BR112013010484B1 - derivados de coelenterazina e métodos de utilizar os mesmos - Google Patents

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Abstract

derivados de coelenterazina e métodos de utilizar os mesmos. a invenção provê derivados de coelenterazina que são substratos para uma enzima não luminescente e um pro-substrato para uma enzima luminescente. a invenção também provê um método de utilizar os derivados.

Description

“DERIVADOS DE COELENTERAZINA E MÉTODOS DE UTILIZAR OS MESMOS”
Referência remissiva a pedidos relacionados [001]Este pedido reivindica a prioridade do US número de série 61/409.413, depositado em 2 de novembro de 2010, que é incorporado aqui a título de referência.
Campo da invenção [002]A presente invenção provê compostos e métodos para ensaiar a presença e atividade de enzimas.
Antecedentes [003]A presença e atividade de enzimas podem ser utilizadas para determinar a saúde ou estado metabólico de uma célula. Enzimas também podem ser marcadores para um tipo específico de célula uma vez que a ocorrência e atividade de certas enzimas é frequentemente característica de uma célula específica. Por exemplo, a atividade de certas enzimas pode ser frequentemente utilizada para distinguir células de origem bacteriana, de planta ou de animal ou distinguir a identidade de tecido do qual a enzima origina.
[004]Glicosidases, também conhecidas como hidrolases de glicosídeo, catalisam a hidrólise da ligação glicosídica para gerar dois açúcares menores. São enzimas extremamente comuns com papeis na natureza incluindo degradação de biomassa como celulose e hemicelulose, em estratégias de defesa antibacteriana (por exemplo, lisozima), em mecanismos de patogênese (por exemplo, neuraminidases virais) e em função celular normal (por exemplo, desbaste de manosidases envolvidas em biossíntese de glicoproteína ligada-N). Em bactérias e procariotas, glicosidases são encontrados tanto como enzimas intracelulares como extracelulares que são amplamente envolvidas em aquisição de nutrientes. Uma das ocorrências importantes de glicosidases em bactérias é a enzima beta-galactosidase (LacZ), que é envol
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2/36 vida na regulação de expressão do operon lac em E. coli. Em organismos superiores, glicosidases são encontrados no retículo endoplásmico e aparelho Golgi onde são envolvidos no processamento de glicoproteínas ligadas-N, e na lisozoma como enzimas envolvidas na degradação de estruturas de carboidrato. A deficiência em glicosidases de lisozoma específica pode levar a uma gama de distúrbios de armazenagem lisozomal que resultam em problemas de desenvolvimento ou morte. Glicosidases são envolvidas na biossíntese e degradação de glicogênio no corpo. Juntamente com glicosil transferases, glicosidases formam a maquinaria catalítica principal para a síntese e ruptura de ligações glicosídicas.
[005]Diaforases são uma classe ubíqua de enzimas ligadas por flavina que catalisam a redução de vários compostos que atuam como aceptores de hidrogênio, a partir da forma reduzida de nucleotídeos de di- e tri-fosfopiridina, isto é, NADH, NADPH. Metabolismo de energia celular é um processo complexo que permite que células armazenagem energia através de uma série de reações enzimáticas e químicas. Um aspecto essencial de metabolismo de energia celular é o estado de redução-oxidação da célula. O status metabólico de células vivas bem como o ensaio de atividade de enzima e/ou nível de metabólito podem ser determinados por medir o cofator de definição de redox NAD(P)/NAD(P)H.
Sumário [006]Em um aspecto a presente invenção provê um composto da fórmula (I):
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3/36
em que R2 é -(CH2)n-T ou alquila C1-5;
R2' é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA;
R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2 -OC(O)R ou rw Λ
J
OCH2OC(O)R;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
H
R4, H ou cicloalquila inferior;
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC; cada RB é independentemente -H ou -RA;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L é um ligante; n é de 0 a 3;
cada R é independentemente uma alquila C1-7;
T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
V é -S- ou -O-; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado.
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4/36 [007]Em outro aspecto, a presente invenção provê um composto da fórmula (II):
R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2, -OC(O)R ou OCH2OC(O)R;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
H r4, H ou cicloalquila inferior;
R11 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA;
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
cada RB é independentemente -H ou -RA;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L' é uma ligação direta ou um ligante;
n é de 0 a 3;
cada R é independentemente uma alquila C1-7;
T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
V é -S- ou -O-; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado.
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5/36 [008]Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um composto da fórmula (III):
em que R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2 -OC(O)R rw Λ
J ou -OCH2OC(O)R;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
H
R4, H ou cicloalquila inferior;
R12 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA;
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
cada RB é independentemente -H ou -RA;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L' é uma ligação direta ou um ligante;
V é -S- ou -O-;
cada X é independentemente-S-, -O- ou -NH-;
cada R é independentemente alquila C1-7; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado.
[009]Em outro aspecto a presente invenção provê um composto da fórmula (IV):
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6/36
(IV) em que R2 é -(CH2)n-T ou alquila C1-5;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
Jc
J
H ou cicloalquila inferior;
R16 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA.
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
cada RB é independentemente -H ou -RA;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L' é uma ligação direta ou um ligante; n é de 0 a 3;
T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
V é -S- ou -O-;
cada X é independentemente -S-, -O- ou -NH-;
cada R é independentemente C1-7 alquila; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado.
[0010]A presente invenção também provê métodos de utilizar os compostos acima.
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Breve descrição dos desenhos [0011]A figura 1 mostra os resultados de teste biológico de z-DEVDcoelenterazina-h.
[0012]A figura 2 mostra os resultados de um ensaio de caspase 3 utilizando um luciferase derivado de Oploforus e z-DEVD-coelenterazina-h.
[0013]A figura 3 mostra ligantes apropriados.
[0014]A figura 4 mostra coelenterazinas que podem ser derivatizadas.
[0015]A figura 5 mostra exemplos de sacarídeos pro-coelenterazina úteis em ensaios de glicosidase.
[0016]A figura 6 mostra vários substratos de peptidila para enzimas.
[0017]A figura 7 mostra pro-coelenterazinas apropriadas para uso em ensaios de protease.
[0018]A figura 8 mostra uma correlação linear entre número de célula e luminescência indicando uma relação direta entre luminescência medida com compostos 40 e 50 e número de célula.
[0019]A figura 9 mostra detecção de HADH utilizando pro-coelenterazinas de acordo com a presente invenção.
[0020]A figura 10 mostra outros substratos de pro-coelenterazina apropriados de acordo com a presente invenção.
[0021]Descrição detalhada [0022]A presente invenção provê compostos e métodos para ensaiar a presença e atividade de várias enzimas em uma amostra.
[0023]A menos que expressamente especificado de outro modo, o termo “compreendendo” é utilizado no contexto do presente pedido para indicar que elementos adicionais podem estar opcionalmente presentes além dos elementos da lista introduzida por “compreendendo”. Entretanto, considera-se como uma modalidade específica da presente invenção que o termo “compreendendo” abrange a possibilidade
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8/36 de nenhum elemento adicional está presente, isto é, para fins dessa modalidade “compreendendo” deve ser entendido como tendo o significado de “consistindo em”.
[0024]Como utilizado aqui, os termos e expressões a seguir têm os significados indicados. Será reconhecido que os compostos da presente invenção contêm átomos de carbono assimetricamente substituídos e podem ser isolados em formas racêmicas ou opticamente ativas. É bem sabido na técnica como preparar formas opticamente ativas, como por resolução de formas racêmicas ou por síntese de materiais de partida opticamente ativos. Todas as formas quirais, diastereoméricas, racêmicas e todas as formas isoméricas geométricas de uma estrutura fazem parte dessa invenção.
[0025]Valores específicos listados abaixo para radicais, substituintes, e faixas são somente para ilustração. Não excluem outros valores definidos ou outros valores compreendidos nas faixas para os radicais e substituintes.
Definições [0026]O termo “alquila” se refere a uma fração monovalente obtida por remover um átomo de hidrogênio de um composto de hidrocarboneto. Um grupo de alquila pode conter de 1-30 átomos de carbono, ou 1-12 átomos de carbono ou 1-10 átomos de carbono ou 1-6 átomos de carbono ou 1-4 átomos de carbono. O grupo de alquila pode ser uma cadeia reta ou ramificada e pode ser saturado, parcialmente insaturado ou totalmente insaturado. Um grupo de alquila pode ser opcionalmente substituído com, por exemplo, halo. Os exemplos de grupos de alquila de cadeia reta incluem, porém não são limitados a, etila, n-propila, n-butila, e n-propila, n-hexila e nheptila. Os exemplos de grupos de alquila insaturada de cadeia reta que têm uma ou mais ligações duplas de carbono-carbono incluem, porém não são limitados a, etenila (vinila, -CH=CH2), 2-propenila (alila, -CH-CH=CH2) e butenila. Os exemplos de alquila insaturada que tem uma ou mais ligações triplas de carbono carbono incluem, porém não são limitadas a, etinila e 2-propinila (propargila). Os exemplos de grupos
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9/36 de alquila ramificada incluem isopropila, iso-butila, sec-butila, t-butila e iso-pentila.
[0027]O termo “aminoácido” se refere a aminoácidos tanto naturais como não naturais. Ele também inclui aminoácidos naturais e não naturais protegidos.
[0028]O termo “arila” se refere a uma fração monovalente obtida por remover um átomo ode hidrogênio a partir de um anel aromático. Um grupo de arila pode ter de 6-10 átomos de carbono (arila C6-10). Por exemplo, o grupo de arila pode ser fenila ou naftila.
[0029]O termo “halo” se refere a um halogênio, como Cl, F, Br ou I.
[0030]O termo “heteroarila” se refere a uma fração monovalente obtida por remover um átomo de hidrogênio a partir de um anel heteroaromático. Um anel heteroaromático pode ter de 5-10 átomos de anel (heteroarila C5-10 (o uso de “C” é entendido como significando o número total de átomos de anel independente de se o átomo é C, N, O ou S).) os átomos de anel podem ser carbono, nitrogênio, enxofre ou oxigênio. Mais de um heteroátomo pode estar presente no anel. Por exemplo, o grupo de heteroarila pode ser furila, tienila, tiazolila, pirazolila, triazolila ou tetrazolila.
[0031]O termo “ligante” se refere a uma cadeia de 2 a 50 átomos que ligam uma fração de substrato ao núcleo de coelenterazina. Ligantes podem incluir um ou mais heteroátomos. Ligantes podem ser substituídos também por grupos oxo, grupos amino, grupos alquila, halogênios e grupos nitro. Ligantes podem também conter grupos de arila. Ligantes apropriados incluem aqueles mostrados na figura 3, como ligante p-aminobenzila. Os ligantes são apropriadamente ligantes “sem traço” ou “auto-imolativos”. O termo “ligante sem traço” ou “ligante auto-imolativo” se refere a um ligante em que clivagem da fração de substrato a partir do ligante resulta em clivagem espontânea do ligante a partir do núcleo coelenterazina para liberar coelenterazina. “Ligantes auto-imolativos” exemplares incluem aqueles mostrados na figura 3.
[0032]O termo “cicloalquila inferior” se refere a uma fração monovalente obtida por remover um átomo de hidrogênio a partir de um composto de hidrocarboneto
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10/36 tendo 3 a 6 átomos de carbono. os exemplos de grupos de cicloalquila inferior saturados incluem, porém não são limitados a, grupos como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e cicloexila. Os exemplos de grupos de cicloalquila inferior insaturados que têm uma ou mais ligações duplas de carbono-carbono incluem, porém não são limitadas a, grupos como ciclopropenila, ciclobutenila, ciclopentenila e cicloexenila.
[0033]O termo “enzima luminescente” a menos que especificado de outro modo, se refere a uma enzima luminescente de ocorrência natural, recombinante ou mutante que utiliza uma coelenterazina como substrato. A enzima luminescente, se de ocorrência natural, pode ser obtida facilmente pela pessoa especializada a partir de um organismo. Se a enzima luminescente for uma que ocorra naturalmente ou é uma enzima luminescente mutante ou recombinante, isto é, uma que retém atividade em uma reação de luciferase-coelenterazina de uma enzima luminescente de ocorrência natural, pode ser obtida prontamente de uma cultura de bactérias, levedura, células de mamífero, células de insetos, células de plantas, ou similares, transformadas para expressar um ácido nucléico que codifica a enzima luminescente. Além disso, a enzima luminescente recombinante ou mutante pode ser derivada de um sistema livre de células in vitro utilizando um ácido nucléico que codifica luciferase. Enzimas luminescentes apropriadas incluem luciferase derivada de decápodes bioluminescentes, como de Oplophoroidea, por exemplo, luciferases derivadas de Oplophorus, organismos marinhos como enidarians (por exemplo, luciferase Renilla), famílias de decápode de Aristeidae, Solenoceridae, Luciferidae, Sergestidae, Pasipheidae e Thalassocarididae e fotoproteínas, como Aequorin.
[0034]Uma “mistura de reação luminescente” contém materiais que permitirão que a enzima luminescente gere um sinal de luz, isto é, luminescência. A mistura também pode conter a enzima. Os materiais necessários, e as concentrações e/ou quantidades específicas, dos materiais necessários para gerar um sinal luminescente variarão dependendo da enzima luminescente utilizada bem como do tipo de en
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11/36 saio sendo realizado. Frequentemente outros materiais serão adicionados à solução incluindo: um tampão para manter a reação no pH adequado, um aditivo como PRIONEX ou albumina de soro bovino (BSA) para ajudar a manter a atividade de enzima, agentes redutores, detergentes, etc.
[0035]O termo “peptídeo” se refere a uma sequência de pelo menos dois aminoácidos. Em algumas modalidades, um peptídeo pode conter não mais do que 80 aminoácidos, ou não mais do que 35 aminoácidos ou não mais do que 10 aminoácidos.
[0036]O termo “sacarídeo” se refere a um açúcar ou outro carboidrato, especialmente um açúcar simples. Inclui tanto alfa como beta-anômeros. O sacarídeo pode ser um composto de poliidroxi C6, tipicamente um pentahidroxi C6, e frequentemente um glical cíclico. Inclui os açucares simples conhecidos e seus derivados, bem como polissacarídeos, com dois ou mais resíduos de monossacarídeo. O sacarídeo pode incluir grupos de proteção nos grupos de hidroxila. Os grupos de hidroxila do sacarídeo podem ser substituídos com um ou mais grupos de acetamido, halo ou amino. Adicionalmente, um ou mais dos átomos de carbono podem ser oxidados, por exemplo, em grupos ceto ou carbonila. Sacarídeos apropriados incluem galactose, glicose, ácido glucorônico e ácido neuromínico.
[0037]O termo “substituído” pretende indicar que um ou mais (por exemplo, 1,2, 3, 4, ou 5; em algumas modalidades 1, 2 ou 3; e em outras modalidades 1 ou 2) hidrogênios no grupo indicado na expressão utilizando “substituído” é substituído com uma seleção do(s) grupo(s) indicado(s) ou com um grupo apropriado conhecido por aqueles versados na técnica, com a condição de que a valência normal do átomo indicado não é excedida, e que a substituição resulta em um composto estável. Substituintes apropriados incluem halo, hidroxila, fenila, -NH2, -NHMe, -NMe2, -SH, CH(OMe)2, -CF3, -OCH3, -SCH3, alquila C1-4, piperazinila e piperazinila substituída por arila.
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Compostos [0038]Coelenterazinas são conhecidas por luminescência quando atuadas por uma ampla variedade de proteínas bioluminescentes, como luciferases marinhas. Os exemplos de luciferases marinhas incluem luciferase Renilla, Aequorin, luciferase Gaussia, luciferase Oplophorus e luciferase Cypridina.
[0039]A invenção provê derivados de coelenterazina que são tanto substratos para uma enzima não luminescente como pro-substratos para uma proteína luminescente. Após ser atuado pela enzima não luminescente de interesse, o derivado se torna um substrato para uma proteína luminescente, e desse modo é detectável por meio conhecido por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica.
[0040]Em algumas modalidades os derivados são compostos das fórmulas I-IV mostradas abaixo:
R2' é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA;
R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2 -OC(O)R ou OCH2OC(O)R;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
H r4, H ou cicloalquila inferior;
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
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13/36
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-Rc ou -CH2-V-RC;
cada RB é independentemente -H ou -Ra;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L é um ligante;
n é de 0 a 3;
cada R é independentemente uma alquila C1-7;
T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
V é -S- ou -O-; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado.
(2)
R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2, -OC(O)R ou OCH2OC(O)R;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
H ou cicloalquila inferior;
R11 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-Ra, -OC(O)O-Ra, -N(Rb)2, ou -NHC(O)ORa;
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-Rc ou -CH2-V-Rc;
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14/36 cada RB é independentemente -H ou -RA;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L' é uma ligação direta ou um ligante;
n é de 0 a 3;
cada R é independentemente uma alquila C1-7;
T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
V é -S- ou -O-; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado.
ou -OCH2OC(O)R;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
H , r4, H ou cicloalquila inferior;
R12 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA;
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
cada RB é independentemente -H ou -RA;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L' é uma ligação direta ou um ligante;
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15/36
V é -S- ou -O-;
cada X é independentemente-S-, -O- ou -NH-;
cada R é independentemente alquila C1-7; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado; ou
em que R2 é -(CH2)n-T ou alquila C1-5;
R8 é selecionado do grupo que consiste em
H r4, H ou cicloalquila inferior;
R16 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA.
em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
cada RB é independentemente -H ou -RA;
RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
L' é uma ligação direta ou um ligante; n é de 0 a 3;
T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
V é -S- ou -O-;
cada X é independentemente -S-, -O- ou -NH-;
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16/36 cada R é independentemente C1-7 alquila; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional, que pode ser saturado ou insaturado.
[0041]Em algumas modalidades, R2 é
ou alquila C2-5;
cada X é independentemente -S-, -O- ou -NH-; Z é -CH- ou -N-; Y é -H ou -OH; W é -NH2, halo, -OH, -NHC(O)R, -CO2R; e R é alquila C1-7.
[0042]Em algumas modalidades, R2 é
e X é O ou S. Em outras modalidades, R2 é alquila C2-5 de cadeia reta. Em certas modalidades, R8 é
cicloalquila inferior ou H, em que R3 e R4 são ambos H ou alquila C1-2. Em outras modalida des, R8 é benzila.
[0043]Em algumas modalidades, V é S.
[0044]Adequadamente, os compostos da presente invenção são derivados de coelenterazinas de ocorrência natural (“nativas”) bem como análogos das mesmas, incluindo coelenterazina-n, coelenterazina-f, coelenterazina-h, coelenterazina-hcp, coelenterazina-cp, coelenterazina-c, coelenterazina-e, coelenterazina-fcp, bisdesoxicoelenterazina (“coelenterazina-hh”), coelenterazina-i, coelenterazina-icp, e 2metil coelenterazina, além daqueles revelados em WO 2003/040100 e pedido US número de série 12/056.073 (parágrafo [0086]), cujas revelações são incorporadas a título de referência aqui. Coelenterazinas apropriadas adicionais que podem ser derivadas de acordo com a presente invenção incluem aquelas na figura 4.
[0045]Em algumas modalidades, derivados de coelenterazina da presente invenção são substratos para glicosidases. Derivados apropriados incluem aqueles mostrados na figura 5.
[0046]Em algumas modalidades, derivados de coelenterazina da presente invenção são substratos para proteases como caspase 2, caspases 3/7, caspase 6, caspase
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8, caspase 9, dipeptidil peptidase 4 (DPPIV), calpain, proteasoma semelhante à quimotripsina, proteasoma semelhante à tripsina, proteasoma semelhante à caspase, granzima B, catepsinas B/L/K, trombina, tripsina, aminopeptidase, e SARS protease. Peptídeos e aminoácidos apropriados e as enzimas para as quais são substratos, incluem aqueles listados na figura 6. Derivados apropriados adicionais incluem aqueles listados na figura 7.
[0047]Em algumas modalidades derivados de coelenterazina da presente invenção são substratos para enzimas de citocromo P450.
[0048]Em algumas modalidades, derivados de coelenterazina da presente invenção são substratos para enzimas de diaforase.
Métodos de uso [0049]Os derivados de coelenterazina da presente invenção podem ser utilizados em reagentes de ensaio para detectar a presença ou atividade de enzimas não luminescentes como enzimas citocromo P450, proteases ou glicosidases. Ensaios utilizando enzimas luminescentes e seus substratos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma enzima luminescente, uma mistura de reação luminescente e um derivado de coelenterazina que é um substrato da enzima não luminescente podem ser adicionados a uma amostra suspeita de conter a enzima não luminescente. Se a enzima não luminescente estiver presente na amostra, a enzima não luminescente atuará sobre o derivado de coelenterazina permitindo que o mesmo seja reconhecido pela enzima luminescente para produzir um sinal luminescente. Alternativamente, a enzima não luminescente pode converter um derivado de coelenterazina luminogênico em uma forma não luminescente, isto é, em um ensaio de perda de sinal.
[0050]Em algumas modalidades, o ensaio pode utilizar a quimiluminescência de coelenterazinas. Por exemplo, um derivado de coelenterazina que é um substrato da enzima não luminescente pode ser adicionado a uma amostra com suspeita de conter a enzima não luminescente. Se a enzima não luminescente estiver presente na amostra,
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18/36 a enzima não luminescente atuará sobre o derivado de coelenterazina permitindo que se torne quimiluminescente e detectável por técnicas bem conhecidas.
[0051]O derivado de coelenterazina pode ser adicionado à amostra antes de ou ao mesmo tempo em que a enzima luminescente. Em certas modalidades, a amostra pode ser uma célula. Células podem ser células eucarióticas, por exemplo, levedura, células de aves, plantas, insetos ou de mamíferos, incluindo porém não limitado a células de seres humanos, símios, murinos, caninos, bovinos, equinos felinos, ovinos, caprinos ou suínos ou células procarióticas, ou células de dois ou mais organismos diferentes, ou lisados de células ou sobrenadantes dos mesmos. As células podem ter sido geneticamente modificadas através de técnicas recombinantes. Em certos aspectos, a célula pode estar em um animal, por exemplo, animais transgênicos, ou fluido fisiológico, por exemplo, sangue, plasma, urina, secreções de mucosa ou similar.
[0052]A amostra pode conter mais de uma enzima não luminescente a ser detectada. nesse caso, mais de uma enzima luminescente pode ser utilizada. Além disso, mais de um substrato pode ser utilizado. Múltiplos substratos e/ou enzimas luminescentes podem ser utilizados para detectar múltiplas enzimas não luminescentes ou outra(s) molécula(s) de interesse, por exemplo, compostos de teste, ao mesmo tempo, por exemplo, em uma reação multiplex.
[0053]Os derivados de coelenterazina são também úteis em métodos no local de analisar células. Métodos de realizar análise células no local utilizando uma luciferase são conhecidos na arte, vide, por exemplo, a patente US 5.998.204. Os derivados de coelenterazina não são substratos das enzimas luminescentes antes da exposição a uma enzima não luminescente. Entretanto, após exposição à enzima não luminescente, os derivados são convertidos em compostos que podem ser prontamente detectados em uma reação de emissão de luz na presença de uma enzima luminescente. Desse modo, pode ser determinado onde a enzima não luminescente está localizada em uma célula por imageamento no local. Isso pode ser feito por contatar uma célula que ex
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19/36 pressa uma enzima luminescente com um derivado de coelenterazina.
[0054]Alternativamente, um animal transgênico que expressa um gene para uma enzima luminescente pode ser administrado um derivado de coelenterazina que é um substrato para uma enzima não luminescente específica de interesse. Tecnologia de imageamento (por exemplo, imageamento biofotônico in vivo) pode ser então utilizada para medir luminescência no local de expressão de enzima luminescente no animal intacto, vivo. Desse modo, um animal transgênico que expressa uma enzima luminescente pode ser administrado um derivado de coelenterazina que será convertido em um substrato para a enzima luminescente em tecidos onde a enzima não luminescente apropriada de interesse é expressa. Se a enzima luminescente for também expressa nesse tecido, um sinal luminescente será produzido e pode ser detectado por qualquer meio apropriado. Desse modo, compostos de teste, por exemplo, drogas, podem ser testados em um ensaio baseado em animal. O composto de teste deve ser administrado ao animal antes do derivado de coelenterazina. Alternativamente, o tecido de animais transgênicos pode ser utilizado em ensaio baseado em tecido.
[0055]Em algumas modalidades, um animal não transgênico pode ser administrado um derivado de coelenterazina que é um substrato para uma enzima não luminescente específica de interesse. O derivado será convertido em um substrato para uma enzima luminescente em tecidos onde a enzima não luminescente apropriada é expressa. Uma amostra biológica, por exemplo, sangue, soro, bile, urina, fezes ou tecido, pode ser obtida de animal e contatada com uma enzima luminescente. O sinal resultante pode ser detectável por qualquer médio apropriado. Desse modo, compostos de teste, por exemplo, drogas podem ser testados em um ensaio baseado em animal. O composto de teste deve ser administrado ao animal antes do derivado de coelenterazina.
[0056]Em algumas modalidades, os compostos de teste como drogas candidatas podem ser classificados e avaliados em relação a suas atividades, como, por exemplo, (1) substratos de uma enzima não luciferase, (2) reguladores, por exemplo, inibidores,
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20/36 indutores ou ativadores, de uma enzima não luciferase, ou (3) modificadores de uma condição celular (por exemplo, viabilidade, aumento de espécie de oxigênio reativo, ou aumento de potencial redutor). Os derivados de coelenterazina podem ser também utilizados para distinguir entre substratos e inibidores de uma enzima não luciferase. A classificação pode ser realizada in vitro ou in vivo.
[0057]Além disso, para quaisquer dos ensaios bioluminogênicos descritos aqui, outros reagentes podem ser adicionados a misturas de reação, incluindo, porém, não limitado aqueles que inibem ou evitam inativação de luciferase, ou de outro modo estendem ou aumentam sinal luminescente.
Kits [0058]A invenção também provê kits para determinar a presença ou atividade de uma ou mais enzimas não luciferase. O kit pode incluir um ou mais dos seguintes: derivado^) de coelenterazina, enzima(s) não luciferase, enzima(s) luminescente(s) dependente^) de coelenterazina, e tampão(tampões) de reação. Os tampões de reação podem estar presentes em formulações individuais para as reações de enzima não luciferase e as reações de enzima luminescente ou em uma formulação única para um ensaio de etapa única. Os kits da presente invenção também podem conter inibidores, ativadores e/ou intensificadores para a(s) enzima(s) não luciferase. Os kits da presente invenção também podem conter um controle positivo e/ou negativo para o ensaio.
[0059]A invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos não limitadores.
Exemplos
Exemplo 1: síntese de z-DEVD-coelenterazina-h (composto 21)
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Η··Ν>^
THF, 10° ata
R-Frrm; 14
SOda, ELjN
Γ-, 1 3ΗΓΚ!. rt
Benzeno, ta
[00Q0]Terc-butila-3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil) amino)-4-((4-(hidroxi metil) fenil) amíno)-4-oxobutanoato (13): um frasco foi carregado com Fmoc-Asp(OtBu)-OH (6,7 g, 16,28 mmol) e 100 ml de THF seco. A essa solução, em temperatura ambiente, N-metil morfolina puro (1,9 mL, 17,28 mmol) foi adicionado, e a solução foi resfriada até -20°C. o isobutil cloroformato puro (2,2 mL, 16,96 mmol) foi adicionado via seringa e a suspensão resultante foi agitada por 10 minutos, o amino álcool (2,0 g, 16,24 mmol) foi adicionado em uma porção, e a mistura de reação foi agitada por 10 minutos antes do banho frio ser removido e a agitação continuou por 2 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com 300 mL de acetato de etila, e a mistura foi lavada sequencialmente com duas porções de 50 mL de água, 50 mL de 0,5 M HCI e duas porções de 50 mL de solução de salmoura. A fase orgânica foi seca (MgSCU) e concentrada a vácuo. O resíduo foi submetido à cromatografia sobre sílica utilizando um gradiente de heptano/acetato de etila. Isso forneceu 5,2 g (10,7 mmol) do produto como um sólido branco. 1H NMR (300 MHz, dmso) d 10,02 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7,5, 2H), 7,81 - 7,67 (m, 3H), 7,55 (d, J = 8,4, 2H), 7,47 - 7,27 (m, 4H), 7,24 (d, J = 8,4, 2H), 5,09 (t, J = 5,7, 1H), 4,51 (m, 1H), 4,43 (d, J
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22/36 = 5,7, 2H), 4,37 - 4,16 (m, 3H), 2,76 - 2,51 (m, 2H), 1,37 (s, 9H).
[0061]terc-Butil 3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((4(clorometil)fenil)amino)-4-oxobutanoato (14): um frasco foi carregado com álcool (13) (0,5 g, 0,97 mmol) e 15 mL de benzeno seco. A essa suspensão, em temperatura ambiente, trietil amina puro foi adicionado e após agitação por 2 minutos, a mistura foi resfriada em um banho de água/gelo por 10 minutos. a esse, cloreto de tionila puro (78 pL, 1,07 mmol) foi adicionado, e após 2 minutos, o banho frio foi removido e a agitação continuou em temperatura ambiente por 3 horas. A mistura de reação foi filtrada através de um pad de celite, e a massa de filtro foi enxaguada com 30 mL de benzeno seco. O filtrado foi concentrado a vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna sobre sílica utilizando cloreto de metileno. Isso forneceu 457 mg (0,85 mmol) do produto como um sólido branco aderente. 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 10,16 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7,5, 2H), 7,79 (d, J = 8,1, 1H), 7,76 - 7,68 (m, 2H), 7,61 (d, J = 8,5, 2H), 7,44 - 7,27 (m, 6H), 4,72 (s, 2H), 4,58 - 4,44 (m, 1H), 4,33 - 4,18 (m, 3H), 2,63 (ddd, J = 6,0, 14,6, 21,8, 2H), 1,37 (s, 9H).
[0062]Compostos 17 e 18: um frasco seco foi carregado com coelenterazina-h (7) (200 mg, 0,37 mmol) e 15 mL de DMF desoxigenado, anidro sob uma atmosfera de argônio. A essa solução, em temperatura ambiente, iodeto de potássio (31 mg, 0,19 mmol) e carbonato de potássio (51 mg, 0,37 mmol) foram adicionados, e a mistura foi agitada por aproximadamente 2 minutos. a essa, o composto 14 foi adicionado, e a mistura foi agitada por 18 horas. Os produtos foram purificados por cromatografia de fase tanto inversa como normal.
[0063]Compostos 19 e 20: a uma solução de composto 17 ou 18 (365 mg, 0,4 mmol) em 3 mL de diclorometano em temperatura ambiente, uma solução de piperidina (2 mL) em 7 mL de diclorometano foi adicionada. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos, diluída com 50 mL de tolueno e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase inversa utilizando um gradiente de 0,1% TFA/água para acetonitrila. A mistura de regioisômeros (133 mg, 0,19 mmol) foi dis
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23/36 solvida em 2 mL de DMF seco, e HOBt (30 mg, 0,22 mmol) e Z-DEVD-CO2H (140 mg, 0,23 mmol) foi adicionada. A essa solução, em temperatura ambiente, EDC (42 mg, 0,22 mmol) foi adicionado, e a mistura de reação foi agitada durante a noite. A mistura de reação bruta foi diluída com 1 mL de acetonitrila e purificada por cromatografia de coluna de fase inversa utilizando um gradiente de 20 mM de acetato de amônio para acetonitrila. Isso forneceu 54 mg de composto 19 e 69 mg de composto 20.
[0064] Composto 21: uma mistura bruta dos compostos 19 e 20 foi dissolvida em 2 mL de diclorometano, e a essa solução em temperatura ambiente, um coquetel de desproteção compreendido de 4 mL de ácido trifluoroacético, 2 mL de diclorometano, 0,4 mL de triisopropil silano e 0,4 mL de tioanisol foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 3 horas e diluída com 30 mL de éter dietílico. A suspensão foi centrifugada, e o sólido foi triturado duas vezes com porções de 10 mL de éter dietílico. O resíduo foi dissolvido em 2 mL de metanol e purificado por cromatografia de fase inversa utilizando um gradiente de 20 mM de acetato de amônio para acetonitrila. Isso forneceu 9 mg do composto 21 como um sólido laranja.
Exemplo 2: teste biológico de z-DEVD-coelenterazina-h (composto 21) [0065]O composto 21 (50 μΜ) foi combinado com luciferase Renilla (6,5 pg/ml, fusão de Renilla-GST) em 50 mM tampão HEPES pH 7,2, 2 mM DTT, e 0,5% de CHAPS e incubado por 20 minutos para remover quaisquer derivados de coelenterazina livre que podem ser substratos para luciferase de Renilla. Controle de tampão ou enzima caspase-3 purificada (50 U/ml) foi adicionado em uma razão de volume de 1:1 para concentrações finais de 25 μΜ substrato de derivado de Z-DEVDcoelenterazina h, 25U/ml de caspase-3 e 3,25 pg/ml de luciferase. Luminescência foi medida durante 110 minutos. Com o passar do tempo, um aumento de cem vezes em luminescência foi visto em relação a amostras de controle que não continham caspase, indicando liberação enzimática de coelenterazina e validando que os com
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24/36 postos de coelenterazina da presente invenção podem ser utilizadas para detectar enzimas de caspase (figura 1).
Exemplo 3: síntese alternativa de z-DEVD-coelenterazina-h (composto 21)
X oX
HN'
Fmoc iBuCIF, NMM.
hidroximetilanilina y°H o
(a)
Fmoc
[0066](R)-terc-butil 3-amino-4-(4-(hidroximetil)fenilamino)-4-oxobutanoato (c).
Em um frasco de fundo redondo de 250 mL, b (6 g, 0,011 mol) foi dissolvido em dimetil formamida (60 mL). Piperidina (10 mL) foi adicionada. Após 4 horas, TLC mos
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25/36 trou conclusão da reação. O solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por carga em Celite (15 g em 250 mL de EtOAc) e eluindo sobre sílica (80 mg) com DCM inclinando para MeOH (10% em DCM). Frações combinadas foram evaporadas. Rendimento: (76%); Rf = 0,2 (50/50 Hept/EtOAc), 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 7,56 (d, J = 8,3, 2H), 7,22 (d, J = 8,3, 2H), 5,06 (t, J = 5,4, 1H), 4,41 (d, J = 4,6, 2H), 3,61 (t, J = 6,5, 1H), 2,59 (dd, J = 5,8, 15,5, 1H), 2,41 (dd, J = 7,2, 15,6, 1H), 1,35 (s, 9H); m/z.
[0067](5S, 8S, 11R, 14R)-terc-butil 5-(2-terc-butoxi-2-oxoetila)-8-(3-terc-butoxi-3oxopropil)-14-(4-(hidroximetil)fenilcarbamoíla)-11 -isopropil-3,6,9,12-tetraoxo-1 -fenil2oxa-4,7,10,13-tetraazahexadecan-16-oato (d). A um frasco de fundo redondo de 100 mL, Z-D(tBu)E(tBu)V-OH (3,96 g, 6,5 mmol), c (1,6 g, 5,4 mmol), HOBt (0,915 g, 5,9 mmol), e DMF (25 mL) foram adicionados. À solução de agitação, EDAC (1,15 g, 5,9 mmol) foi adicionado. Após 18 horas, o solvente foi evaporado, e o resíduo redissolvido em EtOAc (200 mL). A solução foi lavada com ácido cítrico (30% - 50 mL), bicarbonatoSat (50 mL), água (2 x 50 mL) e salmoura (50 mL). O material foi adsorvido em Celite (15 g) e purificado sobre sílica inclinando de heptano para EtOAc. Rendimento (74%). 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 9,85 (s, 1H), 8,33 (d, J = 7,7, 1H), 7,95 (d, J = 8,1, 1H), 7,83 (d, J = 8,3, 1H), 7,59 (d, J = 8,3, 1H), 7,53 (d, J = 8,5, 2H),
7,43 - 7,26 (m, 5H), 7,21 (d, J = 8,6, 2H), 5,06 (t, J = 5,7, 1H(desaparece em agitação de D2O)), 5,02 (d, J = 4,7, 2H), 4,70 (q, J = 7,7, 1H), 4,41 (d, J = 5,6, 2H(colapsa até s em agitação de D2O)), 4,38 - 4,25 (m, 2H), 4,17 - 4,09 (m, 1H), 2,79 - 2,63 (m, 1H), 2,62 - 2,35 (m, 4H), 2,26 - 2,11 (m, 2H), 2,00 - 1,79 (m, 2H), 1,73 (d, J =
6,0, 1H), 1,34 (dd, J = 4,7, 7,4, 31H), 0,81 (t, J = 6,3, 6H), MS: Calcd para C45H65N5O13 883,5; encontrado 883,7.
[0068](5S, 8S, 11R, 14R)-terc-butil 5-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-8-(3-terc-butoxi-3oxopropil)-14-(4-(clorometil)fenilcarbamoíla)-11 -isopropil-3,6,9,12-tetraoxo-1 -fenil-2oxa-4,7,10,13-tetraazahexadecan-16-oato (e). a um frasco de RB de 100 mL, d
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26/36 (3,56 g, 4 mmol) com benzeno (50 mL) foi adicionado. A solução foi evaporada e armazenada durante a noite sob vácuo elevado. Benzeno seco (70 mL) foi adicionado ao sólido juntamente com TEA (610 uL, 4,4 mmol). A solução foi resfriada em um banho de gelo, e SOCl2 (320 pL, 4.4 mmol) foi adicionado lentamente. A solução foi deixada aquecer até a temperatura ambiente. Após 4 horas, TEA adicional (241 pL) e SOCl2 (100 pL) foi adicionado. Após um período adicional de 2 horas, a mistura de reação foi adsorvida sobre Celite (10 g) e eluída sobre sílica inclinando de DCM para 5% MeOH em DCM. Rendimento (33%). 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 10,00 (s, 1H), 8,35 (d, J = 7,8, 1H), 7,95 (d, J = 7,8, 1H), 7,84 (d, J = 8,3, 1H), 7,67 (d, J = 8,6, 3H), 7,41 - 7,22 (m, 7H), 5,11 - 4,91 (m, 2H), 4,77 - 4,59 (m, 3H), 4,43 - 4,21 (m, 2H), 4,19 - 4,04 (m, 1H), 3,30 (s, (água)), 2,79 - 2,32 (m, 4H+DMSO), 2,26 - 2,07 (m, 2H), 2,00 - 1,79 (m, 2H), 1,77 - 1,60 (m, 1H), 1,40 - 1,24 (m, 27H), 0,81 (t, J = 6,4, 6H).
[0069](5S, 8S, 11R, 14R)-terc-butil 5-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-8-(3-terc-butoxi-3oxopropil)-14-(4-((2,8-dibenzil-6-(4-hidroxifenil)imidazo[1,2-a]pirazin-3iloxi)metil)fenilcarbamoíla)-11-isopropil-3,6,9,12-tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,7,10,13tetraazahexadecan-16-oato (20). A um frasco desgaseificado com argônio contendo coelenterazina-h (50 mg, 122 pmol) e K2CO3 (34 mg, 245 pmol), uma solução desgaseificada de e (133 mg, 147 pmol) em DMF (500 pL) foi adicionada. Após 2 horas, a reação foi injetada diretamente em RP-HPLC e eluída com uma rampa de 0,1% TFA (aq) para acetonitrila. O pico maior foi isolado e evaporado. Rendimento (13%). UV: picos 250, 300, e 420nm. 1H NMR (300 MHz, dmso) δ 9,79 (s, 1H), 8,27 (d, J = 7,5, 1H), 7,92 (d, J = 8,0, 1H), 7,85 (d, J = 10,1, 1H), 7,58 (d, J = 8,3, 1H), 7,53 (d, J = 8,7, 2H), 7,45 - 7,14 (m, 15H), 7,09 - 6,80 (m, 6H), 6,72 (d, J = 8,8, 2H), 5,13 4,90 (m, 2H), 4,73 - 4,53 (m, 1H), 4,22 (dd, J = 5,0, 17,7, 3H), 4,16 - 4,01 (m, 3H(2H após agitação de D2O)), 3,25 - 3,01 (m, J = 10,0, 16,5, 4H), 2,76 - 2,53 (m, J = 15,6, 2H), 2,51 - 2,33 (m, 2H+DMSO), 2,24 - 2,04 (m, 2H), 1,99 - 1,77 (m, 2H), 1,76
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27/36
- 1,61 (m, 1H), 1,40 - 1,07 (m, 27H), 0,89 - 0,62 (m, 6H), MS: Calcd para C71H84N8O14 1272,6; encontrado 1272,8.
Exemplo 4: síntese de 30
[0070]Uma mistura de éster de acetil coelenterazina (0,50 g, 1,14 mmol), cloreto de carbonila de diamina-C2 trimetillock quinona (0,436 g, 1,14 mmol), DMAP (0,139 g, 1,14 mmol) e TEA (0,115 g, 1,14 mmol) em 20 ml de dicloreto de metileno foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. O composto foi purificado por cromatografia de sílica utilizando heptano/acetato de etila como um eluente para fornecer um rendimento de 20% (0,184 g). 1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8,47 (s, 1H), 8,04 (d, 2H), 7,55 (d, 2H), 7,0-7,5 (m, 9H), 4,57 (s, 2H, CH2), 4,16 (s, 2H, CH2), 3,2-3,7 (m, 4H, NCH2), 2,7-3,2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 2,30 (s, 3H, CH3), 1,0-2,2 (m, 15 H, CH3), MS (m/e): 796,5 (M+).
Exemplo 5. Síntese de 40
[0071]40 foi feito por empregar o método similar para preparar 30 (exemplo 4). O composto foi purificado por cromatografia de sílica utilizando heptano/acetato de etila como eluente para fornecer um rendimento de 60% (0,32 g). 1H NMR (300 MHz, CD2Cl2) δ 8,47 (s, 1H), 8,03 (m, 2H), 7,57 (d, 2H), 7,1-7,5 (m, 7H), 6,33 (s, 1H), 6,17
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28/36 (s, 1H), 4,58 (s, 2H, CH2), 4,19 (s, 2H, CH2), 3,3-3,7 (m, 4H, NCH2), 2,7-3,2 (m, 8H,
2NCH3 + CH2), 1,0-2,2 (m, 15 H, CH3), MS (m/e): 728,5 (M+). Pureza de HPLC: 90% a 262 nm.
Exemplo 6. Síntese de 50
[0072]50 foi feito por empregar o método similar para preparar PBI 4442 (exemplo 20). O composto foi purificado por cromatografia de sílica utilizando heptano/acetato de etila como um eluente para fornecer um rendimento de 17% (0,15 g). 1H NMR (300 MHz, CDzClz) δ 8,42 (s, 1H), 7,99 (m, 2H), 7,57 (d, 2H), 7,1-7,5 (m, 10H), 4,58 (s, 2H, CH2), 4,19 (s, 2H, CH2), 3,3-3,7 (m, 4H, NCH2), 2,7-3,2 (m, 8H, 2NCH3 + CH2), 1,0-2,2 (m, 15 H, CH3), MS (m/e): 738,5 (M+). Pureza de HPLC: 95% a 262 nm.
Exemplo 7. Medição de células metabolicamente ativas utilizando derivados de quinona [0073]Esse exemplo demonstra o uso de derivados de coelenterazina contendo quinina para medir a quantidade de células metabolicamente ativas. Células viáveis mantêm um estado metabolicamente ativo que é inevitavelmente perdido quando as células são danificadas. Após entrar nas células vivas, a coelenterazina de quinona é reduzida a um derivado de coelenterazina que é um substrato para luciferase utilizando coelenterazina, por exemplo, luciferase de Renilla ou Oplophorus. A conversão da coelenterazina de quinona é proporcional ao número de células metabolicamente ativas, e, portanto, pode ser medida quantitativamente por monitorar luz pro
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29/36 duzida por reação de luciferase.
[0074]Diluições seriais de duas vezes de células Jurkat foram preparadas em PBS, e 50 ul por cavidade transferida para cavidades em placas com 96 cavidades. Os compostos 40 e 50 foram diluídos em PBS para fazer estoques de 50 μΜ e 100 μΜ, respectivamente. 10 μl de estoques de composto preparado foram adicionados às células, e as células foram colocadas em um incubador a 37°C, de CO2 a 5%. Após 30 minutos de incubação, as células foram removidas do incubador, resfriadas em temperatura ambiente por 10 minutos, e 50 μl de reagente de detecção de luciferase Oplophorus adicionado diretamente às cavidades. As amostras foram misturadas, incubadas em temperatura ambiente por 20 minutos, e luminescência medida. A figura 8 mostra a correlação linear entre o número de células e luminescência indicando uma relação direta entre luminescência e número de célula.
Exemplo 8: ensaio de caspase 3 utilizando um luciferase de Oplophorus e composto 21 [0075]Uma variante de luciferase Oplophorus (OgLuc), 9B8 opt, foi utilizada em um ensaio bioluminescente utilizando um substrato pro-coelenterazina compreendendo a sequência de clivagem de DEVD caspase-3. A enzima de caspase-3 purificada foi misturada com uma amostra de lisado de E. coli expressando o variante 9B8 opt, que foi purificado utilizando a resina HALOLINK™ (Promega Corp.) de acordo com instruções do fabricante, e diluída 10 vezes em um tampão contendo 100 mM MES pH 6,0, 1 mM CDTA, 150 mM KCl, 35 mM tioureia, 2 mM DTT, 0,25% TERGITOL® NP-9 (v/v), 0,025% MAZU®, com ou sem 23,5 μM z-DEVDcoelenterazina-h em 100 mM HEPES pH 7.5. a enzima de caspase- 3 foi incubada com a amostra de lisado por 3 horas em temperatura ambiente, e luminescência detectada em um luminômetro Turner MODULUS™ em vários pontos de tempo. Uma amostra contendo somente lisado bacteriano e uma amostra contendo somente caspase-3 foram utilizadas como controles. Três réplicas foram utilizadas. A figura 2 e a
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30/36 tabela 1 demonstram que os substratos de pro-coelenterazina da presente invenção podem ser utilizados para detectar uma enzima de interesse.
Tabela 1
+/- caspase - +
tempo (min.) RLU RLU
5,0 26,023 25,411
15,3 7,707 36,906
29,9 4,013 41,854
60,9 2,305 43,370
190,3 1,155 42,448
[0076]Outra variante de luciferase Oplophorus, L27V02 (“L27V”), foi utilizada em um ensaio bioluminescente utilizando um substrato pro-coelenterazina compreendendo a sequência de clivagem DEVD-caspase-3. A enzima de caspase-3 purificada (1 mg/mL) em 100 mM MES pH 6 (50 pL) foi misturada com 227 nM da variante L27V02 e 47 μΜ PBI-3741 (z-DEVD-coelenterazina-h) em tampão de ensaio de 50 μL (100 mM MES pH 6, 35 mM Tiouréia, 0,5% TERGITOL® NP-9 (v/v), 1 mM CDTA, 2 mM DTT e 150 mM KCl). As reações foram incubadas por 3 h em temperatura ambiente, e luminescência detectada como anteriormente descrito. O ensaio com a variante L27V02 foi comparado com uma versão de luciferase de pirilampo do ensaio, Caspase 3/7 Glo (Caspase-Glo; Promega Corp.). A tabela 2 demonstra que os compostos da presente invenção podem ser utilizados em um ensaio bioluminescente para detectar uma enzima de interesse.
Tabela 2
(+)caspase +/- (-) caspase +/-
L27V 11.532 93 803 25
Caspase-Glo 15.156.567 793.981 302 5
Exemplo profético 9: síntese de O-(8-benzil-2-(furan-2-il metal)-6-fenil imidazo[1,2-aípirazin-3 (7H)-on-il) galactoside (25)
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31/36
i. acetobromo alfa-D-galactose, ilactose, AgOTf, TMU, DCM. 11. KOMe, THF
Síntese típica de beta açúcar pro-coelenterazina típico. (O-(8-benzil-2-(furan2-ilmetil)-6-fenil imidazo[1,2-a] pirazin-3(7H)-on-il) 3,4,5,6-tetra-acetoxi-betagalactosida) [0077]A um frasco de fundo redondo de 100 mL, a acetobromo-alfa açúcar apropriado (por exemplo, acetobromo alfa-D-galactose) (1.1EQ), coelenterazina apropriada (por exemplo, (8-benzil-2-(furan-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pçirazin3(7H)-ona) (1.0 EQ, 100 mg), e triflato de prata (67 mg, 1EQ) é adicionado e é desgaseificado com argônio por 30 minutos. 2 mL de diclorometano e 70 pL de tetrametil uréia é injetado e é agitado em temperatura ambiente por 3 horas. 4 mL de acetonitrila é adicionado, e os sólidos são filtrados. A amostra é purificada por injetar o sobrenadante em coluna C18 RP-HPLC de 250x41 mm preparativa e as frações apropriadas são coletadas por eluir com um gradiente de água para acetonitrila ou outro solvente apropriado. As frações podem ser evaporadas para fornecer o composto.
[0078]À amostra acima, 1 mL de metanol é adicionado e resfriado a 0°C em banho de gelo. Uma solução de metóxido de potássio (5.2 EQ) em metanol ou THF pode ser então adicionada. Após 30 min., exatamente 5,2 equivalentes de ácido acético são adicionados. 3 mL de acetonitrila podem ser então adicionados, e a amostra pode ser filtrada. A amostra pode ser purificada por injetar o sobrenadante em coluna C18 RP-HPLC de 250 x 41 mm preparativa, e as frações apropriadas poPetição 870190061480, de 01/07/2019, pág. 37/76
32/36 dem ser coletadas por eluir com um gradiente de água para acetonitrila ou outro solvente apropriado. As frações podem ser evaporadas para fornecer o composto (25).
Exemplo profético 10: síntese de vários substratos P450
[0079]A uma mistura de coelenterazina e 1,1 equivalentes de carbonato de potássio em DMF, sob uma atmosfera de argônio, poderia ser adicionado um equivalente de iodeto de metila em temperatura ambiente. O progresso da reação pode ser monitorado por cromatografia de camada fina. Após conclusão da reação, a mistura pode ser resfriada em um banho de gelo por vários minutos e um volume de água igual ao volume de reação pode ser adicionado. A mistura resultante pode ser extraída com um solvente orgânico adequado (por exemplo, acetato de etila) e os extratos podem ser concentrados para fornecer o composto bruto 1. O material pode ser adicionalmente purificado por cromatografia sobre sílica gel.
[0080]A uma mistura de coelenterazina e 1,1 equivalentes de carbonato de potássio e iodeto de potássio em DMF sob uma atmosfera de argônio, poderia ser adi
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33/36 cionado um equivalente de brometo de p-metoxi benzila em temperatura ambiente. O progresso da reação pode ser monitorado por cromatografia de camada fina e após conclusão da reação, a mistura pode ser resfriada em um banho de gelo por vários minutos antes da adição de um volume de água igual ao volume de reação. A mistura resultante pode ser extraída com um solvente orgânico adequado (por exemplo, acetato de etila) e os extratos podem ser concentrados para fornecer o composto bruto 2. O material pode ser adicionalmente purificado por cromatografia sobre sílica gel.
[0081]Uma mistura de 3-benzil-5-fenil pirazin-2-amina (6) (1 equiv.), (E)-3-(4((3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il)oxi) fenila)-2-ácido oxopropanoico (5) (1,5 equiv.) e ácido sulfônico de canfora (1,5 equiv.) em THF é aquecida em refluxo na presença de peneiras moleculares até término da condensação dos materiais de partida. A mistura de reação é diluída com acetato de etila até 3 vezes seu volume e lavada com solução de salmoura e água. Após secar sobre sulfato de sódio, o solvente é removido a vácuo e o resíduo contendo composto 7 é dissolvido em DMF seco. A solução resultante é tratada com anidrido acético (1,5 equiv.) e piridina (1,5 equiv.) em temperatura ambiente. O progresso da reação pode ser monitorado por TLC, e após término, a mistura de reação é resfriada em um banho de gelo por vários minu
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34/36 tos antes da adição de um volume de água igual ao volume de reação. A mistura resultante é extraída com um solvente orgânico apropriado (por exemplo, acetato de etila) e os extratos são concentrados para fornecer o composto 8. O material é dissolvido em metanol e após resfriar até aproximadamente 0°C, tratado com boroidreto de sódio (5-10 equiv.) em porções pequenas até término da formação do produto. Enquanto ainda fria, a mistura de reação pode ser tratada com acido acético em uma quantidade equivalente aos mols de hidreto anteriormente adicionados, e a mistura de reação pode ser concentrada a vácuo. O resíduo pode ser triturado com água várias vezes para fornecer o composto bruto 3. Esse material pode ser purificado utilizando cromatografia sobre sílica gel.
o
moleculares
AC2O
[0082]Uma mistura de 3-benzil-5-(4-(3,3-dimetoxi propoxi) fenil) pirazin-2-mina (10) (1 equiv.), 2-oxo-3-ácido fenil propanóico (9) (1,5 equiv.) e ácido sulfônico de cânfora (CSA) (1,5 equiv.) em THF é aquecida em refluxo na presença de peneiras moleculares até término da condensação dos materiais de partida. A mistura de reação é diluída com acetato de etila até 3 vezes seu volume e lavada com solução de salmoura e água. Após secar sobre sulfato de sódio, o solvente é removido a vácuo e o resíduo contendo composto 11 é dissolvido em DMF seco. A solução resultante é tratada com anidrido acético (1,5 equiv.) e piridina (1,5 equiv.) em temperatura
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35/36 ambiente. O progresso da reação pode ser monitorado por TLC, e após término, a mistura de reação é resfriada em um banho de gelo por vários minutos antes da adição de um volume de água igual ao volume de reação. A mistura resultante é extraída com um solvente orgânico apropriado (por exemplo, acetato de etila) e os extratos são concentrados para fornecer o composto 12. O material é dissolvido em metanol e após resfriar até aproximadamente 0°C, tratado com boroidreto de sódio (510 equiv.) em porções pequenas até término da formação do produto. Enquanto ainda fria, a mistura de reação é tratada com acido acético em uma quantidade equivalente aos mols de hidreto anteriormente adicionados, e a mistura de reação é concentrada a vácuo. O resíduo é triturado com água várias vezes para fornecer o composto bruto 4. Esse material pode ser purificado utilizando cromatografia sobre sílica gel.
Exemplo 11: medição de NADH [0083]Um substrato de pro-coelenterazina da presente invenção para detectar diaforase foi utilizado para medir a quantidade de NADH presente em uma amostra. Por combinar NADH, diaforase, o substrato de pro-coelenterazina, e esterases o NADH presente na amostra foi detectado. O substrato de pro-coelenterazina utilizado pela diaforase foi convertido em coelenterazina. A quantidade de coelenterazina gerada foi detectada por uma variante de luciferase de Oplophorus, e a luminescência gerada é proporcional à quantidade de NADH presente na amostra.
[0084]Para o ensaio, 10 pL NADH (triturado de 60 μΜ a 0 μΜ), 10 pL 12 U/mL de enzima de diaforase em PBS, 10 pL 165 U esterase em PBS e 10 pL 60 μΜ PBI4600 em PBS foram incubados em temperatura ambiente por 1 hora. Após incubação, reagente de detecção de luciferase Oplophorus (100mM MES pH 6, 1mM CDTA, 150mM KCl, 35mM Tiouréia, 1mM DTT, 0,5% Tergitol e 0,05% Mazu) contendo uma variante de Luciferase Oplophorus (L27V) em uma diluição de 109 foi adicionada. A luminescência foi medida em 5 minutos e 1 hora (FIG. 9). Os dados
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36/36 demonstram que os compostos da presente invenção podem ser utilizados para medir NADH em uma amostra por detectar uma enzima que utiliza NADH.
[0085]Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são incorporadas aqui a título de referência. Embora no relatório descritivo acima a presente invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades preferidas da mesma, e muitos detalhes foram expostos para fins de ilustração, será evidente para aqueles versados na técnica que a invenção é sucetível a modalidades adicionais e que certos dos detalhes descritos aqui podem ser variados consideravelmente sem se afastar dos princípios básicos da invenção.

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que é de fórmula (II):
    em que R2 é -(CH2)n-T ou alquila C1-5;
    R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2, -OC(O)R ou OCH2OC(O)R;
    R8 é selecionado do grupo que consiste em
    H r4, H ou cicloalquila inferior;
    R11 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2 ou -NHC(O)ORA;
    em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
    RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-Rc ou -CH2-V-RC;
    cada RB é independentemente -H ou -RA;
    RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
    L' é um ligante selecionado de:
    RZ
    O
    RY
    I N
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  2. 2/10 ^vw
    RY O cada RX é independentemente H, halogênio ou NO2;
    cada RY é independentemente H ou Me;
    cada RZ é independentemente NH, NMe, O ou S;
    n é de 0 a 3;
    cada R é independentemente uma alquila C1-7;
    T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
    V é -S- ou -O-; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional que pode ser saturado ou insaturado.
    2. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que é de fórmula (I):
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  3. 3/10
    R2' é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA;
    R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2 -OC(O)R ou OCH2OC(O)R;
    R8 é selecionado do grupo que consiste em
    H
    R4, H ou cicloalquila inferior;
    em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
    RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
    cada RB é independentemente -H ou -RA;
    RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
    rOÁ
    J
    L é um ligante selecionado de:
    cada RX é independentemente H, halogênio ou NO2;
    cada RY é independentemente H ou Me;
    cada RZ é independentemente NH, NMe, O ou S;
    n é de 0 a 3;
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  4. 4/10 cada R é independentemente uma alquila C1-7;
    T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
    V é -S- ou -O-; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional que pode ser saturado ou insaturado.
    3. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que é da fórmula (III):
    (III) em que R6 é selecionado do grupo que consiste em -H, -OH, -NH2 -OC(O)R ou -OCH2OC(O)R;
    R8 é selecionado do grupo que consiste em
    H r4, H ou cicloalquila inferior;
    R12 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA;
    em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
    RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
    cada RB é independentemente -H ou -RA;
    RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
    L' é um ligante selecionado de:
    O
    O
    Ar
    RY
    V O
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  5. 5/10 ^vw
    RY O cada RX é independentemente H, halogênio ou NO2;
    cada RY é independentemente H ou Me;
    cada RZ é independentemente NH, NMe, O ou S;
    V é -S- ou -O-;
    cada X é independentemente -S-, -O- ou -NH-;
    cada R é independentemente alquila C1-7; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional que pode ser saturado ou insaturado.
    4. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que é da fórmula (IV):
    (IV) em que R2 é -(CH2)n-T ou alquila C1-5;
    R8 é selecionado do grupo que consiste em
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  6. 6/10 rw Λ
    J
    H
    R4, H ou cicloalquila inferior;
    R16 é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, um aminoácido, um sacarídeo, -O-RA, -OC(O)O-RA, -N(RB)2, ou -NHC(O)ORA.
    em que R3 e R4 são ambos H ou ambos alquila C1-2;
    RA é alquila C1-4, alquila C1-4 substituída, -CH2-RC ou -CH2-V-RC;
    cada RB é independentemente -H ou -RA;
    RC é arila, heteroarila, arila substituída ou heteroarila substituída;
    L' é um ligante selecionado de:
    cada RX é independentemente H, halogênio ou NO2;
    cada RY é independentemente H ou Me;
    cada RZ é independentemente NH, NMe, O ou S;
    n é de 0 a 3;
    T é arila, heteroarila, arila substituída, heteroarila substituída ou cicloalquila;
    V é -S- ou -O-;
    cada X é independentemente -S-, -O- ou -NH-;
    Petição 870190061480, de 01/07/2019, pág. 48/76
  7. 7/10 cada R é independentemente C1-7 alquila; e as ligações tracejadas indicam a presença de um anel opcional que pode ser saturado ou insaturado.
    5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4,
    CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é
    J
    J w
    ou alquila C2-5 de cadeia linear;
    cada X é independentemente -S-, -O- ou -NH-;
    Z é -CH- ou -N-;
    Y é -H ou -OH;
    W é -NH2, halo, -OH, -NHC(O)R, -CO2R; e
    R é alquila C1-7.
    6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato
    7. Composto, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é alquila C2-5 de cadeia linear.
  8. 8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,
    R3
    JkH CARACTERIZADO pelo fato de que R8 é ' R4, cicloalquila inferior ou H, em que R3 e R4 são ambos H ou alquila C1-2.
  9. 9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que R8 é benzila.
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    8/10
  10. 10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que V é S.
  11. 11. Método para detectar a presença ou quantidade de uma enzima CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    contatar uma amostra suspeita de conter a enzima com um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10; e detectar luminescência da amostra.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a luminescência é quantificada.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é suspeita de conter uma segunda enzima, o método compreendendo contatar a amostra com um segundo composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o segundo composto contém um substrato para a segunda enzima; e detectar a luminescência da amostra.
BR112013010484A 2010-11-02 2011-11-02 derivados de coelenterazina e métodos de utilizar os mesmos BR112013010484B1 (pt)

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