튜불린 III + GFAP + GalC +
MAP-2 +
신경미세섬유(NF) 서브세트
GABA 서브세트
티로신 히드록실라아제 서브세트
글루타메이트 서브세트
글리신 서브세트
신경전달물질의 존재를 또한 평가하였다. β-튜불린 III 또는 MAP2를 함께 발현하며, 뉴런 세포의 특징적인 형태를 갖는 GABA-면역반응성 세포를 확인하였다. 뉴런 마커를 함께 발현하지 않으나, 성상교세포 유사 형태를 갖는 일부의 GABA-양성 세포를 확인하였다. 티로신 히드록실라아제 (TH) 및 MAP-2 양자를 발현하는 뉴런 세포를 확인하였다. 신경접합단백 항체를 이용한 염색으로 시냅스 형성을 확인하였다.
도 4는 인간 ES 세포의 H9 세포주로부터 분화된 배양물 중의 TH 염색을 보여준다. 배상체를 4일 동안 10μM 레틴산에서 유지한 후, EGF, 염기성 FGF, PDGF 및 IGF에서 피브로넥틴 코팅된 플레이트상에서 3일 동안 도말하였다. 다음에 이들을 10 ng/mL NT-3 및 10 ng/mL BDNF로 보충된 N2 배지의 라미닌상에 계대하고, 14일 동안 추가로 분화하게 하였다. 분화된 세포를 상온에서 20분 동안 2% 포름알데히드를 이용하여 고정한 후, 도파민성 세포에 대한 마커인 TH에 대한 항체를 이용하여 발색시켰다.
실시예 6: 칼슘 이미징
칼슘 유동의 표준 푸라-2 이미징을 사용하여 hES 세포 유래 뉴런의 기능성을 조사하였다. 연구된 신경전달물질에는 GABA, 글루타메이트 (E), 글리신(G), 증가된 칼륨 (5mM K+ 대신에 50mM K+), 아스코르브산 (대조군), 도파민, 아세틸콜린(ACh) 및 노르에피네프린이 포함된다. 용액은 래트 링거 (RR) 용액 (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES 완충액, 및 10 mM 글루코오스) 중에 0.5 mM 의 신경전달물질 (10 μM의 ATP 제외)을 함유하였다. 외부 용액을 NaOH를 이용하여 pH 7.4로 조절하였다. 1.2-1.8 mL/분으로 레코딩 체임버에서 세포를 관류시키고, 용액을 용기 입구의 약 0.2mL 위쪽에 위치한 0.2mL 루프 주사기를 이용하여 용기 적용에 의해 적용하였다. 칼슘의 일시적인 상승은, 칼슘 수준이 적용 60초 내에 기준선 값의 10%를 초과하여 증가하고, 1-2분 내에 기준선으로 되돌아온다면 반응성으로 고려된다.
도 5는 다양한 신경전달물질에 대한 신경-제한 전구세포의 반응을 보여준다. 패널 A는 두 가지의 상이한 덮개 유리상에서 단세포로부터의 방출 데이타의 비를 보여준다. 신경전달물질의 첨가는 상단의 표지된 삼각형으로 표시된다.
패널 B는 특정 신경전달물질에 반응한 시험 세포의 빈도를 보여준다. 패널 C는 관찰된 신경전달물질 반응의 조합을 보여준다. 시험한 53 종의 세포 중에서, 26 종이 GABA, 아세틸콜린, ATP 및 증가된 칼륨에 반응하였다. 집단의 유사한 서브세트가 작동약 (agonist)의 다른 조합에 반응하였다. 세포들 중에서 단지 2종이 적용된 임의의 작동약에 반응하지 못했다.
실시예 7: 전기생리
표준 전체 세포 패치-클램프 기술을 hES 세포 유래 뉴런상에서 수행하여, 전압-클램프 방식으로 생성된 이온성 전류, 및 전류-클램프 방식으로 생성된 활동 전위를 기록하였다. 외부 용기 용액은 래트 링거 용액이었다 (실시예 6). 내부 용액은 75 mM 아스파르트산 칼륨, 50 mM KF, 15 mM NaCl, 11 mM EGTA, 및 KOH를 이용하여 pH 7.2로 조절된 10 mM HEPES 완충액이었다.
시험한 모든 6 종의 세포는 나트륨 및 칼륨 전류를 나타냈고, 활동 전위를 자극했다. 수동막 성질을 -70 내지 -80 mV 의 전압 단계를 이용하여 결정하였고; 하기 데이타를 생성하였다: 평균 정전용량 (Cm) = 8.97 ±1.17 pF; 막 저항 (Rm) = 487.8 ±42.0 MΩ; 접속 저항 (Ra) = 23.4 ±3.62 MΩ. 세포를 -100 mV에 유지하고, -80 및 80mV 사이에서 10mV 씩 시험 전압으로 단계적으로 증가시켜, 이온성 전류를 측정하여, 하기 데이타를 생성하였다: 평균 나트륨 전류 INa = -531.8 ±136.4 pA; 평균 칼륨 전류 IK = 441.7 ±113.1 pA; INa (밀도) = -57.7 ±7.78 pA/pF; IK (밀도) = 48.2 ±10.4 pA/pF.
도 6은 전형적인 실험 결과를 보여준다. 패널 A는 -100 mV의 휴지 전위에서 -80 및 80 mV 사이의 시험 전위로 탈분극된 두 종의 세포에서 관찰된 나트륨 및 칼륨 전류를 보여준다. 패널 B는 관찰된 내부 (Na+) 및 외부 (K+) 피크 전류-전압 관계를 보여준다. 나트륨 전류는 -30 및 0 mV 사이에서 활성화되어, -10 또는 0 mV에서 피크에 이른다. 칼륨 전류는 -10 mV 이상에서 활성화되어, 20 및 40 mV 사이의 전압에서 나트륨 전류보다 양에 있어서 그 이상이 된다. 패널 C는 탈분극 자극에 반응하는 동일한 세포수 n에 의해 생성된 활동 전위를 보여준다. 세포막을 -80 또는 -150 pA의 전류로 -60 및 -100 mV 사이의 전압에서 유지하고, 짧은 기간 동안 탈분극하였다.
실시예 8: 신경 선조세포 유래의 도파민성 세포
배상체를 10 μM 레틴산을 함유한 현탁액에서 4일 동안 배양한 후, EGF, bFGF, PDGF, 및 IGF-1으로 보충된 단순 배지에서 3-4 일 동안 도말하였다. 이어서 세포를 자성 비드 분류 또는 면역팬닝에 의해 A2B5-양성 또는 NCAM-양성 농축 집단으로 분리하였다.
면역학적으로 선택된 세포를 10 ng/mL NT-3 및 10 ng/mL BDNF 로 보충된 단순 배지에서 유지하였다. 14일 후에, NCAM-분류된 세포의 25 ±4% 는 MAP-2 양성이었고, 이 중에서 1.9 ±0.8%는 GABA-양성이고, 3 ±1%는 도파민 합성의 율속단계 효소이며, 일반적으로 도파민-합성 세포의 대표적인 것으로 고려되는 티로신 히드록실라아제 (TH) 양성이었다.
NCAM 에 대해 분류된 세포 집단에서, NCAM 양성인 세포는 GFAP 또는 GalC와 같은 신경교 마커를 발현하지 않았다. 상기 데이타는 뉴런 제한 전구세포를 함유하는 집단이 hES 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있고, 신경교 전구세포로 본질적으로 오염되지 않았다는 것을 나타낸다.
그와는 반대로, A2B5에 대해 분류된 세포는 뉴런 및 성상교세포 양자를 생성하는 능력을 가진다. 농축 후에, 세포를 NT-3 및 BDNF로 보충된 단순 배지내로 위치하고, 14일 동안 분화하도록 하였다. 도말 후 처음 1-2 일 내에, A2B5 농축된 집단내의 세포는 과정을 확장하기 시작했다. 2주 후에, 세포는 성숙 뉴런의 형태를 취하였고, 세포의 32 ±3% 는 MAP-2 양성이었다. 중요하게, MAP-2 세포의 3 ±1% 는 TH-양성인 반면, 단지 0.6 ±0.3% 가 GABA 면역반응성이었다. 상기 데이타는 세포 집단이 도파민을 합성하는 것을 포함한, 성상교세포 및 뉴런 양자에 대한 선조세포를 포함하는 hES 세포로부터 수득될 수 있다는 것을 나타낸 다.
TH를 발현하는 뉴런을 수득하기 위한 조건의 추가의 상세한 것은 하기와 같이 수행하였다. 배상체를 1 mg/mL 콜라게나아제 (37℃, 5-20분)에서 인큐베이션하고, 접시를 긁어내고, 세포를 비부착성 배양 플레이트 (Costar
Figure 112002037326782-pct00005
)에 위치함으로써 계대 32에서 H7 세포주의 콘플루언트 hES 세포로부터 생성하였다. 생성된 EB를 FBS 및 10μM 모두-트랜스 레틴산을 함유하는 배지의 현탁액에서 배양하였다. 4일 후에, 집합체를 수합하고, 원심분리 튜브에서 가라앉게 하였다. 이어서 상층액을 흡입하고, 집합체를 증식 배지 (N2, 1/2 농도 B27, 10 ng/mL EGF (R & D Systems), 10 ng/mL bFGF (Gibco), 1 ng/mL PDGF-AAA (R & D Systems), 및 1 ng/mL IGF-l (R & D Systems)로 보충된 DMEM/F12 1:1)의 폴리 L-라이신 및 피브로넥틴 코팅된 플레이트상에서 도말하였다.
EB를 3일 동안 부착하여 증식하도록 한 후; 약 1분간 트립신 (Sigma) 처리하여 수합하고 1일 동안 증식 배지에서 폴리 L-라이신 및 라미닌 코팅된 4-웰 체임버 슬라이드상에서 1.5 ×105 세포/웰로 도말하였다. 이어서 배지를 B27 및 하기 성장 칵테일 중의 하나로 보충된 신경 기초 (Neural Basal) 배지로 교환하였다:
- 10 ng/mL bFGF (Gibco), 10 ng/mL BDNF, 및 10 ng/mL NT-3
- 10 ng/mL bFGF, 5000 ng/mL 음향 고슴도치, 및 100 ng/mL FGF8b
- 10 ng/mL bFGF 단독
2일 간격으로 공급하면서, 세포를 상기 조건에서 6일 동안 유지하였다. 7일에, 배지를 B27, 및 하기 칵테일 중의 하나로 보충된 신경 기초 배지로 교환하였다:
- 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL NT-3
- 1 μM cAMP, 200 μM 아스코르브산
- 1 μM cAMP, 200 μM 아스코르브산, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL NT-3
이들이 면역세포화학을 위해 고정되고, 항-TH 또는 MAP-2로써 표지될 경우 12일 까지 2일 간격으로 배양물에 공급하였다. 마커의 발현을 40 ×대물렌즈를 이용하여 3개의 웰의 각각에서 4 필드를 셈으로써 정량화하였다.
결과를 표 7에서 보여준다. bFGF, BDNF 및 NT-3에서 초기에 배양한 것이 가장 높은 비율의 TH 양성 세포를 수득하였다.
도파민성 뉴런의 제조 조건
배양 조건 MAP-2 양성(%) TH 양성인 MAP-2 세포 (%)
1-6일 6-12일
B,N,F B,N 26% 5.5%
B,N,F CA,AA 35% 4.0%
B,N,F CA,AA,B,N 25% 8.7%
F,F8,S B,N 37% 3.7%
F,F8,S CA,AA 34% 3.9%
F,F8,S CA,AA,B,N 21% 5.8%
F B,N 28% 3.5%
F CA,AA 26% 4.1%
F CA,AA,B,N 22% 5.7%
인자 약어: F-염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) F-FGF8 N-뉴로트로핀 3 (NT3) B-뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF) S-음향 고슴도치 CA-cAMP AA-아스코르브산
본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 적용은 당업자에게는 통상적인 최적화의 문제이고, 본 발명의 취지, 또는 첨부된 청구범위를 벗어나지 않고 수행될 수 있다고 이해된다.

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  29. 하기로 구성된, 신경 세포를 생성하는 두 개의 분리된 세포 집단 세트:
    영장류 만능 (pluripotent) 줄기 (pPS) 세포주를 함유하는 세포 집단; 및
    동일한 pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 뉴런 세포, 신경교세포, 또는 양자 모두를 형성하도록 지정된, 30% 이상의 신경 세포를 함유하는, 분화된 세포 집단.
  30. 하기로 구성된, 신경 세포를 생성하는 두 개의 분리된 세포 집단 세트:
    영장류 만능 줄기 (pPS) 세포주를 함유하는 세포 집단; 및
    동일한 pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 A2B5, 폴리시알화 NCAM, MAP-2, 또는 네스틴을 발현하는, 60% 이상의 신경 세포를 함유하는, 분화된 세포 집단.
  31. 하기로 구성된, 신경 세포를 생성하는 두 개의 분리된 세포 집단 세트:
    영장류 만능 줄기 (pPS) 세포주를 함유하는 세포 집단; 및
    동일한 pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 폴리시알화 NCAM을 발현하는, 30% 이상의 신경 세포를 함유하는, 분화된 세포 집단.
  32. 하기로 구성된, 신경 세포를 생성하는 두 개의 분리된 세포 집단 세트:
    영장류 만능 줄기 (pPS) 세포주를 함유하는 세포 집단; 및
    동일한 pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 β-튜불린 III를 발현하는, 38% 이상의 신경 세포를 함유하는, 분화된 세포 집단.
  33. 하기로 구성된, 신경 세포를 생성하는 두 개의 분리된 세포 집단 세트:
    영장류 만능 줄기 (pPS) 세포주를 함유하는 세포 집단; 및
    동일한 pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 A2B5를 발현하는, 50% 이상의 신경 세포를 함유하는, 분화된 세포 집단.
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  39. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 집단내의 세포의 30% 이상이 성숙 뉴런의 형태적 특징을 가지며 NCAM 양성인 세포 집단(들).
  40. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 집단내의 세포의 1% 이상이 티로신 히드록실라아제를 발현하는 세포 집단(들).
  41. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 집단이, NT-3 및 BDNF은 첨가하지만 세포분열물질은 첨가하지 않고 7일 동안 배양한 후 세포의 30% 이상이 성숙 뉴런의 형태적 특징을 가지며 NCAM 양성인 세포 집단을 생성시키는, 뉴런 선조세포 집단인, 세포 집단(들).
  42. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 집단이, NT-3 및 BDNF은 첨가하지만 세포분열물질은 첨가하지 않고 7일 동안 배양한 후 분화 집단내의 세포의 1% 이상이 티로신 히드록실라아제를 발현하는 세포 집단을 생성시키는, 뉴런 선조세포 집단인, 세포 집단(들).
  43. 제 39 항에 있어서, 성숙 뉴런의 형태적 특징을 갖는 세포가 3 가지 이상의 하기 특성을 갖는 세포 집단(들):
    a) 아세틸콜린을 투여한 때 세포의 60% 이상이 칼슘 유동을 보여줌;
    b) GABA를 투여한 때 세포의 60% 이상이 칼슘 유동을 보여줌;
    c) 노르에피네프린을 투여한 때 세포의 10% 이상이 칼슘 유동을 보여줌;
    d) 외부 칼륨 농도 50 mM 에 처해진 때 세포의 60% 이상이 칼슘 유동을 보여줌; 또는
    e) 전체 세포 패치 클램프 장치 내에서의 자극에 처해진 때 세포의 25% 이상이 활동 전위를 나타냄.
  44. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 집단내의 세포의 60% 이상이 폴리시알화 NCAM에 대해 양성인 세포 집단(들).
  45. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 집단내의 세포의 90% 이상이 폴리시알화 NCAM에 대해 양성인 세포 집단(들).
  46. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포 집단이, 뉴로트로핀의 존재하에 이를 배양함으로써 세포가 증식하는 능력 및 분화시 티로신 히드록실라아제 양성 뉴런을 형성시키는 능력이 유지된다는 특성을 갖는 세포 집단(들).
  47. 삭제
  48. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 집단내의 세포가 텔로머라아제 역전사효소를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포 집단(들).
  49. 3 가지 이상의 첨가된 뉴로트로핀, 세포분열물질, 또는 뉴로트로핀 및 세포분열물질과 함께 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포를 배양하여 분화시키는 것을 포함하며, 세포분열물질은 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)로부터 선택되고; 뉴로트로핀은 뉴로트로핀 3 (NT-3), 뇌 유래 신경영양인자 (BDNF), 및 모양 신경영양인자 (CNTF)로부터 선택되는, 1% 이상의 티로신 히드록실라아제 양성 세포를 함유하는 세포 집단을 생산할 수 있는 신경 전구세포를 수득하는 방법.
  50. 하기 중 어느 하나의 특성을 갖는 분화된 세포 집단이 수득될 때까지 3 가지 이상의 첨가된 뉴로트로핀, 세포분열물질, 또는 뉴로트로핀 및 세포분열물질과 함께 pPS 세포의 자손을 배양하는 것을 포함하며, 세포분열물질은 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)로부터 선택되고; 뉴로트로핀은 뉴로트로핀 3 (NT-3), 뇌 유래 신경영양인자 (BDNF), 및 모양 신경영양인자 (CNTF)로부터 선택되는, 영장류 만능 줄기 (pPS) 세포 유래의 신경 세포 집단을 생산하는 방법:
    pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 뉴런 세포, 신경교세포, 또는 양자 모두를 형성하도록 지정된, 30% 이상의 신경 세포를 함유함;
    pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 A2B5, 폴리시알화 NCAM, MAP-2, 또는 네스틴을 발현하는, 60% 이상의 신경 세포를 함유함;
    pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 폴리시알화 NCAM을 발현하는, 30% 이상의 신경 세포를 함유함;
    pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 β-튜불린 III를 발현하는, 38% 이상의 신경 세포를 함유함; 또는
    pPS 세포주의 자손인 것으로 규명되고 A2B5를 발현하는, 50% 이상의 신경 세포를 함유함.
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  53. 제 50 항에 있어서, 세포를 NT-3 및 BDNF 양자 모두를 이용하여 배양하는 방법.
  54. 제 50 항에 있어서, 세포를 PDGF 및 IGF-1 양자 모두를 이용하여 배양하는 방법.
  55. 제 50 항에 있어서, 세포를 피브로넥틴상에서 배양하는 방법.
  56. 제 50 항에 있어서, 뉴로트로핀 및 세포분열물질로 배양하기 전에 레틴산을 함유한 배지에서 pPS 세포를 예비분화시키는 것을 포함하는 방법.
  57. 제 50 항에 있어서, 뉴로트로핀 및 세포분열물질로 배양하기 전에 배상체를 형성함으로써 pPS 세포를 예비분화시키는 것을 포함하는 방법.
  58. 제 50 항에 있어서, A2B5 또는 폴리시알화 NCAM에 대해 양성인 세포를 선발하고 증식시키는 것을 포함하는 방법.
  59. 화합물, 및 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 세포 집단을 함유하는 배양물을 제조하는 단계; 상기 화합물과 접촉함으로 인해 발생하는 세포의 임의의 표현형 또는 대사과정의 변화를 측정하는 단계; 및 상기 변화를 신경 세포 독성 또는 조절과 연관시키는 단계를 포함하는, 신경 세포 독성 또는 조절용 화합물을 스크리닝하는 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 하나 이상의 하기 단계를 포함하는 스크리닝 방법:
    화합물이 세포에 독성인지를 측정하는 단계;
    화합물이 배양물내에서 유지되는 세포의 능력에 영향을 주는지를 측정하는 단계;
    화합물이 세포의 분화에 영향을 주는지를 측정하는 단계;
    화합물이 세포에 의한 신경전달물질 합성, 방출 또는 흡수를 변화시키는지를 측정하는 단계; 또는
    화합물이 세포의 전기생리를 변화시키는지를 측정하는 단계.
  61. 수술 또는 치료요법에 의한 인체 또는 동물체의 치료를 위하여 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 세포 집단을 함유하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 헌팅톤 무도병(Huntington's disease) 또는 발작의 치료를 위한 약제.
  62. 개인의 중추신경계 (CNS) 기능을 재구성하거나 보충하기 위한 약제의 제조에서 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 분화된 세포 집단을 사용하는 방법.
  63. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 분리되거나 그러한 세포의 자손인 세포 집단(들).
  64. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포인 세포 집단(들).
  65. 제 49 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 분리되거나 그러한 세포의 자손인 방법.
  66. 제 49 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
  67. 제 50 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 분리되거나 그러한 세포의 자손인 방법.
  68. 제 50 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
  69. 제 59 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 분리되거나 그러한 세포의 자손인 방법.
  70. 제 59 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
  71. 제 62 항에 있어서, pPS 세포가 인간 포배로부터 분리되거나 그러한 세포의 자손인 방법.
  72. 제 62 항에 있어서, pPS 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
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