JP6811173B2 - 増強された発光を産生するために赤外発光基質を活用するルシフェラーゼ配列 - Google Patents
増強された発光を産生するために赤外発光基質を活用するルシフェラーゼ配列 Download PDFInfo
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- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2014年9月11日に出願された、米国仮特許出願第62/049,150号の優先権を主張する。
を含んでよい。CBR変異体ポリペプチドの発光は、配列番号1のCBRポリペプチドと比較して、少なくとも2倍増加し得る。CBR変異体ポリペプチドの発光は、配列番号1のCBRポリペプチドと比較して、少なくとも4倍増加し得る。CBR変異体ポリペプチドは、配列番号1のCBRポリペプチドと比較して、変化した放出光スペクトルを有し得る。CBR変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにCBR変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。CBR変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにCBR変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。ルシフェリン誘導体は、
を含んでよい。ルシフェリン誘導体が、
を含む場合、CBR変異体ポリペプチドは、配列番号1のCBRポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約1nm〜少なくとも約100nmのスペクトル最大のシフトを有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、約650nm〜約800nmの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、約725nm〜約775nmの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、約750nmでスペクトル最大を有する光を発し得る。ルシフェリン誘導体が
を含む場合、CBR変異体ポリペプチドは、配列番号1のCBRポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約1nm〜少なくとも約100nmのスペクトル最大におけるのシフトを有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、配列番号1のCBRポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約75nmのスペクトル最大のシフトを有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、約650nm〜約800nmの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、約700nm〜約775nmの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、約725nmでスペクトル最大を有する光を発し得る。CBR変異体ポリペプチドは、配列番号1のCBRポリペプチドと比較して、変化した基質特異性を有し得る。CBR変異体ポリペプチドは、ルシフェリン誘導体と比較して、ルシフェリンの存在下で該CBR変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有し得る。CBR変異体ポリペプチドは、異なるルシフェリン誘導体と比較して、あるルシフェリン誘導体の存在下で該CBR変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有し得る。ルシフェリン誘導体は、
を含んでよい。変異体CBRポリペプチドは、ルシフェラーゼ活性を有し得る。変異体CBRポリペプチドは、少なくとも約0.01μM〜少なくとも約5.00μMのPBI−4813に対するKmを有し得る。変異体CBRポリペプチドは、少なくとも約0.50μM〜少なくとも約3.00μMのPBI−4813に対するKmを有し得る。変異体CBRポリペプチドは、少なくとも約0.82μMまたは2.41μMのPBI−4813に対するKmを有し得る。変異体CBRポリペプチドは、少なくとも約0.01μM〜少なくとも約5.00μMのPBI−4739に対するKmを有し得る。変異体CBRポリペプチドは、少なくとも約1.50μM〜少なくとも約4.50μMのPBI−4739に対するKmを有し得る。変異体CBRポリペプチドは、少なくとも約2.33μMまたは3.95μMのPBI−4739に対するKmを有し得る。変異体CBRポリペプチドは、PBI−4813を基質として使用して、配列番号1のCBRポリペプチドの相対的Vmaxよりも少なくとも2倍高い相対的Vmaxを有し得る。変異体CBRポリペプチドは、PBI−4739を基質として使用して、配列番号1のCBRポリペプチドの相対的Vmaxよりも少なくとも2倍高い相対的Vmaxを有し得る。配列は、コドン最適化されていてよい。配列は、配列番号6〜9のポリヌクレオチドを含んでよい。ポリヌクレオチドは、CBR変異体ポリペプチドに連結した目的のポリペプチドをさらにコードしてよく、該目的のポリペプチド及び該CBR変異体ポリペプチドは融合タンパク質として発現することができる。目的のポリペプチドは、HALOTAG(登録商標)を含んでよい。
を含んでよい。
(a)
及び
(b)緩衝液試薬のうちの少なくとも1つをさらに含んでよい。
を含んでよい。
を含む、ルシフェリン誘導体である。酵素活性は、生存しているインタクトな非ヒト動物において測定されてよい。
の改変体であってよい。目的の非発光酵素は、プロテアーゼ酵素、シトクロムP450酵素、モノアミン酸化酵素、またはグルタチオンS−転移酵素であってよい。非発光酵素の活性は、生存しているインタクトな動物において測定されてよい。
と接触させること、ここで該試料は、第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで該第一の融合タンパク質は、発光酵素の第一の断片及び第一のタンパク質を含む;及び、第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここで該第二の融合タンパク質は、該発光酵素の第二の断片及び第二のタンパク質を含む;ならびに該試料中の発光を検出することを含む。発光の検出は、第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を示し、該発光酵素は、上記の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる。第一のタンパク質及び第二のタンパク質が相互作用するとき、発光酵素の第一の断片及び発光酵素の第二の断片は、細胞透過性基質と安定的に結合することができる完全長酵素を再構成し得る。
試料を、
と接触させること、ここで該試料は、第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで該第一の融合タンパク質は、発光酵素及び第一のタンパク質を含み、該発光酵素は、請求項1〜46のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる;及び、第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここで該第二の融合タンパク質は、蛍光受容体分子及び第二のタンパク質を含む;ならびに(b)該試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出することを含み、これは生物発光ドナー及び蛍光受容体の相互作用または近接を示す。
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、通常当業者により理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本書類が優先されるだろう。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと類似または同等である方法及び材料が本発明の実践または試験において使用されることができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示する材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図しない。
本開示は、ルシフェリン及びルシフェリン誘導体を活用し、より長い近IR(NIR)波長シグナルを産生するクリックビートル赤色ルシフェラーゼ(CBR)の変異体を提供する。本明細書に記載の様々な技術を使用して、拡張コンジュゲーションルシフェリンによってより高輝度の光出力を産生するようにCBRを進化させ、改善された合成CBRポリペプチドを産生するためのアミノ酸置換の部位を同定した。1つまたは複数のアミノ酸置換を、単独でまたは様々な組み合わせで作成することが、増強された発光(例えば、増強された輝度)及びより長い波長の放出を有する合成CBR型ポリペプチドを産生することが見出された。本発明のCBR変異体またはその融合体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドまたはCBR変異体もしくはその融合体を有する単離された宿主細胞、ならびに本発明のポリヌクレオチド、CBR変異体もしくはその融合体または宿主細胞を使用する方法も提供する。
CBR変異体の発光の増強は、以下の特徴:光出力(すなわち輝度)の増強、基質特異性の向上、シグナル安定性の向上、シグナル持続時間の向上、及び/または基質阻害に対する感度の低減の1つまたは複数に起因し得る。シグナル安定性の向上には、例えば、時間経過におけるシグナルの減衰の半減期により測定される、ルシフェラーゼからのシグナルが発光し続ける長さの増加が含まれる。「基質阻害」という用語は、本明細書で用いるとき、高濃度レベルの基質でのルシフェラーゼ酵素活性の阻害(例えば、発光の生成の阻害及びRLU値の低下)を指す。基質阻害に対する感度が低減しているCBR変異体は、基質の量が増加してもRLU値は低下しない。例えば、Kmの10倍を超える濃度でのPBI−4813は、CBR及びATG1230の活性を阻害し、ゆえに生成される発光、すなわちRLU値は低減するが、一方でATG1240は、この阻害をPBI−4813で示さず、基質阻害に対する低減した感度を有する。
CBR変異体ポリペプチドは、親CBR、例えば、配列番号1と比較して、変化した放出光スペクトルを有し得る。CBR変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにCBR変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。CBR変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにPBI−4813またはPBI−4739などのルシフェリン誘導体がCBR変異体ポリペプチドにより活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。
CBR変異体ポリペプチドは、配列番号1のCBRポリペプチドと比較して、変化した基質特異性を有し得る。CBR変異体ポリペプチドは、配列番号1のCBRポリペプチドと比較して、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体、例えば、PBI−4739またはPBI−4813への基質特異性の増減を有し得る。CBR変異体ポリペプチドは、PBI−4739またはPBI−4813などのルシフェリン誘導体と比較して、ルシフェリンの存在下でCBR変異体ポリペプチドに対して相対的特異性における増減などの変化を有し得る。CBR変異体ポリペプチドは、PBI−4739またはPBI−4813などの異なるルシフェリン誘導体と比較して、あるルシフェリン誘導体の存在下でCBR変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の増減などの変化を有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のCBR変異体は、1つまたは複数の非相同アミノ酸配列を、N末端、C末端、または両端で有し(エピトープまたは融合タグを有するものなどの融合ポリペプチド)、それは任意で直接または間接的に目的の分子と相互作用する。いくつかの実施形態では、非相同配列(複数可)の存在は、目的の分子との相互作用の前後のいずれでもCBR変異体の発光を実質的に変化させない。非相同アミノ酸配列は、任意の目的のタンパク質、例えば、RNasinもしくはRNase、及び/またはチャネルタンパク質、受容体、膜タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、リン酸化タンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体関連タンパク質、蛍光タンパク質、酵素基質、転写因子、輸送体タンパク質及び/または標的化配列、例えば、ミリスチル化(myristilation)配列、ミトコンドリア局在配列、または核局在配列であってよく、それはヒドロラーゼ断片、例えば、融合タンパク質を特定の位置に指向させる。
一度、発光活性を有するもの、もしくは別の分子に補完されて発光活性がもたらされ得るもの、または発光活性を有するその融合体などの、CBR変異体またはその断片をコードする所望の核酸分子が調製されると、CBR変異体もしくはその断片、例えば、補完のためのもの、または発光活性を有するその融合体をコードする発現カセットが調製され得る。例えば、CBR変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、転写制御配列、例えば、1つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはその組み合わせに任意で機能可能に連結されて、発現カセットを形成する。核酸分子または発現カセットは、選択可能標識遺伝子を任意で含むベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターに導入され得、該ベクターは、目的の細胞、例えば、大腸菌(E.coli)、ストレプトマイセス種、バシラス種、スタフィロコッカス種等の原核細胞、ならびに植物(双子葉類または単子葉類)、真菌(酵母、例えば、ピキア属、サッカロマイセス属またはシゾサッカロマイセス属を含む)、もしくは哺乳類細胞を含む真核細胞、それらの溶解液、またはin vitro転写/翻訳混合物に導入され得る。哺乳類細胞としては、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞、及びヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳類細胞株としては、CHO、COS、HEK293、HeLa、CV−1、SH−SY5Y、及びNIH3T3細胞が挙げられるが、これらに限定されず、多数の他の細胞株も同じく使用可能である。
本発明のCBR変異体、その機能性断片またはその融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子(ポリヌクレオチド)も提供する。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも1つの選択された宿主中での発現に最適化された核酸配列を含む。最適化された配列は、コドン最適化された配列、すなわち、別の生物、例えば、遠縁生物に対して、ある生物でより頻繁に使用されるコドン、ならびにコザック配列及び/もしくはイントロンを付加もしくは改変するため、ならびに/または望ましくない配列、例えば、潜在的転写因子結合部位を取り除くための改変を含む。そのような最適化された配列は、宿主細胞に導入された場合に、増強された発現、例えば、増加されたタンパク質発現レベルを提供することができる。最適化された配列の例は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,728,118号ならびに米国特許出願公開第2008/0070299号及び同第2008/0090291号に開示されている。
本開示は、上述のCBR変異体、及び新規ルシフェリン誘導体を含む近IR生物発光システムも提供する。CBR変異体及び新規ルシフェリン誘導体のある特定の組み合わせは、生物発光アッセイに関して、特に深部組織イメージングに関して、重大な技術的利益を提供し、それは、近IR発光が生成されるためである。本開示の発明は、深部動物組織からのシグナルの検出の向上を提供し、それは一部には、長化波長が組織により吸収されないためであり、また親CBR及び既知のルシフェリン基質よりも光放出が改善されているからでもある。加えて、他の試薬が生物発光システムに含まれてよく、それにはCBR変異体の不活性化を阻害するもしくは予防するもの、またそうでなければ発光シグナルを延長するまたは増強するものを含むがこれらに限定されない。
近IR生物発光システムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるPCT出願第PCT/US2014/021678に開示されているものなどの新規赤方偏移ルシフェリン誘導体を含み得る。例えば、ルシフェリン誘導体は、式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、または(VII)のうちの1つの化合物、またはそのプロ基質、例えば、レダクターゼ基質、グリコシダーゼ基質、プロテアーゼ及びプロテアーゼ依存性タンパク質改変基質、オキシダーゼ基質、カルボキシル系プロ基質、グルタチオン転移酵素基質、ベータ−ラクタマーゼ基質、及び他のプロ基質を含み得る。いくつかの実施形態では、新規ルシフェリン誘導体は、PBI−4739またはPBI−4813であり得る(図1;PCT出願第PCT/US2014/021678号に開示を参照されたい)。
ルシフェリン誘導体は、式(Ia)、(Ib)及び(Ic):
(Ia)
(Ib)
(Ic)
に係る化合物を含んでよく、
式中、
Xは、CNまたは
であり;
各Yは、独立して、ハロ、SO3H、C1-4アルキル、置換C1-4アルキル、OR1またはNR1R2であり;
各R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
各R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって4〜8員環を形成し;
nは、1〜6であり;
2つのY置換基は、1つに接合して5〜7個の環原子を含有する環を形成し得;
ここで、少なくとも1つのYは、OHまたはNR1R2のいずれかである。
に限定されない。
(II)
に係る化合物を含んでよく、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、OR1またはNR1R2であり;
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって環を形成する。
(III)
に係る化合物を含んでよく、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、OR1またはNR1R2であり;
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって環を形成する。
(IV)
に係る化合物を含んでよく、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、OR1またはNR1R2であり;
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって環を形成する。
(V)
に係る化合物を含んでよく、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、OR1またはNR1R2であり;
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって環を形成する。
(VI)
に係る化合物を含んでよく、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、OR1またはNR1R2であり;
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって環を形成する。
(VII)
に係る化合物を含んでよく、
式中
Xは、CNまたは
であり;
各Yは、独立して、OR1またはNR1R2であり;
各R1は、独立して、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
各R2は、独立して、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって環を形成する。
本発明は、様々な非ルシフェラーゼ酵素に対する基質であり、ルシフェラーゼ酵素に対するプロ基質である化合物も提供する。非ルシフェラーゼ酵素には、レダクターゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、シトクロムP450、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシラーゼ及びグルタチオン転移酵素が含まれるが、これらに限定されない。
(VIII)
を形成し、
式中
Xは、CNまたは
であり;
各Yは、OHまたはNH2であり;
nは、1〜3である。
いくつかの実施形態では、化合物は、レダクターゼ基質である。いくつかの実施形態では、レダクターゼ基質は、式:
(IX)
を有し、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、ORであり;
Rは、
であり;
Wは、S、NRN、またはOであり;
Zは、S、NRN、OまたはCHであり;
RNは、H、C1-4アルキル、または置換C1-4アルキルである。
(X)
を有し、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、OR1またはNR1R2である;及び
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって4〜8員環を形成する。
(XI)
を有し、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、ORであり;
Rは、
である。
を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化合物は、グリコシダーゼ基質である。いくつかの実施形態では、グリコシダーゼ基質は、式:
(XII)
の化合物であり、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、ORであり;
Rは、
であり;
Aは、ORまたはNHAcであり;
各R5は、独立して、H、単糖類または最大で40単位までのポリエチレングリコール部分である。
を含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化合物は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ依存性タンパク質改変基質である。いくつかの実施形態では、基質は、式:
(XIII)
の化合物であり、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、NHRであり;
Rは、
であり;
R7は、アミノ酸側鎖であり;
R6は、H、窒素保護基、または最大で20アミノ酸までの鎖である。
を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化合物は、オキシダーゼ基質である。いくつかの実施形態では、オキシダーゼ基質は、式:
(XIV)
の化合物であり、
式中
Xは、−CH(OR10)2であり;
R10は、C1-4アルキル、置換C1-4アルキル、ベンジル、または置換ベンジルであり;
Yは、OR1またはNR1R2である;及び
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって4〜8員環を形成する。
(XV)
の化合物であり、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、HまたはORであり;
Rは、C1-10アルキル、置換C1-10アルキル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである。
(XVI)
の化合物であり、
式中
Xは−CH(OR10)2であり;
R10は、C1-4アルキル、置換C1-4アルキル、ベンジルまたは置換ベンジルであり;
Yは、OR1またはNR1R2である;及び
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって4〜8員環を形成する。
を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化合物は、カルボキシル系プロ基質である。いくつかの実施形態では、カルボキシル系プロ基質は、式:
(XVII)
の化合物であり、
式中
R8は、CH2OH、C(O)R10または−C(O)ZR9であり;
Zは、OまたはNHであり;
R9は、C1-7アルキルまたは置換C1-7アルキルであり;
R10は、ペプチドであり;
Yは、OR1またはNR1R2である;及び
R1は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであり;
R2は、H、C1-10アルキルまたは置換C1-10アルキルであるか;または
R1及びR2は、一緒になって4〜8員環を形成する。
を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化合物は、グルタチオン転移酵素基質であってよい。いくつかの実施形態では、グルタチオン転移酵素基質は、式:
(XVIII)
の化合物であり、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、ORであり;
Rは、
であり;
各R11は、独立して、H、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、CF3、ハロゲン、NO2、CO2R12であるか、またはR11の少なくとも1つがNO2であるならば、任意の2つの隣接するR11は縮合環を形成することができ;
R12は、H、C1-6アルキルまたは置換C1-6アルキルである。
を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化合物は、ベータ−ラクタマーゼ基質である。いくつかの実施形態では、ベータ−ラクタマーゼ基質は、式:
(XIX)
の化合物であり、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、O、NH、N(C1-7アルキル)、またはN(置換C1-7アルキル)であり;
Zは、存在しないかまたはOであり;
Aは、C1-4アルキレンまたは置換C1-4アルキレンであり;
R14は、H、フェナセチル、またはセファロスポリン側鎖である。
を含むが、これらに限定されない。
本発明は、過酸化水素などの様々な生物学的に重要な小分子と反応し、ルシフェラーゼ酵素のプロ基質である化合物も提供する。いくつかの実施形態では、これらの化合物は、過酸化水素に反応性である。いくつかの実施形態では、これらの化合物は、式:
(XX)
を有し、
式中
Xは、CNまたは
であり;
Yは、L−Rであり;
Lは、リンカーであり;
Rは、ボロン酸またはホウ酸エステルである。
であり;式中、各R16及びR17は、独立して、H、C1-4アルキル、置換C1-4アルキル、CF3、フェニルまたは置換フェニルから選択されるか;またはR16及びR17は一緒になって3〜7個の炭素を有するアルキル環になることができるか、縮合6員芳香族環により置き換えられることができる。
であり;
式中
Aは、−C6(R20)4−、−O−C6(R20)4−または−(CR21=CR21)n−または−S−C6(R20)4−または−NR’−C6(R20)4または直接結合であり;
R’は、H、C1-4アルキル、または置換C1-4アルキルであり;
各R23は、独立して、ハロ、H、C1-4アルキル、置換C1-4アルキル、C1-4ヒドロキシアルキル、置換C1-4ヒドロキシアルキル、C1-4アルキルカルボン酸または置換C1-4アルキルカルボン酸であり;
各R20は、独立して、H、ハロ、CH3、OCH3、またはNO2であり、
各R21は、独立して、HまたはCH3であり;
nは、1または2であり;
Xは、−O−、
から選択される。
を含むが、これらに限定されない。
CBR変異体及び近IR生物発光システムは、ルシフェラーゼ及びルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリン及びルシフェリン誘導体が使用されている任意の方法において使用され得る。CBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、試料(細胞、組織、動物、等を含む)またはin vivoイメージングと共に使用され、様々な顕微鏡検査及びイメージング技術を使用して検出される。CBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、転写レポーターまたはバイオセンサーとして使用され得る。CBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、二色アッセイまたは多重化において使用され得る。CBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、非発光酵素などの酵素の存在または活性を検出するためのアッセイにおいて使用され得る。例えば、それらは、試料中の1つもしくは複数の分子、例えば、酵素、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素アクチベーター、またはOHラジカル、または1つもしくは複数の条件、例えば、酸化還元条件を検出するためにルシフェリンの類似体を採用する、生物発光源法において使用され得る。いくつかの実施形態では、CBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、別の分子(例えば、フルオロフォア、発色団、またはナノ粒子)へのエネルギードナーとして使用され得る。CBR変異体及び近IR生物発光システムは、タンパク質近接アッセイまたはタンパク質相補性アッセイにおいて使用され得る。本発明で開示するCBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、細胞を分析するin situ方法においても有用である。ルシフェラーゼを使用して細胞のin situ分析を実施する方法は、当該分野で既知である。本発明で開示するCBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、酵素の基質と阻害剤を区別するために使用され得る。スクリーニングは、in vitroまたはin vivoのいずれかで実施され得る。
CBR変異体及び近IR(NIR)生物発光システムは、in vivoイメージングのために使用してよく、生物発光イメージングの速度、検出限界、及び深部透過性を改善し得る。CBR変異体及び近IR生物発光システムは、様々な用途、例えば、腫瘍生物学の理解、治療可能性のある化合物の評価のための非侵襲的動物イメージングのための手段を提供する。例えば、本明細書に記載の方法は、小動物における腫瘍進行及び抗癌治療剤に対する反応の迅速及び安価な評価のために使用することができ、それには、例えば、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、画像化されることが望まれる細胞において発現されている、例えば、選択的に発現されているプロモーターまたは遺伝子に連結したルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するマウスを使用する。選択された目的のタンパク質の発現は、生存細胞または動物においてリアルタイムで画像化され得、それには、選択された目的のタンパク質をコードする核酸、または選択されたタンパク質のプロモーターにインフレームで連結されているCBR変異体をコードする核酸を含むレポーター構築物を発現する細胞またはトランスジェニック動物を使用する。
本明細書に記載の方法は、近赤外生物発光を検出できる任意のイメージングシステムで実践することができる。一般的なイメージングシステムは、Xenogen(例えば、IVIS)、Hamamatsu、Roper、及びKodakから入手可能である。
様々な実施形態では、CBR変異体は、生存細胞中の発光を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、CBR変異体は、細胞中で(レポーターまたはその他として)発現されることができ、培養物中の細胞を透過し得る、ルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、例えば、PBI−4739またはPBI−4813などの新規ルシフェリン誘導体、または機能的類似体で処理された細胞は、CBR変異体と反応し、発光を生成する。PBI−4739またはPBI−4813は、細胞毒性試験の見地から、D−ルシフェリンと匹敵する非毒性を示す。いくつかの実施形態では、培地中の未変性ルシフェリン誘導体の安定性を増加させると知られている化学修飾を含有する様々なPBI−4739またはPBI−4813は、合成され得、より強い、生存細胞CBR変異体系レポーターアッセイのために使用される。なおも他の実施形態では、本発明のCBR変異体及び/または新規ルシフェリン誘導体を含有する試料(細胞、組織、動物等を含む)は、様々な顕微鏡検査及びイメージング技術を使用してアッセイされ得る。なおも他の実施形態では、分泌可能なCBR変異体は、生存細胞レポーターシステムの一部として細胞において発現され得る。
CBR変異体及び近IR生物発光システムは、遺伝子転写レポーターシステムとして使用され得る。CBR変異体またはその断片は、発達に関与する遺伝子などの、任意のプロモーター及び/または遺伝子の転写発現パターンを試験するために使用され得る。いくつかの実施形態では、CBR変異体またはその断片は、転写制御配列、例えば、1つまたは複数エンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはその組み合わせに機能可能に連結されて発現カセットを形成することができる。例えば、CBR変異体は、最小プロモーター及びcAMP−応答エレメント(CRE)に機能可能に連結されることができる。
CBR変異体及び生物発光システムは、異なる波長で光を発する別の酵素(例えば、ルシフェラーゼ)との多重化反応において使用され得る。いくつかの実施形態では、CBR変異体は、転写レポーターとして使用してよく、アッセイ試薬に含有される異なる波長で光を発するルシフェラーゼと対合し得る。いくつかの実施形態では、CBR変異体は、1つまたは複数の追加のルシフェラーゼと使用され得、ここで各ルシフェラーゼの発光は、選択的酵素阻害剤の使用を通して別々に測定され得る。例えば、CBR変異体の発光は、適切な基質及び緩衝液を加える際に測定され得、その後、適切な基質及び緩衝液ならびに第一のルシフェラーゼに選択的である1つまたは複数の阻害剤を続けて加える際に第二のルシフェラーゼが測定され得る。
本明細書に記載のプロ基質を含有する生物発光システム及びCBR変異体は、非発光酵素の活性を検出するために発光に基づくアッセイにおいて使用され得る。CBR変異体及びプロ基質は、細胞生理学の特定の態様、例えば、細胞生存能を推定するためのATP、または細胞アポトーシスを推定するためのカスパーゼ活性を測定するためのアッセイ試薬に含有され得る。CBR変異体及びプロ基質は、目的の非発光酵素を含有すると疑われる試料に加えられ得る。試料中に存在する非発光酵素は、基質として使用するためにCBR変異体に対するルシフェリン基質を放出するプロ基質と反応し、従って発光が生成され、測定される。いくつかの実施形態では、目的の非発光酵素は、レダクターゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、カスパーゼ−3及びカスパーゼ−8などのシステインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、ならびにメタロプロテアーゼ、ペプチダーゼ、モノアミン酸化酵素などのオキシダーゼ、エステラーゼ、シトクロムP450、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシラーゼならびにグルタチオンS−転移酵素などのグルタチオン転移酵素プロテアーゼ酵素である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するようなプロ基質は、非発光酵素を検出するために使用され得る。
CBR変異体及び生物発光システムは、リガンド−タンパク質相互作用及び/またはタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための任意の方法において使用され得る。様々な実施形態では、CBR変異体酵素は、エネルギーをエネルギー受容体に移動させるために使用されてよい。1つのかかる方法は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)である。BRETに関して、生物発光ドナーから蛍光受容体へのエネルギー移動は、光の放出のスペクトル分布のシフトをもたらす。このエネルギー移動は、in vitroまたはin vivoでのタンパク質−タンパク質相互作用またはリガンド−タンパク質相互作用のリアルタイムモニタリングを可能にし得る。
いくつかの実施形態では、CBR変異体は、タンパク質近接を測定するために、循環置換された(CP)または直鎖開裂型(SS)発光酵素融合タンパク質として使用され得る。CBR変異体酵素は、プロテアーゼ基質アミノ酸配列(例えば、TEV)の挿入を介して置換または開裂されて、低い生物発光を生成する。CBR変異体発光酵素は、モニタータンパク質に(例えば、遺伝子融合を介して)繋留される。有望な相互作用タンパク質がプロテアーゼ(例えば、TEV)に(例えば、遺伝子融合を介して)繋留される。2つのモニタータンパク質が(例えば、恒常的な相互作用、薬剤刺激または経路応答を介して)相互作用するか、または十分近位に存在する場合、CBR変異体酵素は切断されて、増加した生物発光活性を生成する。この例は、細胞または生化学アッセイにおけるタンパク質近接の測定に適用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、タンパク質相補性アッセイ(PCA)または酵素断片化アッセイなどのリガンド−タンパク質相互作用及びタンパク質−タンパク質相互作用または近接を検出するための他の方法において使用されてよい。タンパク質相補性アッセイ(PCA)は、2つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。PCAは、互いに接近させられた場合に機能的な活性タンパク質に再構成されることができる、同一タンパク質、例えば、CBR変異体の2つの断片を活用する。いくつかの実施形態では、CBR変異体を活用するPCAは、酵素成分またはサブユニットの結合相互作用を介するCBR変異体の再構成による分子近接を検出するために使用され得る。CBR変異体の断片は、目的のタンパク質に融合される。目的のタンパク質が相互作用する場合、CBR変異体の断片は相互作用して完全長CBR変異体酵素を再構成する。
CBR変異体は、バイオセンサーとして使用してよく、これは、別の分子(例えば、1つまたは複数の目的の分子)の存在下、またはある特定の条件下で、1つまたは複数の変化した活性を有する。目的の分子と相互作用するまたはある特定の条件に供される際、バイオセンサーは、立体構造変化を受けるか、または化学的に変化して酵素活性もくしは発光、例えば、比活性、スペクトル分布、もしくは発光動態の変化を引き起こす。例えば、本発明のCBR変異体、例えば、循環置換された変異体は、目的の分子に対する相互作用ドメインを含むことができる。あるいは、例えば、CBR変異体は、エネルギー受容体、例えば、蛍光タンパク質にカップリングし得、酵素からエネルギー受容体へのエネルギー移動の効率を変化させる相互作用ドメインを含み得る。例えば、バイオセンサーは、プロテアーゼ、キナーゼ、リガンド、抗体などの結合タンパク質、cAMPもしくはcGMPなどの環状ヌクレオチド、またはカルシウムなどの金属を検出するために、好適なセンサー領域をCBR変異体配列に挿入することによって生成することができる。1つまたは複数のセンサー領域を、C末端、N末端、及び/またはポリペプチド配列中の1つまたは複数の好適な位置で挿入することができ、そこで、センサー領域は1つまたは複数のアミノ酸を含む。循環置換されたCBR変異体の場合、センサー領域は、親CBR変異体のN末端とC末端の間に挿入され得る。加えて、挿入されたセンサー領域の1つまたは全ては、センサーをCBR変異体ポリペプチドの残りにカップリングさせるためのリンカーアミノ酸を含み得る。
本開示のCBR変異体及び/または近IR生物発光システムは、生体成分を含有する試料と使用してよい。試料は、細胞及び/または組織を含んでよい。試料は、成分(インタクトな細胞、細胞抽出物、細胞溶解液、バクテリア、ウイルス、細胞小器官、及びこれらの混合物)の不均質な混合物または単一成分または成分の均質な群(例えば、天然または合成のアミノ酸、核酸または炭水化物ポリマー、または脂質膜複合体)を含んでよい。化合物は、通常、使用濃度内では、生存細胞及び他の生体成分に対して非毒性である。
CBR変異体及び/または近IR生物発光システムを使用するためのキットを本明細書に提供する。そのようなキットは、活性CBR変異体及びルシフェリン基質を含む。キットは、緩衝液及び指示書をさらに含んでよい。キット構成要素、組成物、及び緩衝液は、好適な構成要素を加えることにより改変されてもよい。本明細書に記載の方法において使用され得る好適なキット構成要素、組成物及び緩衝液は、商業的に入手することもできる。異なる構成要素は、これらの部分のサブセットを含み得、本発明の適用を容易にするか、貯蔵寿命を延ばすいずれかの任意の方法で組み合わされ得る。
キットに含まれる試薬は、異なる構成要素の寿命が保存され、容器の材料によって吸収または変化されないように任意の種類の容器中に供給されることができる。例えば、密閉したガラスアンプルは、窒素などの中性の非反応性ガス下で詰められている凍結乾燥ルシフェラーゼまたは緩衝液を含有し得る。アンプルは、任意の好適な材料、例えば、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレン等の有機ポリマー、セラミック、金属または試薬を保持するために典型的に採用される任意の他の材料からなってよい。好適な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から製造することができる単純なボトルと、アルミニウムまたは合金などの箔で裏打ちされた内部からなるエンベロープが含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ等が含まれる。容器は、皮下注射針によって穿孔することができるストッパーを有するボトルなどの滅菌アクセスポートを有してよい。他の容器は、容易に取り外し可能な膜によって分離された2つの区画を有してよく、除去すると成分が混合する。取り外し可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム等であってよい。
キットは、さらに説明用素材を伴って供給されてよい。説明書は、紙または他の被印刷物に印刷されていてよく、及び/またはフロッピーディスク、CD−ROM、DVD−ROM、Zipディスク、ビデオテープ、音声テープ等の電子読み取り可能媒体として供給されてよい。詳細な説明書は、キットと物理的に付随していなくてよい;代わりに、ユーザーは、キットの製造業者または販売業者によって指定されたインターネットウェブサイトに指向されてよいか、または電子メールとして供給されてよい。
本発明は、以下の非限定的な実施例に例示されるように活用されることができる。
Ultra−Glo(商標)ルシフェラーゼ、QuantiLum(登録商標)組換えルシフェラーゼ、及び精製クリックビートル赤色ルシフェラーゼ(CBR)を用いた近IR基質PBI−4739及びPBI−4813の特徴づけ
材料:以下を実施例において使用した:Ultra−Glo(商標)ルシフェラーゼ(Promegaカタログ番号E140);QuantiLum(登録商標)組換えルシフェラーゼ(Promegaカタログ番号E1701);クリックビートル赤色ルシフェラーゼ(CBR;0.5mg/mL精製済;Promega);Bright−Glo(商標)アッセイ緩衝液(Promegaカタログ番号E264A);PBI−4739(Promega−図1を参照されたい);及びPBI−4813(Promega−図1を参照されたい)。
ライブラリースクリーニング
クリックビートル赤色変異体のライブラリーを、Diversify(商標)PCRランダム突然変異誘発キット(Clontech)を、製造業者の使用説明書に従って、pF4Ag−HT7−CBR、すなわち、CBR−HALOTAG(登録商標)融合タンパク質を鋳型として使用して調製した。変異体DNAのライブラリーをpF4Ag−HT7(Promega)へとクローニングし、50μL KRX形質転換受容性細胞(Promega Corporation)へと形質転換した。細胞をLB−アンピシリンプレート上、37℃で一晩増殖させた。
表1
クリックビートル赤色突然変異組み合わせ
実施例2で概説したライブラリースクリーニングにおいて同定された突然変異のいくつかを、突然変異の有益な組み合わせを同定するために組み合わせた。突然変異を、QuikChange複数部位特異的突然変異誘発キット(Agilent)を使用してクリックビートル赤色(CBR)ルシフェラーゼ(配列番号1)に導入した。変異体を、実施例2に記載のように、クローニングし、発現し、スクリーニングした。表2及び図5は、変異体、及び基質PBI−4813またはPBI−4739でのCBRルシフェラーゼに対する発光の変化倍率を列挙する。
表2
哺乳類細胞で試験した変異体
実施例2及び3で同定した変異体のいくつかを、哺乳類細胞におけるそれらの性能についてスクリーニングした。DNAは、Plasmid.comにより調製された。HEK293及びHeLa細胞を24ウェルプレートのウェル中に0.05×106細胞/mLで播種し、37℃、CO2で一晩増殖させた。2.2μg変異体DNAを、80μL OptiMEMと6.6μL FuGENE(登録商標)HDトランスフェクション試薬(Promega Corporation)と混合し、室温で5分間インキュベートした。25μLのDNA混合液を各ウェルに加えた。
水素受容体突然変異誘発設計
CBRとCBG99の間のアミノ酸差異は、色変化に寄与する。例えば、大きく寄与するアミノ酸変化、Y224V、H247S、及びQ348H、ならびに小さく寄与するアミノ酸変化I346N及びT349Sである。位置351で、アミノ酸は、CBR及びCBG99ではグリシンであり、CBG68ではアルギニンである。
水素受容体突然変異誘発変異体スクリーニング
A.突然変異誘発。水素受容体突然変異誘発を、下記のアミノ酸に特異的な縮合オリゴを使用してQuikChange複数部位特異的突然変異誘発キット(Agilent)を前述のように使用して行った。以下の変異体を、実施例2に記載のようにクローニングし、発現した:
表3
H受容体突然変異誘発及びライブラリースクリーニング突然変異体の組み合わせ
実施例6で同定された水素受容体突然変異体の組み合わせを、QuikChange複数部位特異的突然変異誘発キット(Agilent)を使用して、設計及び調製した。変異体を、実施例2に記載のようにクローニング及び発現させたが、鋳型はpF4Ag−CBRとした。変異体を、実施例6に記載のようにスクリーニングした。ルシフェリン(「D−LH2」)、PBI−4813、及びPBI−4739を使用する変異体の発光をCBRルシフェラーゼに正規化した(表4及び図9)。
表4
クローン1230及び1240の評価
ATG1230(CBR+389F+444R+251S)及びATG1240(CBR+334S+351R)と同定された変異体クローンを、PBI−4813またはPBI−4739のいずれかを用いたそれらの発光、スペクトル特性、Km及び生存細胞動態学についてさらに評価した。これらの変異体を実施例2に記載のようにクローニング及び発現させたが、鋳型は、pF4Ag−CBRとした、すなわちHALOTAG(登録商標)は無しとした。
表5
ATG1240を鋳型として使用する二次ライブラリースクリーニング
ランダムクローンライブラリーを、ATG1240を鋳型として使用して、実施例2に記載のように調製した。変異体を次いで、pF4Ag(HT7無し)へとクローニングした。ライブラリーを以下のようにスクリーニングした(計50プレート)。
表6
挿入突然変異誘発:クリックビートル赤色−ルシフェリン結合ポケットの操作
目的は、赤方偏移基質、例えば、PBI−4739(より赤く溶けにくい)、PBI−4813(より明るい、潜在的基質阻害)を伴うクリックビートル赤色(CBR)突然変異体(複数可)からの光の放出を有意に増加させることとした。以前に記載したランダム突然変異誘発及び部位特異的突然変異誘発は、光の放出において約3倍の改善を得た。
表7
ATG1240ライブラリー突然変異体の組換え
実施例9において同定されたATG1240ライブラリー突然変異体の組み合わせを、DNAシャッフリング(Stemmer(1994)PNAS USA91:10747−10751)を使用して設計及び調製した。簡潔には、突然変異遺伝子のライブラリーを、DNAシャッフリングを介して創出した。次いで、突然変異遺伝子をpF4Agベクターへとクローニングし、実施例6に記載のようにスクリーニングした。発光を、GloMax(登録商標)Discoverマルチモード検出システム上で検出し、ATG−1240ルシフェラーゼに正規化した(表8及び図15)。
表8
生存細胞基質滴定
HEK293細胞を、96ウェルプレートのウェルに5,000細胞/ウェルで播き、一晩増殖させた。細胞を、次いで全体で776μLのOptiMEM中17μgのATG1240 DNAを使用してトランスフェクトした(各試料についてn=24)。次いで、50μLのFuGENE(登録商標)HD(Promega Corporation)を加え、試料を10分間室温でインキュベートした。5μLのDNA複合体を各プレートに18ウェル/試料まで加えた。次いで、プレートを、CO2、37℃で一晩インキュベートした。
ロングパスフィルタを使用した組織による減衰の模倣
この実施例は、様々なロングパスカットオフフィルタを使用して、D−ルシフェリン、PBI−4813またはPBI−4739でアッセイされたATG1240と比較して、Luc2(ポティヌス・ピュラリスルシフェラーゼ)でトランスフェクトされ、D−ルシフェリンでアッセイされた細胞においてどれくらい光が産生されるかを実証する。
コドン最適化
3mL中の600,000細胞(HEK293、3T3、またはCHO細胞)を、6ウェルプレートに播種した。簡潔には、t−75フラスコ内で増殖した各細胞種について、培地をt−75フラスコから除去し、細胞をDPBSで洗浄した。3mLのトリプシンを細胞に加え、細胞を3分間インキュベートした。10mLの増殖培地(HEK293T及び3T3にはDMEM+10%FBS、CHOにはハムF12+10%FBS)を加えた。細胞を500rpmで5分間遠心分離した。細胞を計数し、1mLあたり200,000個に希釈した。3mLの細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに加えた(すなわち、600,000細胞)。
表9
を含む、条項13に記載の単離されたポリヌクレオチド。
を含む、条項19に記載の単離されたポリヌクレオチド。
を含む場合、前記CBR変異体ポリペプチドが、配列番号1の前記CBRポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約1nm〜少なくとも約100nmのスペクトル最大のシフトを有する光を発する、条項20に記載の単離されたポリヌクレオチド。
を含む場合、前記CBR変異体ポリペプチドが、配列番号1の前記CBRポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約1nm〜少なくとも約100nmのスペクトル最大のシフトを有する光を発する、条項20に記載の単離されたポリヌクレオチド。
を含む、条項31または32に記載の単離されたポリヌクレオチド。
を含む、条項55に記載の近赤外生物発光システム。
(a)
;及び
(b)緩衝液試薬のうちの少なくとも1つをさらに含む、条項59または60に記載のキット。
を含む、条項63に記載のBRETシステム。
を含む、ルシフェリン誘導体である、前記方法。
の改変体である、条項69に記載の方法。
(a)試料を、
と接触させること、ここで前記試料は、
(i)第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで前記第一の融合タンパク質は、発光酵素の第一の断片及び第一のタンパク質を含む;及び
(ii)第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド、ここで前記第二の融合タンパク質は、前記発光酵素の第二の断片及び第二のタンパク質を含む;を含む、ならびに
発光の前記検出は、前記第一のタンパク質と前記第二のタンパク質の間の相互作用を示し、前記発光酵素は、条項1〜46のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる、前記方法。
(a)試料を、
と接触させること、ここで前記試料は、
(i)第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで前記第一の融合タンパク質は、発光酵素及び第一のタンパク質を含み、前記発光酵素は、条項1〜46のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる;及び
(ii)第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド、ここで前記第二の融合タンパク質は、蛍光受容体分子及び第二のタンパク質を含む;を含む、ならびに
(b)前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を検出することを含み、これは前記生物発光ドナー及び前記蛍光受容体の相互作用または近接を示す、前記方法。
Claims (17)
- 配列番号1に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号1の位置334及び351に対応する位置にアミノ酸置換を含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ(CBR)変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記変異体CBRポリペプチドが、配列番号1のCBRポリペプチドと比較して、増強された発光、変化した発光波長、変化した基質特異性、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを有するものであり、位置334に対応する位置のアミノ酸置換が、R334S、R334Q、R334N、R334H、R334E、又はR334Kを含み、位置351に対応する位置のアミノ酸置換が、G351R又はG351Kを含むことを特徴とする、単離ポリヌクレオチド。
- 前記CBR変異体ポリペプチドが、配列番号1の位置51及び444に対応する位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記CBR変異体ポリペプチドが、配列番号2、または配列番号4のアミノ酸ポリペプチドを含む、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記単離ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、前記CBR変異体ポリペプチドに連結した目的のポリペプチドをさらにコードし、前記目的のポリペプチド及び前記CBR変異体ポリペプチドが、融合タンパク質として発現されることができる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能可能に連結している、請求項6に記載のベクター。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項6もしくは7に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項6もしくは7に記載のベクター、または、請求項8に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、CBR変異体ポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたCBR変異体ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド及びルシフェリン誘導体を含む、近赤外生物発光システム。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項6もしくは7に記載のベクター、または、請求項10に記載のCBR変異体ポリペプチドを含む、キット。
- 以下:
(a)
の少なくとも1つ;及び
(b)緩衝液試薬
をさらに含む、請求項13に記載のキット。 - 生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システムであって、第一の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第一の融合タンパク質、第二の標的タンパク質及び蛍光受容体分子を含む第二の融合タンパク質、ならびにCBR基質を含み、
前記生物発光ドナー分子が、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるCBR変異体であることを特徴とする、BRETシステム。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド;請求項6または7に記載のベクター;請求項8に記載の細胞;請求項10に記載のCBR変異体ポリペプチド;請求項11に記載の融合タンパク質、または請求項12に記載の近赤外生物発光システムのうちの少なくとも1つを使用する、生物発光を測定するための方法(ただし、該方法の対象がヒトであるものを除く)。
- 前記アミノ酸置換が、S51N及びS444Rを含む、請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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