KR100905387B1 - 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 매자나무 유래 용매 추출물의 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 나타내는 매자나무 유래 용매 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 염증반응인자로서의 산화질소(nitric oxide, NO) 및 종양괴사인자(TNF)-α 와 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 생성을 억제하여 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어 염증면역반응에 의한 질환의 예방 및 치료에 유용한 한국의 특산종인 매자나무(Berberis koreana Palibin) 유래 용매 추출물에 관한 것이다.

항염증, 매자나무, 추출물, 대식세포, 산화질소, 전염증성 사이토카인, 귀부종

Description

항염증 및 면역조절 활성을 가지는 매자나무 유래 용매 추출물의 조성물 {Composition comprising solvent extract of Berberis koreana PALIBIN having anti-inflammatory and immuno-modulatory activity}

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 나타내는 우리나라의 특산종인 매자나무(Berberis koreana Palibin)의 용매 추출물에 관한 것으로서, 이는 염증반응인자로서의 종양괴사인자(TNF)-α 생성 억제, 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 생성을 억제하여 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어 면역염증반응 질환의 예방 및 치료 의약품 또는 이를 개선시키는데 유용한 기능성 식품 제공에 있다.

염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다. 정상인경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직 을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 반해 헴옥시게나아제-1 (HO-1)은 항산화제인 빌리베르딘(biliverdin)과 빌리루빈(bilirubin)을 생산해 염증을 억제하는 것으로 알려져 있다.

따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 표적이 되고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 몇 가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp387-396, 1995 : Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35 , pp27-28, 1996).

또한, 시클로옥시게나제도 2종류의 이소형태가 존재하는데, 시클로옥시게나제-1(cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증반응시 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Weisz A., Biochem. J., 316, pp209-215, 1996). NO와 PGs의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 결장암(colon cancer)을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.

TNF-α와 같은 다 기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다(Verhoef, J. et al., J. Antimicrob. Chemother., 35, 1996). 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화 시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다. 따라서, 발암촉진 단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현 을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE₂의 생성 억제를 통해 초기염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다.

세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇽(endotoxin shock)을 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우, 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다(Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am.,74, 1994 : Giroir, B. P., Crit. Care Med., 21, 1993 : Yamaguchi, Y. et al., J. Reticuloendothel. Soc., 409, 1982). 그러므로 약물 처리를 통하여 LPS의 작용을 줄임으로서 염증억제효과를 볼 수 있을 것이다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용을 한다. 그러므로 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자-α, 인터류킨-1, -2), 세포사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인(chemokines), 염증성 분자, 산화질소(NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE₂를 방출하고, 또한 당단백질(공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절 한다(Bresnihan, 1999; Burmester et al., 1997; Gracie et al., 1999).

그러나 이러한 대식세포들의 이점들은 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존한 다. 염증 매개물질에서 유래한 대식세포는 혈액 내에서 양이 많아져 패혈증(septic shock)이나 류머티즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병(Gracie et al., 1999; Michaelsson et al., 1995; Stuhlmuller et al., 2000)과 관련된 손상을 막을 수 있다. 그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐하는 것은 대식세포 기능 조절에 달려있다.

현재까지의 항염증 약물의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

한편, 매자나무(Berberis koreana Palibin)는 사람 키 만한 낙엽성 관목으로, 한국의 전통식물이다. 매자나무의 줄기는 황염목이라 하여 봄 또는 가을에 줄기만을 채취하여 가시를 제거한 다음 달여서 입가심을 하면 입이 헐었을 때 좋다고 알려져 있으며, 결막염 등에 탁월한 약효가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 이의 뿌리 껍질은 산후 출혈에 효과가 있으며, 이의 꽃 피우는 시기의 잎은 지혈, 자궁수축, 혈압강하 등의 작용이 있으며, 담낭에 질환이 있을 때, 통증 및 염증을 현저하게 줄이는 것으로 알려져 있다. 또한 이의 열매는 위의 염증이나, 입안의 염증, 폐렴 등에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

매자나무를 포함한 매자나무속 식물에는 매발톱나무(Berberis amurensis var. latifolia NAKAI), 매자나무(Berberis koreana PALIBIN), 노란매자나무(Berberis thunbergii DC.) 당매자나무(Berberis poiretii SCHNEID.) 등이 있으며, 주로 줄기와 잎을 주로 약재로 사용한다. 매자나무속 식물들은 알칼로이드 베르베린(berberine)을 다량 함유하고 있으며, 이외에 팔마틴(palmatine), 콜룸바민 (columbamine), 야트로리진(jatrorrhizine) 및 옥사칸틴(oxyacanthine)을 함유하고 있는 것으로 알려졌다.

매자나무속 식물에 대한 염증 관련 연구로, Berberis vulgaris의 베르베린(berberine) 성분이 T-세포 매개 면역반응에 관련된 것으로 보고하였고(Immunopharmacol. Immunotoxicol., 21(4), 771-786, 1999), Berberis crataegina의 뿌리와 껍질 추출물이 항염증과 진통효과가 있는 것으로 보고하였고(J. Ethnopharmacol., 79(2), 237-248, 2002), Berberis vulgaris의 에탄올 추출물이 만성염증 모델에서 효과가 있는 것으로 보고하였다(Int. J. Immunopharmacol., 18(10), 553-561, 1996). 또한 매자나무에 베르베린(berberine) 및 마그노플로린(magnoflorine) 등과 같은 알칼로이드를 함유되어 있으며, 산화적 손상에 의한 뇌질환의 보호작용이 있는 것으로 알려져 있다(Biol. Pharm. Bull., 29(4), 623-628, 2006).

상기와 같이, 현재까지 한국에서 자생하는 매자나무(Berberis koreana)에 관한 추출물과 이들에 대한 구체적인 약리작용의 과학적 연구는 크게 진행되어 있지 못한 실정이다.

이에 본 발명자들은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 천연물을 연구하던 중, 매자나무 유래 용매 추출물이 대식세포에서 면역반응을 조절하며 항염증 활성을 나타내며 안전성이 입증된 전통생약이므로 부작용이 없어 염증 질환을 치료하는데 효과적임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 매자나무 유래 용매 추출물이 대식세포에서 면역반응을 조절하며 항염증 활성이 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 매자나무 유래 용매 추출물 및 그 분획물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 매자나무 유래 용매 추출물의 종양괴사인자(TNF-α) 발현억제, 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 및 산화질소(NO)의 발현 및 억제활성을 제공하는 것으로서 이들과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 또는 기능성 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 매자나무 유래 용매 추출물 및 그 용매추출물의 분획물을 제공한다.

본 발명들은 매자나무 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 열수 또는 80% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명의 매자나무의 추출물은, 건조하여 분말화한 매자나무속 식물의 뿌리, 가지, 줄기부위를 그 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 10배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하 게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매로 20 내지 100℃의 추출 온도에서 약 1 시간 내지 2일, 바람직하게는 2 시간 내지 1일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 혼합하여 회전진공농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃에서 감압 농축하여 용매를 제거하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 비극성 용매 가용추출물은 상기 조추출물을 그 중량의 1 내지 20배에 현탁한 후 이들 현탁액의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 n-헥산을 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 n-헥산 가용성 분획부과 수가용성 분획부로 분리하고, 수가용성 분획부에 다시 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획부와 수가용성 분획부를 분리하고, 수가용성 분획에 다시 부탄올을 가하여 부탄올 가용성 분획부와 수가용성 분획부를 분리한 후 각의 용매 분획부를 회전 진공 농축기로 감압농축하여 용매를 제거하여 각각의 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 제조방법에 따라 얻어진 매자나무의 추출물, 비극성용매 가용추출물 또는 극성용매 가용추출물을 포함한다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 % 중량으로 포함한다. 본 발명의 매자나무의 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성 물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트 윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 매자나무속 식물 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다. 본 발명은 또한, 매자나무의 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 염증 관련 질환 예방 및 개선을 위한 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 매자나무속 식물의 추출물을 포함하는 조성물은 치매질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람 직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명자들은 매자나무의 다양한 용매추출물에 대한 전염증성 사이토카 인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 (PGE₂)의 발현 및 생성을 억제하고 아라키돈산으로 유도된 귀부종을 저해활성을 측정한 결과, 열수 추출물의 부탄올 분획물과 80% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 우수한 항염증 활성을 나타내었으며, 특히 열수 추출물의 부탄올 분획물이 가장 높은 염증 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명은 다음의 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

본 발명의 매자나무 추출물은 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 발현 및 생성을 유의적으로 억제하고 아라키돈산으로 유도된 귀부종을 동물모델에서 부종을 탁월히 억제시키는 항염효과를 확인함으로써, 효과적이고 안전한 관절염 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

매자나무속(Berberis genus) 식물의 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물을 실시예 1과 같은 방법으로 얻고, 매자나무(Berberis koreana)는 실시예 2와 같은 방법으로 각각 80% 에탄올 추출물과 열수추출물 및 이들 추출물의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 용매분획물을 얻었으며, 이들 추출물가 분획물을 실시예 7과 같은 방법으로 아라키돈산으로 유도된 생쥐 급성 귀부종 측정을 하였으며, 그 결과는 표1 과 표2 에 나타내었다.

표1 은 본 발명의 실시예 1의 매자나무속 식물들의 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물에 대한 생쥐 급성 귀부종 억제효과 결과로서 매자나무속 식물 중에서 매자나무(Berberis koreana)의 80% 에탄올 추출물(60% 억제율)과 열수 추출물(80% 억제율)에서 가장 강하고 우수한 생쥐의 귀부종 억제 효과를 보여주었다.

표2는 본 발명 실시예 2의 매자나무 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물 각각에 대한 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올, 물의 용매분획물에 대한 귀부종 억제효과로서 열수 추출물의 n-부탄올 분획물(90% 억제율)과 에틸아세테이트 분획물(70% 억제율)에서 가장 강하고 우수한 생쥐의 귀부종 억제효과를 보여주었다.

표1. 매자나무속 식물 추출물의 귀부종 억제 효과

매자나무속 식물	용매추출	생쥐 귀부종 억제율 (100 ㎎/㎏ 경구투여)
매발톱나무	80% 에탄올	51 %
	열수	45 %
매자나무	80% 에탄올	60 %
	열수	80 %
노란매자나무	80% 에탄올	45 %
	열수	40 %
당매자나무	80% 에탄올	43 %
	열수	39 %

표2. 매자나무 용매 추출물과 분획물의 귀부종 억제 효과

매자나무 용매 추출물	용매 분획물	생쥐 귀부종 억제율 (50 ㎎/㎏ 경구투여)
80% 에탄올 추출물	n-헥산 분획물	52 %
	에틸아세테이트 분획물	65 %
	n-부탄올 분획물	35 %
	물 분획물	48 %
열수 추출물	n-헥산 분획물	60 %
	에틸아세테이트 분획물	70 %
	n-부탄올 분획물	90 %
	물 분획물	45 %

<실험예 1: 매자나무 유래 용매 추출물의 세포 생존률 실험>

실시예2의 방법으로 매자나무 유래 용매 분획의 염증억제 반응이 세포독성에서 기인한 비특이적 반응에서 유도되는지를 확인하기 위해 세포생존율에 미치는 효과를 측정하였다. 도 1에서 확인할 수 있듯이 시험최고 농도인 400 μg/ml의 농도에서도 실시예 2의 매자나무 유래 용매 추출물은 세포독성을 유도하지 않은 것으로 확인되었다.

<실험예 2: 매자나무 유래 용매 추출물의 LPS 처리에 의해 유도된 산화질소(NO)의 생성억제 활성 실험>

본 발명에서는 매자나무 유래 용매 추출물을 가지고 LPS에 의해 활성화된 대식세포로부터 생성되어지는 산화질소 억제효과에 실험결과, 아질산 분석에 따르면 유래 각 용매 추출물 100 μg/ml에서 산화질소의 생성을 80% 이상 저해하는 것을 확인할 수 있었다(도 2A와 도 2B). 특히 매자나무 열수추출물의 n-부탄올 분획이 가장 우수하여, 84% 이상의 억제 효과를 나타내었다.

<실험예 3: 매자나무 유래 용매 추출물의 LPS 처리에 의해 유도된 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비억제 활성>

TNF-α, IL-1β 및 IL-6는 정상적인 방어응답과 셉틱 쇽, 류머티즘성 관절염, 자가면역질병과 같은 악성 염증성 면역질환과 연결된 다양한 생물학적 활성을 가지는 전염증성 사이토카인으로 알려져 있다. 도 3A와 B에서 알 수 있듯이, 실시예 2에서 제조한 매자나무 유래 용매 추출물들(100 μg/ml까지)은 RAW264.7 세포에 서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성을 약 50% 이상 억제하였으며, 특히 매자나무 열수추출물의 n-부탄올 분획은 95% 이상의 우수한 억제 효과를 나타내는 것을 관찰할 수 있었다. 표준약물로 알려진 펜톡시필린(비선택적 포스포다이에스테라제 저해제) 및 프레드니솔론(스테로이드 화합물)은 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 생성을 현저하게 저해시키며 U0126 및 Bay11-7082 또한 IL-1β, IL-6, IL-12의 생성을 현저하게 억제하였다.

<실험예 4: 매자나무 유래 용매 추출물의 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성 저해 활성>

본 발명에서는 많은 다른 악성 및 만성 염증질환에서 잘 알려진 전염증성 중재자인 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 생성에 있어 매자나무 유래 용매 추출물의 저해활성을 측정한 결과, 매자나무 유래 용매 추출물들(25 μg/ml)이 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 생성을 약 40% 이상 억제하였으며, 특히 매자나무 열수추출물의 n-부탄올 분획은 약 91%의 우수한 억제 효과를 나타내는 것을 관찰할 수 있었다(도 4B, 4C).

<실험예 5: 매자나무 유래 용매 추출물의 아라키돈산 유도에 의한 생쥐 귀부종 생성 저해 활성>

아라키돈산은 PGE₂ 생성을 유도하는 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2)의 활성을 증가하여 in vivo에서 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 도 5A에서 알 수 있듯이, 경구투여된 매자나무 유래 용매 추출물 (50 부터 100 μg/ml)은 아라키돈산에 의해 급성적으로 생쥐에 유도된 귀 부종을 매자나무 80% 에탄올 추출 물은 60% 정도 저해하였으나, 매자나무 열수 추출물은 최대 80%까지 저해하는 우수한 효과를 확인할 수 있었다. 도 5B에서 볼 수 있듯이 열수 추출물의 각 용매추출물 (50 mg/kg) 중에서도 n-부탄올 분획이 가장 우수한 효과인 귀부종 90% 억제를 보여주었다.

<실험예 6. 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험>

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 다음과 같이 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 희첨 추출물(SP)을 용해시켜 1 g/kg/㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 추출물을 투여한 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명에 따른 희첨 추출물은 모든 랫트에서 5,000 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소 치사량(LD50값)은 5,000 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 매자나무 유래 용매 추출물은 다양한 전염증성 사이토카인의 활성화, 생성 및 발현을 억제하여 항염증 활성을 나타내므로 염증질환, 염증반응과 관련된 동맥경화 및 이로 인한 순환기 질환의 예방 및 치료용도의 의약품 또는 식품첨가제로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

<실시예 1> 매자나무속 식물 추출물의 제조방법

매자나무속 식물(매발톱나무, 매자나무, 노란매자나무, 당매자나무)의 뿌리, 줄기, 가지를 건조하고 분쇄한 매자나무속 식물 175 g을 각각 80℃에서 80% 에탄올 1.5L로 3회 추출하고, 얻은 추출액은 회전식 감압증발기를 이용하여 농축한 다음 동결건조하여 80% 에탄올 추출물을 얻었다. 또한 매자나무속 식물 175 g을 95℃도로 가온된 열수 1.5L에서 6시간동안 가열하여 열수 추출물을 각각 얻었다.

<실시예 2> 매자나무 추출물의 제조방법

매자나무(Berberis koreana Palibin)의 뿌리, 줄기, 가지를 건조하고 분쇄한 매자나무 175 g을 각각 80℃에서 80% 에탄올 1.5L로 3회 추출하고, 얻은 추출액은 회전식 감압증발기를 이용하여 농축한 다음 동결건조하여 추출물 (80% EtOH) 65 g을 얻었다. 상기 추출물에 물 500 mL을 넣고 현탁시킨 후 n-헥산 500 mL를 가하여 n-헥산층을 분리한 다음 이를 반복하여 얻은 n-헥산층을 농축하여 n-헥산 분획물 5.8 g을 얻었다. 남은 수용액 층에 연이어 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 n-부탄올을 상기한 바와 같은 동일한 방법으로 분획한 후 농축하여 에틸아세테이트 분획물 8.1 g, 부탄올 분획물 23.3 g, 물 분획물 32.0 g을 각각 얻었다. 또한 매자나무 175 g을 95℃도로 가온된 열수 1.5L에서 6시간동안 가열하여 열수추출물 (Hot Water:이하 HW) 분획(28 g)을 얻어 농축하고 이를 다시 상기와 같은 용매를 이용하여 연속분획화하여 n-헥산분획물 2g, 에틸아세테이트 분획물 3.1 g, n-부탄올 분획물 6.3 g, 물 분획물 16.0 g을 각각 얻었다.

<실시예 3> 매자나무 추출물의 MTT 분석을 통한 세포독성 실험

매자나무 유래 용매 추출물의 세포독성 실험은 MTT 분석법으로 측정하였다. 세포독성 실험 배양액은 배양실험 종료 3시간 전에 MTT 용액 (인산완충용액-살린 속에 10 mg/ml, pH 7.4) 10 μl을 첨가하고, 세포는 반응 종료까지 계속 배양시켰다. 배양은 포르마잔의 용해성을 증가시키기 위해 15% 소듐 도데실 설페이트를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 570 nm에서 광학 밀도(OD)는 스펙트라맥스 250 마이크로플레이트 리더 (Spectramax 250 microplate reader)를 사용하여 측정하였다.

<실시예 4> 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성 측정

96-웰 플래이트에서 대식세포 RAW264.7 (1×10⁶ cells/ml)에 10% FBS, 페니실린(100 unit/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100㎍/㎖)가 포함된 RPMI 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소의 환경에서 배양하였으며, 각각의 용매 분획물(400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 0 μg/ml)을 30 분간 전처리한 후, LPS (1 μg/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포 배지 100㎕를 그리에스 시약(5%(v/v), 인산 및 0.1% (w/v) 나프틸에틸렌디아민-염산에 용해된 동량의 1% (w/v) 설파닐아미드) 100㎕에 혼합한 후, 실온에서 10분 동안 배양하였으며, 그 후 마이크로 플레이트 리더(Power Wave 340, Bio-Tek, 미국)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 신선한 배지는 모든 실험에서 무처리군으로 사용하였다. 시료에서의 산화질소의 양은 배지에서 준비된 소듐 니트라이트(sodium nitrite) 표준 곡선으로부터 계산되었다.

<실시예 5> TNF-α, IL-6 과 IL-1β의 생성 또는 발현측정

매자나무 유래 용매 추출물은 DMSO를 이용해 100 mg/ml를 만들어, 희석하여 RAW264.7 세포에 전처리한 후, LPS를 6 시간 처리하고 얻어낸 상층액으로 부터 RAW264.7 세포에서 생성되는 TNF-α, IL-6와 IL-1β의 생성량에 있어 매자나무 유래 용매 추출물의 억제효과에 대해서는 ELISA 방법(Endogen, Cambridge, MA)으로 측정하였다.

<실시예 6> 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 생성 측정

대식세포 RAW264.7 세포(1×10⁶ cells/ml)에 매자나무 유래 용매 추출물 희석액을 전처리한 후, LPS (1 μg/ml)를 무처리하거나 처리하여 24시간 동안 배양시켰다. 그런 다음 배양액을 원심분리하여 상등액을 분리하고 상등액의 프로스타글란딘 E₂의 생성을 ELISA 방법(Endogen, Cambridge, MA)으로 측정하였다.

<실시예 7> 아라키돈산으로 유도된 생쥐 급성 귀부종 측정

숫컷 BALB/c 생쥐 (25 g정도)에 일주일간 0.5% sodium CMC로 현탁된 열수 및 80% 에탄올 추출물과 열수추출물로부터 확보된 용매분획 (50 혹은 100 mg/kg)을 존데를 이용하여 일주일간 오전 10시에 경구투여하였다. 최종 7일째 경구투여 후 2%로 조제된 아라키돈산 용액을 오른쪽 귀에 바른 다음 4시간 후에 유발된 귀 부종을 측정기 (dial thickness gauge)를 이용하여 확인하였다.

<실시예 8> 약제의 제조예

8-1. 산제의 제조

실시예 2의 매자나무의 열수추출물의 부탄올 분획물 ........... 300 mg

유당 ...................................................... 100 mg

탈크 ....................................................... 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

8-2. 정제의 제조

실시예 2의 매자나무의 열수추출물의 부탄올 분획물 ........... 300 mg

옥수수전분 ................................................. 100 mg

유당 ...................................................... 100 mg

스테아린산 마그네슘 ......................................... 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

8-3. 캅셀제의 제조

실시예 2의 매자나무의 열수추출물의 부탄올 분획물 .......... 300 mg

옥수수전분 ................................................ 100 mg

유당 ...................................................... 100 mg

스테아린산마그네슘 ........................................ 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

8-4. 주사제의 제조

실시예 2의 매자나무의 열수추출물의 부탄올 분획물 ........... 300 mg

주사용 멸균 증류수.......................................... 적량

pH 조절제 .................................................. 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

8-5. 액제의 제조

실시예 2의 매자나무의 열수추출물의 부탄올 분획물 ........... 1 g

이성화당 .................................................... 10 g

만니톨 ..................................................... 5 g

정제수 ...................................................... 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬행을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

<실시예 9> 건강식품의 제조예

9-1. 건강 식품의 제조

실시예 2의 매자나무의 열수추출물의 부탄올 분획물 .......... 1000 ㎎

비타민 혼합물............................................... 적량

비타민 A 아세테이트 ....................................... 70 ㎍

비타민 E .................................................. 1.0 ㎎

비타민 B1 ................................................. 0.13 ㎎

비타민 B2 .................................................. 0.15 ㎎

비타민 B6 ................................................. 0.5 ㎎

비타민 B12 ................................................ 0.2 ㎍

비타민 C .................................................. 10 ㎎

비오틴 ..................................................... 10 ㎍

니코틴산아미드 ............................................. 1.7 ㎎

엽산........................................................ 50 ㎍

판토텐산 칼슘 .............................................. 0.5 ㎎

무기질 혼합물 .............................................. 적량

황산제1철................................................... 1.75 ㎎

산화아연.................................................... 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ............................................... 25.3 ㎎

제1인산칼륨................................................. 15 ㎎

제2인산칼슘................................................. 55 ㎎

구연산칼륨.................................................. 90 ㎎

탄산칼슘 ................................................... 100 ㎎

염화마그네슘 ............................................... 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제제예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

9-2. 건강 음료의 제조

실시예 2의 매자나무의 열수추출물의 부탄올 분획물 ......... 1000 ㎎

구연산 .................................................... 100 ㎎

올리고당 .................................................. 100 g

매실농축액 ................................................ 2 g

타우린 .................................................... 1 g

정제수를 가하여 전체 ..................................... 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 제제예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 매자나무 유래 용매 추출물의 세포독성을 확인하기 위한 MTT 분석 결과이다.

도 2는 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 산화질소의 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 3은 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 전염증성 사이토카인의 발현 및 생성에 있어 매자나무 유래 용매 추출물의 효과를 나타낸 것이다.

도 4는 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 생성에 있어 매자나무 추출물의 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 숫컷 BALB/c 생쥐에 일주일간 50 혹은 100 mg/kg로 각 시험물질을 경구투여한 후 급성 염증유발 물질인 아라키돈산을 귀에 처리하고 발생된 귀부종 정도를 나타낸 것이다.

Claims (12)

1. 매자나무(Berberis koreana PALIBIN)를 2~10배 중량비율의 20~100℃ 물로 추출하여 수득되는 농축물에 매자나무 사용량의 2~4배 중량비율의 물로 현탁시킨 후, 상기 현탁액을 매자나무 사용량의 2~4배 중량비율의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올의 순서로 분획 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 매자나무 20~100 ℃ 물 추출물의 부탄올 분획물.
2. 삭제
3. 제 1 항에 따른 매자나무 20~100℃ 물 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역조절의 치료용 약학조성물.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 염증성 질환은 관절염, 패혈증, 염증 또는 자가면역질환 예방 및 치료용 약학조성물.
5. 삭제
6. 제 3 항에 있어서,

   상기 약학조성물은 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 대식세포(RAW264.7)에서 염증발생 인자의 활성화, 발현, 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
7. 제 3 항에 있어서,

   상기 약학조성물은 산화질소(NO)의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
8. 제 3 항에 있어서,

   상기 약학조성물은 IL-6, IL-1β 또는 TNF-α에서 선택되는 전염증성 사이토카인의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
9. 제 3 항에 있어서,

   상기 약학조성물은 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
10. 제 1 항에 따른 매자나무 20~100℃ 물 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
11. 삭제
12. 제 10 항에 있어서,

    상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림을 포함한 낙농제품, 스프, 이온음료 등을 포함한 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제를 포함한 영양 공급용 제품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.

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