KR100676945B1

KR100676945B1 - 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 골이식재 및 조직공학용 지지체

Info

Publication number: KR100676945B1
Application number: KR20050022838A
Authority: KR
Inventors: 박윤정; 정종평; 이승진; 이상훈
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2007-02-01
Also published as: KR20060101019A

Abstract

본 발명은 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 골이식재 및 조직공학용 지지체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 고정된 골이식재 및 조직공학용 지지체에 관한 것이다.

본 발명의 골이식재 및 조직공학용 지지체는 표면에 부착된 골조직 형성 증진 펩타이드에 의해 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진하여 최종적으로 조직재생력을 극대화시킬 수 있다. 또한 표면에 고정된 펩타이드는 분자량이 적어 체내에 적용시 면역반응의 위험이 적고, 체내에서 안정한 형태로 존재할 수 있어 약효의 지속화가 가능하여, 치주조직, 치조골재생 및 기타 골조직 재생 수술시 용이하여 수술 편의성이 우수하며 또한 높은 치료효과를 기대할 수 있다.

조직성장인자, 생리활성 펩타이드, 고정화, 골이식재, 지지체, 골재생력

Description

표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 골이식재 및 조직공학용 지지체{Bone Graft And Scaffolding Materials Immobilized With Osteogenesis Enhancing Peptides On The Surface}

도 1은 본 발명에 따른 골이식재에 고정된 펩타이드의 전자표면분석 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 펩타이드가 고정되지 않은 골이식재의 표면분석결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 황을 함유한 펩타이드가 고정된 골이식재의 표면분석결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 골이식재의 세포 부착양상을 나타낸 공초점 주사형광현미경 사진으로서, 도 2a는 펩타이드가 고정되지 않은 골이식재 표면으로의 세포 부착양상을 나타낸 것이고, 도 2b 및 도 2c는 각각 BMP 및 bone sialoprotein으로부터 유래된 펩타이드가 고정된 골이식재 표면으로의 세포 부착양상을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 펩타이드가 고정된 골이식재 표면의 세포 부착도를 정량적으로 분석한 그래프이다.

도 4는 본 발명의 골이식재에 세포를 분주하여 일정기간 배양하고, 배양된 세포를 수거하여 세포 내의 골조직 분화마커인 smad 1,5,8 단백질의 양을 웨스턴블럿을 통해 측정한 결과를 나타낸 사진이다 (Con: 펩타이드가 고정되지 않은 골이식 재; BMP: BMP 유래 펩타이드가 고정된 골이식재; 및 BSP:bone sialoprotein 유래의 펩타이드가 고정된 골이식재).

도 5는 본 발명에 따른 골이식재를 사용하여 토끼의 두개골 결손부에서의 골재생력을 살펴본 사진으로, 도 5a는 펩타이드가 고정되지 않은 골이식재(HA)의 두개골 결손부에서의 골재생력을 나타낸 것이고, 도 5b는 본 발명의 펩타이드가 고정된 골이식재(HA)의 두개골 결손부에서의 골재생력을 나타낸 것으로 New Bone은 골이식재 표면에 고정된 펩타이드에 의해 생성된 신생골을 나타낸 것이다.

본 발명은 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 골이식재 및 조직공학용 지지체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 고정된 골이식재 및 조직공학용 지지체(이하, 지지체)에 관한 것이다.

치아를 지지하는 치주조직은 크게 치조골, 치조골과 치아사이의 치근막을 구성하는 치주 인대조직, 상피조직, 그리고 결체조직으로 이루어진다. 치주염의 진행으로 인한 치조골의 소실은 치주 인대조직의 상실을 동반하며, 치주염 치료 후 소실된 조직 부위에서는 결체조직의 과다생장으로 인해 치조골과 치주 인대조직의 정 상적인 회복이 불가능하여 진다. 또 새로운 뼈가 생성되더라도 치주 인대조직이 정상적으로 분화되지 않아 치아기능상실을 유발할 수 있다.

따라서, 이러한 문제를 해결하기 위하여, 치조골 재생술로 자가골이식술(autografting)과 함께 인위적인 차폐막을 이용하여 완전한 조직의 재생 또는 신형성을 유도하려는 시도가 활발히 이루어지고 있다. 또한 골조직의 재생을 위해 골이식재로서 조직공학적 배양 지지체 역시 활용되고 있다. 최근 10여년 동안에 골이식재 및 지지체의 도입을 통하여 효과적으로 치주 조직 및 골조직의 재생을 유도한 사례(Camelo, M. et.al, International J. Periodont. Restorative Dent. 21:109, 2001)가 보고된 이래, 소뼈로 이루어진 골분말 입자를 포함하여 다양한 소재들이 골이식재 및 조직 재생목적의 조직공학용 지지체로 활용되어 왔다.

한편, 이러한 골이식재 및 지지체의 재생효율을 향상시키기 위해, 골이식재 및 지지체에 조직 재생을 향상시킬 수 있는 물질들을 부착하는 연구가 진행되고 있다. 이 중 세포외 기질 물질 (extracellular matrix)이나 특정 조직성장인자들은 생체내에서 조직손상을 수복하고 재생시키는 능력이 탁월한 것으로 보고되고 있으며, 실제 임상에서도 이들의 우수한 조직재생력이 다수의 결과에서 확인된 바 있다.

그러나 이들 대부분의 세포외기질 및 성장인자들은 상대적으로 고가이고, 분자량이 수십 kDa에 이르는 고분자량의 단백질로서 생체 내에서는 불안정하여 활성이 떨어지는 단점이 지적되어 왔다. 특히 체내에서 수 분 이내로 소실되므로 원하는 치료효과를 얻기 위해서는 대용량을 투여해야 하는 점과 아울러 이로 인한 부작 용 유발이 단점으로 지적되어 왔다.

최근 골재생술식에 활용되는 골이식재 및 조직공학기술(tissue engineering)에 활용되는 고분자 지지체(scaffold)에 상기 조직성장인자들을 함유시켜 서방출함으로써 단순 적용에 따른 단점을 경감하고자 하는 시도가 이루어져 왔으며 어느 정도 그 효과도 입증 되었다. 그러나 이들 골이식재나 지지체자체에 의해서는 조직성장인자가 물리적으로 혼합되어 있는 상태로서 초기 적용시 속방출 (burst release)이 일어나 치료기간동안 유효농도의 유지가 어렵다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 조직재생 효과를 얻을 수 있는 조직성장인자 및 세포외 기질 단백질의 활성부위의 펩타이드가 표면에 부착된 골이식재 및 지지체가 저농도의 펩타이드만으로도 안정적이고 지속적인 약리효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 저농도의 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드 용량으로도 원하는 조직재생효과를 얻을 수 있는 골이식재 및 조직공학용 지지체를 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 고정되어 있는 골이식재 및 조직공학용 지지체를 제공한다.

즉, 본 발명은 약리활성을 갖는 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드를 골조직 재생용 골이식재 및 조직공학용 지지체의 표면에 고정시킴으로써, 약리활성을 갖도록 하여 골조직 및 기타 조직 재생효율을 증가시킬 수 있는 골이식재 및 지지체를 제공한다.

상기 세포부착 유도 펩타이드 또는 조직성장인자 유래 펩타이드는 생리활성 싸이토카인(cytokine)에서 활성부위의 아미노산 배열을 분리추출한 것으로, 추출 후에 화학적 수식을 거쳐 활성구조를 유지하도록 하였다.

구체적으로, 상기 세포부착 유도 펩타이드는 일반적으로 사용되는 RGD의 아미노산서열을 가지는 펩타이드를 사용하며, 더욱 바람직하게는 CGGRGDS(서열번호 1) 또는 상기 RGD의 아미노산서열을 구조적으로 안정하게 유지하고자 고안된 CGGVACDCRGDCFC(서열번호 2)의 펩타이드를 사용한다.

또한, 상기 조직성장인자 유래 펩타이드는 조직성장인자의 활성영역으로부터 유래된 것을 동정하여 화학적으로 합성한 것을 사용하는데, 구체적으로 (a) 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)-2, 4 및 6의 아미노산서열 중 각각 2-18위치의 아미노산서열[BMP-2의 경우(서열번호3), BMP-4의 경우(서열번호 4) 및 BMP-6의 경우(서열번호 5)] BMP-2의 16-34위치의 아미노산서열(서열번호 6), 47-71위치의 아미노산서열(서열번호 7), 73-92위치의 아미노산서열(서열번호 8), 88-105위치의 아미노산서열(서열번호 9), 283-302위치의 아미노산서열(서열번호 10), 335-353 위치의 아미노산서열(서열번호 11) 및 370-390위치의 아미노산서열(서열번호 12); BMP-4의 74-93위치의 아미노산서열(서열번호 13), 293-313위치의 아미노산서열(서열번호 14), 360-379위치의 아미노산서열(서열번호 15) 및 382-402위치의 아미노산서열(서열번호 16) BMP-6의 91-110위치의 아미노산서열(서열번호 17), 397-418위치의 아미노산서열(서열번호 18), 472-490위치의 아미노산서열(서열번호 19) 및 487-510위치의 아미노산서열(서열번호 20) 및 BMP-7의 98-117위치의 아미노산서열(서열번호 21), 320-340위치의 아미노산서열(서열번호 22), 390-409위치의 아미노산서열(서열번호 23) 및 405-423위치의 아미노산서열(서열번호 24) ;

(b) bone sialoprotein의 62-69위치의 아미노산서열(서열번호 25), 139-148위치의 아미노산서열(서열번호 26), 259-277위치의 아미노산서열(서열번호 27), 199-204위치의 아미노산서열(서열번호 28), 151-158위치의 아미노산서열(서열번호 29), 275-291위치의 아미노산서열(서열번호 30), 20-28위치의 아미노산서열(서열번호 31), 65-90위치의 아미노산서열(서열번호 32), 150-170위치의 아미노산서열(서열번호 33) 및 280-290위치의 아미노산서열(서열번호 34);

(c) 변형성장인자(transforming growth factor)의 242-250위치의 아미노산서열(서열번호 35), 279-299위치의 아미노산서열(서열번호 36) 및 343-361위치의 아미노산서열(서열번호 37);

(d) 혈소판유래 성장인자의 100-120위치의 아미노산서열(서열번호 38) 및 121-140위치의 아미노산서열(서열번호 39);

(e) 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor)의 23-31위 치의 아미노산서열(서열번호 40) 및 97-105위치의 아미노산서열(서열번호 41);

(f) 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor)의 16-27위치의 아미노산서열(서열번호 42), 37-42위치의 아미노산서열(서열번호 43), 78-84위치의 아미노산서열(서열번호 44) 및 107-112위치의 아미노산서열(서열번호 45);

(g) dentin sialoprotein의 255-275위치의 아미노산서열(서열번호 46), 475-494위치의 아미노산서열(서열번호 47) 및 551-573위치의 아미노산서열(서열번호 48);

(h) 헤파린 결합 EGF-유사 성장 인자(heparin binding EGF-lke growth factor)의 63-83위치의 아미노산서열(서열번호 49), 84-103위치의 아미노산서열(서열번호 50), 104-116위치의 아미노산서열(서열번호 51) 및 121-140위치의 아미노산서열(서열번호 52);

(i) cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3의 326-350위치의 아미노산서열(서열번호 53), 351-371위치의 아미노산서열(서열번호 54), 372-400위치의 아미노산서열(서열번호 55), 401-423위치의 아미노산서열(서열번호 56), 434-545위치의 아미노산서열(서열번호 57), 546-651위치의 아미노산서열(서열번호 58), 1375-1433위치의 아미노산서열(서열번호 59), 1435-1471위치의 아미노산서열(서열번호 60), 1475-1514위치의 아미노산서열(서열번호 61), 1515-1719위치의 아미노산서열(서열번호 62), 1764-1944위치의 아미노산서열(서열번호 63) 및 2096-2529위치의 아미노산서열(서열번호 64); 및

(j) osteoblast specific cadherin(OB-cadherin)의 54-159위치의 아미노산서열(서열번호 65), 160-268위치의 아미노산서열(서열번호 66), 269-383위치의 아미노산서열(서열번호 67), 384-486위치의 아미노산서열(서열번호 68) 및 487-612위치의 아미노산서열(서열번호 69)을 지니는 펩타이드로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 펩타이드는 N-말단에 시스테인 및 두 분자의 글리신으로 구성된 스페이서 (CGG-)를 부가하여 화학적으로 골이식재 및 지지체에의 고정이 용이하도록 하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따르는 활성 펩타이드는 전체 조직성장인자의 아미노산서열 중 10~20개 단위의 아미노산 배열을 각각 합성하고, 이들을 이용하여 세포접착력 실험을 시행하여 가장 활성이 높은 아미노산서열을 선택하고, 이들 아미노산서열의 말단에 다시 화학적 수식을 가한 후 골이식재 및 지지체에 고정이 용이하도록 고안한 것이다. 이로서 골이식재는 표면에 최소단위의 아미노산서열만으로 활성을 유지함과 동시에 조직성장인자의 물리적인 함입 및 도포에 따르는 약의 손실 및 부작용을 줄일 수 있어 치료효과에 부가적인 이점을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 골이식재 및 지지체에는 당해분야에서 사용하는 모든 종류 및 형태의 골이식재 및 고분자 지지체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 자가골, 소뼈 및 돼지뼈에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말 및 다공성 블록, 합성 수산화아파타이트 분말 및 다공성 블록, 트리칼슘인산 분말 및 다공성 블록, 모노칼슘인산 분말 및 다공성 블럭, 이산화 규소(실리카)로 이루어진 골이식재, 실리카와 고분자의 혼합체로 이루어진 골충진 이식재, 키토산, 폴리락트산을 포함하는 생 체적합성 고분자로 이루어진 미립자 및 다공성 지지체, 티타늄 및 3차원적 다공성 지지체 등이 있다. 이때, 상기 골이식재 및 지지체의 표면은 활성 펩타이드의 부착이 용이하도록 표면을 개질하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른, 펩타이드는 조직성장인자 자체보다 체내 효소반응에 민감하지 않고 체내 면역원성도 낮으므로 펩타이드를 조직 재생용 골이식재, 지지체, 차폐막이나 임플란트의 표면에 고정하여 술식에 이용하는 경우, 원하는 농도의 활성 펩타이드가 국소에서 존재하면서 활성을 나타내어 치료효과를 증가할 수 있어 골조직 및 치주조직 재생 치료에 적합한 특징을 갖는다.

본 발명에 따른 N말단에 자유 아미노기 또는 시스테인을 지니고 있는 펩타이드는 가교제에 의한 골이식재 및 지지체로 표면으로의 고정이 용이하다. 본 발명에 적합한 가교제는 1,4-bis-maleimidobutane(BMB), 1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol (BM[PEO]4), 1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride(EDC), succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]](SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate](SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester(MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), succimidyl [4-(p-maleimidophenyl) butyrate](SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

또한 상기 펩타이드를 골이식재 및 지지체의 표면에 화학적으로 결합시켜 표면에 ㎠당 0.1~10mg이 고정되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 골이 식재 및 지지체의 표면 ㎠당 1~5mg을 고정하는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 소뼈유래 골미네랄 입자에 세포부착성 RGD 펩타이드의 고정

소뼈 유래골미네랄 입자를 에탄올로 감압세척한 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 골미네랄 입자표면을 헥산에 용해한 3-아미노프로필 트리에톡시 실란(3-aminopropyl ethoxysilane, APTES)으로 처리한 후, 세척하였다. 이에 의해 표면에 아민 잔기가 형성되고, 여기에 가교제 BMB를 첨가하여 결합시켰다. 가교제가 결합된 골미네랄 입자를 다시 RGD를 가지는 서열번호 1 및 서열번호 2의 펩타이드와 12시간 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 골미네랄 입자를 얻었다.

실시예 2: 합성 수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산에 세포부착성 RGD펩타이드의 고정

합성수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산 골이식재 분말을 에탄올 감압 세척한 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 입자표면을 헥산에 용해한 3-아미노프로필 트리에톡시 실란(3-aminopropyl ethoxysilane, APTES)으로 처리한 후, 세척하였다. 이에 의해 표면에 아민 잔기가 형성되고, 여기에 가교제 BMB를 첨가하여 결합시켰다. 가교제가 결합된 골이식재 입자는 서열번호 1 및 서열번호 2의 펩타이드와 12시간 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 골이식재 입자를 얻었다.

실시예 3: 키토산 골이식재에 세포부착성 RGD 펩타이드의 고정

분말상 혹은 다공성 지지체의 형태로 제조된 키토산 골이식재를 2 ml의 인산완충액(pH 7.4)에 가하여 표면을 수화시킨 후 여기에 가교제로서 sulfo-SMCC를 5mg/ml의 농도로 가하고, 2시간동안 교반하여 키토산 골이식재 표면에 반응기(functional group)를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 키토산 골이식재를 세척하고 여기에 서열번호 1의 펩타이드 10mg을 100㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 키토산 골이식재를 제조하였다.

실시예 4: 폴리락트산 골이식재에 세포부착성 RGD 펩타이드의 고정

폴리락트산 이식용 분말이나 다공성 지지체를 인산완충액 (pH 4.7)에 가하여 표면을 수화시킨 후, 20mg/ml의 염산 시스타민 용액과 반응시켰다. 여기에 가교제로서 EDC를 적가하여 골이식재 표면의 카르복실산을 활성화시켰다. 24시간 반응시키고, 세척한 다음 30mg/ml의 dithiothreniol (DTT) 용액 1 ml을 가하여 다시 24시 간 동안 반응하여 폴리락트산의 표면에 sulfhydryl기가 도입되도록 하였다. 상기 개질된 폴리락트산 골이식재를 세포부착성 RGD 펩타이드(서열번호 1)와 혼합하면, 골이식재의 sulfhydryl기와 펩타이드간에 S-S 결합을유도하여 펩타이드를 고정하였다.

실시예 5: 골미네랄 입자에 조직성장인자 유래 펩타이드의 고정

본 실시예에서 사용한 조직성장인자 유래 펩타이드는 골형성 단백질 (BMP-2)의 세포부착 및 활성 도메인을 함유하는 펩타이드인 서열번호 3 및 서열번호 6~9의 아미노산서열 N-말단부위에 시스테인을 지니도록 CGG-스페이서를 부가하여 화학적으로 합성된 펩타이드를 사용하였다.

소뼈 유래 골미네랄 입자를 에탄올로 감압세척 후 100 ℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 골미네랄 입자표면을 헥산에 용해한 3-아미노프로필 트리에톡시 실란 (3-aminopropyl ethoxysilane, APTES)으로 처리한 후 세척하였다 이에 의해 표면에 아민 잔기가 형성되고, 여기에 가교제로서 sulfo-SMCC를 5mg/ml의 농도로 가하여 2시간동안 교반하고 골이식재의 표면에 반응기를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 골이식재를 세척하고 여기에 상기 펩타이드 10mg을 100㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 골미네랄 입자를 얻었다.

실시예 6: 합성골이식재 입자에 조직성장인자 유래 펩타이드의 고정

본 실시예에서는 조직성장인자 유래의 펩타이드로 실시예 5에서 사용한 펩타이드와 동일한 펩타이드를 사용하였다.

합성 골이색재로는 합성 수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산 미네랄를 사용하였으며, 골이식재 입자를 에탄올로 감압세척 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 보관하여 표면의 불순물을 제거하였다. 입자표면을 헥산에 용해한 3-아미노프로필 트리에톡시 실란(3-aminopropyl ethoxysilane, APTES)으로 처리한 후 세척하였다. 이에 의해 표면에 아민 잔기가 형성되고, 여기에 가교제로서 5mg/ml의 sulfo-SMCC를 가하여 2시간동안 교반하여 골이식재의 표면에 반응기(functional group)를 도입하였다. 2시간 동안 상온반응 후 골이식재를 세척하고 여기에 상기 펩타이드 10mg을 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 조직성장인자 펩타이드가 고정된 골이식재 입자를 얻었다.

실시예 7: 키토산 골이식재 및 지지체에 조직성장인자 유래 펩타이드의 고정

키토산으로 이루어진 골이식재 및 조직재생용 지지체를 2ml의 인산완충액 (pH 7.4)에 가하여 표면을 수화시킨 후 여기에 가교제로서 sulfo-SMCC를 5 mg/ml의 농도로 가하여 2시간동안 교반하여 키토산 골이식재의 표면에 반응기(functional group)를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 키토산 골이식재를 세척하고 여기에 실시예 5에서 사용한 조직성장인자 유래 펩타이드와 동일한 펩타이드 10mg을 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 키토산 골이식재 및 지지체를 제조하였다.

실시예 8: 폴리락트산 골이식재 및 지지체에 조직성장인자 유래 펩타이드의 고정

폴리락트산 이식용 분말이나 다공성 지지체를 인산완충액 (pH 4.7)에 가하여 표면을 수화시킨 후 20mg/ml의 염산 시스타민 용액과 반응시켰다. 여기에 가교제로서 EDC를 적가하여 폴리락트산 골이식재 표면의 카르복실산을 활성화시켰다. 24시간 반응 후 세척한 다음 1 ml의 dithiothreniol (DTT) 용액 (30mg/ml)을 가하여 다시 24시간 동안 반응하여 폴리락트산의 표면에 sulfhydryl기가 도입되도록 하였다. 상기 골이식재는 상기 조직성장인자 유래 펩타이드인 서열번호 8의 아미노산서열에 CGG 스페이서가 결합된 펩타이드와 혼합하여 골이식재와 펩타이드간 S-S의 결합을 자발적으로 유도시켜 펩타이드를 고정하였다.

실시예 9:골미네랄 입자에 bone sialoprotein 유래 펩타이드의 고정

본 실시예에서 사용한 bone sialoprotein 유래 펩타이드는 석회화유도 활성 도메인구조를 포함하는 펩타이드인 서열번호 15의 펩타이드 및 세포부착기능부위를 포함하는 펩타이드인 서열번호 27의 펩타이드를 화학적으로 합성한 것을 사용하였다.

소뼈 유래 골미네랄 입자를 에탄올로 감압세척 후 100 ℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 골미네랄 입자표면을 헥산에 용해한 3-아미노프로필 트리에톡시 실란 (3-aminopropyl ethoxysilane, APTES)으로 처리한 후 세척하였다. 이에 의해 표면에 아민잔기가 형성되고, 여기에 가교제로서 5mg/ml농도의 Sulfo-SMCC를 첨가하고 2시간동안 교반하여 골이식재의 표면에 반응기(functional group)를 도입하였다.반응이 끝난 골이식재를 세척하고 여기에 상기 bone sialoprotein 유래 펩타이드 10mg을 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 골미네랄 입자를 얻었다.

실시예 10: 합성 골이식재 입자에 bone sialoprotein유래 펩타이드의 고정

본 실시예에서는 실시예 9에서 사용한 펩타이드와 동일한 펩타이드를 사용하였다.

수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산 미네랄 입자를 에탄올로 감압 세척 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 입자표면을 헥산에 용해한 3-아미노프로필 트리에톡시 실란(3-aminopropyl ethoxysilane, APTES)으로 처리한 후 세척하였다. 이에 의해 표면에 아민잔기가 형성되고, 여기에 가교제로서 5mg/ml 농도의 sulfo-SMCC를 첨가하고 2시간동안 교반하여 골이식재의 표면에 반응기(functional group)를 도입하였다. 반응이 끝난 골이식재를 세척하고 여기에 실시예 9에서 사용한 펩타이드 10mg을 100㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 골이식재 입자를 얻었다.

실시예 11: 키토산 골이식재에 bone sialoprotein의 부착 및 활성부위를 함유 하는 펩타이드의 고정

키토산 골이식재 및 지지체를 2 ml의 인산완충액(pH 7.4)에 가하여 표면을 수화시킨 후 여기에 가교제로서 5mg/ml의 sulfo-SMCC를 가하여 2시간동안 교반하여 키토산 골이식재의 표면에 반응기(functional group)를 도입하였다. 반응이 끝난 키토산 골이식재를 세척하고 여기에 10 mg의 상기 펩타이드를 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 펩타이드가 고정된 키토산 골이식재 및 지지체를 제조하였다.

실시예 12: 폴리락트산 골이식재 및 지지체에 bone sialoprotein의 부착 및 활성부위를 함유하는 펩타이드의 고정

폴리락트산 골이식재 및 지지체를 인산완충액(pH 4.7)에 가하여 표면을 수화시킨 후 20mg/ml의 염산 시스타민의 용액과 반응시켰다. 여기에 가교제로서 EDAC를 적가하여 폴리락트산의 표면의 카르복실산을 활성화시켰다.24시간동안 반응시킨 후 세척한 다음 30mg/ml농도의 DTT용액1ml을 첨가하고 다시 24시간 동안 반응하여 골이식재와 지지체의 표면에 sulfhydryl기가 도입되도록 하였다. 상기 골이식재 및 지지체는 상기 펩타이드와 혼합하여 골이식재와 펩타이드간 S-S 결합을 자발적으로 유도시켜 펩타이드를 고정하였다.

실험예 1: 본 발명에 따른 골이식재의 표면 분석

실시예 1 내지 12에서 제조된 각각의 펩타이드가 고정된 골이식재의 표면을 분석하기 위하여, 골이식재를 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 골이식재를 1%의 오스뮴 테트르옥시드(osmium tetroxide) 용액으로 처리한 후 세척하고,탈수 및 건조하였다.

제조된 골이식재의 표면을 XPS방법에 의해 분석하였다. 상기 방법은 물질 표면에 고정된 원소를 동정하여 결합의 유무를 확인하는 방법으로, 본 발명에 의해 고정된 펩타이드와 골이식재의 사이에는 황결합(disulfide bond)이 존재하므로 황의 존재유무로 결합을 확인하였다.

도 1은 본 발명에 의해 키토산 골이식재에 고정된 펩타이드의 분석결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 펩타이드가 수식되지 않은 키토산으로 제작된 골이식재의 표면을 나타낸 것이고, 도 1b는 황을 함유한 펩타이드가 고정된 골이식재를 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 펩타이드가 고정된 골이식재 표면에서 황의 존재가 확인되어 펩타이드가 고정되었음을 알 수 있었다. 또한 펩타이드가 고정된 골이식재의 황의 함량을 측정함으로써 전체 이식재 표면적당 펩타이드의 고정률을 확인하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 펩타이드로 수식되지 않은 키토산에서는 황이 검출되지 않은 반면, 펩타이드가 고정된 키토산에서는 8.66%의 황이 검출되었다.

Element	O (%)	N (%)	C (%)	S (%)	O/C	N/C
Chitosan with no peptide	31.83	6.18	61.99	0	0.513	0.0997
Peptide immobilized chitosan	32.33	2.96	60.05	8.66	0.605	0.033

실험예 2: 본 발명에 따른 골이식재의 세포부착력

실시예 3, 7 및 11에 의해 제조된 펩타이드 부착 골이식재에 골아세포(MC3T3세포주)를 접종한 후 각각 4시간 및 1일에 걸쳐 배양하였다. 골아세포가 배양된 골이식재를 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 골이식재를 1% 트리톤 엑스 100 (triton X-100)으로 처리한 수 형광표지 팔로이딘 용액을 첨가하여 부착된 세포질을 염색하였다. 염색 후 세척하여 시편을 고정한 후 골이식재에 부착된 세포를 공초점 주사형광 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope)으로 관찰하였다(도 2).

도 2a는 수식되지 않은 골이식재로의 세포부착을 나타낸 것이고, 도 2b 및 도 2c는 각각 BMP 및 bone sialoprotein으로부터 유래된 펩타이드가 각각 고정된 골이식재로의 세포부착을 나타낸 것이다. 세포부착 결과, 펩타이드가 고정되지 않은 골이식재의 세포부착양상은 구형으로 불안정하게 부착되어있는 것이 관찰된 반면, BMP 및 bone sialoprotein 유래 펩타이드가 고정된 골이식재의 표면에는 세포 배양 4시간 후에 이미 대부분의 세포에서 세포질의 신장이 관찰되는 등 안정적인 세포부착이 관찰되었다.

또한, 도 3은 세포부착도를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 것으로서, 펩타이드로 수식되지 않은 키토산 골이식재보다 펩타이드가 수식된 키토산 골이식재에서 세포의 부착정도가 현저히 증가되었으며, 이러한 증가도는 수식된 펩타이드의 양에 어느 농도까지 비례하였다.

실험예 3: 본 발명에 따른 펩타이드 고정 골이식재 표면에 배양된 골아세포에서의 분화 마커단백질의 발현

본 발명에 따라 펩타이드가 고정된 골이식재 표면에서 배양된 골아세포의 분화마커 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 분화마커 단백질인 smad 1, 5 및 8의 발현 정도를 웨스턴블럿으로 확인하였다.

골아세포를 골이식재 및 펩타이드가 고정된 골이식재의 표면에 접종한 후 2주간 배양하였다. 배양 후 세포내의 총 단백질을 추출하고 이의 양을 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이 중 1mg/ml의 단밸질용액 2㎕를 취하여 아크릴아미드 겔에 전기영동시킨 후, 분화마커 단백질인 smad 1, 5 및 8의 항체와 반응시켰다. 이후 항체와 결합하는 2차항체를 표지자로 표지하여 반응시키고, 상기 겔을 현상하여 나타나는 단백질 밴드를 관찰하고 그 밀도를 측정하였다 (도 4).

도 4에 나타난 바와 같이, 펩타이드가 고정되지 않은 골이식재에 배양된 세포의 경우와 비교하여, 펩타이드가 고정된 골이식재의 표면에 배양된 골아세포에서 smad의 발현이 현저히 증가하였으며, 이로 인해 조직성장인자 유래 펩타이드가 고정된 골이식재의 표면에서 자란 세포는 골조직으로의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 펩타이드 고정 골이식재에 의한 토끼 두개골 재생효과

상기 실시예 1 내지 5에서 제조된 펩타이드가 고정된 골이식재를 토끼의 두개골 원형골결손부에서 이식하여 골재생력을 확인하였다. 마취시킨 토끼의 두개골부위에 직경 8미리미터의 원형골결손부를 형성시키고, 상기 골결손부에 골이식재 및 펩타이드가 수식된 골이식재를 결손부당 50mg씩 이식하고, 골막과 피부를 이중봉합하였다. 이식 2주 후에 동물을 희생시키고, 채취한 표본은 포르말린 용액에 넣어 고정시킨 후 조직을 포매하여 두께 20㎛의 시편으로 제작하였다. 제작된 시편은 염기성 푹신과 톨루이딘 블루로 염색하여 비탈회 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 광학현미경으로 관찰하여 사진촬영을 실시하였다.

도 5는 골이식재 및 펩타이드가 고정된 골이식재에 의한 골재생효과를 나타낸 것으로, 펩타이드가 부착되지 않은 골이식재 (도 5a)에 비하여, 본 발명에 따른 골조직 형성 증진 펩타이드가 표면에 부착된 골이식재를 토끼의 두개부 결손에 적용한 경우, 2주이내에도 현저한 골재생력을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (도 5b).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 저농도의 용량으로도 원하는 조직재생효과를 얻을 수 있는 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 고정되어 있는 골이식재 및 조직공학용 지지체를 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 골이식재 및 조직 재생용 지지체는 세포접착 및 골조직으로의 분화를 촉진하며, 기존의 방법에 의한 조직성장인자의 활용의 단순 함입에 의한 빠른 분해 및 체내 누출에 따르는 부작용을 막을 수 있으며, 국소농도를 높이기 위해 다량을 적용함에 따르는 막대한 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다.

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조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 고정되어 있는 골이식재에 있어서,

상기 조직성장인자 유래 펩타이드는 (a) 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)-2, 4 및 6의 아미노산서열 중 각각 2-18위치의 아미노산서열[BMP-2의 경우(서열번호3), BMP-4의 경우(서열번호 4) 및 BMP-6의 경우(서열번호 5)] BMP-2의 16-34위치의 아미노산서열(서열번호 6), 47-71위치의 아미노산서열(서열번호 7), 73-92위치의 아미노산서열(서열번호 8), 88-105위치의 아미노산서열(서열번호 9), 283-302위치의 아미노산서열(서열번호 10), 335-353위치의 아미노산서열(서열번호 11) 및 370-390위치의 아미노산서열(서열번호 12); BMP-4의 74-93위치의 아미노산서열(서열번호 13), 293-313위치의 아미노산서열(서열번호 14), 360-379위치의 아미노산서열(서열번호 15) 및 382-402위치의 아미노산서열(서열번호 16) BMP-6의 91-110위치의 아미노산서열(서열번호 17), 397-418위치의 아미노산서열(서열번호 18), 472-490위치의 아미노산서열(서열번호 19) 및 487-510위치의 아미노산서열(서열번호 20) 및 BMP-7의 98-117위치의 아미노산서열(서열번호 21), 320-340위치의 아미노산서열(서열번호 22), 390-409위치의 아미노산서열(서열번호 23) 및 405-423위치의 아미노산서열(서열번호 24) ;

(b) bone sialoprotein의 62-69위치의 아미노산서열(서열번호 25), 139-148위치의 아미노산서열(서열번호 26), 259-277위치의 아미노산서열(서열번호 27), 199-204위치의 아미노산서열(서열번호 28), 151-158위치의 아미노산서열(서열번호 29), 275-291위치의 아미노산서열(서열번호 30), 20-28위치의 아미노산서열(서열번호 31), 65-90위치의 아미노산서열(서열번호 32), 150-170위치의 아미노산서열(서열번호 33) 및 280-290위치의 아미노산서열(서열번호 34);

(c) 변형성장인자(transforming growth factor)의 242-250위치의 아미노산서열(서열번호 35), 279-299위치의 아미노산서열(서열번호 36) 및 343-361위치의 아미노산서열(서열번호 37);

(d) 혈소판유래 성장인자의 100-120위치의 아미노산서열(서열번호 38) 및 121-140위치의 아미노산서열(서열번호 39);

(e) 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor)의 23-31위치의 아미노산서열(서열번호 40) 및 97-105위치의 아미노산서열(서열번호 41);

(f) 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor)의 16-27위치의 아미노산서열(서열번호 42), 37-42위치의 아미노산서열(서열번호 43), 78-84위치의 아미노산서열(서열번호 44) 및 107-112위치의 아미노산서열(서열번호 45);

(g) dentin sialoprotein의 255-275위치의 아미노산서열(서열번호 46), 475-494위치의 아미노산서열(서열번호 47) 및 551-573위치의 아미노산서열(서열번호 48);

(h) 헤파린 결합 EGF-유사 성장 인자(heparin binding EGF-lke growth factor)의 63-83위치의 아미노산서열(서열번호 49), 84-103위치의 아미노산서열(서열번호 50), 104-116위치의 아미노산서열(서열번호 51) 및 121-140위치의 아미노산서열(서열번호 52);

(i) cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3의 326-350위치의 아미노산서열(서열번호 53), 351-371위치의 아미노산서열(서열번호 54), 372-400위치의 아미노산서열(서열번호 55), 401-423위치의 아미노산서열(서열번호 56), 434-545위치의 아미노산서열(서열번호 57), 546-651위치의 아미노산서열(서열번호 58), 1375-1433위치의 아미노산서열(서열번호 59), 1435-1471위치의 아미노산서열(서열번호 60), 1475-1514위치의 아미노산서열(서열번호 61), 1515-1719위치의 아미노산서열(서열번호 62), 1764-1944위치의 아미노산서열(서열번호 63) 및 2096-2529위치의 아미노산서열(서열번호 64); 및

(j) osteoblast specific cadherin(OB-cadherin)의 54-159위치의 아미노산서열(서열번호 65), 160-268위치의 아미노산서열(서열번호 66), 269-383위치의 아미노산서열(서열번호 67), 384-486위치의 아미노산서열(서열번호 68) 및 487-612위치의 아미노산서열(서열번호 69)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 골이식재.
제3항에 있어서, 서열번호 1 (CGGRGDS) 또는 서열번호 2(CGGVACDCRGDCFC)의 아미노산서열을 가지는 세포부착 유도 펩타이드가 추가로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 골이식재.
제4항에 있어서, 조직성장인자 유래 펩타이드는 N-말단에 시스테인이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는 골이식재.
제5항에 있어서, 시스테인은 CGG의 형태로 부가되어 있는 것을 특징으로 하는 골이식재.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 골이식재는 생물유래 골미네랄의 분말 및 다공성 블록, 합성 수산화아파타이트의 분말 및 다공성 블록, 트리칼슘인산의 분말 및 다공성 블록, 모노칼슘인산의 분말 및 다공성 블럭, 이산화 규소 (실리카)로 이루어진 골이식재, 실리카와 고분자의 혼합체로 이루어진 골충진 이식재, 키토산, 폴리락트산을 포함하는 생체적합성 고분자로 이루어진 미립자 및 다공성 지지체, 티타늄 및 3차원적 다공성 지지체로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골이식재.
제4항에 있어서, 골이식재의 표면은 가교제가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 골이식재.
제8항에 있어서, 상기 가교제는 1,4-bis-maleimidobutane(BMB), 1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol(BM[PEO]4), 1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC), succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]](SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), succimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoate] (SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), succimidyl [4-(p-maleimidophenyl) butyrate](SMPB) 및 그의 설폰화염 (sulfo-SMPB)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골이식재.
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조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 고정되어 있는 조직공학용 지지체에 있어서,

상기 조직성장인자 유래 펩타이드는 (a) 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)-2, 4 및 6의 아미노산서열 중 각각 2-18위치의 아미노산서열[BMP-2의 경우(서열번호3), BMP-4의 경우(서열번호 4) 및 BMP-6의 경우(서열번호 5)] BMP-2의 16-34위치의 아미노산서열(서열번호 6), 47-71위치의 아미노산서열(서열번호 7), 73-92위치의 아미노산서열(서열번호 8), 88-105위치의 아미노산서열(서열번호 9), 283-302위치의 아미노산서열(서열번호 10), 335-353위치의 아미노산서열(서열번호 11) 및 370-390위치의 아미노산서열(서열번호 12); BMP-4의 74-93위치의 아미노산서열(서열번호 13), 293-313위치의 아미노산서열(서열번호 14), 360-379위치의 아미노산서열(서열번호 15) 및 382-402위치의 아미노산서열(서열번호 16) BMP-6의 91-110위치의 아미노산서열(서열번호 17), 397-418위치의 아미노산서열(서열번호 18), 472-490위치의 아미노산서열(서열번호 19) 및 487-510위치의 아미노산서열(서열번호 20) 및 BMP-7의 98-117위치의 아미노산서열(서열번호 21), 320-340위치의 아미노산서열(서열번호 22), 390-409위치의 아미노산서열(서열번호 23) 및 405-423위치의 아미노산서열(서열번호 24) ;

(b) bone sialoprotein의 62-69위치의 아미노산서열(서열번호 25), 139-148위치의 아미노산서열(서열번호 26), 259-277위치의 아미노산서열(서열번호 27), 199-204위치의 아미노산서열(서열번호 28), 151-158위치의 아미노산서열(서열번호 29), 275-291위치의 아미노산서열(서열번호 30), 20-28위치의 아미노산서열(서열번호 31), 65-90위치의 아미노산서열(서열번호 32), 150-170위치의 아미노산서열(서열번호 33) 및 280-290위치의 아미노산서열(서열번호 34);

(c) 변형성장인자(transforming growth factor)의 242-250위치의 아미노산서열(서열번호 35), 279-299위치의 아미노산서열(서열번호 36) 및 343-361위치의 아미노산서열(서열번호 37);

(d) 혈소판유래 성장인자의 100-120위치의 아미노산서열(서열번호 38) 및 121-140위치의 아미노산서열(서열번호 39);

(e) 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor)의 23-31위치의 아미노산서열(서열번호 40) 및 97-105위치의 아미노산서열(서열번호 41);

(f) 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor)의 16-27위치의 아미노산서열(서열번호 42), 37-42위치의 아미노산서열(서열번호 43), 78-84위치의 아미노산서열(서열번호 44) 및 107-112위치의 아미노산서열(서열번호 45);

(g) dentin sialoprotein의 255-275위치의 아미노산서열(서열번호 46), 475-494위치의 아미노산서열(서열번호 47) 및 551-573위치의 아미노산서열(서열번호 48);

(h) 헤파린 결합 EGF-유사 성장 인자(heparin binding EGF-lke growth factor)의 63-83위치의 아미노산서열(서열번호 49), 84-103위치의 아미노산서열(서열번호 50), 104-116위치의 아미노산서열(서열번호 51) 및 121-140위치의 아미노산서열(서열번호 52);

(i) cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3의 326-350위치의 아미노산서열(서열번호 53), 351-371위치의 아미노산서열(서열번호 54), 372-400위치의 아미노산서열(서열번호 55), 401-423위치의 아미노산서열(서열번호 56), 434-545위치의 아미노산서열(서열번호 57), 546-651위치의 아미노산서열(서열번호 58), 1375-1433위치의 아미노산서열(서열번호 59), 1435-1471위치의 아미노산서열(서열번호 60), 1475-1514위치의 아미노산서열(서열번호 61), 1515-1719위치의 아미노산서열(서열번호 62), 1764-1944위치의 아미노산서열(서열번호 63) 및 2096-2529위치의 아미노산서열(서열번호 64); 및

(j) osteoblast specific cadherin(OB-cadherin)의 54-159위치의 아미노산서열(서열번호 65), 160-268위치의 아미노산서열(서열번호 66), 269-383위치의 아미노산서열(서열번호 67), 384-486위치의 아미노산서열(서열번호 68) 및 487-612위치의 아미노산서열(서열번호 69)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 조직공학용 지지체.
제12항에 있어서, 서열번호 1 (CGGRGDS) 또는 서열번호 2(CGGVACDCRGDCFC)의 아미노산서열을 가지는 세포부착 유도 펩타이드가 추가로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 조직공학용 지지체.
제13항에 있어서, 조직성장인자 유래 펩타이드는 N-말단에 시스테인이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는 조직공학용 지지체.
제14항에 있어서, 시스테인은 CGG의 형태로 부가되어 있는 것을 특징으로 하는 조직공학용 지지체.
제12항에 있어서, 조직공학용 지지체의 표면은 가교제가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조직공학용 지지체.
제16항에 있어서, 상기 가교제는 1,4-bis-maleimidobutane(BMB), 1,11-bis- maleimidotetraethyleneglycol(BM[PEO]4), 1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC), succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]](SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), succimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoate] (SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), succimidyl [4-(p-maleimidophenyl) butyrate](SMPB) 및 그의 설폰화염 (sulfo-SMPB)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조직공학용 지지체.