JP6510041B2 - 生物発光サクシネート検出アッセイ - Google Patents

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Description

本発明は、サクシネートの検出及び定量方法と、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジンデメチラーゼ及び２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの検出及び定量方法に関する。
ゲノムのエピジェネティックな状態を定めるには、タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）が重要である。この修飾としては、リン酸化、メチル化、アセチル化、糖鎖付加、ユビキチン化、ニトロシル化及び脂質化が挙げられ、ＰＴＭは、正常細胞の生態と発病機序の多くの局面に影響を及ぼす。より具体的には、ヒストン関連ＰＴＭは、非常に有効なものであり、これは、ヒストンの共有結合修飾が、クロマチン調節を介した転写調節に関連付けられているからである。翻訳後修飾酵素の例としては、キナーゼ／フォスファターゼ、メチルトランスフェラーゼ／デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ／ヒストンデアセチラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ／グルカナーゼ及びＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限らない。正常な生理的状態では、ＰＴＭ酵素の調節は、厳密に調節されている。しかしながら、病的状態では、これらの酵素の活性が異常調節されることがあり、これらの酵素によって支配される、細胞内ネットワークの破壊により、がん及び炎症を含む多くの疾患に至る。そのため、ＰＴＭ酵素は、創薬の重要な標的となっており、それらの酵素の活性をモニタリングするための技術開発に対するニーズが生じている。これらのアッセイは、これらの疾患に対する薬剤候補を探すためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のみならず、細胞プロセスの調節におけるこれらの翻訳後修飾の役割を理解するためにも適用できる。
ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジンデメチラーゼ（「ＪＭＪＣデメチラーゼ」）は、ゲノムのエピジェネティックな状態を定める際に、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼの活性を相殺することによって、役割を果たす。これらの酵素は、ヒストンの特定のリジン部位からメチルマークを除去するのを触媒し、その結果、標的遺伝子の転写を抑制または活性化させることによって、消去剤として作用する。ＪＭＪＣデメチラーゼは、広く研究されており、がんへの関わりがあることから、有効な薬剤標的となっている。したがって、創薬のために、ＪＭＪＣデメチラーゼの調節機序を解明するとともに、選択的かつ強力なインヒビターの同定を促進する基礎調査ツールとして、ＪＭＪＣデメチラーゼ活性をモニタリングするアッセイは望ましい。従来のＪＭＪＣデメチラーゼアッセイでは、抗体、酵素カップリングアッセイ、ＨＰＬＣベースのアッセイまたは質量分析法を用いて、ＪＭＪＣデメチラーゼによって脱メチル化された基質を検出する。これらのアッセイは、デメチラーゼ活性の迅速な検出用として構成するのは容易ではなく、これは、比色アッセイ、放射性アッセイまたは不均一系抗体ベース蛍光アッセイの利用に依存するからである。比色アッセイは通常、創薬用途には望ましくなく、これは、化合物の干渉を受けやすく、感度が低く、偽陽性の割合が高いからである。放射能及び質量分析ベースの方法では、試料の加工が必要である。放射標識した物質を使用するには、廃棄物の管理または面倒な規制上の手順が必要である。上記の酵素種の重要性から、それらの活性、調節をモニタリングするか、または新規インヒビターを同定するための酵素アッセイを開発するニーズが存在する。
本発明は、試料中のサクシネートの発光検出または測定方法に対するものである。この方法は、（ａ）試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、（ｂ）第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｃ）第２の反応混合物における発光を検出することによって、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することを含み、サクシネートが試料に存在する場合、第１の検出試薬と第２の検出試薬は、そのサクシネートをＡＴＰに変換する。第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させることにより、ＡＴＰを生成できる。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法に対するものである。この方法は、（ａ）試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、（ｂ）第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｃ）第２の反応混合物における発光を検出することによって、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することを含み、（ｉ）第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、（ｉｉ）第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または（ｉｉｉ）第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含んでよく、第２の検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含んでよい。第１の検出試薬は、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含んでよく、第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含んでよい。第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含んでよく、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含んでよく、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む。第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させることにより、ＡＴＰを生成できる。サクシネート形成酵素は、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼであってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性の検出または測定方法に対するものである。この方法は、（ａ）試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、試料がサクシネート形成酵素を含む場合に、サクシネートが形成されることと、（ｂ）サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することと、（ｃ）第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｄ）第２の反応混合物における発光を検出することによって、試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素活性を検出または測定することとを含み、（ｉ）第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、（ｉｉ）第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または（ｉｉｉ）第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させることにより、ＡＴＰを生成できる。サクシネート形成酵素は、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼであってよい。２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼであってよい。そのＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６であってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃであってよい。試料は、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させてよい。そのペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンペプチド基質であってよい。そのヒストンペプチド基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法に対するものである。この方法は、（ａ）試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、その試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、（ｂ）試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、（ｃ）サクシネート反応混合物を３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することと、（ｄ）第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、そのＡＴＰ検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、（ｅ）第２の反応混合物における発光を検出することと、（ｆ）第２の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第２の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む。その２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼであってよい。そのＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６であってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃであってよい。試料は、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させてよい。そのペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンペプチド基質であってよい。そのヒストンペプチド基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法に対するものである。この方法は、（ａ）試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、その試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、（ｂ）試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、（ｃ）サクシネート反応混合物をＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＧＤＰに変換することと、（ｄ）第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、そのＡＴＰ検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むことと、（ｅ）第２の反応混合物における発光を検出することと、（ｆ）第２の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第２の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む。２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼであってよい。そのＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６であってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃであってよい。試料は、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させてもよい。そのペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンペプチド基質であってよい。そのヒストンペプチド基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法に対するものである。この方法は、（ａ）試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、その試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、（ｂ）試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、（ｃ）サクシネート反応混合物をＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＡＤＰに変換することと、（ｄ）第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、そのＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含むことと、（ｅ）第２の反応混合物を、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させることであって、そのＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、（ｆ）第３の反応混合物における発光を検出することと、（ｇ）第３の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第３の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む。その２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼであってよい。そのＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６であってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃであってよい。試料は、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させてよい。そのペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンペプチド基質であってよい。そのヒストンペプチド基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中のサクシネートを検出するキットに対するものである。このキットは、（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、（ｉｉ）無機フォスフェートと、（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、（ｖ）ＡＤＰと、（ｖｉ）生物発光酵素と、（ｖｉｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、１つ以上の容器に入っている。このキットは、（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、（ｉｉ）無機フォスフェートと、（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡを含む第１の検出試薬と、（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、（ｖ）ＡＤＰと、（ｖｉ）生物発光酵素と、（ｖｉｉ）ルシフェリン基質を含む第２の検出試薬を含んでよい。生物発光酵素は、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよく、ルシフェリン基質は、Ｄ−ルシフェリンであってよい。このキットは、キットを用いて、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含んでよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中のサクシネートを検出するキットに対するものである。このキットは、（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、（ｉｉ）ＧＴＰと、（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、（ｖ）ＡＤＰと、（ｖｉ）生物発光酵素と、（ｖｉｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、１つ以上の容器に入っている。このキットは、（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、（ｉｉ）ＧＴＰと、（ｉｉｉ）コエンザイムＡを含む第１の検出試薬と、（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、（ｖ）ＡＤＰと、（ｖｉ）生物発光酵素と、（ｖｉｉ）ルシフェリン基質を含む第２の検出試薬を含んでよい。このキットは、キットを用いて、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含んでよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中のサクシネートを検出するキットに対するものである。このキットは、（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｉｉ）ＡＴＰと、（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、（ｖ）ピロフォスファターゼと、（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、（ｉｘ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｉｘ）は、１つ以上の容器に入っている。その第１の検出試薬は、（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｉｉ）ＡＴＰと、（ｉｉｉ）コエンザイムＡを含んでよく、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含んでよく、そのＡＴＰ枯渇試薬は、（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、（ｖ）ピロフォスファターゼを含んでよく、そのＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、（ｉｘ）ルシフェリン基質を含んでよい。このキットは、キットを用いて、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含んでよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットに対するものである。このキットは、（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、（ｉｖ）アスコルベートと、（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、（ｖｉ）無機フォスフェートと、（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、（ｉｘ）ＡＤＰと、（ｘ）生物発光酵素と、（ｘｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）は、１つ以上の容器に入っている。このキットは、（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、（ｖｉ）無機フォスフェートと、（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡを含む第１の検出試薬と、（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、（ｉｘ）ＡＤＰと、（ｘ）生物発光酵素と、（ｘｉ）ルシフェリン基質を含む第２の検出試薬を含んでよい。キットは、キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含んでよい。その２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼであってよい。そのＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼであってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６であってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃであってよい。このキットは、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含んでよい。そのペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンペプチド基質であってよい。ヒストンペプチド基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットに対するものである。このキットは、（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、（ｉｖ）アスコルベートと、（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、（ｖｉ）ＧＴＰと、（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、（ｉｘ）ＡＤＰと、（ｘ）生物発光酵素と、（ｘｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）は、１つ以上の容器に入っている。このキットは、（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、（ｖｉ）ＧＴＰと、（ｖｉｉ）コエンザイムＡを含む第１の検出試薬と、（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、（ｉｘ）ＡＤＰと、（ｘ）生物発光酵素と、（ｘｉ）ルシフェリン基質を含む第２の検出試薬を含んでよい。このキットは、キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含んでよい。その２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼであってよい。そのＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６であってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃであってよい。このキットは、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含んでよい。そのペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンペプチド基質であってよい。ヒストンペプチド基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットに対するものである。このキットは、（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、（ｉｖ）アスコルベートと、（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｖｉ）ＡＴＰと、（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、（ｘ）ピルベートキナーゼと、（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、（ｘｉｉ）生物発光酵素と、（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）は、１つ以上の容器に入っている。このキットは、（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｖｉ）ＡＴＰと、（ｖｉｉ）コエンザイムＡを含む第１の検出試薬と、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含む第２の検出試薬を含んでよく、そのＡＴＰ枯渇試薬は、（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、（ｉｘ）ピロフォスファターゼを含んでよく、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、（ｘ）ピルベートキナーゼと、（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、（ｘｉｉ）生物発光酵素と、（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質を含んでよい。このキットは、キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含んでよい。その２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼであってよい。そのＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼであってよい。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６であってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃであってよい。このキットは、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含んでよい。そのペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンペプチド基質であってよい。ヒストンペプチド基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。生物発光酵素は、ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、組み換えルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼは、耐熱性ホタルルシフェラーゼであってよい。
本発明は、試料中のサクシネートの発光検出または測定方法であって、（ａ）試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、（ｂ）第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｃ）第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することを含み、サクシネートが試料に存在する場合、第１の検出試薬と第２の検出試薬が、そのサクシネートをＡＴＰに変換する方法に対するものである。
本発明は、試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、（ａ）試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、（ｂ）第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｃ）第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することを含み、（ｉ）第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、（ｉｉ）第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬が、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、（ｉｉｉ）第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または（ｉｖ）第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む方法に対するものである。
本発明は、試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性の検出または測定方法であって、（ａ）試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、試料がサクシネート形成酵素を含む場合に、サクシネートが形成されることと、（ｂ）サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することと、（ｃ）第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｄ）第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素活性を検出または測定することを含み、（ｉ）第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、（ｉｉ）第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬が、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、（ｉｉｉ）第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または（ｉｖ）第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む方法に対するものである。
本発明は、ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、（ａ）試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、（ｂ）試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、（ｃ）サクシネート反応混合物を（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換するか、または（ｉｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをＡＴＰに変換することと、（ｄ）第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、ＡＴＰ検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、（ｅ）第２の反応混合物における発光を検出することと、（ｆ）第２の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第２の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む方法に対するものである。
本発明は、ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、（ａ）試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、（ｂ）試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、（ｃ）サクシネート反応混合物をＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＧＤＰに変換することと、（ｄ）第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、ＡＴＰ検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、（ｅ）第２の反応混合物における発光を検出することと、（ｆ）第２の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第２の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む方法に対するものである。
本発明は、ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、（ａ）試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、（ｂ）試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、（ｃ）サクシネート反応混合物をＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＡＤＰに変換することと、（ｄ）第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含むことと、（ｅ）第２の反応混合物をＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させることであって、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、（ｆ）第３の反応混合物における発光を検出することと、（ｇ）第３の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第３の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む方法に対するものである。
本発明は、試料中のサクシネートを検出するキットであって、（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、（ｉｉ）無機フォスフェートと、（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、（ｖ）ＡＤＰと、（ｖｉ）生物発光酵素と、（ｖｉｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
本発明は、試料中のサクシネートを検出するキットであって、（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、（ｉｉ）ＧＴＰと、（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、（ｖ）ＡＤＰと、（ｖｉ）生物発光酵素と、（ｖｉｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
本発明は、試料中のサクシネートを検出するキットであって、（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｉｉ）ＡＴＰと、（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、（ｖ）ピロフォスファターゼと、（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、（ｉｘ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｉｘ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
本発明は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、（ｉｖ）アスコルベートと、（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、（ｖｉ）無機フォスフェートと、（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、（ｉｘ）ＡＤＰと、（ｘ）生物発光酵素と、（ｘｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
本発明は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、（ｉｖ）アスコルベートと、（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、（ｖｉ）ＧＴＰと、（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、（ｉｘ）ＡＤＰと、（ｘ）生物発光酵素と、（ｘｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
本発明は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、（ｉｖ）アスコルベートと、（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｖｉ）ＡＴＰと、（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、（ｘ）ピルベートキナーゼと、（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、（ｘｉｉ）生物発光酵素と、（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
本発明は、試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、（ａ）試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、（ｂ）第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｃ）第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することを含み、第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬及びＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、生物発光酵素及びルシフェリン基質と順次接触させる方法に対するものである。
本発明は、ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、（ａ）試料を化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、（ｂ）試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、（ｃ）サクシネート反応混合物をＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＡＤＰに変換することと、（ｄ）第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、（ｅ）第２の反応混合物をＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させることであって、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、（ｆ）第３の反応混合物における発光を検出することと、（ｇ）第３の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第３の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む方法に対するものである。
本発明は、試料中のサクシネートを検出するキットであって、（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｉｉ）ＡＴＰと、（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、（ｉｖ）ＡＴＰ枯渇試薬と、（ｖ）ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、（ｖｉ）生物発光酵素と、（ｖｉｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
本発明は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、（ｉｖ）アスコルベートと、（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、（ｖｉ）ＡＴＰと、（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、（ｖｉｉｉ）ＡＴＰ枯渇試薬と、（ｉｘ）ＡＴＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、（ｘ）生物発光酵素と、（ｘｉ）ルシフェリン基質を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っているキットに対するものである。
３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ／サクシニル−ＣｏＡリガーゼフォスフォトランスフェラーゼ反応を示している。 サクシネートを生成させる酵素反応後に、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ／サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（方法１）を用いたサクシネート検出アッセイを示している。 方法１を用いたサクシネート滴定曲線を示している。 図４Ａ〜４Ｃは、図２に示されているサクシネート検出アッセイで検出したＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＡＲＩＤ１Ａ及びＵＴＸ酵素のＪＭＪＣデメチラーゼ滴定曲線を示している。 ＪＭＪＤ２Ｃの、様々なメチル化及び非メチル化ヒストンＨ３ペプチドに対する基質特異性を示している。 方法１を用いて、ＪＭＪＤ２ＣのＦｅ（ＩＩ）に対するＫｍappを割り出したものを示している。 図７Ａ〜７Ｂは、デメチラーゼインヒビターＩＯＸ及びＪＩＢ ０４のＪＭＪＤ２Ｃに対する用量反応曲線を示している。 ＳＣＳ（ＧＤＰ形成）／グアニレートキナーゼ（方法２）を用いたサクシネート検出アッセイを示している。 方法２を用いたサクシネート滴定を示している。 図１０Ａ〜１０Ｂは、ＪＭＪＤ２Ｃ及びＪＭＪＤ２Ａ酵素のＪＭＪＣデメチラーゼ滴定曲線を示している。 方法２を用いた、ＪＭＪＤ２Ｃの、様々なメチル化ヒストンＨ３ペプチドに対する基質特異性を示している。 ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）／ＡＤＰ検出試薬（方法３）を用いたサクシネート検出アッセイを示している。 ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）／ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ（方法３）を用いたサクシネート滴定を示している。 図１４Ａ〜１４Ｂは、方法３を用いた、ＪＭＪＤ２Ｃ及びＪＭＪＤ２Ａ酵素のサクシネート滴定曲線を示している。 ３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ／サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（方法１）を用いた、細胞抽出物におけるサクシネート検出を示している。 サクシネートを生成させる酵素反応後に、改変型３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ／サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（方法４）を用いたサクシネート検出アッセイを示している。 改変型３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ／サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（方法４）を用いたサクシネート滴定を示している。 図１８Ａ〜１８Ｂは、ＪＭＪＤ２Ｃ及びＪＡＲＩＤ１Ａ酵素のＪＭＪＣデメチラーゼ滴定曲線（方法４）を示している。 図１９Ａ〜１９Ｂは、ＥＧＬＮ１及びＥＧＬＮ２酵素のジオキシゲナーゼ滴定曲線（方法４）を示している。
本明細書では、汎用的な生物発光・ホモジニアスサクシネート検出アッセイであって、ＪＭＪＣデメチラーゼ活性などの２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を測定するのに適合できるアッセイを開示する。この生物発光サクシネート検出アッセイには、生物発光形式でサクシネートを検出するために（例えば図１、８、１２及び１６を参照）、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ及び／またはサクシニル−ＣｏＡリガーゼ反応（図１）が伴う。本発明の生物発光サクシネート検出アッセイは、サクシネートを検出するので、多種多様な酵素系において様々な基質とともに用いてよい。例えば、本発明の生物発光サクシネート検出アッセイは、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ（例えば、ＪＭＪＣデメチラーゼ及び２−オキソグルタレート依存型（２ＯＧ依存型）ジオキシゲナーゼ）のようなサクシネート形成または生成酵素の存在及び／または活性を検出するために、脱メチル化反応のようなサクシネート形成反応とともに用いてよい。これらの酵素は、生物発光サクシネート検出アッセイでの使用に適し、これは、２−オキソグルタレートをサクシネートに変換するからである。本アッセイは、テンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）酵素のように、ＤＮＡの脱メチル化に関わる酵素のモニタリングにも用いてよい。
本発明の生物発光サクシネート検出アッセイには、２段階アッセイで、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼとその活性を検出し、インキュベーション時間が短く、シグナルがロバストかつ安定であるという利点がある。このホモジニアスアッセイは、迅速で、感度が高く、簡潔であり、洗浄工程が不要である。この２段階形式アッセイは、サクシネート生成物のＡＴＰへの変換を伴い、このＡＴＰは、ロバストなルシフェラーゼ反応で測定され、その際、ルシフェラーゼ反応の光出力は、低ｎＭ〜２０μＭのサクシネート濃度に比例する。この高感度アッセイにより、低活性のＪＭＪＣデメチラーゼの検出、または少量の精製ＪＭＪＣデメチラーゼ、２−オキソグルタレート及び／もしくはＦｅ（ＩＩ）の使用が可能になる。本発明のアッセイは、感度が高く、ロバストであり、大半のＪＭＪＣデメチラーゼサブファミリーの活性を測定可能にする。
開示されているアッセイ及び方法は、利便的であり、いずれの計器プラットフォームでも、試料の加工なしに用いることができる。その生物発光反応は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）で用いるのに十分な感度であるとともに、シグナルが安定している。その試薬は、比較的容易に設計できるとともに、容易に合成できる。その試薬は、発光反応によって生成される高いシグナル安定性により、ハイスループット形式で、長時間にわたって多くの試料における酵素活性を測定するのを容易にできるので、試薬投入機構を備える発光測定装置が不要になり、多くの試料をバッチ方式で処理可能になる。本発明の方法は、１つのウェルで行っても、高い試料処理またはインヒビタースクリーニングのためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法として用いるのに適するように、マルチウェルプレートで行ってもよい。本発明の生物発光サクシネート検出アッセイは、使いやすい方法であり、酵素の使用量をかなり節約でき、放射能、抗体または修飾基質を必要としない。本発明の生物発光サクシネート検出アッセイは、基質特異性を調べたり、ＪＭＪＣデメチラーゼインヒビターの反応速度パラメーター及び作用機序を評価したりするのに適している。
１．定義
別段の定めのない限り、本明細書で用いられている技術用語と科学用語のいずれも、当業者によって広く理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本書が優先される。好ましい方法と材料が以下に示されているが、本発明の実施または試験において、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法と材料を用いることができる。本明細書で言及されている全ての文献、特許出願、特許及びその他の参考文献は、参照により、その全体が援用される。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、実例に過ぎず、限定することは意図されていない。
「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）（挙げられる、含まれる）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｈａｓ（有する）」、「ｃａｎ（できる）」、「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）（含む）」という用語及びこれらの変形表現は、本明細書で使用する場合、追加の行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドな移行句、語句または単語であるように意図されている。本明細書で用いられている用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することは意図されていない。本明細書及び添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上、明らかに別段に示されない場合、複数の言及物が含まれる。本開示は、明示されているか否かにかかわらず、本明細書に示されている実施形態または要素を「含み」、「それらからなり」、及び「それらから本質的になる」他の実施形態も企図している。
本明細書中の数値範囲の説明に関しては、同じ精度を有する、その範囲間の各数字が明らかに企図される。例えば、６〜９の範囲においては、６及び９に加えて、７及び８という数が企図され、６．０〜７．０の範囲においては、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０という数が明らかに企図される。
「２−オキソグルタレート」、「２ＯＧ」または「α−ケトグルタレート」という用語は、本明細書で同義的に使用する場合、α−ケトグルタル酸のアニオンを指す。２−オキソグルタレートは、グルタメートの脱アミノ化によって生成されるケト酸であり、クレブス回路における中間体である。
「３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ」及び「ＳＣＯＴ」という用語は、本明細書で同義的に使用する場合、下記の化学反応を触媒する酵素を指す。
サクシネート＋アセトアセチル−ＣｏＡ⇔サクシニル−ＣｏＡ＋アセトアセテート
ＳＣＯＴは、サクシニル−ＣｏＡ：３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、３−オキソ酸コエンザイムＡ−トランスフェラーゼ、３−ケト酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、３−ケト酸コエンザイムＡトランスフェラーゼ、３−オキソ酸ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセトアセテートサクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルコエンザイムＡ−サクシネートチオホラーゼ、サクシニルコエンザイムＡ−アセトアセチルコエンザイムＡ−トランスフェラーゼ及びサクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼとしても知られている。ＳＣＯＴは、ケトン体の合成及び分解、バリン、ロイシン及びイソロイシンの分解、ならびにブタノエートの代謝という３つの代謝経路に関与する。ＳＣＯＴは、ＣｏＡ−トランスフェラーゼのファミリーに属する。
「発光」という用語には、本明細書で使用する場合、生物発光（すなわち、生物によって作られる光）が含まれる。関与する酵素が、光を生成する目的で、自然選択によって、生物の中で進化したものであるか、または、関与する酵素が、そのような酵素の変異誘導体である場合、その発光反応は、「生物発光反応」ともいい、関与する酵素は、「生物発光酵素」ともいう。生物発光酵素の例としては、それらに限定されるものではないが、甲虫ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼなどが挙げられる。
「ルシフェリン基質」という用語は、本明細書で使用する場合、化学または生化学反応によって光を作ることができる分子を指す（例えば、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体またはこれらの機能的アナログ）。ルシフェリン基質は、ルシフェラーゼによって生成される光を作ることができる分子であってよい。ルシフェラーゼ酵素に対する好適なルシフェリン基質としては、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体及びルシフェリンの機能的アナログが挙げられる。いくつかの実施形態では、ルシフェリンの機能的アナログには、それらの化合物の誘導体を含め、修飾ルシフェリンが含まれる。例示的な化合物としては、米国特許出願公開第２００９／００７５３０９号に開示されているものが挙げられる。
「ルシフェリン誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｄ−ルシフェリンの実質的な構造を有するタイプの発光分子もしくは化合物またはルシフェリン基質を指し、ルシフェラーゼ基質、例えば、アミノルシフェリンもしくはフルオロルシフェリン、または米国特許出願公開第２００７／００１５７９０号に開示されているルシフェラーゼ基質、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に開示されているルシフェラーゼ基質（例えば、ナフチル及びキノリル誘導体）、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）に開示されているルシフェラーゼ基質、及びＢｒａｎｃｈｉｎｉ（２０００）に開示されているルシフェラーゼ基質であり、これらの文献の開示内容は、参照により、本明細書に援用される。
「調節する」とは、本明細書で使用する場合、活性をいずれかの形に変更すること（調節したり、ダウンレギュレートしたり、アップレギュレートしたり、低減したり、阻害したり、上昇させたり、低下させたり、失活させたり、または活性化させることなど）を意味することができる。
「較正組成物群」は、既知濃度のサクシネートを含む複数の組成物を指し、それらの組成物のそれぞれは、その群の別の組成物とは、サクシネートの濃度が異なる。
「小分子」とは、本明細書で使用する場合、通常分子量が約１０ｋＤａ未満である分子を意味することができる。小分子は、合成有機または無機化合物、ペプチド、（ポリ）ヌクレオチド、（多）糖類などであってよい。具体的には、小分子としては、小さい非ポリマー（すなわち、非ペプチドまたは非ポリペプチド）有機分子及び無機分子が挙げられる。多くの製薬会社は、このような分子の広範なライブラリーを有しており、それらの分子は、本明細書に記載されている方法を用いることによって、簡便にスクリーニングできる。小分子の分子量は、約１０００Ｄａ未満、約７５０Ｄａ未満または約５００Ｄａ未満であってよい。
「サクシニル−ＣｏＡシンターゼ」、「サクシニル−ＣｏＡリガーゼ」及び「ＳＣＳ」という用語は、本明細書で同義的に使用する場合、下記の反応を触媒する酵素を指す。
サクシニルＣｏＡ＋Ｐｉ＋ＮＤＰ⇔サクシネート＋ＣｏＡ＋ＮＴＰ
この式中、Ｐｉは、無機フォスフェートを示し、ＮＤＰは、ヌクレオシドジフォスフェート（例えば、ＧＤＰまたはＡＤＰ）を示し、ＮＴＰは、ヌクレオシドトリフォスフェート（例えば、ＧＴＰまたはＡＴＰ）を示す。ＮＤＰは、ＣＤＰ、ＴＤＰまたはＵＤＰを示すこともある。ＮＴＰは、ＣＴＰ、ＴＴＰまたはＵＴＰを示すこともある。サクシニル−ＣｏＡシンターゼは、サクシニルＣｏＡのサクシネートへの変換と、無機フォスフェート分子及びヌクレオシドジフォスフェート分子、例えばＧＤＰまたはＡＤＰからのヌクレオシドトリフォスフェート分子、例えばＧＴＰまたはＡＴＰの形成との共役を促す。ＳＣＳは、サクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、サクシネート−ＣｏＡリガーゼ、ＳＵＣＬ、サクシネートチオキナーゼ、Ａ−ＳＴＫ、Ｇ−ＳＴＫ、Ａ−ＳＣＳ、Ｇ−ＳＣＳ、ＳＣＡＣＴ、ＶＥＧ２３９、ＶＥＧ６３、Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ２３９、Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ６３、ＣＧ１１９６３及びサクシネートチオキナーゼとしても知られている。ＳＣＳは、細胞代謝における主要経路であるクエン酸回路に関与する触媒の１つであり、細胞のミトコンドリアマトリックスにある。「ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ」、「ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）」及び「ＳＣＳ−ＡＤＰ」という用語は、本明細書で同義的に使用する場合、下記の反応を触媒するＳＣＳを指す。
ＡＴＰ＋サクシネート＋ＣｏＡ⇔ＡＤＰ＋フォスフェート＋サクシニル−ＣｏＡ
「ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ」、「ＳＣＳ（ＧＤＰ形成）」及び「ＳＣＳ−ＧＤＰ」という用語は、本明細書で同義的に使用する場合、下記の反応を触媒するＳＣＳを指す。
ＧＴＰ＋サクシネート＋ＣｏＡ⇔ＧＤＰ＋フォスフェート＋サクシニル−ＣｏＡ
「変異体」は、本明細書では、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを説明するために使用する。変異体は、本明細書では、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を説明するためにも使用する。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性（例えば、親水性、帯電領域の程度及び分布）の別のアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において、典型的にはわずかな変化を伴うものとして認識されている。「変異体」は、タンパク質分解、リン酸化またはその他の翻訳後修飾によるなどして別段に処理してあるが、その生物学的活性を依然として保持するポリペプチドまたはそのフラグメントを説明するためにも使用することができる。
２．生物発光サクシネート検出アッセイ
本開示は、試料中のサクシネートを検出する生物発光サクシネート検出アッセイを提供する。このサクシネート検出アッセイには、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（「ＳＣＯＴ」）、ならびに／またはＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ（「ＳＣＳ−ＡＤＰ」）及びＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ（「ＳＣＳ−ＧＤＰ」）のようなサクシニル−ＣｏＡシンターゼ（「ＳＣＳ」）を用いて、試料中のサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することが伴う。サクシネートのサクシニル−ＣｏＡへの変換は、ＡＴＰの生成に結び付いている。生成されたＡＴＰの量は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を用いて検出し、試料に存在するサクシネートの量に比例する。
ａ．ＳＣＯＴ／ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）アッセイ（ＡＤＰからＡＴＰへの変換）
酵素のＳＣＯＴは、サクシネートとアセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートとサクシニル−ＣｏＡへの変換を触媒する（図１参照）。第２の反応において、中間体のサクシニル−ＣｏＡを、ＡＤＰと無機フォスフェートの存在下で、酵素のＳＣＳ−ＡＤＰによって、サクシネートと、ＣｏＡと、ＡＴＰに変換する（図１参照）。ＡＴＰ検出試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いて、生成されたＡＴＰを同時に、生物発光シグナル、例えば生物発光に変換する（図２参照）。
ＳＣＯＴ／ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）アッセイ方法では、サクシネートのサクシニル−ＣｏＡへの変換は、ＳＣＯＴと、アセトアセチル−ＣｏＡと、リン酸カリウム（第一／第二）と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含む試薬を用いて行う。ＡＤＰからＡＴＰへの変換は、試薬、例えば、ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）と、ＡＤＰと、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）を含む生物発光サクシネート検出試薬ＩＩのような、ＡＤＰからＡＴＰへの変換試薬を用いて、別に行う。続いて、ＡＴＰ検出試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ試薬、例えばＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を加えることによって、ＡＴＰを測定してよい。生成される発光の量は、試料に存在するサクシネートの量に比例する。
（１）第１の検出試薬−ＳＣＯＴ反応
第１の検出試薬は、ＳＣＯＴと、無機フォスフェート（リン酸カリウム（第一／第二）など）と、アセトアセチル−ＣｏＡ（３−オキソアシル−ＣｏＡとしても知られる）と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含んでよい。ＳＣＯＴ酵素は、真核生物または原核生物由来のＳＣＯＴ酵素であってよい。例えば、ＳＣＯＴ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来のＳＣＯＴ酵素であってよい。ＳＣＯＴ酵素は、真核生物または原核生物由来の３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＳＣＯＴ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来の３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ遺伝子配列によってコードしてよい。
第１の検出試薬は、ＳＣＯＴを約０．００１ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約０．００１ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約０．００１ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約０．００１ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、または少なくとも約０．００１ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．００３ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．００６ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０１２ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０２０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０９０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．１００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．１９０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．２００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．２５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．３００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．３５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．３７０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．４００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．５００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．７４０ｎｇ／μＬ、少なくとも約１．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約２．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約２．９７ｎｇ／μＬ、少なくとも約３．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約４．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約５．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約５．９４ｎｇ／μＬ、少なくとも約７．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約１０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１１．８８ｎｇ／μＬ、少なくとも約１５．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２３．７５ｎｇ／μＬ、少なくとも約３０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約４０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約４７．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約６０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約７０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約８０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約９０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約９５．０ｎｇ／μＬ、少なくとも約１００．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１９０．０ｎｇ／μＬ、少なくとも約２００．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約３００．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約３５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約３８０．０ｎｇ／μＬ、少なくとも約４００．００ｎｇ／μＬもしくは少なくとも約５００．００ｎｇ／μＬ含んでよい。
第１の検出試薬は、リン酸カリウム（第一／第二）を約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約１０００ｍＭもしくは約５００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、または少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約３５０ｍＭ、少なくとも約４００ｍＭ、少なくとも約４５０ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭ、少なくとも約５５０ｍＭ、少なくとも約６００ｍＭ、少なくとも約６５０ｍＭ、少なくとも約７００ｍＭ、少なくとも約７５０ｍＭ、少なくとも約８００ｍＭ、少なくとも約８５０ｍＭ、少なくとも約９００ｍＭ、少なくとも約９５０ｍＭもしくは少なくとも約１０００ｍＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、アセトアセチル−ＣｏＡを約１μＭ〜約１０００μＭ、約１μＭ〜約９００μＭ、約１μＭ〜約８００μＭ、約１μＭ〜約７００μＭ、約１μＭ〜約６００μＭ、約１μＭ〜約５００μＭ、約１μＭ〜約４００μＭ、約１μＭ〜約３００μＭ、約１μＭ〜約２００μＭ、約１μＭ〜約１００μＭ、約１０μＭ〜約１０００μＭ、約１０μＭ〜約９００μＭ、約１０μＭ〜約８００μＭ、約１０μＭ〜約７００μＭ、約１０μＭ〜約６００μＭ、約１０μＭ〜約５００μＭ、約１０μＭ〜約４００μＭ、約１０μＭ〜約３００μＭ、約１０μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約１０００μＭ、約１００μＭ〜約９００μＭ、約１００μＭ〜約８００μＭ、約１００μＭ〜約７００μＭ、約１００μＭ〜約６００μＭ、約１００μＭ〜約５００μＭ、約１００μＭ〜約４００μＭ、約１００μＭ〜約３００μＭ、約１００μＭ〜約２００μＭ、約２５０μＭ〜約１０００μＭ、約２５０μＭ〜約９００μＭ、約２５０μＭ〜約８００μＭ、約２５０μＭ〜約７００μＭ、約２５０μＭ〜約６００μＭ、約２５０μＭ〜約５００μＭ、約２５０μＭ〜約４００μＭ、約２５０μＭ〜約３００μＭ、約５００μＭ〜約１０００μＭ、約５００μＭ〜約９００μＭ、約５００μＭ〜約８００μＭ、約５００μＭ〜約７００μＭ、約５００μＭ〜約６００μＭ、約７５０μＭ〜約１０００μＭ、約７５０μＭ〜約９００μＭもしくは約７５０μＭ〜約８００μＭ、または少なくとも約１μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１６μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約３２μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約６０μＭ、少なくとも約６４μＭ、少なくとも約７０μＭ、少なくとも約８０μＭ、少なくとも約９０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１１０μＭ、少なくとも約１２０μＭ、少なくとも約１２５μＭ、少なくとも約１３０μＭ、少なくとも約１４０μＭ、少なくとも約１５０μＭ、少なくとも約２００μＭ、少なくとも約２５０μＭ、少なくとも約３００μＭ、少なくとも約３５０μＭ、少なくとも約４００μＭ、少なくとも約４５０μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５５０μＭ、少なくとも約６００μＭ、少なくとも約６５０μＭ、少なくとも約７００μＭ、少なくとも約７５０μＭ、少なくとも約８００μＭ、少なくとも約８５０μＭ、少なくとも約９００μＭ、少なくとも約９５０μＭもしくは少なくとも約１０００μＭ含んでよい。
（２）第２の検出試薬−ＳＣＳ反応
第２の検出試薬は、ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含んでよい。ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、真核生物または原核生物由来のＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素であってよい。例えば、ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来またはＥ．ｃｏｌｉ由来のＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素であってよい。ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、真核生物または原核生物由来のサクシニル−ＣｏＡシンターゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来またはＥ．ｃｏｌｉ由来のサクシニル−ＣｏＡシンターゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。
第２の検出試薬は、ＳＣＳ−ＡＤＰを約０．０００１Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、約０．００１０Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、約０．０１００Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、約０．１０００Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、０．０００１Ｕ／μＬ〜約０．１０００Ｕ／μＬ、約０．００１０Ｕ／μＬ〜約０．１０００Ｕ／μＬ、約０．０１００Ｕ／μＬ〜約０．１０００Ｕ／μＬ、０．０００１Ｕ／μＬ〜約０．０１００Ｕ／μＬもしくは約０．００１０Ｕ／μＬ〜約０．０１００Ｕ／μＬ、または少なくとも約０．０００１Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００２Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００３Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００４Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００５Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００６Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００１０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００１３Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００１５Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００２０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００２５Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００５０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０１００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０２００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０３００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０４１０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０５００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０７５０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０８００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０９００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．１０００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．１５００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．１６２０Ｕ／μＬもしくは少なくとも約０．２０００Ｕ／μＬ含んでよい。
第２の検出試薬は、ＡＤＰを少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約１．０μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約２．０μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３．０μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４．０μＭまたは少なくとも約５．０μＭ含んでよい。
ｂ．修正型ＳＣＯＴ／ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）アッセイ（ＡＤＰからＡＴＰへの変換）
酵素のＳＣＯＴは、サクシネートとアセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートとサクシニル−ＣｏＡへの変換を触媒する（図１参照）。中間体のサクシニル−ＣｏＡは、第２の反応において、ＡＤＰと無機フォスフェートの存在下で、酵素のＳＣＳ−ＡＤＰによって、サクシネートと、ＣｏＡと、ＡＴＰに変換される（図１参照）。続いて、ＡＴＰ検出試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いて、生成されたＡＴＰを生物発光シグナル、例えば生物発光に変換する（図１６参照）。
この修正型ＳＣＯＴ／ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）アッセイ方法では、サクシネートのＡＴＰへの変換は、ＳＣＯＴと、アセトアセチル−ＣｏＡと、リン酸カリウム（第一／第二）と、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＡＤＰ形成）（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含む試薬を用いて行う。続いて、ＡＴＰ検出試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ試薬、例えばＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を加えることによって、ＡＴＰを測定してよい。ＳＣＳ−ＡＤＰ活性には、マグネシウムが必要であり、これは、マグネシウムがないと、このアッセイにおける活性が１０倍低下するからである。生成される発光の量は、試料に存在するサクシネートの量に比例する。
（１）第１の検出試薬−ＳＣＯＴ／ＳＣＳ−ＡＤＰ反応
第１の検出試薬は、ＳＣＯＴと、無機フォスフェート（リン酸カリウム（第一／第二）など）と、アセトアセチル−ＣｏＡ（３−オキソアシル−ＣｏＡとしても知られている）と、ＳＣＳ（ＡＤＰ形成、ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含んでよい。ＳＣＯＴ酵素は、真核生物または原核生物由来のＳＣＯＴ酵素であってよい。例えば、ＳＣＯＴ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来のＳＣＯＴ酵素であってよい。ＳＣＯＴ酵素は、真核生物または原核生物由来の３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＳＣＯＴ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来の３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ遺伝子配列によってコードしてよい。
第１の検出試薬は、ＳＣＯＴを約０．００１ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約５００．００ｎｇ／μＬ、約０．００１ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約４００．００ｎｇ／μＬ、約０．００１ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約３００．００ｎｇ／μＬ、約０．００１ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約０．０１０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約０．１０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約１０．０ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、約１００．００ｎｇ／μＬ〜約２５０．００ｎｇ／μＬ、または少なくとも約０．００１ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．００３ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．００６ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０１２ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０２０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．０９０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．１００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．１９０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．２００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．２５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．３００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．３５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．３７０ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．４００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．５００ｎｇ／μＬ、少なくとも約０．７４０ｎｇ／μＬ、少なくとも約１．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約２．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約２．９７ｎｇ／μＬ、少なくとも約３．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約４．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約５．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約５．９４ｎｇ／μＬ、少なくとも約７．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約１０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１１．８８ｎｇ／μＬ、少なくとも約１５．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２３．７５ｎｇ／μＬ、少なくとも約３０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約４０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約４７．５０ｎｇ／μＬ、少なくとも約５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約６０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約７０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約８０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約９０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約９５．０ｎｇ／μＬ、少なくとも約１００．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約１９０．０ｎｇ／μＬ、少なくとも約２００．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約２５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約３００．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約３５０．００ｎｇ／μＬ、少なくとも約３８０．０ｎｇ／μＬ、少なくとも約４００．００ｎｇ／μＬもしくは少なくとも約５００．００ｎｇ／μＬ含んでよい。
第１の検出試薬は、リン酸カリウム（第一／第二）を約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約１０００ｍＭもしくは約５００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、または少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約３５０ｍＭ、少なくとも約４００ｍＭ、少なくとも約４５０ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭ、少なくとも約５５０ｍＭ、少なくとも約６００ｍＭ、少なくとも約６５０ｍＭ、少なくとも約７００ｍＭ、少なくとも約７５０ｍＭ、少なくとも約８００ｍＭ、少なくとも約８５０ｍＭ、少なくとも約９００ｍＭ、少なくとも約９５０ｍＭもしくは少なくとも約１０００ｍＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、アセトアセチル−ＣｏＡを約１μＭ〜約１０００μＭ、約１μＭ〜約９００μＭ、約１μＭ〜約８００μＭ、約１μＭ〜約７００μＭ、約１μＭ〜約６００μＭ、約１μＭ〜約５００μＭ、約１μＭ〜約４００μＭ、約１μＭ〜約３００μＭ、約１μＭ〜約２００μＭ、約１μＭ〜約１００μＭ、約１０μＭ〜約１０００μＭ、約１０μＭ〜約９００μＭ、約１０μＭ〜約８００μＭ、約１０μＭ〜約７００μＭ、約１０μＭ〜約６００μＭ、約１０μＭ〜約５００μＭ、約１０μＭ〜約４００μＭ、約１０μＭ〜約３００μＭ、約１０μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約１０００μＭ、約１００μＭ〜約９００μＭ、約１００μＭ〜約８００μＭ、約１００μＭ〜約７００μＭ、約１００μＭ〜約６００μＭ、約１００μＭ〜約５００μＭ、約１００μＭ〜約４００μＭ、約１００μＭ〜約３００μＭ、約１００μＭ〜約２００μＭ、約２５０μＭ〜約１０００μＭ、約２５０μＭ〜約９００μＭ、約２５０μＭ〜約８００μＭ、約２５０μＭ〜約７００μＭ、約２５０μＭ〜約６００μＭ、約２５０μＭ〜約５００μＭ、約２５０μＭ〜約４００μＭ、約２５０μＭ〜約３００μＭ、約５００μＭ〜約１０００μＭ、約５００μＭ〜約９００μＭ、約５００μＭ〜約８００μＭ、約５００μＭ〜約７００μＭ、約５００μＭ〜約６００μＭ、約７５０μＭ〜約１０００μＭ、約７５０μＭ〜約９００μＭもしくは約７５０μＭ〜約８００μＭ、または少なくとも約１μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１６μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約３２μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約６０μＭ、少なくとも約６４μＭ、少なくとも約７０μＭ、少なくとも約８０μＭ、少なくとも約９０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１１０μＭ、少なくとも約１２０μＭ、少なくとも約１２５μＭ、少なくとも約１３０μＭ、少なくとも約１４０μＭ、少なくとも約１５０μＭ、少なくとも約２００μＭ、少なくとも約２５０μＭ、少なくとも約３００μＭ、少なくとも約３５０μＭ、少なくとも約４００μＭ、少なくとも約４５０μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５５０μＭ、少なくとも約６００μＭ、少なくとも約６５０μＭ、少なくとも約７００μＭ、少なくとも約７５０μＭ、少なくとも約８００μＭ、少なくとも約８５０μＭ、少なくとも約９００μＭ、少なくとも約９５０μＭもしくは少なくとも約１０００μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＡＤＰを約０．０００１Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、約０．００１０Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、約０．０１００Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、約０．１０００Ｕ／μＬ〜約０．１５００Ｕ／μＬ、０．０００１Ｕ／μＬ〜約０．１０００Ｕ／μＬ、約０．００１０Ｕ／μＬ〜約０．１０００Ｕ／μＬ、約０．０１００Ｕ／μＬ〜約０．１０００Ｕ／μＬ、０．０００１Ｕ／μＬ〜約０．０１００Ｕ／μＬもしくは約０．００１０Ｕ／μＬ〜約０．０１００Ｕ／μＬ、または少なくとも約０．０００１Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００２Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００３Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００４Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００５Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０００６Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００１０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００１３Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００１５Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００２０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００２５Ｕ／μＬ、少なくとも約０．００５０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０１００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０２００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０３００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０４１０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０５００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０７５０Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０８００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．０９００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．１０００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．１５００Ｕ／μＬ、少なくとも約０．１６２０Ｕ／μＬもしくは少なくとも約０．２０００Ｕ／μＬ含んでよい。
第１の検出試薬は、ＡＤＰを少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約１．０μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約２．０μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３．０μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４．０μＭまたは少なくとも約５．０μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）を約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．２０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．４０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約０．８０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約２５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約２５ｍＭもしくは約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または少なくとも約０．０５ｍＭ、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．２ｍＭ、少なくとも約０．４ｍＭ、少なくとも約０．８ｍＭ、少なくとも約１．５６ｍＭ、少なくとも約３．１３ｍＭ、少なくとも約６．２５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２１ｍＭ、少なくとも約２２ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３１ｍＭ、少なくとも約３２ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４１ｍＭ、少なくとも約４２ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭもしくは少なくとも約５０ｍＭ含んでよい。
（２）第２の検出試薬−ルシフェラーゼ反応
第２の検出試薬は、生物発光酵素と、ルシフェリン基質と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含んでよい。
ｃ．ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫアッセイ
酵素のＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼは、サクシネートと、ＣｏＡと、ＧＴＰのサクシニル−ＣｏＡと、ＧＤＰと、Ｐｉへの変換を触媒する。このＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫアッセイ方法では、サクシネートのサクシニル−ＣｏＡへの変換は、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ（「ＳＣＳ−ＧＤＰ」）と、ＧＴＰと、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）と、コエンザイムＡを含む試薬を用いて行う。ＧＤＰのＡＴＰへの変換は、グアニレートキナーゼとＡＤＰを含む試薬を用いて別に行ってよい。続いて、ＡＴＰ検出試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ試薬、例えばＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を加えることによって、ＡＴＰを測定してよい。このアッセイにおけるＳＤＳ−ＧＤＰ活性とＧＭＰＫ活性の両方には、マグネシウムが必要である。生成される発光の量は、試料に存在するサクシネートの量に比例する（図８参照）。
（１）第１の検出試薬−ＳＣＳ−ＧＤＰ
第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含む。ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、真核生物または原核生物由来のＳＣＳ−ＧＤＰ酵素であってよい。例えば、ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来のＳＣＳ−ＧＤＰ酵素であってよい。ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、真核生物または原核生物由来のサクシネート−ＣｏＡリガーゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来のサクシネート−ＣｏＡリガーゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。
第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰを約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、約１０．０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約１０．０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬもしくは約１０．０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、または少なくとも約０．５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．７８μｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約６μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬもしくは少なくとも約１００μｇ／ｍＬ含んでよい。
第１の検出試薬は、ＧＴＰを約１μＭ〜約３０μＭ、約１μＭ〜約２０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約５μＭ〜約２０μＭもしくは約５μＭ〜約１０μＭ、または少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１１μＭ、少なくとも約１２μＭ、少なくとも約１３μＭ、少なくとも約１４μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約１６μＭ、少なくとも約１７μＭ、少なくとも約１８μＭ、少なくとも約１９μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭもしくは少なくとも約３０μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、コエンザイムＡを約１μＭ〜約２５μＭ、約１μＭ〜約２０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約２５μＭ、約５μＭ〜約２０μＭもしくは約５μＭ〜約１０μＭ、または少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１１μＭ、少なくとも約１２μＭ、少なくとも約１３μＭ、少なくとも約１４μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約１６μＭ、少なくとも約１７μＭ、少なくとも約１１０μＭ、少なくとも約１８μＭ、少なくとも約１９μＭ、少なくとも約２０μＭもしくは少なくとも約２５μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）を約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．２０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．４０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約０．８０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約２５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約２５ｍＭもしくは約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または少なくとも約０．０５ｍＭ、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．２ｍＭ、少なくとも約０．４ｍＭ、少なくとも約０．８ｍＭ、少なくとも約１．５６ｍＭ、少なくとも約３．１３ｍＭ、少なくとも約６．２５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２１ｍＭ、少なくとも約２２ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３１ｍＭ、少なくとも約３２ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４１ｍＭ、少なくとも約４２ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭもしくは少なくとも約５０ｍＭ含んでよい。
（２）第２の検出試薬−ＧＭＰＫ
第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含んでよい。ＧＭＰＫ酵素は、真核生物または原核生物由来のＧＭＰＫ酵素であってよい。例えば、ＧＭＰＫ酵素は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来のＧＭＰＫ酵素であってよい。ＧＭＰＫ酵素は、真核生物または原核生物由来のグアニレートキナーゼ１遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＧＭＰＫ酵素は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来のグアニレートキナーゼ１遺伝子配列によってコードしてよい。
第２の検出試薬は、ＧＭＰＫを約０．０１μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約０．０１μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．０２μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．０４μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．０８μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．１６μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．３１μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．６３μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２．０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２８０μｇ／ｍＬもしくは少なくとも約３００μｇ／ｍＬ含んでよい。
第２の検出試薬は、ＡＤＰを約０．５μＭ〜約５．０μＭ、約０．５μＭ〜約４．０μＭ、約０．５μＭ〜約３．０μＭ、約０．５μＭ〜約２．０μＭ、約１．０μＭ〜約５．０μＭ、約１．０μＭ〜約４．０μＭ、約１．０μＭ〜約３．０μＭ、約１．０μＭ〜約２．０μＭ、約２．０μＭ〜約５．０μＭ、約２．０μＭ〜約４．０μＭ、約２．０μＭ〜約３．０μＭ、約３．０μＭ〜約５．０μＭ、約３．０μＭ〜約４．０μＭもしくは約４．０μＭ〜約５．０μＭ、または少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約１．０μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約２．０μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３．０μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４．０μＭもしくは少なくとも約５．０μＭ含んでよい。
ｄ．修正型ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫアッセイ
酵素のＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼは、サクシネートと、ＣｏＡと、ＧＴＰのサクシニル−ＣｏＡと、ＧＤＰと、Ｐｉへの変換を触媒する。このＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫアッセイ方法では、サクシネートのサクシニル−ＣｏＡへの変換は、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ（「ＳＣＳ−ＧＤＰ」）と、ＧＴＰと、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）と、コエンザイムＡを含む試薬を用いて行う。グアニレートキナーゼとＡＤＰを含む試薬を用いて、ＧＤＰのＡＴＰへの変換を同時に行ってもよい。続いて、ＡＴＰ検出試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ試薬、例えばＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を加えることによって、生成されるＡＴＰを測定してよい。生成される発光の量は、試料に存在するサクシネートの量に比例する。
（１）第１の検出試薬−ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ反応
第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含む。ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、真核生物または原核生物由来のＳＣＳ−ＧＤＰ酵素であってよい。例えば、ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来のＳＣＳ−ＧＤＰ酵素であってよい。ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、真核生物または原核生物由来のサクシネート−ＣｏＡリガーゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＳＣＳ−ＧＤＰ酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ由来のサクシネート−ＣｏＡリガーゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。ＧＭＰＫ酵素は、真核生物または原核生物由来のＧＭＰＫ酵素であってよい。例えば、ＧＭＰＫ酵素は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来のＧＭＰＫ酵素であってよい。ＧＭＰＫ酵素は、真核生物または原核生物由来のグアニレートキナーゼ１遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＧＭＰＫ酵素は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ由来のグアニレートキナーゼ１遺伝子配列によってコードしてよい。
第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰを約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、約１０．０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約１０．０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬもしくは約１０．０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、または少なくとも約０．５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．７８μｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約６μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬもしくは少なくとも約１００μｇ／ｍＬ含んでよい。
第１の検出試薬は、ＧＴＰを約１μＭ〜約３０μＭ、約１μＭ〜約２０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約５μＭ〜約２０μＭもしくは約５μＭ〜約１０μＭ、または少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１１μＭ、少なくとも約１２μＭ、少なくとも約１３μＭ、少なくとも約１４μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約１６μＭ、少なくとも約１７μＭ、少なくとも約１８μＭ、少なくとも約１９μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭもしくは少なくとも約３０μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、コエンザイムＡを約１μＭ〜約２５μＭ、約１μＭ〜約２０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約２５μＭ、約５μＭ〜約２０μＭもしくは約５μＭ〜約１０μＭ、または少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１１μＭ、少なくとも約１２μＭ、少なくとも約１３μＭ、少なくとも約１４μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約１６μＭ、少なくとも約１７μＭ、少なくとも約１１０μＭ、少なくとも約１８μＭ、少なくとも約１９μＭ、少なくとも約２０μＭもしくは少なくとも約２５μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、ＧＭＰＫを約０．０１μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約０．０１μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．０２μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．０４μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．０８μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．１６μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．３１μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．６３μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２．０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２８０μｇ／ｍＬもしくは少なくとも約３００μｇ／ｍＬ含んでよい。
第１の検出試薬は、ＡＤＰを約０．５μＭ〜約５．０μＭ、約０．５μＭ〜約４．０μＭ、約０．５μＭ〜約３．０μＭ、約０．５μＭ〜約２．０μＭ、約１．０μＭ〜約５．０μＭ、約１．０μＭ〜約４．０μＭ、約１．０μＭ〜約３．０μＭ、約１．０μＭ〜約２．０μＭ、約２．０μＭ〜約５．０μＭ、約２．０μＭ〜約４．０μＭ、約２．０μＭ〜約３．０μＭ、約３．０μＭ〜約５．０μＭ、約３．０μＭ〜約４．０μＭもしくは約４．０μＭ〜約５．０μＭ、または少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約１．０μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約２．０μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３．０μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４．０μＭもしくは少なくとも約５．０μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）を約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．２０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．４０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約０．８０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約２５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約２５ｍＭもしくは約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または少なくとも約０．０５ｍＭ、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．２ｍＭ、少なくとも約０．４ｍＭ、少なくとも約０．８ｍＭ、少なくとも約１．５６ｍＭ、少なくとも約３．１３ｍＭ、少なくとも約６．２５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２１ｍＭ、少なくとも約２２ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３１ｍＭ、少なくとも約３２ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４１ｍＭ、少なくとも約４２ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭもしくは少なくとも約５０ｍＭ含んでよい。
（２）第２の検出試薬−ルシフェラーゼ反応
第２の検出試薬は、生物発光酵素と、ルシフェリン基質と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含んでよい。
ｅ．ＳＣＳ−ＡＤＰ／ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ
酵素のＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼは、サクシネートと、ＣｏＡと、ＡＴＰのサクシニル−ＣｏＡと、ＡＤＰと、Ｐｉへの変換を触媒する。このＳＣＳ−ＡＤＰ／ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ方法では、サクシネートのサクシニル−ＣｏＡへの変換は、ＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＴＰと、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）と、コエンザイムＡを含む試薬を用いて行う。サクシネートのサクシニル−ＣｏＡへの変換後に存在または残存するＡＴＰは、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼとを含むＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）のような試薬を用いて枯渇させる。ＡＤＰからＡＴＰへの変換は、ピルベートキナーゼとフォスフォエノールピルベートとを含む試薬を用いて、別に行ってもよい。変換されたＡＴＰは、ＡＴＰ検出試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬、例えばＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を用いて、発光によって測定してよい。ＡＤＰからＡＴＰへの変換と、発光の生成は、ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）Ｋｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）のような試薬を用いて、同時に行ってよい。
（１）第１の検出試薬−ＳＣＳ−ＡＤＰ
第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＴＰと、コエンザイムＡと、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含む。ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、真核生物または原核生物由来のＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素を含んでよい。例えば、ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａまたはＥ．ｃｏｌｉ由来のＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素であってよい。ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、真核生物または原核生物由来のサクシニル−ＣｏＡシンターゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、ＳＣＳ（ＡＤＰ形成）酵素は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａまたはＥ．ｃｏｌｉ由来のサクシニル−ＣｏＡシンターゼα及びβサブユニット遺伝子配列によってコードしてよい。
第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＡＤＰを約０．０５単位／ｍＬ〜約１．０単位／ｍＬ、約０．１０単位／ｍＬ〜約１．０単位／ｍＬ、約０．２５単位／ｍＬ〜約１．０単位／ｍＬもしくは約０．５０単位／ｍＬ〜約１．０単位／ｍＬ、または少なくとも約０．０５単位／ｍＬ、少なくとも約０．１０単位／ｍＬ、少なくとも約０．１５単位／ｍＬ、少なくとも約０．２０単位／ｍＬ、少なくとも約０．２１単位／ｍＬ、少なくとも約０．２２単位／ｍＬ、少なくとも約０．２３単位／ｍＬ、少なくとも約０．２４単位／ｍＬ、少なくとも約０．２５単位／ｍＬ、少なくとも約０．２６単位／ｍＬ、少なくとも約０．２７単位／ｍＬ、少なくとも約０．２８単位／ｍＬ、少なくとも約０．２９単位／ｍＬ、少なくとも約０．３０単位／ｍＬ、少なくとも約０．３５単位／ｍＬ、少なくとも約０．４０単位／ｍＬ、少なくとも約０．４５単位／ｍＬ、少なくとも約０．５０単位／ｍＬもしくは少なくとも約１．０Ｕｎｉｔ／ｍＬ含んでよい。
第１の検出試薬は、ＡＴＰを約５μＭ〜約１００μＭ、約５μＭ〜約７０μＭ、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約２５μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約１０μＭ〜約７０μＭ、約１０μＭ〜約５０μＭ、約１０μＭ〜約２５μＭ、約２５μＭ〜約１００μＭ、約２５μＭ〜約７０μＭ、約２５μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約１００μＭもしくは約５０μＭ〜約７０μＭ、または少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約２６μＭ、少なくとも約２７μＭ、少なくとも約２８μＭ、少なくとも約２９μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約３１μＭ、少なくとも約３２μＭ、少なくとも約３３μＭ、少なくとも約３４μＭ、少なくとも約３５μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約４５μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約６０μＭ、少なくとも約７０μＭ、少なくとも約８０μＭ、少なくとも約９０μＭもしくは少なくとも約１００μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、コエンザイムＡを約５μＭ〜約１００μＭ、約５μＭ〜約７０μＭ、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約２５μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約１０μＭ〜約７０μＭ、約１０μＭ〜約５０μＭ、約１０μＭ〜約２５μＭ、約２５μＭ〜約１００μＭ、約２５μＭ〜約７０μＭ、約２５μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約１００μＭもしくは約５０μＭ〜約７０μＭ、または少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約２６μＭ、少なくとも約２７μＭ、少なくとも約２８μＭ、少なくとも約２９μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約３１μＭ、少なくとも約３２μＭ、少なくとも約３３μＭ、少なくとも約３４μＭ、少なくとも約３５μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約４５μＭ、少なくとも約５０μＭもしくは少なくとも約１００μＭ含んでよい。
第１の検出試薬は、硫酸マグネシウムまたはその他の二価カチオン（塩化マグネシウムなど）を約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．３９ｍＭ、約０．１０ｍＭ〜約０．２０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．７８ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約０．４０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約０．８０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１．５６ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約１．５６ｍＭ〜約３．１３ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約２５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約３．１３ｍＭ〜約６．２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約６．２５ｍＭ〜約１２．５ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１２．５ｍＭ〜約２５ｍＭもしくは約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または少なくとも約０．０５ｍＭ、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．２ｍＭ、少なくとも約０．４ｍＭ、少なくとも約０．８ｍＭ、少なくとも約１．５６ｍＭ、少なくとも約３．１３ｍＭ、少なくとも約６．２５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２１ｍＭ、少なくとも約２２ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３１ｍＭ、少なくとも約３２ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４１ｍＭ、少なくとも約４２ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭもしくは少なくとも約５０ｍＭ含んでよい。
（２）第２の検出試薬−ＡＴＰの枯渇とＡＤＰの変換
第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含んでよい。このＡＴＰ枯渇試薬は、試料からＡＴＰを枯渇させる酵素を含んでよく、すなわち、試料ＡＴＰを枯渇させる酵素は、試料中のＡＴＰを加水分解または変換することができる。例えば、この酵素は、アデニレートシクラーゼとＡＴＰスルフリラーゼを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼと、マグネシウムと、カルモジュリンと、緩衝液（ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）など）を含んでよい。アデニレートシクラーゼ酵素は、真核生物または原核生物由来のアデニレートシクラーゼ酵素であってよい。例えば、アデニレートシクラーゼ酵素は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトキシン由来のアデニレートシクラーゼ酵素であってよい。アデニレートシクラーゼ酵素は、真核生物または原核生物由来のアデニレートシクラーゼ遺伝子配列によってコードしてよい。例えば、アデニレートシクラーゼ酵素は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトキシン由来のアデニレートシクラーゼ遺伝子配列によってコードしてよい。
アデニレートシクラーゼ酵素は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトキシン由来のアデニレートシクラーゼ遺伝子配列によってコードしてよい。ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼを約１００μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１２５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１７５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ〜約１７５μｇ／ｍＬ、約１２５μｇ／ｍＬ〜約１７５μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ〜約１７５μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ〜約１５０μｇ／ｍＬ、約１２５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１２５μｇ／ｍＬ〜約１７５μｇ／ｍＬもしくは約１２５μｇ／ｍＬ〜約１５０μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１１５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１３５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１４５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１６５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１７０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１８０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１８５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１９０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１９５μｇ／ｍＬもしくは少なくとも約２００μｇ／ｍＬ含んでよい。
ＡＴＰ枯渇試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬の前に、別に加えてよい。ＡＴＰ枯渇反応は、ＡＴＰを確実に完全に枯渇させるような、すなわち、全てのＡＴＰをｃＡＭＰに完全に変換するような温度で、十分な時間で行ってよい。
全てのＡＴＰをｃＡＭＰに変換するときに、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を加えて、ＡＤＰを同時に変換して、ＡＴＰを生成させるとともに、生成されたＡＴＰを用いて、発光を生成させてよい。ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼ（ＰＫ）と、フォスフォエノールピルベートと、塩化マグネシウムまたはその他の二価カチオンと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質と、緩衝液（ＭＯＰＳ、ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳなど）を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＡＴＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、第２の試薬に含まれていてもよい。いくつかの実施形態では、ＡＴＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、第３の試薬に含まれていてもよい。
ｆ．生物発光酵素と、対応する基質
ルシフェラーゼ酵素は、検出可能な光生成物、感度をもたらす触媒生成物を生成して、ＡＴＰの容易な測定を可能にする。しかしながら、本発明の方法及び組成物では、ＡＴＰ依存型であるいずれの生物発光生成酵素も用いてよい。最も基本的なレベルでは、ルシフェラーゼは、発光を生成させる能力によって定義される。より具体的には、ルシフェラーゼは、ルシフェリン基質の酸化を触媒して、オキシルシフェリンと光子を生成させる酵素である。
これまで、数種のルシフェラーゼが同定されている。それらの中でも、甲虫ルシフェラーゼ（一般的なホタル（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ科）のルシフェラーゼなど）は、独特の進化的起源を有する別個の種を形成する。甲虫ルシフェラーゼは、文献ではホタルルシフェラーゼと称されることが多いが、ホタルルシフェラーゼは実際には、甲虫ルシフェラーゼ種のサブグループである。甲虫ルシフェラーゼは、甲虫そのものの発光部位または当該技術分野において周知のタンパク質発現系から精製してよい。
甲虫ルシフェラーゼ、特に北米のホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼが、当該技術分野において周知である。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｙ）は、その遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質によって算出した場合、Ｍr６１ｋＤａの約５５０個のアミノ酸からなる。しかしながら、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａホタルルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｅ２、５４５個のアミノ酸残基、ＧｅｎＢａｎｋ２１９０５３４）のようなその他のホタルルシフェラーゼが知られている。ＬｕｃＰｐｅ２に由来する耐熱性及び／または化学的に安定な変異型ルシフェラーゼ（例えばＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（７８−０Ｂ１０としても知られている）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（９０−１Ｂ５としても知られている）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３（１３３−１Ｂ２としても知られている）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６（１４６−１Ｈ２としても知られている）を用いてよいが、本発明の組成物、方法及びキットでは、本明細書に示されている制限を満たすいずれのルシフェラーゼも用いてよい。ＬｕｃＰｐｅから変異型ルシフェラーゼを作製する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０９２５に開示されている。
本発明では、典型的には、単離及び／または精製ルシフェラーゼを用いる。本明細書に記載されている方法、組成物及びキットで用いてよいルシフェラーゼとしては、ＷＯ１９９９／１４３３６、ＷＯ２００１／２０００２、ＥＰ１１２４９４４、ＥＰ１２２４２９４、米国特許第６，１７１，８０８号、同第６，１３２，９８３号及び同第６，２６５，１７７号に見られるものが挙げられる。
ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼを産生する生体試料または所望のルシフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを発現する細胞から単離できる。このような技法は、当業者に周知である（米国特許第６，６０２，６７７号参照）。
甲虫ルシフェラーゼの天然の基質は、ホタルルシフェリン、ポリ複素環式有機酸、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸（Ｄ−ルシフェリン）である。ルシフェリンは、天然物（例えばホタル）から単離しても、合成してもよい。合成ルシフェリンは、天然のルシフェリンと同じ構造を有することができ、または、同様に機能するならば、誘導体化することもできる。ルシフェリンの誘導体の例としては、試料中のエステラーゼによって加水分解されるか、または作用を受けてルシフェリンが生成されるＤ−ルシフェリンメチルエステル及びルシフェリンのその他のエステルと、ナフチル−ルシフェリンと、キノリル−ルシフェリンが挙げられる（Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。ルシフェリンの供給業者は多数存在する（例えば、ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）。
発光を生成させる甲虫ルシフェラーゼ−触媒反応（ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応）は、ホタルルシフェリンと、アデノシントリフォスフェート（ＡＴＰ）と、マグネシウムと、分子状酸素を必要とする。初期反応では、ホタルルシフェリンとＡＴＰが反応して、ルシフェリルアデニレートを形成させ、無機ピロフォスフェートが放出される。ルシフェリルアデニレートは、ルシフェラーゼの触媒部位に強固に結合したままである。この形態の酵素が分子状酸素に暴露されると、酵素に結合したルシフェリルアデニレートが酸化されて、電子励起状態のオキシルシフェリンが生成される。励起している酸化ルシフェリンは、基底状態に戻る際に光を発する。
３．サクシネートの検出及び定量方法
本開示は、サクシネートの検出及び定量方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、この場合、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。例示的なＡＴＰ枯渇試薬及び／またはＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、米国特許第８，１８３，００７号に記載されており、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
これらの酵素のいずれかを必要とする反応のいずれか１つは、時間、酵素濃度及び／または基質濃度によって制限または限定してよい。反応条件は、反応が、約、少なくとも約または最大で約１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの割合のうちの導出可能ないずれかの範囲で完了する条件下で行われるように調節してよい。
例えば、上記の反応のいずれも、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約１５℃〜約３５℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約４５℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、約２０℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約４５℃、約２５℃〜約４０℃、約２５℃〜約３５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約４５℃、約３０℃〜約４０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４５℃または約３５℃〜約４０℃の温度で行ってよい。上記の反応は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃で行ってよい。
例えば、ＳＣＯＴ、ＳＣＳ−ＡＤＰ及び／またはＳＣＳ−ＧＤＰによるサクシニル−ＣｏＡの形成は、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約１５℃〜約３５℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約４５℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、約２０℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約４５℃、約２５℃〜約４０℃、約２５℃〜約３５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約４５℃、約３０℃〜約４０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４５℃または約３５℃〜約４０℃の温度で行ってよい。ＳＣＯＴ、ＳＣＳ−ＡＤＰ及び／またはＳＣＳ−ＧＤＰによるサクシニル−ＣｏＡの形成は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃で行ってよい。
例えば、グアニレートキナーゼによるＧＤＰのＡＴＰへの変換は、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約１５℃〜約３５℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約４５℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、約２０℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約４５℃、約２５℃〜約４０℃、約２５℃〜約３５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約４５℃、約３０℃〜約４０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４５℃または約３５℃〜約４０℃の温度で行ってよい。グアニレートキナーゼによるＧＤＰのＡＴＰへの変換は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃で行ってよい。
例えば、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼによるＡＴＰの枯渇は、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約１５℃〜約３５℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約４５℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、約２０℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約４５℃、約２５℃〜約４０℃、約２５℃〜約３５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約４５℃、約３０℃〜約４０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４５℃または約３５℃〜約４０℃の温度で行ってよい。アデニレートシクラーゼによるＡＴＰの枯渇は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃で行ってよい。
例えば、ピルベートキナーゼによるＡＤＰからＡＴＰへの変換は、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約１５℃〜約３５℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約４５℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、約２０℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約４５℃、約２５℃〜約４０℃、約２５℃〜約３５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約４５℃、約３０℃〜約４０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４５℃または約３５℃〜約４０℃の温度で行ってよい。ピルベートキナーゼとフォスフォエノールピルベートによるＡＤＰからＡＴＰへの変換は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃で行ってよい。
これらの温度条件及び／または反応は、１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分または９０分超、保持してよい。
例示的なＡＴＰ枯渇及び／またはＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出反応温度及び条件は、米国特許第８，１８３，００７号に記載されており、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
生成されたＡＴＰの量は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を用いて割り出す。ＡＴＰの検出を促すために、ＡＴＰは、ルシフェリン及び十分な分子状酸素（Ｏ2）とともに、ルシフェラーゼによって使用されて、それによって、ＡＭＰと、ＰＰｉと、オキシルシフェリンと、ＣＯ2と、光を生成させる。本明細書に記載されているアッセイは、測定可能な発光を生成させる。発光量の定量によって、ＡＴＰの量を定量し、その結果、試料中のサクシネートの量を定量する。測定される発光（相対発光値、ＲＬＵ）は、試料に存在するサクシネートのレベルに比例する。例えば、対照試料から生成された発光、または既知量のＡＴＰ及び／もしくはサクシネートと、同じルシフェラーゼ及び反応条件（すなわち、温度、ｐＨなど）とを用いることによって割り出した検量線と、試験試料から生成された発光を比較すると、定量的なＡＴＰ値が得られる。定量には、バックグラウンド値を差し引くこと、またはバックグラウンドを上回るシグナルを算出することが必要になることが理解される。１つの試料から生成された発光を、別の試料から生成された発光と比較すると、試料に存在するサクシネートの絶対量を得る必要なく、定性的なＡＴＰ値が得られる。あるいは、ＡＴＰの検出の出力に干渉し得るいずれかの内因性ＡＴＰを試料から枯渇させてよい。
本明細書に記載されている方法は、発光結果を対照または比較試料と比較することを含んでよい。例えば、その対照または比較試料は、既知量のサクシネートを含んでよい。較正組成物群を用いてサクシネートの検量線を作成して、発光（ＲＬＵ）を、試料に存在するサクシネートの量と相関させてよい。
４．サクシネート形成または生成酵素の検出及び定量方法
本開示は、サクシネート形成もしくは生成酵素、及び／またはそれらの活性の検出及び定量方法も提供する。この方法は、試料において、脱メチル化反応のようなサクシネート形成または生成反応で、サクシネート形成または生成酵素によって形成されるサクシネートのレベルに比例する測定可能な発光を生成させる。例えば、サクシネート形成または生成反応は、サクシネート形成または生成酵素を含む試料を、ヒストンまたはペプチド基質のようなペプチドまたはタンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることを含んでよい。続いて、上記のように、このサクシネート反応混合物を第１の検出試薬と第２の検出試薬と接触させる。試料が、ＪＭＪＣデメチラーゼまたは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼなどの２−オキソグルタレートオキシゲナーゼのようなサクシネート形成または生成酵素を含む場合には、第１の反応混合物、すなわち、サクシネート形成または生成反応において、サクシネートが形成される。
２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、基質の酸化を２ＯＧの酸化的脱炭酸に共役させることによって、２電子酸化反応を触媒して、副産物のサクシネートと二酸化炭素をもたらす。サクシネート反応混合物中に形成されるサクシネートは、第１の反応混合物において、サクシニル−ＣｏＡに変換される。サクシネートの変化を利用して、ＪＭＪＣデメチラーゼ及び／または２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼの活性のような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの活性を判断する。サクシニル−ＣｏＡは、ＡＴＰに変換され、生成されたＡＴＰの量は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を用いて割り出し、生成される光は、試料に存在するサクシネート形成もしくは生成酵素、またはサクシネート形成もしくは生成酵素活性に比例する。
サクシネート形成もしくは生成酵素、及び／またはそれらの活性の検出及び定量方法は、試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、試料がサクシネート形成または生成酵素を含む場合に、サクシネートが形成されることと、サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、前の工程で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することと、第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料におけるサクシネート形成もしくは生成酵素の存在または量、またはサクシネート形成もしくは生成酵素活性を検出または測定することを含む。いくつかの実施形態では、前の工程で形成されたサクシネートは、ＡＴＰに変換される。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含み、第３の検出試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、ＪＭＪＣデメチラーゼまたは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのようなＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼであってよい。
発光量の定量によって、試料におけるＡＴＰの量、すなわち、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼによって生成されるサクシネートの量が定量される。生成されるサクシネートの量は、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ及び／または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性に正比例する。したがって、ＡＴＰの定量により、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ及び／または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性の定量が可能になる。試料に存在する２−オキソグルタレートオキシゲナーゼによってサクシネートが生成される試験試料から生成された発光を、対照試料から生成された発光、または既知量のサクシネート及び／または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼと、同じルシフェラーゼ及び反応条件（すなわち、温度、ｐＨなど）とを用いることによって定めた検量線と比較すると、定量的なＡＴＰ値が得られる。定量には、バックグラウンド値を差し引くこと、またはバックグラウンドを上回るシグナルを算出することが必要になることが理解される。１つの試料から生成された発光を、別の試料から生成された発光と比較すると、試料に存在する２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの絶対量を知る必要なく、定性的なＡＴＰ値が得られる。
本明細書に記載されている方法は、発光結果を対照または比較試料と比較することを含んでもよい。例えば、対照または比較試料は、既知量のサクシネート及び／または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含んでよい。サクシネート及び／または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの検量線を作成して、発光（ＲＬＵ）を、試料に存在する２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの量または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性と相関させてよい。
上記の酵素のいずれかを必要とする反応のいずれか１つは、時間、酵素濃度及び／または基質濃度によって制限または限定してよい。反応条件は、反応が、約、少なくとも約または最大で約１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの割合のうちの導出可能ないずれかの範囲で完了する条件下で行われるように調節してよい。例えば、ＪＭＪＣデメチラーゼまたは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼによるサクシネートの形成は、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約１５℃〜約３５℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約４５℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、約２０℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約４５℃、約２５℃〜約４０℃、約２５℃〜約３５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約４５℃、約３０℃〜約４０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４５℃または約３５℃〜約４０℃で行ってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼまたは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼによるサクシネートの形成は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃で行ってよい。これらの温度条件は、１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分または９０分超保持してよい。
（１）Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼ
２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、ヒストンデメチラーゼのようなＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼであってよい。ヒストンデメチラーゼにはいくつかのファミリーがあり、これらのファミリーは、異なる基質に作用し、細胞機能において異なる役割を果たす。このＦｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼは、ＪＭＪＣデメチラーゼであってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪｕｍｏｎｊｉＣ（ＪｍｊＣ）ドメインを含むヒストンデメチラーゼである。そのＪＭＪＣデメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであってよい。ＪＭＪＣデメチラーゼは、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５、ＪＭＪＤ６、ＪＡＲＩＤ１Ａ、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ、ＵＴＸまたはＦＢＸＬ１１であってよい。
（ａ）ＫＤＭ３
ＫＤＭ３ファミリーには、ＫＤＭ３Ａ、ＫＤＭ３Ｂ及びＪＭＪＤ１Ｃが含まれる。ＫＤＭ３Ａ（ＪＨＤＭ２Ａ／ＪＭＪＤ１Ａ／ＴＳＧＡともいう）は、モノメチル化及びジメチル化Ｈ３Ｋ９に作用できる。ＫＤＭ３Ａは、***形成及び代謝機能における役割を有する。マウスにおけるＫＤＭ３Ａのノックダウン研究（マウスが産生するＫＤＭ３Ａのレベルを低下させた）では、雄が不妊症になり、成体が肥満化した。更なる研究では、ＫＤＭ３Ａが、アンドロゲン受容体依存性遺伝子と、多能性に関与する遺伝子との調節において役割を果たし得ることが示され、腫瘍形成におけるＫＤＭ３Ａの潜在的な役割が示されている。
（ｂ）ＫＤＭ４
ＫＤＭ４ファミリーには、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＤＭ４Ｃ及びＫＤＭ４Ｄが含まれ、これらはそれぞれ、ＪＭＤＭ３Ａ／ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＤＭ３Ｂ／ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＤＭ３Ｃ／ＪＭＪＤ２Ｃ及びＪＭＤＭ３Ｄ／ＪＭＪＤ２Ｄともいう。これらの酵素は、ジメチル化及びトリメチル化Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ３６、Ｈ１Ｋ２６に作用できる。ＫＤＭ４ＢとＫＤＭ４Ｃは、腫瘍形成における役割を有する。タンパク質のＫＤＭ４ファミリーは、悪性転換に関連付けられている。具体的には、食道扁平上皮癌、髄芽腫及び乳がんにおいて、ＫＤＭ４Ｃの増幅が立証されており、髄芽腫では、ＫＤＭ４Ｂの増幅も見られている。その他の遺伝子発現データでは、前立腺がんにおいて、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｂ及びＫＤＭ４Ｃが過剰発現することも示唆されている。
ｉ．ＪＭＪＤ２Ｃ
ＪＭＪＤ２Ｃ（リジン特異的デメチラーゼ４Ｃ）は、ヒトのＫＤＭ４Ｃ遺伝子によってコードされる酵素である。この遺伝子は、Ｊｕｍｏｎｊｉドメイン２（ＪＭＪＤ２）ファミリーのメンバーであり、１つのＪｍｊＣドメインと、１つのＪｕｍｏｎｊｉＮ（ＪｍｊＮ）ドメインと、２つのＰＨＤ型ジンクフィンガーと、２つのＴｕｄｏｒドメインを持つタンパク質をコードする。この核タンパク質は、トリメチル化特異的デメチラーゼとして機能し、特定のトリメチル化ヒストン残基をジメチル化体に変換する。この遺伝子の染色体異常と転写発現の増加は、食道扁平上皮癌と関連付けられている。
ｉｉ．ＪＭＪＤ２Ａ
ＪＭＪＤ２Ａ（リジン特異的デメチラーゼ４Ａ）は、ヒトのＫＤＭ４Ａ遺伝子によってコードされる酵素である。この遺伝子は、Ｊｕｍｏｎｊｉドメイン２（ＪＭＪＤ２）ファミリーのメンバーであり、１つのＪｍｊＮドメインと、１つのＪｍｊＣドメインと、ＪＤ２Ｈドメインと、２つのＴＵＤＯＲドメインと、２つのＰＨＤ型ジンクフィンガーを持つタンパク質をコードする。この核タンパク質は、トリメチル化特異的デメチラーゼとして機能し、特定のトリメチル化ヒストン残基をジメチル化体に変換するとともに、転写抑制因子として機能する。
（ｃ）ＫＤＭ５
ＫＤＭ５ファミリーには、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ及びＫＤＭ５Ｄが含まれ、これらはそれぞれ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ−１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ及びＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹともいう。これらの酵素は、ジメチル化及びトリメチル化Ｈ３Ｋ４に作用できる。ＫＤＭ５タンパク質ファミリーは、発生機能を有し得る。細胞培養系でのＫＤＭ５Ａは、分化、ミトコンドリア機能、細胞周期の進行の調節に関連付けられている。ＫＤＭ５ＢとＫＤＭ５Ｃは、転写抑制に関与するＰｃＧタンパク質と相互作用し得る。
ｉ．ＪＡＲＩＤ１Ａ
ＪＡＲＩＤ１Ａ（リジン特異的デメチラーゼ５Ａ）は、ヒトのＫＤＭ５Ａ遺伝子によってコードされる酵素である。このタンパク質は、ユビキタスに発現する核タンパク質であり、いくつかの他のタンパク質とともに、細胞増殖を調節する網膜芽細胞腫タンパク質に直接結合する。このタンパク質は、正式には、網膜芽細胞腫結合タンパク質２（ＲＢＰ２）として知られていたとともに、赤血球造血とＴ細胞白血病誘発とにおいて著しい機能を発揮するｒｈｏｍｂｏｔｉｎ−２とも相互作用する。ｒｈｏｍｂｏｔｉｎ−２は、コードされたタンパク質の活性に直接影響を与えるか、または網膜芽細胞腫タンパク質に結合することによって、そのタンパク質の機能を間接的に調節し得ると考えられている。この遺伝子に関しては、別個のアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写変異体が見つかっている。
（ｄ）ＫＤＭ６
ＫＤＭ６ファミリーには、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＭ６Ｂ及びＵＴＹが含まれる。ＫＤＭ６Ａ（ＵＴＸともいう）とＫＤＭ６Ｂ（ＪＭＪＤ３ともいう）は、ジメチル化及びトリメチル化Ｈ３Ｋ２７に作用し、発生における役割を有する。ＫＤＭ６ＡとＫＤＭ６Ｂはいずれも、腫瘍抑制特性を持つ。線維芽細胞においてＫＤＭ６Ａをノックダウンすると、線維芽細胞集団が迅速に増大する一方で、線維芽細胞において発現するＫＤＭ６Ｂは、ＲＡＳ＿ＲＡＦ経路の癌遺伝子を誘導する。ＫＤＭ６Ａの欠失と点突然変異は、知的障害をもたらす先天疾患である歌舞伎症候群の原因の１つとして同定されている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ＫＤＭ６Ｂのホモログを突然変異させたところ、生殖腺の発達が失われた。ＫＤＭ６Ｂの発現は、活性化マクロファージにおいてアップレギュレートされ、幹細胞の分化中に、動的に発現する。Ｄ．ｒｅｒｉｏにおけるＫＤＭ６Ａのホモログを欠損すると、発達段階における体のパターン化の調節において役割を果たすＨＯＸ遺伝子の発現が低下することが示されている。哺乳動物研究において、ＫＤＭ６ＡがＨＯＸ遺伝子を調節することも示されている。
（２）２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼ
２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、２−オキソグルタレート（２ＯＧ）依存型ジオキシゲナーゼであってよい。２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼでは、二価鉄（Ｆｅ（ＩＩ））が、（Ｈｉｓ）２（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）１「フェイシャルトライアド」モチーフによって配位されている。２ＯＧと水の二座配位によって、疑似八面体の配位圏が完成する。基質の結合後、水配位子が放出され、酸素の活性化のために、空の配位部位が生じる。酸素が結合すると、変換が行われ、その際、２ＯＧが酸化的に脱炭酸されてサクシネートとなり、Ｏ−Ｏ結合が切断されて、中間体のＦｅ（ＩＶ）−オキソ（フェリル）が形成される。続いて、この強力な酸化剤を用いて、水酸化、ハロゲン化及び脱メチル化を含む様々な反応を行う。２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼとしては、タンパク質の修飾に関わる酵素（例えば、プロリル４−ヒドロキシラーゼ、プロリル３−ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、アスパルチル−アスパラギニルβ−ヒドロキシラーゼ）、リボソームタンパク質の水酸化に関わる酵素（例えば、リボソームオキシゲナーゼＹｃｆＤ、ＭＩＮＡ５３及び核タンパク質６６）、酸素検出に関わる酵素（例えばＰＨＤ（低酸素誘導因子プロリルヒドロキシラーゼ２（「ＨＩＦ−ＰＨ２」、「ＥＧＬＮ１」及び「ＰＨＤ２」としても知られている）及びＥｇｌ ｎｉｎｅホモログ２（ＥＧＬＮ２）など）、ＨＩＦα特異的プロリル４−ヒドロキシラーゼ、ＨＩＦ阻害因子（ＦＩＨ））、ＤＮＡ及びＲＮＡの脱メチル化に関わる酵素（例えば、ＡｌｋＢ、ＡＬＫＢＨ２／３、ＦＴＯ）、ＤＮＡ及びｔＲＮＡの水酸化に関わる酵素（例えばＴＥＴ１、ＡＬＫＢＨ８）、ＲＮＡスプライシングに関わる酵素（例えばＪＭＪＤ６）、カルニチンの生合成に関わる酵素（例えば、Ｎεトリメチルリジンヒドロキシラーゼ、γ−ブチロベタインヒドロキシラーゼ）、脂質代謝に関わる酵素（例えば、フィタノイル−ＣｏＡヒドロキシラーゼ、ＬｐｘＯ）、チミジンのサルベージ経路に関わる酵素（例えばチミンヒドロキシラーゼ）、抗生物質の生合成に関わる酵素（例えば、クラバミネートシンターゼ（ＣＡＳ）、デアセトキシセファロスポリンＣシンターゼ（例えばＤＡＯＣＳ）、デアセチルセファロスポリンＣシンターゼ（例えばＤＡＣＳ）、カルバペネムシンターゼ（例えばＣａｒＣ）、プロリン３−ヒドロキシラーゼ、プロリン４−ヒドロキシラーゼ）、フラボノイドの生合成に関わる酵素（例えば、フラバノン３β−ヒドロキシラーゼ、フラボンシンターゼＩ、フラボノールシンターゼ、アントシアニジンシンターゼ（例えばＡＮＳ）、ジベレリンの生合成に関わる酵素（例えば、ジベレリン７−オキシダーゼ、ジベレリン２０−オキシダーゼ、ジベレリン２−オキシダーゼ）、アルカロイドの生合成に関わる酵素（例えば、デアセトキシビンドリン−４−ヒドロキシラーゼ、ヒヨスチアミン６β−ヒドロキシラーゼ）、硫黄の代謝に関わる酵素（例えば、タウリン／αＫＧジオキシゲナーゼ（ＴａｕＤ）、アルキルスルファターゼ（ＡｔｓＫ））、ならびにその他の活性に関わる酵素（例えば、ハイポフォスファイト／αＫＧジオキシゲナーゼ、２，４−Ｄ／αＫＧジオキシゲナーゼ（ＴｆｄＡ）、エチレン形成酵素）が挙げられる。サクシネートを生成させるその他の酵素、例えば、サクシネートデヒドロゲナーゼ及びフマレートレダクターゼも調べることができる。
（ａ）Ｔｅｔ酵素
テンイレブントランスロケーションメチルシトシンジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１）は、ヒトにおいてＴＥＴ１遺伝子によってコードされる、ＴＥＴファミリーの酵素のメンバーである。ＴＥＴ１は、修飾ＤＮＡ塩基５−メチルシトシン（５−ｍＣ）の５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）への変換を触媒し、それと共役して、α−ケトグルタレート（補基質）を酸化してサクシネートとＣＯ2にする。ＴＥＴ１は、鉄とα−ケトグルタレートに依存する形で５−ｍＣを酸化することによって、５−ｈｍＣを生成させる。５−ｍＣの５−ｈｍＣへの変換は、哺乳動物における能動的なＤＮＡ脱メチル化の最初のステップであり得る。
（ｂ）ＨＩＦ１−αの水酸化に関与する水酸化酵素
２−オキソグルタレートオキシゲナーゼは、ＨＩＦ−１αの水酸化に関与する水酸化酵素であってよい。低酸素誘導因子（ＨＩＦ）は、細胞環境における利用可能な酸素の変化、具体的には酸素の減少、すなわち低酸素状態に応答する転写因子である。ＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ１Ａ遺伝子によってコードされるヘテロダイマー転写因子の低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）のサブユニットである。ＨＩＦ−１αは、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスのＰＡＳドメインを含むタンパク質であり、低酸素状態に対する細胞応答と発生過程応答のマスター転写調節因子と考えられている。低酸素状態または遺伝的変更のいずれかによる、ＨＩＦ−１αの異常調節と過剰発現は、がん生物学に加え、多くの他の病態生理学（特に血管新生及び血管形成の分野）、エネルギー代謝、細胞生存及び腫瘍浸潤に大きく関連付けられている。水酸化酵素は、低酸素誘導因子プロリルヒドロキシラーゼ２（「ＨＩＦ−ＰＨ２」、「ＥＧＬＮ１」及び「ＰＨＤ２」としても知られている）またはＥｇｌ ｎｉｎｅホモログ２（ＥＧＬＮ２））であってよい。
ｂ．ペプチド基質またはタンパク質基質
ペプチド基質またはタンパク質基質は、サクシネート形成または生成酵素によって用いられる基質である。ペプチド基質またはタンパク質基質は、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたはタンパク質ヒドロキシラーゼのようなヒストンデメチラーゼの基質であってよい。特定のヒストンデメチラーゼの基質を示すために、符号が作られている。まず、基質は、ヒストンサブユニット（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）、メチル化されているアミノ酸の１文字表記及びその位置の数値の順で表す。最後に、「ｍｅ＃」（＃は、モノメチル化基質の場合には１、ジメチル化基質の場合には２、トリメチル化基質の場合には３である）を加えることによって、メチル化のレベルを示す場合もある。例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２は、第９位にジメチル化リジンを有するヒストンＨ３である。ペプチド基質またはタンパク質基質は、サクシネートの形成中に除去されるメチル化基を含んでよい。例えば、ペプチド基質またはタンパク質基質は、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６であってよい。
ｃ．非タンパク質基質
非タンパク質基質は、サクシネート形成または生成酵素によって用いられる基質である。非タンパク質基質は、２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼの基質であってよい。２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼは、抗生物質の生合成、またはフラボノイド、ジベレリン、アルカロイドの生合成及び脂質の代謝に関与するＦｅ（ＩＩ）依存型ＲＮＡデメチラーゼ、ＤＮＡヒドロキシラーゼ、シンターゼ、ヒドロキシラーゼまたはオキシダーゼであってよい。非タンパク質基質は、サクシネートの形成中に除去されるメチル化基を含んでよい。非タンパク質基質の例としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列においてシトシン修飾（１−アルキル基及び３−アルキル基）を含むオリゴヌクレオチド、ＤＮＡのメチル化及びヒドロキシメチル化（５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ及び５ｃａＣ）、ｔＲＮＡ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）、Ｎεトリメチルリジン、フィタノイル−ＣｏＡ、Ｎ−α−アセチル−Ｌ−アルギニン、デオキシアミジノプロクラバミネート、デオキシグアニジノプロクラバミネート、ジヒドロクラバミネート、プロクラバミン酸、３’−メチルセフェム、３−エキソメチレンセファロスポリン、７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸、セファレキシン、デアセトキシセファロスポリンＣ、フェニルアセチル−７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸、アンピシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＮ、（３Ｒ，５Ｒ）−カルバペナム−３−カルボキシレート、（３Ｓ，５Ｓ）−カルバペン−２−エム−３−カルボキシレート、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、イソロイシン、フラバノン、フラボン、フラボノール、メチル化フラボノール、アントシアニン、ジベレリンなどが挙げられる。
ｃ．２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの検出または測定方法
本開示の別の態様は、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの存在もしくは量、及び／または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性の検出または測定方法を提供する。この方法は、試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、試料が２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含む場合に、サクシネートが形成されることと、２ＯＧ依存型オキシゲナーゼのサクシネートによる阻害を防ぐために、第１の検出試薬を２ＯＧ依存型オキシゲナーゼ活性アッセイに加えてよく、サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡまたはＡＴＰに変換することと、第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの存在もしくは量、または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含む。いくつかの実施形態では、第３の検出試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。
ｄ．ＪＭＪＣデメチラーゼの検出または測定方法
本開示の別の態様は、試料中のＪＭＪＣデメチラーゼの存在もしくは量、及び／またはＪＭＪＣデメチラーゼ活性の検出または測定方法を提供する。この方法は、試料をペプチド基質またはタンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、試料がＪＭＪＣデメチラーゼを含む場合に、サクシネートが形成されることと、ＪＭＪＣデメチラーゼのサクシネートによる阻害を防ぐために、ＪＭＪＣデメチラーゼ活性アッセイに第１の検出試薬を加えてよく、サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡまたはＡＴＰに変換することと、第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中のＪＭＪＣデメチラーゼの存在もしくは量、またはＪＭＪＣデメチラーゼ活性を検出または測定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含み、第３の試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。
ｅ．２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼの検出または測定方法
本開示の別の態様は、試料中の２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼの存在もしくは量、及び／または２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼ活性の検出または測定方法を提供する。この方法は、試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、試料が２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼを含む場合に、サクシネートが形成されることと、２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのサクシネートによる阻害を防ぐために、第１の検出試薬を２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼ活性アッセイに加えてよく、サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡまたはＡＴＰに変換することと、第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中の２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼの存在もしくは量、または２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼ活性を検出または測定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含み、第３の試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。
５．細胞抽出物及び組織抽出物中のサクシネートの測定方法
本開示の別の態様は、細胞抽出物及び組織抽出物中のサクシネート中の検出及び定量方法を提供する。この方法は、試料に存在する全てのＡＴＰを除去することと、上記の方法のいずれかを用いて、抽出物に存在するサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することを含む。例えば、ＳＣＯＴを用いて、サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換してよい。ＳＣＯＴ反応によって生成されるサクシニル−ＣｏＡをＳＣＳ−ＡＤＰによってＡＴＰに変換してよく、このＡＴＰを発光によって検出する。
６．Ｔｅｔ及び／またはＴｅｔ活性の検出または測定方法
本開示の別の態様は、試料中のＴｅｔの存在もしくは量、及び／またはＴｅｔ活性の検出または測定方法を提供する。この方法は、試料を、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣまたは５ｃａＣ修飾を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドと、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、Ｔｅｔサクシネート反応混合物を形成させることであって、試料がＴｅｔを含む場合に、サクシネートが形成されることと、Ｔｅｔサクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡまたはＡＴＰに変換することと、第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、試料中のＴｅｔの存在もしくは量、またはＴｅｔ活性を検出または測定することを含む。いくつかの実施形態では、高レベルのサクシネート（すなわち、ｍＭレベル）によるＴｅｔのサクシネート阻害を防ぐ目的で、第１の検出試薬をＴｅｔサクシネート反応混合物に加えてよい。
いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含み、第３の試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。
７．２−オキソグルタレートオキシゲナーゼのモジュレーターのスクリーニング方法
サクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、本明細書に記載されている方法は、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーター候補のスクリーニング方法に組み込んでよい。２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターのスクリーニング方法であって、本明細書に記載されている方法では、測定可能な発光の生成を利用し、測定されるその発光（相対発光値、ＲＬＵ）は、試料中のサクシネートのレベルと、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性に比例する。試料は、対象となる化合物と接触させてよい。
この方法は、試料を化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡまたはＡＴＰに変換することと、第１の反応混合物を第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出することと、第２の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第２の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含み、第３の試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。
ａ．ＪＭＪＣデメチラーゼ活性のモジュレーターのスクリーニング方法
本開示の別の態様は、ある化合物が、試料中のＪＭＪＣデメチラーゼ活性を調節するかの判定方法を提供する。この方法は、試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、試料がＪＭＪＣデメチラーゼを含むことと、試験試料をペプチド基質またはタンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡまたはＡＴＰに変換することと、第１の反応混合物を第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出することと、第２の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第２の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物をＪＭＪＣデメチラーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含み、第３の試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。
ｂ．２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼ活性のモジュレーターのスクリーニング方法
本開示の別の態様は、ある化合物が、試料中の２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法を提供する。この方法は、試料をその化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、試料が、２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼを含むことと、試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成されたサクシネートをサクシニル−ＣｏＡまたはＡＴＰに変換することと、第１の反応混合物を第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、第２の反応混合物における発光を検出することと、第２の反応混合物における発光を、対照試料における発光と比較することであって、第２の反応混合物における発光が、対照試料における発光と異なる場合、その化合物を、２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬は、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）、例えばＳＣＳ−ＡＤＰと、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）（例えばＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の、すなわちＡＴＰ検出試薬は、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＳＣＳ−ＧＤＰと、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰを含み、第２の検出試薬は、生物発光酵素とルシフェリン基質を含む。いくつかの実施形態では、第１の検出試薬は、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬は、ＡＴＰ枯渇試薬を含み、第３の試薬は、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、ＡＴＰ枯渇試薬は、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬は、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。
ｃ．モジュレーター候補
本発明の方法では、モジュレーター化合物候補の多種多様なライブラリーを使用及びスクリーニングすることができる。モジュレーター候補は、抗体、小分子、薬剤、ペプチド、核酸、オリゴ糖または無機化合物であってよい。同定するモジュレーター化合物は、モジュレーター化合物候補のライブラリーから得てよい。化合物のライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーであってよい。この方法は、宿主細胞を刺激して、モジュレーター化合物候補を発現させることを含んでよい。モジュレーター候補は、ヒストンデメチラーゼＪＭＪＤインヒビターＪＩＢ−０４（Ｅ）−Ｎ−（５−クロロ−ピリジン−２−イル）−Ｎ’−（フェニル−ピリジン−２−イル−メチレン）−ヒドラジン）またはＩＯＸ１（５−カルボキシ−８ＨＱ、８−ヒドロキシ−５−キノリンカルボン酸としても知られている）のような選択的インヒビターと比較してよい。
本明細書に記載されている方法によって同定するモジュレーターは、薬理活性または治療活性を示す化合物であってよい。薬理活性を有する化合物は、ＪＭＪＣデメチラーゼまたはそのフラグメント活性を高めるかまたは妨げることができる。所望の薬理活性を有する化合物は、生理学的に許容可能な担体中で、宿主に投与してよい。
これらの薬剤は、様々な方法で、経口投与、非経口投与、例えば、皮下投与、腹腔内投与、血管内投与などを行ってよい。導入方法に応じて、それらの化合物は、様々な方法で配合してよい。製剤中の治療活性化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％まで様々であってよい。本発明のモジュレーターは、対象の体重と全体的な健康状態に適合するように、そのモジュレーターのＬＤ５０と、様々な濃度におけるそのモジュレーターの副作用によって定められる割合で投与できる。投与は、単回または分割投与で行うことができる。
本発明の、同定するモジュレーターは、単独で用いても、ＤＮＡのメチル化、脱メチル化及び／または５−ｍＣの水酸化が介在するヒト疾患の治療または予防に有益であることが知られている他の薬剤と併用してもよい。本発明のモジュレーターと、別の薬剤は、併用療法で、または固定された組み合わせのいずれかで、すなわち共投与しても、別々の時間に投与してもよい。
ｄ．対照
本明細書に記載されているいずれかの方法において、対照試料を含めるのが望ましいことがある。この対照試料は、当該化合物と接触させなかった試料であってよい。対照試料は、試験試料と同時に、上記のように解析してよい。試験試料から得られた結果を、対照試料から得られた結果と比較してもよい。検量線を作成してよく、その検量線と、試験試料のアッセイ結果を比較してよい。このような検量線は、アッセイ単位、すなわち発光シグナル強度の関数として、マーカーのレベルを示す。
８．発光の検出
ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によって生成された発光は、典型的には、発光測定装置で検出するが、他の検出手段を用いてもよい。バックグラウンドレベルを上回る光が存在することにより、試料中のＡＴＰ、すなわち、サクシネート及び／または２−オキソグルタレートオキシゲナーゼの存在が示される。バックグラウンドレベルの発光は、典型的には、同じマトリックスで、ただし、試料の非存在下で測定する。好適な対照反応の設計は、当業者であれば容易である。ルシフェラーゼにより、試料を経時的に何度も解析したり、または多くの試料を経時的に解析したりすることを可能にできる。任意に応じて、本発明の組成物及び方法で用いるルシフェラーゼは、耐熱性及び／または化学安定性が向上したものである。
９．変異型酵素
完全長ルシフェラーゼ、ＪＭＪＣデメチラーゼもしくは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、またはサクシネート−ＣｏＡリガーゼの変異体は、対応する完全長天然ルシフェラーゼ、ＪＭＪＣデメチラーゼもしくは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ、ＳＣＯＴ、またはＳＣＳに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％（少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％など）となる。通常、変異体フラグメントは、少なくとも約５０個のアミノ酸の長さであり、少なくとも約６０個のアミノ酸の長さであることが多く、少なくとも約７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個、５５０個または５５０個超のアミノ酸の長さであることが更に多く、発光を生成させ、フォスフェート基を転移し、グルコースを転移し、水酸化する能力を保持する。完全長ルシフェラーゼ、ＪＭＪＣデメチラーゼもしくは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ、ＳＣＯＴ、ＳＣＳ、これらのフラグメント、またはこれらの変異体は、異種のアミノ酸配列に融合してよく、それでも、本発明において機能する。
例えば、本発明の組成物及び方法で用いる完全長甲虫ルシフェラーゼ、ＪＭＪＣデメチラーゼもしくは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ、ＳＣＯＴ、またはＳＣＳ、あるいはこれらのフラグメントまたはこれらの変異体は、天然源から精製しても、（１）化学合成、（２）酵素（プロテアーゼ）によるルシフェラーゼの消化、及び（３）組み換えＤＮＡ法を含む多くの技法によって調製してもよい。化学合成法は、プロテアーゼを用いて特定の部位を切断する方法のように、当該技術分野において周知である。これらの酵素、変異型酵素またはこれらのフラグメントを生成するには、それらの酵素、変異体及びフラグメントをコードするＤＮＡを調製してから、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主生物中で発現させてよい。エンドヌクレアーゼ消化またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような方法により、当業者は、明確に定義されたフラグメントを無制限に生成可能になる。変異体またはフラグメントの活性は、天然酵素の活性とは異なることがある。
いずれかのタイプのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失、またはこれらの組み合わせを用いて、変異型ルシフェラーゼ、ＪＭＪＣデメチラーゼもしくは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ、ＳＣＯＴまたはＳＣＳを生成させてよく、保存的アミノ酸置換は、活性を保持する可能性が高い。ある種のアミノ酸を、同じタイプの別のアミノ酸に置き換える保存的置換によって、酵素活性が損なわれない場合には、その保存的置換は、本発明の範囲内に含まれる。
（１）βシートまたはヘリックスコンフォメーションのような、ポリペプチド主鎖の構造、標的部位の（２）電荷、（３）疎水性または（４）側鎖のかさに影響を及ぼす非保存的置換は、ルシフェラーゼの機能を変更し得る。残基は、一般的な側鎖特性に基づいてグループ分けされる。
変異型ルシフェラーゼ、ＪＭＪＣデメチラーゼもしくは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ、ＳＣＯＴ、またはＳＣＳ遺伝子、あるいは遺伝子フラグメントは、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング及びＰＣＲ突然変異誘発（部位特異的突然変異誘発）カセット突然変異誘発、制限的選択突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発など、当該技術分野において既知の方法を用いて作製してよく、クローニングしたＤＮＡにおいて、他の既知の技法を用いて、変異型ＤＮＡを生成することもできる。
１０．試料
開示されている方法は、サクシネートまたはその誘導体を含む疑いのあるいずれかの試料に対して用いてよい。いくつかの実施形態では、開示されている方法は、非生物または生物試料に対して用いてよい。サクシネート及びその誘導体は、製薬または化粧品産業で作られる製品のような様々な工業製品の製造に用いられている。いくつかの実施形態では、開示されている方法は、医薬、化粧品、洗剤、界面活性剤、プラスチック、ポリマー、潤沢剤及び樹脂（塗料）の製造での試験に用いてよい。開示されている方法は、サクシネートを品質指標として用いるワインなどの食品及び飲料の試験で用いてよい。開示されている方法は、生物学的成分を含む試料に対して用いてよい。試料は、細胞及び／または組織を含んでよい。試料は、成分（無傷細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官及びこれらの混合物を含む）の不均一混合物、あるいは単一の成分または均一な成分群（例えば、天然もしくは合成のアミノ酸、核酸もしくは糖鎖ポリマーまたは脂質膜複合体）を含んでよい。その化合物は概して、使用濃度内では、生細胞及びその他の生物学的成分に対する毒性がない。
試料としては、動物（例えば脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物など）、細胞、細胞溶解物、細胞上清または細胞の精製分画（例えば細胞内分画）を挙げてよい。ある特定の実施形態では、試料は、細胞であってよい。いくつかの実施形態では、試料は、生細胞であってよい。その細胞は、真核細胞、例えば、酵母、鳥類、植物、昆虫または哺乳動物の細胞であってよく、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ネコ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、またはブタ細胞、もしくは原核細胞、または２種類以上の生物に由来する細胞、あるいは、細胞溶解物またはそれらの上清が挙げられるが、これらに限らない。細胞は、組み換え技法によって遺伝子組み換えが行われていないものであっても（非組み換え細胞）、組み換えＤＮＡを一過性にトランスフェクションされており、及び／あるいはそのゲノムが組み換えＤＮＡとともに安定して増幅されているか、または遺伝子を破壊する（例えば、プロモーター、イントロンもしくはオープンリーディングフレームを破壊する）か、あるＤＮＡフラグメントを別のフラグメントに置き換えるかするために、ゲノムが改変されている組み換え細胞であってもよい。組み換えＤＮＡまたは置換ＤＮＡフラグメントは、本発明の方法によって検出される分子、検出される分子のレベルもしくは活性を変える部分、及び／またはその分子のレベルもしくは活性を変える分子もしくは部分と無関係の遺伝子産物をコードできる。細胞は、組み換え技法によって、遺伝子組み換えが行われたものであってよい。
試料は、サクシネート形成または生成酵素を含んでよい。このサクシネート形成または生成酵素は、上記のように、ＪＭＪＣデメチラーゼまたは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼのような２−オキソグルタレートオキシゲナーゼであってよい。いくつかの実施形態では、サクシネート形成または生成酵素は、天然または組み換えサクシネート形成または生成酵素であってよい。例えば、試料は、天然または組み換えデメチラーゼを含んでよい。いくつかの実施形態では、サクシネート形成または生成酵素は、精製または単離されている。例えば、試料は、精製または単離デメチラーゼを含んでよい。
１１．成分
方法及び組成物は、ペプチド基質、タンパク質基質もしくは非タンパク質基質のような精製された基質もしくは実質的に純粋な基質、２−オキソグルタレート、Ｆｅ（ＩＩ）、アスコルベート、無機フォスフェート、アセトアセチル−ＣｏＡ、ＡＤＰ、及びルシフェリン基質、ならびに／またはルシフェラーゼなどの生物発光酵素、ＪＭＪＣデメチラーゼもしくは２ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼなどの２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ、ＳＣＯＴ及びＳＣＳのような酵素を含んでよい。このようなプロトコールは、当業者に知られている。ある特定の実施形態では、精製により、いずれかの夾雑成分に対する純度（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）が、約または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは９９．９％超、またはこれらの割合のうちの導出可能な範囲である分子を得てよい。
１２．キット
本発明では、サクシネートを分析するキットを提供する。このキットは、サクシネートを分析する試薬を含む。このキットは、活性ＳＣＯＴと活性ＳＣＳ−ＡＤＰ、活性ＳＣＳ−ＧＤＰと活性グアニレートキナーゼ、及び／または活性ＳＣＳ−ＡＤＰと、活性アデニレートシクラーゼと、活性ピロフォスファターゼと、活性ピルベートキナーゼを含んでよい。このキットは、１つ以上の標準サクシネート試料と、緩衝液と、説明書と、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を更に含んでよい。このキット成分、組成物及び緩衝液は、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＡＴＰ、無機フォスフェート、アセトアセチル−ＣｏＡ、二価カチオン（マグネシウム、例えば塩化マグネシウムなど）、カルモジュリン、フォスフォエノールピルベート、塩、キレーターなどのような好適な成分を加えることによって変更してもよい。記載されている方法で用いてよい好適なキット成分、組成物及び緩衝液は、市販のものを入手してもよい。これらの様々な成分は、それらの部分のサブセットを含んでもよく、本発明の適用を容易にするか、または保管寿命を長くするいずれかの形で組み合わせてよい。
本発明では、サクシネート形成または生成酵素を分析するキットを提供する。このキットは、サクシネート形成または生成酵素を分析する試薬を含む。このキットは、上記のような、サクシネートを分析する試薬と、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、１つ以上の標準サクシネート試料と、緩衝液と、説明書と、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む。このキット成分、組成物及び緩衝液は、ＡＤＰ、無機フォスフェート、アセトアセチル−ＣｏＡ塩、キレーターなどのような好適な成分を加えることによって変更してもよい。記載されている方法で用いてよい好適なキット成分、組成物及び緩衝液（ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質、２−オキソグルタレート及びＦｅ（ＩＩ）など）は、市販のものを入手してもよい。これらの様々な成分は、それらの部分のサブセットを含んでもよく、本発明の適用を容易にするか、または保管寿命を長くするいずれかの形で組み合わせてよい。
いくつかの実施形態では、キットは、凍結乾燥ルシフェラーゼを含む別の容器を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥ルシフェラーゼを含む容器は、ルシフェラーゼ基質である凍結乾燥ルシフェリンまたはその誘導体を更に含む。
１つ以上の試薬は、在庫保管に適するとともに、後で、その試薬の使用方法を行う際に反応媒体に加えるのに適する固体状または液体緩衝液で供給してよい。好適な包装が提供される。
（１）容器／反応容器
キットに含まれる試薬は、その様々な成分の寿命が保持されるとともに、容器の材料によって吸着または変質されないようないずれかの種類の容器で供給してよい。例えば、密閉ガラスアンプルに、窒素のような中性の非反応ガス下で封入した凍結乾燥ルシフェラーゼまたは緩衝液を収容してよい。アンプルは、ガラス、有機ポリマー（ポリカーボネート、ポリスチレンなど）、セラミック、金属または試薬を保持する目的で典型的に用いられるいずれかの他の物質のようないずれかの好適な物質から構成されていてよい。好適な容器の他の例としては、アンプルと同様の物質から作製し得る簡易ビンと、アルミニウムまたは合金などのホイルで裏打ちされた内部から構成し得る袋が挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ビン、シリンジなどが挙げられる。容器は、皮下用注射針で穿刺できるストッパー付のビンのように、滅菌アクセスポートを有してよい。他の容器は、容易に除去可能な膜であって、除去すると、成分が混合される膜によって隔てられている２つの区画を有してよい。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであってよい。
（２）説明資料
キットには、説明資料も同梱してよい。説明は、紙もしくはその他の基材に印刷しても、及び／またはフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどのような電子読み取り可能な媒体として供給してもよい。詳細な説明書は、キットに物理的に付随していなくてもよく、その代わりに、キットのメーカーもしくは販売業者が指定したインターネットウェブサイトに、ユーザーを誘導するか、または電子メールとして供給してよい。
１３．実施例
本発明は、下記の非限定的な実施例によって例示されているように用いてよい。
実施例１
材料
本明細書に記載されている実施例では、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ＃Ｑ２９５５１）、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ＳＣＳ−ＡＤＰはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ＃Ｏ１９０６９及びＯ９７５８０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＣＳ−ＡＤＰはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ＃Ｐ０Ａ８３６及びＰ０ＡＧＥ９）、アセトアセチル−コエンザイムＡナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ１６２５）、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９９９５７４．１及びＸＰ＿００３１３２３５７．３）、コハク酸第二ナトリウム（Ｓｉｇｍａカタログ番号１４１６０）、α−ケトグルタレートカリウム塩（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｋ２０００）、超高純度ＧＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、コエンザイムＡトリリチウム塩（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ３０１９）、グアニレートキナーゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１５２８８４．１及びＮＰ＿００１１５２８８５．１）、ウサギ骨格筋由来のピルベートキナーゼ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ９１３６）、フォスフォエノールピルベート（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ７１２７）及びアデニレートシクラーゼ（ＡＣ）、すなわち、活性ＡＣ部分を含むとともに、ＡＴＰを基質として用いたところ、活性を示した、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトキシンの組み換えフラグメント（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）キナーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ９１０１）を使用した。
本明細書に記載されている実施例では、表１の試薬を使用した。
Figure 0006510041
実施例２
３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）とサクシニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ及びＳＣＳ−ＧＤＰ）のクローニングと発現
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａの３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ遺伝子を合成コドン最適化配列としてクローニングした。その発現タンパク質は、４０〜５１７番目までのアミノ酸に及ぶとともに、８Ｘ ＨｉｓタグをＣ末端に含んでいた。そのタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＲＸ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、ＦｌｅｘｉベクターｐＦ１Ｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＴ７プロモーターから発現させた。ＫＲＸ株をＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈで２５℃にて増殖させ、約１．５のＯＤ600で、０．１％のラムノースにより誘導した。２５℃での増殖を一晩継続した。ＳＣＯＴ酵素をＨｉｓＬｉｎｋレジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製し、精製した溶出液を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び５０％のグリセロールに透析した。精製した酵素のサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａのサクシニル−ＣｏＡシンテターゼα及びβサブユニット遺伝子（ＳＣＳ−ＡＤＰ及びＳＣＳ−ＧＤＰ）を合成コドン最適化配列としてクローニングした。ＳＣＳαタンパク質は、６Ｘ ＨｉｓタグをＮ末端に含む。そのタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＲＸ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、ＦｌｅｘｉベクターｐＦ１Ｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＴ７プロモーターから発現させた。ＫＲＸ株をＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈで２５℃にて増殖させ、約１．５のＯＤ６００で、０．１％のラムノースにより誘導した。２５℃での増殖を一晩継続した。ＳＣＳ−ＡＤＰ及びＳＣＳ−ＧＤＰ酵素をＨｉｓＬｉｎｋレジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製し、精製した溶出液を２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに透析した。精製した酵素のサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）は、１つのバイシストロニック配列のＷ３１１０ Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡから直接クローニングした。αタンパク質は、６Ｘ ＨｉｓタグをＣ末端に含む。発現と精製は、上記のように行った。
実施例３
３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼとＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼを用いたサクシネート検出アッセイ
図２のサクシネート検出アッセイを、下記のように、概ね２つの工程で行った。１×デメチラーゼ反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１００μＭのアスコルベート、１０μＭのＦｅ（ＩＩ）、１０μＭのα−ケトグルタレート）を含む２５μＬ中で、サクシネート滴定を行った。２５μＬの生物発光サクシネート検出試薬Ｉをサクシネート試料に加え、その混合物を６０分、室温（約２３℃）でインキュベートした。サクシニル−ＣｏＡを検出するために、５０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、その混合物を６０分、室温でインキュベートしてから、発光を発光測定装置で検出した。図３に示されているサクシネート滴定は、９６ウェルの低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３６９３）で行った。
実施例４
ＪｕｍｏｎｊｉＣデメチラーゼ系
本発明の方法を用いて、代表的な脱メチル化酵素（Ｌｙｓ（Ｍｅ３）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４４５２）を基質とするＪＭＪＤ２Ｃ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１０５）、Ｌｙｓ（Ｍｅ３）４−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４１９４）を基質とするＪＡＲＩＤ１Ａ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１１０）、及びＬｙｓ（Ｍｅ３）２７−ヒストンＨ３（２３−３４）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４３７８）を基質とするＵＴＸ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号１０７７４）が挙げられるが、これらに限らない）をアッセイした。各酵素を別々に滴定し、その反応は、デメチラーゼ反応緩衝液中で行った。生物発光サクシネート検出試薬Ｉを用いて、サクシネートを変換してから、ＡＤＰからＡＴＰへ変換し、生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを用いて、ＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、９６ウェルの低容量プレートのウェルに、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０及び１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ中の５μＬの段階希釈ＪＭＪＣデメチラーゼを加えた。２×デメチラーゼ反応緩衝液と２０μＭのトリメチル化ヒストンＨ３ペプチド基質とを含む５μＬの混合物を加えることによって、ＪＭＪＣデメチラーゼ反応を開始させた。６０分、室温でインキュベート後、サクシネートからサクシニル−ＣｏＡへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ）を１０μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、その試料を室温で６０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図４）。この反応で生成されたサクシネートは、脱メチル化活性及び／または酵素活性と比例していたことが分かった。すなわち、本発明の方法を用いて、ヒストンの脱メチル化に関与する全ての酵素の活性を変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。
実施例５
ＪＭＪＣデメチラーゼの基質特異性の測定
本発明の方法では、ＪＭＪＣデメチラーゼ酵素（ＪＭＪＤ２Ｃ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１０５）が挙げられるが、これに限らない）との反応は、最大で５０μＭのヒストンＨ３ペプチド基質Ｌｙｓ（Ｍｅ３）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４４５２）、Ｌｙｓ（Ｍｅ２）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６５４０１）及びヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６１７０１）という濃度で行った。生成される発光の量は、飽和に達するまで、基質濃度と比例していたとともに、反応の直線範囲内では、酵素の量と比例していた。生物発光サクシネート検出試薬Ｉを用いて、試料中のサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換した。続いて、生成されたサクシニル−ＣｏＡをＡＴＰに変換し、生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを用いて、そのＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、９６ウェルの低容量プレートのウェルに、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０及び１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ中の５μＬのＪＭＪＣデメチラーゼを加えた。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）と、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０と、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡと、２００μＭのアスコルベートと、２０μＭのＦｅ（ＩＩ）と、２０μＭのα−ケトグルタレートとを含む反応緩衝液中で、メチル化状態の異なるヒストンＨ３ペプチド基質の滴定（量は図に示されている）を行った。ＪＭＪＣデメチラーゼ反応を１０μＬ中で６０分、室温で行った。インキュベート後、サクシネートからサクシニル−ＣｏＡへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ）を１０μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、試料を再度、室温で６０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図５）。１０μＬの反応物中で、ＪＭＪＣデメチラーゼと、サクシネートと、生物発光サクシネート検出試薬Ｉを混合し、室温で６０分インキュベートしてから、１０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加えることによって、ＪＭＪＣデメチラーゼ反応と、サクシネートのサクシニル−ＣｏＡへの変換を１つの工程で行った。この反応は、９６ウェルの低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３６９３）によって行った。
様々なＪＭＪＣデメチラーゼ成分の滴定を含む反応も、上記のように行い、本発明の方法で得られた見掛けＫｍ値は、文献に報告されている値と同様であった（０．５〜１．６μＭ）（図６）。
実施例６
ＪＭＪＣデメチラーゼを用いた阻害実験
本発明の方法では、ＪＭＪＣデメチラーゼ酵素（ＪＭＪＤ２Ｃ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１０５）が挙げられるが、これに限らない）との反応は、最大で１０μＭのＬｙｓ（Ｍｅ３）９−ヒストンＨ３（１−２１）ペプチド基質（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４４５２）という濃度で行った。生成された発光の量は、飽和に達するまで、基質濃度と比例していたとともに、反応の直線範囲内では、酵素の量と比例していた。生物発光サクシネート検出試薬Ｉを用いて、試料中のサクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換した。続いて、生成されたサクシニル−ＣｏＡをＡＴＰに変換し、生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを用いて、そのＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、９６ウェルの低容量プレートのウェルに、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０及び１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ中の５μＬのＪＭＪＣデメチラーゼを加えた。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ及び５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む反応緩衝液中で、ＪＭＪＣデメチラーゼインヒビターの滴定（量は図に示されている）を行い、１０分、室温でインキュベートした。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２５０μＭのアスコルベート、１．５μＭのＦｅ（ＩＩ）及び６２．５μＭのα−ケトグルタレートを含む反応緩衝液で希釈した４μＬの２５μＭのヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９ペプチド基質を加えて、反応を開始させた。ＪＭＪＣデメチラーゼ反応を１０μＬ中で６０分、室温で行った。インキュベート後、サクシネートからサクシニル−ＣｏＡへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ）を１０μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、試料を再度、室温で６０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図７）。反応は、９６ウェルの低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３６９３）のウェルで行った。このアッセイにおいて、ＬＯＰＡＣライブラリーの１２８０個の化合物に対してスクリーニングしたところ、偽陽性がほんのわずかであったことが示されたとともに、高いＺ’値が得られ、そのロバスト性が確認された（データは示されていない）。
実施例７
ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼとグアニレートキナーゼとを用いたサクシネート検出アッセイ
下記のように、図８に記載されているサクシネート検出アッセイを概ね２つの工程で行った。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１５μＭのコエンザイムＡ及び１５μＭのＧＴＰを含む２５μＬ中で、サクシネート滴定を行った。２５μＬの生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法）をサクシネート試料に加え、その混合物を６０分、室温でインキュベートした。サクシニル−ＣｏＡを検出するために、５０μｌの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩ（１ｍＬのＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬中の１．６μＬの生物発光サクシネート検出液ＩＩ（ＧＭＰＫ））を加え、その混合物を６０分、室温でインキュベートしてから、発光を発光測定装置で検出した。図９に示されているサクシネート滴定を９６ウェルの低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３６９３）のウェルで行った。
実施例８
ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼとグアニレートキナーゼとを用いた、様々なＪＭＪＣデメチラーゼ活性の定量
本発明の方法を用いて、代表的な脱メチル化酵素（ＪＭＪＤ２Ｃ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１０５）とＪＭＪＤ２Ａ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１２３）が挙げられるが、これらに限らない）をアッセイし、ペプチドのＬｙｓ（Ｍｅ３）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４４５２）を基質として用いた。各酵素を別々に滴定し、反応は、Ｔｗｅｅｎ−２０とＢＳＡとを含まないデメチラーゼ反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００μＭのアスコルベート、５μＭのＦｅ（ＩＩ）及び５μＭのα−ケトグルタレート）中で行った。生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法）を用いて、サクシネートとＧＴＰをサクシニル−ＣｏＡとＧＤＰに変換してから、ＧＤＰとＡＤＰをＡＴＰとＧＭＰに変換した。生物発光サクシネート検出試薬ＩＩ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法）を用いて、ＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の６μＬの段階希釈ＪＭＪＣデメチラーゼを９６ウェルの低容量プレートのウェルに加えた。Ｔｗｅｅｎ−２０とＢＳＡとを含まないデメチラーゼ反応緩衝液と、２．５μＭのトリメチル化ヒストンＨ３ペプチド基質とを含む６μＬの混合物を加えることによって、ＪＭＪＣデメチラーゼ反応を開始させた。６０分、室温でインキュベート後、サクシネートからサクシニル−ＣｏＡへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法））を１２μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２４μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法）を加え、その試料を室温で６０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図１０）。この反応で生成されたサクシネートは、脱メチル化及び／または酵素活性と比例していたことが分かった。すなわち、本発明の方法を用いて、ヒストンの脱メチル化に関与する全ての酵素の活性を変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。
実施例９
ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼとグアニレートキナーゼとを用いた、ＪＭＪＣデメチラーゼの基質特異性の測定
本発明の方法では、ＪＭＪＣデメチラーゼ酵素（ＪＭＪＤ２Ｃ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１０５）が挙げられるが、これに限らない）との反応は、最大で５０μＭのヒストンＨ３ペプチド基質のＬｙｓ（Ｍｅ３）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４４５２）、Ｌｙｓ（Ｍｅ２）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６５４０１）及びヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６１７０１）という濃度で行い、生成された発光の量は、飽和に達するまで、基質濃度と比例していたとともに、反応の直線範囲内では、酵素の量と比例していた。生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法）を用いて、試料中のサクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＧＤＰに変換した。続いて、生成されたＧＤＰをＡＴＰとＧＭＰに変換し、生物発光サクシネート検出試薬ＩＩ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法）を用いて、そのＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の１２μＬのＪＭＪＣデメチラーゼを９６ウェルの低容量プレートのウェルに加えた。Ｔｗｅｅｎ−２０とＢＳＡとを含まないデメチラーゼ反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００μＭのアスコルベート、２０μＭのＦｅ（ＩＩ）及び２０μＭのα−ケトグルタレート）を含む反応緩衝液中で、メチル化状態の異なるヒストンＨ３ペプチド基質の滴定（量は図に示されている）を行った。ＪＭＪＣデメチラーゼ反応を２４μＬ中で６０分、室温で行った。インキュベート後、サクシネートからサクシニル−ＣｏＡへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法））を２４μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、４８μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩ（ＳＣＳ−ＧＤＰ／ＧＭＰＫ法）を加え、試料を再度、室温で６０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図１１）。その反応は、９６ウェルの低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３６９３）のウェルで行った。
実施例１０
ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼと、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼと、ピルベートキナーゼを用いたサクシネート検出アッセイ
本明細書で後述されているように、図１２に記載されているサクシネート検出アッセイを概ね３つの工程で行った。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む１０μＬ中で、サクシネート滴定を行った。１０μＬの生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＡＤＰ／ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）法、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、３０μＭのＡＴＰ及び３０μＭのコエンザイムＡを含む）をサクシネート試料に加え、その混合物を６０分、室温でインキュベートした。残ったＡＴＰを除去するために、２０μＬのＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬をサクシネート試料に加え、その混合物を４０分、室温でインキュベートした。ＡＤＰを検出するために、４０μＬのＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）キナーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、その混合物を３０分、室温でインキュベートしてから、発光を発光測定装置で検出した。図１３に記載されているサクシネート滴定は、９６ウェルの低容量プレートのウェルで行った。
実施例１１
ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼと、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼと、ピルベートキナーゼとを用いた、様々なＪＭＪＣデメチラーゼ活性の定量
本発明の方法を用いて、代表的な脱メチル化酵素（ＪＭＪＤ２Ｃ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１０５）とＪＭＪＤ２Ａ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１２３）が挙げられるが、これらに限らない）をアッセイし、ペプチドのＬｙｓ（Ｍｅ３）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４４５２）を基質として用いた。各酵素を別々に及び併せて滴定し、反応は、Ｔｗｅｅｎ−２０とＢＳＡとを含まないデメチラーゼ反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００μＭのアスコルベート、５μＭのＦｅ（ＩＩ）及び５μＭのα−ケトグルタレート）中で行った。生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＡＤＰ／ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）法）を用いてサクシネートとＡＴＰをサクシニル−ＣｏＡとＡＤＰに変換した。ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬を９６ウェルの低容量プレートのウェルに加えて、残った全てのＡＴＰを反応物から除去してから、ＡＤＰをＡＴＰに変換し、ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）キナーゼ検出試薬を用いて、ＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の６μＬの段階希釈ＪＭＪＣデメチラーゼを９６ウェルの低容量プレートのウェルに加えた。Ｔｗｅｅｎ−２０とＢＳＡとを含まないデメチラーゼ反応緩衝液と、２．５μＭのトリメチル化ヒストンＨ３ペプチド基質とを含む６μＬの混合物を加えることによって、ＪＭＪＣデメチラーゼ反応を開始させた。６０分、室温でインキュベート後、サクシネートからサクシニル−ＣｏＡへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ（ＳＣＳ−ＡＤＰ／ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）法））を１２μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２４μＬのＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬を加え、その試料を室温で４０分、インキュベートした。ＡＤＰのＡＴＰへの変換のために、４８μＬのＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）キナーゼ検出試薬を加え、その試料を室温で３０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図１４）。この反応で生成されたサクシネートが、脱メチル化及び／または酵素活性と比例していたことが分かった。すなわち、本発明の方法を用いて、ヒストンの脱メチル化に関与する全ての酵素の活性を変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。
実施例１２
細胞抽出物及び組織抽出物中のサクシネートの測定
本発明の方法を用いて、組織抽出物中のサクシネートの存在及び／または量を測定した。試料に存在する全てのＡＴＰを除去した。試料に存在する全てのＡＴＰの除去後、ＳＣＯＴによって、サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換し、ＡＤＰをＡＴＰに変換し、生物発光サクシネート検出試薬ＩＩ（ＡＤＰからＡＴＰへの変換試薬）を用いて、そのＡＴＰを検出した。サクシネート（ＳＣＯＴとＳＣＳを含む）の変換について調べるＡＴＰ枯渇済み試料を、ルシフェラーゼ／ルシフェリンのみを含む試料と比較して、サクシネートの存在を評価した。
ＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を用いて、試料に存在する全てのＡＴＰを除去し、生物発光サクシネート検出試薬Ｉを用いて、サクシネートを変換してから、ＡＤＰをＡＴＰに変換した。生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを用いて、ＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2中の１０μＬのＡＴＰ枯渇済み細胞抽出物を、サクシネートからサクシニル−ＣｏＡへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ）１０μＬとともにインキュベートし、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、その試料を室温で６０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図１５）。
実施例１３
改変した３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼとＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼとを用いたサクシネート検出アッセイ
下記のように、図１６に記載されているサクシネート検出アッセイを概ね２つの工程で行った。１×デメチラーゼ反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００μＭのアスコルベート、１０μＭのＦｅ（ＩＩ）、１０μＭのα−ケトグルタレート）を含む２５μＬ中で、サクシネート滴定を行った。２５μＬの生物発光サクシネート検出試薬Ｉをサクシネート試料に加え、その混合物を６０分、室温（約２３℃）でインキュベートした。ＡＴＰを検出するために、５０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、その混合物を１０分、室温でインキュベートしてから、発光を発光測定装置で検出した。図１７に示されているサクシネート滴定は、９６ウェルの低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３６９３）で行った。
実施例１４
改変した３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼとＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼとを用いた、様々なＪｕｍｏｎｊｉＣデメチラーゼ活性の定量
本発明の方法を用いて、代表的な脱メチル化酵素（Ｌｙｓ（Ｍｅ３）９−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４４５２）を基質とするＪＭＪＤ２Ｃ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１０５）、及びＬｙｓ（Ｍｅ３）４−ヒストンＨ３（１−２１）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号６４１９４）を基質とするＪＡＲＩＤ１Ａ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０１１０）が挙げられるが、これに限らない）をアッセイした。各酵素を別々に滴定し、その反応は、デメチラーゼ反応緩衝液中で行った。生物発光サクシネート検出試薬Ｉを用いて、サクシネートをＡＴＰに変換してから、生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを用いて、ＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の５μＬの段階希釈ＪＭＪＣデメチラーゼを９６ウェルの低容量プレートのウェルに加えた。２×デメチラーゼ反応緩衝液と２０μＭのトリメチル化ヒストンＨ３ペプチド基質とを含む５μＬの混合物を加えることによって、ＪＭＪＣデメチラーゼ反応を開始させた。６０分、室温でインキュベート後、サクシネートからＡＴＰへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ）を１０μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、その試料を室温で１０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図１８）。この反応で生成されたサクシネートは、脱メチル化及び／または酵素活性と比例していたことが分かった。すなわち、本発明の方法を用いて、ヒストンの脱メチル化に関与する全ての酵素の活性を変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。
実施例１５
改変した３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼとＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡシンターゼとを用いた、様々なジオキシゲナーゼ活性の定量
本発明の方法を用いて、代表的な水酸化酵素（ＨＩＦ−１α（５５６−５７４）（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ−６１５２８）を基質とするＥＬＧＮ１（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＴＰ３１５１５８）及びＥＧＬＮ２（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＴＰ３０６１５２）が挙げられるが、これらに限らない）をアッセイした。各酵素を別々に滴定し、その反応は、１×反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００μＭのアスコルベート、１０μＭのＦｅ（ＩＩ）、１０μＭのα−ケトグルタレート）中で行った。生物発光サクシネート検出試薬Ｉを用いて、サクシネートをＡＴＰに変換してから、生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを用いて、ＡＴＰを検出した。簡潔に述べると、５μＬの段階希釈プロリルヒドロキシラーゼ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中）を９６ウェルの低容量プレートのウェルに加えた。２×反応緩衝液と２０μＭのＨＩＦ−１α（５５６−５７４）ペプチド基質とを含む５μＬの混合物を加えることによって、プロリルヒドロキシラーゼ反応を開始させた。６０分、室温でインキュベート後、サクシネートからＡＴＰへの変換試薬（生物発光サクシネート検出試薬Ｉ）を１０μＬ加え、オービタルシェーカーで２分混合してから、室温で６０分インキュベートした。その試料に、２０μＬの生物発光サクシネート検出試薬ＩＩを加え、その試料を室温で１０分インキュベートした。続いて、発光を発光測定装置で検出した（図１９）。この反応で生成されたサクシネートは、ヒドロキシラーゼ及び／または酵素活性と比例していたことが分かった。すなわち、本発明の方法を用いて、ＨＩＦ１−αの水酸化に関与する全ての酵素の活性を変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。
最も実用的かつ好ましい実施形態と現在考えられる実施形態と関連させながら、本発明について説明されているが、当然のことながら、本発明は、開示されている実施形態に限定されず、請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な修正形態及び均等な構成を網羅するように意図されている。請求項に定義されているような本発明の新規態様から逸脱しなければ、本発明の修正及び変形を行ってよい。添付の請求項は、幅広く、かつ本明細書における本発明の趣旨及び範囲に沿った形で解釈すべきである。
万全を期すために、番号が付された下記の条項に、本開示の様々な態様を示す。
条項１．試料中のサクシネートの発光検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することと、
を含み、
サクシネートが前記試料に存在する場合、前記第１の検出試薬と前記第２の検出試薬が、前記サクシネートをＡＴＰに変換する、前記方法。
条項２．試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することと、
を含み、
（ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、
（ｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または
（ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記第１の反応混合物を前記ＡＴＰ枯渇試薬と、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む、前記方法。
条項３．第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む、条項２に記載の方法。
条項４．第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む、条項２に記載の方法。
条項５．第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記第１の反応混合物を前記ＡＴＰ枯渇試薬と、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む、条項２に記載の方法。
条項６．試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、前記試料がサクシネート形成酵素を含む場合に、サクシネートが形成されることと、
（ｂ）前記サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することと、
（ｃ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｄ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素活性を検出または測定することと、
を含み、
（ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、
（ｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または
（ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記第１の反応混合物を前記ＡＴＰ枯渇試薬と、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む、前記方法。
条項７．第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させることによって、ＡＴＰが生成される、条項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
条項８．サクシネート形成酵素が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼである、条項６に記載の方法。
条項９．ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、
（ｂ）前記試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物を３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することと、
（ｄ）前記第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、ＡＴＰ検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、
（ｅ）前記第２の反応混合物における発光を検出することと、
（ｆ）前記第２の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較することであって、前記第２の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含む、前記方法。
条項１０．ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、
（ｂ）前記試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物をＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＧＤＰに変換することと、
（ｄ）前記第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＴＰ検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、
（ｅ）前記第２の反応混合物における発光を検出することと、
（ｆ）前記第２の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較することであって、前記第２の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することと、
を含む、前記方法。
条項１１．ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、
（ｂ）前記試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物をＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＡＤＰに変換することと、
（ｄ）前記第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含むことと、
（ｅ）前記第２の反応混合物をＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、
（ｆ）前記第３の反応混合物における発光を検出することと、
（ｇ）前記第３の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較することであって、前記第３の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することと、
を含む、前記方法。
条項１２．前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、条項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
条項１３．前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、条項１２に記載の方法。
条項１４．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、条項１３に記載の方法。
条項１５．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、条項１４に記載の方法。
条項１６．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、条項１５に記載の方法。
条項１７．前記試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させる、条項６〜１６のいずれか１項に記載の方法。
条項１８．前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、条項１７に記載の方法。
条項１９．前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、条項１８に記載の方法。
条項２０．前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。
条項２１．前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、条項２０に記載の方法。
条項２２．前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、条項２０に記載の方法。
条項２３．前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、条項２２に記載の方法。
条項２４．試料中のサクシネートを検出するキットであって、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項２５．第１の検出試薬が、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項２４に記載のキット。
条項２６．前記生物発光酵素が、耐熱性ホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリン基質が、Ｄ−ルシフェリンである、条項２４または２５に記載のキット。
条項２７．試料中のサクシネートを検出するキットであって、
（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｉｉ）ＧＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項２８．第１の検出試薬が、
（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｉｉ）ＧＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項２７に記載のキット。
条項２９．試料中のサクシネートを検出するキットであって、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、
（ｖ）ピロフォスファターゼと、
（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、
（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、
（ｉｘ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｉｘ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項３０．第１の検出試薬が、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、
（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、
（ｖ）ピロフォスファターゼと、
を含み、
前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、
（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、
（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、
（ｉｘ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項２９に記載のキット。
条項３１．前記キットを用いて、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含む、条項２４〜３０のいずれか１項に記載のキット。
条項３２．試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項３３．第１の検出試薬が、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスファー（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項３２に記載のキット。
条項３４．試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｖｉ）ＧＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項３５．第１の検出試薬が、
（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｖｉ）ＧＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項３４に記載のキット。
条項３６．試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、
（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、
（ｘ）ピルベートキナーゼと、
（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｘｉｉ）生物発光酵素と、
（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項３７．第１の検出試薬が、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、
（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、
（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、
を含み、
前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、
（ｘ）ピルベートキナーゼと、
（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｘｉｉ）生物発光酵素と、
（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項３６に記載のキット。
条項３８．前記キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含む、条項３２〜３７のいずれか１項に記載のキット。
条項３９．前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、条項３２〜３８のいずれか１項に記載のキット。
条項４０．前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、条項３９に記載のキット。
条項４１．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、条項４０に記載のキット。
条項４２．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、条項４１に記載のキット。
条項４３．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、条項４２に記載のキット。
条項４４．ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含む、条項３２〜４３のいずれか１項に記載のキット。
条項４５．前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、条項４４に記載のキット。
条項４６．前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、条項４５に記載のキット。
条項４７．前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、条項２４〜４６のいずれか１項に記載のキット。
条項４８．前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、条項４７に記載のキット。
条項４９．前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、条項４８に記載のキット。
条項５０．前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、条項４９に記載のキット。
条項５１．試料中のサクシネートの発光検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することと、
を含み、
サクシネートが前記試料に存在する場合、前記第１の検出試薬と前記第２の検出試薬が、前記サクシネートをＡＴＰに変換する、前記方法。
条項５２．試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することと、
を含み、
（ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、
（ｉｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、前記第２の検出試薬が、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、
（ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または
（ｉｖ）前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記第１の反応混合物を前記ＡＴＰ枯渇試薬と、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む、前記方法。
条項５３．前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む、条項５１または５２に記載の方法。
条項５４．前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、前記第２の検出試薬が、耐熱性ホタルルシフェラーゼとＤ−ルシフェリンを含む、条項５１または５２に記載の方法。
条項５５．前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む、条項５１または５２に記載の方法。
条項５６．前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記第１の反応混合物を前記ＡＴＰ枯渇試薬と、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む、条項５１または５２に記載の方法。
条項５７．試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることであって、前記試料がサクシネート形成酵素を含む場合に、サクシネートが形成されることと、
（ｂ）前記サクシネート反応混合物を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることであって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換することと、
（ｃ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｄ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素活性を検出または測定することと、
を含み、
（ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、
（ｉｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムを含み、前記第２の検出試薬が、生物発光酵素とルシフェリン基質を含むか、
（ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むか、または
（ｉｖ）前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記第１の反応混合物を前記ＡＴＰ枯渇試薬と、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む、前記方法。
条項５８．前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させることによって、ＡＴＰが生成される、条項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
条項５９．前記サクシネート形成酵素が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼである、条項５７に記載の方法。
条項６０．ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、
（ｂ）前記試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物を
ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換するか、または
ｉｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをＡＴＰに変換することと、
（ｄ）前記第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＴＰ検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、
（ｅ）前記第２の反応混合物における発光を検出することと、
（ｆ）前記第２の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較することであって、前記第２の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することと、
を含む、前記方法。
条項６１．ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、
（ｂ）前記試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物をＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＧＤＰに変換することと、
（ｄ）前記第１の反応混合物をＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＴＰ検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、
（ｅ）前記第２の反応混合物における発光を検出することと、
（ｆ）前記第２の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較することであって、前記第２の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することと、
を含む、前記方法。
条項６２．ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、
（ｂ）前記試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物をＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＡＤＰに変換することと、
（ｄ）前記第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼを含むことと、
（ｅ）前記第２の反応混合物をＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、
（ｆ）前記第３の反応混合物における発光を検出することと、
（ｇ）前記第３の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較することであって、前記第３の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することと、
を含む、前記方法。
条項６３．前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、条項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
条項６４．前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、条項６３に記載の方法。
条項６５．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、条項６４に記載の方法。
条項６６．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、条項６５に記載の方法。
条項６７．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、条項６６に記載の方法。
条項６８．前記試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させる、条項５７〜６７のいずれか１項に記載の方法。
条項６９．前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、条項６８に記載の方法。
条項７０．前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、条項６９に記載の方法。
条項７１．前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。
条項７２．前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、条項７１に記載の方法。
条項７３．前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、条項７１に記載の方法。
条項７４．前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、条項７３に記載の方法。
条項７５．試料中のサクシネートを検出するキットであって、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項７６．第１の検出試薬が、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項７５に記載のキット。
条項７７．第１の検出試薬が、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉｉｉ）塩化マグネシウムと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、
条項７５に記載のキット。
条項７８．前記生物発光酵素が、耐熱性ホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリン基質が、Ｄ−ルシフェリンである、条項７５〜７７のいずれか１項に記載のキット。
条項７９．試料中のサクシネートを検出するキットであって、
（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｉｉ）ＧＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項８０．第１の検出試薬が、
（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｉｉ）ＧＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項７９に記載のキット。
条項８１．試料中のサクシネートを検出するキットであって、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、
（ｖ）ピロフォスファターゼと、
（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、
（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、
（ｉｘ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｉｘ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項８２．第１の検出試薬が、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、
（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、
（ｖ）ピロフォスファターゼと、
を含み、
前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、
（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、
（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、
（ｉｘ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項８１に記載のキット。
条項８３．前記キットを用いて、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含む、条項７５〜８２のいずれか１項に記載のキット。
条項８４．試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項８５．第１の検出試薬が、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項８４に記載のキット。
条項８６．第１の検出試薬が、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘｉｉ）塩化マグネシウムと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項８４に記載のキット。
条項８７．試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｖｉ）ＧＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項８８．第１の検出試薬が、
（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｖｉ）ＧＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、
（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項８７に記載のキット。
条項８９．試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、
（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、
（ｘ）ピルベートキナーゼと、
（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｘｉｉ）生物発光酵素と、
（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項９０．第１の検出試薬が、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、
（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、
（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、
を含み、
前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、
（ｘ）ピルベートキナーゼと、
（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｘｉｉ）生物発光酵素と、
（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、条項８９に記載のキット。
条項９１．前記キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含む、条項８４〜９０のいずれか１項に記載のキット。
条項９２．前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、条項８４〜９１のいずれか１項に記載のキット。
条項９３．前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、条項９２に記載のキット。
条項９４．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、条項９３に記載のキット。
条項９５．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、条項９４に記載のキット。
条項９６．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、条項９５に記載のキット。
条項９７．ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含む、条項８４〜９６のいずれか１項に記載のキット。
条項９８．前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、条項９７に記載のキット。
条項９９．前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、条項９８に記載のキット。
条項１００．前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、条項７５〜９９のいずれか１項に記載のキット。
条項１０１．前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、条項１００に記載のキット。
条項１０２．前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、条項１０１に記載のキット。
条項１０３．前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、条項１０２に記載のキット。
条項１０４．試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させることと、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定することと、
を含み、
前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記第１の反応混合物を前記ＡＴＰ枯渇試薬及び前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、生物発光酵素及びルシフェリン基質と順次接触させる、前記方法。
条項１０５．ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するかの判定方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させることであって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含むことと、
（ｂ）前記試験試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させることと、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物をＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡとＡＤＰに変換することと、
（ｄ）前記第１の反応混合物をＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させることと、
（ｅ）前記第２の反応混合物をＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させることであって、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含むことと、
（ｆ）前記第３の反応混合物における発光を検出することと、
（ｇ）前記第３の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較することであって、前記第３の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定することと、
を含む、前記方法。
条項１０６．前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンを含む、条項１０４または１０５に記載の方法。
条項１０７．前記ＡＴＰ枯渇試薬が、（ｉ）アデニレートシクラーゼまたはＡＴＰスルフリラーゼと、（ｉｉ）ピロフォスファターゼを含む、条項１０４または１０５に記載の方法。
条項１０８．前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、条項１０５〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
条項１０９．前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、条項１０８に記載の方法。
条項１１０．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、条項１０９に記載の方法。
条項１１１．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、条項１１０に記載の方法。
条項１１２．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、条項１１１に記載の方法。
条項１１３．前記試料をペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させる、条項１０５〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
条項１１４．前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、条項１１３に記載の方法。
条項１１５．前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、条項１１４に記載の方法。
条項１１６．前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。
条項１１７．前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、条項１１６に記載の方法。
条項１１８．前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、条項１１６に記載の方法。
条項１１９．前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、条項１１８に記載の方法。
条項１２０．試料中のサクシネートを検出するキットであって、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）ＡＴＰ枯渇試薬と、
（ｖ）ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項１２１．第１の検出試薬が、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、（ｉｖ）ＡＴＰ枯渇試薬と、（ｖ）ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含む、条項１２０に記載のキット。
条項１２２．前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含む、条項１２０または１２１に記載のキット。
条項１２３．前記ＡＴＰ枯渇試薬が、（ａ）アデニレートシクラーゼまたはＡＴＰスルフリラーゼと、（ｂ）ピロフォスファターゼを含む、条項１２０または１２１に記載のキット。
条項１２４．前記キットを用いて、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含む、条項１２０〜１２３のいずれか１項に記載のキット。
条項１２５．試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）ＡＴＰ枯渇試薬と、
（ｉｘ）ＡＴＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、
（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
条項１２６．第１の検出試薬が、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、
第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質を含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、（ａ）アデニレートシクラーゼまたはＡＴＰスルフリラーゼと、（ｂ）ピロフォスファターゼを含む、条項１２５に記載のキット。
条項１２７．前記キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含む、条項１２５〜１２６に記載のキット。
条項１２８．前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、条項１２５〜１２７のいずれか１項に記載のキット。
条項１２９．前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、条項１２８に記載のキット。
条項１３０．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、条項１２９に記載のキット。
条項１３１．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、条項１３０に記載のキット。
条項１３２．前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、条項１３１に記載のキット。
条項１３３．ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含む、条項１２５〜１３１のいずれか１項に記載のキット。
条項１３４．前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、条項１３３に記載のキット。
条項１３５．前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、条項１３４に記載のキット。
条項１３６．前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、条項１２０〜１３５のいずれか１項に記載のキット。
条項１３７．前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、条項１３６に記載のキット。
条項１３８．前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、条項１３７に記載のキット。
条項１３９．前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、条項１３８に記載のキット。
条項１４０．前記試料が細胞を含む、条項５１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
条項１４１．前記試料が、細胞溶解物を含む、条項５１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
条項１４２．前記細胞が、真核細胞または原核細胞である、条項１４０または１４１に記載の方法。
条項１４３．前記試料が、組織試料を含む、条項５１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕試料中のサクシネートの発光検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定する工程と、
を含み、
サクシネートが前記試料に存在する場合、前記第１の検出試薬及び前記第２の検出試薬が、前記サクシネートをＡＴＰに変換することを特徴とする、方法。
〔２〕試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定する工程と、
を含み、
（ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡとを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、
（ｉｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムとを含み、前記第２の検出試薬が、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、
（ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、または
（ｉｖ）前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬とを含み、前記第１の反応混合物を、前記ＡＴＰ枯渇試薬及び前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼとを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む
ことを特徴とする、方法。
〔３〕前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡとを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンとを含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムとを含み、前記第２の検出試薬が、耐熱性ホタルルシフェラーゼとＤ−ルシフェリンとを含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔５〕前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンとを含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔６〕前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬とを含み、前記第１の反応混合物を、前記ＡＴＰ枯渇試薬及び前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼとを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンとを含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔７〕試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させる工程であって、前記試料がサクシネート形成酵素を含む場合に、サクシネートが形成される工程と、
（ｂ）前記サクシネート反応混合物を、第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程であって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換する工程と、
（ｃ）前記第１の反応混合物を、第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
（ｄ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性を検出または測定する工程と、
を含み、
（ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡとを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、
（ｉｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムとを含み、前記第２の検出試薬が、生物発光酵素とルシフェリン基質とを含むか、
（ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、または
（ｉｖ）前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬とを含み、前記第１の反応混合物を、前記ＡＴＰ枯渇試薬及び前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と順次接触させ、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼとを含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む
ことを特徴とする、方法。
〔８〕前記第１の反応混合物を、第２の検出試薬と接触させる工程によって、ＡＴＰが生成される、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕前記サクシネート形成酵素が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼである、前記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するか判定する方法であって、
（ａ）前記試料を、前記化合物と接触させて、試験試料を形成させる工程であって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含む工程と、
（ｂ）前記試験試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物を、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換するか、または
（ｉｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをＡＴＰに変換する工程と、
（ｄ）前記第１の反応混合物を、ＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程であって、前記ＡＴＰ検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む工程と、
（ｅ）前記第２の反応混合物における発光を検出する工程と、
（ｆ）前記第２の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較する工程であって、前記第２の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
〔１１〕ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するか判定する方法であって、
（ａ）前記試料を、前記化合物と接触させて、試験試料を形成させる工程であって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含む工程と、
（ｂ）前記試験試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物を、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートを、サクシニル−ＣｏＡ及びＧＤＰに変換する工程と、
（ｄ）前記第１の反応混合物を、ＡＴＰ検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程であって、前記ＡＴＰ検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む工程と、
（ｂ）前記第２の反応混合物における発光を検出する工程と、
（ｃ）前記第２の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較する工程であって、前記第２の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
〔１２〕ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するか判定する方法であって、
（ａ）前記試料を、前記化合物と接触させて、試験試料を形成させる工程であって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含む工程と、
（ｂ）前記試験試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物を、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートを、サクシニル−ＣｏＡ及びＡＤＰに変換する工程と、
（ｄ）前記第１の反応混合物を、ＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程であって、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、アデニレートシクラーゼとピロフォスファターゼとを含む工程と、
（ｅ）前記第２の反応混合物を、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させる工程であって、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む工程と、
（ｆ）前記第３の反応混合物における発光を検出する工程と、
（ｄ）前記第３の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較する工程であって、前記第３の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
〔１３〕前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、前記〔９〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させる、前記〔７〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１９〕前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、先行態様のいずれか１項に記載の方法。
〔２２〕前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２４〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕試料中のサクシネートを検出するためのキットであって、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っていることを特徴とする、キット。
〔２６〕第１の検出試薬が、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
を含み、第２の検出試薬が、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔２５〕に記載のキット。
〔２７〕第１の検出試薬が、
（ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｉｉ）無機フォスフェートと、
（ｉｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｉｖ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉｉｉ）塩化マグネシウムと、
を含み、第２の検出試薬が、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔２５〕に記載のキット。
〔２８〕前記生物発光酵素が、耐熱性ホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリン基質が、Ｄ−ルシフェリンである、前記〔２５〕〜〔２７〕のいずれか１項に記載のキット。
〔２９〕試料中のサクシネートを検出するためのキットであって、
（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｉｉ）ＧＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っていることを特徴とする、キット。
〔３０〕第１の検出試薬が、
（ｉ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｉｉ）ＧＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、第２の検出試薬が、
（ｉｖ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｖ）ＡＤＰと、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔２９〕に記載のキット。
〔３１〕試料中のサクシネートを検出するためのキットであって、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、
（ｖ）ピロフォスファターゼと、
（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、
（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、
（ｉｘ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｉｘ）が、１つ以上の容器に入っていることを特徴とする、キット。
〔３２〕第１の検出試薬が、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、
（ｉｖ）アデニレートシクラーゼと、
（ｖ）ピロフォスファターゼと、
を含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、
（ｖｉ）ピルベートキナーゼと、
（ｖｉｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｖｉｉｉ）生物発光酵素と、
（ｉｘ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔３１〕に記載のキット。
〔３３〕前記キットを用いて、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含む、前記〔２５〕〜〔３２〕のいずれか１項に記載のキット。
〔３４〕試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するためのキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っていることを特徴とする、キット。
〔３５〕第１の検出試薬が、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
を含み、第２の検出試薬が、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔３４〕に記載のキット。
〔３６〕第１の検出試薬が、
（ｖ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、
（ｖｉ）無機フォスフェートと、
（ｖｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡと、
（ｖｉｉｉ）サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘｉｉ）塩化マグネシウムと、
を含み、第２の検出試薬が、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔３４〕に記載のキット。
〔３７〕試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するためのキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｖｉ）ＧＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っていることを特徴とする、キット。
〔３８〕第１の検出試薬が、
（ｖ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、
（ｖｉ）ＧＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、第２の検出試薬が、
（ｖｉｉｉ）グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、
（ｉｘ）ＡＤＰと、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔３７〕に記載のキット。
〔３９〕試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するためのキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、
（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、
（ｘ）ピルベートキナーゼと、
（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｘｉｉ）生物発光酵素と、
（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）が、１つ以上の容器に入っていることを特徴とする、キット。
〔４０〕第１の検出試薬が、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬とを含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、
（ｖｉｉｉ）アデニレートシクラーゼと、
（ｉｘ）ピロフォスファターゼと、
を含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、
（ｘ）ピルベートキナーゼと、
（ｘｉ）フォスフォエノールピルベートと、
（ｘｉｉ）生物発光酵素と、
（ｘｉｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含む、前記〔３９〕に記載のキット。
〔４１〕前記キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含む、前記〔３４〕〜〔４０〕のいずれか１項に記載のキット。
〔４２〕前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、前記〔３４〕〜〔４１〕のいずれか１項に記載のキット。
〔４３〕前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、前記〔４２〕に記載のキット。
〔４４〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、前記〔４３〕に記載のキット。
〔４５〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、前記〔４４〕に記載のキット。
〔４６〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、前記〔４５〕に記載のキット。
〔４７〕前記キットが、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含む、前記〔３４〕〜〔４６〕のいずれか１項に記載のキット。
〔４８〕前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、前記〔４７〕に記載のキット。
〔４９〕前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、前記〔４８〕に記載のキット。
〔５０〕前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、前記〔２５〕〜〔４９〕のいずれか１項に記載のキット。
〔５１〕前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、前記〔５０〕に記載のキット。
〔５２〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、前記〔５１〕に記載のキット。
〔５３〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、前記〔５２〕に記載のキット。
〔５４〕試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、
（ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、
（ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定する工程と、
を含み、
前記第１の検出試薬が、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、その後のＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬とを含み、前記第１の反応混合物を、前記ＡＴＰ枯渇試薬及び前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬、ならびに生物発光酵素及びルシフェリン基質と、順次接触させることを特徴とする、方法。
〔５５〕ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するか判定する方法であって、
（ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させる工程であって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含む工程と、
（ｂ）前記試験試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記サクシネート反応混合物を、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと接触させて、第１の反応混合物を形成させ、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートを、サクシニル−ＣｏＡ及びＡＤＰに変換する工程と、
（ｄ）前記第１の反応混合物を、ＡＴＰ枯渇試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
（ｅ）前記第２の反応混合物を、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させる工程であって、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む工程と、
（ｆ）前記第３の反応混合物における発光を検出する工程と、
（ｇ）前記第３の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較する工程であって、前記第３の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
〔５６〕前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、耐熱性ホタルルシフェラーゼと、Ｄ−ルシフェリンとを含む、前記〔５４〕または〔５５〕に記載の方法。
〔５７〕前記ＡＴＰ枯渇試薬が、（ｉ）アデニレートシクラーゼまたはＡＴＰスルフリラーゼと、（ｉｉ）ピロフォスファターゼとを含む、前記〔５４〕または〔５５〕に記載の方法。
〔５８〕前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、前記〔５５〕〜〔５７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５９〕前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、前記〔５８〕に記載の方法。
〔６０〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、前記〔５９〕に記載の方法。
〔６１〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、前記〔６０〕に記載の方法。
〔６２〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、前記〔６１〕に記載の方法。
〔６３〕前記試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と接触させる、前記〔５５〕〜〔６２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６４〕前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６５〕前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６６〕前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、先行態様のいずれか１項に記載の方法。
〔６７〕前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、前記〔６６〕に記載の方法。
〔６８〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、前記〔６６〕に記載の方法。
〔６９〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、前記〔６８〕に記載の方法。
〔７０〕試料中のサクシネートを検出するためのキットであって、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｉｖ）ＡＴＰ枯渇試薬と、
（ｖ）ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、
（ｖｉ）生物発光酵素と、
（ｖｉｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、１つ以上の容器に入っていることを特徴とする、キット。
〔７１〕第１の検出試薬が、
（ｉ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｉｉ）ＡＴＰと、
（ｉｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、第２の検出試薬が、（ｉｖ）ＡＴＰ枯渇試薬と、（ｖ）ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬とを含む、前記〔７０〕に記載のキット。
〔７２〕前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む、前記〔７０〕または〔７１〕に記載のキット。
〔７３〕前記ＡＴＰ枯渇試薬が、（ａ）アデニレートシクラーゼまたはＡＴＰスルフリラーゼと、（ｂ）ピロフォスファターゼとを含む、前記〔７０〕または〔７１〕に記載のキット。
〔７４〕前記キットを用いて、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するための説明書を更に含む、前記〔７０〕〜〔７３〕のいずれか１項に記載のキット。
〔７５〕試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するためのキットであって、
（ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、
（ｉｉ）２−オキソグルタレートと、
（ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）と、
（ｉｖ）アスコルベートと、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
（ｖｉｉｉ）ＡＴＰ枯渇試薬と、
（ｉｘ）ＡＴＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と、
（ｘ）生物発光酵素と、
（ｘｉ）ルシフェリン基質と、
を含み、（ｉ）〜（ｘｉ）が、１つ以上の容器に入っている、前記キット。
〔７６〕第１の検出試薬が、
（ｖ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、
（ｖｉ）ＡＴＰと、
（ｖｉｉ）コエンザイムＡと、
を含み、第２の検出試薬が、ＡＴＰ枯渇試薬と、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬を含み、前記ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬が、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含み、前記ＡＴＰ枯渇試薬が、（ａ）アデニレートシクラーゼまたはＡＴＰスルフリラーゼと、（ｂ）ピロフォスファターゼとを含む、前記〔７５〕に記載のキット。
〔７７〕前記キットを用いて、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するための説明書を更に含む、前記〔７５〕〜〔７６〕に記載のキット。
〔７８〕前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、前記〔７５〕〜〔７７〕のいずれか１項に記載のキット。
〔７９〕前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、前記〔７８〕に記載のキット。
〔８０〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ヒストンデメチラーゼのＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーである、前記〔７９〕に記載のキット。
〔８１〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ１Ａ、ＪＭＪＤ１Ｂ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＭＪＤ３、ＪＭＪＤ４、ＪＭＪＤ５またはＪＭＪＤ６である、前記〔８０〕に記載のキット。
〔８２〕前記ＪＭＪＣデメチラーゼが、ＪＭＪＤ２ＡまたはＪＭＪＤ２Ｃである、前記〔８１〕に記載のキット。
〔８３〕前記キットが、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含む、前記〔７５〕〜〔８１〕のいずれか１項に記載のキット。
〔８４〕前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、前記〔８３〕に記載のキット。
〔８５〕前記ヒストンペプチド基質が、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ１Ｋ９、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ４、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ２７、ヒストンＨ３ Ｍｅ３Ｋ３６またはヒストンＨ３ Ｍｅ２Ｋ３６である、前記〔８４〕に記載のキット。
〔８６〕前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼである、前記〔７０〕〜〔８５〕のいずれか１項に記載のキット。
〔８７〕前記ルシフェラーゼが、組み換えルシフェラーゼである、前記〔８６〕に記載のキット。
〔８８〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性及び／または化学的に安定なルシフェラーゼである、前記〔８７〕に記載のキット。
〔８９〕前記ルシフェラーゼが、耐熱性ホタルルシフェラーゼである、前記〔８８〕に記載のキット。
〔９０〕前記試料が、細胞を含む、前記〔１〕〜〔６９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９１〕前記試料が、細胞溶解物を含む、前記〔１〕〜〔６９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９２〕前記細胞が、真核細胞または原核細胞である、前記〔９０〕または〔９１〕に記載の方法。
〔９３〕前記試料が、組織試料を含む、前記〔１〕〜〔６９〕のいずれか１項に記載の方法。

Claims (16)

  1. 試料中のサクシネートの存在または量の検出または測定方法であって、
    （ａ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、
    （ｂ）前記第１の反応混合物を第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
    （ｃ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定する工程と、
    を含み、
    サクシネートが前記試料に存在する場合、前記第１の検出試薬及び前記第２の検出試薬が、前記サクシネートをＡＴＰに変換し、
    （ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡとを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、
    （ｉｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムとを含み、前記第２の検出試薬が、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、または
    （ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む
    ことを特徴とする、方法。
  2. 前記第１の反応混合物を、第２の検出試薬と接触させる工程によって、ＡＴＰが生成される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記試料が、細胞、細胞溶解物、または組織試料を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼであり、及び／または、前記ルシフェリン基質が、Ｄ−ルシフェリンである、請求項１に記載の方法。
  5. 請求項１に記載の方法に従って、試料中のサクシネートの存在または量を検出または測定するためのキットであって、
    （Ｉ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、
    （ＩＩ）ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、または
    （ＩＩＩ）ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼと、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む
    ことを特徴とする、キット。
  6. 試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性の検出または測定方法であって、
    （ａ）前記試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させる工程であって、前記試料がサクシネート形成酵素を含む場合に、サクシネートが形成される工程と、
    （ｂ）前記サクシネート反応混合物を、第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程であって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換する工程と、
    （ｃ）前記第１の反応混合物を、第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
    （ｄ）前記第２の反応混合物における発光を検出し、それによって、前記試料中のサクシネート形成酵素の存在もしくは量、またはサクシネート形成酵素の活性を検出または測定する工程と、
    を含み、
    （ｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡとを含み、前記第２の検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、
    （ｉｉ）前記第１の検出試薬が、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムとを含み、前記第２の検出試薬が、生物発光酵素とルシフェリン基質とを含むか、または
    （ｉｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記第２の検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む
    ことを特徴とする、方法。
  7. 前記第１の反応混合物を、第２の検出試薬と接触させる工程によって、ＡＴＰが生成される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記サクシネート形成酵素が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼである、請求項６に記載の方法。
  9. 前記２−オキソグルタレートオキシゲナーゼが、Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼまたは２−オキソグルタレート依存型ジオキシゲナーゼである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記Ｆｅ（ＩＩ）依存型リジンデメチラーゼが、ＪｕｍｏｎｊｉＣドメインを含むヒストンリジン（ＪＭＪＣ）デメチラーゼである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記試料が、細胞、細胞溶解物、または組織試料を含む、請求項６に記載の方法。
  12. 前記生物発光酵素が、ルシフェラーゼであり、及び／または、前記ルシフェリン基質が、Ｄ−ルシフェリンである、請求項６に記載の方法。
  13. 請求項６に記載の方法に従って、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を検出または測定するためのキットであって、
    （Ｉ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、
    （ＩＩ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡと、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、または
    （ＩＩＩ）ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと、ＡＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＡＤＰ）と、ＡＴＰと、コエンザイムＡと、アデニレートシクラーゼと、ピロフォスファターゼと、ピルベートキナーゼと、フォスフォエノールピルベートと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む
    ことを特徴とする、キット。
  14. 前記キットが、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質を含む、請求項１３に記載のキット。
  15. 前記ペプチド基質またはタンパク質基質が、ヒストンペプチド基質である、請求項１４に記載のキット。
  16. ある化合物が、試料中の２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性を調節するか判定する方法であって、
    （ａ）前記試料を前記化合物と接触させて、試験試料を形成させる工程であって、前記試料が、２−オキソグルタレートオキシゲナーゼを含む工程と、
    （ｂ）前記試験試料を、ペプチド基質、タンパク質基質または非タンパク質基質と、２−オキソグルタレートと、Ｆｅ（ＩＩ）と、アスコルベートと接触させて、サクシネート反応混合物を形成させる工程と、
    （ｃ）前記サクシネート反応混合物を、第１の検出試薬と接触させて、第１の反応混合物を形成させる工程と、
    （ｄ）前記第１の反応混合物を、ＡＴＰ検出試薬または第２の検出試薬と接触させて、第２の反応混合物を形成させる工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）で第２の検出試薬が用いられる場合には、前記第２の反応混合物を、ＡＤＰからＡＴＰへの変換／検出試薬と接触させて、第３の反応混合物を形成させる工程と、
    （ｆ）工程（ｄ）の前記第２の反応混合物または工程（ｅ）の前記第３の反応混合物における発光を検出する工程と、
    （ｇ）工程（ｄ）の前記第２の反応混合物または工程（ｅ）の前記第３の反応混合物における前記発光を、対照試料における発光と比較する工程であって、工程（ｄ）の前記第２の反応混合物または工程（ｅ）の前記第３の反応混合物における前記発光が、対照試料における前記発光と異なる場合、前記化合物を２−オキソグルタレートオキシゲナーゼ活性のモジュレーターとして同定する工程と、
    を含み、
    （ｉ）前記第１の検出試薬が、（Ａ）第１の反応混合物を形成し、それによって、工程（ａ）で形成された前記サクシネートをサクシニル−ＣｏＡに変換するための、３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡとを含むか、または（Ｂ）３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＳＣＯＴ）と、無機フォスフェートと、アセトアセチル−ＣｏＡと、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、塩化マグネシウムとを含み、かつ、前記ＡＴＰ検出試薬が、サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含むか、または
    （ｉｉ）前記第１の検出試薬が、ＧＤＰ形成サクシニル−ＣｏＡリガーゼ（ＳＣＳ−ＧＤＰ）と、ＧＴＰと、コエンザイムＡとを含み、前記ＡＴＰ検出試薬が、グアニレートキナーゼ（ＧＭＰＫ）と、ＡＤＰと、生物発光酵素と、ルシフェリン基質とを含む
    ことを特徴とする、方法。
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