DE10134667A1

DE10134667A1 - Verfahren zur Herstellung isolierter Zellkulturen, Kulturmedium zur Kultivierung von Zellkulturen und Zellkultur

Info

Publication number: DE10134667A1
Application number: DE10134667A
Authority: DE
Inventors: Johannes Schwarz; Sigrid Schwarz
Original assignee: Neuroprogen GmbH Leipzig
Current assignee: Neuroprogen GmbH Leipzig
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2003-02-06
Also published as: CA2454552A1; AU2002336930A1; WO2003010304A3; EP1409651A2; US20040265996A1; WO2003010304A2; JP2004536606A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Zellkulturen, enthaltend eine Vielzahl von Zellen, wobei ein oder mehrere Verfahrensschritte aus der Gruppe Expansion der Zellkultur und Modifikation der Zellen der Zellkultur in einem Kulturmedium umfasst. Um eine schnellere und bezüglich der vorhandenen Zellen gleichmäßigere Kultivierung zu erreichen, wird vorgeschlagen, eine Zellkultur zu verwenden, bei der die Zellen bei dem Verfahrensschritt zu einem wesentlichen Anteil als Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen, bei denen die Zell-Zell-Wechselwirkungen durch externe Einwirkung auf das Kulturmedium ohne Beschädigung des überwiegenden Anteils der Zellen unter Überführung der Agglomerate in separate Einzelzellen auftrennbar sind. Vorzugsweise erfolgt die Expansion und/oder Modifikation der Zellen unter Kulturbedingungen, die die für die Ausbildung von Zell-Zell-Adhäsionen verantwortlichen Rezeptoren der Zellen zumindest teilweise blockiert. Das Kulturmedium kann eine Ca·2+·-Konzentration von 0,5 mmol/l Kulturmedium und/oder Inhibitoren aufweisen, die für Zell-Zell-Wechselwirkungen eingehende Rezeptoren der Zellmembran der Zellen spezifisch sind.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Zellkulturen, insbesondere zur Herstellung isolierter Zellkulturen, enthaltend eine Mehrzahl von Zellen, wobei das Verfahren einen oder mehrere Verfahrensschritte aus der Gruppe der Expansion und Modifizierung der Zellkultur in einem Kulturmedium umfasst. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Kulturmedium zur Expansion oder Modifikation einer Zellkultur mit einer Mehrzahl von Zellen. Ferner betrifft die Erfindung eine Zellkultur, bestehend aus einer Vielzahl von Zellen, die aus einem Kulturmedium erhalten wurde, in welchem eine Mehrzahl von Zellen expandiert und/oder modifiziert wurde.
Üblicherweise werden Zellkulturen in einem Kulturmedium expandiert, d. h. die Zellzahl in der Zellkultur durch Vermehrung der Zellen erhöht, und/oder modifiziert, wobei eine oder mehrere Zellen in das Expansionsmedium überführt werden, welches üblicherweise für die Zellvermehrung oder Modifikation notwendige oder förderliche Komponenten enthält. Bei der Kultivierung der Zellen erfolgt ab gewissen Zellkonzentrationen in dem Kulturmedium eine Ausbildung von Zell-Zellkontakten, wodurch sich eine Vielzahl von Zellen zu zusammenhängenden Zellhaufen verbinden, die oft nur unter Zugabe von Verdauungsenzymen und mit einem hohen Zellverlust getrennt werden können. Insbesondere bei postmitotischenen neuronalen Zellen beziehungsweise deren Vorläuferzellen (sogenannte Progenitorzellen) werden derartige Zellhaufen als Neurospheres bezeichnet. Diese Neurospheres sind derzeit die am weitesten verbreitete Expansionsform neuronaler Vorläuferzellen. Derartige Neurospheres wachsen in Suspensionskulturen, wobei sich die Erfindung insbesondere auf Neurospheres bezieht, bei denen das Wachstum der Zellen insbesondere abhängig sein kann von EGF (Epidermal Growth Factor) und/oder FGF (Fibroblast Growth Factor) und/oder LIF (Leukemia Inhibitory Factor), die Zellen erfordern zum Wachstum jedoch nicht CEE (Hühnerembryoextrakt). Derartige Zellhaufen oder "Spheres" sind nicht auf Neurospheres beschränkt, sondern können auch bei anderen Zelltypen auftreten.
Die Expansion von Progenitorzellen, insbesondere von neuronalen Progenitorzellen, erfolgte bisher über die Expansion derartiger Zellhaufen (Spheroide bzw. Neurospheres). Diese Zellhaufen bilden ein relativ kompaktes Gewebe mit einer Zellzahl von wenigen bis hin zu mehreren Millionen adherierender Zellen (Zellhaufendurchmesser: typischerweise 0.01-5 mm), wobei insbesondere die zentralen Bereiche dieser Zellhaufen (oder Zellkugeln) zur Differenzierung oder zur Nekrose neigen. Diese zentralen Abschnitte der Spheroide gehen in aller Regel bei Andauung dieser Zellhaufen verloren. Eine Verkleinerung der Spheroide bis hin zur Gewinnung von Einzelzellsuspensionen ist aber für viele Kulturtechniken (z. B. Subklonierung, Transfektion, Zellsortierung, Zellzählung) zwingend erforderlich. Ferner wird durch die Bildung der Zellhaufen die Zugänglichkeit der Membranrezeptoren der nicht unmittelbar mit dem Kulturmedium in Kontakt stehender und innerhalb des Zellhaufens angeordneten Zellen behindert. Hierdurch wird zum einen die Vermehrung der Zellen durch die behinderte Zugänglichkeit des Nährmediums behindert, zudem werden Manipulationen der Zellen durch exogene Faktoren, die beispielsweise die Differenzierung der Zellen oder andere Transformationen der Zellen bewirken sollen, behindert.
Eine möglichst effiziente Expansion und/oder Modifizierung von Zellen stellt eine in vielen Anwendungsbereichen wichtige Voraussetzung dar, beispielsweise bei der Bereitstellung von neuronalen Progenitoren als Ressource für die restaurative Therapie neurologischer Erkrankungen wie dem Morbus Parkinson, dem Morbus Alzheimer oder anderen, wie sie beispielsweise in der WO 00/78931 beschrieben wurden. Es besteht somit ein allgemeines Bedürfnis, die Einwirkung von Kultur- oder Manipulationsmedien auf die Zellen im Kulturmedium zu erhöhen und zu vergleichmässigen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem die Expansion und/oder Modifizierung von Vorläufer-Zellen schneller und/oder bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen des Kulturmediums gleichmässiger erfolgt. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Zellkultur bereitzustellen, welche eine schnellere Vermehrung von insbesondere Vorläufer-Zellen, die zur Bildung von Zellhaufen neigen, ermöglicht sowie die Modifikationen der Zellen durch exogene Faktoren erleichtert.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Kultivierung von Vorläufer-Zellen, insbesondere zur Herstellung isolierter Zellkulturen von Vorläufer-Zellen, gelöst, bei welchem die Vorläufer-Zellen bei der Expansion und/oder Modifikation zu einem wesentlichen Anteil als Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen vorliegen, insbesondere mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Vorläufer-Zellen, und somit keine Aggregate enthaltend Vorläufer-Zellen mit deutlichen Zell-Zellkontakten entstehen. Andererseits können aber auch Zellen, insbesondere Vorläufer-Zellen und/oder neuronale Zellen, die bisher als Spheroide expandiert wurden, durch die Überführung in die erfindungsgemässen Nährmedien in Einzelzellsuspensionen überführt werden, wobei die adhäsiven Zell-Zell-Wechselwirkungen der Agglomerate durch externe Einwirkung auf das Kulturmedium ohne Beschädigung des überwiegenden Anteils der Zellen unter Überführung der Agglomerate in separierte Einzelzellen auftrennbar sind. Die Expansion und/oder Modifikation der Vorläufer-Zellen und/oder neuronalen Zellen, kann dann an Zellen, die als Einzelzellen und/oder als Agglomerate mit den oben gekennzeichneten schwachen adhäsiven Zell-Zell- Wechselwirkungen vorliegen, erleichtert bzw. gleichmässiger durchgeführt werden, da in dem Kulturmedium enthaltene Nährstoffe oder andere Wirkstoffe wie Wachstumsstoffe, Koenzyme, Plasmide, Vektoren oder dergleichen den Zellen wesentlich leichter zugänglich sind. Hierdurch kann beispielsweise eine beschleunigte Vermehrung der Zellen verglichen mit den in Zellhaufen (Spheres) vorliegenden Zellen erfolgen. Entsprechendes gilt für Zellen, die in Agglomeraten mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen.
Insbesondere enthält die erfindungsgemäße Zellkultur oder die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zellkultur teilweise, vorzugsweise mehr als 25% oder mehr als 50%, besonders bevorzugt mehr als 75% (jeweils bezogen auf die Gesamtzellzahl der Kultur oder auf eine repräsentative Probe) oder praktisch ausschließlich, Vorläuferzellen (auch Progenitorzellen genannt).
Vorläufer-Zellen im Sinne der Erfindung sind pluripotente (von omnipotenten Stammzellen verschiedene), teilungsfähige Zellen, die durch Einwirkung exogener Faktoren in bestimmte oder nur in bestimmte Zelltypen ausdifferenzieren können. Bei unterschiedlichen exogenen Faktoren oder Einwirkungsbedingungen können qualitativ oder quantitativ unterschiedlich ausdifferenzierte Zellen einer begrenzten Anzahl möglicher Zelltypen resultieren. Die resultierenden Zellen können sich bei Einwirkung unterschiedlicher exogener Faktoren in ihrer Zusammensetzung in qualitativer oder quantitativer Hinsicht unterscheiden, beispielsweise in dem Sinne, dass bei Einwirkung eines ersten exogenen Faktors überwiegend ein erster Zelltyp und bei Einwirkung eines verschiedenen exogenen Faktors ein anderer Zelltyp überwiegend oder ausschliesslich entsteht.
Im speziellen sind neuronale Vorläufer-Zellen solche, die ausschliesslich oder unter bestimmten Kultivierungsbedingungen überwiegend in neuronale Zellen und/oder gliale Zellen differenzieren können. Die neuronalen Zellen können ausschliesslich oder vorzugsweise einen oder mehrere neuronale Zelltypen der Gruppe dopaminerge, cholinerge, serotoninerge und/oder GABAerge Neuronen umfassen, wobei in Abhängigkeit von den exogenen Faktoren oder Einwirkungsbedingungen die Anteile der Zelltypen variieren können.
Ferner seien unter neuronalen Vorläuferzellen im weiteren Sinne alle dem Gehirn entnehmbaren Vorläuferzellen (ausgenommen Stammzellen) verstanden.
Neuronale Zellen im Sinne der Erfindung sind vorzugsweise postmitotische Zellen.
Vorzugsweise liegen erfindungsgemäße Zellkulturen vor bzw. werden im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, bei denen die Verfahrensschritte der Expansion und/oder Modifizierung nicht Tumorzellen betreffen. Vorzugsweise sind die erfindungsgemässen bzw. im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Zellkulturen praktisch frei von Tumorzellen, d. h. enthalten weniger als 5% Tumorzellen bezogen auf die Gesamtzellzahl oder keine nachweisbaren Anteile. Unter Tumorzellen seien hier insbesondere sowohl benigne als auch maligne Tumorzellen, d. h. metastasierende Tumorzellen mit infiltrierendem Wachstum, verstanden.
Unter Zellen im Sinne der Erfindung seien im folgenden sofern nicht explizit etwas anderes gesagt ist oder sich dies aus dem Zusammenhang ergibt stets Vorläuferzellen, insbesondere neuronale Vorläufer-Zellen, verstanden.
Unter Zell-Zell-Kontakten im Sinne der Erfindung seien im folgenden sofern nicht explizit etwas anderes gesagt ist oder sich dies aus dem Zusammenhang ergibt stets Vorläuferzell-Kontakte oder Kontakte zwischen Vorläuferzellen und anderen Zellen, insbesondere weiter oder vollständig ausdifferenzierten Zellen, im speziellen weiter oder vollständig ausdifferenzierten neuronalen Zellen, oder Kontakte zwischen neuronalen Zellen untereinander verstanden.
Unter einer Modifizierung der Zellen im Sinne der Erfindung sei jegliche Änderung eines Merkmales der Zellen verstanden, insbesondere bezüglich einer nachfolgenden Expansion und/oder Differenzierung, einschliesslich einer Änderung bezüglich der Expression eines Gens. Eine Modifizierung kann insbesondere durch eine Differenzierung, insbesondere eine partielle Differenzierung, ein Priming, eine genetische Manipulation wie Transfektion oder ähnliche allgemein bekannte Verfahren erfolgen.
Unter Zell-Zell-Kontakte im Sinne der Erfindung fallen direkte Zell-Zell-Kontakte, bei denen Zellen untereinander durch direkte Zell-Zell-Wechselwirkungen aneinander haften, beispielsweise vermittels Adhäsionsproteinen wie Cadherine, Selectine und/oder Immunoglobuline, ohne auf diese beschränkt zu sein. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Zell-Zell-Kontakte mit homotypischen Wechselwirkungen oder mit heterotypischen Wechselwirkungen aufgehoben werden, um die Bildung von Zellhaufen zu vermeiden, wobei diese Zell-Zell-Kontakte "anfängliche" Kontakte sind, die einer Zell-Verbindung mit gewebestabilisierenden, einen Stoffaustausch ermöglichenden oder anderen Eigenschaften, die zu einer Ergänzung der Wirkung der Zellen untereinander führen, wie die Ausbildung von Tight Junctions, Desmosomen oder Gap Junctions, vorgelagert sind.
Ferner seien unter Zell-Zell-Kontakten im Sinne der Erfindung indirekte Zell-Zell-Kontakte verstanden, bei denen die Zellen untereinander zumindest teilweise durch eine extrazelluläre Matrix miteinander verbunden sind. Eine extrazelluläre Matrix im Sinne der Erfindung stellt insbesondere eine Ansammlung sezernierter Proteine und Kohlehydrate dar, die den Raum zwischen den Zellen eines tierischen Gewebes füllt und die Kollagene und/oder Proteoglycane enthalten kann. Allgemein gesagt kann jedes organische oder nichtorganische Material mit erhöhter Strukturfestigkeit gegenüber dem Kulturmedium, insbesondere durch Phasengrenzen gegenüber dem Kulturmedium abgetrenntes Material, als Matrix angesehen werden, wie beispielsweise organische Gewebematerialien, insbesondere tierisches Zellgewebe, anorganische Strukturmaterialien oder Strukturmaterialien wie Gefäßwandungen jeglicher Art.
Die in dem erfindungsgemässen Verfahren bzw. Zellkulturen vorliegenden, eingesetzten und/oder erhaltenen Zellagglomerate weisen vorzugsweise weniger als 100 Zellen, insbesondere Vorläufer-Zellen, besonders bevorzugt 2 bis 16 Zellen, insbesondere Vorläufer-Zellen, je Zellhaufen auf. Die Agglomerate sind durch schwache externe Einwirkungen, insbesondere durch schwache mechanische Einwirkungen, in Einzelzellen separierbar. Die Separation der Agglomerate durch schwache mechanische Einwirkungen kann beispielsweise durch einfaches Pipettieren, durch Rühren mit geringer Rührgeschwindigkeit, beispielsweise im Bereich von 50 bis 250 Umdrehungen pro Minute, wobei gegebenenfalls auch niedrigere oder höhere Rührgeschwindigkeiten anwendbar sind, durch Ultraschall oder durch andere geeignete Weise erfolgen, solange keine Beschädigung des überwiegenden Anteils der Zellen, insbesondere der Vorläufer-Zellen, der Zellkultur erfolgt. Die externe Einwirkung auf die Agglomerate zur Auftrennung derselben erfolgt vorzugsweise derart, dass eine Beschädigung der Zellen, insbesondere der Vorläufer-Zellen, nur in untergeordnetem Ausmaß (vorzugsweise < 20 oder < 5 bis 10% oder < 1% der Zellen bzw. Vorläuferzellen) erfolgt, besonders bevorzugt erfolgt keine signifikante Beschädigung der Zellen. Eine Beschädigung der Zellen wird dann angenommen, wenn die Zellen in ihrem Proliferations- oder Differenzierungsverhalten wahrnehmbar durch die externe Einwirkung beeinflusst oder wenn die Zellenmembranen zerstört werden.
Die Kultivierung, d. h. die Expansion und/oder Modifizierung, der Zellkultur erfolgt vorzugsweise an einer Zellkultur, bei welcher der Anteil der Zellen, der als Einzelzellen oder als Zellagglomerate mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen vorliegt bezogen auf die Gesamtzellzahl der Kultur mehr als 25%, vorzugsweise mehr als 50%, besonders bevorzugt mehr als 75%, insbesondere mehr als 95% oder mehr als 99% beträgt oder bei der praktisch sämtliche Zellen der Zellkultur als einzelne Zellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen. Besonders bevorzugt beträgt der Anteil der Zellen an der Gesamtzellzahl der Kultur die als Einzelzellen vorliegen mehr als 25%, vorzugsweise mehr als 50%, mehr als 75% oder insbesondere mehr als 95% oder mehr als 99% bis praktisch 100%. Die obigen Angaben zu dem Anteil der Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl versteht sich als Anteil an Vorläuferzellen, als Anteil an neuronalen Vorläufer- Zellen oder alternativ als Anteil an neuronalen Zellen.
Die als Einzelzellen und/oder in Form von Agglomeraten mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegenden Zellen, insbesondere Vorläufer-Zellen, im speziellen neuronale Vorläufer-Zellen, oder neuronale Zellen, können in dem Kulturmedium mit einer Zellzahl von 100 bis 10.000.000 Zellen oder mehr/ml Kulturmedium, vorzugsweise 1000 bis 1.000.000 Zellen/ml Kulturmedium, besonders bevorzugt 10.000 bis 500.000 Zellen/ml Kulturmedium vorliegen. Insbesondere können die Zellen mit einer Zellzahl von ca. 100.000 bis 500.000 Zellen/ml Kulturmedium vorliegen.
Die Kultivierung der Vorläufer-Zellen und/oder neuronalen Zellen erfolgt vorzugsweise unter Bedingungen, die die Aktivität der für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlichen Rezeptoren der Zellen zumindest teilweise blockiert. Eine Blockierung kann hierbei beispielsweise dadurch erfolgen, dass unter den Kulturbedingungen eine Expression oder Aktivierung der die Zell-Zell-Adhäsion bewirkenden Rezeptoren verhindert wird, indem beispielsweise ein zur Aktivierung der Rezeptoren notwendiger Stoff den Rezeptoren nicht zugänglich gemacht wird, indem dieser beispielsweise dem Kulturmedium nicht zugesetzt wird oder indem Maskierungsmittel dem Kulturmedium zugegeben werden, die eine Anbindung des aktivierenden Stoffes an den Rezeptoren verhindern. Zusätzlich oder alternativ können dem Kulturmedium Stoffe zugegeben werden, die eine unmittelbare Blockierung der Rezeptoren ergeben, beispielsweise indem diese Stoffe an die Rezeptoren anbinden und hierdurch Zell-Zell-Adhäsionen unterbinden. Des weiteren seien unter einer Blockierung der Rezeptoren auch Maßnahmen verstanden, die zu einem Abbau, insbesondere einem selektiven Abbau, der Rezeptoren führen.
Die Verfahrensschritte des erfindungsgemässen Verfahrens, insbesondere die Expansion und/oder Modifizierung der Zellen bzw. Vorläufer-Zellen, insbesondere neuronale Vorläufer-Zellen, erfolgt daher vorzugsweise an Zellen die in einem Zellstadium vorliegen, in dem diese Zellen bei geeigneten Kulturbedingungen Adhäsionsmoleküle exprimieren können, insbesondere PSA-N-CAM und/oder N-Cadherin und/oder L1. Entsprechend beziehen sich die erfindungsgemässen Zellkulturen vorzugsweise auf solche, bei denen die Zellen in einem Zellstadium vorliegen, in dem diese bei geeigneten Kulturbedingungen Adhäsionsmoleküle exprimieren können, insbesondere PSA-N-CAM und/oder N-Cadherin und/oder L1.
Vorzugsweise erfolgt die Manipulation der Vorläufer-Zellen und/oder neuronalen Zellen unter Kulturbedingungen, unter welchen mehr als 25%, vorzugsweise mehr als 75%, besonders bevorzugt mehr als 90% oder mehr als 95% der für die Zell-Zell-Adhäsion und/oder für Multiadhäsivproteine spezifischen Rezeptoren der Zellen blockiert sind. Insbesondere können mehr als 99% oder praktisch alle der Rezeptoren blockiert sein.
Die Manipulation der Zellkultur kann insbesondere unter Bedingungen erfolgen, bei welcher für Adhäsionsmoleküle spezifische Zellrezeptoren der Vorläufer-Zellen und/oder neuronalen Zellen, die direkte Zell-Zell-Kontakte generieren, teilweise oder vollständig blockiert sind. Derartige Zellrezeptoren, die in die Zellmembranen der jeweiligen Zellen integriert sein können, können insbesondere Cadherine, Selektine, Integrine und/oder Rezeptoren der Immunoglobulin- (Ig-)Superfamilie wie insbesondere N-CAM, im besonderen ploysialyliertes, vorzugsweise embryonales, N-CAM (PSA-N- CAM) und/oder I-CAM und/oder L1, ohne auf diese beschränkt zu sein, sein.
So kann beispielsweise PSA-N-CAM wirksam über Endoneuraminidase inaktiviert bzw. seine Expression durch eine Hemmung von NF-kappaB reduziert werden. Das Kulturmedium enthält somit vorzugsweise wirksame Anteile an Kohlehydrate spaltenden Enzymen wie Endoneuraminidase, um mehr als 10 oder mehr als 25%, vorzugsweise mehr als 75%, besonders bevorzugt mehr als 95% oder mehr als 99% oder praktisch vollständig PSA-N-CAM zu blockieren. Entsprechend können durch geeignete Inhibitoren die anderen genannten Zellrezeptoren blockiert werden, insbesondere N-Cadherin und/oder L1.
Ferner kann die Manipulation der Zellkulturen, alternativ oder kumulativ, unter Bedingungen erfolgen, bei denen für Multiadhäsivproteine spezifische Zellrezeptoren teilweise oder vollständig blockiert sind. Als derartige Multiadhäsivproteine, die in der extrazellulären Matrix vorkommen und Wechselwirkungen mit Kollagenen und Proteoglyconen eingehen können, seien beispielhaft Fibronectine genannt, die mittels spezieller Integrine an Zelloberflächen anhaften können.
Eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung isolierter Zellkulturen liegt vor, wenn die Expansion und/oder Manipulation der Vorläufer-Zellen und/oder neuronalen Zellen der Zellkultur in einem Kulturmedium erfolgt, welches eine wirksame Ca²⁺- Konzentration von ≤ 1 mmol/l Kulturmedium, vorzugsweise ≤ 0,5 mmol/l Kulturmedium, besonders bevorzugt ≤ 0,1 mmol/l aufweist. Vorzugsweise ist die Gesamtkonzentration an Ca²⁺- Ionen in dem Kulturmedium gleich der wirksamen Konzentration. Gegebenenfalls kann eine Maskierung der Ca²⁺-Ionen durch geeignete Maskierungsmittel, die die Konzentration an freien Ca²⁺-Ionen, die an die für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlichen Rezeptoren ankoppeln kann, verringert, erfolgen. Als derartige Mittel können beispielsweise Komplexierungsmittel wie beispielsweise EGTA, EDTA, Kronenether oder andere geeignete Mittel verwendet werden.
Das Kulturmedium kann gegebenenfalls bis auf unvermeidliche Verunreinigungen frei von Ca²⁺-Ionen sein, vorzugsweise ist das Medium nicht frei von Ca²⁺-Ionen. Es hat sich verschiedentlich ein Mindestgehalt an Ca²⁺-Ionen von 0,001-0,1 mmol/l, insbesondere 0,01 oder 0,05 bis 0,1 mmol/l Kulturmedium als günstig erwiesen.
Des weiteren enthält das Kulturmedium vorzugsweise eine nur geringe Magnesiumionen-Konzentration oder ist bis auf unvermeidbare Verunreinigungen frei von Magnesiumionen. Insbesondere kann die Magnesium-Konzentration in dem Kulturmedium ≤ 2 mmol/l Kulturmedium, vorzugsweise ≤ 1 mmol/l Kulturmedium, insbesondere ≤ 0,6 oder ≤ 0,1 mmol/l Kulturmedium liegen.
Zur Blockierung der Rezeptoren, die für die Ausbildung von adhäsiven Zell-Zell-Kontakten spezifisch sind, kann die Expansion und/oder Modifizierung der Zellen in Gegenwart von Inhibitoren (z. B. Rezeptorantagonisten, Rezeptorantikörper oder Antisense gegen entsprechende Rezeptor-RNA) erfolgen, die für die die Zell-Zell-Kontakte ausbildenden Rezeptoren der Zellmembranen der zu expandierenden Zellen spezifisch sind.
Insbesondere kann die Kultivierung des Zellmediums mit einem Kulturmedium erfolgen, das wirksame Mengen eines oder mehrerer Inhibitoren aufweist, die für Caderine, Selektine, Integrine und/oder Immunoglobuline (Ig-Familie) spezifisch sind, insbesondere für PSA-N-CAM, N-Cadherin und/oder L1. Diese Inhibitoren lagern sich unmittelbar an die Rezeptoren an und blockieren so eine Zell-Zell-Adhäsion. Für E-, P-, N-Cadherine spezifische Inhibitoren sind bevorzugt, das Kulturmedium kann auch für Cadherine anderen Typs spezifische Inhibitoren aufweisen. Das Kulturmedium kann alternativ oder zusätzlich Inhibitoren für Rezeptoren der N-CAM (insbesondere PSA-N-CAM) und/oder ICAM-Familie und/oder für L1 spezfische Rezeptoren aufweisen. Die Inhibitoren können in dem Kulturmedium in Konzentrationen vorhanden sein, die ausreichen, alle oder einen gewünschten Anteil der Rezeptoren zu blockieren.
Die Inhibitoren können jeweils einzeln und/oder bei gleichzeitiger Anwesenheit mehrerer verschiedener Inhibitoren insgesamt, in Konzentrationen im Bereich von ca. 0,001 bis ca. 10 µMol/l Kulturmedium, beispielsweise 0,01 bis 1 µ Mol/l oder 0,1 bis 1 µMol/l, vorliegen. Die Inhibitionen können ggf. auch in niedrigeren oder höheren Konzentrationen vorliegen, beispielsweise in Abhängigkeit von der Ca²⁺- Ionenkonzentration des Kulturmediums, sofern eine ausreichende Blockierung der Rezeptoren erfolgt.
Das Kulturmedium kann auch sowohl einen niedrigen Gehalt an Ca²⁺-Ionen, beispielsweise ≤ 0,1 mmol/l Kulturmedium in Gegenwart von für Zell-Zell-Adhäsionsrezeptoren spezifische Inhibitoren aufweisen, um den Anteil der Einzelzellen und/oder Agglomeraten mit schwachen adhäsiven Zell-Zell- Wechselwirkungen an der Gesamtzellzahl in dem Kulturmedium einzustellen.
Besonders bevorzugt ist es, wenn die Manipulation der Einzelzellen und/oder Zellagglomerate mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen bei einer hohen Telomerase-Aktivität der Zellen erfolgt. Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt einen mindestens 2fachen Anstieg der Telomerase-Aktivität gegenüber aus Nagetieren oder humanem Gewebe gewonnenen Progenitorzellen und diese Methode verhindert zusätzlich die Reduktion der Telomeraseaktivität in neuronalen Progenitoren aus humanem Gewebe, welche bei den bisherigen Kulturtechniken beobachtet wurde.
Hierbei ist insbesondere die Verwendung calciumarmer Kulturmedien besonders vorteilhaft, da durch den niedrigen Calciumgehalt neben einer fehlenden Aktivierung von Adhäsionsmolekülen zugleich auch die Telomerase nur wenig oder praktisch nicht inhibiert wird. Die Inhibition der Telomerase kann weniger als 50% bezogen auf die in dem Kulturmedium vorhandene vollständig aktivierte Telomerase, vorzugsweise weniger als 75%, besonders bevorzugt weniger als 90 % betragen. Durch die hohe Telomerase-Aktivität wird zugleich der Zellzyklus verkürzt und die Seneszenz der Zellen aufgehoben oder verringert.
Die Telomerase-Aktivität kann beispielsweise mit einem PCR ELISA nach dem "Telomeric Repeat Amplification Protocol" (TRAP) bestimmt werden. Gemäss der Figur wird in einem TRAP-Assay bei einer erfindungsgemässen Zellkutur bei Ca²⁺- Ionenkonzentrationen von 0,01 bis 0,5 mM/L, insbesondere im Bereich von 0,01 bis 0,1 mM/l, verglichen mit einer Kontrollprobe C einer Tumorzellinie eine ausgeprägte Telomeraseaktivität gefunden. Bei sehr hohen Ca²⁺- Ionenkonzentrationen oder in Ca²⁺-freiem Medium wird demgegenüber eine nur geringe oder praktisch keine Telomeraseaktivität gefunden.
Das erfindungsgemässe Verfahren und das erfindungsgemässe Kulturmedium können insbesondere, ohne hierauf beschränkt zu sein, in Zusammenhang mit dem Verfahren nach der WO 00/78931 eingesetzt werden, das auf dem Konzept basiert, neuronale Progenitorzellen in Kultur zu halten und zu vermehren. Nach ausreichender Expansion können diese Zellen dann durch Einwirkung geeigneter Wirkstoffe sekundär in spezifische Neuronen, z. B. dopaminerge Neuronen, differenziert werden.
Unabhängig hiervon können bei einem Verfahrensschritt gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren, insbesondere bei einer partiellen Differenzierung, bei dem die Differenzierungsbedingungen nach der WO 00/78931 hiermit durch Inbezugnahme mit umfasst sein sollen, und/oder bei einer Modifikation und/oder Expansion der Zellen, Zellkulturen eingesetzt und/oder erhalten werden oder es können erfindungsgemässe Kulturen bzw. Zellmedien vorliegen, die praktisch ausschließlich aus den gewünschten neuronalen Zellen (eines oder mehrerer neuronaler Zelltypen) bestehen und andere Zellen, insbesondere immunkompetente gliale Zellen, nur noch in Anteilen von < 90%, vorzugsweise < 95%, < 98% oder < 99% bezogen auf die Gesamtzellzahl der Zellkultur enthalten. Besonders bevorzugt sind gliale Zellen nur in Anteilen enthalten, die keine physiologische Wirkung mehr haben, insbesondere nicht mehr nachweisbar sind. Durch die hier beschriebene erfindungsgemässe Verfahrensdurchführung kann das Verfahren nach der WO 00/78931 vorteilhaft weitergebildet werden.
So kann mittels des erfindungsgemässen Verfahrens Zellmaterial einfacher und reproduzierbarer erhalten werden bzw. eine erfindungsgemässe Zellkultur vorliegen, das/die praktisch ausschließlich dopaminerge Neuronen und/oder cholinerge Neuronen und/oder GABAerge striatale und/oder serotoninerge Neuronen einzeln oder in Kombinationen enthält, d. h. der Anteil der genannten Neuronen an dem Zellmaterial beträgt größer 90%, vorzugsweise größer 95% oder größer 99% bzw. enthält keine physiologisch wirksamen Anteile anderer Zellen, insbesondere glialer Zellen.
Die erfindungsgemäss eingesetzten neuronalen Progenitorzellen, durch deren Vermehrung, Selektion und (partielle) Differenzierung Zellkulturen bzw. transplantationsfähiges Zellmaterial gewonnen werden kann, können sowohl aus fetalem als auch aus adultem neuronalem Zellmaterial (Gehirn, vorzugsweise Mittelhirn oder Rückenmark) eines Säugetiers einschliesslich Mensch gewonnen werden. Die entnommenen Hirnteile können insbesondere solchen Hirnarealen entstammen, die derartige Neuronen enthalten, zu denen die Progenitorzellen partiell oder vollständig differenzieren oder denen die Progenitorzellen zur Therapie einer Hirnfehlfunktion appliziert werden. Das adulte Zellmaterial wird vorteilhafterweise aus periventrikulären Abschnitten präpariert. Das fetale Material kann aus Föten mit einem Alter von 3 bis 25 Wochen, vorzugsweise 5 bis 11 Wochen, nach der Befruchtung präpariert werden. Die neuronalen Progenitorzellen können auch aus Stammzellen des Blutes aus Nabelschnurgewebe erhalten werden.
Erfindungsgemäss kann eine Bereitstellung von transplantationsfähigem neuronalem Zellmaterial durch ein Verfahren erfolgen, dass eine Expansion der mittelbar oder unmittelbar aus Zellmaterial von Säugetieren einschliesslich Mensch gewonnen humanen Progenitorzellen, eine partielle in vitro Differenzierung und eine Selektionierung umfaßt, wobei die letztlich erhaltenen neuronalen Kulturen ohne Zugabe weiterer Faktoren oder genetischer Manipulationen mit hohem Prozentsatz in den gewünschten Zelltyp ausdifferenziert werden können oder nach Transplantation ausdifferenzieren. Gegebenenfalls kann nach einem partiellen Differenzierungs- oder Selektionierungsschritt der Progenitorzellen eine erneute Expansion des Zellmaterials erfolgen, die Schritte der partiellen Differenzierung und Selektionierung können mehrmals wiederholt werden, wobei die Art und Weise der Durchführung sich jeweils unterscheiden kann.
Durch die Erfindung ist es insgesamt möglich semiunreife neuronale Progenitorzellen soweit zu selektionieren und differenzieren, dass nach Zugabe von Nährmedien bzw. nach Transplantation überwiegend ein spezifischer Zelltyp ausdifferenziert.
Das erfindungsgemässen Verfahren, beipielsweise als Weiterbildung der Verfahrens nach der WO 00/78931, ohne hierauf beschränkt zu sein, kann einen oder mehrere Schritte der Modifizierung von Zellen in Form einer partiellen oder vollständigen Differenzierung und der Selektionierung von Zellen umfassen. Einer, mehrere oder sämtliche der Verfahrensschritte der Differenzierung, insbesondere partiellen Differenzierung, und/oder Selektionierung kann/können mit einem Medium durchgeführt werden, das teilweise oder praktisch ausschließlich Vorläuferzellen, insbesondere neuronale Vorläuferzellen, in Form von Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen enthält. Alternativ oder zusätzlich kann/können einer, mehrere oder sämtliche der oben genannten Verfahrensschritte mit einem Medium durchgeführt werden, das keine Vorläuferzellen Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen enthält oder nur in vernachlässigbaren Anteilen bezogen auf die Gesamtzellzahl in dem Medium.
Die Differenzierung, die unter in vitro-Bedingungen erfolgen kann, insbesondere die partielle Differenzierung, kann an Progenitorzellen erfolgen. Besonders hervorzuheben sind hier neuronale Progenitorzellen, wobei die erfindungsgemäße Kultivierung der Zellen auch bei Progenitorzellen anderer Typen, beispielsweise Progenitorzellen, die in Muskelzellen, Leberzellen oder Hautzellen differenzieren, eingesetzt werden kann, ohne hierauf beschränkt zu sein. Die Differenzierung, insbesondere partielle Differenzierung, erfolgt unter diesen Kulturbedingungen nicht nur wesentlich schneller sondern auch reproduzierbarer und selektiver als bei einer Differenzierung oder partiellen Differenzierung in Gegenwart von Zellhaufen (Spheres).
Besonders vorteilhaft ist es, erfindungsgemäße Kulturmedien enthaltend Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen bei der partiellen Differenzierung von Progenitorzellen durch Priming und/oder durch genetische Manipulation, insbesondere durch Transfektion (z. B. transiente oder nichttransiente Transfektion), zu verwenden, wobei die Differenzierung jeweils auch unter hypoxischen Bedingungen, wie unten näher beschrieben, erfolgen kann.
Eine partielle Differenzierung der Zellen kann insbesondere durch Behandlung mit einer oder mehreren Komponenten aus der Gruppe Zytokine, Wachstumsfaktoren, Transkriptionsfaktoren, Neurotransmitter, Hormone und Ganglioside erfolgen, die insbesondere auch in einem Priming-Schritt einsetzbar sind. Die partielle Differenzierung von neuronalen Progenitorzellen ist insbesondere in der WO 00/79931 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt bezüglich der oben genannten Komponenten hiermit vollumfänglich mit umfasst sein soll.
Als Wachstumsfaktoren können einer oder mehrere aus der Gruppe epidermal growth factor (EGF), insbesondere EGF1, EGF2, EGF3 mit den Subgruppen α und β, transforming growth factor (TGF) α und β, LIN-3-Protein, fibroblast growth factor (FGF), FGF1 und FGF2, nerve growth factor (NGF), brainderived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophine (NT), insbesondere NT-3, NT-4, NT-5, NT-6, insulin-like growth factors (IGF), insbesondere IGF-1 und IGF-2, glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), Neurturin (NTN), Persephin (PSP), vascular endothelial growth factor (VEGF), einschließlich deren Untergruppen oder Faktoren ähnlicher Wirkung verwendet werden.
Als Zytokine können einer oder mehrere aus der Gruppe Interleukine (IL 1-16), leukemia inhibitory factor (LIF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), tumor necrosis faktor (TNF), insbesondere TNF-α, Interferone (IFN), insbesondere IFN-α, makrophage inhibitory oder stimulating factors, insbesondere macrophage migration inhibitory factor (MIF), mitochondrial import stimulation factor (MSF) und Retinsäure eingesetzt werden.
Als Neurotransmitter können einer oder mehrere aus der Gruppe Dopamin, Acetylcholin, GABA, Glutamat, Glycin, Taurin, Prolin, Noradrenalin, Serotonin und Neuropeptide, insbesondere Substanz P und Enkephalin, eingesetzt werden.
Die Neurotransmitter können allein oder in Gegenwart von Wachstumsfaktoren und/oder Zytokinen eingesetzt werden.
Einzeln oder in Kombination mit den oben genannten Stoffen oder Stoffkombinationen können Hormone wie Wachstumshormone, Schilddrüsenhormone (insbesondere zur Differenzierung der Progenitorzellen zu dopaminergen Neuronen), Steroidhormone oder Ganglioside, jeweils einschließlich deren Derivate, eingesetzt werden.
Zur Erzeugung von dopaminergen Neuronen können insbesondere GDNF, LIF und eine oder mehrere von IL1-11 einzeln oder in Kombination eingesetzt werden, insbesondere die Kombination IL-1, GDNF, LIF, IL-11, jeweils einschließlich deren Untergruppen.
Die exogenen Faktoren können einzeln oder in Kombination jeweils in Konzentrationen von 25,000 bis 0,005 ng/ml, vorzugsweise 100 bis 1 ng/ml Expansionslösung eingesetzt werden, ohne hierauf beschränkt zu sein. Insbesondere können zur Differenzierung jeweils IL-1 in Konzentrationen von 0,005 bis 10 ng/ml, vorzugsweise 0,05 bis 0,25 ng/ml eingesetzt werden. IL-11 und LIF können in Konzentrationen von 0,01 bis 100 ng/ml, vorzugsweise 0,5 bis 2,5 ng/ml eingesetzt werden. GDNF kann in Konzentrationen von 1 bis 25.000 ng/ml, vorzugsweise 1-100 bis 2.500 ng/ml eingesetzt werden.
Die Faktoren können auch in Kombination in diesen Konzentrationen eingesetzt werden. Die einzusetzenden Konzentrationen sind jedoch nicht auf die oben genannten Werte beschränkt und können unter anderem können in Abhängigkeit von den jeweils anderen eingesetzten Faktoren variieren.
Unter einer partiellen Differenzierung in Form eines Priming sei hierbei ein Verfahren verstanden, welches die Behandlung von (monoklonalen) neuronalen Progenitorzellen mit einem oder mehreren exogenen Stoffen, insbesondere einem oder mehreren Stoffen aus der Gruppe Wachstumsfaktor, Zytokine, Neurotransmitter, umfasst, bei welchem eine partielle Differenzierung der Progenitorzellen in weiter ausdifferenzierte Zelltypen erfolgt. Gegebenenfalls können hierzu auch sogenannte konditionierte Medien eingesetzt werden, d. h. Kulturmedien, die zur Kultivierung insbesondere der Neuronen einer bestimmten gewünschten Nervenzellpopulation (beispielsweise dopaminerge Neuronen, cholinerge Neuronen, GA- BAerge Neuronen und/oder serotoninerge Neuronen oder auch Glialzellen) verwendet werden. Diese exogenen Faktoren werden dann zu einem Zeitpunkt entzogen, zu welchem die Zellen roch in einen Zustand zurückdifferenzieren können, in dem eine weitere Expansion der Zellen möglich ist. Derartige rückumgewandelte Progenitorzellen werden als geprimte Zellen bezeichnet. Bei einer erneuten Exposition mit wirksamen exogenen Faktoren, die auch bereits in der Überführung der Zellen in ein anderes Medium, beispielsweise die Transplantation in ein Gewebe wie beispielsweise ein Gehirn, beinhalten kann, kommt es dann zu einer vielfach schnelleren Differenzierung der Progenitorzellen. Bei einer erneuten Expansion der geprimten Zellen können dann geprimte monoklonale Zelllinien gewonnen werden, die bereits Gene exprimieren, die eine höhere Spezifität gewährleisten.
Besonders vorteilhaft ist es, das erfindungsgemäße Verfahren mit Vorläuferzellen, insbesondere neuronalen Vorläuferzellen, in Form von Einzelzellen und/oder Agglomeraten mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen durchzuführen, die derart partiell differenziert sind, dass sie zu einem Priming noch befähigt sind, d. h. zu einer partiellen oder vollständigen Rückumwandlung nach Entzug des eine partielle Differenzierung bewirkenden Mediums, wobei der Zustand der partiellen Differenzierung unabhängig davon ist, ob ein derartiges Priming tatsächlich durchgeführt wird oder nicht. Die neuronalen Progenitorzellen liegen somit in einem besonders frühen Differenzierungsstadium vor.
Insbesondere kann im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens auch zur partiellen Differenzierung durch Transfektion ein erfindungsgemäßes Kulturmedium enthaltend Anteile an Einzelzellen und/oder Agglomerat mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen eingesetzt werden. Eine derartige Transfektion kann auch im Rahmen des zuvor beschriebenen Primings oder alternativ zu diesem eingesetzt werden. Durch die Transfektion (auch Transformation oder Transduktion genannt) die unabhängig von dem speziell verwendeten Verfahren eine Insertion oder einen Transfer eines Gens oder von Genen in die jeweiligen Zellen umfasst, kann eine Differenzierung der Progenitorzellen in einen gewünschten Zelltyp, insbesondere in spezifische Neuronentypen begünstigt werden. Hierbei sei auch eine vorübergehende Expression dieser Gene, welche das Erbmaterial der Zelle nicht verändert und nach einer gegebenenfalls durchgeführten Transplantation in ein Gewebe, beispielsweise in das Gehirn, keine Fremdgene in das Gewebe einschleust, jedoch das weitere Schicksal der Zellen determiniert, mit umfasst.
Als Gene können insbesondere Gene verwendet werden, die für bestimmte neuronale Zelltypen spezifisch sind, wobei die in der WO 00/79931 unter dem Kapitel "Partielle Differenzierung durch Transfektion" genannten Gene hiermit durch Inbezugnahme eingeschlossen werden. Beispielhaft kann die Entwicklung von dopaminergen Neuronen durch die Transfektion von Genen gesteuert werden, die Mitglieder der Steroid- und Thyroid-Hormon-Rezeptor-Familie wie Tyrosinhydroxylase, Nurr-1 und/oder Nurr-77 Rezeptoren kodieren oder durch Gene des vesikulären Monoamintransporters oder des Dopamintransporters, allgemein Gene, die für dopaminerge Neuronen spezifisch sind. Zur Selektion cholinerger Neuronen können für diese Neuronen spezifische Gene transferiert werden, insbesondere Gene des nikotinergen Acetylcholinrezeptors, insbesondere präsynaptische α- und β- Untereinheiten, insbesondere α-7, Gene des Nervenwachstumsfaktor (NGF)-Rezeptors oder der Cholinesterase. Die partielle Differenzierung striatale Neuronen kann insbesondere durch γ-Aminobuttersäure (GABA)-Transporter kodierende Gene, Dopaminrezeptor kodierende Gene, Glutamatrezeptor kodierende Gene, Enkephalin oder Substanz P kodierende Gene gesteuert werden. Die entsprechenden cDNA's mit den oben genannten Genen, sind aus der Literatur bekannt und verfügbar. Die Transfektion erfolgt mit den in der Literatur angegebenen Standardverfahren. So ist eine transiente oder stabile Transfektion der Progenitorzellen möglich.
Der Verfahrensschritt der Selektionierung der Zellen, insbesondere der Selektion von Progenitorzellen, kann durch eine Subklonierung oder durch andere geeignete Verfahren erfolgen. Die Subklonierung kann insbesondere durch eines oder mehrere in geeigneter zeitlicher Abfolge ausgeführter Verfahren aus der folgenden Gruppe erfolgen, ohne auf diese beschränkt zu sein: Subklonierung durch Endverdünnung, insbesondere als Ausplattierung von Einzelzellen; Subklonierung durch Mikromanipulation markierter vitaler Zellen; Subklonierung durch Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung markierter vitaler Zellen; Subklonierung durch magnetische Aufkonzentrierung von magnetisch markierten Zellen. Unabhängig hiervon wird hiermit bezüglich der Durchführung der Selektionierung auf das Kapitel "Selektionierung durch Subklonierung" der WO 00/78931 verwiesen, das durch Inbezugnahme vollinhaltlich in die vorliegenden Ausführungen mit aufgenommen sei.
Die Subklonierung der Progenitorzellen kann insbesondere unabhängig von der gewählten Methode so durchgeführt werden, dass lediglich eine Zelle in jedem Kulturgefäß verbleibt (insbesondere bei Subklonierung durch Endverdünnung), oder dass nur eine oder mehrere Zellen eines ausgewählten Zelltyps, der durch entsprechende Wahl der verwendeten zelltypischen Marker definiert ist, in einem Kulturgefäss verbleibt, sofern eine zelltypenspezifische Subklonierung erfolgte wie z. B. durch Fluoreszenz-Markierung, FACS, magnetische Aufkonzentrierung in Kombination mit zelltypenspezifischen Markern. Die so ausplatierten Zellen können anschliessend expandiert werden, wodurch man monoklonale Zellinien erhält. Dabei werden die Medien vorzugsweise mit mitogenen Substanzen versetzt (siehe oben angegebene Wachstumsfaktoren), um eine Vermehrung aus einer gegebene Wachstumsfaktoren), um eine Vermehrung aus einer Einzelzelle zu erreichen. Die Expansion, Differenzierung und Charakterisierung erfolgt dann im weiteren wie bereits oben für polyklonale Progenitorzellsuspensionen beschrieben. Dies gilt vorzugsweise unabhängig von der gewählten Methode der Subklonierung.
Nur beispielhaft sei ausgeführt, dass die Subklonierung der Progenitorzellen durch Mikromanipulation nach Fluoreszenz- Markierung der vitalen Zellen kann erfolgen, indem die lebenden Zellen mit einem für die jeweilige Zellpopulation spezifischen Marker gefärbt werden. Als Marker für dopaminerge Zellen können die Zellen beispielsweise mit dem Gen für das grün fluoreszierende "enhanced green-fluorescence protein" (EGFP), welche unter der Kontrolle spezifisch dopaminerger Promotoren exprimiert werden (Tyrosinhydroxylase- und Dopamintransporter-Promotor), vorübergehend transfiziert werden. Die grün leuchtenden Zellen können anschließend wie beschrieben kloniert werden. Für cholinerge Zellen wird die gleiche Technik mit dem Promotor der Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT), für GABAerge Neuronen mit dem Promotor für Glutamyl-Decarboxylase (GAD) oder anderen geeigneten Promotoren, verwandt. In der WO 00/78931 ist beschrieben, wie durch andere Subklonierungsverfahren spezifische Zelltypen, insbesondere dopaminerge, cholinerge oder GABAerge Zellen, selektioniert werden können, so dass Einzelzellen oder mehrere Zellen eines spezifischen Zelltyps vorliegen.
Bei allen Verfahren der Subklonierung erfolgt diese vorzugsweise in einem Stadium der Zellen, in dem eine möglichst weitgehende Differenzierung erfolgt ist, ohne daß die Teilungsfähigkeit der Zellen gemindert wird, also nach einem Priming, genetischer Manipulation, Veränderung der Atmosphäre oder Behandlung mit exogenen Faktoren.
Die oben beschrieben Schritte der partiellen Differenzierung, Selektionierung (Klonierung) und/oder Expansion können bei Bedarf kombiniert und wiederholt angewandt werden.
An die Selektion der Progenitorzellen können sich einer oder mehrere Verfahrensschritte der Vermehrung der Progenitorzellen, der partiellen oder vollständigen Differenzierung der Progenitorzellen oder der erneuten Selektion der Progenitorzellen anschließen.
Des weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Zellkultivierung auch eine Expansion und/oder Modifizierung der Zellen, beispielsweise durch partielle Differenzierung, und/oder Selektionierung der Zellen oder einen oder mehrere andere Verfahrensschritte unter dysoxischen Bedingungen umfassen. Derartige dysoxische Bedingungen können eine Erniedrigung oder Erhöhung der Sauerstoffaktivität verglichen mit Luft unter Standardbedingungen (Sauerstoffgehalt 21 Vol.-%) oder Bedingungen umfassen, die durch eine reduzierte oder erhöhte Sauerstoffaktivität induziert werden können. Die Sauerstoffaktivität kann einem Sauerstoffgehalt der Atmosphäre von 15 Vol.-%, vorzugsweise ≤ 5 Vol.-% oder ≤ 3 Vol.-%, besonders bevorzugt ≤ 1 Vol.-% entsprechen. Gegebenenfalls kann hierbei gleichzeitig der Stickstoffgehalt des Gases, das im Austausch mit dem Kulturmedium steht, verglichen mit Luft unter Standardbedingungen erhöht oder zusätzliche Gase wie beispielsweise CO₂, zugesetzt werden, wobei ein CO₂-Gehalt von 1 bis 15, vorzugsweise ca. 5-10 Vol.-% vorliegen kann, ohne auf diese Werte beschränkt zu sein. Alternativ oder zusätzlich zur Absenkung des Sauerstoffgehaltes des mit dem Kulturmedium in Austausch stehenden Gases können auch Substanzen eingesetzt werden, die die Energiegewinnung beeinträchtigen und einen verminderten Sauerstoffgehalt simulieren, insbesondere Hemmer der mitochondrialen Atmung, wie beispielsweise Rotenon, MPP⁺, Malonat oder andere.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kulturmedium, das bei der Expansion und/oder Modifikation einer Zellkulturen mit einer Vielzahl von Zellen verwendet werden kann, wobei die Zellen vorzugsweise zur Bildung von Zellhaufen (Spheres) in dem Kulturmedium neigen. Gemäß der Erfindung ist das Kulturmedium derart eingestellt, dass zur Bildung von Zellhaufen (Spheres) neigenden Zellen, insbesondere Vorläufer- Zellen wie neuronale Vorläufer-Zellen oder neuronale Zellen, in dem Kulturmedium zumindest teilweise als Einzelzellen oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen. Vorzugsweise weist das Kulturmedium die Merkmale auf, wie sie für das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Kulturmediums beschrieben wurden, so das zur Vermeidung von Wiederholungen hierauf verwiesen wird. Insbesondere kann das Kulturmedium derart eingestellt sein, dass bei Zellzahlen von 100 bis 10 Millionen/ml Kulturmedium Vorläufer-Zellen an wie neuronale Vorläufer-Zellen oder an neuronale Zellen die Zellen zumindest teilweise, vorzugsweise zu einem Anteil von > 25%, besonders bevorzugt praktisch ausschließlich als Einzelzellen oder als Agglomerate mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen, die die vorzugsweise eine Größe von < 32 Zellen aufweisen, vorliegen, wobei Zellrezeptoren, die für die Ausbildung von Zell-Zell-Adhäsionen verantwortlich sind, zumindest teilweise blockiert sind.
Insbesondere kann das Zellmedium eine Calciumionenkonzentration von < als 0,5 mmol/l Kulturmedium, insbesondere < als 0,1 mmol/l Kulturmedium, besonders bevorzugt < 0,05 mmol/l Kulturmedium enthalten oder bis auf unvermeidbare Verunreinigungen praktisch calciumfrei sein. Alternativ oder zusätzlich kann das Kulturmedium Inhibitoren für eine Zell-Zell-Adhäsion bewirkende Rezeptoren aufweisen, wie sie oben beschrieben wurden.
Das Kulturmedium kann des weiteren zur Expansion förderliche und/oder essentielle Wirkstoffe wie einen oder mehrere Wirkstoffe aus der Gruppe Aminosäuren, Nukleinsäuren oder Precursor derselben, Salze, Vitamine, Provitamine, Enzymcofaktoren, Hormone, Wachstumsfaktoren, physiologisch aktive Kohlenstoffquellen, physiologisch aktive Stickstoffquellen, Spurenelemente und/oder jeweils deren Precursor enthalten. In Abhängigkeit von den gewünschten Kulturbedingungen ist es nicht erforderlich, eine oder mehrere der oben genannten Komponenten in dem Kulturmedium bereitzustellen oder es können weitere Komponenten in dem Kulturmedium enthalten sein.
Das Kulturmedium kann die zur Expansion förderlichen und/oder essentiellen Stoffe in einer Konzentration enthalten, dass die Zellen für einen Zeitraum von 1 Stunde bis 10 Tagen oder länger, beispielsweise mindestens 1-3 oder 5 Tagen, ohne hierauf beschränkt zu sein, in dem Kulturmedium vorzugsweise ohne signifikante Beeinträchtigung deren Eigenschaften überleben und/oder 1 bis 10 oder mehr, vorzugsweise mindestens 3 Teilungszyklen durchführen können.
Beispielsweise kann das Kulturmedium je Liter jeweils ca. 0,00001 mmol-lösliche Kupfersalze (z. B. CuSO₄), ca. 0,003 mmol-lösliche Eisensalze (z. B. FeSO₄), ca. 3-4 mmol KCl, ca. 100 mmol NaCl, ca. 15 mmol NaHCO₃, ca. 0,45 mmol KPO₄, ca. 0,9 mmol NaH₂PO₄, ca. 0,05 ZnSO₄, Selensäure, ca. 1-25, vorzugsweise 3-15 mmol insbesondere ca. 10 mmol Glukose (wobei der genannte Glukosegehalt unabhängig von der sonstigen Zusammensetzung des Kulturmediums vorteilhaft sein kann), ca. 30 mmol HEPES, ca. 0,03 Natriumhypoxanthin, jeweils 0,001 bis 0,003 mmol Liponsäure, Phenolrot, Natriumputreszin, ca. 2 mmol Natriumpyrovat, Aminosäuren, Biotin, Vitamine und Provitamine wie d-Calciumpantothenat, Cholin, Chlorid, Folsäure, Niacinamid, Pyrodoxin, Riboflavin, Thiamine, Thymidine, Vitamin B12, Wachstumsfaktoren wie Inositol oder EGF, Cortikoide wie Dexamethason, Hydrocortison oder Cortison, Insulin, Humanalbumin, Choleratoxin, Phosphorethanolamin, FGF (beispielsweise bFGF) oder LIF enthalten. Es versteht sich, dass für bestimmte Anwendungsfälle gegebenenfalls einige dieser Komponenten nicht zwingend notwendig sind oder dass andere übliche in Kulturmedien verwendete Komponenten eingesetzt werden können. Von besonderer Bedeutung sind jedoch die Komponenten Choleratoxin, Kortison, Insulin und Humanalbumin.
Das erfindungsgemäße Kulturmedium kann zu Vorratszwecken frei von Zellen vorliegen. Weist das Kulturmedium eine Zellkultur, die teilweise oder vollständig aus Einzelzellen und/oder aus Agglomeraten mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen besteht kann, auf so kann durch übliche Verfahren wie zentrifugieren oder durch andere geeignete Verfahren ein isoliertes und von dem Kulturmedium im wesentlichen abgetrenntes Zellmaterial gewonnen werden. Das in einem calciumarmen, d. h. mit einer Calciumkonzentration von weniger als 0,5 mmol/l Kulturmedium, kultivierte Zellmaterial zeichnet sich insbesondere durch eine hohe Telomeraseaktivität aus.
Die Vorläufer-Zellen der erfindungsgemäßen Zellkultur unterscheiden sich ferner von bisherigen neuronalen Progenitoren dadurch, dass eine Differenzierung während der Expansion zumindest gehemmt oder vollständig verhindert wird. Es fehlen also neuronale und gliale Marker (MAP2, NeuN, NCAM, GFAP, etc.), wie sie in herkömmlichen Spheroiden nachgewiesen werden. Desweiteren ist die DNA-Fragmentierung bei beginnender Apoptose, die in den herkömmlichen Spheroiden zu 5-20% beobachtet wird, bei erfindungsgemäßen Zellen praktisch nicht mehr vorhanden, d. h. kleiner 2%, vorzugsweise kleiner 1% bis kleiner 0,5%, besonders bevorzugt nicht mehr nachweisbar. Die DNA Fragmentierung kann hierbei durch allgemein bekannte Methoden bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen hergestellten Zellkulturen zeichnen sich nicht nur dadurch aus, dass diese verglichen mit aus Zellhaufen bestehenden Kulturen leichter expandierbar und modifizierbar sind, sie können auch bei therapeutischen Verfahren besonders vorteilhaft eingesetzt werden, bei denen spezifisches Zellmaterial Patienten appliziert wird. Eine derartige Applikation kann durch Transplantation, beispielsweise aber auch durch Infusion oder durch andere geeignete Weise erfolgen.
Im nachfolgenden wird die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Kulturmediums an einem Ausführungsbeispiel beschrieben, das sich auf eine derartige Anwendung bezieht. Bezüglich weiterer Details sei auf die Kapitel "Allgemeine Verfahrensdurchführung" sowie das Ausführungsbeispiel der WO 00/78931 verwiesen, das hiermit durch Inbezugnahme vollinhaltlich mit umfasst sei, wobei im folgenden im wesentlichen die Unterschiede zu dem Ausführungsbeispiel der WO 00/78931 beschrieben seien.
Zur Gewinnung der neuronalen Progenitorzellen erfolgt eine Präparation des Hirngewebes auf übliche Weise und anschließend eine Homogenisierung des Hirngewebes. Hierzu wird das Gewebe mit einem proteolytisch wirkenden Enzym, beispielsweise einer Serin-Protease, mit einer geeigneten Konzentration versetzt, um den Gewebeverband zu lockern.
Das derart präparierte Gewebe wird anschließend mit einer DNase-Lösung in einer geeigneten Konzentration versetzt.
Nach einer Inkubationszeit von ca. 10 Minuten werden die angedauten Gewebeteile durch Aufziehen in eine Pasteur- Pipette homogenisiert.
Anschließend wird das Gewebe mit einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Expansionsmediums versetzt, welches einen Calciumgehalt von 0,02 mmol (als CaCl₂) und einen Magnesiumgehalt von 0,4 mmol (als MgCl₂ und MgSO₄) enthält (jeweils bezogen auf ein Liter Kulturmedium). Des weiteren enthält das Expansionsmedium übliche Anteile an weiteren Komponenten wie sie oben für eine beispielhaftes Kulturmedium angegeben wurden. Als Wachstumsfaktoren waren Inositol, EGF, FGF und LIF enthalten. Weitere übliche in Kulturmedien eingesetzte Stoffe wie Insulin, Cortisone, Penizillin, Streptomyzin usw. waren in üblichen Konzentrationen enthalten. Das Kultivierungsmedium ist abgesehen von Humanalbumin, welches für die Anwendung an Menschen zugelassen ist serum- und serumextraktfrei.
Die Expansion erfolgt unter einer Atmosphäre mit reduziertem Sauerstoffgehalt von 1-5 Vol.-% und einem Kohlendioxidgehalt von 5 Vol.-% ergänzt durch 90-94% Stickstoff.
Das expandierte Gewebe wird mit einer Eppendorf-Pipette homogenisiert und die Zellzahl mit einem Hämozytometer bestimmt. Die Zellsuspension, die praktisch ausschliesslich aus Einzelzellen und losen Zellagglomeraten besteht, wird mit dem Expansionsmedium auf eine Zellzahl von ca. 300.000 Zellen/ml verdünnt. 8 ml dieser Zellsuspension werden auf eine 25 cbm Flasche aufgesetzt und die Zellen mit einer Atmosphäre aus 1-5 Vol.-% Sauerstoff, 5-10 Vol.-% CO₂ und 84-94 Vol.-% Stickstoff bei 37°C kultiviert.
Die Zellen werden ein- bis zweimal pro Woche in frisches erfindungsgemäßes Expansionsmedium mit einem Calciumgehalt von ca. 0,05 mmol/l Expansionsmedium umgesetzt, wozu die Zellen in Plastikröhrchen überführt und anschließend zentrifugiert werden. Der Überstand wird abgesaugt und 2 ml frische erfindungsgemäße Expansionslösung werden zugefügt, anschließend wird homogenisiert. Die homogenisierte Lösung wird in mehrere Proben aufgeteilt, in neue Flaschen überführt und mit 8 ml der calciumarmen Expansionslösung versetzt.
Die derart expandierten neuronalen Progenitorzellen können zur Lagerung in flüssigem Stickstoff in üblicher Weise tiefgefroren werden. Die Zellpräparation erfolgt hierbei wie üblich (hierbei sei auf den Offenbarungsgehalt der WO 00/78931 Bezug genommen, der hiermit vollinhaltlich eingeschlossen sein soll). Die Aufnahme der Zellen erfolgt auch hier durch ein Expansionsmedium mit einem Calciumgehalt von ca. 0,05 mmol/l Kulturmedium.
Zur Differenzierung der Progenitorzellen kann das Gefrierpräparat in einem Wasserbad aufgetaut und mit 70%igem Ethanol desinfiziert werden. Die Zellsuspension wird langsam mit einem Expansionsmedium enthaltend ca. 0,05 mmol Ca²⁺/l Expansionsmedium unter Schütteln versetzt, erneut zentrifugiert und mit Expansionsmedium aufgenommen. Anschließend wird die Probe in einer Kulturflasche in einer Atmosphäre mit 5 Vol.-% CO2/95% Luft bei 37°C für ca. eine Woche inkubiert. Die weitere Expansion der Zellen erfolgt wie oben beschrieben.
Eine Differenzierung der Progenitorzellen kann mit frisch expandierten oder mit aufgetauten Proben erfolgen. Bezüglich der Probenbehandlung aufgetauter Proben und der Verwendung der Aufnahmemedien sei auf den Offenbarungsgehalt der WO 00/78931 Bezug genommen, der hiermit vollinhaltlich eingeschlossen sein soll). Das Aufnahmemedium, dass im wesentlichen dem Aufnahmemedium I der WO 00/78931 entspricht, weist auch hier vorzugsweise eine Calciumionenkonzentration von < 0,1 mmol/l Kulturmedium auf.
Die Proben werden anschließend für 7 bis 21 Tage in einer Atmosphäre mit einem Sauerstoffgehalt von 2 Vol.-% inkubiert. Anschließend werden die erhaltenen Zellen durch Subklonierung in einer Atomosphäre mit 5 Vol.-% Sauerstoff selektioniert, worauf die oben beschriebenen Schritte der Expansion und partiellen Differenzierung wiederholt werden.
Die entstandenen Zellsuspensionen können für Transplantationen in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung aufgenommen werden.
Es wurden jeweils Präparate aus dopaminergen Neuronen erhalten, die praktisch frei von glialen Zellen sind. Die Zellen können dann transplantiert werden.
In Abwandlung des obigen Versuchsbeispiels wurde bei der Expansion der Zellkultur ein Kulturmedium eingesetzt, das einen Ca²⁺-Gehalt von ca. 0,1 mmol/l Kulturmedium und eine Konzentration von N- und E-Cadherin Blockern (Beispiele angeben) von 1 µmol/l Kulturmedium enthielt. Das Verfahren führte praktisch zum gleichen Ergebnis, insbesondere wurde auch hier eine DNA-Fragmentierung aufgrund beginnender Apoptose von weniger als 1% beobachtet.

Claims

1. Verfahren zur Kultivierung von Zellkulturen enthaltend eine Vielzahl von Vorläufer-Zellen, wobei das Verfahren einen oder mehrere Verfahrensschritte aus der Gruppe Expansion der Vorläufer-Zellen und Modifikation der Vorläufer-Zellen der Zellkultur in einem Kulturmedium umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläufer-Zellen der Zellkultur bei dem Verfahrensschritt zu einem wesentlichen Anteil als Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell- Wechselwirkungen vorliegen, bei denen die Zell-Zell- Wechselwirkungen durch externe Einwirkung auf das Kulturmedium ohne Beschädigung des überwiegenden Anteils der Vorläufer-Zellen unter Überführung der Agglomerate in separate Einzelzellen auftrennbar sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläufer-Zellen zumindest teilweise oder praktisch ausschließlich bis auf unvermeidbare Anteile an Fremdzellen neuronale Vorläufer- Zellen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt aus der Gruppe der Expansion und Modifikation der Vorläufer-Zellen unter Kulturbedingungen erfolgt, die die für die Ausbildung von Zell-Zell-Adhäsionen verantwortlichen Rezeptoren der Zellen zumindest teilweise blockiert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt aus der Gruppe der Expansion und Modifikation in einem Kulturmedium mit einer Ca²⁺- Konzentration von ≤ 1,0 mmol/l, vorzugsweise ≤ 0,5 mmol/l Kulturmedium, besonders bevorzugt ≤ 0,1 mmol/l Kulturmedium durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mg²⁺- Konzentration des Kulturmediums ≤ 2 mmol/l Kulturmedium, vorzugsweise ≤ 0,6 mmol/l Kulturmedium beträgt.

6. Verfahren nach einem der Schritte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt in Gegenwart von Inhibitoren, die für Zell-Zell-Wechselwirkungen eingehende Rezeptoren der Zellmembran der Zellen spezifisch sind, erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt in Gegenwart von Inhibitoren erfolgt, die für zumindest einen Stoff aus der Gruppe Cadherine, Selectine, Integrine und Immunoglobuline spezifisch sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt in Gegenwart von einem oder mehreren der Stoffe PSA-N-Cam, L1, N-Cadherin erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt in Gegenwart von aktiver Telomerase erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Schritte 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt in einem serum- und/oder serumextraktfreien Expansionsmedium erfolgt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Form von Spheroiden vorliegende Vorläufer-Zellen in ein Kulturmedium überführt werden, dass zumindest teilweise eine Aufhebung von Zell-Zell-Kontakten der Vorläufer- Zellen bewirkt, und dass die Vorläufer-Zellen für einen ausreichend langen Zeitraum in dem Kulturmedium, vorzugsweise vor Durchführung eines weiteren Verfahrensschrittes belassen werden, bis die Vorläufer-Zellen teilweise oder überwiegend als Einzelzellen oder als Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen oder mehrere weitere Verfahrensschritt, insbesondere aus der Gruppe der partiellen Differenzierung, Subklonierung und Priming, umfasst, dem jeweils Vorläufer-Zellen unterzogen werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Verfahrensschritt mit einer Zellkultur durchgeführt wird, die zu einem wesentlichen Anteil Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen enthält.

14. Verfahren zur Herstellung einer wachstumsfähigen Zellkultur aus Vorläufer-Zellen, enthaltend die folgenden Verfahrensschritte:

- Entnahme von Hirnteilen eines Mammals,

- Selektion von Vorläufer-Zellen,

- Expansion der Vorläufer-Zellen

- partielle Differenzierung der Progenitorzellen

- bei Bedarf ein- oder mehrmalige Wiederholung einer oder mehrere der Schritte der Expansion, Selektion und/oder partiellen Differenzierung,

dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläufer-Zellen der Zellkultur zumindest bei einem der Verfahrensschritte der Expansion und/oder der partiellen Differenzierung zu einem wesentlichen Anteil als Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell- Zell-Wechselwirkungen vorliegen, bei denen die Zell- Zell-Wechselwirkungen durch externe Einwirkung auf das Kulturmedium ohne Beschädigung des überwiegenden Anteils der Vorläufer-Zellen unter Überführung der Agglomerate in separate Einzelzellen auftrennbar sind.

15. Kulturmedien zur Kultivierung von Zellkulturen, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium derart eingestellt ist, dass die eine Zell- Zell-Adhäsion bewirkenden Rezeptoren von in das Kulturmedium eingebrachten Vorläufer-Zellen zumindest teilweise blockiert sind.

16. Kulturmedium nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Ca²⁺-Konzentration ≤ 1,0 mmol/l, vorzugsweise ≤ 0,5 mmol/l Kulturmedium, besonders bevorzugt ≤ 0,1 mmol/l Kulturmedium beträgt.

17. Kulturmedium nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium einen oder mehrere Inhibitoren enthält, die für einen oder mehrere Stoffe aus der Gruppe Cadherine, insbesondere E-, P- und N-Cadherin, Selectine, Integrine, Immunoglobuline, insbesondere N-CAM, im speziellen PSA-N- CAM, spezifisch sind.

18. Kulturmedium nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium im wesentlichen serum- und/oder serumextraktfrei ist.

19. Zellkultur enthaltend eine Vielzahl von Zellen, die Vorläufer-Zellen sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläufer-Zellen zu einem wesentlichen Anteil als Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen, bei denen die Zell-Zell-Wechselwirkungen durch externe Einwirkung auf das Kulturmedium ohne Beschädigung des überwiegenden Anteils der Vorläufer-Zellen unter Überführung der Agglomerate in separate Einzelzellen auftrennbar sind.

20. Zellkultur nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläufer-Zellen zumindest teilweise oder praktisch ausschließlich bis auf unvermeidbare Anteile an Fremdzellen neuronale Vorläufer-Zellen sind.

21. Zellkultur enthaltend eine Vielzahl von Zellen, die neuronale Zellen sind, dadurch gekennzeichnet, dass die neuronalen-Zellen zu einem wesentlichen Anteil als Einzelzellen und/oder Agglomerate mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen, bei denen die Zell-Zell-Wechselwirkungen durch externe Einwirkung auf das Kulturmedium ohne Beschädigung des überwiegenden Anteils der neuronalen-Zellen unter Überführung der Agglomerate in separate Einzelzellen auftrennbar sind.

22. Zellkultur nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläufer-Zellen und/oder neuronalen Zellen in einer Konzentration von mindestens 10.000 Zellen/ml Kulturmedium in Form von Einzelzellen und/oder Agglomeraten mit schwachen Zell-Zell-Wechselwirkungen vorliegen.

23. Zellkultur, insbesondere nach einem der Ansprüche 19 bis 22, die nach Durchführung eines oder mehrerer der Verfahrensschritte 1 bis 15 und gegebenenfalls nach weiteren Verfahrensschritten isoliert wurde.

24. Zellkultur nach einem der Ansprüche 19 bis 23 in einer zur Applizierung bei einem Tier, einschließlich Mensch, geeigneten Form.