JPH09510610A - ルシフェラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位またはＬｕｃｉｏｌａ属ルシフェラーゼの３５６位に位置するグルタミン酸と同等のグルタミン酸を代替アミノ酸、特にリシンで置換することにより、野生型ルシフェラーゼよりも高い熱安定性を具えたルシフェラーゼ活性保有タンパク質を提供する。本発明のタンパク質をコードし、また発現させるＤＮＡ、ベクター及び細胞、並びに本発明のタンパク質を用いる発光アッセイの実施のための試験キット及び試薬も提供する。好ましいタンパク質は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの２１５位またはＬｕｃｉｏｌａ属ルシフェラーゼの２１７位と同等の位置に第二の置換アミノ酸を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 ルシフェラーゼ 本発明は、ルシフェラーゼ活性を有する新規なタンパク質、及び該タンパク質 の発現をコードするＤＮＡ及びベクターに係わる。本発明は特に、３０℃を越え る温度下で熱安定性を有するルシフェラーゼを提供する。 ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ²⁺及び酸素分子の存在下にルシフェリ ンの酸化を触媒し、その結果光を発生させる。この反応の量子収率は約０．８８ であり［ＤｅＬｕｃａ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９７８）並びにＳｅｌｉｇｅｒ及 びＭｃＥｌｒｏｙ（１９６０）参照］、上記発光特性はＡＴＰレベルを測定する 発光測定（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイで用いられている。 ルシフェラーゼはホタルまたはツチボタルといった昆虫の体から直接取得可能 であり、あるいはまた該酵素をコードする組み換えＤＮＡ構築物を保有する微生 物からの発現によって取得可能である。この酵素を取得できる、またはこの酵素 をコードするＤＮＡを得ることができる四つの重要なホタル種は、日本のゲンジ ボタルＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びヘイケボタルＬｕｃｉｏｌａ ｌ ａｔ ｅｒａｌｉｓ、東ヨーロッパのホタルＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、 並びに北アメリカのホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）である。ツチ ボタルＬａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａもルシフェラーゼ供給源の一つで あり、そのルシフェラーゼのアミノ酸配列はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ のものに対して８４％の相同性を有する。 野生型ルシフェラーゼ及び組み換えルシフェラーゼの熱安定性は、これらのル シフェラーゼを３０℃を越える、特に３５℃より高い温度に曝露するとその活性 がきわめて急激に失われるようなものである。このような不安定性は、上記酵素 を高い周囲温度の下で使用もしくは貯蔵する場合、または加熱によって反応速度 を高めなければならない場合当該酵素の欠点となる。日本ホタルのルシフェラー ゼをその２１７位において突然変異させてトレオニン残基をイソロイシン残基に よって置換すれば該ルシフェラーゼを熱失活に対して安定化できることが知られ ている（Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ ３２ ，ｐｐ．１３７９５−１３７９９，１９９３）。上記のようにして、酵素の熱及 びｐＨ安定性並びに比活性 が高められた。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎ ｇｒｅｌｉｃａの熱安定化は未だ報告されていない。 本発明者はここに、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍ ｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのいずれもが保存する配列中に存在するグルタミン酸（ｇｌ ｕｔａｍａｔｅ）残基を代替アミノ酸、特にリシンまたはアルギニンで置換する ことによって、野生型ルシフェラーゼより高い熱安定性を有する新規なルシフェ ラーゼを提供する。上記グルタミン酸はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシ フェラーゼの３５４位に見出されるもので、前記種及び他の種のルシフェラーゼ 中に見出される保存アミノ酸配列ＴＰＥＧＤＤＫＰＧＡの３番目のアミノ酸であ る。 即ち、本発明はその第一の態様において、ルシフェラーゼ活性を有するタンパ ク質で、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌ ｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒ ａｌｉｓのそのようなタンパク質に対して６０％ を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質を提供しこのタンパク質はＰｈ ｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４またはＬｕｃｉｏｌ ａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏ ｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５６に対応するアミノ酸残基 がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする。 上記アミノ酸は天然アミノ酸であっても、また天然アミノ酸の修飾体や天然ア ミノ酸の類似体といったいわゆる非一般的アミノ酸であってもよい。グルタミン 酸以外のアミノ酸の類似体とは、タンパク質への作用において元のアミノ酸と同 等である化合物のことであると理解される。典型的な非一般的アミノ酸は、“Ｕ Ｓ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔｉｎ Ｍａｎｕａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｃａｓｅ ｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ／ｏｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎ ｃｅｓ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｕｎｕｓｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ”に示されているものであ る。 好ましくは、本発明のタンパク質はアミノ酸配列ＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、こ の配列中のＸはグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする。更に好ま しくは、本発明のタンパク質はアミノ酸配列ＴＰＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、その 際Ｘは熱安定性の観点から、アスパラギン酸、プロリンまたはグリシン以外の任 意のアミノ酸であることが好ましい。更に好ましくは、Ｘはトリプトファン、バ リン、ロイシン、イソロイシンまたはアスパラギンであるが、リシンもしくはア ルギニンまたはそのいずれかの類似体であれば最も好ましい。 上記保存ＴＰＸＧＤＤＫＰＡ領域中１個または２個のアミノ酸が相違するルシ フェラーゼを有し得る種は幾つか存在するが、前記配列の３位のアミノ酸がグル タミン酸でないように改変されたルシフェラーゼに対応する活性タンパク質は総 て本発明により提供されることは明らかである。 本発明の好ましい態様において、本発明のタンパク質は、Ｌｕｃｉｏｌａ属ホ タルルシフェラーゼのアミノ酸２１７またはＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ ルシフェラーゼのアミノ酸２１５に対応する位置のアミノ酸が、ヨーロッ パ特許出願公開第０５２４４４８号に開示されているような疎水性アミノ酸、好 ましくはイソロイシン、ロイシンまたはバリンに変更されたアミノ酸を有する。 このような変更を行なうと、３５４位の変更のみの場合よりも熱安定性が向上す ることが判明した。即ち、これら二つの変更は実質的に互いに独立で、しかも併 用可能な効果を有する。 本発明は第二の態様において、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを提供 し、また第三の態様では、本発明のタンパク質を発現し得るような形態を有する 、ｌｕｃ遺伝子（ルシフェラーゼをコードする遺伝子）を含むベクター、特にプ ラスミドを提供する。上記のような形態とはベクターが本発明のタンパク質の発 現を制御し得るＤＮＡ配列を、微生物宿主細胞への導入時に前記タンパク質が、 必要であれば適当な誘導物質の添加により、必要に応じて容易に発現され得るよ うに含む形態のことである。 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ のｌｕｃ遺伝子はいずれも公知であり、かつ標準的な分子生物学的技術で単離可 能である。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの ｌｕｃ遺伝子はＰｒｏｍｅｇａから、プラスミドｐＧＥＭとして市販されている 。即ち、本発明のＤＮＡの調製に用いる出発物質を得るのに好ましい方法及び供 給源は、（ｉ）天然のホタルゲノムＤＮＡを用い、このＤＮＡから得たｌｕｃ遺 伝子を、例えばＰＣＲを用いて増幅すること、（ｉｉ）ｐＧＥＭ、及び（ｉｉｉ ）Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏのｐＧＬｆ３７プラスミドである。ルシフ ェラーゼ活性、即ちルシフェリンを酸化させて発光を実現する活性を有するタン パク質をコードする更に別の遺伝子も、本発明のＤＮＡを得、かつ遺伝子発現に よって究極的に本発明のタンパク質を得るための出発物質の適当な供給源である 。 本発明のＤＮＡを調製するべく野生型または他の種類のｌｕｃ遺伝子を操作す る上で用いるのに適したベクターは、天然グルタミン酸の代替アミノ酸への改変 が行なわれる一方で、ＤＮＡを内部に含み得る任意のベクターである。例えばヒ ドロキシルアミンなどの薬剤を用いて化学的に誘発される突然変異の場合、ベク ターは特に重要でなく、突然変異誘発過程前後の遺伝子操作を容易にする適当な ベクターは当業者であれば多数想起できよう。 ｌｕｃ遺伝子を前記グルタミン酸において特異的に突然変異させることが好ま しく、即ち部位特異的突然変異誘発操作が必要となる。この操作はベクターにお いて最も容易に実施でき、当業者にも良く知られている。 野生型、及び公知のｌｕｃ遺伝子、並びに本発明のｌｕｃ遺伝子の発現に適し たベクターには、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ ａｎｎｈｅｉｍから入手可能）及びｐＴ７−７が含まれる。先の２種は、発現が イソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在によって誘発されることを 可能にするラクトースリプレッサーの制御下にｔａｃプロモーターを有する。ｐ Ｔ７−７はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによる制御を可能にし、即ち Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを有する大腸菌細胞におけるきわめて高レベルの遺伝 子発現の基礎となる。これらのベクターうちで、ｐＴ７−７ベクターにｌｕｃ遺 伝子を挿入した場合に発現が最高となることが判明した。 ｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０に挿入されたｌｕｃ遺伝子由来のルシフェ ラーゼの発現は野生型Ｎ末端配列ルシフェラーゼの発現をもたらし、一方ｐＴ７ −７に挿入さ れたｌｕｃ遺伝子の発現は余分のＮ末端アミノ酸Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑとの融合タ ンパク質の合成をもたらす。ｌｕｃ遺伝子を含有するベクター（構築物ｐＰＷ２ ０４、ｐＰＷ１１６及びｐＰＷ３０４と呼称する）それぞれにおけるｌｕｃ遺伝 子のリボソーム結合部位及び開始コドンを、実施例の表１に示す。 本発明はその第三の態様において、本発明のタンパク質を発現させ得る細胞、 該細胞を用いて本発明のタンパク質を製造する方法、並びに本発明のタンパク質 を含む試験キット及び試薬を提供する。本発明はまた、ルシフェリン／ルシフェ ラーゼ試薬を用いてＡＴＰを測定する、当業者に良く知られたアッセイ方法であ って、ルシフェラーゼが本発明のタンパク質であることを特徴とする方法も提供 する。本発明のルシフェラーゼ調製物は３０〜７０℃、特に３７〜６０℃、更に は４０〜５０℃において、野生型ルシフェラーゼ及び組み換え野生型ルシフェラ ーゼに比較してより熱安定性である。 本発明のタンパク質の発現には、細胞自身のＤＮＡ中にか、または細胞内に導 入されたプラスミドなどのベクター中に存在するＤＮＡ配列を用いて異種タンパ ク質を発現さ せ得る任意の細胞を用い得る。このような細胞は典型的には、Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞などの酵母細胞及び大腸菌細胞などの細 菌細胞であるが、タンパク質発現という目的に適った宿主生物は当業者ならほか にも多数想起できよう。タンパク質が昆虫タンパク質であるので、昆虫細胞が好 ましいともいえる。タンパク質は、天然ルシフェラーゼ及び公知の組み換えルシ フェラーゼに類似の構造を有するタンパク質として発現されてもよく、または前 記のようなタンパク質と、他のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、または他の化 学実体、例えば先に触れたＭ−Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑ配列との融合体または結合体とし て発現されてもよい。 或る種の宿主は特定の優先コドンを持ち、例えば細菌は場合によっては酵母と は異なるコドンを用いるので、前記のような宿主に導入するＤＮＡは、所与のア ミノ酸に関して当該宿主における発現をより好ましく実現する縮重コドンが得ら れるように改変すれば有利であり得ることは、当業者には明らかであろう。その ような縮重ＤＮＡは当然ながら、本発明のＤＮＡの範囲に含まれる。 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は適当な宿主の一つで、誘導 性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にその染色体に安定に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを有し、即ちこの宿主はｐＴ７−７由来の構築物と適合性で ある。ＢＬ２１のような大腸菌Ｂ株は、ｌｏｎプロテアーゼ及びｏｍｐＴ外膜プ ロテアーゼを欠く。これらの欠失は、大腸菌における外来タンパク質の発現及び 蓄積を安定化する一助となり得る。先に述べた３種の発現構築物をそれぞれ保有 する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の粗抽出物をアッセイしたところ、最高レベルの ルシフェラーゼ発現は構築物ｐＰＷ３０４を保有する細胞において実現すること が判明した（表２参照）。 本発明の突然変異タンパク質は熱安定性以外の利点も有する。Ｐｈｏｔｉｎｕ ｓ属３５４位／Ｌｕｃｉｏｌａ属３５６位のアミノ酸を突然変異させると、いず れのアミノ酸または類似体でグルタミン酸を置換するかに依存してルシフェリン の酸化の際に発せられる光の波長が変化することが判明した。即ち、本発明は、 特異的結合物質のラベルとして用いるルシフェラーゼ、またはそのタンパク質産 物が用いられるルシフェリン酸化の際に特定波長の光として自身の存在（ｉｄｅ ｎｔｉｔｙ）を報告し返すリポーター遺 伝子も提供する。上記のような特性の獲得では、グリシン、プロリン及びアスパ ラギン酸などを用いる突然変異も利用できる。本発明のタンパク質はまた、その 熱安定性が向上することから、後段に例示するように比較的高温、例えば３７℃ 以上の温度の下でも対応して向上した収率で製造可能であるという利点も有する 。 本発明のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター及び細胞の一例を、次の非限定的実施 例、添付図面、諸表及び配列表を参照しつつ以下に詳述する。別のタンパク質、 タンパク質結合体、ＤＮＡ、ベクター及び細胞、並びにこれらのうちのいずれか を包含するアッセイ及び試験キットも、ここに説明するものに照らせば当業者に は想起されよう。図面の簡単な説明 図１は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＫＫ２２３−３ から得たプラスミドｐＰＷ２０４の制限酵素地図である。 図２は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＤＲ５４０から 得たプラスミドｐＰＷ１１６の制限酵素地図である。 図３は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入に よってｐＴ７−７から得たプラスミドｐＰＷ３０４の制限酵素地図である。 図４はｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位を除去したｐＧＥＭ−ｌｕｃ由来のＢａｍ Ｈ１／Ｓｓｔ１断片とから得たプラスミドｐＰＷ６０１ａの制限酵素地図である 。 図５は実施例に後述するように所与の温度で２０分間インキュベートした組み 換え及び野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）の熱失活のグ ラフである。 図６は異なる温度下で増殖させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＰＷ３０４の粗 抽出物中のルシフェラーゼ活性のグラフである。 図７はｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１（グルタミン酸３５４がリシンで 置換されるようにコードする本発明のプラスミド）に由来するルシフェラーゼ活 性の熱失活のグラフである。 図８はＳｉｇｍａ野生型、ｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１組み換えルシ フェラーゼの３７℃での経時失活のグラフである。 図９はＴａｂｏｒから得たｐＴ７−７の制限酵素地図である。 図１０は野生型の３５４位のグルタミン酸がアラニン、バリン、ロイシン、イ ソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、ヒス チジン、アスパラギン、メチオニン、アルギニン、リシン、セリン、トレオニン 及びシステインでそれぞれ置換されたルシフェラーゼを発現する本発明のルシフ ェラーゼ発現大腸菌の粗細胞抽出物活性の、４０℃のＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液 中での熱活失を示すグラフである。 図１１はＥ３５４Ｋリシン変更及びＡ２１５Ｌロイシン変更を有する精製二重 突然変異ルシフェラーゼ活性のリン酸緩衝液中４７℃での熱失活を、単一突然変 異体Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋと比較して示すグラフである。 図１２は０．０２％アジドを加えたｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃ におけるリシンＥ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ、組み換え野生型ルシフェラ ーゼ及び天然ホタルルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の経時変化を示すグ ラフである。 図１３は組み換え野生型、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異体及びＥ３５４Ｋ＋Ａ２１ ５Ｌ二重突然変異体の３７℃でのルシフェラーゼ発現を、培養細胞密度の尺度と しての光学密 度の上昇をルシフェラーゼ活性に対してプロットすることによって示すグラフで ある。 図１４は１％ＢＳＡ及び０．０２％アジドを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥ Ｓ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ 単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ 野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示す グラフである。 図１５は１％ＢＳＡ、０．０２％アジド、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴ Ｔを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌの Ａ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二 重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（ ％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。配列表 ： 本明細書本文の最後に添付した配列表に、次のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す 。 配列番号１には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型の１０６３〜１０ ６５位に位置するコドンを突然変異 させた、本発明のルシフェラーゼをコードするＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。リシ ンを得るには１０６３位の塩基をＡに突然変異させる。 配列番号２には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型のアミノ酸３５４ のグルタミン酸を別のアミノ酸に変更した本発明のタンパク質のアミノ酸配列を 示す。 配列番号３には、実施例２においてｐＰＷ６０１をＳＤＭ突然変異させ、それ によって３５４位にグルタミン酸に替えてリシンを得るのに用いたオリゴヌクレ オチドの配列を示す。 配列番号４には、実施例５においてｐＰＷ６０１をＳＤＭ突然変異させ、それ によって２１５位にロイシンを得るのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す 。 配列番号５には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型のアミノ酸３５４ のグルタミン酸を他の任意のアミノ酸に変更し、かつアミノ酸２１５をロイシン に変更した本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。実施例 実施例１：本発明のＤＮＡを含むプラスミドの作製 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからプラスミ ドｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０を得た。ｐＤＲ５４０はＰｈａｒｍａｃｉ ａからも入手可能である。 マサチューセッツ州、ボストン所在のＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃ ｈｏｏｌ、生物化学部のＳｔａｎ Ｔａｂｏｒから、プラスミドｐＴ７−７（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第II巻，１６．２．１．章のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ参照）を得たが、該プラスミドは、（図８に示されている ように）ｐＴ７−５のＰｖｕIIとＣｌａＩ部位の間に挿入されたＴ７遺伝子１０ タンパク質（Ｔ７ ２２８５７〜２２９７２ｂｐ）のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ プロモーターφ１０及び翻訳開始部位を含んでいる。（５′末端に充填後）融合 タンパク質を作製するための単一制限部位は、フレーム０：ＥｃｏＲＩ；フレー ム１：ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＣｌａＩ；フレーム２：ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ，Ｈ ｉｎｄIIIである。元のポリリンカーのＳａｃＩ部位を欠失により除去し、追加 のＸｂａＩ部位を開始コドンの上流に設ける。 Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．からホタルルシフェラーゼ（カタログ番 号 Ｌ９００９の結晶懸濁液から調製）、補酵素Ａ及びＡＴＰを得た。甲虫ルシ フェリンカ リウム塩はＰｒｏｍｅｇａから得た。細胞抽出物をＰｒｏｍｅｇａテクニカルブ レティン １０１号に記載のように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の一部を細胞 溶解試薬（２５ｍＭ トリス−リン酸、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ トリトン Ｘ−１００、２．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１．２５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）中で室温で１０分間溶解し、次い でアッセイに先立ち、氷上に保存した。 コロニーをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移 し、次いで該フィルターを、０．５ｍＭ ルシフェリンを含有する１００ｍＭク エン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０〔Ｗｏｏｄ ＆ ＤｅＬｕｃａ，（１９８７） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６１ ５０１−５０７ページ〕に浸して、該コロニ ーが発光する生物発光をモニターして、細胞系のルシフェラーゼ活性をアッセイ した。１２５μｌのアッセイ緩衝液（２０ｍＭ トリシン、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、 ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、０．２７ｍＭ 補酵素Ａ、０．４ ７ｍＭ ルシフェリン、０．５３ｍＭ ＡＴＰ及び１〜２μｌの試料）を用い、２ ５℃で、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイを実 施した。アッセイカクテルの最終ｐＨは７．８であり、ＢｉｏＯｒｂｉｔ １２ ５０ルミノメーターを用いて光測定を行った。 ＤＮＡの非特異的化学突然変異体を作製するために、Ｋｉｒｏｎｄｅら（１９ ８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９，４２１−４２６ページの方法に従って、０ ．１ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０中０．８Ｍ ヒドロキシルアミン、１ｍＭ ＥＤＴＡを用い、６５℃で２時間、ｌｕｃ遺伝子を含むプラスミドを処理した。 突然変異を起こしたプラスミドをＧ６０ ＤＮＡグレードＮｉｃｋカラム（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形 質転換した。 ルシフェラーゼ活性を有する粗細胞抽出物を種々の温度で２０分間インキュベ ートし、残留活性を測定して、熱失活実験を実施した。Ｓｉｇｍａから得た精製 ルシフェラーゼを用いた実験では、失活に先立ち、酵素をＰｒｏｍｅｇａ溶解緩 衝液に希釈した。経時変化実験では、溶解緩衝液中５０μｌの粗細胞抽出物又は Ｓｉｇｍａルシフェラーゼを含むエッペンドルフ管を３７℃でインキュベートし た。アッセイに先立ち、種々の時間に管を取り出し、氷上で冷 却した。残留（又は残存）活性は初期の活性の百分率として表した。 各構築物、ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６及びｐＰＷ３０４からのルシフェラー ゼの相対的発現レベルは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）では０．１：０． ５：１．０である。ＬＢ中３７℃でＯＤ ６００が０．３になるまで細胞を増殖 させ、次いで、ＩＰＴＧにより誘発、４時間増殖を継続させた後、粗抽出物を調 製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。 以下のプロトコルを用い、グルタミン酸を別のアミノ酸に変換するに必要な部 位特異的突然変異誘発を実施した。グルタミン酸からリシンへの突然変異は単一 ＡｖａＩ制限部位内に存在し、従って該部位を破壊するので、単一のオリゴヌク レオチドを突然変異誘発及び選択オリゴヌクレオ チドとして用いることが可能である。 部位特異的突然変異誘発プロトコル： 選択したプラスミドをリシン用の選択／突然変異誘発オリゴヌクレオチド：5 ′−CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG−3′〔下線を付したＴは不適正（ミスマッチ）塩 基である〕で変性・アニーリングする。突然変異ＤＮＡ鎖を合成、連結し、一次 制限部位全体をＡｖａＩで消化する。 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ２−８９型を用い、細胞、この場合 はＥ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１−１８突然変異Ｓ細胞への形質転換を実施した。収 穫した細胞と、突然変異を起こしたプラスミド及び親プラスミドを含む精製混合 プラスミドプールとを得、ＡｖａＩによる二次制限消化を実施して、Ｅ．ｃｏｌ ｉ ＪＭ１０９細胞に形質転換した。これらの細胞を選択培地（ＬＢ寒天＋５０ μｇ／ｍｌ アンピシリン）上に置き、クローンのプニラスミドＤＮＡを精製し 、ＡｖａＩ制限部位の欠損を分析してクローンのスクリーニングを行った。いず れの場合にも、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７，１５１３ページのアルカリ溶解法を用いてプラ スミドＤＮＡを精製した。厳密なプ ロトコルは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（ＵＳ）から カタログ番号Ｋ１６００−１として販売されている、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ^{RT M} 部位特異的突然変異誘発キット（バージョン２）に記載の通りであった。 Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位が破壊されたｐＧＥＭ−ｌ ｕｃからのＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩフラグメントとから誘導されたｐＰＷ１１６の 変異体であるｐＰＷ６０１ａの制限地図を図４に示す。上記のように、Ｃｌｏｎ ｔｅｃｈの指示に従って、挿入された野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓのｌｕｃ遺伝子を 、発現されたタンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に示されているように３５ ４位でリシンに改変されている配列番号１（１０６３−１０６５はＡＡＧである ）に示されている配列に変換するように部位特異的突然変異誘発を実施した。実施例２：ルシフェラーゼの熱安定性 Ｅ．ｃｏｌｉにおいて上記のように作製されたベクター中の非改変及び改変（ 即ち、本発明の）ｌｕｃ遺伝子によって発現された種々のルシフェラーゼの熱安 定性を測定し、結果を図５〜図８に示す。 ５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ ／ｖ）ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％ 硫酸アンモニウム中、４３．５℃で５ ０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ活性のｔ^1/2（半減期）の比較は、以下のような 時間で到達する残留５０％活性を示す。 上記数値から明らかなように、３５４グルタミン酸をリシンで置換すると、ル シフェラーゼの熱安定性が少なくとも４３．５％まで増大することがわかる。実施例３：ルシフェラーゼの熱安定性 Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施例１に記載のものと類似の方法で作製したベクター 中の本発明の他の３５４位突然変異に対応するＳＤＭ改変ｌｕｃ遺伝子により発 親された多くのルシフェラーゼの熱安定性を測定し、結果を図１０にグラフで示 す。 Ｐｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液中４０℃でｔ^1/2の比較を行い、以下のようなｔ^1/2 （分）の結果を得た： 実施例４：３７℃及び室温でのルシフェラーゼの安定性 ｐＰＷ６０１Ｋリシン突然変異ルシフェラーゼ（８６ｎｇ／ｍｌ）、組換え野 生型ルシフェラーゼ（５５０ｎｇ／ｍｌ）及び天然型ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍ ａ）（６２． ５ｎｇ／ｍｌ）を、１％ ＢＳＡ、保存剤として０．０２％アジドを含むｐＨ７ ．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃で４時間インキュベートした。残留活性を測定 するために、Ｄ−ルシフェリン基質に１ｎｇのルシフェラーゼを加え、１分当た りの発光カウント数を記録した。 ３７℃で２時間、室温で１０日間インキュベートした後の残留活性に関する結 果を以下に示す。 ３７℃で２時間後： Ｅ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ 残留活性７０％ 組換え野生型ルシフェラーゼ 残留活性１２％ Ｓｉｇｍａ天然ルシフェラーゼ 残留活性１８％ 室温で１０日後： Ｅ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ 残留活性８５％ 組換え野生型ルシフェラーゼ 残留活性５９％ Ｓｉｇｍａ天然ルシフェラーゼ 残留活性７１％実施例５：３５４Ｋ：２１５Ｌ二重突然変異体の作製及び安定性 実施例１に記載のように、ｐＰＷ６０１ａ Ｅ３５４Ｋを得、これを、配列番 号４のオリゴヌクレオチド、5′-GAATCTGACGCAGAGAGTTCTATGCGG-3′〔下線を付 した塩基は突然変異を引き起こす不適正（ミスマッチ）塩基を表す〕 を用いて突然変異を起こさせ、ｐＰＷ６０１ａ Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌ ｉｓルシフェラーゼの３５４リシン：２１５ロイシン二重突然変異体を作製した 。熱失活媒体として１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴ Ｔ及び１０％硫酸アンモニウムを含むｐＨ７．８リン酸緩衝液を用い、実施例２ から４に記載のようにして、実施例１に記載のものと類似の方法によりＥ．ｃｏ ｌｉ中で発現させて得られたルシフェラーゼのＤＮＡ配列決定及び熱安定性の測 定によりこの突然変異体を確認した。 リン酸緩衝液中４３．５℃では、３２分間にわたる活性の損失は５％未満であ ったのに対し、４７℃では、ｔ^1/2は約３８分であった。５０℃では、二重突然 変異体は、１６分間のインキュベーション後に１５％の活性を保持している。こ の失活テストの結果を図１２にグラフで示す。実施例６：ルシフェラーゼの精製 組換え野生型又は突然変異ルシフェラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０ ９細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ ）中３０℃で増殖させ、初期対数増殖期の間にＩＰＴＧ（１ｍＭ）により誘発さ せた。中間の静止期に細胞を収穫し、５０ｍＭ Ｋ Ｃｌ、１ｍＭ ジチオトレイトール、１．２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフル オリド（ＰＭＳＦ）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ８．０（緩衝液Ａ）に再懸濁した。ＭＳＥ ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０音波処理装 置（振幅：１４μ）中で細胞を破壊し、細胞溶解物を３０，０００×ｇで３０分 間遠心した。次いで、粗抽出物の上清を硫酸アンモニウムで分画し、３５〜５５ ％飽和の間に沈殿した画分が、ルシフェラーゼ活性を含むことが見いだされ、緩 衝液Ａに溶解した。 ０．５ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ） 中で平衡にしたＰｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ１０カラムを用いて抽出物を脱塩し、 脱塩抽出物をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｎｏ Ｑアニオン交換カラムにかけ、緩衝 液Ｂ中０→５００ｍＭの直線勾配のＮａＣｌを用い流速４ｍｌ／分で２ｍｌの画 分として溶離した。ルシフェラーゼ活性のピーク画分を捕集し、長期保存するた めに、０．５ｍＭ ＤＴＴ及び１２％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２５ｍＭ リ ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。実施例７：精製ルシフェラーゼの熱失活 実施例６に記載のように、ルシフェラーゼの無細胞抽出物を含むエッペンドル フ管を準備した。精製したルシフェラーゼ調製物（５０μｇ／ｍｌ）を、１０％ 飽和硫酸アンモニウム、１ｍＭ ジチオトレイトール及び０．２％ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８からなる熱 安定性緩衝液中でインキュベートした。アッセイに先立ち、設定時間に管を取り 出して氷／水浴中で冷却し、定量残留活性を初期活性の百分率として計算した。 ４２〜５０℃の温度範囲にわたって熱安定性緩衝液中での失活の半減期を測定 して、精製された組換え野生型及び熱安定性ルシフェラーゼのアウレニウスプロ ットを作成した。次いで、ｔ^1/2（分）の自然対数値を１／Ｋに対してプロット した。等しい失活率に対して、Ｅ３５４Ｋ突然変異体はこの範囲の温度で熱安定 性を２℃上昇させるのに対し、Ａ２１５Ｌ突然変異体は５℃上昇させ、二重突然 変異体Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌは６℃上昇させる。後者は、二重突然変異体の付 加的性質を示している。実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて野生型組換えルシフェラーゼに比べて増大した 突然変異ルシフェラーゼの発現 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞におけるルシフェラーゼの発現を液状培地中３ ７℃での増殖中にモニターした。増殖中に、熱安定性突然変異体を発現する細胞 は、組換え野生型酵素を発現する細胞に比べてより高い活性のルシフェラーゼを 蓄積することが判明した。図１３は、組換え野生型、Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ二 重突然変異体及びＥ３５４Ｋの培養物について、６００ｎｍで増大する光学密度 に対してルシフェラーゼ活性をプロッティングした際の上記作用をグラフで示し ている。単一及び二重突然変異体の熱安定性が増大すると、培養温度３７℃での ルシフェラーゼの産生が増大し得ることがわかる。実施例９：３７℃での突然変異ルシフェラーゼの安定性に対する緩衝液の作用 １％ ＢＳＡ及び０．０２％ アジドを含むＨＥＰＥＳｐＨ７．７５緩衝液中、 Ａ２１５Ｌ、Ｅ３５４Ｋ、Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ、組換え野生型及びＳｉｇｍ ａルシフェラーゼそれぞれの１０ｎｇ／ｍｌ溶液を調製し、３７℃での熱安定性 を、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴを添加した同一組成物と比較した。結果 を図１４及び図１５に示す。該結果は、Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋの３７℃での 相 対安定性が緩衝液によって変化することを示している。実施例１０：Ｄ−ルシフェリンの酸化により発光した光の波長に対するアミノ酸 置換の影響 Ｄ−ルシフェリンを実施例３に記載の種々の本発明ルシフェラーゼで酸化した ときに発光した光の波長を測定し、該波長がアミノ酸の突然変異によって変化す ることを知見した。発光した光の波長は、組換え野生型（Ｅ３５４）とＥ３５４ Ｋとでは５ｎｍの変化があり、Ｅ３５４ＫとＥ３５４Ｉとでは約１５ｎｍの変化 があった。 野生型組換えＥ．ｃｏｌｉ微生物はＤ−ルシフェリンの存在下に黄緑色の発光 を示す。Ｄ−ルシフェリンを加えた場合の各突然変異Ｅ．ｃｏｌｉによる発光色 は以下の通りであった： Ｅ３５４Ｇ 黄緑色 Ｅ３５４Ｎ 黄緑色 Ｅ３５４Ａ 緑色 Ｅ３５４Ｖ 橙赤色 Ｅ３５４Ｍ 橙赤色 Ｅ３５４Ｆ 黄緑色 Ｅ３５４Ｌ 黄色 Ｅ３５４Ｙ 黄緑色 Ｅ３５４Ｓ 黄緑色 Ｅ３５４Ｃ 黄緑色 Ｅ３５４Ｋ 黄色 Ｅ３５４Ｑ 黄緑色 Ｅ３５４Ｗ 黄緑色 Ｅ３５４Ｔ 黄緑色 Ｅ３５４Ｐ 橙色 Ｅ３５４Ｒ 黄橙色 Ｅ３５４Ｈ 黄緑色 Ｅ３５４Ｎ 黄色 Ｅ３５４Ｉ 赤色。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/50 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ホワイト，ピーター・ジヨン イギリス国、ケンブリツジシャー・シー・ ビー・２・１・キユー・テイー、ケンブリ ツジ、テニス・コート・ロード、ユニバー シテイ・オブ・ケンブリツジ（番地なし) (72)発明者 マリイ，ジエイムズ・オーガスタス・ヘン リー イギリス国、ケンブリツジシャー・シー・ ビー・２・１・キユー・テイー、ケンブリ ツジ、テニス・コート・ロード、ユニバー シテイ・オブ・ケンブリツジ（番地なし) (72)発明者 スキレル，デイビツド・ジエイムズ イギリス国、ウイルトシヤー・エス・ピ ー・４・０・ジエイ・キユー、サリスベ リ、ポートン・ダウン、シー・ビー・デイ ー・イー（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ルシフェラーゼ活性を有し、かつＰｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃ ｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬ ｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼに対して６０％を越え るアミノ酸配列相同性を有するタンパク質であって、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒ ａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉ ｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌ ｉｓルシフェラーゼの残基３５６に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外の アミノ酸であることを特徴とするタンパク質。 ２．アミノ酸配列ＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸以外 のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。 ３．アミノ酸配列ＴＰＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸 以外のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。 ４．アミノ酸Ｘがグリシン、プロリンまたはアスパラギン酸でないことを特徴と する請求項１から３のいずれか１項 に記載のタンパク質。 ５．アミノ酸Ｘがトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びアスパ ラギンのうちのいずれかであるか、またはこれらのアミノ酸のうちのいずれかの 類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記 載のタンパク質。 ６．アミノ酸Ｘがリシン及びアルギニンのいずれか一方であるか、またはこれら のアミノ酸の類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１から３のいず れか１項に記載のタンパク質。 ７．配列番号２に示したアミノ酸配列を含み、前記配列中のＸａａは請求項５ま たは６に記載のアミノ酸またはその類似体もしくは修飾体であるタンパク質。 ８．請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。 ９．配列番号１に示したヌクレオチド配列を含み、前記配列の１０６３〜１０６ ５位の３個の塩基Ｎはグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンを構成す ることを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ。 １０．前記コドンが請求項５または６に記載のアミノ酸、 類似体または修飾体をコードすることを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ。 １１．請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするｌｕｃ遺 伝子を含むベクター。 １２．野生型または組み換えｌｕｃ遺伝子を含むベクターを、Ｐｈｏｔａｌｉｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位のグルタミン酸またはＬｕｃｉｏｌ ａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃ ｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５６位のグルタミン酸をコー ドするコドンを代替アミノ酸、該アミノ酸の類似体、または該アミノ酸の修飾体 をコードするコドンに変更する部位特異的突然変異誘発によって処理することに より取得可能であることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。 １３．代替アミノ酸が請求項５または６に記載のアミノ酸、類似体または修飾体 であることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。 １４．内部にｌｕｃ遺伝子が連結された、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０及び ｐＴ７−７の中から選択されることを特徴とする請求項９から１３のいずれか１ 項に記載のベ クター。 １５．請求項８から１４のいずれか１項に記載のＤＮＡまたはベクターを保有す る、請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質を発現させ得る細胞。 １６．大腸菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは昆虫細胞であることを特徴とす る請求項１５に記載の細胞。 １７．ＡＴＰ測定によるアッセイを実施するための試験キットであって、発光試 薬中に存在する請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質を含むことを 特徴とするキット。 １８．光を発生するルシフェリン及びルシフェラーゼを用いてＡＴＰを測定する アッセイ方法であって、前記光の量はＡＴＰの量に関連し、ルシフェラーゼが請 求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質であることを特徴とする方法。 １９．アッセイを３０〜７０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記 載の方法。 ２０．アッセイを３７〜６０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記 載の方法。 ２１．アッセイを４０〜５０℃の温度で行なうことを特徴 とする請求項１８に記載の方法。 ２２．熱安定化剤の不在下に室温で１０日間貯蔵後にそのルシフェラーゼ活性を ８５％以上維持しているルシフェラーゼ調製物。 ２３．請求項１から７のいずれか１項または請求項２２に記載のルシフェラーゼ の、特異的結合試薬のためのラベルとしての使用。 ２４．請求項１から７のいずれか１項に記載のルシフェラーゼで標識した特異的 結合試薬を含むことを特徴とする試験キット。 ２５．細胞またはＤＮＡの同定のための、請求項８から１４のいずれか１項に記 載のルシフェラーゼコーディングＤＮＡまたはベクターの使用。