KR100665504B1 - 눈개승마 추출물을 포함하는 허혈성 질환 및 퇴행성뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저산소 조건에서 세포생존 개선능력을 갖는 눈개승마 (Aruncus dioicus (Walt.) Fern var.) 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 조추출물 및 비극성용매 가용추출물은 허혈상태에서의 세포자살(apoptosis)을 억제하여 허혈성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 사용될 수 있다.

눈개승마, 비극성용매, 세포자살, 허혈성질환, 퇴행성 뇌질환

Description

눈개승마 추출물을 포함하는 허혈성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물{Composition comprising an extract of Aruncus dioicus. for the prevention and treatment of ischemic diseases and degenerative brain diseases}

도 1은 눈개승마 조추출물을 첨가하지 않은 세포주와 첨가한 세포주의 저산소와 정상산소 조건하에서 세포생존결과를 비교한 도이며,

도 2a는 저산소조건에서 배양배지에 눈개승마 조추출물을 첨가하지 않은 세포주의 DNA분절분석 결과를 나타낸 도이며,

도 2b는 저산소조건에서 배양배지에 눈개승마 조추출물을 첨가한 세포주의 DNA분절분석 결과를 나타낸 도이며,

도 3은 저산소 조건에서 배양배지에 농도를 달리한 눈개승마 조추출물 또는 비극성용매 가용추출물을 첨가한 각각의 세포주에 대해 MTT어세이(MTT assay)를 수행함으로써 각 분획의 효과를 나타낸 도이고,

도 4a는 눈개승마 조추출물을 주입하지 않은 뇌경색모델과 주입한 뇌경색모델의 TTC(triphenyl tetrazolium chloride) 염색 결과를 비교한 도이며,

도 4b는 눈개승마 조추출물을 주입하지 않은 뇌경색모델의 TTC 염색 결과를 나타낸 도이며,

도 4c는 눈개승마 조추출물을 주입한 뇌경색모델의 TTC 염색 결과를 나타낸 도이며,

도 5는 눈개승마 비극성용매 가용분획물을 주입하지 않은 뇌경색모델과 주입한 뇌경색모델의 TTC 염색 결과를 비교한 도이다.

본 발명은 세포자살을 억제함으로써 허혈성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방 효과가 있는 눈개승마 추출물에 관한 것이다.

대표적인 허혈성 질환인 뇌경색과 심근경색은 고혈압, 고지혈증, 당 뇨, 흡연 등에 의해 혈관이 좁아지는 동맥경화증에 빠진 상태에서 혈전 등에 의해 뇌에 혈액을 공급하는 뇌동맥 또는 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 막혀 주위조직이 괴사됨으로써 발생한다.

심혈관질환은 세계적으로 전체 사망률의 30%를 차지하고 있어 사망률 1위를 차지하고 있으며, 이 중의 75%는 심근경색과 뇌경색과 같은 허혈성질환이 차지하고 있어 심근경색과 뇌경색 각각은 암과 더불어 3대 높은 사망률을 이루고 있다. 이러한 심근경색과 뇌경색에 의한 사망률을 줄이는 방법에는 고혈압과 고지혈증을 치료하여 혈관의 폐색을 방지하는 방법과 혈관 폐색시 주위조직의 괴사를 감소시키는 방법이 있다.

이 중 괴사부위를 감소시키는 최선의 방법은 가장 빠른 시간 내에 막힌 혈관을 혈전용해제로 뚫어 혈관을 재관류시키는 것이나, 심장과 뇌는 호흡에 의해 에너지를 얻는 관계로 혈관이 막히는 폐색 3-6 시간 이내에 조직들이 괴사되어 이후에는 재관류를 시키더라도 그 치료효과를 기대할 수 없다. 그런데, 폐색 3-6 시간 이내에 병원에 도착하여 재관류시키는 것은 현실적으로 어렵고, 또한 심장과 뇌는 일단 손상을 입으면 재생이 잘 되지 않으므로 병원에서 재관류시킬 때까지 허혈상태에서의 세포생존력을 개선할 수 있다면 치료효과를 높일 수 있다. 이 때, 조직괴사의 원인은 세포자살이므로(Crow MT et al., Circ. Res., 95, pp957-970, 2004; Friedlander RM et al., N. Engl. J. Med., 348, pp1365-1375, 2003), 세포자살을 억제함으로써 세포생존력을 개선할 수 있다.

또한, 심장을 정지시키고 시행하는 수술의 경우, 심폐기에 의해 공급되는 산소량보다 요구되는 산소량이 많게 되면 심근손상 또는 저혈압에 의한 뇌손상이 발생할 수 있다. 예를 들어, 관상동맥 폐색시에 실시하는 우회로이식(bypass graft) 수술, 뇌동맥이나 대동맥에 발생한 동맥류(aneurysm) 수술 등, 혈액을 일부 차단하는 수술 시에 허혈로 인한 심근손상 및 뇌손상으로 심부전 및 반신불수 등의 부작용이 발생할 수 있다. 실제로 대동맥류의 수술적 또는 중재적 치료시, 3-16%의 환자에게서 심근허혈, 신부전, 하지 마비 등의 부작용이 나타난다. 따라서 허혈조건에서 세포자살을 억제하는 약물을 전처치에 이용한다면, 상기 부작용을 감소시킬 수 있다.

신경세포자살의 원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않았지만 대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP가 감소하고 부종(edema)이 발생되면서 신경세포자살이 유발되는 것으로 알려져있다. 뇌허혈에 의한 신경세포자살 기전으로는 허혈에 의해서 세포 밖에 과도한 글루탐산(glutamate)이 축적되게 되고 이 글루탐산이 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포자살이 유발된다는 흥분성 신경세포자살 기전(Kang TC. et al., J. Neurocytol., 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류 시에 갑작스러운 산소 공급으로 인한 생체 내 라디칼의 증가가 DNA 및 세포질에 손상을 입혀 신경세포사가 유발된다는 산화성 신경세포자살 기전(Won MH. et al., Brain Res., 836, pp70-78, 1999)이 있다. 이러한 기전적인 연구를 바탕으로 뇌허혈로 인한 신경세포자살을 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있지만 아직까지 신경세포자살을 효과적으로 억제하는 물질은 거의 발견되지 않았다.

다만, 허혈조건에서 세포자살을 억제하는 테트라사이클린 계열의 항생제인 미노사이클린의 경우, 심근경색(Yrjanheikki J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(23), pp13496-13500, 1999.) 및 뇌경색 (Scarabelli TM et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43(5), pp865-874, 2004.) 등의 허혈성질환뿐만 아니라 파킨슨병 (Wu DC et al., J. Neurosci., 22(5), pp1763-1771, 2002), 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병 및 헌팅턴병(Chen. M. et al., Nat. Med., 6(7), pp797-801, 2000) 등의 신경세포자살에 의해 발생하는 퇴행성 뇌질환의 치료에도 효과가 있다는 것이 알려져 있다. 또한, 본 발명자들은 이러한 테트라사이클린 계열의 항생제가 본 연구와 유사한 허혈조건에서 세포의 생존을 개선시키는 것을 확인하였다(미국특허등록번호 6716822호). 따라서 허혈조건에서 세포자살을 억제하여 세포생존을 개선시키는 천연물은 허혈성질환의 치료뿐만 아니라 신경세포자살에 의해 발생하는 퇴행성 뇌질환의 치료에도 효과가 있음을 유추할 수 있다.

눈개승마 (Aruncus dioicus (Walt.) Fern var. kamtschaticus Hara 또는 Korean goatsbeard)는 장미목 장미과에 속하는 여러해살이풀로 삼나물 또는 가승마라고도 불린다. 한방과 민간에서는 전초를 해독, 지혈 등에 약으로 쓰며, 지상부의 어린 순은 육개장을 만들 때 넣어 먹기도 한다. 이러한 효능을 가진 눈개승마의 주성분은 사포닌, 살리실 알데히드, 스파린, 인회분, 지질, 비타민 A 등이다.

본 식물에서 추출한 성분을 이용한 용도특허로는 일본특허등록 3251188호 및 5017768호가 있으나, 이는 상기 추출물을 항생제로써 이용한 특허이고 허혈성질환 및 퇴행성 뇌질환과 관련된 용도에 관해서는 상기 문헌 어디에도 교시되거나 기재된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 허혈성질환 및 퇴행성 뇌질환의 치료에 있어서 종래 기술상의 문제점을 인식하고 저산소 조건에서 세포생존력을 개선시키는 세포자살 억제제를 허혈성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 치료제로 개발하기 위한 연구개발을 통하 여 눈개승마 추출물 및 그 활성분획의 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 허혈조건에서 세포자살을 효과적으로 억제하는 눈개승마 추출물 및 이를 함유한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 눈개승마 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 허혈성질환은 심근경색, 뇌경색, 허혈성급성신부전증, 당뇨성족부궤양 및 외과수술 부작용에 기인한 질환(심부전, 반신불수 등) 등을 포함한다.

본 발명은 눈개승마 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병 등을 포함한다.

상기 추출물은 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 극성용매에 가용한 조추출물 및 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매에 가용한 비극성용매 가용추출물로, 바람직하게는 물 또는 메탄올에 가용한 조추출물 및 에틸아세테이트에 가용한 비극성용매 가용 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 눈개승마 조추출물은 건조 후, 세절한 눈개승마 줄기 또는 잎 중량의 약 1 내지 15배의 부피, 바람직하게는 약 5 내지 10배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜 또는 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매, 바람직하게는 메탄올을 가하고 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 100℃의 추출온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 약탕기 추출 등이 추출방법으로, 바람직하게는 약탕기 추출법으로 1회 내지 12회, 바람직하게는 3회 내지 4회 반복하여 추출한 후 여과하고, 여과한 추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 70℃에서 감압농축한 후 추출된 잔사를 진공동결건조기로 건조하여 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매에 가용한 눈개승마 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 비극성용매 가용추출물은 상기 수가용 추출물, 저급 알코올 가용 추출물 및 이들의 혼합용매에 의한 가용 추출물을 물에 현탁한 후, 이들 현탁액의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등과 같은 비극성 용매, 바람직하게는 에틸아세테이트를 가하여 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 4회 분획하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 당업계에 잘 알려진 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed., pp6-7, 1998).

본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 본 발명의 눈개승마 조추출물 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된 다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 허혈성질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 건강기능식품을 제공한다. 본 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

또한, 본 발명의 추출물은 허혈성질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 효과를 목적 으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품으로는 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 ∼ 20g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 눈개승마 조추출물의 제조

1-1. 눈개승마 물추출물의 제조

강원도 화천군 일대에서 채집한 눈개승마 줄기, 뿌리를 시료로 하여 깨끗이 수세하고 세절하여 건조한 후, 재래식 약탕기추출법에 따라서 눈개승마 200g에 물 2ℓ를 가하고 약 2시간 동안 전기 약탕기(대웅약탕기 DWP-2000, 대웅)에서 2회 반복하여 추출한 후, 여과한다. 여과하여 얻은 추출물 2.5ℓ를 냉동건조하여 눈개승마 추출물 16g을 수득하였다.

1-2. 눈개승마 메탄올 추출물의 제조

상기의 채집한 눈개승마 시료 500g에 5ℓ의 메탄올을 넣고 초음파추출기(sonicator)에서 24시간 동안 3회 반복하여 추출하여 여과하고, 감압농축기(NP-1, eyella)로 감압농축하여 눈개승마 추출물 50g을 수득하였다.

실시예 2. 눈개승마 비극성용매 가용추출물의 제조

상기 실시예 1-1의 물추출물인 경우는 그대로, 실시예 1-2의 메탄올추출물인 경우에는 30g의 농축된 추출물을 1ℓ의 증류수에 부유시키고, 여기에 1ℓ의 헥산을 넣어서 강하게 진탕한 후 방치하여 두개의 층이 완전히 분리가 되었을 때 상층액을 회수하였다. 다시 남은 물층에 1ℓ의 헥산을 넣고 같은 과정을 2회 더 반복하여 합쳐서 3ℓ를 수득하였다. 수득한 헥산층을 감압하에서 농축하여 2g의 헥산분획물을 얻었다. 헥산 추출 후 남은 물층에 동량의 에틸아세테이트를 넣고 위와 같은 과정을 3회 반복하여 합친 후 감압농축하여 에틸아세테이트 분획물 10g을 제조하였다. 동일한 방법으로 10g의 부탄올 분획물을 제조하였다. 최종적으로 남은 물층은 그대로 농축하였다.

참고예 1. 실험동물의 준비

실험동물은 체중 280-310g의 스프라그-다우리(Sprague-Dawley)계 수컷 랫트(효창사이언스 사)를 사용하였고, 대구카톨릭의대 동물사육실에서 일정한 조건(온도: 21±2, 명암: 12시간 명암주기)에서, 사료와 음수의 자유로운 섭취가 가능하도록 하였으며, 실험시작 전까지 물과 먹이를 충분히 제공하며 실험시작 전에 실험동물을 10분 동안 사전취급(handling) 한다.

실험예 1. 조추출물의 세포생존개선 능력 측정 (in vitro)

본 추출물이 저산소 및 정상산소 조건에서 세포의 생존에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포에 농도를 달리한 추출물을 넣은 배지를 첨가한 후, 저산소 조건 및 정상산소 조건에서 하기와 같이 실험을 수행함으로써 세포생존을 개선시키는 정도를 문헌(Sambrook J. and Russel D.W., Molecular Cloning 3rd ed., Vol.3, A8.6-8,8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)에 기재된 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion)을 변형하여 측정하였다.

간암세포주인 HepG2(1×10⁶ 세포/4ml)를 이글 최소 배지를 사용하여 60 mm dish에서 배양하였다. 세포들을 37℃ 및 5% CO₂-95% 대기상태에서 48시간 동안 배양한 후 새로운 배양배지로 교체한 다음, 조추출물을 DMSO에 용해시켜 100㎍/㎖의 농도로 배양배지에 첨가한 실험군 및 아무것도 첨가하지 않은 음성대조군(negative control)을 저산소 (산소농도 3%) 및 정상산소 조건에서 각각 2일 동안 배양한 후, 트립판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion)을 이용하여 세포수를 측정하였다.

도 1에서 보는 바와 같이, 본 추출물은 저산소 조건에서는 100㎍/㎖의 농도에서 세포의 생존을 개선시키면서도 (도 1의 위 그림), 정상산소 조건에서는 세포의 성장을 저해하지 않는 것을 확인하였다 (도 1의 아래 그림). 이에 따라 본 추출물이 저산소 조건에서 효과적으로 세포의 생존을 개선한다는 것을 확인할 수 있었고 정상조건에서 세포성장을 저해하지 않으면서 저산소 조건에서 효과를 나타내기 위해서는 100㎍/㎖ 이상의 농도로 투여되어야 함을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 조추출물의 저산소조건에서의 세포자살 억제 효과 시험(in vitro)

본 추출물이 저산소 조건에서 세포생존에 도움을 주는 기전을 확인하기 위해서 문헌에 기재된 DNA분절분석방법(DNA fragmentation assay-G. P. Studzinski, Apoptosis, pp47-48, 1999)을 변형하여 수행하였다.

간암세포주인 HepG2(1×10⁶ 세포/4ml)를 이글 최소 배지를 사용하여 60 mm dish에서 배양하였다. 상기 실험예 1에서와 동일한 조건에서 세포들을 37℃ 및 5% CO₂-95% 대기상태에서 48시간 동안 배양한 후 새로운 배양배지로 교체한 다음, 상기 실시예 1의 추출물을 DMSO에 용해시켜 100㎍/㎖의 농도로 배양배지에 첨가한 실험군 및 아무것도 첨가하지 않은 음성대조군(negative control)을 저산소 조건에서 각각 2일 동안 배양하면서, DNA분절분석(DNA fragmentation assay)을 실시하여 DNA 사다리가 나타나는 양상을 조사하였다. 그 결과, 추출물을 첨가한 실험군이 첨가하지 않은 대조군보다 DNA 사다리(ladder)가 나타나는 시간이 지연되었다(도 2a, 2b 참조). 따라서 조추출물이 세포자살을 억제하여 세포의 생존을 개선시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 분획물의 세포생존개선 능력 측정 (in vitro)

본 조추출물로부터 분리된 분획의 활성을 확인하기 위해서 문헌에 기재된 MTT 어세이법(Julio E. Celis (Ed.), Cell Biology, 1, pp369-370, Academic Press, 1994)을 변형하여 HepG2 세포주에 각각 농도를 달리한 분획물을 넣은 배지를 첨가한 후, 저산소 조건에서 하기와 같이 실험을 수행함으로써 세포생존을 개선시키는 정도를 조사하였다.

간암세포주(human hepatoma cell line)인 HepG2(2×10⁵ 세포/800㎕)를 이글 최소 배지를 사용하여 12웰 플레이트(12well-plate)에서 배양하였다. 세포들을 37℃ 및 5% CO₂-95% 대기상태에서 48시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 1의 조추출물 뿐만 아니라 실시예 2의 분획물들을 DMSO에 용해시켜 1-1000㎍/㎖의 농도로 배양배지에 첨가한 실험군 및 아무것도 첨가하지 않은 음성대조군(negative control)을 저산소와 정상산소 조건하에서 각각 2일 동안 배양하면서, MTT 어세이를 수행하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 헥산 분획층(Hx)은 세포 생존률 증가에 거의 기여하지 않았고 조추출물(Wh)과 부탄올 분획층(Bu)은 100-1,000㎍/㎖의 농도에서 비로소 세포의 생존률을 증가시킬 수 있는데 반해, 에틸아세테이트 분획층(EA)의 경우에는 10-100㎍/㎖의 농도에서 세포의 생존률을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 세포생존을 개선시키는 물질이 에틸아세테이트 분획층에 많이 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 복강주사시, 뇌경색에 대한 효과 시험(in vivo)

본 추출물이 뇌경색의 치료에 효과가 있는지를 확인하기 위해 문헌(Han HS et al., Journal of Neuroscience, 22, pp3921-3928, 2002)에 기재된 실험을 변형하여 상기 참고예 1의 랫트로 뇌경색모델을 만들어 하기와 같이 동물실험을 수행하였다.

4-1. 조추출물이 뇌경색모델에 미치는 영향

상기 참고예 1의 랫트를 엔플루란(enflurane)으로 흡입 마취시킨 후 하지동맥에서 혈압측정 및 혈액 채취 경로를 확보하고 경부를 절개하여 경동맥을 노출시킨 후, 경동맥과 외경동맥을 결찰하고 내경동맥으로 3-0 나이론 봉합사를 넣어 중간대뇌동맥(middle cerebral artery)을 막아서 뇌경색 모델을 만들었다.

상기 실시예 1의 조추출물을 이 뇌경색모델에 주입하여 괴사부위의 면적을 조사하였다. 이 때 투여량은 독성이 없는 안전량의 측정과 효과를 나타내는 용량 결정이라는 것을 동시에 해결해야 하므로 시험관내(in vitro) 실험에서 나온 실험 결과를 바탕으로 가능한 최소량을 시작점으로 잡아 단계별로 상승시키는 방법을 이용하였다. 이를 위해 용량 증가는 2배수 증가법을 채택하였으며, 50mg/kg로 시작할 경우 100, 200 mg/kg 등으로 증가시켰다.

중간대뇌동맥을 막아 허혈을 유발하기 20시간과 1시간 전에 각각 200 mg/kg의 조추출물 1㎖를 복강에 주사하여 투여하고, 2 시간동안 허혈상태로 방치한 후 봉합사를 제거하고 동물을 회복시켰다. 22시간 경과 후 실험동물을 안락사시켜 뇌조직을 적출하여 TTC 용액에 넣어 염색한 후, 손상정도를 영상분석 시스템으로 측정하여 뇌반구에 대한 손상부분의 비율을 계산하고 하기 수학식 1과 같은 방법으로 허혈지수(ischemic index)를 측정하여 약물의 효과를 비교하였다.

허혈지수(%)=A/B×100

A:뇌 반구(半球) 중 손상 부위의 부피(mm³ ),

B:뇌 반구의 전체 부피(mm³ ).

상기 실험을 수행한 결과, 조추출물을 주사하지 않은 랫트는 허혈지수가 93%인데 비해 주사한 랫트는 78%로, 괴사부위의 부피가 15%정도(p<0.05) 감소한 것으로 나타나서 눈개승마 조추출물이 뇌경색모델에서 상당한 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 4a, 도 4b, 도 4c 참조).

4-2. 에틸아세테이트 분획층이 뇌경색모델에 미치는 영향

상기 실험예 3에서 활성물질이 다량 함유된 것으로 확인된 에틸아세테이트 분획층을 상기 실험예 4-1과 동일한 방법으로 만든 뇌경색모델에 주입하여 괴사부위의 면적을 조사하였다.

10 mg/kg의 에틸아세테이트 분획층 1㎖을 중간대뇌동맥을 막아 허혈을 유발하기 20시간과 1시간 전에 각각 복강에 주사하여 투여하고, 1시간 30분 동안 허혈상태에 둔 후 재관류시켰다. 3시간 경과 후 TTC 염색을 시행하고 상기 실험예 4-1 과 동일한 방법으로 허혈지수(ischemic index)를 측정하였다.

상기 실험을 수행한 결과, 에틸아세테이트 분획층을 주사하지 않은 랫트는 허혈지수가 55%인데 비해 주사한 랫트는 24%에 불과하였다. 이는 괴사부위의 부피가 57%정도(p<0.05)나 감소한 것으로써, 눈개승마 에틸아세테이트 분획층이 뇌경색모델에서 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

실험예 5. 독성 실험

상기 실시예 1의 조추출물을 320±20g의 스프라그 다우리종(Spague-Dawley) 흰쥐 5마리에게 주입하여 변화를 관찰하였다.

500mg/kg의 눈개승마 조추출물을 복강으로 주사하여 24시간 후 몸무게를 측정하였더니 유의할 정도의 무게변화는 없었다. 또한 별다른 행동양상의 변화도 관찰되지 않았고 배를 절개해봤을 때 복수도 차지 않았다.

본 발명의 눈개승마 추출물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 비극성용매 가용추출물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 비극성용매 가용추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 조추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

상기 실시예 2의 눈개승마 조추출물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

상기 실시예 2의 눈개승마 조추출물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 조추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분 을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 조추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 눈개승마 추출물을 함유하는 조성물은 허혈상태에서 세포자살을 억제하여 조직의 경색부위를 감소시킬 뿐만 아니라, 장기간 복용해도 부작용이 없으므로 허혈성질환 및 퇴행성 뇌질환의 치료를 위한 의약 및 건강기능식품에 사용될 수 있다.

Claims (8)

1. 눈개승마 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌경색, 심근경색의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 삭제
3. 눈개승마 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 피크병 및 크로이츠펠트-야콥병임을 특징으로 하는 약학조성물.
5. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 추출물은 물, 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 조추출물 또는 에틸아세테이트 가용추출물인 약학조성물.
6. 눈개승마 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 뇌경색, 심근경색의 예방 및 개선용 건강기능식품.
7. 제 6항에 있어서, 정제, 환제, 캡슐제 또는 액제인 뇌경색, 심근경색의 예방 및 개선용 건강기능식품.
8. 제 6항에 있어서, 상기 추출물은 물, 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 조추출물 또는 에틸아세테이트 가용추출물인 뇌경색, 심근경색의 예방 및 개선용 건강기능식품.

Images