JP4238557B2 - ハイモビリティーグループタンパクと親和性を有するペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイモビリティーグループタンパク（以下、ＨＭＧタンパクと略す）に親和性を有するペプチド、特に、ＨＭＧタンパクの高感度な定量、ＨＭＧタンパクの関与する疾患などの治療に用いられるペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＭＧタンパクは、真核細胞内に存在する非ヒストン性のＤＮＡ結合タンパクであり、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２、ＨＭＧ１４、ＨＭＧ１７、ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）等が知られている。ＨＭＧは本来細胞内でＤＮＡに結合して転写の促進や細胞の増殖などの機能に関与すると考えられてきたが、神経細胞の表面に存在して神経突起を伸長させる因子として見出されていたアンフォテリンがＨＭＧタンパクの一つであるＨＭＧ−１であることが示され、ＨＭＧタンパクが幅広い作用を有する可能性が示されている。
【０００３】
最近、このＨＭＧ−１が細胞外に分泌され、敗血症ショックの強力なメディエーターとして作用するという興味深い報告がなされた（たとえば、非特許文献１参照）。すなわち、マウスにリポポリサッカロイド（ＬＰＳ）を投与すると８−２４時間後に血清中のＨＭＧ−１濃度が顕著に上昇しマウスは死に至る。精製したＨＭＧ−１自体をＬＰＳと同時にマウスに投与した場合も相乗的に作用して致死活性を示し、また抗ＨＭＧ−１抗体を投与するとＬＰＳによる致死作用が抑制されることから、ＨＭＧ−１がエンドトキシンショックの重要なメディエーターとなることが示された。ヒトにおいても、敗血症患者血中でＨＭＧ−１濃度が顕著に上昇し、特に死亡例において高いことが示された。ＨＭＧ−１は出血性ショックにおいても血中濃度の上昇が認められている。また、ＨＭＧタンパクが癌の増殖に関与することも報告されている（たとえば、非特許文献２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
ワン（Ｗａｎｇ Ｈ）他１８名、「マウスにおけるエンドトキシン侵襲の後期メディエーターとしてのＨＭＧ−１（ＨＭＧ−１ ａｓ ａ ｌａｔｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、（アメリカ）、１９９９年、２８５号、ｐ２４８−２５１
【０００５】
【非特許文献２】
タグチ（Ｔａｇｕｃｈｉ Ａ）他１８名、「ＲＡＧＥ−アンホテリン情報伝達を阻害すると腫瘍の成長と転移が抑制される（Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＲＡＧＥ−ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（イギリス）、２０００年、４０５号、ｐ３５４−３６０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、血中のＨＭＧタンパクは敗血症などの疾患の病態と密接に関連することが示されており、その血中濃度を正確かつ高感度に測定することは疾患の診断のために非常に重要と考えられる。これまでＨＭＧタンパクの測定はウェスタンブロット法、酵素免疫測定法などの抗体を用いた免疫学的検出法によって行われてきたが、定量性・測定感度等が必ずしも充分ではなかった。これは、ＨＭＧタンパクは、動物種間の配列の類似性が非常に高いために通常の免疫操作では親和性の高い抗体が得られにくいという問題点に起因すると考えられる。従って、より高感度の検出を行うためには抗体以外の親和性物質を取得する必要があると考えられる。さらには、ＨＭＧタンパクと結合してその作用を阻害する物質は治療薬として非常に有用と考えられるが、この目的においても抗体よりも親和性が高く、抗体よりも分子量の小さい物質を取得することが強く望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するため、本発明は以下のような構成を取る。
（１）ハイモビリティーグループタンパクに親和性を有するペプチドであって、３０個以下のアミノ酸で構成されることを特徴とするペプチド。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有することを特徴とするペプチド。
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有することを特徴とするペプチド。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有するペプチド。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有するペプチド。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを提示するファージ。
（７）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のペプチドをその部分として含み、ハイモビリティーグループタンパクに親和性を有するペプチド。
（８）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（９）ＤＮＡである（８）に記載のポリヌクレオチド。
（１０）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを用いたハイモビリティーグループタンパクを測定する方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含むハイモビリティーグループタンパクを測定するキット。
（１２）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含む敗血症の治療薬。
（１３）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含む癌の治療薬。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明でいうＨＭＧタンパクとは、哺乳動物におけるＨＭＧタンパクを指し、ヒトのＨＭＧ−1、ＨＭＧ−２、ＨＭＧ１４、ＨＭＧ１７、ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）等を含む。
【０００９】
本発明でいうＨＭＧタンパクに親和性のあるペプチドとはＨＭＧタンパクに非共有結合、すなわちイオン結合、疎水結合、水素結合などにより結合しうるペプチドのことをいう。ペプチドがＨＭＧに対して親和性を有するかどうかを調べるには固相化したＨＭＧタンパクとペプチドまたはペプチドを提示するファージと反応させ、未結合の物質を洗浄除去した後に結合したペプチドまたはペプチドを提示するファージを抗体などで検出する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により確認することが可能である。
【００１０】
本発明においてＨＭＧタンパクに親和性を有するペプチドまたはファージとは、プレートにＨＭＧタンパクを固相化し、これにペプチドまたはファージを反応させて結合したペプチドまたはファージを酵素標識２次抗体などを用いて検出するＥＬＩＳＡ法において、無関係な配列を持つコントロールのペプチドまたはファージと比べて２倍以上の吸光度を示すものをいう。
【００１１】
本発明のペプチドはＨＭＧタンパクに親和性を有する３０アミノ酸残基以下の長さのペプチドからなる。また、Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ（配列表の配列番号１）、もしくはＧｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ（配列表の配列番号２）、もしくはＶａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ ＴｈｒＡｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ（配列表の配列番号３）、もしくはＣｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔ（配列表の配列番号４）で表されるアミノ酸配列で特定されるペプチドからなるものが含まれる（上記配列中、左側末端はＮ末端、右側末端はＣ末端を表し、構成アミノ酸残基は通常の３文字表記で表現してある）。上記アミノ酸配列で特定される本発明のペプチドはＨＭＧタンパクに親和性を有することを特徴としている。本発明のペプチドには、上記の特定のペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在しており、かつ、実質的にＨＭＧタンパクに親和性を有するペプチドも包含される。置換及び／又は挿入される１又は２以上のアミノ酸の種類は特に限定されないが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在するペプチドが、実質的にＨＭＧタンパク親和性を有しているか否かは、当業者が容易に確認することが可能である。
【００１２】
本発明は、上記のペプチドを表面に提示するファージも含まれる。その場合のファージの種類は特に限定されないが、繊維状ファージが好適に用いられる。また、本発明のペプチドには、上記の各ペプチドをその部分配列として含み、実質的にＨＭＧタンパクに親和性を有するペプチドも包含される。尚、特定のタンパク・ペプチドにアミノ酸を置換、欠損もしくは挿入させることによって修飾する技術は、例えば欧州特許第７７１０９号明細書または英国特許出願公開第２１１９８０４号明細書などにより知られている。例えば欧州特許第７７１０９号明細書にはベクターを１本鎖にして１残基変異の入ったプライマーとアニールさせて大腸菌ポリメラーゼと混ぜることによりコードするアミノ酸を置換する方法が開示されている。
【００１３】
本発明のハイモビリティーグループに親和性を有するペプチドであって、３０個以下のアミノ酸で構成されるペプチドは、たとえばランダムペプチドライブラリーを用いた技術を利用して以下のような方法で製造することができる。
【００１４】
ランダムペプチドライブラリーとしてはファージランダムペプチドライブラリーなどを用いることができるが、ファージランダムペプチドライブラリーの種類及び調製方法は特に限定されず、市販のライブラリーを購入して用いても良い。
【００１５】
ランダムペプチドライブラリーのペプチドの長さは、製造しようとするペプチドの長さに応じて選択されるべきで、３０残基以下であることが好ましく、製造しようとするペプチドの長さが短いものであるならば、２０残基や１５残基のものも使用することができる。
【００１６】
ＨＭＧタンパクと親和性を有するペプチドを提示するファージは、カラムやプレート上にＨＭＧタンパクを直接あるいは抗体等を介して固定化し、ペプチドライブラリーを接触させ、非結合ファージを洗浄で洗い流した後に、結合しているファージを酸などで溶出させるという方法により選択することができる。親和性の高いファージを得るためには、この選択操作を２回以上繰り返し行うことが望ましい。得られたファージを単一クローン化し、ＤＮＡ配列を解析することにより提示されたペプチドの配列を決定することができる。
【００１７】
上記の方法で配列が決定されたペプチド（本発明の配列番号１〜４の各ペプチドを含む）および該ペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在するものは、ペプチド合成に用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することができる。また、固相法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することができる。
【００１８】
また、配列番号１〜４の各ペプチド及び該ペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在するものは、通常の遺伝子発現操作等の生物学的手法に従って、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組み換えベクターを用いて、該ベクターにより形質転換された微生物（形質転換体）を調製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のペプチドを分離・精製することによっても製造可能である。その際に、アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失を導入する方法については上述の通りである。
【００１９】
本発明にかかる上記の各種ペプチドを提示するファージは、上記の各種ペプチドアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、制限酵素で切断したファージＤＮＡに組み込み、大腸菌に感染させ、培養上清から、ポリエチレングリコール沈殿等により取得することが可能である。
【００２０】
本発明にかかるペプチドをコードするポリヌクレオチドは上述のファージＤＮＡを鋳型として複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより得られる（たとえば米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書参照。）。本質的に、ＰＣＲは配列の２つの資料部分が知られているときに、選ばれたＤＮＡ配列の産生を可能にする。問題の配列のそれぞれの末端に相当するプライマー、すなわちオリゴヌクレオチド・プローブがえられる。ＰＣＲを使用して、ポリヌクレオチド配列の中心部分が次いで合成により産生される。またコードするポリヌクレオチドがＤＮＡである場合増幅したファージクローンを大腸菌に感染し培養・増幅させた後、遺伝子を抽出することにより得られる。
【００２１】
本発明にかかるペプチドまたはファージを用いてＨＭＧタンパクを測定する方法は、ＥＬＩＳＡ法・ウェスタンブロット法等の手法により可能である。例えばＥＬＩＳＡであるならば、プレートに抗ＨＭＧタンパク抗体または本発明のペプチドまたはファージを固相化し、これにＨＭＧタンパクを含むサンプルを反応させ、結合したＨＭＧタンパクを酵素標識した本発明のペプチドで測定することができる。ペプチドをビオチン標識して酵素標識アビジンで検出することも可能である。また、ペプチド提示ファージを反応させ、酵素標識抗ファージ抗体を用いて検出することも可能である。ウェスタンブロット法によってＨＭＧタンパクの測定を行うにはポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったゲルをメンブランに転写させ転写されたＨＭＧタンパクと酵素標識された本発明のペプチドを反応させることによってＨＭＧタンパクを測定することができる。
【００２２】
また、本発明にかかるペプチドを含むＨＭＧタンパクの測定キットは例えば以下のような構成をとる。例えば、ＨＭＧの体液中の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定するキットであれば、抗ＨＭＧタンパク抗体固相化プレート、酵素で標識されたＨＭＧタンパクと親和性を有する本発明のペプチド、および既知濃度のＨＭＧタンパク標準液を構成要素として含み、抗ＨＭＧタンパク抗体固相化プレートとＨＭＧタンパクを反応の後、これと酵素標識されたペプチドを反応させ酵素基質を加えて発色させることにより使用可能である。
【００２３】
本発明に係るペプチドまたはファージは、生体に投与することにより体内のＨＭＧタンパクと結合してその作用を阻害することが期待でき、それにより敗血症または癌の処置のための医薬製剤または処方に使用することができる。本発明は、上述の症状の治療薬を提供する。該治療薬は、医薬として許容される担体と混合することができ、さらに非経口的に全身に投与しうる。必要であれば、該治療薬は皮下、局所、例えば障害部位に投与できる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）ＨＭＧ−１の作製
ＨＬ６０細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、その培養上清を原料としてヘパリンカラムクロマトグラフィーおよびＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーにより精製した。
（２）ファージを用いたＥＬＩＳＡ法によるＨＭＧ−１の測定
ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートのウェルに５μｇ／ｍｌの抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体ＰＢＳ溶液を入れ４℃で一晩固相化を行い、抗体ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８．１０ｍＭ Ｎａ2ＰＯ４・１２Ｈ2Ｏ，２．６８ｍＭ ＫＣｌ，１．４７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4）溶液を除去した後、０．５％ＢＳＡを溶解させたＰＢＳを入れブロッキングを行った。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、緩衝液（０．２５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ）を含む０．１ＭＴｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ８．０））５０μｌ及び種々濃度のＨＭＧ−１を添加した希釈液（０．２５％ＢＳＡ，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ），０．００１％フェノールレッドを含むＰＢＳ−Ｔ溶液）５０μｌを加えて２５℃で６０分反応させた。各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後１．０×１０12Ｔｕ／ｍｌのペプチド提示ファージを含む希釈液１００μｌを入れ２５℃で６０分反応させた。ファージ溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、希釈液で５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体（アマシャムバイオサイエンス社）溶液を１００μｌ入れ２５℃で３０分反応させた。ファージ溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色液（０．００６％過酸化水素，０．２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸―クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を１００μｌ分注して１５分反応させた。反応後、１Ｎ硫酸を１００μｌ加え反応を止めた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
（３）ＨＭＧ−１親和性ペプチドを提示したファージの作製
シャーレに０．５μｇ／ｍｌのＨＭＧ−１を溶解させたＰＢＳを２ｍｌ加え４℃で一晩放置して固相化を行った。シャーレから溶液を除去し０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を溶解させたＰＢＳを８ｍｌ入れブロッキングを行った。シャーレをＰＢＳで洗浄後、１５残基のランダム配列ペプチドを発現させたファージライブラリーを入れ室温で３０分放置した。液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０秒間３回、及び５分間３回の洗浄を行った。５０ｍＭ グリシン−塩酸バッファー（ｐＨ２．４）４００μｌを加え５分間放置して、結合したファージを解離させて回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）８０μｌを加え中和した。回収したファージを大腸菌に感染させ培養し増殖させた。増殖したファージをＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法で精製し、再度ＨＭＧ−１との反応に用いた。これらの操作を３ラウンド行った。３ラウンド選択後のファージを感染させた大腸菌とＬＢプレートで培養し、シングルコロニーをピックアップし、ＬＢ培地で一晩培養した培養上清中に産生されたファージをＰＥＧ法を用いて１４０コロニー精製回収した。回収したファージを上記（２）のＥＬＩＳＡ法を用いて吸光度が抗ＨＭＧ−１抗体を用いたときより２倍以上であったものを選択し、ファージＤＮＡを抽出し配列を解析した。その結果、以下のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が見出された。
配列番号１；Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ
配列番号２；Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ
配列番号３；Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
配列番号４；Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔ
（実施例１）配列番号１を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒを含むペプチドをコードし、末端に下記プライマーに相補的な配列を付加したＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法で増幅させた。ＰＣＲは２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭ ５’末端ビオチン化ＳＥＮＳＥプライマー（５’−ＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＧ−３’）、０．５μＭ ５’末端ビオチン化ＡＮＴＩＳＥＮＳＥプライマー（５’−ＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’）、５０ｐｇ ポリヌクレオチドの条件で行った。ＰＣＲにはＴａｋａｒａ社のＴａｑポリメラーゼおよび添付されたＰＣＲ用バッファーを使用した。１サイクルを９６℃で０．５分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間とし、計３５サイクルの増幅を行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈殿させ、得られたＤＮＡをＢｇｌＩを用いて３７℃で１時間処理した。その後、アビジン化アガロースを用いてビオチン化ＤＮＡフラグメントを除去し、溶液をフェノール／クロロホルム抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。得られたＤＮＡを滅菌水に溶解してインサートＤＮＡとした。繊維状ファージＤＮＡ（ＦＵＳＥ５）をＳｆｉＩで５０℃で約１９時間反応し、ファージベクターＤＮＡの切断を行った。反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。得られたＤＮＡを滅菌水に溶解した後、クロマスピン ＴＥ４００（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて精製した。ファージベクターＤＮＡとインサートＤＮＡのライゲーションは１０-13ｐｍｏｌのＳｆｉＩ切断ＦＵＳＥ５ ＤＮＡと１０-12ｍｏｌのインサートＤＮＡとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績（株）製）を用いて１６℃、３．５時間処理した。反応液をフェノール／クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈殿させる。得られたＤＮＡを滅菌水に溶解した後、−２０℃で保存した。ヒートショック法で大腸菌の形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地プレートに形質転換した大腸菌希釈液１００μｌを撒き、３７℃で終夜培養した。生じたシングルコロニーをピックアップし５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養した培養上清中に産生されたファージ（実施例１）をＰＥＧ法を用いて精製回収した。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
（実施例２）スクリーニングによる配列番号２を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａを含むペプチドをコードするＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で行った。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
（実施例３）スクリーニングによる配列番号３を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕを含むペプチドをコードするＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で行った。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
（実施例４）スクリーニングによる配列番号４を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔを含むペプチドをコードするＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で行った。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
【００２５】
実施例１〜実施例４のファージのＨＭＧ−１への結合性の結果を図１に示す。
【００２６】
（比較例１）ＨＲＰ標識抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体を用いて上記（ｂ）のＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による検出を行った。この場合、ペプチド提示ファージ及びＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージ抗体の代わりに、ＨＲＰ標識抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体を用いた。結果を図２に示す。
【００２７】
ペプチド提示ファージを用いることにより（実施例１〜実施例４）、モノクローナル抗体を用いる従来の方法（比較例１）よりもＨＭＧ−１の検出感度が大幅に向上した。
（実施例５）配列番号１を提示したペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチドの製法
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒを有するペプチドをペプチド合成機で合成する。
（ｂ）ペプチドを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートのウェルに５μｇ／ｍｌの抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体ＰＢＳ溶液を入れ４℃で一晩固相化を行い、抗体ＰＢＳ溶液を除去した後、０．５％ＢＳＡを溶解させたＰＢＳを入れブロッキングを行う。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、緩衝液（０．２５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ）を含む０．１ＭＴｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ８．０））５０μｌ及び種々濃度のＨＭＧ−１を添加した希釈液（０．２５％ＢＳＡ，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ），０．００１％フェノールレッドを含むＰＢＳ−Ｔ溶液）５０μｌを加えて２５℃で６０分反応させる。各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、あらかじめビオチン化したペプチド溶液を１００μｌ入れ２５℃で６０分反応させる。ペプチド溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、希釈液で希釈したＨＲＰ標識アビジン溶液を入れ２５℃で３０分反応させる。溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色液（０．００６％過酸化水素，０．２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸―クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を１００μｌ分注して１５分反応させる。反応後、１Ｎ硫酸を１００μｌ加え反応を止める。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定する。
（実施例６）配列番号２のペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡによる検出
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａを有するペプチドをペプチド合成機で合成し、実施例５と同様に行う。
（実施例７）配列番号３のペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡによる検出
アミノ酸配列Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕを有するペプチドをペプチド合成機で合成し、実施例５と同様に行う。
（実施例８）配列番号４のペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡによる検出
アミノ酸配列Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔを有するペプチドをペプチド合成機で合成し、実施例５と同様に行う。
【００２８】
実施例５〜８のＥＬＩＳＡにより、コントロールのペプチドを用いた場合と比べて有意に高い発色が得られる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のペプチド、またはそのペプチドを提示するファージはＨＭＧタンパクに親和性を有しており、このペプチドを合成もしくはライブラリーからのスクリーニングで得ることによりＨＭＧタンパクの高感度な定量が可能になる。また、本発明のペプチド、またはそのペプチドを提示するファージにアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドもＨＭＧタンパクに親和性を有し、ＨＭＧタンパクの高感度な定量が可能である。また本発明のペプチドまたはペプチドを提示するファージを用いることによりＨＭＧタンパクを測定するキットを提供することが可能である。また、本発明のペプチド、またはペプチドを提示するファージは、敗血症の治療薬等の有効成分として有用である。また、本発明のペプチド、またはペプチドを提示するファージは、癌の治療薬等の有効成分として有用である。
【００３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１の測定結果（実施例１〜４）である。
【図２】抗ＨＭＧ−１抗体を用いたＨＭＧ−１の測定結果（比較例１）である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイモビリティーグループタンパク（以下、ＨＭＧタンパクと略す）に親和性を有するペプチド、特に、ＨＭＧタンパクの高感度な定量、ＨＭＧタンパクの関与する疾患などの治療に用いられるペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＭＧタンパクは、真核細胞内に存在する非ヒストン性のＤＮＡ結合タンパクであり、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２、ＨＭＧ１４、ＨＭＧ１７、ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）等が知られている。ＨＭＧは本来細胞内でＤＮＡに結合して転写の促進や細胞の増殖などの機能に関与すると考えられてきたが、神経細胞の表面に存在して神経突起を伸長させる因子として見出されていたアンフォテリンがＨＭＧタンパクの一つであるＨＭＧ−１であることが示され、ＨＭＧタンパクが幅広い作用を有する可能性が示されている。
【０００３】
最近、このＨＭＧ−１が細胞外に分泌され、敗血症ショックの強力なメディエーターとして作用するという興味深い報告がなされた（たとえば、非特許文献１参照）。すなわち、マウスにリポポリサッカロイド（ＬＰＳ）を投与すると８−２４時間後に血清中のＨＭＧ−１濃度が顕著に上昇しマウスは死に至る。精製したＨＭＧ−１自体をＬＰＳと同時にマウスに投与した場合も相乗的に作用して致死活性を示し、また抗ＨＭＧ−１抗体を投与するとＬＰＳによる致死作用が抑制されることから、ＨＭＧ−１がエンドトキシンショックの重要なメディエーターとなることが示された。ヒトにおいても、敗血症患者血中でＨＭＧ−１濃度が顕著に上昇し、特に死亡例において高いことが示された。ＨＭＧ−１は出血性ショックにおいても血中濃度の上昇が認められている。また、ＨＭＧタンパクが癌の増殖に関与することも報告されている（たとえば、非特許文献２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
ワン（Ｗａｎｇ Ｈ）他１８名、「マウスにおけるエンドトキシン侵襲の後期メディエーターとしてのＨＭＧ−１（ＨＭＧ−１ ａｓ ａ ｌａｔｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、（アメリカ）、１９９９年、２８５号、ｐ２４８−２５１
【０００５】
【非特許文献２】
タグチ（Ｔａｇｕｃｈｉ Ａ）他１８名、「ＲＡＧＥ−アンホテリン情報伝達を阻害すると腫瘍の成長と転移が抑制される（Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＲＡＧＥ−ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（イギリス）、２０００年、４０５号、ｐ３５４−３６０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、血中のＨＭＧタンパクは敗血症などの疾患の病態と密接に関連することが示されており、その血中濃度を正確かつ高感度に測定することは疾患の診断のために非常に重要と考えられる。これまでＨＭＧタンパクの測定はウェスタンブロット法、酵素免疫測定法などの抗体を用いた免疫学的検出法によって行われてきたが、定量性・測定感度等が必ずしも充分ではなかった。これは、ＨＭＧタンパクは、動物種間の配列の類似性が非常に高いために通常の免疫操作では親和性の高い抗体が得られにくいという問題点に起因すると考えられる。従って、より高感度の検出を行うためには抗体以外の親和性物質を取得する必要があると考えられる。さらには、ＨＭＧタンパクと結合してその作用を阻害する物質は治療薬として非常に有用と考えられるが、この目的においても抗体よりも親和性が高く、抗体よりも分子量の小さい物質を取得することが強く望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するため、本発明は以下のような構成を取る。
（１）ハイモビリティーグループタンパクに親和性を有するペプチドであって、３０個以下のアミノ酸で構成されることを特徴とするペプチド。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有することを特徴とするペプチド。
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有することを特徴とするペプチド。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有するペプチド。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパクと親和性を有するペプチド。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを提示するファージ。
（７）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のペプチドをその部分として含み、ハイモビリティーグループタンパクに親和性を有するペプチド。
（８）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（９）ＤＮＡである（８）に記載のポリヌクレオチド。
（１０）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを用いたハイモビリティーグループタンパクを測定する方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含むハイモビリティーグループタンパクを測定するキット。
（１２）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含む敗血症の治療薬。
（１３）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含む癌の治療薬。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明でいうＨＭＧタンパクとは、哺乳動物におけるＨＭＧタンパクを指し、ヒトのＨＭＧ−1、ＨＭＧ−２、ＨＭＧ１４、ＨＭＧ１７、ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ）等を含む。
【０００９】
本発明でいうＨＭＧタンパクに親和性のあるペプチドとはＨＭＧタンパクに非共有結合、すなわちイオン結合、疎水結合、水素結合などにより結合しうるペプチドのことをいう。ペプチドがＨＭＧに対して親和性を有するかどうかを調べるには固相化したＨＭＧタンパクとペプチドまたはペプチドを提示するファージと反応させ、未結合の物質を洗浄除去した後に結合したペプチドまたはペプチドを提示するファージを抗体などで検出する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により確認することが可能である。
【００１０】
本発明においてＨＭＧタンパクに親和性を有するペプチドまたはファージとは、プレートにＨＭＧタンパクを固相化し、これにペプチドまたはファージを反応させて結合したペプチドまたはファージを酵素標識２次抗体などを用いて検出するＥＬＩＳＡ法において、無関係な配列を持つコントロールのペプチドまたはファージと比べて２倍以上の吸光度を示すものをいう。
【００１１】
本発明のペプチドはＨＭＧタンパクに親和性を有する３０アミノ酸残基以下の長さのペプチドからなる。また、Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ（配列表の配列番号１）、もしくはＧｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ（配列表の配列番号２）、もしくはＶａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ ＴｈｒＡｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ（配列表の配列番号３）、もしくはＣｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔ（配列表の配列番号４）で表されるアミノ酸配列で特定されるペプチドからなるものが含まれる（上記配列中、左側末端はＮ末端、右側末端はＣ末端を表し、構成アミノ酸残基は通常の３文字表記で表現してある）。上記アミノ酸配列で特定される本発明のペプチドはＨＭＧタンパクに親和性を有することを特徴としている。本発明のペプチドには、上記の特定のペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在しており、かつ、実質的にＨＭＧタンパクに親和性を有するペプチドも包含される。置換及び／又は挿入される１又は２以上のアミノ酸の種類は特に限定されないが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在するペプチドが、実質的にＨＭＧタンパク親和性を有しているか否かは、当業者が容易に確認することが可能である。
【００１２】
本発明は、上記のペプチドを表面に提示するファージも含まれる。その場合のファージの種類は特に限定されないが、繊維状ファージが好適に用いられる。また、本発明のペプチドには、上記の各ペプチドをその部分配列として含み、実質的にＨＭＧタンパクに親和性を有するペプチドも包含される。尚、特定のタンパク・ペプチドにアミノ酸を置換、欠損もしくは挿入させることによって修飾する技術は、例えば欧州特許第７７１０９号明細書または英国特許出願公開第２１１９８０４号明細書などにより知られている。例えば欧州特許第７７１０９号明細書にはベクターを１本鎖にして１残基変異の入ったプライマーとアニールさせて大腸菌ポリメラーゼと混ぜることによりコードするアミノ酸を置換する方法が開示されている。
【００１３】
本発明のハイモビリティーグループに親和性を有するペプチドであって、３０個以下のアミノ酸で構成されるペプチドは、たとえばランダムペプチドライブラリーを用いた技術を利用して以下のような方法で製造することができる。
【００１４】
ランダムペプチドライブラリーとしてはファージランダムペプチドライブラリーなどを用いることができるが、ファージランダムペプチドライブラリーの種類及び調製方法は特に限定されず、市販のライブラリーを購入して用いても良い。
【００１５】
ランダムペプチドライブラリーのペプチドの長さは、製造しようとするペプチドの長さに応じて選択されるべきで、３０残基以下であることが好ましく、製造しようとするペプチドの長さが短いものであるならば、２０残基や１５残基のものも使用することができる。
【００１６】
ＨＭＧタンパクと親和性を有するペプチドを提示するファージは、カラムやプレート上にＨＭＧタンパクを直接あるいは抗体等を介して固定化し、ペプチドライブラリーを接触させ、非結合ファージを洗浄で洗い流した後に、結合しているファージを酸などで溶出させるという方法により選択することができる。親和性の高いファージを得るためには、この選択操作を２回以上繰り返し行うことが望ましい。得られたファージを単一クローン化し、ＤＮＡ配列を解析することにより提示されたペプチドの配列を決定することができる。
【００１７】
上記の方法で配列が決定されたペプチド（本発明の配列番号１〜４の各ペプチドを含む）および該ペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在するものは、ペプチド合成に用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することができる。また、固相法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することができる。
【００１８】
また、配列番号１〜４の各ペプチド及び該ペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在するものは、通常の遺伝子発現操作等の生物学的手法に従って、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組み換えベクターを用いて、該ベクターにより形質転換された微生物（形質転換体）を調製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のペプチドを分離・精製することによっても製造可能である。その際に、アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及び／又は欠失を導入する方法については上述の通りである。
【００１９】
本発明にかかる上記の各種ペプチドを提示するファージは、上記の各種ペプチドアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、制限酵素で切断したファージＤＮＡに組み込み、大腸菌に感染させ、培養上清から、ポリエチレングリコール沈殿等により取得することが可能である。
【００２０】
本発明にかかるペプチドをコードするポリヌクレオチドは上述のファージＤＮＡを鋳型として複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより得られる（たとえば米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書参照。）。本質的に、ＰＣＲは配列の２つの資料部分が知られているときに、選ばれたＤＮＡ配列の産生を可能にする。問題の配列のそれぞれの末端に相当するプライマー、すなわちオリゴヌクレオチド・プローブがえられる。ＰＣＲを使用して、ポリヌクレオチド配列の中心部分が次いで合成により産生される。またコードするポリヌクレオチドがＤＮＡである場合増幅したファージクローンを大腸菌に感染し培養・増幅させた後、遺伝子を抽出することにより得られる。
【００２１】
本発明にかかるペプチドまたはファージを用いてＨＭＧタンパクを測定する方法は、ＥＬＩＳＡ法・ウェスタンブロット法等の手法により可能である。例えばＥＬＩＳＡであるならば、プレートに抗ＨＭＧタンパク抗体または本発明のペプチドまたはファージを固相化し、これにＨＭＧタンパクを含むサンプルを反応させ、結合したＨＭＧタンパクを酵素標識した本発明のペプチドで測定することができる。ペプチドをビオチン標識して酵素標識アビジンで検出することも可能である。また、ペプチド提示ファージを反応させ、酵素標識抗ファージ抗体を用いて検出することも可能である。ウェスタンブロット法によってＨＭＧタンパクの測定を行うにはポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったゲルをメンブランに転写させ転写されたＨＭＧタンパクと酵素標識された本発明のペプチドを反応させることによってＨＭＧタンパクを測定することができる。
【００２２】
また、本発明にかかるペプチドを含むＨＭＧタンパクの測定キットは例えば以下のような構成をとる。例えば、ＨＭＧの体液中の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定するキットであれば、抗ＨＭＧタンパク抗体固相化プレート、酵素で標識されたＨＭＧタンパクと親和性を有する本発明のペプチド、および既知濃度のＨＭＧタンパク標準液を構成要素として含み、抗ＨＭＧタンパク抗体固相化プレートとＨＭＧタンパクを反応の後、これと酵素標識されたペプチドを反応させ酵素基質を加えて発色させることにより使用可能である。
【００２３】
本発明に係るペプチドまたはファージは、生体に投与することにより体内のＨＭＧタンパクと結合してその作用を阻害することが期待でき、それにより敗血症または癌の処置のための医薬製剤または処方に使用することができる。本発明は、上述の症状の治療薬を提供する。該治療薬は、医薬として許容される担体と混合することができ、さらに非経口的に全身に投与しうる。必要であれば、該治療薬は皮下、局所、例えば障害部位に投与できる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）ＨＭＧ−１の作製
ＨＬ６０細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、その培養上清を原料としてヘパリンカラムクロマトグラフィーおよびＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーにより精製した。
（２）ファージを用いたＥＬＩＳＡ法によるＨＭＧ−１の測定
ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートのウェルに５μｇ／ｍｌの抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体ＰＢＳ溶液を入れ４℃で一晩固相化を行い、抗体ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８．１０ｍＭ Ｎａ2ＰＯ４・１２Ｈ2Ｏ，２．６８ｍＭ ＫＣｌ，１．４７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4）溶液を除去した後、０．５％ＢＳＡを溶解させたＰＢＳを入れブロッキングを行った。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、緩衝液（０．２５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ）を含む０．１ＭＴｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ８．０））５０μｌ及び種々濃度のＨＭＧ−１を添加した希釈液（０．２５％ＢＳＡ，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ），０．００１％フェノールレッドを含むＰＢＳ−Ｔ溶液）５０μｌを加えて２５℃で６０分反応させた。各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後１．０×１０12Ｔｕ／ｍｌのペプチド提示ファージを含む希釈液１００μｌを入れ２５℃で６０分反応させた。ファージ溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、希釈液で５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体（アマシャムバイオサイエンス社）溶液を１００μｌ入れ２５℃で３０分反応させた。ファージ溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色液（０．００６％過酸化水素，０．２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸―クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を１００μｌ分注して１５分反応させた。反応後、１Ｎ硫酸を１００μｌ加え反応を止めた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
（３）ＨＭＧ−１親和性ペプチドを提示したファージの作製
シャーレに０．５μｇ／ｍｌのＨＭＧ−１を溶解させたＰＢＳを２ｍｌ加え４℃で一晩放置して固相化を行った。シャーレから溶液を除去し０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を溶解させたＰＢＳを８ｍｌ入れブロッキングを行った。シャーレをＰＢＳで洗浄後、１５残基のランダム配列ペプチドを発現させたファージライブラリーを入れ室温で３０分放置した。液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０秒間３回、及び５分間３回の洗浄を行った。５０ｍＭ グリシン−塩酸バッファー（ｐＨ２．４）４００μｌを加え５分間放置して、結合したファージを解離させて回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）８０μｌを加え中和した。回収したファージを大腸菌に感染させ培養し増殖させた。増殖したファージをＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法で精製し、再度ＨＭＧ−１との反応に用いた。これらの操作を３ラウンド行った。３ラウンド選択後のファージを感染させた大腸菌とＬＢプレートで培養し、シングルコロニーをピックアップし、ＬＢ培地で一晩培養した培養上清中に産生されたファージをＰＥＧ法を用いて１４０コロニー精製回収した。回収したファージを上記（２）のＥＬＩＳＡ法を用いて吸光度が抗ＨＭＧ−１抗体を用いたときより２倍以上であったものを選択し、ファージＤＮＡを抽出し配列を解析した。その結果、以下のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が見出された。
配列番号１；Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ
配列番号２；Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ
配列番号３；Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
配列番号４；Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔ
（実施例１）配列番号１を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒを含むペプチドをコードし、末端に下記プライマーに相補的な配列を付加したＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法で増幅させた。ＰＣＲは２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭ ５’末端ビオチン化ＳＥＮＳＥプライマー（５’−ＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＧ−３’）、０．５μＭ ５’末端ビオチン化ＡＮＴＩＳＥＮＳＥプライマー（５’−ＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’）、５０ｐｇ ポリヌクレオチドの条件で行った。ＰＣＲにはＴａｋａｒａ社のＴａｑポリメラーゼおよび添付されたＰＣＲ用バッファーを使用した。１サイクルを９６℃で０．５分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間とし、計３５サイクルの増幅を行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈殿させ、得られたＤＮＡをＢｇｌＩを用いて３７℃で１時間処理した。その後、アビジン化アガロースを用いてビオチン化ＤＮＡフラグメントを除去し、溶液をフェノール／クロロホルム抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。得られたＤＮＡを滅菌水に溶解してインサートＤＮＡとした。繊維状ファージＤＮＡ（ＦＵＳＥ５）をＳｆｉＩで５０℃で約１９時間反応し、ファージベクターＤＮＡの切断を行った。反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。得られたＤＮＡを滅菌水に溶解した後、クロマスピン ＴＥ４００（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて精製した。ファージベクターＤＮＡとインサートＤＮＡのライゲーションは１０-13ｐｍｏｌのＳｆｉＩ切断ＦＵＳＥ５ ＤＮＡと１０-12ｍｏｌのインサートＤＮＡとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績（株）製）を用いて１６℃、３．５時間処理した。反応液をフェノール／クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈殿させる。得られたＤＮＡを滅菌水に溶解した後、−２０℃で保存した。ヒートショック法で大腸菌の形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地プレートに形質転換した大腸菌希釈液１００μｌを撒き、３７℃で終夜培養した。生じたシングルコロニーをピックアップし５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養した培養上清中に産生されたファージ（実施例１）をＰＥＧ法を用いて精製回収した。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
（実施例２）スクリーニングによる配列番号２を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａを含むペプチドをコードするＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で行った。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
（実施例３）スクリーニングによる配列番号３を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕを含むペプチドをコードするＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で行った。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
（実施例４）スクリーニングによる配列番号４を提示したファージの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチド提示ファージの作製
アミノ酸配列Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔを含むペプチドをコードするＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で行った。
（ｂ）ペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定は上記（２）と同様の方法で行った。
【００２５】
実施例１〜実施例４のファージのＨＭＧ−１への結合性の結果を図１に示す。
【００２６】
（比較例１）ＨＲＰ標識抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体を用いて上記（ｂ）のＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による検出を行った。この場合、ペプチド提示ファージ及びＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージ抗体の代わりに、ＨＲＰ標識抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体を用いた。結果を図２に示す。
【００２７】
ペプチド提示ファージを用いることにより（実施例１〜実施例４）、モノクローナル抗体を用いる従来の方法（比較例１）よりもＨＭＧ−１の検出感度が大幅に向上した。
（実施例５）配列番号１を提示したペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１の検出
（ａ）ペプチドの製法
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒを有するペプチドをペプチド合成機で合成する。
（ｂ）ペプチドを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡ法による測定
ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートのウェルに５μｇ／ｍｌの抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体ＰＢＳ溶液を入れ４℃で一晩固相化を行い、抗体ＰＢＳ溶液を除去した後、０．５％ＢＳＡを溶解させたＰＢＳを入れブロッキングを行う。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、緩衝液（０．２５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ）を含む０．１ＭＴｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ８．０））５０μｌ及び種々濃度のＨＭＧ−１を添加した希釈液（０．２５％ＢＳＡ，０．０１％パラヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（ＰＨＢ），０．００１％フェノールレッドを含むＰＢＳ−Ｔ溶液）５０μｌを加えて２５℃で６０分反応させる。各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、あらかじめビオチン化したペプチド溶液を１００μｌ入れ２５℃で６０分反応させる。ペプチド溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、希釈液で希釈したＨＲＰ標識アビジン溶液を入れ２５℃で３０分反応させる。溶液を捨て、各ウェルを４００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色液（０．００６％過酸化水素，０．２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸―クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５））を１００μｌ分注して１５分反応させる。反応後、１Ｎ硫酸を１００μｌ加え反応を止める。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定する。
（実施例６）配列番号２のペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡによる検出
アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａを有するペプチドをペプチド合成機で合成し、実施例５と同様に行う。
（実施例７）配列番号３のペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡによる検出
アミノ酸配列Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕを有するペプチドをペプチド合成機で合成し、実施例５と同様に行う。
（実施例８）配列番号４のペプチドの製造及びそれを用いたＨＭＧ−１のＥＬＩＳＡによる検出
アミノ酸配列Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔを有するペプチドをペプチド合成機で合成し、実施例５と同様に行う。
【００２８】
実施例５〜８のＥＬＩＳＡにより、コントロールのペプチドを用いた場合と比べて有意に高い発色が得られる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のペプチド、またはそのペプチドを提示するファージはＨＭＧタンパクに親和性を有しており、このペプチドを合成もしくはライブラリーからのスクリーニングで得ることによりＨＭＧタンパクの高感度な定量が可能になる。また、本発明のペプチド、またはそのペプチドを提示するファージにアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドもＨＭＧタンパクに親和性を有し、ＨＭＧタンパクの高感度な定量が可能である。また本発明のペプチドまたはペプチドを提示するファージを用いることによりＨＭＧタンパクを測定するキットを提供することが可能である。また、本発明のペプチド、またはペプチドを提示するファージは、敗血症の治療薬等の有効成分として有用である。また、本発明のペプチド、またはペプチドを提示するファージは、癌の治療薬等の有効成分として有用である。
【００３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペプチド提示ファージを用いたＨＭＧ−１の測定結果（実施例１〜４）である。
【図２】抗ＨＭＧ−１抗体を用いたＨＭＧ−１の測定結果（比較例１）である。
Claims (12)
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパク−１（ＨＭＧ−１）と親和性を有することを特徴とするペプチド。 - 以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパク−１（ＨＭＧ−１）と親和性を有することを特徴とするペプチド。 - 以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパク−１（ＨＭＧ−１）と親和性を有するペプチド。 - 以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド。
（ａ）Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｍｅｔのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつハイモビリティーグループタンパク−１（ＨＭＧ−１）と親和性を有するペプチド。 - 請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを提示するファージ。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドをその部分として含み、ハイモビリティーグループタンパク−１（ＨＭＧ−１）に親和性を有するペプチド。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- ＤＮＡである請求項７に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを用いたハイモビリティーグループタンパク−１（ＨＭＧ−１）を測定する方法。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含むハイモビリティーグループタンパク−１（ＨＭＧ−１）を測定するキット。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含む敗血症の治療薬。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドまたはファージを含む癌の治療薬。
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