KR100319442B1

KR100319442B1 - 플루라나아제, 이를 제조하는 미생물, 이플루라나아제의 제조방법과 이의 용도

Info

Publication number: KR100319442B1
Application number: KR1019930030410A
Authority: KR
Inventors: 필립드위어; 안토인아모리
Original assignee: 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드
Priority date: 1992-12-28
Filing date: 1993-12-28
Publication date: 2002-11-18
Also published as: FI116531B; FI935900A0; EP0605040A1; CN1090325A; US6074854A; MX9400123A; AU6483198A; FI935900A; DE69325981T2; US5817498A; AU5275993A; US5736375A; US5721127A; JPH06217770A; CA2112028C; CN1061089C; AU686574B2; DK0605040T3; US5731174A; CA2112028A1

Abstract

본 발명은 아밀로펙틴에서 α-1,6형의 글루코시드 결합을 가수분해하는 성질을 갖고 산성배지에서와 약 60℃의 온도에서 효소활성을 갖는 열 안정성 플루라나아제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이 플루라나아제를 생성시키는 미생물의 균주와 이 플루라나아제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 이의 용도와 생성물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 DNA 분자에 관한 것이고, 본 발명은 이 DNA 분자를 함유하는 합성벡터와 이 DNA 분자를 함유하는 염색체 집성벡터에 관한 것이다.

Description

플루라나아제, 이를 제조하는 미생물, 이 플루라나아제의 제조방법과 이의 용도

본 발명은 새로운 플루라나아제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 플루라나아제를 제조하는 미생물의 새로운 균주와 이러한 플루라나아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 이의 용도와 이러한 제품으로 이루어지는 조성물에 관한 것이다.또한 본 발명은 이러한 플루라나아제의 유전자를 함유하는 DNA와 바실러스 균주에서 플루라나아제를 합성하는데 사용될 수 있는 이 DNA 분자를 함유하는 합성벡터에 관한 것이다.

전분, 아밀로스와 아밀로펙틴인 필수성분 다음 두단계로 행하는 효소적 방법에 의하여 간단한 당류로 변환시킬 수 있다 : 한 단계는 전분의 액화이고 한단계는 액화된 전분의 당화이다. 전분의 변환수준을 높이기 위하여, 액화된 전분을 당화하는 동안, 예를들어 플루라나아제와 같은 α-1,6-글루코디드 결합을 가수분해하는 효소를 첨가하는 것은 이미 알려져 있다.

유럽특허 0063903에는 소위 분지절단효소 즉, 아밀로펙틴에서 α-1,6-글루코시드 결합을 가수분해 할 수 있는 효소가 기술되어 있는데, 이는 플루라나아제 활성을 갖고 60℃하에 4-5pH에서 최적의 활성을 갖는다. 이 효소는 바실러스 아시도플루라나아제리티커스균주에서 유도된다.

더우기, 미국특허 5,055,403에는 산 매체에서 효소활성을 갖고 바실러스 나가노엔시스 균주에서 유도된 플루라나아제가 기술되어 있다. 이 효소는 60℃ 측정되는 약 5의 pH에서 최대의 활성을 갖고, pH 4.5에서 측정되는 약 62.5℃의 온도에서 최적의 활성을 갖는다.

산성 pH 에서와 약 60℃의 온도에서 활성을 가지므로서 액화된 전분의 당화에 사용하는데 적합할지라도, 종래의 플루라나아제는 이와같은 온도와 Ph 조건하에서 매우 낮은 안정성을 갖고, 수십분을 초과하지 않는 기질없이 약 4.5의 pH에서와 60℃의 온도에서 반감기를 갖는 결함이 있다.

따라서 현재 액화된 전분의 당화에 사용될 수 있고 넓은 온도와 pH 범위내에서 특히 약 60℃의 온도와 약 4.5의 pH에서 매우 안정한 플루라나아제가 요청되고 있다.

본 발명의 목적은 산성 pH에서 활성을 갖고, 산성 pH에서 종래의 플루라나아제보다 매우 우수한 열안정성을 갖고 상기 조건하에서 몇시간의 반감기를 갖는 새로운 플루라나아제를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 균주, 특히 상기 플루라나아제를 천연적으로 제조하는 바실러스 균주를 동정하고, 단리하고 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 플루라나아제를 부호화하는 누클레오티드 배열을 단리하고 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 목적은 합성벡터와 상기 플루라나아제를 부호화하는 누클레오티드 배열을 함유하는 염색체 집성백터를 제조하고 공급하는데 있다.

또한 본 발명의 목적은 합성벡터 또는 상기 플루라나아제를 부호화하는 바실러스 균주의 누클레오티드 배열을 함유하는 집성벡터로 형질전환된 바실러스 숙주를 제조하고 제공하는데 있다.

이러한 목적을 위하여 본 발명은 바실러스에 의하여 특히 바실러스 데라미피칸스와 같은 호기성 및 비-고온성 미생물에 의하여 생성된 플루라나아제에 관한 것이다. 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D 또한 이러한 바실러스 데라미피칸스 균주의 유도체나 돌연변이체를 사용하는 것이 바람직하다.

단리되고 정제된 플루라나아제는 약 100(±10)KDa의 분자량을 갖는 폴리펩티드 단일형으로 이루어지는 것이 바람직하다.

더우기, 상기 플루라나아제의 N-말단배열(SEQ ID NO:1)은 다음과 같이 아미노-카르복실 감응에서 좌에서 우로 된다 :

본 발명은 1∼928 아미노산(SEQ ID NO:11)의 아미노산 배열로부터 유도된 수정된 배열로 이루어지는 단리되고 정제된 플루라나아제에 관한 것이다. 이 배열은 제 4 도(제 4a 내지 4f 도)에서 예시한 바와같이 상기 플루라나아제의 완전한 아미노산 배열이다.

플루라나아제를 부호화하고 이를 아미노산으로 번역하는 완전한 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:10)은 제 4 도에 표시했다.

특히, 바람직한것은 상기 플루라나아제가 4.1∼4.5의 등전점을 갖는 것이다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 광범위한 온도에서 열안정성화 활성을 갖는다. 플루라나아제는 산성 pH에서 활성을 갖는다.

상기 플루라나아제는 두 아밀로펙틴과 플루란에 존재하는 α-1,6-글루코시드 결합의 가수분해를 촉진시킬 수 있다. 그러므로, 이는 소위 데라미화 또는 분지화 효소라 불리운다. 상기 플루라나아제는 아밀로펙틴에서 α-1.6-형의 글루코시드 결합을 가수분해 할 수있는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 플루란을 말토트리오제로, 아밀로펙틴을 아밀로제로 분해시키는 것이 바람직한 것이다.

더우기, 본 발명의 플루라나아제는 아밀로펙틴을 가수분해하여 올리고 당류(알토올리고당류)를 형성한다. 이와같이 가수분해가는 동안, 약 13의 글루코오스단위(13의 중합도, 또한 이 분자는 "연쇄A"라 부른다)로 이루어지는 올리고당류의 형성이 관찰되고, 다음 약 47 글루코오스단위(47의 중합도, 또한 이 분자는 "연쇄B"라 불리운다)로 이루어지는 올리고당류의 형성이 관찰된다.

연쇄 A 와 B 를 갖는 올리고당류는 디.제이.매너스("곡류탄수화물에 관한 새로운 연구서"에서 "분지절단 효소에 의한 전분성분의 구조적 분석" 암스테르담 1985. P45∼54)와 비. 이. 에네볼드센("곡류탄수화물에 관한 새로운 연구서"에서 "전분의 미세구조의 견해" 암스테르담, 1985, P55∼60)가 정의했다.

본 발명의 플루라나아제는 감자 아밀로펙틴을 가수분해 하는데 바람직하다. 이 가수분해는 플루라나아제의 최적 활성조건 하에서 즉 약 60℃의 온도와 약 4.3의 pH에서 플루라나아제의 존재하에 아밀로펙틴의 현탁액으로 수행할 수 있다.

본 발명의 플루라나아제는 말토스의 축합반응을 촉진하여 테트라홀로사이드류(4 글루코오스단위를 갖는 올리고당류)를 형성한다.

본 발명의 플루라나아제는 기질없이 약 4.5pH에서 완충된 용액에서 약 60℃의 온도하에 측정된 약 55시간의 반감기를 갖는다.

반감기란 플루라나아제가 기질없이 약 4.5의 pH에서 완충된 용액에서 약 60℃의 온도에서 55시간 배양한 후 측정된 최소한 50%의 상태 효소활성도를 나타내는것을 의미한다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 산성 pH에서 열안정성을 갖는다. 실제 본 발명에 따른 플루라나아제는 기질없이 약 4.5의 pH에서 완충된 용액에서 60℃의 온도하에 40시간 배양한후 측정된, 최소한 55%의 상태효소 활성도를 나타낸다. 이는 이와같은 동일한 조건하에서 24시간 배양한후 측정된 최소한 70%의 상대효소 활성도를 나타낸다.

상대효소 활성도는 주어진 pH, 온도, 기질화 기간조건하에 행한 시험과정에서 측정된 효소활성도와, 이러한 동일시험과정에서 측정된 최대효소 활성도 사이의 비율을 뜻하며, 효소활성도는 플루라나아제의 가수분해에서 출발하여 측정하고, 최대효소 활성도는 100의 값에서 임의로 고정시킨다.

본 발명에 다른 플루라나아제는 광범위한 산성 pH 값에서 더욱 안정성을 갖는다.

하술안 조건하에서 이는 3 이거나 그 이상의 pH에서 활성을 갖는다. 실제, 상기 플루라나아제는 기질없이 약 3.5이거나 그 이상의 pH 범위에서 약 60℃의 온도하에 60분 배양한후, 측정된 최소한 85%의 상대효소 활성도를 나타낸다.

하술한 조건하에서, 이는 7 이거나 또는 그 이하의 pH에서 활성을 갖는다. 실제, 상기 플루라나아제는 기질없이 약 5.8이거나 또는 그 이하의 pH 범위에서 약 60℃의 온도하에서 60분 배양한 후 측정된 최소한 85%의 상태효소 활성도를 나타낸다.

이는 바람직하게 이와같이 동일한 조건하에서 악 3.8 내지 약 5의 pH 범위에서 측정된 90% 이상의 상대효소 활성도를 나타낸다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 4.0 이상의 pH 범위에서 약 60℃의 온도하에 측정된 최적의 효소활성도를 개선한다. 본 발명에 따른 플루라나아제는 4.8 이하의 pH 범위에서 약 60℃의 온도하에 측정된 최적의 효소 활성도를 개선한다. 상기 플루라나아제는 약 4.3의 pH에서 약 60℃의 온도하에 측정된 최적효소 활성도를 바람직하게 개선한다.

더우기, 본 발명에 따른 플루라나아제는 55∼65℃의 온도범위에서 특히 60℃하에, 약 4.3의 pH에서 측정된 최적효소 활성도를 개선한다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 약 3.8 내지 약 4.9의 pH 범위와 약 60℃의 온도하에 80% 이상의 최대효소 활성도(최대효소 활성도는 60℃의 온도와 4.3의 pH에서 측정한다)의 효소활성도를 개선한다.

더우기, 본 발명에 따른 플루라나아제는 전분 당화의 실제적 공업조건에 맞는 모든 적합한 성질을 갖는다. 이들 성질은 5 이하의 최적 pH, 약 60℃의 최적온도와 산성 pH 및 상승된 온도의 조건하에서 효소의 양호한 안정성을 뜻한다. 산 배지는 전분의 공업적 당화에서 글루코아밀라제와 같은 플루라나아제의 동시 사용으로 나타난다. 실제, 전분의 당화에 사용된 글루코아밀라제는 일반적으로 균에 의하여 특히 아스페르길러스 니거, 아스페르길러스 아와모리 또는 아스페르길러스 포에티더스와 같은 아스페르길러스 균주에 의하여 생성된다. 글루코아밀라제의 존재하에 액화된 전분의 당화에 적합한 이상적인 조건은 약 60℃의 온도와 약 4.0∼4.5의 pH이다. 이것은 특히 솔베이 엔자임스(미국, 엘카르트)에 의하여 상표명 DIAZYME?으로와 솔베이 엔자임스(독일, 하노버)에 의하여 상표명 OPTIDEX?로 판매되고 있는 글루코아밀라제의 경우가 있다.

더우기, 당화단계는 몇시간, 일반적으로 40∼60시간 계속하고, 사용되는 효소는 이 단계 전체에서 안정성, 활성과 유효성을 갖는 것은 필수적이며, 그러므로 이들 효소는 산 배지에서 높은 열 안정성과 가능한 가장 높은 반감기를 갖는다. 이러한 이유 때문에, 본 발명의 플루라나아제는 공지의 플루라나아제보다 더 효과적이다.

또한, 본 발명은 공중 생물학적 조건하에서 탄소와 질소의 급원과 무기염을 함유하는 적당한 배양기에서 플루라나아제를 제조하고 여기서 얻은 플루라나아제를 수확할 수 있는 기호성(과 비-고온성) 박테륨의 배양을 뜻하는 플루라나아제의 제조방법에 관한 것이다. 이러한 배지는 고체 또는 액체 일 수있고, 배지는 액체가 바람직하다.

그리고, 본 발명은 공중 생물학적 조건하에 탄소와 질소의 급원과 무기염을 함유하는 적당한 배양기에서 플루라나아제를 제조하여, 여기서 얻은 플루라나아제를 수확할 수 있는 균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D(LMG P-13056) 또는 이 균주의 유도체의 배양으로 이루어지는 플루라나아제의 제조방법에 관한 것이다.

배지의 성분, 배양 파라미터, 온도, pH, 통기와 교반과 같은 이들 박테리아용 배양조건은 전문가에게 잘 알려져 있다.

배지에서 탄소급원은 통상 전분, 부분적으로 가수분해된 전분, 용해성 전분, 올리고당류, 글루코오스, 아밀로오스, 아밀로펙틴 또는 이들의 둘 또는 그 이상의혼합물에서 선택한다. 배지에서 탄소급원은 부분적으로 가수분해된 전분에서 얻는다. 배지에서 질소급원은 통상 효모추출물, 콩분말, 목화씨분말, 어분, 젤라틴, 감자분말 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 혼합물에서 선택한다. 배지에서 질소급원으로 바람직한 것은 효모추출물, 콩분말 또는 이들의 혼합물에서 선택하는 것이다. 좋은 결과는 효모추출물에서 얻는다. 배지에서 무기염은 일반적으로 음이온에 있어서는 염화물, 탄산염, 인산염과 황산염에서 선택하고 양이온에 있어서는 칼륨, 나트륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 혼합물에서 선택한다. 좋은 결과는 다음염의 혼합물에서 얻는다 : KH₂PO₄, K₂HPO₄·3H₂O, (NH₄)₂SO₄, MgCl₂·6H₂O 와 CaCl₂·2H₂).

배양은 일반적으로 20∼45℃, 바람직하기로는 25∼40℃의 온도에서 행하는 것이다.

배양은 일반적으로 3.5∼6, 바람직하기로는 4∼6의 pH에서 행하는 것이다.

또한, 배양은 교반하면서 공기 또는 산소의 존재하에 공중 생물학적 조건아래에서 행한다.

생성된 플루라나아제를 수확하는 방법은 전문가에게 잘 알려져 있다. 원심분리, 한외여과, 증발, 침전, 여과, 미량여과, 결정화 또는 원심분리 다음 한외여과와 같이 이들 방법의 하나 또는 다른 것과의 조합이 통상 사용된다.

이때 플루라나아제는 필요하면 정제할 수 있다. 효소의 정제방법은 특이 황산암모늄과 같은 염 또는 주로 아세톤과 같은 용매의 도움으로 침전시키는 것이 전문가에게 알려져 있다.

또한, 플루라나아제는 분무 또는 동결건조에 의하어 건조될 수 있다.

본 발명은 플루라나아제를 생성시키는 새로이 단리된 호기성 박테리아의 동정과 공급에 관한 것이다. 일반적으로 이것은 바실라시에과에 속한다. 이는 바실러스속에 속하는 것이 바람직하다. 상기 바실러스는 특히 균주 바실러스 데라미피칸스 또는 이 균주의 유도체나 돌연변이체가 바람직하다.

이러한 균주의 유도체나 돌연변이체는 자연적으로나 인공적으로 수정된 박테리아를 의미한다. 이러한 균주의 유도체는 자외선, X-선, 돌연변이 유발제 또는 유전자 공학과 같은 공지의 수정방법에 의하여 얻을 수 있다.

균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D 는 1993. 6. 21자 번호 LMG P-13056하의 부다페스트 조약에 따라 미생물의 벨지움 기탁협회(LMG 배양기탁소, 겐트 대학교, 미생물 연구소, 벨지움 B-9000 케이. 엘. 리드칸크스트라트 35 소재)라 불리우는 기탁소에 기탁되어 있다. 따라서, 본 발명은 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 단리되고 정제된 배양물과 이로부터 유도되거나 또는 돌연변이의 배양물에 관한 것이다.

본 발명의 균주는 이의 생화학 특성에 의하여 확인된다 : 아포를 형성하는 그람-양성, 기호성, 봉형 박테리아.

또한 본 발명은 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D(LMG P-13056)의 플루라나아제를 부호화한 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:10) 또는 이로부터 유도된 수정된 배열로 이루어지는 DNA 분자의 단리와 제공에 관한 것이다. 이 DNA 분자는 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 플루라나아제의 전체 유전자로 이루어지는 것이 바람직하다. 플루라나아제의 전체 유전자는 최소한의 전사촉진 유전자의 전체 유전자 신호배열, 숙성 플루라나아제와 전사 터미네이터를 부호화 하는 누클레오티드 배열을 의미한다.

본 발명에 따른 DNA 분자는 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D(LMG P-13056)의 숙성 플루라나아제를 부호화하는 최소한의 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:10)과 이의 신호배열(예비배열)(SEQ ID NO:13)로 이루어진다. 이러한 DNA 분자는 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D 플루라나아제의 전체 유전자로 이루어지는 것이 바람직하다. 좋은 결과는 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:8)로 이루어지는 DNA 분자에서 얻는다. 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:8)은 아미노-카르복실 감응에서 좌에서 우로 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:14), 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:13), 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:10) 과 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:15)로 이루어진다.

본 발명의 플루라나아제는 2P 아미노산의 부가적 배열(SEQ ID NO:12)을 함유하는 전구물질의 형태로 합성된다.

또한 본 발명은 수정된 플루라나아제, 즉 아미노산 배열이 최소한 하나의 아미노산에 의하여 야생효소의 배열과 다른 효소에 관한 것이다. 이러한 수정은 자외선에 또는 아질산나트륨이나 O-메틸히드록실아민과 갈은 화학 생성물에 노출시키는 것과 같은, DNA에서 돌연변이 유발의 일반적 방법에 의하여, 또는 예를들어 부위-관련 돌연변이 유발이나 랜덤 돌연변이 유발과 같은 유전공학법에 의하여 얻을 수 있다.

또한 본 발명은 상술한 플루라나아제의 수정에 의하여 얻은 숙성된 플루라나아제에 관한 것이다. 이와같은 숙성된 플루라나아제를 얻는 방법은 전문가에 알려져있고 특히 분자 클로닝-연구소 매뉴얼-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-제 2 판, 1989, 제 15 장에 기술되어 있다.

또한 본 발명은 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 플루라나아제를 분호화하는 누클레오티드 배열로 이루어지는 DNA 분자를 함유하는 합성백터의 제조와 제공에 관한 것이다. DNA 분자는 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 숙성 플루라나아제를 부호화하는 구조적 유전자로 이루어지는 것이 바람직하다. 이러한 벡터는 특히 벡터 pUBDEBRA1 인 것이 바람직하며, 좋은 결과는 벡터 pUBCDEBRA11에서 얻는다.

합성벡터는 레플리콘과 다른 DNA 영역(누클레오티드 배열)으로 이루어지고 완전한 유전자 합성단위로서 독립적으로 숙주로 작용하는 어떠한 DNA 배열을 의미한다.

완전한 유전자 합성단위는 구조적 유전자와 촉진유전자 및 전사와 번역에 필요한 조절영역을 의미한다.

구조적 유전자는 RNA로 전사하는데 사용되고 숙주에 의하여 단백질을 합성하게 하는 부호화 배열을 뜻한다.

바람직한 합성벡터는 벡터 pUBDEBRA1이다. 이러한 벡터는 본 발명에 따른 균주 바실러스 데라미피칸스의 플루라나아제를 부호화하는 유전자를 함유한다. 이러한 벡터는 적당한 숙주에 주입할 수 있다. 이러한 숙주는 일반적으로 바실러스의균주이고, 이 숙주는 바실러스 리케니포르미스의 균주가 바림직하며, 특히 이 숙주는 바실러스 리케니프로미스 SE2의 균주가 바람직하다. 우수한 결과는 이들 숙주로서 사용된 균주 바실러스 리케니포르미스에 주입할때 이 벡터에서 얻는다.

또한, 본 발명은 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 플루라나아제를 부호화하는 누클레오티드 배열로 이루어지는 DNA 분자를 함유하는 염색체 집성 벡터의 제조와 제공에 관한 것이다. DNA 분자는 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 숙성 플루라나아제를 부호화하는 구조적 유전자로 이루어지는 것이 바람직하다. 이러한 염색체 집성벡터는 특이 벡터 pUBCDEBRA11DNSI인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 플루라나아제를 부호화하는 상기 유전자를 유전-공학법에 의하여 주입하는 제조합 균주에 관한 것이다. 유전자는 합성 벡터에 의하여 플라스미드에 주입되거나 염색체 집성벡터에 의하여 하나 또는 그 1상의 카피로 숙주염색체에 집성될 수 있다.

또한, 본 발명은 플루라나아제를 부호화하는 누클레오티드를 염색체 DNA에 집성되는 형태 아니면 자동복제형태(플라스미드)로 형질전환에 의하여 주입하고 출발 생성 유기체와 다른 미생물의 균주에 관한 것이다.

본 발명은 상술한 DNA 분자로 이루어지는 바실러스 리케니포르미스의 형질 전환된 균주에 관한 것이다.

본 발명은 합성벡터 또는 이러한 DNA 분자를 합유하는 염색체 집성벡터로 이루어지는 바실러스 리케니포르미스의 형질 전환된 균주에 관한 것이다. 바람직하기로는 본 발명이 합성벡터 pUBDEBRA1 또는 염색체 집성벡터 pUBCDEBRA11DNSI로 이루어지는 바실러스 리케니포르미스의 형질 전환된 균주에 관한 것일때 이다.

또한, 본 발명은 재조합 유기체에서 출발하는 플루라나아제의 제조방법에 관한 것으로, 이 방법은 플루라나아제를 부호화하는 DNA 단편의 단리, 이 DNA 단편을 적당한 벡터에 삽입, 이 벡터를 적당한 숙주에 주입 또는 이 DNA 단편을 적당한 숙주의 염색체에 주입, 이 숙주의 배양, 플루라나아제의 합성과 플루라나아제의 수확으로 이루어진다. 적당한 숙주는 일반적으로 에스케리키아콜리, 바실러스 또는 아스페르질러스 미생물에서 선택한다. 숙주는 통상 바실리에서 선택한다. 숙주는 바실러스속의 (호기성) 미생물에서 선택하는 것이 바람직하다. 특히 숙주는 미생물 바실러스 서브티리스, 바실러스 리케나포르미스, 바실러스 알카돈필러스, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 렌투스, 바실러스 아밀로리케파시엔스 또는 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D(LMG P-3056)에서 선택하는 것이 바람직하다.

좋은 결과는 본 발명에 따른 플루라나아제의 합성용 숙주가 바실러스리케니포르미스에서 유도된 재조합 균주이고, 바람직하기로는 균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl일때 얻는다.

바실러스 리케니포르미스 SE2의 균주는 번호 LMG P-14034 하에 부다페스트 조약에 따라서 미생물의 벨지움 기탁협회(LMG 배양기탁소, 켄트, 밸지움)이라 불리우는 기탁소에 1993. 6. 21에 기탁했다.

따라서, 바실러스 리케니포르미스 SE2 에서 얻은 형질 전환된 균주 SE2 delapl는 숙성 프로테아제를 부호화한 DNA 배열을 이의 염색체내에 함유하지 않는다는 유일한 사실로서 모균주와는 다르다.

또한, 본 발명은 야생상태에서 알카리성 프로테아제를 부호화하는 유전자를 함유하는 바실러스속의 미생물에 의하여 이종방법으로 제조한 플루라나아제에 관한 것이다. 이러한 미생물은 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D를 부호화하는 누클레오티드 배열로 이루어지는 DNA 분자를 갖는 바실러스 리케니포르미스의 균주가 바람직하다. 알카리성 프로테아제를 부호화하는 유전자가 특히 이러한 바실러스 균주에서 삭제되는 것이 바람직하다. 이 균주는 균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl이 바람직하다.

이종 방법으로의 제조는 천연미생물, 즉 플루라나아제를 부호화하는 유전자를 야생상태로 함유하는 미생물에 의하여 실행되지 않는 제조를 의미한다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 예를들어 식품공업, 약품공업 또는 화학공업과 같은 각종 공업계에서 몇몇 사용처를 가지고 있다.

특히 플루라나아제는 방부제로서, 즉 저장하는 동안 빵의 부패를 예방하는 첨가제로서 제빵에서 사용될 수 있고 또한, 저칼로리 맥주를 제조하는 양조에 사용될 수 있다.

또한, 플루라나아제는 아밀로제를 지방용 대용물로서 사용하는 저-칼로리 음식의 제조에 사용할 수 있다.

플루라나아제를 사용하여 말토즈를 출발물질로 한 테트라홀로사이드를 형성시킬 수 있다.

또한, 플루라나아제를 사용하여 α-1,6형의 결합을 일으키는 모노- 또는 올리고- 당류를 축합할 수 있다.

플루라나아제는 예를들어 과일쥬스를 정제하는데 사용될 수 있다.

플루라나아제는 전분의 액화에 사용될 수 있다.

식품용에 있어서, 플루라나아제는 지지체에서 부동화될 수 있고, 효소의 부동화 방법은 전문가에게 잘 알려져 있다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 특히 전분화 플루란을 처리하는데 적합하다.

또한 본 발명은 액화된 전분의 당화에 플루라나아제를 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명은 플루라나아제의 존재하에 전분 또는 부분적으로 가수분해된 전분을 당화하는 단계로 이루어지는 전분 또는 부분적으로 가수분해된 전분의 분해방법에 플루라나아제를 사용하는 용도에 관한 것이다. 이 방법은 일반적으로 글루코아밀라제, α-아밀라제, β-아밀라제, α-글루코디다에제, 또는 기타 당화 효소와 같은 하나 또는 그 이상의 효소의 존재하에서 행한다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 이의 생화학적 성질에 따라 강산조건, 즉 3.9 이상의 pH 아래에서 당화단계를 행할 수 있다. 이 pH는 공지의 플루라나아제가 수용할 수 있는 것보다 산성이 더 크다.

본 발명에 따른 플루라나아제는 이의 생화학적 성질에 따라, 당화단계를 비교적 높은 온도, 즉 최소한 65℃이하의 온도에서 행할 수 있다.

본 발명에 따른 플투라나아제를 당화배지에 첨가하면 얻은 최종 조성물에서 글루코오스 함량이 증가하므로서 반응생성물이 증가한다.

더우기, 본 발명에 따른 플루라나아제를 당화배지에 첨가하면 당화기간이 감소된다.

본 발명의 플루라나아제는 높은 전분 전환수준을 이룬다.

또한, 당화단계에서 통상 사용되는 큰 비율(최소한 60%)의 글루코아밀라아제를 글루코오스의 수율에 영향을 미치지 않고 본 발명의 플루라나아제로 대치할 수 있다. 이러한 대치는 특히 유익하고, 실제 통상적으로 얻는 부산물의 양을 상당히 감소시킨다. 글루코아밀라제는 작은 비율로 존재하기 때문에, 글루코오스를 출발물질로 한 올리고- 당류(α-1,6 결합을 함유)의 합성반응을 촉진시킬 수 없으며; 정상조건하에서 텍스트로오스의 고농도가 전분전환 수준을 한정하는 당화배지에 도달될때 글루코아밀라제는 이러한 올리고당류 합성의 역반응을 촉진시킨다.

더우기, 본 발명의 플루라나아제는 농축된 당화배지, 즉 높은 함량의 액화된 전분을 갖는 배지를 사용하게 한다. 이것은 경제적인 관점으로 보아 유익하며 실제 증발내용을 감소시킨다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 플루라나아제를 함유하는 효소조성물에 관한 것이다.

본 발명의 플루라나아제를 함유하는 조성물은 고체 또는 액체형태로 사용될 수 있다.

플루라나아제는 의도하는 용도에 따라 처방된다. 또한, 본 발명에 따른 플루라나아제를 함유하는 효소조성물에 안정화제나 방부제를 첨가할수 있다. 예를들면, 풀르는 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 전분, 플루란, 글루코오스와 솔비톨과 같은 당분, 염화나트륨, 염화칼슘, 소르브산 칼륨과 벤조산 나트륨과 같은 염, 둘 또는 그 이상의 이들 제품의 혼합물을 첨가하여 안정화 시킬 수 있다. 좋은 결과는 전분, 벤조산 나트륨과 소르브산 칼륨의 혼합물로 얻는다.

또한, 본 발명에 다른 효소조성물은 플루라나아제와 더불어 하나 또는 그 이상의 다른 효소를 함유할 수 있다. 특히, 이와같은 효소는 예를들어 글루코아밀라제, α-아밀라제, β-아밀라제, α-글루코시다아제, 이소아밀라제, 시클로말토덱스트린, 글루코트란스퍼라아제, β-글루카나아제와 글루코오스 이성질화 효소와 같은 탄수화물 가수분해효소, 당화효소, 글루코시드 결합을 분해하는 효소나 둘 또는 그 이상의 이들의 혼합물이 있다.

바람직하기로는 본 발명은 글루코아밀라제와 플루라나아제를 함유하는 효소조성물에 관한 것이다.

도면에서 분명하게 측정되지 앉은 누클레오티드는 기호 N으로 표시했다.

이들 도면에 사용된 기호와 약어의 의미는 다음표에 요약했다.

본 발명을 실시예를 들어 예시하면 다음과 같다.

실시예 1

바실러스 데라미피칸스 균주의 단리와 특성화

한천 배양기에서 토양으로부터 균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D를 단리하고 이의 능력이 메가짐에 의하여 판매되고 AZCL-플루란으로 공지되어 있는 플루란의 착색된 유도체를 분해하도록 선택한다.

이 균주를 MYE 성장 배지에서 37℃하에 배양하며, 이의 조성은 다음과 같다.:

KH₂PO₄33mM; K₂HPO₄·2H₂O 6mM; (NH₄)₂SO₄45mM; MgCl₂·6H₂) 1mM; CaCl₂·2H₂) 1mM; 효모추출물 0.5%(중량/체적); 글루코오스 0.5%(중량/체적) 배지의 pH를 H₃PO₄로 pH 4.5로 조절한다.

한천배지 (MYE/한천)는 부가적을 2%(중량/체적)의 한천을 함유한다.

본 발명의 균주를 이의 생화학적 특성에 의하여 확인한다 : 그람-양성, 호기성, 아포를 형성하는 봉형 박테리아 따라서 이는 바실러스속에 속한다.

37℃하에서 MYE 배지상의 배양에서 이 균주의 영양세포는 0.7 ×3.0 - 3.5㎛크기의 바실러스 형태를 갖는다.

MYE 배지에서 37℃하에 3일동안 성장한 후, 현미경으로 관찰하면 약간 변형된 타원의 말단 포자주머니의 존재가 나타난다.

카탈라아제 시험에서 10%의 과산화수소가 존재하는 약한 양성을 나타내며,옥시다아제 시험에서 1%의 테트라메틸-1,4-페닐렌-디암모늄 디클로라이드가 존재하는 양성을 나타낸다.

이 균주는 호기성이고, 즉 이는 호기생활하에서 발육한다. 이는 무호기생활하에서, 즉 37℃에서의 84%(V/V)의 N₂, 8%(V/V)의 CO₂와 8%(V/V)의 H₂의 대기하에서 발육하지 않으며, 그러나 한편 이는 미량무호기 생활하에서 즉, 37℃에서의 82.5% (V/V)의 N₂, 6%(V/V)의 O₂, 7.5%(V/V)의 H₂와 4%(V/V)의 CO₂의 대기하에서 발육한다.

이 균주는 고온성이 아니다. 이는 26℃, 30℃, 37℃ 와 45℃의 MYE배지에서 배양한후 정상발육을 나타내며, 그러나 이는 50℃와 55℃에서는 발육하지 않는다. 이는 pH값 : pH4.0, pH4.5, pH5.0과 pH5.5로 인산염 완충제로 완충시킨 MYE 배지에서 배양한 후, 정상발육을 나타내며, 그러나 이는 pH 7에서는 발육하지 않는다. 이는 2.0%(W/V) 와 3.5(W/V)의 농도로 NaCl의 존재하에 MYE 배지에서 배양한 후 정상발육을 나타내며, 5.0%(W/V)의 NaCl의 존재하에서는 약한 발육을 나타내며, 7.0%(W/V)의 NaCl의 존재하에서는 발육하지 않는다. 약어 %(W/V)는 체적당 중량으로 표시되는 퍼센트를 나타낸다.

이 균주는 카세인을 가수분해 하지못하며; 실제로 용균작용 구역은 37℃에서 2주이상 배양한 후 관찰될 수 없다. 이는 티토신을 약간 분해시키고, 피루브산염에서 아세토인을 생성시키지 못하고 질산염을 아질산염 또는 N₂로 환원시키지 못한다.

본 발명에 따른 균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D는 유럽특허 0 063 909에 기술되어 있는 바실러스 아시도풀리티커스균주 및 미국특허 5,055,403에 기술되어 있는 바실러스 나가노엔시스 균주와 뷴류학적으로 다르다. 균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D는 4.7∼5.5의 pH에서 성장을 나타내고, 7.0의 pH에서는 성장을 나타내지 못하고, 3.5%(W/V)의 MaCl의 존재하에서 발육하며, 티토신을 분해하고 질산염을 아질산염으로 환원시키지 못한다.

균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D는 벨기에왕국 미생물기탁협회(LMG 배양물 기탁소)라 불리우는 기탁소에 번호 LMG P-13056으로 기탁했다.

실시예 2

효소추출물의 함량과 글루코오스를 전분으로 다음과 같이 하는 것을 제외하고는 MYE 배지와 동일한 조성을 갖는 액체배지(MYA)에서 균주 바실러스 데라미피칸스를 배양한다:

효소추출물 2.5%(W/V)

감자전분 2.5%(W/V)

37℃의 온도에서 효과적인 통기하에 교반하면서 배양을 행한다.

배양 66시간 후 플루라나아제와 세포생체량을 원심분리(30분 동안 5000 rpn, BECKMAN JA-10)하여 분리한다. 균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D에 의하여 생성된 플루라나아제를 세포외로 한다.

플루라나아제를 한외여과(AMICON SI10 Y10막)로 농축하여 농축된 플루라나아제 수용액을 얻는다.

얻은 용액의 효소활성을 측정한다.

플루라나아제의 한 효소단위(PUN)는 60℃의 온도로 4.5의 pH에서 플루란의존재하에 분당 1㎛ 글루코오스당량의 속도로 환원성 당분의 용해를 촉진시키는 효소의 양으로 정의된다.

플루라나아제 효소활성은 다음 규정에 따라서 축정한다. 이에 pH4.5의 50mM초산염 완충제에 용해한 플루란의 1% 농도용액 1㎖, 0.2∼1PUN/㎖의 활성도에 해당하는 플루라나아제 용액 0.1㎖을 가한다. 다음 0.4㎖의 0.5M NaOH를 가하여 15분후에 반응을 정지시킨다. 용해된 환원성 당분을 SOMOGYI-NELSON 방법 [J. Biol. Chem., 153(1944) P 375∼380; 과 J. Biol. Chem., 16(1945) P61∼68]으로 분석하고 이 출원의 다른 실시예에서도 이와같이 한다.

제 2 방법을 사용하여 플루마나아제를 분석한다. 플루라나아제의 존재하에 효소반응을 시험조건에 따라서 행하고, 다음 황산(0.1N)을 가하여 정지시킨다. 플루란의 가수분해 생성물을 HPLC 크로마토그라피(BIO-RAD로부터 HPX-87H 컬럼; 이등상은 10mM H₂SO₄이다)하여 각종 성분을 분리한다. 형성된 말토트리오스의 양은 얻은 정점지역을 측정하여 평가한다.

소위 분지절단 활성도, 즉 아밀로펙틴에 존재하는 α-1.6-글루코시드 결합의 가수분해는 요오드의 존재하에, 발생되는 청색의 증가에 의하여 아밀로펙틴에서 아밀로제의 용해로 정량될 수 있다.

분지절단 효소활성도는 다음 규정에 따라서 측청한다.

pH 4.5로 50mM 초산염 완충제를 함유하는 1%농도 아밀로펙틴 용액 0.4㎖를 10분동안 60℃에서 배양한다. 0.2㎖의 플루라나아제를 가하여 반응을 시작하고,0.4㎖의 0.3M HCl을 가하여 30분후 정지한다. 요오드의 0.0025%(V/V) 농도용액 0.8㎖을 0.2㎖의 이 반응혼합물에 가한다음, 565nm에서 흡광도를 측정한다.

플루라나아제를 정제하기 위하여, 플루라나아제의 농축된 수용액을 9g/ℓ의 NaCl 수용액 5㎖을 6부분으로 완전 여과한 다음 여기서 얻은 수용액의 pH를 실온에서 25%(V/V)농도 HCl을 가하여 pH 3.5로 조정한다. 완전여과는 플루라나아제 용액과 NaCl 용액을 혼합한 다음 얻은 용액을 한외여과하는 것이다.

얻은 침전물을 원심분리(30분 동안 5000rpm, BECKMAN JA-10)하여 제거하고, 원심분리에서 나온 상청액을 수집한다.

이 상청액을 5M NaOH를 가하여 pH 6.0으로 조정하고, 얻은 침전물을 원심 분리하여 제거한다.

원심분리에서 나온 상청액을 수집하여 15분 동안 55℃에서 가열한다.

형성된 침전물을 다시 원심분리(30분 동안 5000rpm, BECKMAN JA-10)하여 제거하고, 원심분리에서 나온 상청액을 수집한다.

이 상청액에 아세톤을 가하여 최종 농도를 60%(V/V)로 하고 형성된 현탁액을 2시간 이상 4℃로 한다. 4℃에서 형성된 침전물을 20mM, MES(2-(N-몰포리노)에탄술폰산)와 1mM CaCl₂(pH 6.0)의 완충제에 용해시킨다. 이 플루라나아제 용액을 용액A 라 부른다.

이 용액A 를 이온교환 크로마토그라피에 의하여 다시 농축하여 이를 정제한다. S-SEPHAROSE?HP HI LOAD 16/10의 상품명으로 판매되고 있는 약 20㎖ 내부체적의 컬럼을 5㎖/분의 유속으로 50mM CH₃COONa 와 100mM NaCl(pH 4.0)의 완충제로 먼저 평형되게 한다. 용액A를 초산염 완충제로 10배 희석시키고 15㎖의 이 희석용액을 컬럼에 석출시킨다. 이소크래트상을 80㎖의 초산염 완충제(100mM NaCl)로 용리시켜서 확보한 다음, 선형 기울기의 NaCl(100-500mM)을 함유 하는 200㎖의 50mM 초산염 완충제(pH = 4.0) 로 용리한다.

플루라나아제 활성도를 각 분획에서 측정한다.

가장 활성적인 분획을 용액B(0.025mg/㎖의 단백질을 함유하고 0.7PUN/㎖의 플루라나아제 활성도를 갖는 12㎖)에 조합한다.

이 용액B 에서 출발하여 80%(V/V)의 최종농도를 아세톤으로 침전을 행한다. 얻은 침전물을 20mM MES 와 1mM CaCl₂(pH 6.0)을 함유하는 0.6㎖의 완충제의 체적에 용해시킨다.

이 플루라나아제 용액을 용액C 라 부른다.

용액 C는 0.4mg/㎖의 단백질 함량, 12PUN/㎖의 효소활성도와 30PUN/mg의 비활성도를 갖는다.

그 결과는 다음 표 1 에 요약했다.

[표 1]

표 1 은 이 정제 단계에서 인자 10 까지 효소용액의 플루라나아제 비활성도가 증가함을 나타낸다.

분지 절단 활성도 즉, 플루라나아제의 아밀로펙틴에서 α-1,6-결합에 관한 가수분해 활성도를 상술한 바와같이 아밀로펙틴의 가수분해 후 요오드로 착색시켜서 측정한다. 그 결과, 분지절단 활성도가 증가함을 나타낸다.

실시예 3

분자량 측정

트리클로로초산(10% (V/V) 최종농도)에 의한 침전을 실시예 2 에서 얻은 바와같은 용액C 에서 행한다. 얻은 침전물을 10Mm TRIS/HCl(pH = 8.0), 1mM EDTA, 2.5%(W/V)의 SDS(황산 도데실 나트륨), 5%(V/V)의 β-머캅토엔탄올과 0.01%(W/V)의브로모페놀블루로 조성된 완충제에 흡입시킨다.

완충제에 흡입된 ㎕의 침전물을 폴리아크릴아미드겔상에 석출시킨다. 사용된 겔계는 SDS의 존재하에 10-15%(V/V)의 폴리아크릴아미드 기울기를 갖는 겔로, PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY에서 나온 PHASTSYSTEN계이다. 전기 이동조건은 공급자에 의하여 제공된 것이다. 쿠마시 블루로 겔의 착색은 약 105 킬로달톤의 분자량을 갖는 폴리펩티드를 나타내는데, 이는 용액C 의 주성분이다.

이것은 실시예 4 에 기술된 바와같이, 플루라나아제의 성숙형태의 아미산배열(신호배열없이)에서 이루어지는 평가로서 확인되고 102 킬로달톤의 분자량은 계산으로 알 수 있다.

실시예 4

1.N-말단배열의 측정

실시예 3 에 기술된 겔을 출발물질로하여, 보우 등(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 84 P4806∼4810에 기술된 방법에 따라 플루라나아제의 N-말단 배열을 확인한다.

여기서 측정된 이 배열(SEQ ID NO:1)은 다음과 같이 아미노-카르복실 감응에 있어 좌에서 우로 이루어진다 :

Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyc Phe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gln Pro

2.플루라나아제의 아미노산 배열의 측정

실시예 21에서 얻은 바와같이, 플루라나아제를 부호화 하는 유전자를 함유하는 약 4.5Kb의 플라스미드 pUBCDEBRA11의 Bam HI-PstI 단편의 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:8)을 생거등(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 74, P5463∼5467의 디데옥시-누클레오티드를 사용한 연쇄말단 방법으로 측정한다.

T7 DNA 중합효소에 의하여 생장반응을 시작하는데 사용되는 합성 올리고 누클레오티드를 비우케이지등(1981) 테드라헤드론 논문 22, P 1859∼1882에 기술된 방법으로 합성한다. 배열은 NaOH 와 처리하여 두-가닥 DNA의 변성을 진행하면서, 배열 분석키트의 공급자(파마시아)가 제공한 방법에 따라 행한다.

배열분석 방법은 SAMBROOK, 1989 P13.15 와 13.17에 기술되어 있다. 배열분석용 폴리아크릴아미드겔은 SAMBROOK, 1989, P13.45∼13.58에 기술된 방법에 따라서 제조한다.

pUBCDEBRA11의 Bam HI 부위에서 PstI 부위까지의 DNA 단편의 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:8)고, 플루라나아제의 신호 및 숙성배열의 아미노산(SEQ ID NO:9)으로의 번역을 확인했다(제 5 도).

확실하게 측정되지 않은 누클레오티드는 기호 N로 표시된다. 이러한 배열을 분석하면, 플루라나아제를 부호화하는 개방판독 프레임의 존재를 나타낸다. 숙성 플루라나아제를 부호화 하는 누클레오티드배열(SEQ ID NO:10)을 확인했다. 따라서, 숙성 플루라나아제의 아미노산 배열(SEQ ID NO:11)은 이러한 개방판독 프레임에 의하여 알 수 있다. 제 4 도는 숙성 플루라라나아제를 부호화 하는 누클레모티드 배열과 아미노산으로의 이의 번역을 나타낸다.

상술한 바와같이 단백질에서 실험적으로 측정된 N-말단배열은 DNA 배열에서번역된 것에 해당함이 입증된다.

이것은 플루라나아제가 29 아미노산의 부가적 배열(예비배열)을 함유하는 전구물질의 형태로 합성됨을 알 수 있다. 이러한 29 아미노산의 배열은 대응하는 누클레오티드 배열(SEQ ID NO:13)인 것므로 확인된다(SEQ ID NO:13). 이러한 부가적 배열은 분비신호 배열의 대표적 특성을 나타내며, 이는 세포의 외부로 효소를 증발시키는 동안 제거된다. 프로우들(1992), 생물기술지 23, P231∼240). 이러한 29 아미노산의 배열은 다음과 같다 :

실시예 5

플루라나아제의 아미노산 배열에서 측정된 (실시예 4), 숙성 플루라나아제의 아미노산 분포는 표 2 에 요약했다.

[표 2]

실시예 6

등전점의 측정

실시예 2 에서 얻은 용액C 로 4.0∼6.5 범위의 pH 기울기에서 IEF(등 전자 집중법)을 행한다.

0.12 플루라나아제 단위에 해당하는 체적을 겔상에 3배로 석출시킨다. 이동후 겔의 3분의 1 은 쿠마시에 블루로 착색시킨다.

겔의 다른 두 부분은 100mM CH₃COONa, 1mM CaCl₂와 1mM MgCl₂(pH 4.5)로 완충되고 각각 0.1%(W/V)의 AZCL-플루란 또는 1%(W/V)의 아밀로펙틴을 함유하는 한천 겔(1% 중량/체적)로 피복한다. 여기서 얻은 조합물(아크릴아미드 겔/한천 겔)을 16시간동안 포화습도의 대기에서 60℃로 배양한 다음 아밀로펙틴의 최상층으로 피복된 겔을 실온하에 3mM I₂와 50mM KI를 함유하는 용액에서 배양하여 청색 착색의 외양에 의하여 분지절단 활성도를 나타나게 한다.

아밀로펙틴 겔의 요오드를 전개를 전개하면 본 발명 효소의 약 1.4 내지 약 4.5의 등전점에서 분지절단 활성도를 알리는 짙은 청색 할로를 나타낸다. 플루라나아제의 전개는 동일한 결과를 나타낸다.

이것은 본 발명의 플루라나아제가 플루라나아제 활성과 분지절단활성을 가짐을 입증한다.

또한, 이것은 본 발명의 플루라나아제가 두 플루란에서와 아밀로펙틴에서 α-1,6형의 결합을 가수분해 할 수 있음을 증명한다. 이것은 이의 기질에 관한 본 발명의 플루라나아제의 특이성이 낮음을 입증한다.

이것은 실시예 4 에서 기술된 바와같이 플루라나아제의 숙성형태의 아미노산배열(신호배열없음)로 출발하여서 되는 평가에 의하여 확인되고, 4.5의 등전점은 계산으로 알 수 있다.

실시예 7

천연균주(바실러스 데라미피칸스)에 의하여 생성된 플루라나아제의 pH와 온도의 기능에 따른 활성면

용해된 환원성 당분을 측정하여 50mM 시트르산염/인산염 완총제에서 플루라나아제의 효소활성도를 여러가지 온도(55.60 와 65℃)에서와 여러가지 pH 값(3.25∼7)에서 측정한다. 약 1PUN/㎖로 희석된, 실시예 2 에서 얻은 플루라나아제의 용액C 를 사용한다.

그 결과는 다음 표 3 에 요약했다.

이 시험과정에서, 최대 효소활성도는 15분 이상의 기간동안 약 60℃의 온도에서와 약 4.3pH에 있는 시료에 용해된 환원성 당분을 측정하여 측정한다. 따라서, 100%의 상대 효소활성도는 이 시료에 따른다.

이 실시예는 본 발명에 따른 플루라나아제는 4.0∼4.8의 pH 범위에서 약 60℃의 온도하에 측정된 최적의 효소활성을 갖는 것을 나타낸다.

또한 이 실시예는 본 발명에 따른 플루라나아제가 55∼65℃의 온도범위에서 약 4.3의 pH 하에 측정된 최적의 효소활성도를 가짐을 나타낸다.

더우기, 이 실시예는 본 발명에 따른 플루라나아제가 약 3.8 과 약 4.9 사이의 pH 범위에서 80% 이상의 최적의 효소활성도인 효소활성을 일으킴을 나타낸다.

[표 3]

실시예 8

천연균주(바실러스 데라미피칸스)에 의하여 생성된 플루라나아제의 pH 안정성

실시예 2 에서 얻은 플루라나아제의 용액A를 희석하여 3.0∼7.0의 pH값 범위하에 여러가지 100mM 시트르산염/염산염 완충제에서 약 0.7PUN/㎖의 효소활성도를 일으키도록 한다. 플루라나아제를 60분동안 60℃에서 배양한다.

1.6%(중량/체적)의 플루란의 존재하에 pH 4.2에서 60℃로 60분 동안 배양한 후 이들 다른 용액의 효소 활성도를 측정한 다음, 형성된 말토트리오스의 양을 HPLC 크로마토그라피에 의하여 측정한다(실시예 2 에 기술된 바와같이).

그 결과는 표 4 에 요약했다.

이 시험과정에서 약 60℃의 온도에서와 약 4.5의 pH에 있는 시료에 대하여 최대의 효소활성도를 측정한다. 따라서 100%의 상대효소 활성도는 이 시료에 따른다.

이 실시예는 본 발명에 따른 플루라나아제가 넓은 산성 pH 범위에서 안정성을 갖고 실제 이는 약 3.5와 약 5.8 사이의 pH 범위에서와 기질없이 약 60℃의 온도에서 60분동안 배양한 후 측정된 최소한 85%의 상대효소 활성도를 가짐을 나타낸다. 또한 이 실시예는 이것이 이와같은 동일한 조건하에 약 3.8과 약 5 사이의 pH 범위에서 측정된 90% 이상의 상대효소 활성도를 갖는것과, 이것이 3 이거나 그 이하 또는 7이거나 그 이상의 pH 에서만 비활성인 것을 나타낸다.

[표 4]

실시예 9

천연균주(바실러스 데라미피칸스)에 의하여 생성된 플루라나아제의 반감기 측정

실시예 2 에서 얻은 플루라나아제의 용액C를 희석하여 이것이 4.5의 pH 하에 100mM 초산나트륨 완충제에서 약 0.7PUN/㎖의 효소활성도를 일으키도록 한다. 플루라나아제를 함유하는 희석용액을 60℃에서 배양하고 수회 시료를 취한다.

다음 효소활성도를 환원성 당분방법(상술한 소모교 방법)으로 측정한다.

이 시험과정에서 최대 효소활성도를 0 시간에 시료에 대하여 측정한다. 따라서 100%의 상대 효소활성도가 이 시료에 따른다.

그 결과는 다음 표 5 에 요약했다.

[표 5]

이 실시예에서 플루라나아제가 산성 pH 에서 열안정성을 가짐을 나타낸다.

이 실시예는 플루라나아제의 반감기가 이들 조건하에서 약 55 시간임을 나타낸다. 실제, 플루라나아제는 약 4.5의 pH 에서 완충된 용액에서 기질없이 약 60℃의 온도에서 55시간 배양한후 측정된 최소한 50%의 상대 효소활성도를 갖는다.

더우기, 이 실시예는 본 발명에 따른 플루라나아제가 약 4.5의 pH 에서 완충된 용액에서 기질없이 약 60℃의 온도에서 40시간 배양한후 측정된, 최소한 55%의상대 효소활성도를 가짐을 나타낸다. 또한 이 실시예는 이것이 이와같은 동일한 조건하에서 24시간 배양한 후 측정된 최소한 70%의 상대 효소활성도를 갖는 것을 나타낸다.

실시예 10과 실시예 11R(비교예)

당화

35중량%(중량/중량)의 전분 건조물질의 농도에서 옥수수전분와 0.02%(중량/체적)의 농도에서 염화칼슘을 물에 현탁시켜서 당화배지를 제조한다.

이 옥수수-전분 현탁액을 pH 6.0하에 5분동안 105℃에서 솔베이 엔자임스에 의하여 상품명 TAKATHERM?하에 판매되고 있는 α-아밀라제의 존재하에 액화시킨다.

여기서 얻은 액화된 전분을 95℃의 온도로 신속하게 냉각시키고 95℃에서 120분동안 교반하면서 가수분해를 계속한다. 이 단계에서 가수분해도는 10∼12 DE 이다(여기서 DE 는 "덱스트로오스 당량"의 단위, 즉 글루코오스 당량으로 표현되는 환원성 말단의 수를 나타낸다).

여기서 얻은 액화된 전분을 희석하여 당화배지 100g 당 32g의 건조중량의 최종 농도로 한다.

얻은 당화배지를 60℃의 온도로 냉각시킨다.

이 당화배지의 pH를 초산으로 3.9∼4.8의 여러가지 값으로 조절하여 당화과정에서 일정하게 유지한다.

0.176DU/g.ds(당화배지의 건조물질 g당 글루코아밀라제의 효소단위)에 해당하는 글루코아밀라제의 양을 당화배지에 가하며, 사용된 글루코아밀라제는 솔베이 엔자임스에서 상품명 DIAZYME L-200으로 판매되고 있다.

본 발명에 따른 실시예 10 에 있어서, 건조물질의 0.075PUN/g 에 해당하는 플루라나아제의 양을 실시예 2 에 서술된 바와같이 플루라나아제의 농축된 수용액(용액A)의 형태로 당화배지에 가한다.

비교예 11R은 플루라나아제를 첨가하지 않고, 실시예 10 에서 상술한 바와같이 행한다.

48시간 후, 당화를 중지하고 얻은 생성물을 크로마토그라피에 의하여 분석한다(실시예 2 에 서술된 바와같이).

그 결과는 표 6 에 요약했다.

이 실시예는 본 발명에 따른 플루라나아제가 당화에서 효과적임을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 플루라나아제는 전분당화의 실제 공업조건에 알맞는 적당한 성질을 모두 갖는다.

이 실시예는 전분 전환수준이 높은 산성 pH 이하의 여러가지 pH 값, 즉 최소한 3.9에서 본 발명에 따른 플루라나아제의 존재하에서 더 큰 것음을 나타낸다.

[표 6]

DP2는 둘의 글루코오스 단위(글루코오스 이량체)를 갖는 올리고당류를 나타내고, EP3는 셋의 글루코오스 단위(글루코오스 삼량체)를 갖는 올리고당류이고, >DP3는 3 이상의 글루코오스 단위를 갖는 올리고당류를 나타낸다.

실시예 12와 실시예 13R(비교예)

당화

당화배지의 pH를 4.2의 pH로 고정시키는 것을 제외하고, 실시예 10을 반복한다.

0.17 DU/g.ds(당화배지의 건조물질 g당 효소단위)에 해당하는 글루코아밀라제의 양을 당화배지에 가하며, 사용된 글루코아밀라제는 솔베이엔자임스에서 상품명 DIAZYME L-200으로 판매하고 있다.

본 발명에 따른 실시예 12 에 있어서, 각각 0.0325 PUN/g.ds., 0.050PUN/g.ds., 0.075 PUN/g.ds. 와 0.10 PUN/g.ds. (당화 배지의 건조물질 그람당 플루라나아제의 효소단위)에 해당하는 플루라나아제의 여러가지 양을 실시예 2 에 서술된 바와같이 플루라나아제의 농축된 수용액(용액A)의 형태로 당화배지에 가한다.

비교예 13R은 플루라나아제를 첨가하지 않는 것을 제외하고, 실시예 12에 서술된 바와같이 행한다.

그 결과는 다음 표 7 에 요약했다.

이 실시예는 생성된 글루코오스의 퍼센트 증가를 관찰하기 위하여 사용하는뎨 필수직인 플루라나아제의 양이 0.0325 PUN/g.ds. 임을 나타낸다.

[표 7]

실시예 14

플라스미드 pUBDEBRA1의 구성

플라스미드 pUBDEBRA1(제 1 도)는 벡터 pUB131에 주입된 그 자신 전사촉진 유전자의 제어하에서 균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 플루라나아제를 부호화 하는 유전자를 함유한다. 플라스미드 pUBDEBRA1의 구성은 하술한 바와같다.

염색체의 DNA을 균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D(번호 LMG P-13056 으로 확인)의 배양물에서 추출하여 정제한다.

이를 위하여, 200㎖의 이 바실러스의 배양을 액체 MYE 배지에서 행한다(실시예 1).

이 배양물을 실현하여 정지상에 있을때, 이를 10분동안 5000rpm으로 원심분리 한다(BECKMAN JA-10 로터). 여기서 얻은 원심분리 펠릿을 pH8의 0.1M TRIS - HCl[HCl로 산성화 된 트리스(히드록시메틸)아미노메탄], 0.1M EDTA(에틸렌디아민테트라초산)와 18mg의 리조자임을 함유하는 0.15M NaCl로 이루어지는 9㎖의 완충제에 흡입시키고, 여기서 얻은 현탁액을 37℃에서 15분동안 배양한다.

여기서 얻은 용군체를 20분동안 50℃에서 10mg/㎖ RNAse의 용액 200㎕로 처리한다. 1㎖의 SDS의 10% 농도용액(황산도데실 나트륨)을 이 용군체에 가한다. 다음 이 용군체를 70℃에서 30분동안 배양한다.

용군체를 약 45℃로 냉각시킨 다음 20mg/㎖의 프로테인나아제 K 용액(즉석에서 제조) 0.5㎖을 이에 가한다.

용군체를 투명용액으로 얻을때까지 수동으로 교반하면서 45℃에서 배양한다.

페눌로한 몇몇 추출물을 이러한 조건하에 이 투명용액에서 다음 문헌에 서술된 적당한 경계면을 얻을때까지 분자-클로닝-연구소 매뉴얼-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-제 2 판, 1989, 페이지 E.3에 기술된 방법에 따라 행한다.

DNA를 20㎖의 에탄올로 침전시킨다. 침전물을 5분동안 5000rpm으로 원심분리하여 수집한 다음, 2㎖이 pH 8.0에서 TE 완충제(pH 8.0 에서 10mM TRIS-HCl, 1mM EDDTA)에 현탁시킨다.

여기서 얻은 DNA를 부분적으로 제한효소 Sau 3AI로 분해시킨다음, 이 실시예에서와 이 출원의 다른 모든 실시예에서 제한조건은 이들 제한조건이 다음 정제단계에서 DNA양을 충분히 얻기 위하여 인자 10까지 증가시키는 것을 제외하고는 SAMBROOK 등(P 5.23∼5.32)이 기술한 것이다.

사용된 DNA의 양과 효소 양 사이의 비율을 조정하여 5∼10KbP(KbP : 10³염기상) 크기의 최대 단편을 얻도록 한다.

여기서 얻은 조합된 단편을 SAMBROOK 등(P 6.01∼6.19)에 기술된 바와 같이 아가로우스 겔 전기이동(0.8%) 시킨다음 5∼10KbP 크기의 단편을 GENE CLEAN 방법에 의하여 단리하고 정제한다. 이들을 바이오랩스[클로테크 연구소(미국), 카타로그 번호 6210-1]에 의하여 판매되고 있는 플라스미드 pBR322과 접합시키고, Bam HI 부위에서 절단하고, SAMBROOK 등(p1.60∼1.61)에 기술된 바와같이 탈인산화한다. 이와 동일한 방법을 다른 실시예에서도 사용한다.

여기서 얻은 접합체를 전기이동화(SAMBROOK 등 P 1.75∼1.81)하여 이.콜리 MC1061 [클론테크 연구소, 카타로그 번호 : C - 1070-1]의 세포로 형질전환 시키고; 형질전환된 균주를 약 18시간동안 37℃에서 성장시킨후, LB(루리아-베르타니) 한천 배지와 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 페트리 접시에서 선택한다. LB 배지는 SAMBROOK 등(페이지 A. 4)에 기술되어 있다. 이 배지는 10g/ℓ의 트립톤, 5g/ℓ의 효모추출액과 10g/ℓ의 염화나트륨을 함유한다.

이들 접시에서 얻은 군체를 같은 배지의 두 접시에서 복제한다.

두 접시중 하나는 1%(W/V)의 한천, 100mM 초산나트륨(pH 4.5)와 0.1%(W/V)의 AZCL-플루란을 함유하는 한천배지로 덮는다. 18시간동안 60℃에서 배양한 후, AZCL-플루란 가수분해의 가장 큰 지역을 나타내는 군체를 확인하여 해당군체를 다른 복제된 접시에 단리시킨다.

따라서, 균주는 pBRDEBRA3라 불리우는 플라스미드를 추출하므로서 얻게된다. 약 4.6KbP의 플라스미드는 pBRDEBRA3의 EcoRI-Bam HI 단편은 플라스미드 pBRDEBRA3를 Bam HI 와 EcoI로 이중 소화시키고, 아가로우스 겔전기이동(0.8% W/V)에 의하여 얻는다. 이 단편은 벡터 pUB131 (유럽특허출원 0 415 296 에 기술되어 있음)와 접합시키는데, 이는 미리 숙주로서 균주 바실러스 서브틸리스 PSL1를 사용하여 Bam HI 와 EcoRI 부위에서 Bam HI 와 EcoRI 와 이중 소화시킨 것이다.

균주 바실러스 서브틸리스 PSL1은 번호 1A510으로 B.G.S.C. 기탁소(미국, 오하이오 주립대학교, 바실러스 유전자 저장센터)에서 얻을 수 있다.

여기서 얻은 플라스미드 pUBDEBRA1은 알카리성 용균작용방법(SADMBROOK 등, P 1.25∼1.28)에 의하여 형질 전환된 PSL1 세포에서 단리시켜 정제한다. 이와같은 방법은 다른 실시예에서도 사용한다.

바실러스 서브틸리스의 모든 형질전환된 균주는 플루라나아제를 나타낼 수 있고 플루라나아제를 분비할 수 있다.

플라스미드 pUBDEDBRA1을 함유하는 형질전환된 PSL1 균주를 LB 배지를 함유하는 페트리 접시에서 25㎍/㎖의 카나마이신으로 재배양한다.

AZCL-플루란(0.1% 중량/체적)과 초산나트륨(100mM, pH 4.5)을 함유하는 아가로우스(1% 중량/체적)의 최상층으로 덮는다. 18시간 동안 60℃에서 배양한 후, 형질전환된 균주의 모든 군체는 AZCL-플루란의 가수분해 무리로 둘러싸임을 알 수 있다.

실시예 15

균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl의 제조

바실러스 리케니포르미스 SE2 숙주의 알카리성 프로테아제의 유전자 말단부의 확인

이 실시예는 바실러스 리케니포르미스 SE2의 상기 유전자를 삭제하기 위하여삭제 플라스미드를 제조하기 위한 바실러스 리케니포르미스 숙주의 알카리성 프로테아제 유전자의 말단부의 확인에 관한 것이다.

1.비. 리케니포르미스 SE2 로부터 염색체 DNA의 추출

바실러스 리케니포르미스 SE2의 염색체 DNA의 알카리성 프로테아제 유전자를 단리시키기 위하여 배지가 LB 배지를 함유하고 정제되는 것을 제외하고는, 염색체 DNA을 추출하기 위한 실시예 14 에 기술된 방법에 따라서 염색체 DNA을 먼저 추출한다.

2.알카리성 프로테아제 유전자의 C-말단부의 확인

추출된 염색체 DNA을 분자클로닝 - SAMBROOK 등 (P 1.85)와 분자 클로닝, 연구소 매뉴얼, 매니아티스 등, 1982, 코울드 스프링 하아버 연구소 P 374∼379에 기술된 제한분석으로 분석한다. 이들 소화로 부터 얻은 DNA 단편을 0.8%(중량/체적) 아가로우스겔에서 이들의 크기에 따라 분리한다.

아가로우스겔을 사우던 블로트(SOUTHERN BLOT) 방법(SAMBROOK 등, P9.31)에 기술된 방법으로 분석하여 알카리성 프로테아제 유전자의 C-말단부의 누클레오티드 배열을 함유하는 단편을 확인한다.

잡종형성에 사용하는 구성된 시료는 알카리성 프로테아제 유전자의 C-말단부에 해당하는 합성 올리고 누클레오티드이다. 합성 올리고 누클레오티드를 구성하는데 사용되는 방법은 BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER 장치에서 β-시아노에틸-포스포아미디트를 사용하여서 하는 비유케이지, 에스. 엘. 등 (1981), 테트라헤드론 논문, 22, P 1859∼1882에 기술되어 있다. 구성되는 합성 올리고 누클레오티드 배열은 다음과 같다(SEQ ID NO:2) :

5'-GGCGGAGCAAGCTTTGTGG-3'

이들 결과는 알카리성 프로테아제 유전자의 C-말단부가 약 2.7KbP의 PstI 단편에 위치함을 나타낸다.

DNA 시료의 잡종형성은 분자 클로닝-SAMBROOK 등-P 9.52∼9.55에 기술되어 있는 방법에 따라서 행한다. 이와 동일한 방법을 다른 실시예에서도 사용한다.

바실러스 리케니포르미스 SE2 균주에서 나온 추출된 염색체 DNA의 제조는 효소 PstI로 소화시켜서 한 다음 얻은 단편을 아가로우스 겔 전기이동(0.8%)에 의하여 이들의 크기에 따라 분리한다.

약 2.7 KbP의 얻은 PstI 단편을 겔에서 추출하고 유리구슬을 사용하고 바이오 101 회사(미국)에 의하여 판매되고 있는 소위 "진크린(GENE CLEAN)"이라 불리우는 방법으로 정제한다.

2.7KbP의 Pst1 단편을 먼저 PstI 부위에서 소화되고 탈인산화되는 플라스미드 pUC18(클론테크 연구소 NO. 6110-1)와 접합시킨다(SAMBROOK 등 P 1.68∼1.69). 여기서 얻은 접합체를 Call₂로 하는 방법(SAMBROOK 등, P1.82∼1.84)에 의하여 에스케리키아 콜리 MC 1061의 세포로 형질전환 시킨다. DNA 단편을 탈인산화 하거나 벡터를 선형화 하는 방법은 SAMBROOK 등(P 1.60∼1.61)에 서술되어 있다. 또한, 접합방법도 SAMBROOK 등(P 1.68∼1.69)에 서술되어 있다.

형질전환된 균주를 100㎍/㎖의 암피실린으로 보충된 LB 한천배지를 함유하는 페트리 접시에 선택한다. 여기서 얻은 이. 콜리 MC 1061로 출발한 형질전환된 균주를 사우던 연구소에서 사용된 C-말단 시료를 사용하여 표지된 합성 올리고 누클레오티드와의 잡종형성에 의하여 선택한 다음 플라스미드 pKC1을 단리시킨다.

합성 올리고 누클레오티드를 파아지 T4의 T4 폴리누클레오티드 키나아제를 사용하여^32Pσ-ATP와 인산화 하여서와 SAMBROOK 등(P 11.31∼11.33)에 서술된 방법에 따라서 표지한다.

3.알카리성 프로테아제 유전자의 N-말단부의 확인

추출된 염색체 DNA를 제한 분석한다. 이들 소화에서 얻은 DNA 단편을 0.8% 아가로우스 겔에서 이들의 크기에 따라 분리한다.

아가로우스 겔을 사우던 블로트 방법으로 분석하여 알카리성 프로테아제 유전자의 N-말단부의 누클레오티드 배열을 함유하는 단편을 확인한다.

잡종형성에 사용되는 시료는 알카리성 프로테아제 유전자의 N-말단부에 해당하는 합성 올리고 누클레오티드이고, 구성되는 합성 올리고 누클레오티드의 배열은 다음과 같다(SEQ ID NO:3):

5'-ATGGCTCCTGGCGCAGGC-3'

이러한 결과는 알카리성 프로테아제 유전자의 N-말단부가 약 5.5KbP의 PstI 단편과 또한 약 KbP의 더 적은 BclI-PstI 단편에 위치함을 나타낸다. 이 단편은 제한부위 xbaI, cLAi, HpaI 과 SphI는 함유하지 않는다.

바실러스 리케니포르미스 SE2의 균주에서 나온 추출된 염색체 DNA의 제조는 효소 PstI로 소화시킨 다음 얻은 단편을 아가로우스 겔 전기이동(0.8%)에 의하여 이들의 크기에 따라 분리하는 것이다.

약 5.5KbP의 얻은 단편을 겔에서 추출하여 소위 "GENE CLEAN"이라 불리는 방법(BIO 101 회사)으로 정제한다.

여기서 얻은 5.5KbP의 PstI 단편을 일련의 BclI, XbaI, ClaI, HpaI 와 SphI로 소화시킨다. 여기서 생성된 DNA 단편을 Bam HI 와 PstI 에 의하여 먼저 선형화 된 플라스미드 PMK4 [술리반등 (1984) 유전자 29 P1-26에서 서술된 것]와 접합시킨다. 플라스미드 pMK4는 번호 1E29로 B.G.S.C. 기탁소(미국 오하이오 콜럼버스 바실러스 유전자 저장센터(오하이오 주립대학))에서 얻을 수 있다.

여기서 얻은 접합체를 CaCl₂로 하는 방법에 의하여 에스케리키아 콜리 MC 1061의 세포로 형질전환시킨다.

형질전환된 균주를 100㎍/㎖의 암피실린으로 보충된 LB 한천 배지를 함유하는 페트리 접시에 선택한다.

여기서 얻은 이. 콜리 MC 1061 에서 출발한 형질 전환된 균주를 사우던 연구소에서 N-말단 시료를 사용하여 표지한 합성 올리고 누클레오티드로 잡종 형성시켜서 선택하고 플라스미드 pKP1을 단리한다.

실시예 16

알카리성 프로테아제의 배열

플라스미드 pKP1 과 pKC1에 주입된 단편의 배열을 SAMBROOK 등에 의하여 기술된 방법(P 13.15 와 13.17 및 제 13.3B 도)에 따라서 PstI 부위에서 부터 SacI 부위까지 측정한다.

실시예 17

플라스미드 pLD1의 구성

균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 dclapL을 제조하기 위하여 플라스미드 pLD1(제 2 도)을 구성한다. 플라스미드 pLD1의 구성은 하술한 바와같다.

플라스미드 pKP1(실시예 15 에서 얻은 것)은 이. 콜리 MC 1061에서 불안정하다. 이러한 이유로 비. 리케니포르미스 SE2의 알카리성 프로테아제 유전자의 N-말단부를 함유하는 염색체 DNA 단편을 벡터 pACYC184(미국 바이오랩스, 번호 #401-M)에 주입시킨다. 이러한 주입은 플라스미드의 1849bp의 EcoRI-EcoRI 단편을 플라스미드 pACYC184의 EcoRI 부위에 주입시켜서 행하고, 접합을 사용하여 이. 콜리 MC 1061의 세포를 형질전환 시킨다. 여기서 플라스미드 pKPN11을 얻는다.

형질 전환된 균주를 12.5㎍/㎖의 테드라시클린으로 보충된 LB 한천배지를 함유하는 페트리 접시에 선택한다. 플라스미드 pKPN11에서 1849bp의 EcoRI-EconI의 배향은 제한분석에 의하여 측정한다(SAMBROOK 등, P 1.85 와 MANIATIS 등, P 374∼379).

플라스미드 pKPN12는 다음과 같은 방법으로 얻는다 : 플라스미드 pKPN11의 1671bp의 StyI-StyI 단편을 StyI로 소화시켜서 제거한 다음, 미리 제조한 다음과같은 합성 이중-스트랜드 DNA로 이 단편을 대치한다:

제한 효소로 하는 플라스미드의 소화는 SAMBROOK 등 - 1989- 5.28∼5.32장에 서술된 방법에 따라서 행한다.

카나마신에 대한 내성과 블레오마이신 또는 플레오마이신에 대한 내성을 부호화 하는 플라스미드 pUB131에서 나온 DNA 단편은 다음과 같이 얻는다:

카나마이신에 대한 내성과 블레오마이신 또는 플레오마이신에 대한 내성을 부호화 하는 유전자를 갖는 2666bp의 PstI-TaqI 단편을 플라스미드 pUB131의 PstI-TaqI의 이중 소화로 얻는다. 이 단편을 플라스미드 pBS-의 PstI-AccI 부위(번호 211202, 미국 STRATAGENE)에 주입한다. 여기서 플라스미드 pBSKMPM을 얻는다.

플라스미드 pBSKMPM을 제조하는 동안, 플라스미드 pBS-로 결합 영역에서 작은 삭제가 나타나는데, 이는 플라스미드 pBSKMPM에서 SphI 과 PstI의 손실을 일으킨다. 플라스미드 pBSKMPM을 사용하여 두 합성 누클레오티드를 주입하기 위한 부위-관련 돌연변이 유발을 효과적으로 하는데 사용되는 단일-스트랜드 DNA을 생성시키고, 두 합성 누클레오티드의 SmaI 부위는 하나는 카나마이신과 플레오마이신에 대한 내성을 갖는 유전자 앞에 다른 하나는 후에 위치한다.

부위-관련 돌연변이 유발방법은 SAMBROOK 등 - P 15.74∼15.79에 기술되어 있다. 이는 바이오-패드에 의하여 판매되고 있는 돌연변이 유발키트(NO.170∼3576)를 사용한다.

돌연변이 유발에 사용된 합성 올리고 누클레오티드의 배열은 다음과 같다(각각 SEQ ID NO:6 과 SEQ ID NO:7) :

두 올리고 누클레오티드의 존재하에서 이 돌연변이 유발에 의하여 얻은 플라스미드는 플라스미드 pBSKMPM이다. 이 플라스미드는 카나마이신과 플레오마이신에 대한 내성을 부호화 하는 유전자를 함융가는 DNA 단편을 단리하는 두 SmaI 제한부위를 함유한다.

플라스미드 pBSKMPM1의 1597 bp의 SmaI-SmaI단편을 플라스미드 pKPN12의 SmaI 부위에 주입하면서 플라스미드 pKPN14를 얻는다.

플라스미드 pKPN14에 주입된 단편의 적당한 배양은 제한분석에 의하여 플라스미드 DNA을 제조하는데 선택하므로서 실증된다(SAMBROOK 등 P 1.85).

플라스미드 pKC1에 존재하고 알카리성 프로테아제의 N-말단배열전에 위치하는 DNA 단편을 처음에 HindIII로 소화시켜서 1.2KbP의 플라스미드 pKC1(실시예 15 에서 얻은 바와같다)의 SacI-HindIII 단편에서 단리시킨다.

HindIII의 투영 5' 말단을 DNA 중합효소의 클리노우 단편으로 처리하여 둔단으로 되게 한다(SAMBROOK 등 - P F.2∼F.3).

따라서, SacI 제한을 작용시켜서 원하는 둔단 SacI-HindIII 단편을 제조한다. 이 단편을 플라스미드 pLID1을 생성시키는 플라스미드 pKPN14의 HpaI 와 SacI 부위에 주입시킨다.

이들 구성 모두는 형질 전환된 균주를 선택하기 위한 테트라시클린(12㎍/㎖)의 존재하에 균주 이. 콜리 M 1061 을 형질전화 시키므로서 일어난다.

비. 서브틸리스 에서와 비. 리케니포르미스에서 번식시킬 수 있는 플라스미드는 이. 콜리의 복제기능을 대치하므로서, 플라스미드 pLID1에서 구성되고, 이는 바실러스의 복제기능을 갖는 단편 : 플라스미드에서 단리된 2238bp의 단편 BglII-BamHI 에 의하여 플라스미드 pLID1의 3623pb의 BgLII-BglI 단편으로 행한다.

이러한 바실러스 세포에 의한 이. 콜리의 복제기능의 대치는 BglII 와 BamHI 로 플라스미드 pLID1을 소화시켜서 플라스미드 pLID1에서 3.6KbP의 BglII-BglII 단편을 먼저 단리시켜서 행한다. 보충 BamHI 소화가 필요하고, 실제 BglII 단독 소화는 아가로우스 겔 전기이동에 의하여 분리될 수 없는 동일 크기의 단편을 가져온다. 따라서 3.6KbP의 BglII-BglII 단편을 플라스미드 pLD1을 생성하면서, 플라스미드 pUB131에서 단리되는 2238bp의 단편 BglII-BamHI 에서 바실러스 서브틸리스 SE3의 균주로 클론화 된다.

균주 바실러스 서브틸리스 SE3 는 부다페스트 협약에 따라 변호 LMGP-14035로 벨기에왕국 미생물 기탁협회라 불리우는 기탁소에 1993. 6. 21자 기탁했다.

실시예 18

바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl의 구성

균주 바실러스 리케니포르미스 SE2의 염색체 DNA 에서 원하는 수정은 동종재조합을 기초로 한 방법으로 실시한다. 수정을 실시하여 균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl을 제조한다.

바실러스의 분자 생리학적 방법(P 150∼151)에 서술된 원형질체 방법에 의하여서와, 다음 수정을 제외하고 언급한 조건하에서 플라스미드 pLD1을 비. 리케니포르미스 SE2 에서 형질 전환한다 :

기술한 공정 단계 7 에서 언급한 바와같이 리조자임 분말을 SMMP 에 1mg/㎖ 대신에 5mg/㎖의 양으로 가하고, 리조자임으로 최대 용균작용을 얻는 잠복기간은 60분으로 하고, 200㎍/㎖의 카나마이신을 함유가는 DM3 배지[바실러스의 분자 생리학적 방법(하아우드등) 죤 윌리와 선스(1990), P150∼151에 기술됨]에서 재생을 행한다.

형질 전환된 균주를 단리하고 이 균주에 주입된 플라스미드 pLD1의 제한 효소지도를 확인한다.

형질전환된 균주를 37℃에서 18시간 동안 2g/ℓ의 글루코오스와 25㎍/㎖의 카나마이신으로 보충된 50㎖의 LB 배지에서 배양한다.

배양물의 시료(0.1㎖)를 취하여 50㎖의 동일한 LB 배지를 함유하는 삼각 플라스크에 접종시키는데 사용한다. 배양물을 18시간동안 37℃에서 배양한다. 이 배양물의 시료를 취하여 25㎍/㎖의 카나마이신과 1%(중량/체적)의 탈지우유(DIFCO)로 보충된 LB 한천배지를 함유하는 페트리 접시에서 시험하여 프로테아제의 존재를 검색한다.

이들 페트리 접시에서 성장을 나타내는 군체주위에 가수분해 무리가 없는 것은 이들 군체가 알카리성 프로테아제를 생성시킬 수 없음을 나타내는 것이다.

균주(apr', km') 즉, 알카리성 프로테아제(apr')와 카나마이신(km')에 대한 내성을 더 이상 일으키지 않는 것을 얻을때까지 배양과 시험을 반복한다.

이 바실러스 리케니포르미스의 균주에 존재하는 플라스미드 pLD1을 항생물질 없이 37℃하에 성장배지에서 배양하여 이로부터 제거한다.

이러한 균주를 37℃에서 18시간 동안 2g/ℓ의 글루코오스로 보충된 50㎖의 LB 배지에서 배양한다. 이 배양물을 1㎖의 체적을 취하여 50㎖의 동일 배지를 함유하는 다른 삼각플라스크에 접종하는데 사용하고, 배양을 37℃에서 18시간 계속한다. 시료를 취하여 LB 배지를 함유하는 페트리 접시에 전개한다. 단리된 군체를 25㎍/㎖의 카나마이신으로 보충된 LB 배지의 두번째 접시에서 재배양한다. 카나마이신(Km⁸)에 민감한 균주를 단리시킨다. 이의 표현형을 확인한다(apr', Km⁸).

이 균주의 염색체 DNA를 단리하여 정제한 다음 염색체 삭제구조를 사우선 블로트 방법으로 확인한다.

알카리성 프로테아제의 유전자에서 (5')앞과 (3')후에 위치하는 배열에서 동종 이중 재조합에 의하여 일어나는 이들의 위치를 생각하여 확인된 삭제를 정정한다.

얻은 균주를 비. 리케니포르미스 SE2 delapl 이라 부르고, 이는 알카리성 프로테아제를 생산하지 못한다.

실시예 19

합성벡터로 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl의 형질전환

실시예 14 에 서술된 플라스미드 pUBDEBRAl(제 1 도)을 이의 숙주에서 추출하고, 단리하고 정제한다(SAMBROOK 등, 1989, P 1.25∼1.28).

실시예 18 에 서술된 균주 비. 리케니프로미스 SE2 delapl의 배양물을 제소하고 이 균주를 MANIATIS 등에 의하여 기술된 원형질체 방법(P 150∼151)에 따라서, 이 플라스미드로 형질전환 시킨다.

형질전환된 균주를 페트리 접시에 선택하고, 단리시키고 선별하여 정제한다.

실시예 20

비. 리케니포르미스 SE2 delapl(pUBDEBRA1)에 의한 플루라나아제의 제조

실시예 19 에서 얻은 바와같이 플라스미드 pUBDEBRA1에 의하여 형질전환된 균주 비. 리케니포르미스 SE2 delapl을 0.5%(W/V)의 글루코오스와 20㎍/㎖의 카나마이신으로 보충된 예비배양물 LB 배지에서 37℃에서 17시간 동안 배양한다. 이 예비배양물을 20㎍/㎖의 카나마이신으로 보충된 50㎖의 M2 배지에 전이시킨다(5% V/V). M2 배지는 30g의 콩분말, 75g의 용해성 전분, 2g 의 황산나트륨, 5mg 의 염화마그네슘, 3g 의 NaH₂PO₄, 0.2g 의 CaCl₂·H₂O와 1000㎖의 물을 함유한다. 이 M2 배지의 pH 는 이를 살균하기 전에 10N NaOH 로 5.8로 조정한다. 배양물을 37℃에서 80시간동안 교반하면서 배양한다. 80시간 후, 생체물을 10분 동안 5000rpm으로 원심분리하여 제거한다. 원심분리에서 나온 상청액을 유지한다. 이 상청액의 효소활성도를 측정하고 플루라나아제 활성도의 존재를 기록한다.

실시예 21

바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl(pUBCDEBRA11DNSI)염색체 집성의 구성

이 실시예는 플루라나아제를 균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl의 염색체로 부호화 하는 유전자의 집성에 관한 것이다.

이를 위하여 4.6Kb의 플라스미드 pBRDEBRA3의 EcoRI-BamHI 단편을 균주 이. 콜리 MC 1061의 형질전환에 의하여 pUBC131의 EcoRI 와 BamHI 부위로 클론화하여, 플라스미드 pUBCDBRA11을 발생시킨다.

집성벡터 pUBCDEBRA11DNSI (제 3 도)를 88bp의 플라스미드 pUBCDEBRA11의 NsiI-nsI 단편을 삭제시켜서 구성한 다음, 여기서 얻은 플라스미드는 886bp의 NsiI 단편의 상실로 인하여 바실러스에서 그 자체 복제가능성을 상실한다.

이 구성을 실행하기 위하여, 플라스미드 pUBCDEBRA11을 NsiI 제한효소로 분해하고 약 0.4KbP의 NsiI-NsiI 단편을 아가로우스 겔 전기이동으로 정제한다. 이 단편을 접합시켜서 이를 재순환시킨다. 접합체를 이. 콜리 MC 1061 로 형질전환시켜서 플라스미드 pUBCDEBRA11DNSI1을 얻는다.

플라스미드 pUBCDEBRA11DNSI1을 균주 비. 리케니포르미스 SE2 delapl에 집성시키기 위하여 이 플라스미드가 염색체 DNA 와 동종인 DNA 단편을 갖는 것이 필요하다. 따라서, 비. 리케니포르미스에서 나온 염색체 Sau3AI 단편을 집성벡터 pUBCDEBRA11DNSI121 BamHI 부위로 클론화 한다.

이를 위하여 균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl에서 추출된 염색체 DNA을 Sau 3AI 제한효소로 부분적으로 분해시킨다. 1.5∼3Kb 크기의 DNA 단편을 아가로우스 겔로 정제한 다음 BamHI 제한효소에 의하여 분해된 플라스미드 pUBCEDBRA11DNSI와 접합시키고 탈인산화 한다. 여기서 얻은 접합체를 전기 이동화에 의하여 MC 1061 의 세포로 형질전환 시킨다. 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지에 선택한 후, 약 3000 군체를 얻는다. 이들 군체 모두를 LB 배지에 현탁시키고 플라스미드를 알카리성 용균법으로 추출한다(SAMBROOK 등 P 1.25∼1.28).

여기서 제조한 플라스미드를 원형질체법에 의한 형질전환에 의하여 균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl에 주입한다. 형질전환된 세포를 플레오마이신 (17㎍/㎖)에 대한 이들의 내성을 갖는 DM3 재생배지[바실러스의 분자 생리학적 방법(하우드. 시. 알. 과 커팅. 에스. M) 제이. 윌리와 선스 1990 P 150∼151]에 선택하며, 이는 상기에서 구성한 플라스미드중 하나의 염색체 집성에 의하여서만 이들에 부여될 수 있다.

여기서 얻은 군체를 50㎍/㎖의 플레오마이신과 0.06%의 AZCL-플루란으로 보충된 LB 안전 배지에서 재배양한다. AZCL-플루안의 가장 큰 가수분해 무리를 갖는 군체를 단리한 다음 LB 한천 배지에서 재배양한다.

이 균주의 플라스미드 함량을 추출한다. 여기서 얻은 제품을 아가로우스 겔 전기이동에 의하여 분석하고, 여기서 플라스미드가 존재하지 않음을 나타낸다.

염색체 DNA를 실시예 14 와 같이 추출하고 정제하고 사우던 방법으로 분석하는데, 이는 플라스미드 pUBCDEBRA11DNSI 가 약 3Kb의 Sau 3AI 단편으로 동일한 재조합에 의하여 염색체 DNA에 집성되는 것을 나타낸다.

이것은 비. 데라미피칸스의 플루라나아제를 부호화하는 유전자가 염색체에서집성된 상태로 비. 리케니포르미스로 표현되는 것을 입증한다.

실시예 22

균주 바실러스 리키네포르미스 SE2 delapl(pUBCDEBRA11DNSI)에 의한 플루라나아제의 제조방법

실시예 21 에서 얻은 바와같이 염색체 DNA에서 집성된 형태로 플루라나아제의 유전자를 함유하는 균주 비. 리케니포르미스 SE2 delapl 을 0.5%(W/W)의 글루코오스와 5㎍/㎖의 플레오마이신으로 보충된 예비배양물 LB 배지에서 37℃로 17시간동안 배양한다. 이 예비배양물 10㎖의 체적을 배플 플라스크에서 5㎍/㎖의 플레오마이신으로 보충된 250㎖의 M2 배지(실시예 20 에 서술되어 있다)에서 접종시킨다.

여기서 얻은 모든 배양물을 37℃에서 교반하면서 24시간 동안 배양한 후 6.5리터의 M2 배지를 함유 하는 발효기에 주입한다. 발효를 37℃에서 72시간동안 계속한다. 농인산을 첨가하여 pH를 7.0 이하의 값으로 유지하고, 공기유속을 4리터/분으로 유지하고 교반을 조정하여 포화 함량인 30%(V/V) 이상의 용해된 산소함량을 얻도록 한다.

솔베이 도이취란드에 의하여 OPTIFLOC? FC205의 상품명으로 판매되고 있는 폴리아민을 주성분으로 한 50㎖의 응집제를 얻은 배양물에 첨가한 후, 생체물을 15분동안 5000rpm으로 원심분리(BECKMAN JA-10)에 의하여 제거하고 얻은 상청액을 1MHCl의 용액을 pH 4.5로 산성화한다.

5000 달톤의 재용해 범위를 갖는 막이 장치된 한외여과 유니트를 사용하여 한외여과하여 1리터의 최종체적으로 상청액을 농축시킨다.

이 농축된 용액에 아세톤을 가하여 최종농도를 60%(V/V)로 한다. 형성된 현탁액을 2시간동안 4℃에서 배양한 다음 15분동안 8000 rpm으로 원심분리한다 (BECKMAN JA-10). 얻은 원심분리 잔재를 pH 4.5 에서 상품명 MALTRIN? 250(그레인 프로세싱 코포레이션)의 전분 30%(W/V), 0.3%(W/V)의 벤조산 나트륨과 0.15%(W/V)의 소르브산 칼륨을 함유하는 100㎖의 수용액에 현탁시킨다. 여기서 얻은 재조합 균주에 의하여 생성된 플루라나아제의 정제품을 용액D 라 부른다.

환원성 당분법에 의하여 측정된 용액D 의 플루라나아제의 활성도는 150PUN/㎖ 이었다.

실시예 23

온도에 대한 균주 바실러스 리케니포르미스 SE2 delapl(pUBCDEBRA11DNSI)에 의하여 생성된 플루라나아제의 안정성

실시예 22 에서 얻은 플루라나아제의 용액D 를 희석하여 pH 4.75하에 0.05M 시트르산염/인산염 완충제에서 10∼150PUN/㎖의 효소활성을 일으키도록 한다.

플루라나아제를 함유하는 이 회석용액을 시험관 당 5㎖의 회석용액의 양으로 9개의 시험관으로 나눈다.

희석용액을 함유하는 여러가지 관을 75분동안 40∼80℃의 온도에서 물중탕에서 배양한다.

이 배양후에 관을 급냉시키기 위하여 얼음욕에 넣는다.

여러가지 용액의 효소활성도를 측정한다(측정조건: 60℃의 온도, 4.5의 pH, 15분의 배양기간).

이 시험의 과정에서, 최대 효소활성도는 약 7.45의 pH 에서와 약 55℃의 온도에서 위치하는 시료에 대하여 측정한다. 따라서 100%의 상대 효소활성도가 이 시료에 있다고 간주된다.

그 결과를 요약하면 다음 표 12 와 같다.

[표 12]

이 실시예는 기질없이 65℃이거나 그 이하의 온도범위에서 4.75의 pH하에 75분 배양한후 측정된 최소한 80%의 상대 효소활성을 갖는 것을 나타낸다.

제 1 도는 플라스미드 pUBDEBRA1의 제한효소지도를 나타내고,

제 2 도는 플라스미드 pLD1의 제한효소지도를 나타내며,

제 3 도는 플라스미드 pUBCDEBR11DNSI의 제한효소지도를 나타내며,

제 4 도 (제 4a 내지 4f 도)는 성숙한 플루라나아제를 부호한 누클레오티드배열(SEQ ID NO:10)과 아미노산(SEQ ID NO:11) 으로 이의 번역을 나타내며,

제 5 도는 Bam HI 부위내지 플라스미드 pUBCDEBRA11의 DNA 단편의 누클레오티드 배열(SEQ ID:8)과, 신호의 아미노산(SEQ ID NO:9)으로 번역과 플루라나아제의 성숙한 배열을 나타낸다.

Claims

균주 바실러스 데라미피칸스에 의하여 또는 이 균주의 유도체나 돌연변이체에 의하여 제조됨을 특징으로 하는 플루라나아제.
N-발단배열(SEQ ID NO:1)이 다음과 같이 아미노 카르복실 감응에서와 좌에서우로 위치함을 특징으로 하는 플루라나아제:
도 4(SEQ ID NO:11)에 예시된 바와 같은 1∼928 아미노산의 아미노산 배열 또는 이로부터 유도된 수정배열로 이루어짐을 특징으로 하는 단리되고 정제된 플루라나아제.
299 아미노산의 부가적 배열(SEQ ID NO:12)을 함유하는 전구물질의 형태로 합성함을 특징으로 하는 플루라나아제.
야생상태의 알카리성 프로테아제를 부호화 하는 유전자를 함유하는 바실러스속의 미생물로 이종방법에 따라 바실러스속의 미생물에서 삭제된 알카리성 프로테아제를 부호화 하는 유전자를 제조함을 특징으로 하는 플루라나아제.
호기성 조건하에서 탄소 및 질소급원과 무기염을 함유하는 적당한 배양기에서 플루라나아제를 제조하고 얻은 플루라나아제를 수확할 수 있는 균주 바실러스 데라미피칸스 또는 이 균주의 유도체의 배양으로 이루어짐을 특징으로 하는 제 1 항 또는 제 4 항중 어느 한 항에 따른 플루라나아제의 제조방법.
플루라나아제를 부호화 하는 DNA 단편의 단리, 이 DNA 단편을 적당한 벡터에 삽입, 이 벡터를 적당한 숙주에 주입 또는 이 DNA 단편을 적당한 숙주의 염색체에 주입, 이 숙주의 배양, 플루라나아제의 합성과 플루라나아제의 수확으로 이루어짐을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 따른 플루라나아제의 제조방법.
바실러스 데라미피칸스의 플루라나아제를 부호화 하는 누클레오티드배열(SEQ ID NO:10) 또는 이로부터 유도되는 수식된 배열로 이루어지는 DNA 분자.
제 8 항에 있어서, 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 플루라나아제의 전체유전자(SEQ ID NO:8)로 이루어짐을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 8 항에 따른 DNA 분자를 함유하는 합성벡터 pUBDEBRAL 또는 염색체 집성벡터 pUBCDEBRA11DNSI.
합성벡터 pUBDEBRA1.
염색체 집성벡터 pUBCDEBRA11DNSI.
제 8 항에 따른 DNA 분자를 함유하는 바실러스 리케니포르미스의 형질전환된균주.
제 10 항에 따른 합성벡터 또는 염색체 집성벡터를 함유하는 바실러스 리케니포르미스의 형질전환된 균주.
합성벡터 pUBDEBRA1 또는 염색체 집성벡터 pUBCDEBRA11DNSI를 함유하는 바실러스 리케니포르미스의 형질전환된 균주.
제 13 항, 제 14 항 또는 제 15 항에 따른 바실러스.리케니포르미스의 형질전환된 균주에 의하여 제조된 플루라나아제.
바실러스 데라미피칸스의 단리되고 정제된 배양물과 이로부터 유도되거나 돌연변이된 배양물.
균주 바실러스 데라미피칸스 T 89.117D(LMG P-13056) 또는 이 균주의 유도체나 돌연변이체에 의하여 제조됨을 특징으로 하는 플루라나아제.
바실러스 데라미피칸스 T 89.117D의 단리되고 정제된 배양물과 이로부터 유도되거나 돌연변이된 배양물.