KR100392020B1 - 루시퍼라제 - Google Patents

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KR100392020B1
KR100392020B1 KR1019960705464A KR19960705464A KR100392020B1 KR 100392020 B1 KR100392020 B1 KR 100392020B1 KR 1019960705464 A KR1019960705464 A KR 1019960705464A KR 19960705464 A KR19960705464 A KR 19960705464A KR 100392020 B1 KR100392020 B1 KR 100392020B1
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피터 존 화이트
제임스 아우구스투스 헨리 머레이
데이비드 제임스 스쿼렐
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더 세크리터리 오브 스테이트 포 디펜스 인 허 브리트닉 머제스티스 거번먼트 오브 더 유나이티드 킹덤 오브 그레이트 브리튼 앤드 노던 아일랜드
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Abstract

포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제의 354번 위치 또는 루시올라(Luciola) 루시퍼라제의 356번 위치에 상응하는 글루타메이트가 다른 아미노산, 특히 라이신으로 대체됨으로써 야생형 루시퍼라제보다 열 안정성이 훨씬 큰 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질이 제공된다. 또한 이러한 단백질을 암호화하고 발현하는 DNA, 벡터 및 세포가 본 발명의 단백질을 사용하는 발광 검정을 수행하기 위한 시험 키트와 시약으로써 제공된다. 바람직한 단백질은 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 215번 위치 또는 루시올라 루시퍼라제의 217번 위치에 상응하는 위치에서 제2의 치환된 아미노산을 갖는다.

Description

루시퍼라제
반딧불이 루시퍼라제는 ATP, Mg2+및 산소 분자의 존재하에 루시페린의 산화를 촉매하여 광을 생성한다. 이 반응의 양자 수율은 약 0.88이며[참조; DeLuca & McElroy(1978) and Seliger & McElroy(1960)] 이러한 발광 특성은 ATP 농도가 측정되는 광도계 검정에서 사용할 수 있도록 한다.
루시퍼라제는 반딧불이(firefly; 개똥벌레) 또는 딱정벌레(glow-worm)와 같은 곤충체로부터 직접 수득하거나 이러한 효소를 암호화하는 재조합 DNA 작제물을 포함하는 미생물로부터의 발현에 의해 수득할 수 있다. 상기 효소가 수득될 수 있거나, 상기 효소를 암호화하는 DNA가 기원할 수 있는, 4개의 중요한 반딧불이의 종은 일본 갠지(GENJI) 및 헤이케(HEIKE)산 반딧불이인 루시올라 크루시아타(Luciola cruciata) 및 루시올라 라테랄리스(Luciola lateralis), 동유럽산 반딧불이인 루시올라 민그렐리카(Luciola mingrelica) 및 북아메리카산 반딧불이인 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)이다. 딱정벌레인 람피리스 녹틸루카(Lampyris noctiluca)는 이의 루시퍼라제 아미노산 서열이 포티누스 피랄리스의 루시퍼라제 아미노산 서열과 84%의 상동성을 갖는 추가의 종이다.
야생형 및 재조합형 루시퍼라제의 열 안정성은 약 30℃를 초과하는 온도, 특히 35℃ 이상의 온도에 노출되는 경우 활성을 매우 신속하게 상실하는 정도로 불안정하다. 이러한 불안정성은 높은 대기 온도에서 사용 또는 저장되거나 반응율에 있어서의 열 유도된 증가가 요구되는 경우 효소 상실을 초래한다. 일본산 반딧불이 루시퍼라제의 경우, 이의 아미노산의 217번 위치를 돌연변이시킴에 의해 트레오닌 잔기를 이소류신 잔기로 대체함으로써 열 불활성화에 대해 안정화시킬 수 있음이 공지되어 있다[참조; Kajiyama & Nakano(1993) Biochemistry32page 13795 내지 13799)], 이러한 방식에 의해 효소의 열 및 pH 안정성과 특이적 활성이 증가된다. 포티누스 피랄리스와 루티올라 민그렐리카 루시퍼라제의 열 안정화는 아직 보고되어 있지 않다.
본 발명은 루시퍼라제 활성을 갖는 신규한 단백질, 이의 발현을 위해 암호화되어 있는 DNA 및 벡터에 관한 것이다, 특히 본 발명은 30℃ 이상의 온도에서 열안정성을 갖는 루시퍼라제를 제공한다.
도 1은 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 luc 유전자의 삽입에 의해 pKK223-3으로부터 기원한 플라스미드 pPW204의 제한 지도를 도시한 것이다.
도 2는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 luc 유전자의 삽입에 의해 pDR540으로부터 기원한 플라스미드 pPW116의 제한 지도를 도시한 것이다.
도 3은 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 luc 유전자의 삽입에 의해 pT7-7로부터 기원한 플라스미드 pPW304의 제한 지도를 도시한 것이다.
도 4는 Xho 부위가 제거된 pGEM-luc로부터의 BamH1/Sst1 단편 및 pDR540으로부터 기원한 플라스미드 pPW601a의 제한 지도를 도시한 것이다.
도 5는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 주어진 온도에서 20분간 항온 처리한 재조합체 및 야생형 포티누스 루시퍼라제(Sigma 제조원)의 열 불활성화에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 6은 상이한 온도에서 증식하는 동안 이. 콜라이 BL21(DE3) pPW304의 조 추출물중 루시퍼라제 활성에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 7은 pPW304 및 pPW304M-1(리신이 글루타메이트 354와 교체되는 방식으로 암호화된 본 발명의 플라스미드)로부터 기원한 루시퍼라제의 활성에 대한 열 불활성화의 그래프를 도시한 것이다.
도 8은 37℃에서 시그마 야생형, 및 pPW304 및 pPW304M-1 재조합 루시퍼라제의 시간 의존성 불활성화의 그래프를 도시한 것이다.
도 9는 테이버(Tabor) 후 pT7-7의 제한 지도를 도시한 것이다.
도 10은 40℃의 프로메가 분해 완충액 중에서, 354번 위치의 야생형의 글루타메이트가 각각 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 아스파라긴, 메티오닌, 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌 및 시스테인으로 치환된, 루시퍼라제를 발현하는 본 발명의 루시퍼라제 발현-이. 콜라이의 조 세포 추출물의 활성에 있어 열 불활성화를 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
도 11은 단일 돌연변이체 A215L 및 E354K와 비교하여 47℃의 포스페이트 완충액 중에서 E354K 리신 및 A215L 류신으로 치환된 정제된 이중 돌연변이체 루시퍼라제의 활성에 있어 열 불활성화를 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
도 12는 0.02% 아지드가 들어있는 HEPES 완충액(pH 7.75)중 37℃에서 시간에 대해 잔류하는 리신 E354K 돌연변이체, 재조합 야생형 및 천연 반딧불이 루시퍼라제의 초기 활성 %의 그래프를 도시한 것이다.
도 13은 루시퍼라제 활성에 대해 플로팅한 배양 세포 밀도의 척도로써 광학밀도가 증가된 재조합체 야생형, E354K 단일 및 E354K + A215L 이중 돌연변이체에 있어 37℃에서의 루시퍼라제 발현에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 14는 37℃의, 1% BSA 및 0.02% 아지드를 포함하는 HEPES(pH 7.75) 중에서 5시간에 걸쳐 A215L 및 E354K 단일, A215L + E354K 이중, 재조합체 및 시그마 야생형 루시퍼라제 각각 10ng/ml의 시간에 대한 초기 활성%의 그래프를 도시한 것이다.
도 15는 37℃의, 1% BSA 및 0.02% 아지드, 2mM EDTA 및 2mM DTT를 포함하는 HEPES(pH 7.75) 중에서 5시간에 걸쳐 A215L 및 E354K 단일, A215L + E354K 이중, 재조합체 및 시그마 야생형 루시퍼라제 각각 10ng/ml의 시간에 대한 초기 활성%의 그래프를 도시한 것이다.
서열 리스트:
본 명세서의 끝에 제공된 서열 리스트는 하기와 같은 DNA 및 아미노산 서열을 기술한다:
서열확인번호: 1은 포티누스 피랄리스 야생형 코돈 1063번 내지 1065번이 돌연변이된, 즉 리신을 암호화하도록 1063번의 염기가 A로 돌연변이된 본 발명의 루시퍼라제를 암호화하는 DNA의 DNA 서열을 나타낸다.
서열확인번호: 2는 포티누스 피랄리스 야생형 아미노산 354번 글루타메이트가 다른 아미노산으로 치환된 본 발명의 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열확인번호: 3은 실시예 2에서 354번 위치에서의 글루타메이트 대신 리신을 수득하기 위한 pPW601의 SDM 돌연변이를 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 나타낸다.
서열확인번호: 4는 실시예 5의 215번 위치에서 류신을 수득하기 위한 pPW601의 SDM 돌연변이에 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 나타낸다.
서열확인번호: 5는 포티누스 피랄리스 야생형 아미노산 354번 글루타메이트가 다른 특정 아미노산으로 치환되고 215번 아미노산이 류신으로 치환된 본 발명의 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명자는 본 발명에 이르러 각각의 포티누스 피랄리스, 루시올라 민그렐리카, 루시올라 라테랄리스 및 루시올라 크루시아타 내의 보존된 서열 중에 존재하는 글루타메이트 잔기를 다른 아미노산, 특히 리신 또는 아르기닌으로 교체함으로써 야생형 루시퍼라제보다 증가된 열 안정성을 갖는 신규한 루시퍼라제를 제공하게 되었다. 이 글루타메이트는 포티누스 피랄리스 루시퍼라제내 354번 위치 및 이종 및 다른 종의 루시퍼라제내에서 발견되는 보존된 아미노산 서열인 TPEGDDKPGA의 세번째 아미노산에서 발견된다.
따라서 본 발명의 첫 번째 양태에서는 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 354번 잔기 및 루시올라 민그렐리카, 루시올라 크루시아타 및 루시올라 라테랄리스 루시퍼라제의 356번 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 글루타메이트 이외의 다른 아미노산임을 특징으로 하는, 포티누스 피랄리스, 루시올라 민그렐리카, 루시올라 크루시아타 또는 루시올라 라테랄리스의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖고 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질이 제공된다.
이 아미노산은 천연적으로 존재하는 아미노산이거나 소위 개질된 천연적으로 존재하는 아미노산과 같은 특수한 아미노산 또는 이와 같은 아미노산의 동족체일 수 있다. 글루타메이트 이외의 아미노산의 동족체는 단백질 상에서 아미노산에 대해 동등한 효과를 지니는, 화합물의 동족체로 이해될 것이다. 통상의 특수한 화합물은 미국 및 유럽 페이턴트인 매뉴얼 및 특허 건에 있어서의 시행 규칙: 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 특허 기술: 개질된 특수 아미노산에 설정된 것들이다.
바람직하게는 단백질은 아미노산 서열 XGDDKPGA(여기서, X는 글루타메이트 이외의 아미노산이다)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는 단백질은 아미노산 서열 TPXGDDKPGA를 포함하며 바람직하게는, 열안정성을 위해, X는 아스파르트산, 프롤린 또는 글리신 이외의 아미노산이며, 더욱 바람직하게는 트립토판, 발린, 류신, 이소류신 또는 아스파라긴이나, 가장 바람직하게는 리신 또는 아르기닌, 또는 이들의 특정의 동족체이다.
일부 종이 상기 보존된 TPXGDDKPA 영역내에 1개 또는 2개의 상이한 아미노산을 갖는 루시퍼라제를 지닐수 있다는 사실은 인지될 것이지만, 본 발명에서는 상기 서열내 세 번째 위치에서의 아미노산이 글루타메이트가 아닌 정도로 변경된 루시퍼라제에 상응하는 모든 활성 단백질을 제공한다.
본 발명의 바람직한 형태로서, 본 발명의 단백질은 또한 EP 0524448 A에 기술된 바와 같이, 루시올라 반딧불이 루시퍼라제의 아미노산 217번 또는 포티누스 피랄리스의 아미노산 215번에 상응하는 위치의 아미노산이 소수성 아미노산, 바람직하게는 이소류신, 류신 또는 발린으로 변화된 아미노산을 지닌다. 이와 같은 변화는 354번 아미노산만이 변하는 것보다 열안정성을 증가시킴이 밝혀졌으며; 따라서 2개의 변화는 실질적으로 서로 독립적이며 함께 사용될 수 있다는 효과를 지닌다.
본 발명의 두 번째 측면에서는, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA가, 본 발명의 세 번째 측면에서는 본 발명의 단백질을 발현할 수 있는 형태로서의 luc 유전자(이 유전자는 루시퍼라제를 암호화한다)를 포함하는 벡터, 특히 플라스미드가 제공된다. 이와같은 형태는, 벡터가 미생물 숙주 세포내에 도입되는 경우, 경우에 따라 적합한 유도제를 첨가함에 의해, 필요한 단백질이 용이하게 발현될 수 있도록 하는, 본 발명의 단백질의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 포함하는 형태이다.
포티누스 피랄리스, 루시올라 민그렐리카, 루시올라 크루시아타 및 루시올라 라테랄리스의 경우 luc 유전자는 모두 공지되어 있으며 표준 분자 생물학 기술로 분리할 수 있다. 포티누스 피랄리스 luc 유전자는 플라스미드 pGEM으로서업자(Promega)로부터 구입할 수 있다. 따라서 본 발명의 DNA를 생산하기 위한 출발 물질을 유도하기 위한 통상의 방법 및 공급원은 (i) 천연적으로 존재하는 반딧불이 게놈성 DNA의 사용 및 이로부터 예를 들면, PCR을 사용한 luc 유전자의 증폭, (ii) pGEM 및 (iii) 가지야마 및 나카노(Kajiyama & Nakano)의 pGLf37 플라스미드이다. 또한, 루리퍼라제 활성 즉, 발광하에 루시페린을 산화시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 또한 DNA를 수득하기 위한 출발 물질 및 궁극적으로는 유전자 발현을 통한, 본 발명의 단백질에 대한 적합한 공급원일 수 있다.
본 발명의 DNA를 수득하기 위하여 야생형 또는 다른 luc 유전자 DNA를 증폭시키는데 사용하기 위한 적합한 벡터는 DNA를 포함할 수 있으며 천연적으로 존재하는 글루타메이트의 다른 아미노산으로의 변경이 수행된 특정의 벡터일 것이다. 화학적으로 유도된 돌연변이 유발, 즉 하이드록실아민과 같은 제제를 사용하는 경우, 이는 특히 중요하지는 않으며 돌연변이 유발 방법을 수행하기 전 및 후에 유전자를 용이하게 증폭시킬수 있는 당해 분야의 숙련가는 많은 적합한 벡터를 알고 있을 것이다.
상기 글루타메이트에서 luc 유전자를 특수하게 돌연변이시킴이 바람직할 수 있으므로 부위 지시된 돌연변이 유발 공정이 요구될 것이다. 이와같은 공정은 벡터내에서 가장 용이하게 수행될 수 있으며 이것은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있을 것이다.
야생형 및 공지된 유형의 luc 유전자 및 본 발명의 luc 유전자를 발현하기에 적합한 벡터는 pKK223-3, pDR540(Boehringer Mannheim에서 시판) 및 pT7-7을 포함하며; pKK223-3 및 pDR540은 락토즈 리프레서의 조절하에서 tac 프로모터를 지님으로써 이소프로필-티오갈락토시드(IPTG)의 존재하에 발현이 유도되도록 한다. pT7-7은 T7-RNA 폴리머라제 프로모터에 의해 조절되므로 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 이. 콜라이(E. coli) 세포내에서 유전자를 매우 높은 수준으로 발현시키기 위한 기초를 제공한다. 이들 벡터에 있어 발현은 luc 유전자가 pT7-7 벡터내로 삽입된 경우에 가장 최상임이 밝혀졌다.
pKK223-3 및 pDR540 내로 삽입된 luc 유전자로부터 루시퍼라제의 발현은 야생형 N-말단 서열 루시퍼라제의 발현을 초래하는 반면 pT7-7내로 삽입된 luc 유전자로부터의 발현은 외부 N-말단 아미노산인 M-A-R-I-Q를 지닌 융합 단백질의 합성을 가져온다. luc 유전자가 존재하는 벡터(작제물 pPW204, pPW116 및 pPW304로 명명) 각각에 있어 luc 유전자의 출발 코돈과 리보소옴 결합 부위는 실시예의 표 1에 나타나 있다.
본 발명의 세 번째 측면은 본 발명의 단백질을 발현할 수 있는 세포; 이러한 세포를 사용한 상기 단백질의 제조 방법 및 본 발명의 단백질을 포함하는 시험 키트 및 시약을 제공하는 것이다. 또한 당해 분야에 공지된 바와 같은 루시페린/루시퍼라제 시약을 사용하여 ATP를 측정하는 검정 방법에서 루시퍼라제가 본 발명의 단백질임을 특징으로하는 검정 방법이 제공된다. 본 발명의 루시퍼라제 제제는 야생형 및 재조합 야생형 루시퍼라제와 비교하여 30 내지 70℃, 특히 37 내지 60℃ 및 바람직하게는 40 내지 50℃에서 비교적 열안정성을 가진다.
세포 자체의 DNA내 또는 세포내에 포함된 플라스미드와 같은 벡터내의 DNA서열을 사용하여 이종 단백질을 발현할 수 있는 어떠한 세포도 본 발명의 단백질을 발현시키는데 사용할 수 있다. 이와같은 세포의 대표적인 것은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 효모 및 세균 세포일 것이나, 단백질 발현 목적에 적합한 다른 많은 숙주 유기체가 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 단백질이 곤충 단백질이므로, 곤충 세포가 바람직할 수 있다. 단백질은 천연의 및 공지된 재조합 루시퍼라제와 구조가 유사한 단백질로서 발현될 수 있거나, 다른 아미노산, 펩타이드, 단백질 또는 다른 화학적 물질, 예를 들어 상기 M-A-R-I-Q 서열과의 융합체 또는 접합체로서 발현될 수 있다.
당해 분야의 숙련가들은, 특정의 숙주가 특수한 코돈 선호성을 지닐 수 있으므로, 예를 들어 일부 경우 세균이 효모와는 상이한 코돈을 사용하므로 이와 같은 숙주내로 도입된 DNA가 유리하게 변형되어 이러한 숙주내에서 더욱 잘 발현될, 주어진 아미노산에 대한 변성 코돈을 제공할 수 있음을 인지할 것이다. 이와같은 변성된 DNA는 본 발명의 DNA의 영역에 포함된다.
이. 콜라이 BL21(DE3)은 적합한 숙주중 하나이며 유도성 lacUV5 프로모터의 조절하에 자체의 염색체내로 안정하게 통합되는 T7 RNA 폴리머라제를 지니므로 pT7-7 기원한 작제물과 혼화성이다. BL21과 같은 이.콜라이 B 균주에는 lon프로테아제와 ompT 외막 프로테아제가 결실되어 있다. 이러한 결실은 이.콜라이내에서 외부 단백질의 발현 및 축적을 안정화하는데 도움을 줄 수 있다. 상술한 3개의 발현 작제물 각각을 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3)의 조 추출물의 검정은 루시퍼라제의최고 수준의 발현이 작제물 pPW304를 포함하는 세포로부터 수득됨을 나타낸다(표 2 참조).
본 발명의 돌연변이체 단백질은 열안정성 이외의 장점을 제공한다. 포티누스 354번/루시올라 356번 위치에서 아미노산의 돌연변이는 글루타메이트를 치환한 아미노산 또는 동족체에 따라 루시페린의 산화시 발광 파장을 변화시킴이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 단백질 산물을 사용한 루시페린 산화의 경우 광의 특정 파장으로서 정체(identity)를 알려주는 리포터 유전자(reporter gene) 또는 특이한 결합제 표지로서 사용하기 위한 루시퍼라제를 제공하며; 이와 같은 특성은 글리신, 프롤린 및 아스파르테이트와 같은 돌연변이에 대한 용도를 제공한다. 증가된 열안정성에 기원하는, 본 발명의 단백질의 추가의 장점은 하기 예시되는 바와 같이, 고온, 예를 들어 37℃ 이상의 온도에서 상응하는 증가된 수율로 이를 제조할 수 있다는 점이다.
이제 본 발명의 단백질, DNA, 벡터 및 세포는 하기 비-제한적인 실시예, 도면, 표 및 서열 리스트를 참조로 하여 기술될 것이다. 추가의 단백질, 이러한 단백질의 접합체, DNA, 벡터 및 세포와 이들중 어느것을 도입하는 검정 및 시험 키트는 이 분야에 해박한 당해 분야의 숙련가에게서 생각되어질 수 있을 것이다.
실시예 1: 본 발명의 DNA를 포함하는 플라스미드의 제조
플라스미드 pKK223-3 및 pDR540을 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)으로부터 입수했는데, pDR540은 또한 파마시아(Pharmacia)로부터 입수가능하다.
플라스미드 pT7-7(참조: Molecular Biology Vol II Section 16.2.1의 현 프로토콜)을 매사추세츠주 02115 보스톤 소재의 하바드 의과대학 생화학 부의 스탄타보(Stan Tabor)로부터 입수했고 도 8에 나타난 바와 같이 T7 RNA 폴리머라제 프로모터Ψ10 및 pT7-5의 PvuII 및 ClaI 부위 사이에 삽입된 T7 유전자 10 단백질(T7 bp 22857 내지 22972)에 대한 해독 개시 부위를 포함한다. 5' 말단 필링(filling) 후 융합 단백질을 생성하기 위한 유일한 제한 부위는 프레임 0에서는 EcoR1이고; 프레임 1에서는 NdcI, SmaI 및 ClaI이며; 프레임 2에서는 BamHI, SalI 및 HindIII이다. 원래의 폴리링커의 SacI 부위는 결실에 의해 제거되며 추가의 XbaI 부위는 개시 코돈의 상부 스트림에 제공된다.
반딧불이 루시퍼라제(제품 번호 L9009인 결정성 현탁액으로부터 제조), 조효소 A 및 ATP를 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)로부터 입수했고 딱정벌레(beetle) 루시페린 칼륨 염은 프로메가(Promega)로부터 입수했다. 세포 추출물을 프로메가 기술 공보 제101호에 기술된 바와 같이 제조했다. 이. 콜라이 배양물의 분취량을 세포 배양 분해 시약(25mM 트리스-포스페이트, pH7.8, 2mM DTT, 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 2.5mg/ml BSA, 1.25mg/ml 라이소자임)중에서 10분간 실온에서 분해한 후 검정 전에 빙상에 저장했다.
세포주의 루시퍼라제 활성은 콜로니를 나일론 여과기(Hybond N, Amersham 제조원)에 이전시킨 다음 이 여과기를 100mM 나트륨 시트레이트 완충액 pH5.0중 0.5mM 루시페린과 함께 침지시킴에 의해 이로부터 방사되는 생발광을 모니터함으로써 검정했다[참조: Wood & DeLuca, (1987) Anal Biochem 161 p501-507]. 시험관내 루시퍼라제 검정은 25℃에서 125㎕의 검정 완충액(20mM 트리신, 1nm MgSO4, 0.1mMEDTA, 33.3mM DTT, 0.27mM 조효소 A, 0.47mM 루시페린, 0.53mM ATP 및 1 내지 2㎕의 샘플)을 사용하여 수행했다. 검정 칵테일의 최종 pH는 7.8이며 광은 BioOrbit 1250 광도계를 사용하여 측정했다.
DNA의 비-특이적인 화학 돌연변이체를 제조하기 위하여, luc 유전자를 포함하는 플라스미드를 문헌[참조: Kironde et al(1989) Biochem. J. 259, p421-426]의 방법에 따라 0.8M 하이드록실아민, 0.1mM 나트륨 포스페이트(pH6.0)중 1mM EDTA를 사용하여 65℃에서 2시간 동안 처리했다. 돌연변이유발된 플라스미드를 G60 DNA 등급 닉(Nick) 칼럼(Pharmacia 제조원) 상에서 탈염시킨 다음 이. 콜라이 BL21(DE3)내로 형질전환시켰다.
열 불활성화 연구는 루시퍼라제 활성을 갖는 조 세포 추출물을 다양한 온도에서 20분간 항온처리하고 잔류하는 활성을 측정함으로써 수행했다. 시그마로부터 입수한 정제된 루시퍼라제를 사용한 연구에서는 효소를 불활성화 전에 프로메가 분해 완충액 중에 희석시켰다. 시간 의존성 연구를 위해 분해 완충액중 조 세포 추출물 또는 시그마 루시퍼라제 50㎕를 포함하는 에펜도르프 튜브를 37℃에서 항온처리했다. 다양한 시간에서 튜브를 제거하고 검정전에 빙상에서 냉각시켰다. 잔류하는 활성은 원래 활성의 %로서 나타냈다.
각각의 작제물 pPW204, pPW116 및 pPW304로부터의 루시퍼라제의 상대적 발현 수준은 이. 콜라이 BL21(DE3)으로부터의 0.1:0.5:1.0이다. 세포를 LB 배지중 37℃에서 OD600이 0.3이 될 때까지 증식시키고 IPTG로 유도하여 4시간 동안 계속 증식시킨 후 조 추출물을 제조하여 루시퍼라제 활성을 측정했다.
[표 1]
실시예 1에서 사용된 발현 작제물중 리보소옴 결합 부위(밑줄 부분) 및 개시 코돈
글루타메이트를 다른 아미노산으로 전환시키기 위한 부위 지시된 돌연변이 유발은 하기 프로토콜을 사용하여 수행했다. 글루타메이트에서 리신으로의 돌연변이는 유일한 AvaI 제한 부위내에 존재하여, 이를 파괴시키기 때문에, 돌연변이 유발원 및 선별 올리고뉴클레오타이드로써 단일의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 가능하다.
부위 지시된 돌연변이유발 프로토콜:
선별한 플라스미드를 변성시키고 리신에 대한 선별/돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드 즉, 5'-CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG-3'(여기서 밑줄친 T는 미스매치된 부분이다)를 사용하여 어닐링시킨다. 돌연변이체 DNA 쇄를 합성하고 연결하여 전체를 AvaI으로 제1 제한 분해했다.
세포 즉, 이. 콜라이 BMH 71-18 mut S 세포내로의 형질전환은 Bio-Rad Gene Pulser version 2-89를 사용하여 수행했다. 수거한 세포와 돌연변이된 플라스미드와 모 플라스미드를 포함하는 정제된 혼합된 플라스미드 혼주물이 수득되었고 AvaI을 사용하는 제2 제한 분해를, 이. 콜라이 JM109 세포내로 형질전환시키기 전에 수행했다. 이 세포를 선별 배지(LB 한천 + 50㎍/ml 암피실린) 상에 플레이팅하고 클론의 플라스미드 DNA를 정제하고 AvaI 제한 부위의 상실을 분석함으로써 클론을 선별했다. 각 경우 플라스미드 DNA는 문헌[참조: Birnboim and Doly(1979) Nucleic Acids Research 7, p1513]의 알칼라인 분해법을 사용하여 정제했다. 상세한 프로토콜은 클론테크 래보라토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories Inc, 미국 소재)의 카탈로그 번호 K1600-1에 의해 시판되는 TransformerRTM부위-지시된 돌연변이 유발 키트(Version 2) 내에 기술된 바와 같다.
파마시아 pDR540으로부터 기원한 pPW116의 변이체인, pPW601a 및 Xho 부위가 파괴된 pGEM-luc로부터의 BamH1/Sst1 단편은 도 4에 나타나 있다. 부위 지시된 돌연변이 유발은 상술한 바와 같이 및 여기에 삽입된 야생형 포티누스 luc 유전자를 서열확인번호 1(여기서, 1063 내지 1065는 AAG이다)에 나타낸 바와 같은 서열로 전환시키는 클론테크 지침에 기술된 바와 같이 수행하여, 서열확인번호 2에 나타낸 바와 같이 354번 위치에서 리신으로 변형된 아미노산 서열의 발현된 단백질을 수득했다.
실시예 2: 루시퍼라제의 열 안정성
상술한 바와 같이 제조된 이. 콜라이내 벡터중 본 발명의 변형된 luc 유전자 및 변형되지 않은 luc 유전자에 의해 발현된 다양한 루시퍼라제의 열 안정성을 측정하고 이 결과를 도 5 내지 8에 나타낸다.
50mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH7.8, 1mM EDTA, 0.2%(w/v) BSA, 1mM DTT 및 10% 암모늄 설페이트중 43.5℃에서의 50㎍/ml 루시퍼라제의 활성의 t1/2(반감기)의 비교는 다음과 같은 시간에 도달할 때 50% 잔류 활성을 나타낸다.
시그마 야생형 루시퍼라제: 대략 1.5분 후에 t1/2에 도달
pPW601 (354 = 글루타메이트): 대략 5분 후에 t1/2에 도달
pPW601ak(354 = 리신): 대략 30분 후에 t1/2에 도달.
상술한 기술에서 명백해지는 바와 같이 354번 글루타메이트를 리신으로 대체함에 의해 루시퍼라제의 열 안정성이 적어도 43.5℃까지 증가한다.
실시예 3: 루시퍼라제의 열 안정성
실시예 1에 기술한 바와 유사한 방법에 의해 제조된 이. 콜라이내 벡터중 본 발명의 다른 354번 위치 돌연변이에 상응하는 SDM 변형된 luc 유전자에 의해 발현된 다수의 루시퍼라제의 열 안정성을 측정하고 이 결과를 도 10에 그래프적으로 나타낸다.
프로메가 분해 완충액중 40℃에서의 t1/2의 비교를 수행하고 분으로 나타낸t1/2로 수득한 결과는 다음과 같다:
실시예 4: 37℃ 및 실온에서 루시퍼라제의 안정성
pPW601K 리신 돌연변이체(86ng/ml), 재조합 야생형(550ng/ml) 및 천연형(시그마 제조원)(62.5ng/ml)의 루시퍼라제를 1% BSA, pH7.75 HEPES 완충액중 37℃에서4시간 동안 방부제로서의 0.02% 아지드와 함께 항온처리했다. 잔류 활성을 측정하기 위해 1ng의 루시퍼라제를 D-루시페린 기질에 가하고 분당 발광 수를 기록했다.
37℃에서 2시간 및 실온에서 10일간 항온처리한 후 잔류하는 활성 측면에서의 결과를 하기에 나타낸다.
37℃에서 2시간 후:
실온에서 10일 후:
실시예 5: 354K:215L 이중 돌연변이체의 제조 및 안정성
포티누스 피랄리스 루시퍼라제 pPW601a의 이중 돌연변이체 354 리신: 215 류신은 실시예 1에 기술한 바와 같이 pPW601aE354K를 취하고 이를 서열확인번호 4 '미스매치를 나타낸다)의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 돌연변이시킴에 의해 제조했다. 상기 돌연변이는 DNA 서열 분석으로 확인했고 실시예 1에 기술된 것과 유사한 방법에 의해, 이. 콜라이내에서 발현된 것으로서 수득된 루시퍼라제의 열안정성의 측정은 실시예 2 내지 4에서와 같이 열 불활성화 매질로서 1mM EDTA, 0.2%(w/v) BSA, 1mM DTT 및 10% 암모늄 설페이트를 포함하는 pH7.8 포스페이트 완충액을 사용하여 수행했다.
포스페이트 완충액중 43.5℃에서 32분에 걸쳐 활성의 상실은 5% 미만인 반면, 47℃에서 t1/2는 대략 38분이었다. 50℃에서 이중 돌연변이체는 16분간의 항온처리후 15%, 활성을 지녔다. 이러한 불활성화 시험 결과는 도 12에 그래프적으로 나타낸다.
실시예 6: 루시퍼라제의 정제
재조합체 야생형 또는 돌연변이체 루시퍼라제를 발현하는 이. 콜라이 JM109 를 50㎍/ml 암피실린을 포함하는 루리아 브로쓰(LB)중 30℃에서 증식시키고 초기 대수기 동안 IPTG(1mM)로 유도시켰다. 세포를 중기 정상기에서 수거하고 50mM KCl, 1mM 디티오트레이톨, 1.2mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 및 1mM EDTA(완충액 A)를 포함하는 50mM 트리스-HCl pH8.0 중에 재현탁했다. 세포를 MSE soniprep 150 초음파기(증폭 14μ)내에서 파괴시켜 분해하고 세포 분해물을 30000xg에서 30분간 원심분리했다. 다음, 조 추출물의 상층액을 암모늄 설페이트로 분획화한 결과 35% 내지 55% 포화에서 침전된 분획이 루시퍼라제 활성을 포함하며 완충액 A 중에 용해됨이 밝혀졌다.
추출물을 0.5mM DTT(완충액 B)를 포함하는 50mM 트리스-HCl pH8.0 중에서 평형화시킨 파마시아 PD10 칼럼을 사용하여 탈염시키고 탈염된 추출물을 파마시아 모노 Q 양이온-교환 칼럼에 적용시키고 2ml 분획중 4ml/분의 유동 속도에서 완충액 B중 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출했다. 루시퍼라제 활성의 피크 분획을 수집하고 장기간 저장을 위해 0.5mM DTT 및 12%(v/v) 글리세롤을 포함하는 25mM 나트륨 포스페이트 완충액에 대해 투석했다.
실시예 7: 정제된 루시퍼라제의 열 불활성화
루시퍼라제의 세포 유리된 추출물을 포함하는 에펜도르프 튜브를 실시예 6에서 기술한 바와 같이 제조했다. 루시퍼라제(50㎍/ml)의 정제된 제제를 10% 포화된 암모늄 설페이트, 1mM 디티오트레이톨 및 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 50mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.8을 포함하는 열안정성 완충액 중에서 항온처리 했다. 정해진 시간에 튜브를 제거하고 검정전에 얼음/물 욕 중에서 냉각시켜 잔류하는 검정된 활성을 초기 활성의 %로써 계산했다.
정제된 재조합체 야생형 및 열안정성 루시퍼라제에 대한 아레니우스 플롯은 42℃ 내지 50℃ 범위의 온도에 걸쳐 열안정성 완충액 중에서 불활성화에 대한 반감기를 측정함으로써 구성되었다. 다음, 분당 t1/2의 자연 로그를 1/K에 대해 플로팅했다. 동등한 불활성화율에 대해 상기 범위의 온도에서 A215L 돌연변이체의 경우 열안정성이 5℃가 증가되고 이중 돌연변이체 E354K+A215L의 경우 6℃가 증가되는 경우와 비교하여 E354K 돌연변이체에서는 열안정성을 2℃까지 증가시키며, 여기서 E354K+A215L의 경우는 이중 돌연변이체의 추가된 특성을 나타낸다.
실시예 8: 이. 콜라이내 야생형 재조합체 루시퍼라제와 비교한 돌연변이체 루시퍼라제의 증가된 발현
이. 콜라이 JM109 세포내에서의 루시퍼라제의 발현을 37℃에서 액체 배양으로 증식하는 동안 모니터했다. 열안정성 돌연변이체를 발현하는 세포는 재조합체 야생형 효소를 발현하는 세포 보다 증식하는 동안 더욱 활성인 루시퍼라제를 축적시킴이 밝혀졌다. 도 13은 재조합체 야생형, E354K+A215L 이중 돌연변이체 및 E354K의 배양물에 대해 600nm에서 광학 밀도를 증가시키면서 루시퍼라제 활성을 플로팅한 경우 상기 효과를 그래프로 나타낸다. 단일 및 이중 돌연변이체의 증가된 열안정성은 37℃의 배양 온도에서 루시퍼라제의 생산을 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 9: 37℃에서 돌연변이체 루시퍼라제의 안정성에 대한 완충액의 효과
A215L, E354K, E354+A215L, 재조합 야생형 및 시그마 루시퍼라제 각각의 10ng/ml 용액을, 1% BSA 및 0.02% 아지드를 포함하는 HEPES pH7.75 완충액중에 제조하고 37℃에서의 열안정성을 2mM EDTA 및 2mM DTT를 첨가한 동일한 조성물의 것과 비교했다. 도 14 및 도 15에 그래프적으로 나타낸 결과는 A215L 및 E354K의 상대적인 안정성이 37℃에서 완충액에 따라 변함을 나타낸다.
실시예 10: D-루시페린 산화시의 발광 파장에 있어 아미노산 치환의 효과
실시예 3에 설정한 본 발명의 각종 루시퍼라제를 사용한 D-루시페린의 산화시의 발광 파장을 측정한 결과 아미노산 돌연변이에 따라 변함이 밝혀졌다. 발광 파장은 재조합체 야생형(E354)과 E354K 사이에서는 5nm 변했고, E354K와 E354I 사이에서는 약 15nm 변했다.
야생형 돌연변이체 이. 콜라이 유기체는 D-루시페린의 존재하에서 황녹색 발광을 나타낸다. D-루시페린을 사용한 경우 각각의 돌연변이체 이. 콜라이에 의해 방사된 색상은 하기와 같다:

Claims (28)

  1. 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제의 354번 잔기 또는 루시올라 민그렐리카(Luciola mingrelica), 루시올라 크루시아타(Luciola cruciata) 또는 루시올라 라테랄리스(Luciola lateralis) 루시퍼라제의 356번 잔기에서는 X가 글루타메이트 잔기인 아미노산 서열 XGDDKPGA를 포함하고, 상기 서열에서 잔기 X에 상응하는 아미노산 잔기가 리신, 아르기닌, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린, 트립토판, 알라닌 및 티로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산임을 특징으로 하는, 반딧불이(firefly)로부터의 루시퍼라제의 돌연변이형인 루시퍼라제 활성을 가지는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, X가 리신, 아르기닌, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린, 트립토판, 알라닌 및 티로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산인, 아미노산 서열 TPXGDDKPGA를 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 X가 트립토판, 발린, 류신, 이소류신 및 아스파라긴으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 X가 리신 또는 아르기닌임을 특징으로 하는 단백질.
  5. Xaa가 제3항 또는 제4항에 나열된 바와 같은 아미노산인, 서열확인번호 2에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  6. 제1항에 따른 단백질을 암호화하는 DNA.
  7. 제6항에 있어서, 1063 내지 1065에서의 3개의 염기 N이 리신, 아르기닌, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린, 트립토판, 알라닌 및 티로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 암호화하는 코돈을 형성하는, 서열확인번호 1에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA.
  8. 제7항에 있어서, 상기 코돈이 제3항 또는 제4항에 나열된 바와 같은 아미노산을 암호화하는 DNA.
  9. 제1항에 따른 단백질을 암호화하는 luc 유전자를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 야생형 또는 재조합 luc 유전자를 포함하는 벡터를 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 처리하여 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 354번 위치에서의 글루타메이트 또는 루시올라 민그렐리카, 루시올라 크루시아타 또는 루시올라 라테랄리스 루시퍼라제의 356번 위치에서의 글루타메이트를 암호화하는 코돈을리신, 아르기닌, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린, 트립토판, 알라닌 및 티로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환시킴으로써 수득할 수 있는 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 치환된 아미노산이 제3항 또는 제4항에 나열된 바와 같은 아미노산인 벡터.
  12. 제9항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, luc 유전자가 연결된 pKK223-3, pDR540 및 pT7-7로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터.
  13. 제6항에 따른 DNA 또는 제9항에 따른 벡터를 포함하고 제1항 또는 제2항에 따른 단백질을 발현할 수 있는, 효모, 세균 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포.
  14. 제13항에 있어서, 이. 콜라이(E.coli), 에스, 세레비지애(S.cerevisiae) 또는 곤충 세포인 세포.
  15. 발광성 시약내에 포함된 제1항 또는 제2항에 따른 단백질을 포함함을 특징으로 하는, ATP의 측정을 통한 검정을 수행하기 위한 시험 키트.
  16. 루시퍼라제가 제1항 또는 제2항에 따른 단백질임을 특징으로 하는, 루시페린 및 루시퍼라제를 사용하여 ATP의 양과 관련된 양의 광을 생성시킴으로써 ATP를 측정하는 검정 방법.
  17. 제16항에 있어서, 검정을 30℃ 내지 70℃의 온도에서 수행하는 검정 방법.
  18. 제16항에 있어서, 검정을 37℃ 내지 60℃의 온도에서 수행하는 검정 방법.
  19. 제16항에 있어서, 검정을 40℃ 내지 50℃의 온도에서 수행하는 검정 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 특이적 결합 시약을 표지하기 위한 단백질.
  21. 제1항 또는 제2항에 따른 단백질로 표지된 특이적 결합 시약을 포함함을 특징으로 하는 시험 키트.
  22. 제6항에 있어서, 세포 또는 DNA의 정체(identity)를 알아내기 위한 DNA.
  23. 제9항에 있어서, 세포 또는 DNA의 정체(identity)를 알아내기 위한 벡터.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 215번 잔기 또는 루시올라 민그렐리카, 루시올라 크루시아타 및 루시올라 라테랄리스 루시퍼라제의 217번 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 소수성 아미노산임을 추가의 특징으로 하는 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 소수성 아미노산이 이소류신, 류신 또는 발린중의 하나인 단백질.
  26. Xaa가 제3항 또는 제4항에 나열된 바와 같은 아미노산인, 서열확인번호 5에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  27. 제24항에 따른 단백질을 암호화하는 DNA.
  28. 제27항에 있어서, 1063 내지 1065에서의 3개의 염기 N이 리신, 아르기닌, 류신, 이소류신, 아스파라긴, 발린, 트립토판, 알라닌 및 티로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 암호화하는 코돈을 형성하고, 위치 646 내지 648에서의 3개의 염기가 소수성 아미노산을 암호화하는 코돈을 형성하는, 서열확인번호 1에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA.
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