CN109679885B - 一株增加酱油中3-羟基-2-丁酮含量的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一株植物乳杆菌ZF611,该菌株够在酱油和/或酱发酵阶段明显提高发酵产物中3‑羟基‑2‑丁酮的含量,从而增加酱油和/或酱的香气,提高酱油和/或酱的风味和口感。本发明提供的植物乳杆菌ZF611,具有能提高3‑羟基‑2‑丁酮含量的优点,并且添加后不影响酱油和/或酱中其它成分的特点,无需后期调配,即保留了酱油和/或酱浓郁和风味,又无安全风险,为酱油和/或酱的酿造提供香气四溢、风味鲜甜、滋味醇厚香的原油。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域,尤其涉及一株适用于酱油、酱等生产中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),本发明还涉及所述植物乳杆菌在酱油、酱等调味品生产中的应用。
背景技术
酱油是一种经过多种微生物持续发酵后的产品。酱油营养丰富,含有大量的氨基酸、糖和盐份。在微生物发酵过程中,微生物不仅产生营养物质,同时也会代射产生一些香气物质,如3-羟基-2-丁酮。3-羟基-2-丁酮又名乙偶姻,分子式:C4H8O2,分子量:88.11,外观:淡黄色,密度:0.983g/cm3,具有奶香和脂类香气,主要用于奶油、乳品、酸奶和草莓香型香精,同时是酒类行业、制药行业、烟草行业以及化工行业中一个极其重要的香料。近年来,国内外已进行有发酵法生产3-羟基-2-丁酮。与化学生成相比,发酵产生的3-羟基-2-丁酮产品,其安全性更易为人们所接受。
植物乳杆菌是乳杆菌属(Lactobacillus)中较为广泛分布的成员,通常能够在许多发酵食品中被发现。目前对于植物乳杆菌对酱油中3-羟基-2-丁酮的含量提升未见报道。国内一些发明专利/专利申请报道了一些其它菌株能够产生3-羟基-2-丁酮。例如中国发明专利ZL201310289934.7(一株产3-羟基丁酮的芽孢杆菌及其应用)公开了一株可以产3-羟基-2-丁酮的芽孢杆菌,有效提高15至20%的3-羟基丁酮产量,但该发明并非针对酱油风味的提升,不一定能够在酱油发酵中直接应用。中国发明专利ZL201510468138.9(一种提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3丁二醇的工艺方法)公开了一株解淀粉芽孢杆菌可以产3-羟基-2-丁酮,改善酒的风味,提高酒的质量。中国发明专利ZL201310342414.8(一种微生物发酵选择性生产3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的方法)公开了一株解淀粉芽孢杆菌通过发酵玉米浆选择性生产3-羟基-2-丁酮。
但是,在现有技术中没有一株能够在酱油生产中直接应用来提高酱油发酵阶段发酵产物中3-羟基-2-丁酮含量的安全菌,从而能够安全可靠地提高酱油的风味品质。
发明内容
本发明提供一株植物乳杆菌ZF611,能够在酱油和/或酱发酵阶段明显提高发酵产物中3-羟基-2-丁酮的含量,从而增加酱油和/或酱的香气,提高酱油和/或酱的风味和口感。
本发明提供以下植物乳杆菌:
1、本发明提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF611,该菌株于2018年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:60455,保藏地址:广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮政编码:510075。
2、本发明的植物乳杆菌ZF611的菌落特征如下:固体MRS平板培养基培养48h,菌落直径达3至5mm,菌落呈现乳白色、菌落凸起、呈圆形,表面光滑,菌落边缘整齐。
3、本发明植物乳杆菌ZF611是从酱醪中分离筛选获得。具体地,本发明所述的植物乳杆菌的筛选方法及发酵制剂制备过程如下:
3.1初步筛选乳酸菌:从天然酱醪中分离筛选乳酸菌:将酱醪加入无菌水中,稀释浓度为105至106,将不同稀释浓度的酱油稀释液,均匀涂布在固体MRS培养基上(含15%至18%食盐),放入培养箱中30℃至37℃培养24至48h后,在固体MRS培养基上挑选具有植物乳杆菌典型菌落形态的乳酸菌,菌落呈现乳白色、菌落凸起、呈圆形,表面光滑,菌落边缘整齐单菌落,接入含盐15%至18%的MRS液体培养基中,37℃培养。在酱油发酵中期接入,按照传统高盐稀态发酵工艺放入28℃静置培养进行发酵。发酵至55天时,从各罐中取样进行常规的总酸和氨基氮指标检测以及按轻工行业标准QB/T4234-2011方法,检测酱油中3-羟基-2-丁酮含量,选出产3-羟基-2-丁酮含量高的乳酸菌进行复筛。
3.2复筛乳酸菌:将获得的乳酸菌培养至对数生长期,在酱油发酵的中期,在各发酵罐中分别接种获得的各种乳酸菌,接种量为104至108cfu/ml。发酵结束后,放入28℃至37℃静置培养50-55天后过滤得头油。通过专业鉴评师进行感官评价确定最佳乳酸菌及其添加量。
3.3生产应用:按照常规酱油生产,在发酵酱油中期,接入104至108cfu/ml的植物乳杆菌,发酵结束后,检测酱油中3-羟基-2-丁酮含量及酱油的感官质量。
固体MRS培养基的配方为:称取180g氯化钠,10g蛋白胨,5g牛肉膏粉,4g酵母膏粉,20g葡萄糖,1mL吐温-80,磷酸氢二钾2g,乙酸钠5g,柠檬酸三铵2g,硫酸镁0.2g,硫酸锰0.05g,琼脂15g,溶于1000mL蒸馏水中,调节pH至6.2,分装,0.1Mpa、115℃灭菌15min。
液体MRS培养基的配方为:不添加琼脂的固体MRS培养基配方。
因此,在一方面,本发明提供植物乳杆菌ZF611,其于2018年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏地址:广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮政编码:510075,保藏号为GDMCC No:60455。
在另一方面,本发明提供所述植物乳杆菌ZF611在食品发酵中的用途。在一个实施方案中,食品发酵为酱油和/或酱发酵。
在又一方面,本发明提供所述植物乳杆菌ZF611在酱油和/或酱发酵中的用途。在一个实施方案中,所述植物乳杆菌ZF611用于在酱油和/或酱发酵中期接入。
在另一方面,本发明提供所述植物乳杆菌ZF611在制备酱油和/或酱中的用途。
在又一方面,本发明提供所述植物乳杆菌ZF611在制备发酵剂中的用途。
在另一方面,本发明提供组合物,其包含本发明所述的植物乳杆菌ZF611。
在又一方面,本发明提供组合物,其包含本发明所述的植物乳杆菌ZF611,其为发酵剂。
在另一方面,本发明提供组合物,其包含本发明所述的植物乳杆菌ZF611,其用于制备酱油和/或酱。
本发明的创新之处在于:
1、本发明提供一株保藏号为GDMCC No:60455的植物乳杆菌ZF611及其筛选方法和在酱油和/或酱等调味品生产中的应用。
2、本发明的植物乳杆菌具有在发酵酱油和/或酱过程中产生较高浓度3-羟基-2-丁酮的特征,具有提高发酵酱油和/或酱的香气以及口感的特征。
本发明具有以下技术优势和积极效果:
1、本发明提供的植物乳杆菌ZF611菌株的筛选方法具有普适性,可以广泛应用于提高酱油和/或酱的风味物质含量的菌种筛选。
2、本发明提供的植物乳杆菌ZF611,具有能够提高3-羟基-2-丁酮含量的优点,并且添加后不影响酱油和/或酱中其它成分的特点,无需后期调配,既保留了酱油和/或酱浓郁和风味,又无安全风险,能够为酱油和/或酱的酿造提供香气四溢、风味鲜甜、滋味醇厚的原油。
附图说明
图1是本发明的菌株在固体MRS培养基上的菌落形态。
图2是本发明的菌株在显微镜下形态。
图3是本发明的技术路线图。
生物保藏信息
一株植物乳杆菌ZF611,其分类学名称为Lactobacillus plantarum,该菌株于2018年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:60455,保藏地址:广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮政编码:510075。
具体实施方式
为了促进对本发明的理解,以下将参考某些实施方式,并且将使用特定语言来描述本发明。然而,应当理解的是,这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改,以及本发明的任何进一步应用,均为本领域技术人员通常会想到的。
下述实施例中所述试验方法,如无特别说明,均为常规方法;所述试剂和生物材料,如无特别说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中,所述百分含量如无特别说明,均为质量百分含量。
下述实施例对本发明的具体实施做进一步说明,但并不仅限于此实施例。
实施例1
1、原材料的处理
取传统工艺条件下发酵的酱醪,加入生理盐水稀释至10-5、10-6浓度,制成菌体稀释液。
2、乳酸菌的初筛
将不同稀释浓度的酱油稀释液,均匀涂布在固体MRS培养基上(含18%食盐,固体MRS培养基的配方为:称取180g氯化钠,10g蛋白胨,5g牛肉膏粉,4g酵母膏粉,20g葡萄糖,1mL吐温-80,磷酸氢二钾2g,乙酸钠5g,柠檬酸三铵2g,硫酸镁0.2g,硫酸锰0.05g,琼脂15g,溶于1000mL蒸馏水中,调节pH至6.2,分装,0.1Mpa、115℃灭菌15min),放入培养箱中37℃培养48h后,在固体MRS培养基上挑选具有植物乳杆菌典型菌落形态的乳酸菌,菌落呈现乳白色、菌落凸起、呈圆形,表面光滑,菌落边缘整齐单菌落,接入含盐18%的MRS液体培养基(MRS液体培养基:180g氯化钠,10g蛋白胨,5g牛肉膏粉,4g酵母膏粉,20g葡萄糖,1mL吐温-80,磷酸氢二钾2g,乙酸钠5g,柠檬酸三铵2g,硫酸镁0.2g,硫酸锰0.05g,溶于1000mL蒸馏水中,调节pH至6.2,分装,0.1Mpa、115℃灭菌15min)中,37℃培养。菌落的编号依次为LH610至LH618。
在酱油发酵中期接入,接种量为1×105cfu/mL,按照传统高盐稀态发酵工艺放入28℃静置培养进行发酵。发酵至55天时,从各罐中取样进行常规的总酸和氨基氮指标检测,并通过轻工行业标准QB/T4234-2011进行3-羟基-2-丁酮含量进行分析,结果如表1所示。
表1.发酵原油质量分析
选取原油质量正常,总酸量低,氨基氮和3-羟基-2-丁酮含量高的菌株LH611、LH615、LH617进行复筛。
3、乳酸菌株复筛
将初筛选出的三株乳酸菌LH611、LH615、LH617,重新活化培养,接于MRS液体培养基(含18%NaCl),温度37℃,培养24h,在酱油发酵中期接种,最终接种量为1×105cfu/ml。按照传统高盐稀态发酵工艺进行28℃静置培养发酵。发酵至55天结束后,专业鉴评师对原油进行感官评价,结果如表2所示。
表2.发酵原油感官分析
备注:各项指标满分为100分,得分越高表示结果越好。
根据得分,选择感官评价结果最好的菌,经鉴定为植物乳杆菌,并命名为植物乳杆菌LH611。该菌株在固体MRS平板培养基上的形态观察如图1所示,菌落直径达3mm至5mm,菌落呈现乳白色、菌落凸起、呈圆形,表面光滑,菌落边缘整齐。本发明的LH611菌株经基因鉴定,其基因序列如下:
TATACATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGCAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCTAAGG(SEQ ID No:1)
根据16S rDNA检测结果对比分析,本发明的菌种所测得的16S区序列与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)相似度达到99%,可确定该菌种为一株植物乳杆菌。
本实施例选育获得的LH611已经由本发明人保藏于广东省微生物菌种保藏中心,命名为植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)ZF611,保藏号为GDMCC No:60455。因此,在本申请中,ZF611与LH611指的是同一菌株。
实施例2
植物乳杆菌菌株ZF611的遗传稳定性检测
将实施例1中的ZF611植物乳杆菌(即本发明的植物乳杆菌菌株(Lactobacillusplantarum)ZF611)在MRS培养基上连续传代10代,分别对第1代、第5代、第10代培养菌种按照实施例1中的方法检测所发酵原油中3-羟基-2-丁酮的含量并进行感官评价,以判断其遗传稳定性,具体数据见表3。
表3.传代稳定性测试的种曲检测结果
从3-羟基-2-丁酮的含量和感官综合分析结果来看,植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZF611遗传稳定性好,符合生产使用要求。
实施例3
将实施例1中的植物乳杆菌ZF611,以菌体终浓度为104cfu/ml的剂量添加在酱油发酵中期使用,以无植物乳杆菌ZF611添加的酱油作为对照组,按照传统高盐稀态发酵工艺进行30℃静置培养发酵,55天发酵结束后采用轻工行业标准QB/T4234-2011测定3-羟基-2-丁酮含量并由专业鉴评师进行感官评价,结果显示在表4和表5。
实施例4
将实施例1中的植物乳杆菌ZF611,以菌体终浓度为105cfu/ml的剂量添加在酱油发酵中期使用,以无植物乳杆菌ZF611添加的酱油作为对照组,按照传统高盐稀态发酵工艺进行30℃静置培养发酵53天发酵结束后采用轻工行业标准QB/T4234-2011测定3-羟基-2-丁酮含量并由专业鉴评师进行感官评价,结果显示在表4和表5。
实施例5
将实施例1中的植物乳杆菌ZF611,以菌体终浓度为106cfu/ml的剂量添加在酱油发酵中期使用,以无植物乳杆菌ZF611添加的酱油作为对照组,按照传统高盐稀态发酵工艺进行29℃静置培养发酵,55天发酵结束后采用轻工行业标准QB/T4234-2011测定3-羟基-2-丁酮含量并由专业鉴评师进行感官评价,结果显示在表4和表5。
实施例6
将实施例1中的植物乳杆菌ZF611,以菌体终浓度为107cfu/ml的剂量添加在酱油发酵中期使用,以无植物乳杆菌ZF611添加的酱油作为对照组,按照传统高盐稀态发酵工艺进行30℃静置培养发酵,55天发酵结束后采用轻工行业标准QB/T4234-2011测定3-羟基-2-丁酮含量并由专业鉴评师进行感官评价,结果显示在表4和表5。
实施例7
将实施例1中的植物乳杆菌ZF611,以菌体终浓度为108cfu/ml的剂量添加在酱油发酵中期使用,以无植物乳杆菌ZF611添加的酱油作为对照组,按照传统高盐稀态发酵工艺进行28℃静置培养发酵,55天发酵结束后采用轻工行业标准QB/T4234-2011测定3-羟基-2-丁酮含量并由专业鉴评师进行感官评价,结果显示在表4和表5。
表4.酱油中3-羟基-2-丁酮含量分析
表5.感官评价
注:每项评定满分10分,以0.5为评分间隔,综合评分为各项总合的平均值。
将本发明的植物乳杆菌ZF611应用于酱油生产,能够有显著改善酿油中3-羟基-2-丁酮的含量。在实施例3至7中植物乳杆菌ZF611添加的量越多,则酱油中3-羟基-2-丁酮含量越高,但是当植物乳杆菌ZF611添加的量增大到一定程度时例如实施例7,使得酱油的香气、鲜味、甜味等因素受到较大影响,因此在添加本发明的植物乳杆菌ZF611时应注意产品的添加量,本研究表明在添加量为105至106cfu/ml,为最佳条件,既有效生成3-羟基-2-丁酮,又不改变酱油的风味。而实施例3中植物乳杆菌ZF611的添加量,虽然没有影响酱油的感观评价,但是和对照组比并没有对酱油的整体有很好的提升,也这表明植物乳杆菌ZF611并不是添加量越少越好。
实施例8
将本发明的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)ZF611在液体MRS培养基上扩增后,以1.0×105cfu/mL接入酱料中发酵,判断其在酱料发酵影响,具体数据见表6。
表6.酱料的感官评价
从3-羟基-2-丁酮的含量、色泽、香气、咸味、鲜味、甜味、酸味结果来看,本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF611可以有效改善酱料的感官水平,增加酱料的香气,提高酱料的风味和口感,酱料香气四溢、风味鲜甜、滋味醇厚。
本发明提供的植物乳杆菌ZF611,具有提高3-羟基-2-丁酮含量的优点,并且添加后不影响酱油和/或酱中其它成分的特点,无需后期调配,既保留了酱油和/或酱浓郁和风味,又无安全风险,为酱油和/或酱的酿造提供香气四溢、风味鲜甜、滋味醇厚的原油。
上述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述,而不是限制;因此在和本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变,都应该认为是包括在权利要求书的范围内。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文,如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外,本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解,并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明,但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。
序列表
<110> 佛山市海天(高明)调味食品有限公司;
广东海天创新技术有限公司; 佛山市海天调味食品股份有限公司
<120> 一株增加酱油中3-羟基-2-丁酮含量的植物乳杆菌及其应用
<130> IDC190055
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌16S rDNA
<400> 1
tatacatgca gtcgaacgaa ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga tttacatttg 60
agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg gggataacac 120
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cgcattaagc attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg acatggatac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag ctaatctctt 1260
aaagccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta accttttagg aaccagccgc 1440
taagg 1445
Claims (9)
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZF611,其于2018年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏地址:广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮政编码:510075,保藏号为GDMCC No:60455。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌ZF611在食品发酵中的用途。
3.权利要求2所述的用途,其中食品发酵为酱油和/或酱发酵。
4.权利要求3所述的用途,其中所述植物乳杆菌ZF611用于在酱油和/或酱发酵中期接入。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌ZF611在制备酱油和/或酱中的用途。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌ZF611在制备发酵剂中的用途。
7.组合物,其包含权利要求1所述的植物乳杆菌ZF611。
8.权利要求7所述的组合物,其为发酵剂。
9.权利要求7或8所述的组合物,其用于制备酱油和/或酱。
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