JP3886346B2 - 骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨髄間質細胞をインビトロにおいてＳｃｈｗａｎｎ細胞に誘導する方法、及び当該骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経系、特に脳・脊髄に代表される中枢神経はひとたび障害を受けると不可逆的であり、最終的には変性という過程を辿ると考えられている。交通外傷やスポーツ外傷、虚血、腫瘍、長期の炎症、原因不明の変性疾患を含め、多くの罹患人口を抱える神経疾患への突破口は社会的急務である。
中枢神経の障害が不可逆的である理由は、組織を構成するグリア環境にあると考えられている。脳・脊髄と同じグリア環境をもち、かつ、中枢神経である視神経を例にとって説明する。
【０００３】
１）まず神経線維が変性を起こし、消失していく。この過程で神経を被覆していたミエリン鞘も変性を起こし、細胞残渣となる（図１ｂ参照）。オリゴデンドロサイトの形成するこれらミエリン鞘には神経線維の再生・伸長を強力に阻害する物質が含まれていることがわかっている（１）。
２）アストロサイトが増殖肥大し、グリオーシスｇｌｉｏｓｉｓを形成する（図１ｂ参照）。すなわち神経組織に置き換わって主要な場所を占拠し、物理的に再生を阻害するのである（２）。グリオーシスを起こしたアストロサイトは正常時とはかなり形態的に様相が異なり、突起数が増大し互いに入り組んだ形態を呈する。特に損傷においては、障害部位は神経線維の走行に対して直角方向に何層ものアストロサイトが重なり、互いの突起で連結し合い、あたかも蓋をしてしまったかのようにバリアー構造を形成してしまう。
３）変性によるオリゴデンドロサイトやそのミエリンなどの細胞残渣の処理が、再生するほかの組織に比べて遅い。その第一の理由として、末梢性のマクロファージや単球などの免疫系細胞の侵入がきわめて少なく初期の段階における残渣の処理が遅れるのであろう。
【０００４】
視神経が再生しない理由として以下のものが提案されている。
１）先にも述べたが、オリゴデンドロサイトは神経再生において強力な阻害作用を持っている。具体的には、オリゴデンドロサイトから抽出されたＮｏｇｏという分子が阻害することが示されている（１，９）。培養系を使った実験では、神経突起が伸長しているときにオリゴデンドロサイト由来のミエリン鞘と接触すると突起は伸長を止めるだけでなく、突起を退縮させることがわかっている（contact inhibition）。またミエリン鞘のあるところには神経突起は伸長せず、培養においてはそれらを避けるように突起が進んでいくことが示されている。
２）グリオーシスを起こしたアストロサイトはさまざまな阻害物質を産生することがわかっており、なかでもケラチン硫酸やコンドロイチン硫酸などのプロテオグリカンがあげられている（３）。
【０００５】
３）損傷を受けても、視神経に限らず中枢神経系は非常にサイレントな系である。そもそも免疫の監視からはずれた系であり、逆にそのことが再生においては不利になっているといわれている。例えば後述する末梢神経系は、視神経とはグリア構成も異なっており、また同じ神経組織でありながら再生する系としてこれまでよく比較・検討されてきた。末梢神経組織では損傷後速やかに（数時間〜２日以内で）末梢性マクロファージなどの免疫系細胞が侵入し、細胞残渣が処理される。それと同時に多くのサイトカインを分泌し、神経組織の再生を促すことがわかっている。このように神経再生というのは、ある反応が次の反応を起こすというようにさまざまな現象がカスケードのようにつながって起きているのであるが、視神経ではマクロファージの初期段階での侵入がみられない。これは視神経を含め中枢神経系には、マクロファージの活性を抑制する作用があることによるのではないかと推察されている（４）。複雑に発達した中枢神経網がマクロファージによって消化されるのを防ぐために、抑制機能を発達させてきたらしい。このように視神経では最初のきっかけ（ｔｒｉｇｇｅｒ）がないために再生に向かわず変性に陥るのではないかということが指摘されている。
【０００６】
４）再生するには、神経線維を誘導する構造的な足場が必要である。しかし、視神経では一度変性が起こると再生のための道筋が消失してしまう。視神経では一つのオリゴデンドロサイトが複数の神経線維のミエリン鞘を形成し、これらの有髄線維の周囲や、あるいは無髄線維束をアストロサイトが覆っている（図２下参照）。基底膜はグリア境界膜を形成しているアストロサイトの外側にあるのみで、言い換えると視神経全体がまとめて一つの基底膜のさやに入っているのと同じである。末梢神経では基底膜が再生の道筋として働いている。したがって視神経においては神経線維が一度変性すると、各神経線維にとってのかつての道筋が消失してしまうことになるのである。
【０００７】
一方、末梢神経は、中枢神経と異なり再生することができる。
【０００８】
中枢神経とは異なり、末梢神経を構成する主要な細胞はＳｃｈｗａｎｎ細胞である。また神経線維は有髄・無髄のいずれの形態をとっていても、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞によって被覆されている（図２上参照）。Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は神経堤細胞（neural crest cell)に由来し、神経再生に阻害的に作用する中枢性グリア（オリゴデンドロサイト、アストロサイト）は神経管（neural tube)に由来するというように、それぞれ発生起源を異にしている。
【０００９】
末梢神経は以下のように再生すると考えられる。
１）末梢神経では、切断などの損傷を受けると損傷部位よりも末梢側ではＷａｌｌｅｒ変性（Wallerian degeneration）が起きる（図３参照）。これはＳｃｈｗａｎｎ細胞が、髄鞘を形成し分化した形態から未分化な状態に逆戻りし、活性化され***増殖し、索状を呈することを指す。末梢神経では個々の神経線維は独立してＳｃｈｗａｎｎ細胞に包まれており、その外側は基底膜に覆われている（図２参照）。すなわち各神経が別々の基底膜のさやに入っている。したがって変性を起こしても基底膜のさやの中で活性化されたＳｃｈｗａｎｎ細胞が増殖し、索状構造を形成するのでこれを手がかりに元の神経回路を再建することができるのである。Ｗａｌｌｅｒ変性とはいいながら、変性ではなく実はこれが再生への第一歩なのである。
【００１０】
２）Ｗａｌｌｅｒ変性の一連の過程において大きくかかわっているのが末梢性マクロファージである。マクロファージは損傷部位よりも末梢側に素早く侵入し、変性した神経線維やミエリンの残骸などを処理する（図３参照）と同時にＩＬ−１などのサイトカインを出すことによってＳｃｈｗａｎｎ細胞を活性化する。何がマクロファージの侵入を誘導するのかに関しては未だはっきりとした結論は出ていないが、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞自身ではないだろうかともいわれている。とにかくマクロファージのシグナルで活性化されたＳｃｈｗａｎｎ細胞は、これから述べる神経成長因子など再生にとって不可欠な種々の因子を合成し、神経再生を導くと考えられているのである。
【００１１】
３）同じミエリン鞘でもＳｃｈｗａｎｎ細胞のものであれば阻害作用は少ないらしい（５）。これはオリゴデンドロサイトのミエリン鞘が阻害作用を示すのと大きく異なる点である。また、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞とオリゴデンドロサイトでは、ミエリンを構成する蛋白の組成に違いがあることもわかっている。
このように中枢のグリアは障害を受けても、末梢神経におけるＳｃｈｗａｎｎ細胞のように未分化な形に先祖返りをして***増殖したり、形態を大きく変えていくようなことをせず、比較的分化したままの表現型を維持するのである。その点、末梢神経は受けた障害に対して柔軟性に富んだ素早い反応を示すのが特徴である。
【００１２】
神経再生におけるＳｃｈｗａｎｎ細胞は、以下の役割をもつと考えられている。
【００１３】
Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は多くの因子を産生し、拡散性に放出する。また自らの細胞膜表面には基底膜が被っており、ここには細胞外基質成分（extracellular matrix）が含まれる。さらにＳｃｈｗａｎｎ細胞膜には、細胞接着分子が発現されていることがわかっており、これらのファクターが総合的に働いて神経再生が誘導されていると考えられている（図４参照）。
１．拡散性因子
Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は多くの神経栄養因子を産生することがわかっているが、なかでも再生に関係ある主だったものを以下にあげる：１）ニューロトロフィンファミリー、例えば、nerve growth factor、brain-derived neurotrophic factor、neurotrophin-3、neurotrophin-4/5；２）毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor）；３）ＦＧＦファミリー、例えば、acidic and basic fibroblast growth factor；４）インスリンファミリー、例えば、insulin-like growth factor-Ｉ，II；５）腫瘍化促進因子（transforming growth factor-β２，β３）。
上記ニューロトロフィンは神経細胞に対する生存のほか、突起伸長などの強力な作用がある。ほかの因子も神経に対する栄養因子としての作用や突起伸長の作用もあるが、同時にＳｃｈｗａｎｎ細胞自身に対する活性化作用も有するため、ａｕｔｏｃｒｉｎｅとしての作用機序も考えられている。
【００１４】
２．細胞外基質成分
fibronectin、laminin、type IV collagen、tenascinなどが含まれる。なかでも培養系などの実験ではfibronectin やlaminin が神経再生において支持的に働くといわれている。
３．細胞接着分子
細胞接着分子は数多くのものが同定されてきている。ここではＳｃｈｗａｎｎ細胞と神経再生において関連のあるものに焦点を当てる。
１）免疫グロブリンスーパーファミリー
ＮＣＡＭ（neural cell adhesion molecule)やＬ１は特にＳｃｈｗａｎｎ細胞の膜上に発現され、神経線維がＳｃｈｗａｎｎ細胞上を足場とし接触しながら伸長していくときに接着分子として大きな役割を果たす。両者とも、細胞骨格とつながり細胞の形態維持に働くと同時に、イノシトールリン酸系やカルシウムチャンネル活性化を通じて細胞内活性化を図っている。また、神経の伸長がある程度行われ、神経線維の再ミエリン化が始まるときにＭＡＧ（myelin associated glycoprotein）がＳｃｈｗａｎｎ細胞との間に発現する。
【００１５】
２）カドヘリンスーパーファミリー
カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）はカルシウム依存性の細胞接着分子で多くの種類が同定されているが、神経再生において特に関与しているのがＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎである。これも免疫グロブリンスーパーファミリーであるＮＣＡＭやＬ１と同様、神経線維がＳｃｈｗａｎｎ細胞上を接触し、認識しながら伸長していくときに大きな役割を果たす。
３）インテグリンスーパーファミリー
インテグリンは上述の細胞外基質に対する細胞側の受容体である。α、βの２つのサブユニットからなるｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃな分子である。またカドヘリン同様細胞骨格と連結しており、細胞間の情報伝達においても直接的に働いていると考えられている。Ｓｃｈｗａｎｎ細胞においてはα₆ β₄ というサブタイプが発現しており、再生中の再ミエリン化の過程において役割を果たしている。
【００１６】
中枢神経再生の試みは過去何十年にもわたり多くの研究者により試みられてきた。それらを総括すると、
１）手や足などの末梢神経を一部切り出し、中枢神経に自家移植することによって再生が認められている。したがって、末梢神経は中枢神経の再生を促す環境をもっているといえる。これは、１９８３年のカナダのＡｇｕａｙｏらによる研究が発端になっている（８）。
２）上述のように、中枢神経そのものに神経が再生することを抑える働きがある。これは２０００年にNatureにより掲載されたNogo因子をはじめ、以前より分かっているミエリン関連タンパク質などが抑制作用を有することが報告されている。そこでこれらに対する抗体を注入してこれらの因子を中和してしまうと多少なりとも中枢神経は再生するということが報告されている。
【００１７】
３）細胞を移植することによって再生を促す。これには以下の２タイプがある：
−ａ）変性して失われた神経細胞を供給して、神経回路を再建する。神経幹細胞、胎児由来の神経細胞を用いたアプローチである。
−ｂ）神経そのものを供給するのではなく、神経の再生能力を誘導することができる細胞（グリア細胞）を移植し、再建する。このような細胞として、末梢神経由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞、神経栄養因子を導入した中枢神経由来のグリア細胞、同じく中枢神経由来の上衣細胞、臭神経由来の支持細胞、神経幹細胞などが試みられている。
しかしながら、上記いずれの方法も一長一短であり、未だ画期的な方法は開発されていない。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らはこれまで神経再生並びに機能再建法の開発に長らく取り組んできた。特に、上記３）−ｂ）に記載した末梢神経の組織構成を担っているＳｃｈｗａｎｎ細胞を用いた方法である。Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は末梢神経に存在するが、自らの組織である末梢神経はもとより中枢神経系も含めて再生誘導能を有し、損傷部位への移植によって再生線維の足場を提供して有効な神経再生を導くこと、また神経が正常に機能する上で不可欠な要素である神経跳躍伝導を担うミエリンもＳｃｈｗａｎｎ細胞の移植によって再建可能であることを解明した。動物実験レベルでもＳｃｈｗａｎｎ細胞を移植することによって中枢神経である視神経が切断状態から再生することを確認している。
しかしながら、動物実験レベルでは比較的容易なＳｃｈｗａｎｎ細胞の採取・培養もヒトとなると、様々な困難がある。例えば、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は末梢神経に存在するため、手や足の神経片を採取し、そこから単離しなくてはならないので、採取後ドナーに障害が残ることになる。さらに成人由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞の増殖能には限界があり、大量培養には時間がかかり難しい、という点も挙げられる。また、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に分化すると考えられている神経堤細胞(neural crest cell)は、胎児の末梢神経からしか採取できない。
したがって、神経再生治療に用いることができる、培養により多量に入手することができる天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞代替物を提供する必要性が存在する。
【００１９】
神経系においては、成人になっても脳のごく一部に神経幹細胞(neuronal stem cell)が存在することが判っている。これらは神経系を構成するニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなどに分化する（図５参照）。しかしながら、幹細胞といってもごく僅かしか存在せず、しかも採取するには開頭しなければならない。また、最近の研究により、胚葉の概念を超えて、ある種の細胞は全く別種の細胞にtransdifferentiateする可能性があるということが判ってきた（図６参照）。例えば、血液細胞が神経細胞になったり、逆に神経細胞が血液になったりする可能性があるということである。しかしながら、本願出願当時、骨髄間質細胞は、造血支持機能のみならず、それ自体が骨芽細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞等に分化できる間葉系の幹細胞又は前駆細胞であることが判っていたが（１０）、骨髄間質細胞を、実際に、神経堤細胞(neural crest cell)由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞に分化させることができるかどうかについては、その可能性を示唆する文献すら存在せず、かつ、その分化・誘導方法も全く確立されていなかった。
【００２０】
以上の現状を鑑み、本願発明者らは、上述のように入手困難である神経堤細胞(neural crest cell)の代わりに骨髄間質細胞を用いてＳｃｈｗａｎｎ細胞への分化・誘導の実験・研究を試みた。なぜなら、骨髄間質細胞であれば骨髄穿刺によって病院の外来レベルでの採取が容易であり、非常に旺盛な増殖能を持つので大量培養が比較的短い時間で可能であるからである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
今般、本願発明者らは、上記実験を繰返した結果、複数段階の操作により、骨髄間質細胞をＳｃｈｗａｎｎ細胞に、高効率で分化・誘導させることに初めて成功した。さらに、かかる分化・誘導方法により得られた骨髄間質細胞由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞を損傷視神経（中枢神経）に移植することにより実際に神経が再生・伸長することを確認し、ここに本願発明を完成するに至った。
【００２２】
本願発明の１の態様においては、骨髄間質細胞を、インビトロにおいて、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に分化・誘導させる方法であって、以下のステップ：
（１） 骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；
（２） 還元剤を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し；
（３） 分化誘導剤を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し；並びに
（４） サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又はグリア細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添加し、さらに培養して、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を得る；
を含む前記分化・誘導方法が、提供される。
【００２３】
前記ステップ（１）における細胞の密度は、５０％のコンフルエントの時点であることができ、好ましくは４代まで継代培養された時点であることができる。
前記標準的な基礎培地がＥａｇｌｅ’ｓアルファ修飾最小必須培地(Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification)（ＳＩＧＭＡ社、Ｍ４５２６）であり、そして前記血清はウシ胎児血清(fetus carf serum)（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１Ｆ、Ｌｏｔ＃６１−１０１２）であることができる。前記血清は、２０％の濃度であることができる。前記還元剤がＳＨ試薬であり、好ましくは、前記ＳＨ試薬はβ−メルカプトエタノール(beta-mercaptoethanol)（ナカライテスク社 ２１４−１８ Ｌｏｔ＃ＭＯＭ７５８２）であることができる。前記還元剤の濃度は、１ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０ｎＭ〜５ｍＭ、そしてさらに好ましくは１００μＭ〜２ｍＭであることができる。前記ステップ（２）における培養時間は、１時間〜５日間、好ましくは１２時間〜４８時間、そしてさらに好ましくは１８時間〜３０時間であることができる。上記試薬の濃度は細胞が直接触れる培地中の濃度を示す（以下の試薬においても同様である）。
【００２４】
前記分化誘導剤はレチノイン酸(retinoic acid, All Trans)（ＳＩＧＭＡ社、Ｒ−２６２５）であることができる。前記分化誘導剤の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、そしてさらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ステップ（３）においては、ステップ（２）の終了後、ステップ（２）において用いた培地を、前記分化誘導剤含有培地に交換することができる。この新たな培地は、前記分化誘導剤を含有することを除きステップ（１）において用いた培地と同一であることができる。前記ステップ（３）における培養時間は、１時間〜３０日間、好ましくは１２時間〜７日間、さらに好ましくは２日間〜４日間であることができる。
【００２５】
前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、３４４２７３）であることができる。前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであることができる。
【００２６】
前記グリア細胞分化生存作用性因子は、Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ、血小板由来成長因子ＡＡ(platelet-derived growth factor-alpha,alpha)(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ．，３９６−ＨＢ)、塩基性線維芽細胞成長因子(basic-fibroblast growth factor)（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ．，１００−１８Ｂ）、及びそれらの混合物から成る群から選ばれることができ、前記Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎは、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ（商標）（Ｒ＆Ｄ社、３９６−ＨＢ）であることができる。前記グリア細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、前記血小板由来成長因子ＡＡに関しては、この濃度は、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであり、そして前記塩基性線維芽細胞成長因子に関しては、この濃度は、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ステップ（４）における培養時間は、１時間〜３０日間、好ましくは４日間から１０日間であることができる。
【００２７】
本願発明の他の態様においては、前記分化・誘導方法により得られた骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞が提供される。
本願発明のさらに他の態様においては、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物が提供される。
【００２８】
本願明細書中、用語「骨髄間質細胞」とは、骨髄中に存在する造血系以外の細胞をいい、骨、軟骨等の細胞に分化できると考えられている。骨髄間質細胞は、図７の免疫蛍光写真に示すように、Ｔｈｙ１．２が＋、β１−インテグリンが＋、かつ、ＣＤ３４が−である。Ｓ−１００（カルシウム結合タンパク質）は＋のものと−のものがある。上記Ｔｈｙ１．２、β１−インテグリン、及びＣＤ３４に対する抗体を、それぞれ、用いた。
本願明細書中、用語「天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞」とは、生物の体内に存在する末梢神経から採取したＳｃｈｗａｎｎ細胞をいう。図８上段の免疫蛍光写真に示すように、Ｓ−１００＋である。
【００２９】
本願明細書中、用語「骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞」とは、（１）形態学的に天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に酷似し、かつ、継代培養によって骨髄間質細胞の形態に復帰せず、（２）図８下段の免疫蛍光写真に示すように、免疫染色においてＰ７５（nerve growth factor (NGF) receptor、神経成長因子受容体、低親和性）、Ｓ−１００、ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein、中間径フィラメントの一種）、Ｎｅｓｔｉｎ（中間径フィラメントの一種）、及びＯ４（Ｓｃｈｗａｎｎ細胞やオリゴデンドロサイトなどミエリンを作る細胞のマーカー）との反応において天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と同様の反応を示し、そして（３）神経再生能力に関して天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と同様の形質を有するが、分化・誘導履歴の違いにより、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と区別され得るＳｃｈｗａｎｎ細胞をいう。Ｐ７５、Ｓ−１００、ＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔｉｎ、及びＯ４に対する抗体を、それぞれ以下から得た：
Anti-nerve growth factor-receptor, Boehringer Mannheim社、1198645 ; Anti-S-100, DAKO社、z-311 ; Anti-Glial fibrillary acidic protein, DAKO社、L-1812 ; Anti-Nestin, Bioproducts社、BMS4353 ; Anti-O4, Boehringer Mannheim社、1518925。
【００３０】
図９の顕微鏡写真に示すように、本願発明に係る複数段階の処理を行った後の骨髄
間質細胞（図９の右側上下の写真）は、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞（図９の左側の写真）と同様の形態を示す。
図１０に、本願発明に係る骨髄間質細胞の分化・誘導方法において、上記ステップ（２）〜（４）又はその一部の試薬を欠いた場合に得られる骨髄間質細胞の形態を示す。図１０の顕微鏡写真中、上段左端の写真は、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞のものである。下段右端の写真は、処理前の骨髄間質細胞のものである。ここで、上段中央は、本願発明に係る分化・誘導方法におけるステップ（２）〜（４）を省略せずに行ったものであり、本願発明に係る処理により天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と同様の形態を呈する細胞を生じていることがわかる。上段右端の写真は、上記ステップ（４）を省略したものであり、下段左端及び下段中央の写真は、それぞれ、上記ステップ（３）及び上記ステップ（４）における分化誘導剤レチノイン酸及びフォルスコリンを省略したものである。
【００３１】
したがって、上記ステップ（２）〜（４）に記載する複数段階の処理が、骨髄間質細胞を、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に、高効率で、分化・誘導することがわかる。
本願明細書中に使用するとき、用語「高効率」とは、本願発明に係る分化・誘導方法により、出発骨髄間質細胞が、最終骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に変換される割合が高いことをいう。本願発明に係る分化・誘導方法においては、この高効率は、５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上、そして最も好ましくは９５％以上である。上記個々のステップは、いずれも、周知であったけれども、本願発明における上記ステップの選択及び最適な組み合わせは、本願発明者らにより初めて発見された意義はひじょうに高いといえる。なぜなら、上述のように、骨髄間質細胞が、骨芽細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞等に分化・誘導される可能性がある間葉系の幹細胞又は前駆細胞であることは判っていたとしても、骨髄間質細胞を、実際に、神経堤細胞(neural crest cell)由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞に分化させることができるかどうかについては知られておらず、かつ、切望されていたにも拘らず未だかつて誰も実際にこれに成功した者はいなかったからである。いずれの理論に拘束されることを望まないが、本願発明者らは、上記ステップ（２）における還元剤による処理が、細胞にショックを与え、上記ステップ（３）におけるレチノイン酸による処理が、細胞をリセットさせ、そして上記ステップ（４）における、サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及びグリア細胞分化生存作用性因子による処理が、細胞の分化・誘導をもたらすと推定する。
【００３２】
本願発明により、骨髄間質細胞を採取し、複数ステップから成る処理をこれに施すことによって、これを神経再生能力に関する限り天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と同様の形質に、高効率で誘導することができる。この骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を末梢及び中枢神経系に移植することによって障害を受けた神経系の再生・伸長を誘導することが可能となった。
【００３３】
上述のように、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は末梢神経から採取しなくてはならないので人への適応となると困難な面がある。一方、骨髄間質細胞であれば採取が容易であり、人体に障害を残さないで済む。さらに細胞の増殖速度が早いので、大量にしかも迅速に細胞を供給することができるため、本願発明によって、骨髄間質細胞は、種々の神経系の疾患への適応性を広げられたといえる。
さらに、骨髄間質細胞は自家移植が可能であり、これは大変大きな利点であると思われる。自分の骨髄間質細胞を採取して分化・誘導をかけ、神経に移植するのであれば拒絶反応が起きないので免疫抑制剤等の投与が不必要であり、安定した再生が得られるはずである。また、骨髄バンクからも骨髄間質細胞を得ることが可能であるため、供給面からは現実的な対応が可能である。
【００３４】
以下の実施例から明らかなように、本願発明に係る骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は、末梢神経又は中枢神経の再生に広く応用可能であると思われる。
従って、１の態様において、本願発明は、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞自体を提供する。上述のように、これは、分化・誘導の履歴の違いから天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞とは異なる、人為的に改変された物である。他の態様においては、本願発明は、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物として提供される。上述のように、本願発明に係る骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は自家移植可能であるが、他人に移植することもできる。なぜなら、神経系は免疫系による攻撃を受けにくい細胞であり、また、骨髄バンクなどから組織適合抗原の一致したドナーを見つけることができれば、拒絶反応を受けないようにすることができるからである。上記医薬組成物は、慣用の医薬として許容される担体、緩衝液、塩、賦形剤などを含むこともできる。上記組成物は、そのまま罹患部位に注射されることもできるし、中空管に充填された後、中枢神経及び末梢神経切断部位を繋ぐように移植されることができる。
【００３５】
末梢神経はもともと再生するが、数センチのギャップが存在すると再生出来ないことが判っているので、そのようなケースを含めて末梢神経への応用も実用的であると思われる。
再建が不可能とされている中枢神経疾患は、外傷による脊髄損傷や脳血管障害、失明に至る緑内症からパーキンソン氏病などの変性疾患まで実に多種多様の疾患が含まれ、罹患人口は多いものと思われる。本願発明に係る医薬組成物は、多種多様な中枢神経再生のために使用されることができる。上記疾患に対する神経再生法の研究は社会的急務であり、本願発明は、実際の人体への応用に確実に繋がるものと思われる。
【００３６】
以下の実施例により、本願発明をさらに詳細に説明する。但し、本願発明の範囲を何ら限定するものと解してはならない。
【００３７】
【実施例】
実施例１：骨髄間質細胞の、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞への分化・誘導
図１１に、上記分化・誘導処理手順を示す。
成体ラット(Ｗｉｓｔａｒ種)の骨髄より間質細胞を採取し培養する。培地は修飾Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地アルファ（Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification）に２０％のウシ胎児血清（fetus carf serum）を加えたものを用いた。４代まで継代培養し、５０％のコンフルエント（集密confluent）に達した時点で、β−メルカプトエタノール（β-mercaptoethanol） を１ｍＭの濃度で２４時間培養液に添加した。その後レチノイン酸 ３５ｎｇ／ｍｌを加えた培地に切り替えた。培地は Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modificationに２０％のfetus carf serumを加えたものを用いた。３日後、Forskolin ５μＭ、Platelet-derived growth factor-ＡＡ ５ｎｇ／ｍｌ、basic- Fibroblast growth factor １０ｎｇ／ｍｌ、Heregulin （商標）２００ｎｇ／ｍｌを培地に添加したものにさらに切り替えた。７日後に細胞の免疫染色を行った。P75、O4、S-100、GFAP、及びNestin抗体とで反応させたところ、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と同様の反応を示した（図８参照）。上記骨髄間質細胞は、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と形態学的に同様の形態に誘導された（図９参照）。
【００３８】
実施例２：中枢神経（切断視神経）の再生
実施例１において得られた細胞をTrypsin処理によって回収し、マウスＥＨＳ腫瘍由来の細胞外基質Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Collaborative Biomedical Products社、40234A）と混合後、人工的なチューブ（Amicon社、Hellow fiber Cartridge, HIP10-43）に充填し、成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ種）の切断視神経（中枢神経）と縫合し、移植した。
【００３９】
図１２に、移植１０日後のＧＡＰ４３（growth associated protein-43、神経線維が成長・伸長するときに発現するタンパク質）標識の結果を示す。青色矢印は、移植片起始部、そして赤色矢印は、再生線維先端部を示す。無処理骨髄間質細胞（左側）に比較して、分化誘導骨髄間質細胞（右側）では、神経線維が有意に伸びていることがわかる。神経線維の伸長距離と線維数は週数と共に増加していた。
移植３週間後の結果を図１３に示す。図中、緑色のＦＩＴＣは、視神経線維のみを特異的に標識するために硝子体内にCholeratoxin B Subunitを注入し、順行性に標識したものを免疫組織化学で検出したものであり、人工的チューブ内に再生した神経線維を示す。赤色のＴｅｘＲｅｄは、培養下において骨髄間質細胞を予めＢｒｄ−Ｕを用いて標識したものを表す。そして青色のＡｌｅｘａ６６３は、ＭＡＧ（myelin-associated glycoprotein）を表す。骨髄細胞を充填した人工的チューブ内への視神経の再生が見られ、かつ、それらはＢｒｄ−Ｕで標識された骨髄間質細胞と接触し、ミエリン形成も起きていることが確認された。
【００４０】
実施例３：末梢神経（坐骨神経）の再生
成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ種）の坐骨神経を切断し、人工的チューブに分化誘導をかけた。骨髄間質細胞を充填し、吻合した。
【００４１】
図１４に、移植７日後のＧＡＰ４３（growth-associated protein-43）標識の結果を示す。青色矢印は、移植片起始部、そして赤色矢印は、再生線維先端部を示す。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（細胞外基質）のみ（左側）に比較して、分化誘導骨髄間質細胞（右側）では、神経線維が伸びていることがわかる。神経線維の伸長距離と線維数は週数と共に増加していた。
移植後４週間目の結果を図１５に示す。図中、緑色のＧＦＰ（green fluorescent protein）は、骨髄間質細胞を緑色の蛍光の遺伝子（ＧＦＰ）をレトロウイルスを用いて光らせたものであり；青色のＭＡＧは、ミエリン・タンパク質であり；そして赤色のＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔは、再生した神経線維である。図１５から、移植から４週間後に坐骨神経が見事に再生されていることがわかる。
【００４２】
図１６、図１７、及び図１８に移植から４週間後の坐骨神経の再生結果を示す。緑色のＧＦＰは、骨髄間質細胞を緑色の蛍光の遺伝子を導入して光らせたものであり；青色のＭＡＧは、Ａｌｅｘａ６３３という蛍光標識を用いてミエリン・タンパク質ＭＡＧを検出したものであり；そして赤色のＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔは、Ａｌｅｘａ５４６という赤い蛍光標識を用いて検出した再生神経線維である。図１６〜１８から、移植から４週間後に坐骨神経（末梢神経）が完全に再生されていることがわかる。即ち、再生した線維（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）はＧＦＰで緑色に光る骨髄間質細胞と接触し、さらに骨髄間質細胞がミエリン・タンパク質ＭＡＧを発現し、ミエリンを形成していることがわかる。
【００４３】
参考文献一覧
１．Schwab, ME et al : Rat CNS myelin and a subtype of oligodendrocytes in culture represent a nonpermissive substrate for neurite growth and fibroblast spreading. J Neurosci 8 : 2381-2393, 1988
２．Hall, S et al : Electron microscopic study of the interaction of axons and glia at the site of anastomosis between the optic nerve and cellular or acellular sciatic nerve grafts. J Neurocytol 18 : 171-184, 1989
３．Snow, DM et al : Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite out-growth in vitro. Exp Neurobiol 109 : 111-130, 1990
４．Blaugrund, E et al : Disappearance of astrocytes and invasion of macrophages following crush injury of adult rodent optic nerves : implications for regeneration. Exp Neurol 118 : 105-115, 1992
５．Bastmeyer, M et al : Similarities and differences between fish oligodendrocytes and Schwann cells in vitro. Glia 11 : 300-314, 1994
６．Vidal-Sanz, M et al : Axonal regeneration and synapse formation in the superior colliculus by retinal ganglion cells in the adult rat. J Neurosci 7 : 2894-2909, 1987
７．Dezawa, M et al : The role of Schwann cells during retinal ganglion cell regeneration induced by peripheral nerve trans-plantation. Invest Ophthalmol Vis Sci 38 : 1401-1410, 1997
８．Aguago, A. J. et al. ; A potential for axonal regeneration in neurons of the adult manmalian nervous system. In Nervous System Regeneration, B. Haber, J. R. Perez-Polo, G. A. Hashim and A.M.G. Stella eds., pp.327-340, Alan R. Liss, New York, 1983
９．Chen, M. S. et al. ; Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature 403 : 434-439, 2000
10. NEDO H11年度提案公募事業成果報告予稿集９提案公募：97S09-003 「分化機保持細胞株の樹立とこれを用いた生体組織機能の再構築に関する研究」帯刀 益夫 東北大学教授
【図面の簡単な説明】
【図１】修復時の視神経グリア細胞の変化を説明する。
【図２】末梢神経と中枢神経（視神経を含む）構造的相違を説明する。
【図３】末梢神経におけるＷａｌｌｅｒ変性を説明する。
【図４】Ｓｃｈｗａｎｎ細胞の関与する神経再生因子を説明する。
【図５】神経細胞の分化・系統図を表す。
【図６】胚葉の概念を超えて細胞が全く別の細胞になる可能性があるＴｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎを説明する。
【図７】分化・誘導前の骨髄間質細胞の形質を示す、図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図８】天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と比較した、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞の形質を示す、図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図９】天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と比較した、本願発明に係る分化・誘導方法により得られた骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１０】天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と天然骨髄間質細胞に比較した、本願発明に係る分化・誘導方法により得られた骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、及び上記方法におけるステップを一部省略した方法により得られた細胞の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）である。
【図１１】本願発明に係る分化・誘導方法の概要を説明する図である。
【図１２】ＧＡＰ４３を指標とした視神経の再生を示す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１３】ＦＩＴＣ、ＴｅｘＲｅｄ、及びＡｌｅｘａ６３３を指標とした視神経の再生を示す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１４】ＧＡＰ４３を指標とした坐骨神経の再生を示す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１５】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１６】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１７】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１８】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。

Claims (14)

1. 骨髄間質細胞を、インビトロにおいて、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に分化・誘導させる方法であって、以下のステップ：
   （１） 骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培
   地中で培養し；
   （２） 還元剤を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し；
   （３） レチノイン酸を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し；並びに
   （４） Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、及び／又は神経とグリア細胞に作用する分化・生存・
   増殖因子を上記培養液に添加し、さらに培養して骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗ
   ａｎｎ細胞を得る；
   を含む前記分化・誘導方法。
2. 前記標準的な基礎培地がＥａｇｌｅ’ｓアルファ修飾最小必須培地である、請求項１に記載の分化・誘導方法。
3. 前記血清がウシ胎児血清である、請求項１又は２に記載の分化・誘導方法。
4. 前記還元剤がＳＨ試薬である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
5. 前記ＳＨ試薬がβ−メルカプトエタノールである、請求項４に記載の分化・誘導方法。
6. 前記還元剤の濃度が、１ｎＭ〜１０ｍＭである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
7. 前記ステップ（２）における培養時間が、１時間〜５日間である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
8. 前記レチノイン酸の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
9. 前記ステップ（３）における培養時間が、３０日以内である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
10. 前記Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎの濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
11. 前記グリア細胞分化生存作用性因子が、Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ、血小板由来成長因子ＡＡ、塩基性線維芽細胞成長因子、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
12. 前記Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎが、Ｓｕｂｔｙｐｅの１つであるＨｅｒｅｇｕｌｉｎである、請求項１１に記載の分化・誘導方法。
13. 前記グリア細胞分化生存作用性因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
14. 前記ステップ（４）における培養時間が、３０日以内である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。

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