JP4672776B2 - マンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストックメセンテロイデス及びそれを利用したキムチの製造方法 - Google Patents
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Description
従って、最近ではキムチから由来する乳酸菌を分離し、キムチ製造の際スターター(starter)として添加することにより、キムチの味と発酵の調節を試みる研究等が多く進められている。特に、ロイコノストック メセンテロイデスを利用してキムチの品質を向上させようとする研究が継続して進められている。大韓民国登録特許第1989-4894号に次亜塩素酸ナトリウムとロイコノストック メセンテロイデスを添加して酸敗が抑制され、保存性が延長されたキムチを製造する方法が開示された。さらに、大韓民国登録特許第0181009号にロイコノストック パラメセンテロイデスとロイコノストック メセンテロイデスを混合添加することにより、味が良くなるばかりでなくラクトバチルス属菌株の生育を抑制して酸敗が遅延されるようにしたキムチの製造方法が開示された。しかしながら、ロイコノストック メセンテロイデスは耐酸性が弱いことからキムチの発酵が漸次進行されながらその数が減少され、キムチの新鮮な味を持続的に維持することができないという問題点がある。
これにより、キムチの淡泊でサッパリした味を長く維持させ得る乳酸菌スターターに対する開発が切実に要望されている実情である。
さらに、本発明は前記菌株又はその培養液を含む食品添加用組成物を提供する。
さらには、本発明は前記菌株又はその培養液を添加することを特徴とするキムチの製造方法を提供する。
本発明はマンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を提供する点に特徴がある。
本発明ではキムチの味が最も良い時、生育される耐酸性が優れた乳酸菌を分離し、前記分離された乳酸菌を果糖が添加された培地で自然改良し、耐酸性と共にマンニトール生成能が優れた新菌株を得た。前記菌株を同定した結果、ロイコノストック メセンテロイデスに属することを確認することができた。前記菌株をロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と命名し、前記菌株をブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学院生物資源センター遺伝子銀行(Korean Collection for Type Culture)(大韓民国大田市儒城区魚恩洞52番地韓国生命工学研究院)に2005年12月14日付で寄託番号KCTC 10882BPで寄託した。前記寄託物は登録特許(issued patent)の全期間中韓国生命工学院生物資源センター遺伝子銀行で生きている状態で維持され、寄託物管理法の規定により無制限で非商業的用途の為全ての人(any person or entity)が入手できる。
さらに、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は優れたマンニトール生成能を有する(表1参照)。特に本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は、従来マンニトール生成能が優れているとして知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291(N.V. Weymarn, M. Hujanen, M. Leisola,Process Biochemistry, 37, 1207-1213, 2002)に比べて、糖含有培地で30%程度高めのマンニトール生成能を示す(図1参照)。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみ、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
耐酸性及びマンニトール生成が優れた乳酸菌の製造
〈1-1〉乳酸菌分離キムチ試料の製造及びそれより乳酸菌の分離
通常的なキムチの製造方法により製造された多種類のキムチ等を対象に、官能評価を実施して最も味の良いものとして評価されるキムチを選択した。前記キムチを-1℃の低温で熟成させながら官能評価を実施し、最も風味の優れた時点のキムチを乳酸菌分離キムチ試料として用いた。前記キムチ試料を0.85%食塩水で10倍希釈し、0.1mlずつPESアガ培地(Phenylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, Phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L)のプレートに接種後ガラス棒で塗抹した。以後、プレートを25℃の恒温培養器で1日間培養した。生成されたそれぞれのコロニーをPESアガプレートに画線接種(streakinoculated)し、25℃で1日間培養して乳酸菌コロニー等を分離した。
前記実施例〈1-1〉で分離された乳酸菌コロニー等を、乳酸(lactic acid)でpH3.0、3.5、4.0、5.0にそれぞれ調整したMRSブロス(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 20g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L)5mlにそれぞれ接種した。25℃で72時間培養しながら生育有無を観察して前記pH範囲でも最も生育が活発な耐酸性菌株を選別した。選別された耐酸性乳酸菌はpH3.5-5.0で生育が活発で耐酸性が強いものとして示された。
前記実施例〈1-2〉で選別された耐酸性乳酸菌をマンニトール生成量の優れた菌株に改良する為、前記乳酸菌をMRSブロス5mlに2回に亙り継代培養した。以後、前記乳酸菌を果糖が1-9%(w/v)までそれぞれ添加された栄養培地(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g〜90g/D.W. 1L)5mlに1.0%(v/v)で接種して25℃で24時間培養した。以後、生成されたマンニトールの量を測定してマンニトールが多く生成された順に1-5位までの菌株を選別した。選別された5種の菌株をさらに1-9%(w/v)の果糖が添加された培地にそれぞれ再接種して再度マンニトールの生成量を測定した。マンニトール生成量の測定は次のような方法で行った:各培養液を13,000rpm, 3分間遠心分離し、0.22μmシリンジフィルター(syringe filter)で濾過した。80℃で超純粋 H2O(0.5ml/min)溶媒を用いて濾過された試料20μlをHPLC(High performance liquid chromatography)で分析した。
その内でマンニトール生成量が多い1〜3位までの菌株を再選別し、これらを再度1-9%(w/v)の果糖が添加された培地に2次再接種してマンニトールの生成量を測定した。その内6%(w/v)の果糖が添加された培地で、マンニトール生成量が最も高く維持されるものとして示された。従って、6%(w/v)の果糖が添加された培地で、前記菌株等を10回にわたり継代培養し、この内マンニトール生成量が最も優れた1種の菌株を最終選抜した(表1参照)。
前記実施例1で分離及び改良した乳酸菌の同定
〈2-1〉バージスの分類細菌学マニュアルによる分析
前記実施例1で最終選抜された乳酸菌(改良菌株2)を単一コロニーに分離し、バージスの分類細菌学マニュアル(Bergy’s manual of systematic bacteriology)に準じて形態学的及び生化学的特性を調査してグラム染色を行った。その結果、前記分離された菌株はグラム陽性菌株であり、桿菌の形態を有していることが確認できた。
前記菌株をAPIシステム(API system; La Balme-les-Grottes, France)で同定した。先ず、滅菌白金で菌コロニーを採り、滅菌蒸留水2mlに浮遊させた。さらに、前記菌液を滅菌蒸留水5mlにAPI 50CHキット(BioMerieux, France)より提供されるマックファランド標準溶液No.2(MccFaland Standard Solution No.2)の濃度で菌液を浮遊させた。前記浮遊液をAPI 50CHキットの液体培地に添加して均質化させ、API 50CHキットの50個各チューブに200μlずつ接種した。ミネラルオイルでチューブの上を覆った後、30℃で48時間培養させた。前記培養液をAPIシステムで分析して49種の炭水化物発酵パターンを確認し、その結果をATB同定コンピュータシステムに入力して同定した。その結果、前記実施例1で分離及び改良した乳酸菌は、下記表2の炭水化物発酵パターンを有しているロイコノストック メセンテロイデスに属する菌株であることが判明された。
当業界に公知された通常的な方法により、前記選別された乳酸菌の16S rDNAの塩基配列を分析した。その結果、前記乳酸菌の16S rDNA塩基配列はロイコノストック メセンテロイデスの16S rDNA塩基配列と99%同一であることが確認できた(結果未図示)。
従って、本発明者等は前記乳酸菌を“ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512”と命名し、これを韓国生命工学研究院生物資源センター遺伝子銀行に2005年12月14日付で寄託した(寄託番号:KCTC 10882BP)。
本発明の乳酸菌と従来乳酸菌との耐酸性程度比較
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌との耐酸性程度を比較した。従来乳酸菌(対照群)には、ロイコノストック メセンテロイデス(KCCM-11325)とロイコノストック属菌株(KFCC-10774)を用いた。
各乳酸菌を乳酸でpH3.2、3.5、4.0、5.0に調整したMRSブロス10mlにそれぞれ接種し、25℃で72時間培養しながら生育有無を観察した。その結果を下記表3に示した。
本発明の乳酸菌と従来乳酸菌とのマンニトール生成量比較
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌とのマンニトール生成量を比較した。従来乳酸菌(対照群)ではマンニトール生成能が優れていると知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291と、キムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス CH-3及びOH-20を用いた。前記乳酸菌等を2%(w/v)果糖が添加された栄養培地(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g〜90g/D.W. IL)5mlに1.0%(v/v)で接種して10℃で5〜10日間培養した。以後前記実施例〈1-3〉に記載された方法と同一な方法で培養液内マンニトール生成量を測定した。
その結果、図1に示された通り、本発明の乳酸菌は従来のキムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス菌株等(CH-3及びOH-20)に比べて著しく高い水準でマンニトールを生成した。さらに、本発明の乳酸菌は従来のマンニトール生成能が優れていると知られた、ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291に比べてもさらに高い水準でマンニトールを生成した。
ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を利用したキムチの製造及び製造されたキムチの特性分析
先ず、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512をMRSブロス5mlに接種し、25℃で24時間1次前培養を行った。以降、前記1次前培養を白菜汁に1.0%(v/v)接種し、25℃で24時間2次前培養を行った。この際前記白菜汁は下記のような方法で製造した:塩漬け白菜をブレンダーで粉砕、搾汁後再製塩を用いて塩度が2.5%になるように調整した。ここにブドウ糖を1.0%(w/v)添加後、滅菌して白菜汁を製造した。以後、前記2次前培養液を再度滅菌された白菜汁に1.0%接種し、25℃で18時間本培養をした。
先ず、白菜を塩漬けして白菜の塩度が2.3%となるようにした。塩漬け白菜(82.5重量%)に唐辛子粉(2.5重量%)、ニンニク(2重量%)、生姜(0.5重量%)、太葱(2重量%)、千切り大根(9重量%)、砂糖(0.5重量%)のキムチ薬味を混合した。以後、スターターとして前記実施例〈5-1〉で製造した本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液をキムチ全体の重量に対して1.0%(w/w)で添加した。この際、陽性対照群としてはマンニトール生成能が、優れているとして知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291(陽性対照群1)、さらに、従来キムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス CH-3(陽性対照群2)とロイコノストック メセンテロイデス OH-3(陽性対照群3)をそれぞれ用いた。さらに、陰性対照群には乳酸菌スターターを添加せずに同一な方法で製造したキムチを用いた。以後、製造された各キムチをキムチの一般的な熟成温度である10℃で貯蔵しながら酸度、乳酸菌数及びマンニトール生成量を測定して官能評価を実施した。
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチを対象に酸度を測定して比較した。各キムチ100gを磨砕し、ガーゼで濾過してキムチ液を製造した。キムチ液20mlを0.1N NaOHを用いてpH8.1となるように中和滴定後、消費されたNaOHの量を下記の式により乳酸含量(%)で換算して酸度を求めた。
酸度(%)={0.00908×F(0.1N NaOH factor)×0.1N NaOH 添加量}/試料の重さ
その結果、図2に示した通り、熟成初期には各キムチの酸度の差がさほど大きくはなかったものの、熟成期間が長引く程酸度の差が開いた。本発明に伴う乳酸菌を利用して製造されたキムチの場合、酸度増加速度が異なるキムチに比べて緩慢であることが見られた。さらに、本発明の乳酸菌が添加された熟成20日以降にもキムチの適正熟成度(酸度0.4-0.8%)を維持した。反面、他の乳酸菌が添加されたキムチ等は全て熟成20日目に酸度0.8%を超過し、25日目には酸度がさらに増加するものとして示された。マンニトール生成能が優れたものとして知られた、従来のロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を利用して製造されたキムチの場合(陽性対照群1)には初期酸度は最も低かったものの、5日目以降には急上昇して20日目には適正熟成度を外れた。
前記実施例〈5-2〉で製造された各キムチの乳酸菌数を測定した。10℃で10日間熟成させた各キムチを0.85%食塩水で10倍に希釈してキムチ希釈液を製造した。以降、総乳酸菌数の測定の為には、前記キムチ希釈液0.1mlずつをMRSアガ培地プレートに接種後ガラス棒で塗抹した。さらに、ロイコノストック菌数の測定の為には前記キムチ希釈液0.1mlずつPESアガ培地(tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L)プレートに接種した後、ガラス棒で塗抹した。キムチ希釈液が塗抹された各アガプレートを25℃の恒温培養器で2日間培養した。生成された集落の数をそれぞれの菌数で計数した。さらに、優占率(%)は総乳酸菌菌数の内乳酸菌スターター(PESアガプレートに表れるロイコノストック属菌株の内、乳酸菌スターターと形態学的タイプが一致する菌)の菌数の比率で計算した
(下記式参照)。その結果を下記表4に示した。
優占率(%)=(乳酸菌スターターと形態学的タイプが一致するロイコノストック属菌株の数/総乳酸菌数)×100
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチを対象にマンニトール含量を測定して比較した。前記実施例〈5-2〉に記載された方法と同一な方法で各キムチからキムチ液を製造し、これを13,000rpmで3分間遠心分離し、0.22μmシリンジフィルター(syringe filter)で濾過した。80℃で超純粋 H2O(0.5ml/min)溶媒を用いて濾過された試料20μlをHPLC(High performance liquid chromatography)で分析した。
その結果、図3に示した通り、本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を利用して製造されたキムチのマンニトール含量が最も高く、これは熟成時間の経過に伴い増加するものとして表れた。本発明の菌株を利用して製造されたキムチは従来マンニトール生成能が優れているとして知られた、ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を利用して製造されたキムチ(陽性対照群1)よりもさらに高いマンニトール含量を示した。
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチ(酸度0.6-0.7%)に対して訓練された検査要員50名により官能検査を行った。5点を満点に嗜好度尺度法により実施し、有意性検証はt-testにより実施した。その結果を下記表5に示した。
Claims (4)
- キムチより分離されたpH3.5-5.0で耐酸性を有し、マンニトール生成能が優れたロイコノストック メセンテロイデス DRC0512(Leuconostoc mesenteroides DRC0512)(寄託番号:KCTC 10882BP)。
- 請求項1に記載のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液を含有することを特徴とする食品添加用組成物。
- 請求項1に記載のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液を添加することを特徴とするキムチの製造方法。
- 前記ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液をキムチ製造の際、キムチ全体の重量に対して0.5-3重量%で添加することを特徴とする請求項3に記載のキムチの製造方法。
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