KR100630903B1

KR100630903B1 - 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및임플란트

Info

Publication number: KR100630903B1
Application number: KR1020060049454A
Authority: KR
Inventors: 박윤정; 정종평; 이승진; 구영
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2006-10-09
Also published as: KR20060082060A

Abstract

본 발명은 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및 임플란트에 관한 것으로, 구체적으로 가교제가 결합된 표면에 세포부착유도 펩타이드 또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 고정된 차폐막 및 임플란트에 관한 것이다.

본 발명의 차폐막 및 임플란트는 표면에 약리활성을 부여하여 재생에 관련된 새포의 이행, 증식 및 분화를 촉진하여 최종적으로 조직재생력을 극대화시킬 수 있다. 또한 표면에 고정된 약리활성을 부여하기 위한 펩타이드는 분자량이 적어 체내에 적용시 면역반응의 위험이 없고 화학적 조작에 의해 체내에서 안정한 형태로 존재할 수 있어 약효의 지속화가 가능하며, 치주조직 수술시 용이하게 고안된 펩타이드를 차폐막 표면에 붙여서 술식에 바로 적용함으로써 수술 편의성이 우수하며 또한 치료효과의 최대화를 기대할 수 있다.

조직성장인자, 펩타이드, 고정화, 키토산 차폐막, 임플란트.

Description

표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및 임플란트{MEMBRANE AND IMPLANT IMMOBILIZED OSTEOGENIC ENHANCING PEPTIDES ON THE SURFACE}

도 1은 본 발명에 의해 차폐막에 고정된 펩타이드의 전자표면분석 결과를 나타낸 것으로,

도 1a는 펩타이드가 고정되지 않은 키토산 나노섬유로 제작된 차폐막의 표면분석결과를 나타낸 그래프이며,

도 1b는 유황을 함유한 펩타이드가 고정된 키토산 나노섬유로 제작된 차폐막의 표면분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 차폐막의 세포 부착양상을 나타낸 SEM 사진으로서,

도 2a는 펩타이드가 고정되지 않은 차폐막의 세포 부착양상을 나타낸 것이며,

도 2b 및 도 2c는 BMP 및 Bone sialoprotein으로부터 유래된 펩타이드가 각각 고정된 차폐막의 세포 부착양상을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 차폐막의 세포 부착도를 정량적으로 분석한 그래프이다.

도 4는 본 발명의 차폐막에 세포를 분주하여 배양한 후 일정기간 배양하고, 배양된 세포를 수거하여 세포내의 오스테오칼신의 양을 RT-PCR 실험을 통해 정량한 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및 임플란트에 관한 것이다.

치아를 지지하는 치주조직은 크게 치조골, 치조골과 치아 사이의 치근막을 구성하는 치주 인대조직, 상피조직, 그리고 결체조직으로 이루어진다. 치주염의 진행으로 인한 치조골의 소실은 치주 인대조직의 상실을 동반하며, 치주염 치료 후 소실된 조직 부위에서는 결제조직의 과다생장으로 인해 치조골과 치주 인대조직의 정상적인 회복이 불가능하여진다. 또 새로운 뼈가 생성되더라도 치주 인대조직이 정상적으로 분화되지 않아 치아기능상실을 유발할 수 있다. 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위하여 치조골 재생술로 자가골이식(autografting)술과 함께 인위적인 차폐막을 이용하여 완전한 조직의 재생 또는 신형성을 유도하려는 시도가 활발히 이루어지고 있다. 최근 10여년 동안에 차폐막의 도입을 통하여 효과적으로 치주 조직의 재생을 유도한 사례(J. Gottlow, et al., J. Clin. Perio, 13, (1986) pp. 604~616)가 보고된 이래 여러가지 소재를 차폐막으로 이용하여 조절적 유도조직재생에 대한 연구가 진행되어 왔다.

한편, 차폐막의 조직 재생을 향상시키기 위해, 차폐막에 조직 재생을 향상시킬 수 있는 물질들을 부착하는 연구가 진행되고 있다. 이 중 세포외 기질 물질 (Extracellular matrix)이나 특정 조직성장인자들은 생체내에서 조직손상을 수복하고 재생시키는 능력이 탁월한 것으로 보고되어져 왔으며, 실제 임상에서도 우수한 조직재생력은 다수의 결과에서 확인된바 있다.

그러나 이들 대부분의 세포외기질 및 성장인자들은 상대적으로 고가이고, 분자량이 수십 KDa에 이르는 고분자량의 단백질로서 그 활성을 유지하기 위해서는 특정 삼차구조를 항시 보존해야하는 조건이 필수적이나 실제로 생체 내에서는 불안정하여 활성이 떨어지는 단점이 지적되어져 왔다. 특히 수 분 이내로 체내에서 소실되어지므로 원하는 치료효과를 얻기 위해서는 대용량을 투여해야 하는 어려운 점이 있으며 이로 인한 부작용 유발 또한 단점으로 지적되어져 왔다.

최근 유도 조직 재생술식 (Guided Tissue Regeneration, GTR) 및 임플란트 시술에 적용되는 유도골재생술 (Guided Bone Regenearation, GBR)에 활용되는 고분자 차폐막이나 조직공학기술 (Tissue Engineering)에 활용되는 고분자 지지체 (scaffold)에 상기 조직성장인자들을 함유시켜 서방출화함으로써 단순 적용에 따른 단점을 경감하고자 하는 시도가 이루어져 왔으며 어느정도 그 효과도 입증 되었다. 그러나 이들 고분자 차폐막이나 지지체에 의해서는 조직성장인자가 물리적으로 혼합되어져 있는 상태로서 초기 적용시 속방출 (burst release)이 일어나 치료기간동안 유효농도 유지가 어려운 단점이 지적되었다.

본 발명의 목적은 상기한 종래기술의 문제점을 개선하기 위한 것으로, 구체적으로 저농도의 용량으로도 원하는 조직재생효과를 얻을 수 있는 조직성장인자의 활성부위로 이루어진 펩타이드가 그 활성을 유지한 채로 표면에 안정하게 고정된 차폐막 및 임플란트를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가교제가 결합된 표면에 세포부착유도 펩타이드 또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 고정된 차폐막 및 임플란트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표면에 약리활성을 갖도록 하여 치주조직 재생효율을 증가시킬 수 있는 조직재생용 고분자 차폐막 및 임플란트를 제공하는 것으로, 상기 약리활성은 차폐막 또는 임플란트 표면에 약리활성을 갖는 펩타이드를 고정시킴으로써 성취할 수 있다.

상기 펩타이드는 세포부착 유도 펩타이드 또는 조직성장인자 유래 펩타이드를 사용한다. 상기 세포부착 유도 펩타이드 또는 조직성장인자 유래 펩타이드는 생리활성 시토킨(cytokine)에서 활성부위의 아미노산 배열을 분리추출한 것으로, 추출 후에 화학적 수식을 거쳐 활성구조를 유지하도록 하였다.

구체적으로, 상기 세포부착 유도 펩타이드는 일반적으로 사용되는 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 포함하는 펩타이드를 사용하며, 바람직하게는 서열번호 2 또는 상기 서열번호 1의 아미노산을 RGD를 구조적으로 안정하게 유지하고자 고안된 서열번호 3을 사용한다. 또한, 상기 조직성장인자 유래 펩타이드는 조직성장인자의 활성영역으로부터 유래된 것을 동정하여 화학적으로 합성한 것을 사용한다. 구체적으로,

(a) 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP)-2의 283-302번 위치의 아미노산(서열번호 4), 335-353번 위치의 아미노산(서열번호 5), 370-390번 위치의 아미노산(서열번호 6);

BMP-4의 293-313번 위치의 아미노산(서열번호 7), 360-379번 위치의 아미노산(서열번호 8), 382-402번 위치의 아미노산(서열번호 9);

BMP-6의 397-418번 위치의 아미노산(서열번호 10), 472-490번 위치의 아미노산(서열번호 11), 487-510번 위치의 아미노산(서열번호 12);

BMP-7의 320-340번 위치의 아미노산(서열번호 13), 390-409번 위치의 아미노산(서열번호 14), 405-423번 위치의 아미노산(서열번호 15);

(b) Bone sialoprotein의 199-204번 위치의 아미노산(서열번호 16), 151-158번 위치의 아미노산(서열번호 17), 275-291번 위치의 아미노산(서열번호 18), 20-28번 위치의 아미노산(서열번호 19), 65-90번 위치의 아미노산(서열번호 20), 150-170번 위치의 아미노산(서열번호 21), 280-290번 위치의 아미노산(서열번호 22),

(c) 변형성장인자(Transforming growth factor) beta 1의 242-250번 위치의 아미노산(서열번호 23), 279-299번 위치의 아미노산(서열번호 24), 343-361번 위치의 아미노산(서열번호 25),

(d) 혈소판 유래 성장인자의 100-120번 위치의 아미노산(서열번호 26), 121-140번 위치의 아미노산(서열번호 27),

(e) 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor)의 23-31번 위치의 아미노산(서열번호 28), 97-105번 위치의 아미노산(서열번호 29),

(f) 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor)의 16-27번 위치의 아미노산(서열번호 30), 37-42번 위치의 아미노산(서열번호 31), 78-84번 위치의 아미노산(서열번호 32), 107-112번 위치의 아미노산(서열번호 33),

(g) Dentin Sialoprotein의 255-275번 위치의 아미노산(서열번호 34), 475-494번 위치의 아미노산(서열번호 35), 551-573번 위치의 아미노산(서열번호 36),

(h) 헤파린 결합 EGF-유사 성장 인자(Heparin binding EGF-lke growth factor)의 63-83번 위치의 아미노산(서열번호 37), 84-103번 위치의 아미노산(서열번호 38), 104-116번 위치의 아미노산(서열번호 39), 121-140번 위치의 아미노산(서열번호 40),

(i) Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3의 326-350번 위치의 아미노산(서열번호 41), 351-371번 위치의 아미노산(서열번호 42), 372-400번 위치의 아미노산(서열번호 43), 401-423번 위치의 아미노산(서열번호 44), 434-545번 위치의 아미노산(서열번호 45), 546-651번 위치의 아미노산(서열번호 46), 1375-1433번 위치의 아미노산(서열번호 47), 1435-1471번 위치의 아미노산(서열번호 48), 1475-1514번 위치의 아미노산(서열번호 49), 1515-1719번 위치의 아미노산(서열번호 50), 1764-1944번 위치의 아미노산(서열번호 51), 2096-2529번 위치의 아미노산(서열번호 52),

(j) Osteoblast specific Cadherin(OB-Cadherin)의 54-159번 위치의 아미노산(서열번호 53), 160-268번 위치의 아미노산(서열번호 54), 269-383번 위치의 아미노산(서열번호 55), 384-486번 위치의 아미노산(서열번호 56), 487-612번 위치의 아미노산(서열번호 57),이며,

상기 펩타이드는 N-말단에 두개의 글리신 (Glycine)잔기와 시스테인을 부가하여 펩타이드의 구조를 안정화 하고 화학적으로 차폐막의 고정에 용이하도록 한다.

이러한 펩타이드는 1 종 또는 2종 이상의 혼합 펩타이드를 차폐막에 고정시킬 수 있다. 상기 활성 펩타이드는 전체 조직성장인자의 아미노산 배열중 10∼20개 단위의 아미노산 배열을 각각 합성하여 이들로부터 세포접착력 실험을 시행하여 가장 활성이 높은 아미노산 배열을 선택하여 이들의 말단에 다시 화학적 수식을 가한 후 차폐막 및 임플란트 표면에 고정이 용이하도록 고안한 것으로서 차폐막은 표면에 최소단위의 아미노산 배열만으로 활성을 유지함과 동시에 조직성장인자의 물리적인 함입 및 도포에 따르는 약의 손실 및 부작용을 줄일수 있어 치료효과에 부가적인 이점을 제공할 수 있다.

본 발명에 의해 표면이 활성화될 차폐막은 본 분야에서 사용할 수 있는 모든 종류 및 형태의 차폐막을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 다공성 폴리락트산 차폐막; 키틴 또는 키토산의 나노섬유로 제조된 재생막 또는 필름형태의 차폐막이 포함된다. 또한 임플란트는 본 분야에서 사용할 수 있는 모든 종류의 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 티타늄 임플란트를 사용한다. 이때, 임플란트의 표면은 활성 펩타이드가 부착하는데 용이하도록 산화 및 질소화를 거친 것을 포함한다.

본 발명의 펩타이드는 각각 그 펩타이드의 N말단에 자유 아미노기 또는 시스테인을 지니고 있어서 가교제에 의한 차폐막으로의 고정이 용이하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 가교제는 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-Bis-maleimidobutane; BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-Bis-Maleimidotetraethyleneglycol; BM[PEO]₄), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로리드(1-Ethyl-3- [3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride; EDC), 숙신이미딜-4-[4-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복시-[6-아미도카프로에이트](Succinimidyl-4- [N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]; SMCC) 및 그의 설폰화염(Sulfo-SMCC), 숙시이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트(Succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)- propionamido]hexanoate; SPDP) 및 그의 설폰화염 (Sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester; MBS) 및 그의 설폰화염 (Sulfo-MBS), 숙시이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트(Succimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate; SMPB) 및 그의 설폰화염 (Sulfo-SMPB)이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 차폐막 및 임플란트의 표면에 화학적으로 결합시켜 표면에 단위면적당 0.1∼4.0 mg이 고정되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 펩타이드는 10∼20개의 아미노산 함량을 지니며 이들은 차폐막 및 임플란트의 표면단위 면적당 1∼2 mg이 고정되는 것이다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포부착성 RGD 펩타이드의 키토산 차폐막으로의 고정화

키토산 차폐막을 2 ml의 인산완충액 (pH 7.4)에 가하여 차폐막의 표면을 수화시킨 후 여기에 가교제로서 설폰산화된 숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복시-[6-아미도카프로에이트](Sulfonated Succinimidyl-4- [N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]; Sulfo-SMCC)를 5 mg/ml의 농도로 가하고, 2 시간동안 교반하여 차폐막의 표면에 반응기를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 차폐막을 세척하고 여기에 5 mg의 서열번호 2의 펩타이드를 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24시간동안 반응시키고, 세척한 후 펩타이 드가 고정된 차폐막을 제조하였다.

<실시예 2> 세포부착성 RGD 펩타이드의 폴리락트산 차폐막으로의 고정화

폴리락트산 차폐막을 인산완충액 (pH 4.7)에 가하여 표면을 수화시킨 후 염산 시스타민(cystamine, 20mg/ml)의 용액과 반응시켰다. 여기에 가교제로서 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카르보디이미드 히드록클로리드(1-Ethyl-3- [3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride; EDC)를 적가하여 폴리락트산의 표면의 카르복실산을 활성화시켰다. 24시간 반응 후 세척한 다음 1 ml의 디티오트레니올(dithiothreniol; DTT) 용액 (30mg/ml)을 가하여 다시 24시간 동안 반응하여 차폐막의 표면에 Sulfhydryl기가 도입되도록 하였다. 상기 차폐막은 세포부착성 RGD 펩타이드 서열번호 2와 혼합하여 차폐막과 펩타이드간 S-S의 결합을 자발적으로 유도할 수 있어 용시에 고정할 수 있도록 하였다.

<실시예 3> 조직성장인자 유래 펩타이드의 키토산 차폐막으로의 고정화

본 발명의 조직성장인자 중 골형성 단백질 (BMP-2)의 세포부착 및 활성 도메인의 아미노산 배열을 함유하면서 N-말단부위에 시스테인을 지니도록 고안된 펩타이드인 서열번호 58 펩타이드는 화학적 방법으로 합성한 것으로 사용하였다.

한편, 키토산 차폐막을 2ml의 인산완충액 (pH 7.4)에 가하여 차폐막의 표면을 수화시킨 후 여기에 가교제로서 Sulfo-SMCC를 5 mg/ml의 농도로 가하여 2시간동안 교반하여 차폐막의 표면에 반응기를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 차폐막을 세척하고 여기에 5 mg의 서열번호 58 펩타이드를 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시켜 세척한 후 펩타이드가 고정된 차폐막을 제조하였다.

<실시예 4> 조직성장인자 유래 펩타이드의 폴리락트산 차폐막으로의 고정화

본 발명의 조직성장인자 중 골형성 단백질 (BMP-2)의 세포부착 및 활성 도메인의 아미노산 배열을 함유하면서 N-말단부위에 시스테인을 지니도록 고안된 펩타이드인 서열번호 58 펩타이드는 화학적 방법으로 합성한 것을 사용하였다.

한편, 폴리락트산 차폐막을 인산완충액 (pH 4.7)에 가하여 표면을 수화시킨 후 염산 시스타민(20mg/ml)의 용액과 반응시켰다. 여기에 가교제로서 EDAC를 적가하여 폴리락트산의 표면의 카르복실산을 활성화시켰다. 24시간 반응 후 세척한 다음 1 ml의 DTT용액 (30mg/ml)을 가하여 다시 24시간 동안 반응하여 차폐막의 표면에 Sulfhydryl기가 도입되도록 하였다. 상기 차폐막은 조직성장인자 유래 펩타이드인 서열번호 58 펩타이드와 혼합하여 차폐막과 펩타이드간 S-S의 결합을 자발적으로 유도할 수 있어 용시에 고정할 수 있도록 하였다.

<실시예 5> Bone sialoprotein의 부착 및 활성부위를 함유하는 펩타이드의 키토산 차폐막으로의 고정

N-말단 부위에 스스테인을 지닌 본 발명의 Bone sialoprotein의 석회화유도 활성 도메인구조 (아미노산 서열)를 포함하는 펩타이드(서열번호 59) 및 세포부착 기능부위인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (서열번호 60)는 화학적으로 합성한 것을 사용하였다.

한편, 키토산 차폐막을 2 ml의 인산완충액 (pH 7.4)에 가하여 차폐막의 표면을 수화시킨 후 여기에 가교제로서 Sulfo-SMCC를 5 mg/ml의 농도로 가하여 2시간동안 교반하여 차폐막의 표면에 반응기를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 차폐막을 세척하고 여기에 5 mg의 상기 펩타이드를 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시켜 세척한 후 펩타이드가 고정된 차폐막을 제조하였다.

<실시예 6> Bone sialoprotein의 부착 및 활성부위를 함유하는 펩타이드의 폴리락트산 차폐막으로의 고정

N-말단 부위에 시스테인을 지닌 본 발명의 Bone sialoprotein의 석회화유도 활성 도메인구조 (아미노산 서열)를 포함하는 펩타이드(서열번호 59) 및 세포부착기능부위인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (서열번호 60)는 화학적으로 합성한 것을 사용하였다.

한편, 폴리락트산 차폐막을 인산완충액 (pH 4.7)에 가하여 표면을 수화시킨 후 염산 시스타민 (20mg/ml)의 용액과 반응시켰다. 여기에 가교제로서 EDAC를 적가하여 폴리락트산의 표면의 카르복실산을 활성화시켰다. 24시간 반응 후 세척한 다음 1 ml의 DTT용액 (30mg/ml)을 가하여 다시 24시간 동안 반응하여 차폐막의 표면에 Sulfhydryl기가 도입되도록 하였다. 상기 차폐막은 상기 제조된 펩타이드와 혼합하여 차폐막과 펩타이드간 S-S의 결합을 자발적으로 유도할 수 있어 용시에 고 정할 수 있도록 하였다.

<실시예 7> 세포부착성 RGD 펩타이드의 티타늄 임플란트로의 고정화

티타늄으로 이루어진 임플란트의 표면을 질소화 플라즈마처리하여 아민기를 표면에 노출시킨 후 여기에 가교제로서 Sulfo-SMCC를 5mg/ml의 농도로 가하여 2시간동안 교반하여 표면에 반응기를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 임플란트를 세척하고 여기에 5mg의 서열번호 2 펩타이드를 100ul의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24시간동안 반응시켜 세척한 후 펩타이드가 고정된 임플란트를 제작하였다.

<실시예 8> 조직성장인자 유래 펩타이드의 티타늄 임플란트로의 고정화

한편, 티타늄으로 이루어진 임플란트의 표면을 질소화 플라즈마처리하여 아민기를 표면에 노출시킨 후 여기에 가교제로서 Sulfo-SMCC를 5mg/ml의 농도로 가하여 2시간동안 교반하여 표면에 반응기를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 임플란트를 세척하고 여기에 5 mg의 펩타이드를 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24시간동안 반응시켜 세척한 후 펩타이드가 고정된 임플란트를 제작하였다.

<실시예 9> Bone sialoprotein의 부착 및 활성부위를 함유하는 티타늄 임플란트로 의 고정화

N-말단 부위에 시스테인을 지닌 본 발명의 Bone sialoprotein의 석회화유도 활성 도메인구조 (아미노산 서열)를 포함하는 펩타이드(서열번호 59) 및 세포부착기능부위인 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 (서열번호 60)는 화학적으로 합성된 것을 사용하였다.

한편, 티타늄으로 이루어진 임플란트의 표면을 질소화 플라즈마처리하여 아민기를 표면에 노출시킨 후 여기에 가교제로서 Sulfo-SMCC를 5 mg/ml의 농도로 가하여 2시간동안 교반하여 표면에 반응기를 도입하였다. 2시간 상온반응 후 임플란트를 세척하고 여기에 5 mg의 펩타이드를 100 ㎕의 인산완충액에 녹인 용액을 가하여 24 시간동안 반응시켜 세척한 후 펩타이드가 고정된 임플란트를 제작하였다.

< 실험예 1> 차폐막 표면 분석

실시예 1 내지 6에서 제조된 각각의 펩타이드가 고정된 차폐막의 표면을 분석하기 위하여, 제작된 차폐막을 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 차폐막을 1%의 오스뮴 테트르옥시드(osmium tetroxide) 용액으로 처리한 후 세척하여 탈수 및 건조하였다.

건조된 차폐막의 표면을 XPS방법에 의해 분석하였다. 이 방법은 표면에 고정된 원소를 동정하여 결합의 유무를 확인하는 방법인데 본 발명에 의해 고정된 펩타이드와 차폐막의 사이에는 유황결합 (disulfide bond)이 존재하므로 유황의 존재유무로 결합을 확인할 수 있었다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명에 의해 차폐막에 고정된 펩타이드의 분석결과를 나타낸 그래프로서, 전자표면분석을 통해 표면에 존재하는 유황(Sulfur)의 존재유무를 확인하였다. 구체적으로 도 1a는 펩타이드가 수식되지 않은 키토산 나노섬유로 제작된 차폐막의 표면분석을 나타낸 것이며, 도 1b는 유황을 함유한 펩타이드가 고정된 차폐막으로서, 표면의 분석된 유황의 존재로서 펩타이드가 고정되었음을 알 수 있다.

<실험예 2> 차폐막으로의 세포부착력 실험

실시예 1, 3, 5에 의해 제조된 펩타이드 부착 차폐막에 골아세포를 접종한 후 4시간 및 1일에 걸쳐 배양하였다. 배양한 후 차폐막을 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 차폐막을 1%의 오스뮴 테트르옥시드(osmium tetroxide) 용액으로 처리한 후 세척하여 탈수 및 건조하였다.

건조된 차폐막의 표면은 시차주사 전자현미경으로 분석하였다. 도 2a 내지 도 2c는 펩타이드가 수식된 차폐막으로의 세포의 부착양상을 나타낸 SEM 사진이다. 도 2a는 수식되지 않은 차폐막으로의 세포부착을 나타낸 것이며, 도 2b 및 도 2c는 각각 BMP 및 Bone sialoprotein으로부터 유래된 펩타이드가 각각 고정된 차폐막으로의 세포부착을 나타낸 것이다. 세포부착결과 펩타이드가 고정되지 않은 차폐막의 세포부착도가 크지 않은 반면 BMP 및 Bone sialoprotein유래 펩타이드가 고정된 차폐막으로는 이미 4시간 째에도 현저히 많은 세포가 안정하게 부착되었음을 관찰할 수 있었다.

또한, 도 3은 세포 부착도를 정량적으로 분석한 결과로서, 도 3에서 보는 바와 같이, 표면에 수식되지 않은 키토산의 차폐막 보다도 펩타이드가 수식된 경우 세포의 부착정도가 현저히 증가됨을 알 수 있다.

<실험예 3> 펩타이드 고정 차폐막에 배양된 골아세포의 오스테오칼신의 발현

골아세포를 차폐막 및 펩타이드가 고정된 차폐막의 표면에 접종한 후 2주간 배양하였다. 배양후 세포내의 총 RNA를 추출하고 이의 양을 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이중 0.5 ㎍의 RNA로부터 0.5 ㎍의 올리고dT primer를 이용하여 cDNA로 역전사한 후 쥐의 오스테오칼신 단백질의 primer와 연쇄중합반응기를 이용하여 역전사된 cDNA를 증폭하였다. 이후 증폭된 DNA는 2% 아가로즈 젤 상에서 전기영동시킨 후 SYBR Gold 핵산 염색시약으로 염색하여 관찰하였다.

도 4는 세포내의 오스테오칼신(osteocalcin) 발현을 RT-PCR실험을 통해 나타낸 것이다. 도 4에서 보는 바와 같이, 펩타이드가 고정된 차폐막의 표면에 배양된 골아세포에서 오스테오칼신의 발현이 고정되지 않은 차폐막에 배양된 세포에서보다도 현저히 증가하였음을 나타내주며, 이로 인해 차폐막의 표면에 조직성장인자유래 펩타이드의 고정이 세포의 골조직으로의 분화를 촉진함을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 활성펩타이드가 고정된 차폐막 및 임플란트는 차폐막 및 임플란트의 표면에 조직성장인자의 활성부위 펩타이드를 고정하는 것만 으로도 현저한 세포접착력 및 골조직으로의 분화를 촉진함을 알 수 있다. 이는 기존의 방법에 의한 조직성장인자의 활용의 단순 함입에 의한 빠른 분해 및 체내 누출에 따르는 부작용을 막을수 있다는 점과 국소농도를 높이기 위해 다량을 적용함에 따르는 막대한 비용을 절감할 수 있는 두가지 장점을 가지고 있다. 펩타이드는 전체조직성장인자보다도 체내 효소반응에 민감하지 않고 체내 면역원성도 낮으므로 펩타이드를 차폐막이나 임플란트의 표면에 고정하여 술식에 이용하는 경우 원하는 농도의 활성 펩타이드가 국소에서 존재하면서 활성을 나타내어 치료효과를 증가할 수 있어 골조직 및 치주조직 재생 치료에 적합한 특징을 갖는다.

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Claims

가교제가 결합된 표면에 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9; 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12; 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15; 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 가지는 조직성장인자 유래 펩타이드가 고정되어 있으며, 상기 펩타이드의 N-말단에 두 개의 글리신 잔기와 시스테인이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는 임플란트.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드가 표면에 1 종 또는 그 이상의 혼합 펩타이드로 고정되는 것을 특징으로 하는 임플란트.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 임플란트가 티타늄 임플란트인 것을 특징으로 하는 임플란트.
제 1항에 있어서, 상기 가교제가 1,4-비스-말레이미도부탄, 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜, 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로리드, 숙신이미딜-4-[4-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복시-[6-아미도카프로에이트] 및 그의 설폰화염, 숙시이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트 및 그의 설폰화염, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 및 그의 설폰화염 (Sulfo-MBS), 숙시이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트 및 그의 설폰화염로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 임플란트.
제 1항에 있어서, 상기 표면에 고정되는 펩타이드의 용량이 0.01∼5 ㎎인 것을 특징으로 하는 임플란트.