KR101531349B1 - 문어 배추김치에서 분리한 류코노스톡 메센테로이드 sk-1 및 이를 이용한 수산물 김치의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 덱스트란 생성이 우수한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 유산균은 식품첨가용 조성물 및 김치의 스타터로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 수산물 김치는 종래의 수산물 김치에 비해 산도 및 젖산 생성량이 적어 적정 숙성도가 오래 유지됨으로써 수산물 김치의 장기간 유통 및 저장이 가능한 효과를 가진다.

Description

문어 배추김치에서 분리한 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 및 이를 이용한 수산물 김치의 제조 방법{Leuconostoc mesenteroides SK-1 isolated from octopus Baechu kimchi and method for preparing seafood kimchi using the same}

본 발명은 문어 등의 수산물을 첨가한 배추김치에서 분리한 신규의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주 및 이를 이용한 수산물 김치의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 내산성을 가지며 덱스트란 생성능이 우수한 신규한 미생물 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주 및 이를 수산물김치의 스타터로 이용하여 기존의 수산물 김치보다 신맛이 적고 적정 숙성도가 오래 유지되는 수산물 김치 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 김치산업 및 발효식품분야에서 유용한 기술로 사용될 수 있다.

김치는 채소류를 소금으로 절임 후 각종 양념 및 젓갈 등의 부재료를 넣어 버무려 저온에서 발효시키는 우리나라의 대표적인 전통발효식품으로 각 지역의 식품생산과 지리적 특성에 따라 부재료가 달라질 수 있으며 담그는 방법에 따라 다양한 형태와 맛을 가지고 있다. 예로부터 수산물을 사용하여 담근 김치에 대한 기록이 남아 있어, 1809년 조선시대 빙허각(憑虛閣) 이씨(李氏)가 저술한 「규합총서(閨閤叢書)」를 살펴보면, ‘어육침채’는 대구, 민어, 북어, 조기머리와 껍질을 많이 넣고 진하게 달인 육수를 사용하여 담그는 물김치 형태이고 ‘섞박지’는 소라와 낙지를 사용하여 담그는 김치이며 전복에 유자를 소로 사용하여 담근 ‘전복김치’가 소개되어 있다. 이러한 기록들을 근간으로 해서 현대에는 주로 해안가 지역을 중심으로 젓갈 외에도 굴, 조기, 명태, 오징어, 새우, 전복 등 다양한 수산물을 첨가한 김치를 담가 먹어 오고 있다. 이와 같이 김치에 첨가하는 수산물은 김치의 맛 증진뿐만 아니라 아미노산 등 영양가를 보충해 주는 역할을 한다고 알려짐에 따라 김치 부재료로서의 수산물에 대한 관심이 증가하였고, 경제성장에 따른 국민소득의 증가로 고급화된 김치에 대한 소비자들의 요구에 의하여 문어, 전복 등을 첨가한 김치가 상품화되기 시작하였다.

그러나 일반적으로 시중에서 판매되고 있는 상품김치의 경우, 같은 원료와 방법을 사용하여 제조하여도 김치 발효를 주도하는 젖산균의 종류와 수가 달라지고 숙성 중에는 그 차이가 더욱 커져 김치의 맛을 일정하게 재현하는 것이 어려운 문제점이 발생한다. 더욱이, 김치 제조 시 수산물과 같은 동물성 단백질원을 부재료로 첨가하는 수산물 김치의 맛이나 품질을 원하는 상태로 일정하게 재현한다는 것은 상당히 어려운 일이 아닐 수 없다.

최근에 이러한 문제점을 해결하기 위해, 김치에서 유래되는 유산균을 분리하여 김치 제조 시 스타터(starter)로 첨가함으로써, 김치의 맛과 품질을 조절하려는 연구들이 많이 진행되고 있다.

대한민국 특허등록 0181009호(1998. 12. 04)에는 류코노스톡 파라멘센테로이디스와 류코노스톡 메센테로이디스 균주를 혼합 첨가함으로써 김치의 맛이 좋을 뿐만 아니라, 산패와 연부현상을 지연되도록 하는 김치 제조방법을 게시하였고, 대한민국 특허등록 0519083호(2005.09.27)에는 류코노스톡 메센테로이데스 K8P4 또는 류코노스톡 메센테로이데스 K2M5 및 락토바실러스 사케이 K5M3을 함께 첨가하여 첨가한 미생물이 김치숙성 중 지배균으로 점유되어 김치의 미생물 조성을 조절함으로써 김치의 맛을 균일하게 조절하는 방법을 게시하였으며, 대한민국 특허등록 0536108호(2005. 12. 14)는 내산성 류코노스톡 메센테로이드 균주와 가바를 첨가하여 맛과 기능성이 향상된 김치의 제조방법을 게시하였다. 이처럼, 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 재현하는 것이 맛과 품질이 좋은 김치를 생산할 수 있는 주요 관건이 되기 때문에, 이상젖산발효균(heterofermentative lactic acid bacteria)인 류코노스톡 메센테로이드를 김치의 스타터로 이용하려고 하는 연구가 많이 진행되어 오고 있다. 또한, 김치의 발효초기에 우점종으로 생육하는 젖산균인 류코노스톡 속은 식품의 숙성과 맛에 관여하는 주요 미생물로서 발효과정 중에 젖산, 초산, 이산화탄소 그리고 만니톨과 같은 매우 다양한 성분을 생성한다. 특히, 류코노스톡 속은 설탕(sucrose) 존재 시 덱스트란 슈크라제를 분비하여 과당(fructose)을 유리하고 덱스트란(dextran)이라는 점질의 다당을 생성하며, 덱스트란을 식품으로 섭취하였을 때 장내미생물의 생육을 증식시키는 효과가 있다. 이와 같은 류코노스톡 균주의 특성을 이용하여, 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(대한민국 특허공개 2008-0077390호)나 류코노스톡 시트리움(대한민국 특허등록 1302465호) 균주를 스타터로 김치에 첨가함으로써, 관능 특성이 우수한 김치를 제조하는 방법들을 게시하였으며, 대한민국 특허등록 0718344호(2007. 05. 08)는 김치의 숙성에 관여하며 설탕을 이용하여 고분자 점질물의 덱스트란을 생성하는 류코노스톡 시트리움 균주를 스타터로 접종하여 점질성의 기능성 발효식품을 제조하는 방법을 게시하였다.

한편, 이와 같은 종래의 기술들은 수산물을 첨가하지 않고 제조한 김치에서 유래된 유산균인 류코노스톡 속을 스타터로 활용한 연구들로서, 수산물을 첨가하여 제조한 김치에 상기 균주를 스타터로 첨가한다 해도, 배합된 원료의 영양성분 및 숙성조건 등의 차이로 인해 미생물의 생육속도가 달라져 수산물김치의 시원하고 신선한 맛을 지속적으로 유지하거나 재현시킬 수 없다는 문제점이 있다. 이에 따라 수산물김치의 시원하고 깔끔한 맛을 오랫동안 유지하면서 재현할 수 있는 수산물김치 전용 유산균 스타터에 대한 개발이 절실히 요구되는 실정이다. 그러나 아직까지 수산물을 첨가한 김치에서 분리한 유산균 및 이 유산균을 수산물 김치의 스타터로 이용하여 제조하는 방법에 관해 공지된 기술을 찾아볼 수 없다.

1. 대한민국 특허등록 0181009호(1998. 12. 04) 2. 대한민국 특허등록 0519083호(2005.09.27) 3. 대한민국 특허등록 0536108호(2005. 12. 14) 4. 대한민국 특허공개 2008-0077390호(2008. 8. 22.) 5. 대한민국 특허등록 1302465호(2013. 08. 27.) 6. 대한민국 특허등록 0718344호(2007. 05. 08)

1. 규합총서(閨閤叢書):1809년 조선시대 빙허각(憑虛閣) 이씨(李氏) 저술

본 발명은 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 내산성을 갖으며 덱스트란 생성능이 뛰어난 신규한 유산균을 문어 등의 수산물을 첨가하여 제조한 배추김치로부터 분리하고, 이 유산균을 수산물을 첨가한 김치의 스타터로 활용함으로써, 시원한 맛과 독특한 풍미를 지속적으로 오래 유지할 수 있는 수산물 김치의 제조방법을 제공하는 것이다. 동 기술개발을 활용해서, 우리나라 김치산업의 활성화 및 김치품질의 다양화에 크게 기여할 것으로 전망되며 김치의 소비확대에도 도움이 될 것으로 기대된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 절인배추 전체 중량 대비 문어 등의 수산물을 5∼10%(w/w) 첨가하여(이하에서는 문어를 사용한 배추김치에 대하여 구체적은 예를 들어 설시한다) 제조한 문어 등이 함유된 수산물배추김치에서 분리된 유산균으로, pH 3.2∼5.0에서 내산성을 갖으며 덱스트란 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) subsp. suionicum SK-1(기탁번호: KCCM11519P)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 수산물 김치의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는 문어 등의 수산물을 첨가하여 제조한 배추김치에서 내산성을 갖고 덱스트란 생성능이 우수한 신규한 유산균을 제공하고, 이를 수산물 김치에 첨가함으로써 수산물 김치의 적정 산도를 일정하게 오랫동안 유지시켜 신 냄새가 약하고 수산물김치 특유의 시원한 맛을 재현시킬 수 있는 효과가 있다. 또한 상기 유산균은 덱스트란 생성능이 뛰어나므로 기능성을 갖는 수산물 김치의 제조가 가능하다.

따라서 본 발명의 유산균은 수산물을 첨가하여 제조하는 김치의 스타터로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1과 종래 유산균의 덱스트란 생성량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
SK-1: 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1
KCTC3505: 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505
KCTC13302: 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302
도 2는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치와 종래 공지된 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302 균주를 각각 첨가하여 제조한 수산물 김치, 그리고 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 수산물 김치의 pH 변화를 비교하여 나타낸 것이다.
○ : 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
■ : 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
▲ : 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
× : 유산균을 첨가하지 않고 제조한 수산물 김치
도 3은 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치와 종래 공지된 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302 균주를 각각 첨가하여 제조한 수산물 김치, 그리고 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 수산물 김치의 산도 변화를 비교하여 나타낸 것이다.
○ : 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
■ : 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
▲ : 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
× : 유산균을 첨가하지 않고 제조한 수산물 김치
도 4는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치와 종래 공지된 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302 균주를 각각 첨가하여 제조한 수산물 김치, 그리고 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 수산물 김치의 젖산생성량 변화를 비교하여 나타낸 것이다.
SK-1: 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
KCTC3505: 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
KCTC13302: 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
유산균 미첨가: 류코노스톡 속 균주를 첨가하지 않고 제조한 수산물 김치
도 5는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치와 종래 공지된 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302 균주를 각각 첨가하여 제조한 수산물 김치, 그리고 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 수산물 김치의 류코노스톡 속 변화를 비교하여 나타낸 것이다.
○ : 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
■ : 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 균주를 첨가하여 제조한 수산 물김치
▲ : 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302 균주를 첨가하여 제조한 수산물 김치
× : 유산균을 첨가하지 않고 제조한 수산물 김치

본 발명은 문어 등의 수산물을 첨가한 배추김치에 분리한 유산균으로 내산성을 갖고 덱스트란 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) subsp. suionicum SK-1을 제공한다는 점에 특징이 있다. 이하에서 균주는 문어를 첨가하여 제조한 배추김치로부터 분리되기는 하였으나, 관련 균주의 분리 범위가 이에 한정되는 것은 아니며, 낙지나 오징어, 쭈꾸미, 전복 등의 수산물이 첨가된 배추김치에서 분리된 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) subsp. suionicum SK-1의 사용이 가능하다.

본 발명에서는 시원한 맛과 독특한 풍미를 갖는 수산물 김치를 제조하기 위해 문어를 첨가한 배추김치가 가장 맛있을 때 생육 되는 균주를 분리하였다. 구체적으로 문어를 첨가한 배추김치를 4℃에서 숙성하면서 pH가 4.55, 산도가 0.65%를 나타낼 때 유산균들을 분리하였고, 상기 분리된 7종의 유산균 중 내산성 활성이 우수하게 나타난 유산균 3종에 대해서 덱스트란 생성능을 비교하여 가장 우수한 덱스트란 생성능을 지닌 SK-1 균주의 동정을 수행하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드에 속하는 균주임을 확인할 수 있었고, 이 균주를 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1라고 명명하였다. 상기 균주는 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2014년 2월 17일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11519P).

본 발명은 상기 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1 균주를 제공하는 것을 특징으로 한다. 일반적인 류코노스톡 메센테로이드 균주는 산성조건, 특히 pH 4.0 이하에서 증식이 급격히 저하되나, 본 발명의 문어를 첨가한 배추김치에서 분리한 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1은 pH 3.2-5에서 내산성을 갖고 있으며, 특히 pH 3.5에서 활발하게 생육하여 내산성이 강한 것으로 나타났다.

또한 본 발명의 문어를 첨가한 배추김치에서 분리한 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1은 우수한 덱스트란 생성능을 갖고 있다.

종래에 공지된 류코노스톡 메센테로이드 중에서 류코노스톡 메센테로이드 subsp. mesenteroides KCTC3505 및 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302와 덱스트란 생성능을 비교했을 때 각각 10% 및 17% 정도 더 많은 덱스트란을 생성하였다.

이와 같은 특성을 갖는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1 또는 이의 배양액을 첨가하여 수산물김치를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 수산물 김치 제조 시 사용되는 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1 균주의 배양액은 상기 균주를 PES(Phenylethyl alcohol sucrose) 배지에 접종한 후 20∼25℃에서 20∼24시간 동안 1차 전 배양하는 단계; 상기 1차 전 배양액을 PES 배지에 0.5∼1%(v/v) 접종한 후 20∼25℃에서 20∼24시간 동안 2차 전 배양하는 단계; 상기 2차 전 배양액을 멸균된 PES 배지에 0.5～1%(v/v) 접종한 후 20∼25℃에서 20∼24시간 동안 본 배양하는 단계를 거쳐 제조하는 것이 바람직하다.

이와 같이 제조된 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1 균주의 배양액은 4,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 하층의 균체를 회수하는 과정을 거친 뒤, 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 1×10^7~8CFU/mL 되게 희석하는 단계를 거쳐 김치 양념 전체 중량에 대해서 1∼5%(w/v)로 첨가하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 혼합한 김치 양념(고춧가루, 마늘, 생강, 까나리액젓, 새우젓, 찹쌀풀, 설탕, 실파)의 전체 중량에 대해서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1 배양액을 3%(w/v) 첨가하여 수산물 김치를 제조할 수 있다. 상기 균주의 배양액을 김치 양념 전체 중량에 대해서 5%를 초과하여 첨가하게 되면 수산물 김치가 과숙성하게 되고 단맛이 강해지는 문제점이 발생할 수 있으며, 1% 이하로 첨가되면 균주에 의한 효과가 미미하다.

이상과 같이 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1을 첨가하여 제조한 수산물 김치는 종래의 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가한 수산물 김치보다도 산도 증가 속도가 완만하여 수산물 김치의 적정 숙성도(산도 0.4∼0.8%)를 오랫동안 유지하는 것으로 나타나, 수산물 김치 제조 시 본 발명에서 분리된 균주 또는 그 배양액을 이용하는 경우는 적정 숙성도를 유지하는 기간이 연장됨에 따라 수산물 김치의 시원한 맛을 오래 유지할 수 있는 특징이 있다. 또한, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1 균주 및 그 배양액을 수산물 김치 제조 시 첨가하게 되면 수산물 김치의 숙성 중 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도하게 되고 덱스트란 함량 높은 수산물 김치가 제조되어 신맛을 억제하고 시원한 맛을 오래 유지할 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다.

다만 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시되는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

문어 배추김치로부터 유산균의 분리

절인 배추 전체 중량 대비 문어를 5∼10%(w/w) 첨가하는 방식으로 제조한 문어 배추김치를, 4℃에서 25일간 숙성시키면서 관능평가를 실시하여 풍미가 가장 좋은 시점의 김치를 유산균 분리 시료로 사용하였다. 숙성 17∼19일 된 문어배추김치를 대상으로 실시한 관능평가 결과가 가장 맛이 좋은 것으로 평가되었고, 이 시기의 pH가 4.55, 산도는 0.65%를 나타내었다. 상기 문어 배추김치의 김치즙액을 0.85％ 식염수로 10배 희석하였고, 0.1mL씩 PESA 배지(Phenylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, magnesium sulfate heptahydrate 0.244g, potassium phosphate monobasic 1g, phenylethyl alcohol 2.5mL, agar 15g/D.W. 1L) 플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 20℃의 항온 배양기에서 5일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니(colony) 중 맑고 형태가 큰 콜로니 7종을 선택하여 PES 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 20℃에서 3일 동안 배양하여 유산균 콜로니들을 분리하였다.

문어 배추김치에서 분리한 유산균 중 내산성 균주 선별

상기 실시예 1에서와 같이 문어 배추김치로부터 분리된 7종의 유산균 콜로니의 내산성을 비교하기 위해 젖산(lactic acid)을 사용하여 pH 3.2, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0으로 조정한 PES 배지(Phenylethyl alcohol sucrose; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, magnesium sulfate heptahydrate 0.244g, potassium phosphate monobasic 1g, phenylethyl alcohol 2.5mL/D.W. 1L)를 제조하고, PES 배지 5mL에 7종의 유산균 콜로니를 각각 접종한 후 20℃에서 72시간 배양하면서 생육 유무를 관찰하여 상기 pH 범위에서도 가장 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 콜로니 SK-1, SK-2 및 SK-5의 균주가 pH 3.5∼5.0에서 생육이 활발하여 내산성이 강한 것으로 나타났다(표 1 참조).

문어 배추김치로부터 분리한 유산균의 내산성 활성 비교

콜로니 번호	pH
	3.5	4.0	4.5	5.0
SK-1	+	+	+	+
SK-2	+	+	+	+
SK-3	-	+	+	+
SK-4	-	+	+	+
SK-5	+	+	+	+
SK-6	-	+	+	+
SK-7	-	+	+	+

덱스트란 생성능이 우수한 균주의 선별

상기 실시예 2에서와 같이 문어 배추김치로부터 선별된 내산성 유산균 SK-1, SK-2 및 SK-5를 대상으로 덱스트란 생성량을 확인하기 위해, 상기 3종의 유산균을 PES 배지 10mL에 2차에 걸쳐 계대배양을 실시하였다.

이후, 상기 유산균 3종을 PES 배지 100mL에 1％(v/v)로 각각 접종하여 20℃에서 5일 동안 배양한 후 생성된 덱스트란의 양을 측정하여 덱스트란 생성량이 가장 우수한 콜로니 SK-1 균주를 최종 선별하였다. 단일 분리된 내산성 유산균 균주의 덱스트란 생성량의 측정방법은 다음과 같이 수행하였다; 각각의 배양액 50mL를 채취하여 10분 동안 5,000rpm으로 원심분리하고 맑은 상층액을 얻었다. 상기의 상층액에 10배의 에탄올(99.9%)을 첨가하여 침전된 덱스트란을 회수하여 동결 건조를 실시하였고 건조된 덱스트란의 양을 측정하였다(표 2 참조).

문어 배추김치로부터 분리한 내산성 균주의 덱스트란 생성량 비교

콜로니 번호	덱스트란 생성량(%)
SK-1	3.1
SK-2	1.6
SK-5	2.1

문어 배추김치로부터 분리된 유산균 SK-1의 동정

문어 배추김치로부터 분리한 7종의 유산균 중 내산성을 갖고 덱스트란 생성능이 높게 나타난 SK-1 균주에 대한 형태학적 특성을 분석하였다. 형태학적 특성을 분석하기 위해 SK-1 균주를 최적 조건에서 배양하여 그람염색(Gram staining)을 실시한 결과, 상기 분리된 유산균 균주는 그람 양성이며 간균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다. 카탈라제(catalase) 실험결과 음성반응을 보여 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.)의 형태적 특징과 일치하였다.

상기의 SK-1 균주를 대상으로 API-50CHL(BioMerieux SA사, 프랑스)을 사용하여 49종의 탄수화물 이용 패턴을 확인한 결과는 표 3과 같다. SK-1 균주는 L-아라비노스, 리보스, D-자일로스, D-만노스, 만니톨, 알파-메틸-D-글루코시드, N-아세틸 글루코사민, 살리신, 말토스, 멜리비오스, 트레할로스, D-라피노스, D-투라노스, 글루코네이트, 2-케토-글루코네이트 및 5-케토-글루코네이트를 이용하는 것으로 나타나, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.

문어 배추김치로부터 분리한 유산균 SK-1의 탄소화물 이용 패턴 조사

탄수화물	활성	탄수화물	활성
글리세롤	-	에스큘린	-
에리쓰리톨	-	살리신	+
D-아라비노즈	-	셀로비오스	-
L-아라비노즈	+	말토스	+
리보스	+	락토스	-
D-자일로스	+	멜리비오스	+
L-자일로스	-	수크로스	-
아도니톨	-	트레할로스	+
베타-메틸-D-자일로시드	-	이뉼린	-
갈락토스	-	메레지토스	-
D-글루코스	-	D-라피노스	+
D-프럭토스	-	스타치	-
D-만노스	+	글리코겐	-
L-소르보스	-	자일리톨	-
람노스	-	베타-젠티오비오스	-
둘시톨	-	D-투라노스	+
이노시톨	-	D-릭소스	-
만니톨	+	D-타가토스	-
소르비톨	-	L-푸코스	-
알파-메틸-D-마노시드	-	D-아라비톨	-
알파-메틸-D-글루코시드	+	L-아라비톨	-
N-아세틸 글루코사민	+	글루코네이트	+
아미그달린	-	2-케토-글루코네이트	+
알부틴	-	5-케토-글루코네이트	+

한편, 상기에서 분리된 SK-1 균주의 동정은 16S rRNA 염기서열을 분석하여 상동성을 조사하였다. 즉, 16S rRNA 염기서열을 결정하기 위해 일반적인 방법에 따라 정제된 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA단편을 Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems, USA)로 정제한 다음, DNA sequencer(Applied Biosystems model 3730XL, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 EzTaxon server 2.1을 이용하여 상동성을 분석하였다. SK-1 균주의 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum LMG 8159^T와 99.8% 동일성을 갖는 균주를 류코노스톡 메센테로이드 subsp. suionicum SK-1로 명명하고, 이를 한국미생물종보존센터(KCCM11519P, 2014. 2. 17)에 기탁하였다(기탁증 별도 첨부).

본 발명의 유산균과 종래 유산균과의 내산성 비교

문어 배추김치에서 분리된 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1과 종래 공지된 유산균 균주인 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302의 내산성 정도를 비교하였다.

각 유산균을 젖산으로 pH 3.2, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0으로 조정한 PES 배지 10mL에 균체배양액을 각각 1mL씩 접종하였다. 20℃에서 72시간 배양하면서 생육유무를 관찰하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1은 종래의 류코노스톡 속 균주인 KCTC3505 및 KCTC13302보다 내산성이 강하여 pH 3.2∼5.0에서도 생육이 활발함을 확인하였다.

본 발명의 유산균과 종래 유산균과의 내산성 비교

pH	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1	류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505	류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302
5.0	+	+	+
4.5	+	+	+
4.0	+	+	+
3.5	+	+	+
3.2	+	-	-

본 발명의 유산균과 종래 유산균과의 덱스트란 생성능 비교

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1과 종래 공지된 유산균과의 덱스트란 생성능을 비교해 보기 위해, 덱스트란 생성능이 우수하다고 알려진 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 수산물을 첨가하지 않은 일반김치에서 분리된 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302를 사용하여 덱스트란 생성능을 비교하였다. 상기 유산균들을 PES 배지 100mL에 1mL를 접종하여 20℃에서 5일 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 3에 기재된 것과 같이 동일한 방법으로 배양액 중의 덱스트란 생성량을 측정하였다. 도 2에서 나타내었듯이, 본 발명의 유산균은 덱스트란 생성능이 우수하다고 알려진 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC3505 균주보다도 덱스트란 생성량이 10%정도 높게 나타났고, 일반김치에서 분리된 류코노스톡 메센테로이드 KCTC13302보다는 17%정도 많은 덱스트란을 생성하였다. 본 발명에서 분리, 동정한 류코노스톡 메센테로이드 SK-1은 종래 류코노스톡 속 미생물에 비해 덱스트란 생성능이 우수함을 확인할 수 있었다.

류코노스톡 메센테로이드 SK -1의 수산물김치 첨가 배양액 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 이용하여 수산물 김치를 제조하기 위한 상기 균주 배양액은 다음과 같이 제조하였다.

류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주의 배양액은 상기 균주를 PES 배지에 접종한 후 20℃에서 24시간 동안 1차 전 배양하였고, 상기 1차 전 배양액을 PES 배지에 1%(v/v) 접종한 후 20℃에서 24시간 동안 2차 전 배양을 실시하였다. 상기 2차 전 배양액을 멸균된 PES 배지에 1% 접종한 후 20℃에서 24시간 동안 본 배양하는 단계를 거쳐 제조하였다.

이와 같이 제조된 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주의 배양액은 4,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 하층의 균체를 회수하는 과정을 거친 뒤, 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 1×10^7~8CFU/mL되게 희석한 것을 사용하였다.

류코노스톡 메센테로이드 SK -1 균주 배양액을 이용한 수산물 김치의 제조

수산물(문어, 오징어, 전복, 주꾸미, 낙지 등)의 내장을 제거하고 깨끗이 세척한 후 물기를 제거하고 수산물의 전체 중량 대비 3%(w/w)의 천일염을 넣고 버무린 것을 4℃의 냉장고에서 24시간 저장한 다음 깨끗이 여러 번 세척하여 짠맛을 제거시킨 후 감초 물에 3∼5분간 데쳤다. 배추는 이물질을 제거하고 이등분하여 뿌리부분에 4∼6cm 칼집을 넣은 후, 줄기 쪽 위주로 배추무게의 3%(w/w)가 되게 천일염을 켜켜이 뿌렸으며, 천일염으로 만든 10% 염수를 배추 총 중량의 2배가 되게 침지시켜 약 18℃에서 12시간 이상 절인 후, 배추의 염도가 1.8±0.1%에 도달하였을 때 흐르는 물에 2회 세척하여 채반에 건져 4시간 탈수하였다.

수산물 김치의 제조를 위해 절인 배추(78.3%)와 고춧가루(2.35%), 마늘(2.35%), 까나리액젓(1.17%), 새우젓(1.57%), 생강(0.47%), 찹쌀 풀(3.38%), 설탕(0.47%), 양파(2.11%)를 혼합한 김치양념, 그리고 상기와 같은 방법으로 처리해 놓은 수산물(문어, 오징어, 전복, 주꾸미, 낙지 등)을 적당한 크기로 썰어 놓은 것을 절인 배추 중량에 대해 10%가 되도록 수산물을 준비하였다. 상기 실시예 7과 같은 방법으로 제조한 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주 배양액은 수산물을 제외한 김치양념 전체 중량 대비 3%(w/v)가 되도록 측정하여 김치양념에 첨가하고 혼합하였다. 수산물은 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주 배양액이 혼합되어 있는 김치양념과 같이 버무려 배추 속에 켜켜이 넣어가면서 수산물 김치를 제조하였고, 이와 같은 방법으로 제조한 수산물 김치의 최종 염도는 2.2±0.1%이었다.

류코노스톡 메센테로이드 SK - 1균주를 첨가한 수산물 김치의 발효양상

문어 배추김치에서 분리하여 동정한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 첨가한 수산물 김치의 발효양상을 비교 분석하기 위해 4℃에서 냉장보관을 하면서 7일 간격으로 꺼내어 총 35일간 pH, 산도, 젖산 생성량 및 류코노스톡 속 균수의 측정을 실시하였다.

이때 대조군으로는 동일한 재료와 배합비로 제조하되 류코노스톡 속과 같은 젖산균을 첨가하지 않고 담근 수산물 김치(음성 대조군)와 상기 실시예 7과 같은 방법으로 제조한 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505(양성 대조군 1) 및 KCTC13302(양성 대조군 2) 균주 배양액을 상기 실시예 8의 방법으로 제조한 수산물 김치를 사용하였다.

(9-1) pH 및 산도 측정

상기 실시예 8에서와 같이 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주의 배양액을 첨가하여 제조한 수산물 김치와 대조군으로 사용된 각각의 수산물 김치를 대상으로 pH 및 산도를 측정하여 비교하였다. 수산물과 배추의 비율이 1:9(g/g)가 되도록 시료를 취하고 잘게 다진 후 거즈로 짠 액을 김치액으로 사용하였다. pH는 김치액 20 mL를 취하여 실온에서 pH meter(Thermo Orion US/320, Barrington, IL, USA)로 측정하였고, 김치액 10mL를 0.1N NaOH용액을 사용하여 pH 8.1이 되도록 중화시키는 데 소비된 0.1N NaOH의 양을 젖산 함량(%)으로 환산하여 산도를 측정하였다.

도 2에 나타낸 것처럼, 숙성 14일째까지는 류코노스톡 속 균주룰 첨가하지 않은 음성 대조군의 수산물 김치가 양성 대조군 1 및 2를 포함한 류코노스톡 SK-1 균주를 첨가한 수산물 김치보다 높은 pH 값을 나타내었다. 그러나, 숙성 21일 이후부터는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주 배양액을 첨가한 수산물 김치의 pH가 4.56에 도달하면서 이후 계속 유지되는 양상을 보인 반면, 대조군으로 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302를 첨가한 양성 대조군 1과 2의 수산물 김치와 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 음성 대조군의 수산물 김치는 숙성 21일 이후부터 pH 값이 감소하는 경향을 나타내었다.

도 3에 나타낸 것처럼, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 이용하여 제조한 수산물 김치는 4℃에서 숙성 28일째 적정 산도 0.65%에 도달하였으나, 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302 균주를 첨가한 양성대조군 1과 2의 수산물 김치는 각각 숙성 21일 및 17일경에 적정 숙성 산도인 0.65%에 도달하는 것으로 나타났다. 또한, 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 이용하여 제조한 수산물 김치는 숙성 35일째에도 산도가 0.8%에 도달하지 않았으나, 음성 대조군으로 류코노스톡 속 균주를 첨가하지 않은 수산물 김치를 비롯하여 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302 균주를 첨가한 양성 대조군의 수산물 김치는 저장 28일째부터 산도가 0.8%에 도달하였고 이후부터는 급속하게 산도 값이 증가하는 양상을 나타내었다.

(9-2) 젖산 생성량 측정

상기에서 제조한 본 발명의 수산물 김치와 대조군으로 사용된 수산물 김치를 대상으로 젖산 생성량을 측정하여 비교하였다. 젖산 생성량은 다음과 같이 HPLC(High performance liquid chromatography)를 이용한 유기산 분석법에 의거하여 측정하였다. 수산물 김치 각 시료의 김치액을 13,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 0.22㎛ syringe filter로 여과하였다. 여과된 시료는 HPLC를 이용하여 시료 10μL를 주입하였고 이동상 0.008M H₂SO₄를 사용하여 분당 0.6mL로 흐르게 설정하였다. 이때 사용한 칼럼은 Aminex HPX-87H(300×7.8mm, 9㎛, Bio-rad, USA)이었고 칼럼온도는 35℃로 하여 분석하였다.

도 2와 도 3에서 나타낸 결과와 유사하게 4℃에서 숙성 21일째까지는 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 음성 대조군의 수산물 김치가, 류코노스톡 속 균주를 첨가한 양성 대조군의 수산물 김치 및 SK-1 균주를 첨가한 수산물 김치보다 다소 낮은 젖산 생성량을 나타내었다. 그러나 도 4에 나타낸 것처럼, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 이용하여 제조한 수산물 김치는, 4℃에서 숙성 21일째 젖산 생성량이 0.072%를 나타낸 이후 숙성 28일 및 35일째에도 젖산 생성량은 0.076% 및 0.079%로 일정한 값을 유지한 반면에, 음성대조군으로 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 수산물 김치와 류코노스톡 메센테로이드 KCTC3505 및 KCTC13302 균주를 첨가한 양성대조군의 수산물 김치는 숙성 28일째에 젖산생성량이 각각 0.096%, 0.115% 및 0.112%로 급속히 젖산 생성량이 증가하는 경향을 나타내었다.

이상의 결과를 종합하면, 문어 배추김치에서 분리, 동정된 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 이용하여 수산물 김치를 제조하게 되면, 종래에 공지된 류코노스톡 속 균주를 이용한 것보다도 수산물 김치의 적정 pH 및 산도를 유지하는 기간이 길어지고 젖산 생성을 적게 함으로써, 수산물 김치의 장기간 유통 및 저장이 가능할 것으로 분석되었다.

(9-3) 류코노스톡 속 균수의 측정

상기 실시예 8에서 제조된 각 김치의 류코노스톡 속 균수를 측정하기 위해, 4℃에서 35일 동안 숙성시킨 각 김치액을 0.85％ 식염수로 희석하여 제조하였고, 상기 김치 희석액 0.1mL씩을 PESA 배지 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 김치 희석액이 도말된 류코노스톡 속 측정 아가 플레이트는 20℃의 항온 배양기에서 5일 동안 배양하여 생성된 콜로니의 수를 각각의 균수로 계수하였다.

도 5에 나타낸 것처럼, 숙성 35일의 기간 동안에 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 및 류코노스톡 속 균주를 첨가한 양성 대조군의 수산물 김치는, 류코노스톡 속 균주를 미첨가한 음성대조군의 수산물 김치에 비해 류코노스톡 속 균주의 수가 현저히 높게 나타났다. 또한, 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 이용하여 제조한 수산물 김치는 4℃에서 숙성 14일째 이후부터 류코노스톡 속 균수가 10⁸CFU/mL 이상의 수준으로 일정하게 유지되는 것으로부터, 첨가한 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주가 수산물 김치 내에서 우점종으로 발효를 주도하여 수산물 김치의 시원한 맛을 지속적으로 유지시킬 수 있음을 확인할 수 있었고, 양성대조군인 1 및 2의 균주를 이용하여 제조한 수산물 김치에서도 같은 경향을 나타내었다.

상기 실시예에서는 문어를 첨가한 배추김치로부터 분리된 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주에 대하여 설시하고 있으나, 기타 낙지나 오징어, 쭈꾸미, 전복 등의 수산물을 첨가한 배추김치로부터 생성된 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주를 분리하여 사용할 수 있음은 이 기술분야의 통상의 기술자이면 자명한 것이므로, 이러한 변경은 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

상기 도면과 발명의 상세한 설명은 단지 본 발명의 예시적인 것으로서, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미 한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위하여 사용된 것은 아니다. 그러므로 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11519P 20140217

Claims (6)

1. 문어를 첨가하여 제조한 배추김치에서 분리된 pH 3.2～5.0에서 내산성을 가지며 덱스트란 생성능이 우수한 수산물 김치용 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) subsp. suionicum SK-1 균주(기탁번호: KCCM 11519P).
2. 삭제
3. 제1항의 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 또는 그의 배양액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 수산물 김치의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주의 배양액은 상기 균주를 PES(Phenylethyl alcohol sucrose) 배지에 접종한 후 20∼25℃에서 20∼24시간 동안 1차 전 배양하는 단계; 상기 1차 전 배양액을 PES 배지에 0.5～1%(v/v) 접종한 후 20∼25℃에서 20∼24시간 동안 2차 전 배양하는 단계; 상기 2차 전배양액을 멸균된 PES 배지에 0.5∼1%(v/v) 접종한 후 20∼25℃에서 20∼24시간 동안 본 배양하는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 수산물 김치의 제조 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 SK-1 균주 배양액을 수산물을 제외한 김치양념 전체 중량 대비 1 내지 5%(w/v)가 되도록 측정하여 김치양념에 첨가하는 것을 특징으로 하는 수산물 김치의 제조방법.
6. 제3항에 있어서, 감초물에 데친 수산물을 절인 배추 중량에 대해 10%(w/w)가 되도록 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 수산물 김치의 제조방법.

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