FI116531B - Pullulanaasi, sitä tuottavia mikro-organismeja, menetelmiä pullulanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö - Google Patents

Pullulanaasi, sitä tuottavia mikro-organismeja, menetelmiä pullulanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI116531B
FI116531B FI935900A FI935900A FI116531B FI 116531 B FI116531 B FI 116531B FI 935900 A FI935900 A FI 935900A FI 935900 A FI935900 A FI 935900A FI 116531 B FI116531 B FI 116531B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
pullulanase
asp
gly
thr
asn
Prior art date
Application number
FI935900A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI935900A0 (fi
FI935900A (fi
Inventor
Antoine Amory
Philippe Deweer
Original Assignee
Genencor Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from BE9201156A external-priority patent/BE1006483A3/fr
Priority claimed from BE9300744A external-priority patent/BE1007313A3/fr
Priority claimed from BE9301278A external-priority patent/BE1007723A6/fr
Application filed by Genencor Int filed Critical Genencor Int
Publication of FI935900A0 publication Critical patent/FI935900A0/fi
Publication of FI935900A publication Critical patent/FI935900A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI116531B publication Critical patent/FI116531B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Mechanical Means For Catching Fish (AREA)
  • Selective Calling Equipment (AREA)

Description

116531
Pullulanaasi, sitä tuottavia mikro-organismeja, menetelmiä pullulanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö
Keksintö koskee uutta pullulanaasia. Keksintö kos-5 kee samoin uusia mikro-organismikantoja, jotka tuottavat tätä pullulanaasia, ja menetelmiä tämän pullulanaasin valmistamiseksi. Keksintö koskee samoin sen käyttöjä ja sitä käsittäviä koostumuksia. Keksintö koskee samoin DNA-molekyyliä, joka sisältää tämän pullulanaasin geenin, 10 ja ilmentämisvektoria, joka sisältää tämän DNA-molekyylin ja joka on käyttökelpoinen pullulanaasin ilmentämiseksi Bacillus-kannoissa.
Tärkkelys, jonka oleelliset rakenneosat ovat amy-loosi ja amylopektiini, voidaan muuttaa yksinkertaisiksi 15 sokereiksi entsymaattisella menetelmällä, joka toteutetaan kahdessa vaiheessa: vaihe, jossa tärkkelys nesteyte-tään, ja vaihe, jossa nesteytetty tärkkelys sokeroidaan. Jotta saavutettaisiin tärkkelyksen korkea konversiotaso, on jo ehdotettu a-1,6-glukosidisidoksia hydrolysoivan ent-20 syymin, kuten esimerkiksi pullulanaasin, lisäämistä nes-teytetyn tärkkelyksen sokeroinnin aikana.
.···. EP-patenttijulkaisussa 0 063 909 kuvataan entsyymi.’ miä, jonka sanotaan olevan haarautumia katkaiseva, eli !'; kykenevä hydrolysoimaan amylopektiinin a-1,6-glukosidisi- / 25 doksia, ja jolla on pullulanaasiaktiivisuutta ja jonka • ! · : aktiivisuuden pH-optimi on 4 - 5 60 °C:ssa. Tämä entsyymi ·* .* on peräisin Bacillus acidopullulyticus-kannasta.
v * Lisäksi US-patenttijulkaisussa 5 055 403 esitetään pullulanaasi, jolla on entsymaattista aktiivisuutta hap-: . ; 30 pamassa ympäristössä ja joka on saatu Bacillus naganoen- sis-kannasta. Tällä entsyymillä on aktiivisuusmaksimi pHrssa noin 5 60 °C:ssa mitattuna ja aktiivisuusmaksimi 1 * « noin 62,5 °C:n lämpötilassa mitattuna pH:ssa 4,5.
Vaikkakin alan teknisen tason mukaiset pullulanaa-: ' : 35 sit ovat aktiivisia happamassa pHrssa ja noin 60 °C:n 2 116531 lämpötilassa ja ovat siten käyttökelpoisia nesteytetyn I tärkkelyksen sokeroinnissa, niiden huono puoli on, että ne ovat erittäin epästabiileja tällaisissa lämpötila- ja ; pH-olosuhteissa, jolloin niiden puoliintumisaika 60 °C:n 5 lämpötilassa ja pH:ssa noin 4,5 substraatin puuttuessa on vain muutama kymmenen minuuttia.
Siten tällä hetkellä tarvitaan pullulanaasi, joka on käyttökelpoinen nesteytetyn tärkkelyksen sokeroinnissa ja joka on hyvin stabiili laajalla lämpötila- ja pH-alu-10 eella, ja erityisesti noin 60 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa noin 4,5.
Esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyttöön uusi pullulanaasi, joka on aktiivinen happamassa pH:ssa, jonka lämpöstabiilisuus happamassa pH:ssa on hyvin 15 paljon parempi kuin alan teknisen tason mukaisten pullulanaasien ja jonka puoliintumisaika on useita tunteja mainituissa olosuhteissa.
Esillä olevan keksinnön päämääränä on samoin identifioida, eristää ja antaa käyttöön kanta, ja erityisesti 20 Bacillus-kanta, joka tuottaa luonnollisesti mainittua pullulanaasia.
*': Esillä olevan keksinnön päämääränä on samoin eris- tää ja antaa käyttöön mainittua pullulanaasia koodittava . nukleotidisekvenssi.
: ,·, 25 Esillä olevan keksinnön päämääränä on samoin val- y‘,‘ mistaa ja antaa käyttöön ilmentämisvektori ja kromosomi- integraatiovektori, joka sisältää mainittua pullulanaasia *·’ * koodittavan nukleotidisekvenssin.
Esillä olevan keksinnön päämääränä on samoin val-: 30 mistaa ja antaa käyttöön Bacillus-isäntä, joka on trans- formoitu ilmentämisvektorilla tai integraatiovektorilla, joka sisältää Bacillus-kannan mainittua pullulanaasia ,··*, koodittavan nukleotidisekvenssin.
Tässä tarkoituksessa keksintö koskee pullulanaasia, 35 jonka on tuottanut jokin Bacillus-kanta, ja tarkemmin otta-; *.♦ en aerobinen ja ei-termofiilinen mikro-organismi kuten 3 116531
Bacillus deramificans. Keksinnön mukaiselle pullulanaasille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön muut kohteet on samoin määritelty oheisissa patenttivaatimuksissa. Edullisesti käytetään Bacillus dera-5 mificans-kantaa T 89.117D tai tämän kannan johdannaista tai mutanttia.
Edullisesti tämä pullulanaasi, eristettynä ja puhdistettuna, muodostuu yhdestä ainoasta polypeptidityypistä, jonka molekyylipaino on noin 100 ( + /- 10) kDa.
10 Lisäksi mainitun pullulanaasin N-pään sekvenssi (sekvenssi tunnusnro 1) on amino-karboksyylisuunnassa ja vasemmalta oikealle seuraava:
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Vai His 15 1 5 10
Tyr Phe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gin Pro 15 20
Keksintö koskee eristettyä ja puhdistettua pullu-20 lanaasia, joka käsittää aminohapposekvenssin aminohapot 1 -928 (sekvenssi tunnusnro 11) tai modifioidun sekvenssin, joka on tämän johdannainen. Tämä sekvenssi on mainitun '·. pullulanaasin täydellinen aminohapposekvenssi kuviossa 4 , ·, (4a - 4f) esitetyn mukaisesti.
; ,·# 25 Pullulanaasia koodittava täydellinen nukleotidi- • » · !!’.* sekvenssi (sekvenssi tunnusnro 10) sekä sen translaatio
* % I
aminohapoiksi esitetään kuviossa 4.
t · I
*·* * Erityisen edullisesti mainitun pullulanaasin iso- elektrinen piste on 4,1 - 4,5.
• » : 30 Keksinnön mukainen pullulanaasi on lämpöstabiili ja • « · aktiivinen laajalla lämpötila-alueella. Pullulanaasi on aktiivinen happamassa pH:ssa.
» » * ,···, Mainittu pullulanaasi kykenee katalysoimaan yhtä hyvin amylopektiinissä kuin pullulaanissa esiintyvien ’...· 35 a-1,6-glukosidisidosten hydrolyysiä. Se on siten entsyymi, I V jota voidaan sanoa haarautumia katkaisevaksi. Edullisesti 4 116531 mainittu pullulanaasi kykenee hydrolysoimaan tyypin a-1,6-glukosidisidoksia amylopektiinissä.
Edullisesti keksinnön mukainen pullulanaasi hajottaa pullulaanin maltotrioosiksi ja amylopektiinin amyloo-5 siksi.
Lisäksi esillä olevan keksinnön mukainen pullulanaasi hydrolysoi amylopektiinin muodostaen oligosakkarideja (malto-oligosakkarideja). Tämän hydrolyysin aikana todetaan muodostuvan oligosakkarideja, jotka muodostuvat 10 noin 13 glukoosiyksiköstä (polymerisaatioaste 13, tätä molekyyliä kutsutaan myös "A-ketjuksi"), minkä jälkeen muodostuu oligosakkarideja, jotka muodostuvat noin 47 glukoosiyksiköstä (polymerisaatioaste 47, tätä molekyyliä kutsutaan myös "B-ketjuksi").
15 Oligosakkaridit, joiden ketjut ovat A ja B, määri tellään viitaten julkaisuihin D.J. Manners, "Structural Analysis of Starch Components by Debranching Enzymes" ("Tärkkelyksen rakenneosien rakenneanalyysi haarautumia pilkkovilla entsyymeillä"), "New Approaches to Research on 20 Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, ss. 45 - 54, ja B.E. Enevoldsen, "Aspects of the Fine Structure of Starch" '·. ("Näkökohtia tärkkelyksen hienorakenteesta"), "New Appro aches to Research on Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, ss. 55 - 60.
25 Edullisesti esillä olevan keksinnön mukainen pui- ' · lulanaasi hydrolysoi perunan amylopektiinin. Tämä hydro- • lyysi voidaan suorittaa käyttäen amylopektiinin vesisus- • « · *·’ ’ pensiota pullulanaasin läsnä ollessa pullulanaasiaktiivi- suudelle optimaalisissa olosuhteissa, eli noin 60 °C:n · 30 lämpötilassa ja pH:ssa noin 4,3.
'r : Esillä olevan keksinnön mukainen pullulanaasi ka- , ··>, talysoi maltoosin kondensaatioreaktiota muodostaen tetra- ... holosideja (oligosakkarideja, joissa on 4 glukoosiyksik- ’ köä).
* t 5 116531
Keksinnön mukaisen pullulanaasin puoliintumisaika on noin 55 tuntia mitattuna noin 60 °C:n lämpötilassa liuoksessa, joka on puskuroitu pH:hon noin 4,5, ja substraatin puuttuessa.
5 Puoliintumisajalla tarkoitetaan, että pullulanaasi osoittaa vähintään 50 %:n suhteellista entsyymiaktiivisuutta, kun aktiivisuus mitataan 55 tunnin inkuboinnin jälkeen noin 60 °C:n lämpötilassa liuoksessa, joka on puskuroitu pH:hon noin 4,5, substraatin puuttuessa.
10 Keksinnön mukainen pullulanaasi on lämpöstabiili happamassa pH:ssa. Itse asiassa keksinnön mukainen pullulanaasi osoittaa vähintään 55 %:n suhteellista entsyymi-aktiivisuutta, kun aktiivisuus mitataan 40 tunnin inkuboinnin jälkeen 60 °C:n lämpötilassa liuoksessa, joka on 15 puskuroitu pH:hon noin 4,5, substraatin puuttuessa. Se osoittaa vähintään 70 %:n suhteellista entsyymiaktiivisuutta, kun aktiivisuus mitataan 24 tunnin inkuboinnin jälkeen näissä samoissa olosuhteissa.
Suhteellisella entsyymiaktiivisuudella tarkoite-20 taan entsyymiaktiivisuuden, joka mitataan ilmoitetuissa pH-, lämpötila-, substraatti- ja kesto-olosuhteissa suoritetussa kokeessa, ja samalla kokeella mitatun maksimaa->, lisen entsyymiaktiivisuuden välistä suhdetta, jolloin entsyymiaktiivisuus mitataan pullulaanin hydrolyysistä ja 25 maksimaalisen entsyymiaktiivisuuden arvoksi valitaan 100.
Keksinnön mukainen pullulanaasi on lisäksi stabii- li laajalla happamalla pH-alueella.
* ' Jäljempänä kuvatuissa olosuhteissa se on aktiivi nen pH:ssa, joka on yli tai yhtä kuin 3. Itse asiassa • 30 mainittu pullulanaasi osoittaa vähintään 85 %:n suhteel- ; lista entsyymiaktiivisuutta, kun aktiivisuus mitataan 60 minuutin inkuboinnin jälkeen noin 60 °C:n lämpötilassa substraatin puuttuessa ja pH-alueella, joka on yli tai yhtä kuin noin 3,5.
6 116531 Jäljempänä kuvatuissa olosuhteissa se on aktiivinen pH:ssa, joka on alle tai yhtä kuin 7. Itse asiassa mainittu pullulanaasi osoittaa vähintään 85 %:n suhteellista entsyymiaktiivisuutta, kun aktiivisuus mitataan 60 5 minuutin inkuboinnin jälkeen noin 60 °C:n lämpötilassa substraatin puuttuessa ja pH-alueella, joka on alle tai yhtä kuin noin 5,8.
Edullisesti se osoittaa yli 90 %:n suhteellista entsyymiaktiivisuutta, kun aktiivisuus mitataan näissä 10 samoissa olosuhteissa pH-alueella, joka on noin 3,8 - noin 5.
Keksinnön mukainen pullulanaasi kehittää optimaalisen entsyymiaktiivisuuden mitattaessa aktiivisuus noin 60 °C:n lämpötilassa pH-alueella yli 4,0. Keksinnön mu-15 kainen pullulanaasi kehittää optimaalisen entsyymiaktiivisuuden mitattaessa aktiivisuus noin 60 °C:n lämpötilassa pH-alueella alle 4,8. Edullisesti mainittu pullulanaasi kehittää optimaalisen entsyymiaktiivisuuden mitattaessa aktiivisuus noin 60 °C:n lämpötilassa pH:ssa noin 4,3. 20 Keksinnön mukainen pullulanaasi kehittää lisäksi optimaalisen entsyymiaktiivisuuden mitattaessa aktiivi-suus pH:ssa noin 4,3 lämpötila-alueella 55 - 65 °C, ja erityisesti 60 °C:ssa.
, ;·. Keksinnön mukainen pullulanaasi kehittää entsyymi- > 1 « 25 aktiivisuuden, joka on yli 80 % maksimaalisesta entsyymi- * » * il*,’ aktiivisuudesta (mitattaessa maksimaalinen entsyymiaktii- » f » " visuus lämpötilassa 60 °C ja pHrssa 4,3), pH-alueella, joka *·' * on noin 3,8 - noin 4,9, noin 60 °C:n lämpötilassa.
Keksinnön mukaisella pullulanaasilla on sitä pait- 1 | :,· * 30 si kaikki tarkoituksenmukaiset ominaisuudet, jotka sopi- : vat tärkkelyksen sokeroinnissa teollisuudessa todella , käytettyihin olosuhteisiin. Nämä ominaisuudet ovat pH-op- timi alle 5, lämpötilaoptimi noin 60 °C ja entsyymin hyvä stabiilisuus näissä happaman pH:n ja korkean lämpötilan 35 olosuhteissa. Happaman ympäristön määrää glukoamylaasin ja 7 116531 pullulanaasin samanaikainen käyttö tärkkelyksen teollisessa sokeroinnissa. Itse asiassa tärkkelyksen sokeroimiseksi käytetty glukoamylaasi tuotetaan yleensä sienellä tai etenkin Aspergillus-kannalla, kuten Aspergillus niger, 5 Aspergillus awamori tai Aspergillus foetidus. Nesteytetyn tärkkelyksen sokerointiin glukoamylaasin läsnä ollessa sopivat ihanteelliset olosuhteet ovat noin 60 °C:n lämpötila ja pH noin 4,0 - 4,5. Täten on asia etenkin glukoamylaasin kohdalla, jota myy nimellä DiazymeR L-200 Solvay 10 Enzymes (Elkhart, USA) ja nimellä 0ptidexR Solvay Enzymes (Hanover, Saksa). Sitä paitsi sokerointivaihe kestää useita tunteja, yleensä 40 - 60 tuntia, jolloin on oleellista, että käytetyt entsyymit ovat stabiileja, aktiivisia ja tehokkaita koko tämän vaiheen ajan, jolloin siis näiden 15 entsyymien on osoitettava hyvää lämpöstabiilisuutta happamassa ympäristössä ja mahdollisimman pitkää puoliintumis-aikaa. Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön mukainen pul-lulanaasi on tehokkaampi kuin tunnetut pullulanaasit.
Esillä oleva keksintö koskee samoin menetelmää 20 pullulanaasin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää pul-lulanaasia tuottamaan kykenevän aerobisen (ja ei-termo- '« tiilisen) bakteerin viljelemisen sopivassa ravintokasvu- * alustassa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä ja mine-, raalisuoloja, aerobisissa olosuhteissa sekä näin saadun 25 pullulanaasin ottamisen talteen. Tämä kasvualusta voi ol-!. ‘ la kiinteä tai nestemäinen. Edullisesti kasvualusta on nestemäinen.
Esillä oleva keksintö koskee samoin menetelmää pullulanaasin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää 30 Bacillus deramificans-kannan T 89.117D (LMG P-13056) tai tämän kannan pullulanaasia tuottamaan kykenevän johdannaisen viljelyn sopivassa ravintokasvualustassa, joka si- * * * , ··, sältää hiili- ja typpilähteitä ja mineraalisuoloja, aero bisissa olosuhteissa ja näin saadun pullulanaasin ottami-35 sen talteen.
> 8 116531 Näiden bakteerien viljelyolosuhteet kuten kasvualustan ainesosat, viljelyparametrit, lämpötila, pH, ilmastus, sekoitus ovat alan ammattilaiselle tutut.
Kasvualustan hiililähteet valitaan tavanomaisesti 5 tärkkelyksestä, osittain hydrolysoidusta tärkkelyksestä, liukoisesta tärkkelyksestä, oligosakkarideista, glukoosista, amyloosista, amylopektiinistä tai kahden tai useamman näistä seoksesta. Kasvualustan hiililähteet valitaan edullisesti osittain hydrolysoidusta tärkkelykses-10 tä, pullulaanista, glukoosista tai näiden seoksesta. Hyviä tuloksia on saatu glukoosilla ja osittain hydrolysoidulla tärkkelyksellä. Kasvualustan typpilähteet valitaan tavanomaisesti hiivauutteesta, soijajauhosta, puuvillan-jyväjauhosta, kalajauhosta, gelatiinista, perunajauhosta 15 tai kahden tai useamman näistä seoksesta. Kasvualustan typpilähteet valitaan edullisesti hiivauutteesta, soijajauhosta tai näiden seoksesta. Hyviä tuloksia on saatu hiivauutteella. Kasvualustan mineraalisuolat valitaan anionien osalta yleensä kloridista, karbonaatista, fos-20 faatista, sulfaatista ja kationien osalta kaliumista, natriumista, ammoniumista, magnesiumista, kalsiumista tai kahden tai useamman näistä seoksesta. Hyviä tuloksia on • # saatu seuraavien suolojen seoksella: KH2P04, Κ2ΗΡ04·3Η20, ’ (NH4)2S04, MgCl2· 6H20 ja CaCl2-2H20.
25 Viljely suoritetaan yleensä lämpötilassa, joka on · 20 - 45 °C ja edullisesti 25 - 40 °C.
* » >' ' Viljely suoritetaan yleensä pH:ssa, joka on 3,5 - V ' 6 ja edullisesti 4-6.
Viljely suoritetaan aerobisissa olosuhteissa ilman • ; : 30 tai hapen läsnä ollessa ja sekoittaen.
Tekniikat tuotetun pullulanaasin ottamiseksi talteen ovat alan ammattilaiselle tutut. Tavanomaisesti käy-tetään sentrifugointia, ultrasuodatusta, haihdutusta, saostamista, suodatusta, mikrosuodatusta, kiteyttämistä • *
• I
9 116531 tai joidenkin näistä tekniikoista yhdistelmää kuten sent-rifugointia, jota seuraa ultrasuodatus.
Pullulanaasi voidaan sitten tarvittaessa puhdistaa. Entsyymien puhdistustekniikat ovat alan ammattilaiselle 5 tuttuja, kuten etenkin saostaminen suolan avulla, kuten ammoniumsulfaatti, tai liuottimen avulla, kuten pääasiassa asetoni.
Pullulanaasi voidaan samoin kuivata spray- tai kylmäkuivaamalla.
10 Esillä oleva keksintö koskee samoin pullulanaasia tuottavan eristetyn uuden aerobisen bakteerin viljelmää, joka on Bacillus deramificans-kanta T 89.117D, ja jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivatimuksessa 27 esitetään.
Tämän kannan johdannaisella tai mutantilla tarkoi-15 tetaan mitä tahansa luonnollisesti tai keinotekoisesti modifioitua bakteeria. Tämän kannan johdannaisia voidaan saada tunnetuilla modifiointitekniikoilla kuten UV-säde-, röntgensädesäteilytys, mutagenisoivat aineet tai geeniteknologia .
20 Bacillus deramificans -kanta T 89.117D on talle tettu 9. joulukuuta 1992 Budapestin sopimuksen nojalla talletuskokoelmaan Belgian Coordinated Collections of
. I
Micro-organisms (LMG-viljelykokoelma, Gandin yliopisto, .· ·. Mikro-biologian laboratorio, K.L. Ledeganckstraat 35, B- * ♦
; ,*_ 25 9000 Gand, Belgia), jossa se on saanut hakunumeron LMG
!!V P-13056. Keksintö koskee siis eristettyä ja puhdistettua • ·
Bacillus deramificans T 89.117D-viljelmää.
• · · ’·* * Esillä olevan keksinnön mukainen kanta on identi fioitu sen biokemiallisten ominaispiirteiden perusteella: !.! : 30 gram-positiivinen, aerobinen bakteeri, joka esiintyy sauvan ή,,·' muodossa, se muodostaa bakteerinsisäisen itiön.
10 116551 Tässä esitetään edelleen sellaisen DNA-molekyylin eristämistä ja antamista käyttöön, joka käsittää Bacillus deramificans T 89.117D- (LMG P-13056-) pullulanaasia koo-dittavan nukleotidisekvenssin (sekvenssi tunnusnro 10) tai 5 tästä modifioimalla saadun sekvenssin. Edullisesti tämä DNA-molekyyli käsittää kokonaisuudessaan Bacillus deramificans T 89.117D-pullulanaasin geenin. Pullulanaasigeenillä kokonaisuudessaan tarkoitetaan vähintään yhtä tai useampaa transkriptiopromoottoria, yhtä tai useampaa sig-10 naalisekvenssiä, kypsää pullulanaasia koodittavaa nukleo-tidisekvenssiä ja yhtä tai useampaa transkription päättäjää.
Keksinnön mukainen DNA-molekyyli käsittää vähintään nukleotidisekvenssin (sekvenssi tunnusnro 10), joka koo-15 dittaa kypsää Bacillus deramificans T 89.117D- (LMG
P-13056-) pullulanaasia, ja sen signaalisekvenssin (sekvenssi tunnusnro 13) . Edullisesti tämä DNA-molekyyli käsittää Bacillus deramificans T 89.117D-pullulanaasigeenin kokonaisuudessaan. Hyviä tuloksia on saatu DNA-molekyy-20 Iillä, joka käsittää nukleotidisekvenssin sekvenssi tun nusnro 8. Nukleotidisekvenssi sekvenssi tunnusnro 8 koostuu amino-karboksyylisuunnassa ja vasemmalta oikealle nuk- t leotidisekvenssistä sekvenssi tunnusnro 14, nukleotidi- . sekvenssistä sekvenssi tunnusnro 13, nukleotidisekvenssistä * < · ; 25 sekvenssi tunnusnro 10 ja nukleotidisekvenssistä sekvenssi • * * I!'.* tunnusnro 15.
* * · • ·
Keksinnön mukainen pullulanaasi syntetisoidaan pre- • > t "·’ * kursorin muodossa, joka sisältää 29 aminohapon lisäsek- venssin (sekvenssi tunnusnro 12) .
: 30 Tässä esitetään myös modifioitua pullulanaasia, eli ·,./ entsyymiä, jonka aminohapposekvenssi poikkeaa villientsyy- min aminohapposekvenssistä vähintään yhdellä aminohapolla.
* I · ,·*·, Näitä modifikaatioita voidaan saada tavanomaisilla DNA- • » Ί* mutagenisointitekniikoilla, kuten altistaminen UV-sätei- ,,,· 35 lylle, kemiallisille aineille kuten natriumnitriitti tai i i 116531 11 o-metyylihydroksyyliamiini, tai geeniteknologisilla menetelmillä kuten esimerkiksi kohdennettu mutagenisointi tai sattumanvarainen mutagenisointi.
Edelleen tässä esitetään mutagenisoitua pullulanaa-5 siä, joka saadaan modifioimalla edellä määritellyn pullu-lanaasia koodittavan geenin nukleotidisekvenssiä. Tekniikat tällaisten mutagenisoitujen pullulanaasien saamiseksi ovat alan ammattilaiselle tuttuja ja niitä kuvataan etenkin julkaisussa Sambrook, Fritsch, Maniatis, "Molecular Cloning 10 - A Laboratory Manual", 2. painos, 1989, luku 15.
Lisäksi kuvataan sellaisen ilmentämisvektorin valmistusta ja antamista käyttöön, joka sisältää DNA-molekyy-lin, joka käsittää Bacillus deramificans T 89.117D-pullulanaasia koodittavan nukleotidisekvenssin. Edullisesti 15 DNA-molekyyli käsittää rakennegeenin, joka koodittaa kypsää Bacillus deramificans T 89.117D-pullulanaasia. Erityisen edullisesti tämä vektori on vektori pUBDEBRAl. Hyviä tuloksia on samoin saatu vektorilla pUBCDEBRAll.
Ilmentämisvektorilla tarkoitetaan mitä tahansa DNA-20 sekvenssiä, joka käsittää replikonin ja muita DNA-alueita (nukleotidisekvenssejä) ja joka on funktionaalinen isän-nästä riippumatta täydellisenä geeni-ilmentymisyksikkönä.
> * · ’··. Täydellisellä geeni-ilmentymisyksiköllä tarkoite- taan rakennegeeniä ja yhtä tai useampaa promoottorialuetta > · ; *t 25 ja yhtä tai useampaa säätelyaluetta, joka on tarpeel-
• I I
linen/jotka ovat tarpeelliset transkriptiolle ja trans-laatiolle. Rakennegeenillä tarkoitetaan koodaussekvenssiä,
» > I
*·' * jota käytetään RNA:n transkriptioon ja joka mahdollistaa proteiinin synteesin isännän toimesta, i 30 Edullinen ilmentämisvektori on vektori pUBDEBRAl.
Tämä vektori sisältää geenin, joka koodittaa keksinnön mukaista Bacillus deramificans -kannan T 89.117D pullula-
• 4 I
,···, naasia. Tämä vektori voidaan viedä sopivaan isäntään.
Yleensä tämä isäntä on Bacillus-kanta. Edullisesti tämä 35 isäntä on Bacillus licheniformis -kanta. Erityisen edulli- ; sesti tämä isäntä on Bacillus licheniformis -kanta SE2.
12 1 1 6531
Erinomaisia tuloksia on saatu tällä vektorilla vietäessä se isäntänä käytettyyn Bacillus licheniformis -kantaan SE2 delapl.
Keksintö liittyy edelleen sellaisen kromosomi-inte-5 graatiovektorin valmistukseen ja antamiseen käyttöön, joka sisältää DNA-molekyylin, joka käsittää Bacillus derami-ficans T 89.117D-pullulanaasia koodittavan nukleotidisek-venssin. Edullisesti DNA-molekyyli käsittää rakennegeenin, joka koodittaa kypsää Bacillus deramificans T 89.117D-10 pullulanaasia. Erityisen edullisesti tämä kromosomi- integraatiovektori on vektori pUBCDEBRAHDNSI.
Esillä oleva keksintö liittyy myös yhdistelmä-DNA-kantoihin, joihin mainittu pullulanaasia koodittava geeni on viety geeniteknologisilla menetelmillä. Geeni voidaan 15 viedä plasmidiin ilmentämisvektorilla tai integroida isännän kromosomiin yhtenä tai useampana kopiona kromosomi-integraatiovektorilla.
Keksintö liittyy samoin mikro-organismikantoihin, jotka poikkeavat alkuperäisestä tuottajaorganismista ja 20 joihin pullulanaasia koodittavat nukleotidit on viety transformoimalla joko kromosomi-DNA:hän integroidussa : muodossa tai itsenäisesti replikoituvassa muodossa (plasmidi).
’. Keksintö koskee transformoitua Bacillus licheni- ; 25 formis -kantaa, joka käsittää edellä kuvatun DNA-mole- * t ;·_/ kyylin. Keksintö koskee transformoitua Bacillus liche- * · niformis -kantaa, joka käsittää ilmentämisvektorin tai • > · * * kromosomi-integraatiovektorin, joka käsittää tämän DNA- molekyylin. Edullisesti keksintö koskee transformoitua : 30 Bacillus licheniformis -kantaa, joka käsittää ilmentämis- vektorin pUBDEBRAl tai kromosomi-integraatiovektorin pUBCDEBRAHDNSI.
,···, Keksintö koskee samoin menetelmää pullulanaasin • · valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-organismista lähtien, joi- i · i3 1 1 6531 loin menetelmä käsittää pullulanaasia koodattavan DNA-fragmentin eristämisen, tämän DNA-fragmentin insertoinnin sopivaan vektoriin, tämän vektorin viemisen sopivaan isäntään tai tämän DNA-fragmentin viemisen sopivan isän-5 nän kromosomiin, tämän isännän viljelemisen, pullulanaa-sin ilmentämisen ja pullulanaasin ottamisen talteen. Sopiva isäntä valitaan yleensä ryhmästä, jonka muodostavat mikro-organismit Escherichia coli, Bacillus tai Aspergillus. Tavanomaisesti isäntä valitaan Bacillus-suvusta. 10 Edullisesti isäntä valitaan suvun Bacillus (aerobisista) mikro-organismeista. Erityisen edullisesti isäntä valitaan mikro-organismeista Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus alcalophilus, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens tai Bacillus 15 deramificans T 89.117D (LMG P-13056).
Hyviä tuloksia on saatu silloin, kun isäntä esillä olevan keksinnön mukaisen pullulanaasin ilmentämiseksi on Bacillus licheniformiksesta saatu yhdistelmä-DNA-kanta, ja edullisesti Bacillus licheniformis-kanta SE2 delapl.
20 Bacillus licheniformis-kanta SE2 on talletettu Bu dapestin sopimuksen nojalla 21. kesäkuuta 1993 talletus-kokoelmaan Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (LMG-viljelykokoelma, Gand, Belgia), jossa se on ; saanut hakunumeron LMG P-14034.
25 Bacillus licheniformis-kannasta SE2 näin saatu · transformoitu kanta SE2 delapl eroaa emäkannasta vain ·' siinä, ettei se sisällä kromosomissaan kypsää proteaasia * koodittavaa DNA-sekvenssiä.
Keksintö koskee myös pullulanaasia, jonka on tuot- : 30 tanut heterologisella tavalla suvun Bacillus mikro-orga- nismi, joka sisältää alkalista proteaasia koodittavan !. geenin ollessaan villimuodossa. Edullisesti tämä mikro- • ·
organismi on Bacillus lichenif ormis-kanta, joka käsittää ·;’ DNA-molekyylin, joka käsittää Bacillus der ami f leans T
: 35 89.117D-pullulanaasia koodittavan nukleotidisekvenssin.
t 116531 14
Erityisen edullisesti alkalista proteaasia koodittava geeni on deletoitu tästä Bacillus-kannasta. Tämä kanta on edullisesti Bacillus lichenlformis-kanta SE2 delapl.
Heterologisella tavalla tuotetulla tarkoitetaan 5 tuottamista, jota ei suoriteta luonnollisella mikro-organismilla, eli mikro-organismilla, joka sisältää villimuo-dossa pullulanaasia koodittavan geenin.
Keksinnön mukaisella pullulanaasilla on moninaisia käyttöjä eri teollisuuden aloilla, kuten esimerkiksi 10 elintarviketeollisuus, farmaseuttinen teollisuus tai kemian teollisuus.
Pullulanaasia voidaan etenkin käyttää leipomossa "anti-staling"-, eli pilaantumista estävänä, aineena, eli lisäaineena leivän vanhenemisen välttämiseksi sen säily-15 tyksen aikana tai panimossa vähän kaloreita sisältävien oluiden valmistuksessa.
Pullulanaasia voidaan myös käyttää vähän kaloreita sisältävien elintarvikkeiden valmistuksessa, joissa amy-loosia käytetään rasvojen korvikkeena.
20 Pullulanaasia voidaan samoin käyttää amylopektii- nin hydrolysoimiseksi ja oligosakkaridien muodostamiseksi \ tästä amylopektiinistä.
Pullulanaasia voidaan niinikään käyttää tetraholo-sidien muodostamiseksi maltoosista.
. 25 Pullulanaasia voidaan samoin käyttää mono- tai oligosakkaridien kondensoimiseksi a-l,6-tyypin sidoksia : *' muodostamalla.
Pullulanaasia voidaan käyttää esimerkiksi hedelmämehujen kirkastamiseksi.
J j 30 Pullulanaasia voidaan käyttää tärkkelyksen nes- : teyttämiseksi.
Elintarvikekäyttötarkoituksiin pullulanaasi voi- » * * daan immobilisoida tuelle. Entsyymien immobilisointitek-
t I
niikat ovat alan ammattilaiselle tuttuja.
116531 15
Keksinnön mukainen pullulanaasi sopii erityisen hyvin tärkkelyksen ja pullulaanin käsittelyyn.
Keksintö koskee pullulanaasin käyttöä nesteytetyn tärkkelyksen sokerointiin.
5 Esillä oleva keksintö koskee myös pullulanaasin käyttöä tärkkelyksen tai osittain hydrolysoidun tärkkelyksen hajotusmenetelmässä, joka käsittää vaiheen, jossa tärkkelys tai osittain hydrolysoitu tärkkelys sokeroidaan pullulanaasin läsnä ollessa. Yleensä tämä menetelmä suo-10 ritetaan yhden tai useamman muun entsyymin kuten gluko-amylaasin, a-amylaasin, β-amylaasin, α-glukosidaasin tai muiden sokeroivien entsyymien läsnä ollessa.
Ottaen huomioon esillä olevan keksinnön mukaisen pullulanaasin biokemialliset ominaisuudet sillä on mah-15 dollista suorittaa sokerointivaihe voimakkaasti happamis-sa olosuhteissa, eli ainakin aina pH:ssa 3,9. Tämä pH on happamampi kuin tunnetuilla pullulanaaseilla hyväksyttävä pH.
Ottaen huomioon esillä olevan keksinnön mukaisen 20 pullulanaasin biokemialliset ominaisuudet sillä on mahdollista suorittaa sokerointivaihe suhteellisen korkeissa lämpötiloissa, eli vähintään aina lämpötilassa 65 °C.
", Lisäämällä esillä olevan keksinnön mukaista pullu- lanaasia sokerointiympäristöön on mahdollista lisätä glu-25 koosin pitoisuutta saadussa lopullisessa koostumuksessa ja i t » siten nostaa reaktion saantoa.
• I f • Lisäksi lisäämällä esillä olevan keksinnön mukais- • v · ta pullulanaasia sokerointiympäristöön on mahdollista lyhentää sokeroinnin kestoa.
·,; * 30 Esillä olevan keksinnön mukaisella pullulanaasilla ;_ ! on mahdollista päästä tärkkelyksen korkeaan konversiota- , ; , soon.
» I i
Lisäksi sokerointivaiheessa on mahdollista korvata ‘I suuri osa (vähintään 60 %) normaalisti käytetystä gluko- 35 amylaasista esillä olevan keksinnön mukaisella pullula- 116531 16 naasilla, jolloin näin voidaan menetellä vaikuttamatta glukoosisaantoon. Tämä korvaus on erityisen edullinen, itse asiassa sitä käyttämällä on mahdollista vähentää huomattavasti tavanomaisesti saatavien sivutuotteiden 5 määrää. Koska glukoamylaasia on läsnä pieni määrä, se ei pysty katalysoimaan oligosakkaridien (jotka sisältävät a-1,6-sidoksia) synteesireaktiota glukoosista; normaaleissa olosuhteissa glukoamylaasi katalysoi tätä käänteistä oligosakkaridien synteesireaktiota dekstroosipitoisuuksien 10 kohotessa sokerointiympäristössä korkeiksi, mikä rajoittaa tärkkelyksen konversiotasoa.
Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaista pullula-naasia käytettäessä on mahdollista käyttää konsentroitua sokerointiympäristöä, eli ympäristöä, jossa nesteytetyn 15 tärkkelyksen pitoisuus on korkea. Tämä on edullista taloudelliselta kannalta, itse asiassa tämä mahdollistaa haihdutuskustannusten pienentämisen.
Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaista pullulanaasia käsittäviä entsymaattisia koostumuk-20 siä.
Esillä olevan keksinnön mukaista pullulanaasia käsittäviä koostumuksia voidaan käyttää kiinteässä tai nestemäisessä muodossa.
' Pullulanaasi koostetaan aiottujen käyttöjen mu- » 25 kaan. Keksinnön mukaista pullulanaasia käsittäviin entsy-
’ I
maattisiin koostumuksiin voidaan samoin lisätä stabiloi-
• > I
• ** misaineita tai säilytysaineita. Esimerkiksi pullulanaasi • * V ' voidaan stabiloida lisäämällä propyleeniglykolia, etylee- niglykolia, glyserolia, tärkkelystä, pullulaania, sokeria *.· j 30 kuten glukoosia tai sorbitolia, suolaa kuten natriumklo- ; : ridia, kalsiumkloridia, kaliumsorbaattia ja natriumbent- , soaattia tai kahden tai useamman näistä tuotteista seos- » » ♦ ta. Hyviä tuloksia on saatu propyleeniglykolilla. Hyviä * t ’!* tuloksia on saatu tärkkelyksen, natriumbentsoaatin ja ka- : 35 liumsorbaatin seoksella.
5 » s * * 116531 17
Keksinnön mukaiset entsymaattiset koostumukset voivat niinikään käsittää pullulanaasin lisäksi yhtä tai useampaa muuta entsyymiä. Tällaisia entsyymejä ovat etenkin hiilihydraattihydrolaasit, kuten esimerkiksi gluko-5 amylaasi, a-amylaasi, β-amylaasi, α-glukosidaasi, isoamy-laasi, syklomaltodekstriiniglukotransferääsi, B-glukanaa-si, glukoosi-isomeraasi, sokeroivat entsyymit, entsyymit, jotka pilkkovat glukosidisidoksia, tai kahden tai useamman näistä seos.
10 Esillä oleva keksintö koskee edullisesti entsy maattista koostumusta, joka käsittää glukoamylaasin ja pullulanaasin.
Kuviossa 1 esitetään plasmidin pUBDEBRAl restrik-tiokartta.
15 Kuviossa 2 esitetään plasmidin pLDl restriktio- kartta.
Kuviossa 3 esitetään plasmidin pUBCDEBRAHDNSI res-triktiokartta.
Kuviossa 4 (kuviot 4a - 4f) esitetään kypsää pul-20 lulanaasia koodittava nukleotidisekvenssi (sekvenssi tun-nusnro 10), sekä sen aminohappotranslaatiotuote (sekvens-·, si tunnusnro 11).
_ -t Kuviossa 5 (kuviot 5a - 5g) esitetään DNA-fragmen tin nukleotidisekvenssi (sekvenssi tunnusnro 8), plasmi-25 din pUBCDEBRAl1 BamHl-keskuksesta PstI-keskukseen, sekä ’ : · aminohappotranslaatiotuote (sekvenssi tunnusnro 9) pullu- • ·' lanaasin signaalisekvenssille ja kypsälle sekvenssille, v · N-ukleotidit, joita ei ole varmuudella määrätty, on mer kitty symbolilla N.
: j ; 30 Näissä kuvioissa käytettyjen symbolien ja lyhen- : : teiden merkitykset on koottu seuraavaan taulukkoon.
18 I 1 6531
Symboli Merkitys
Lyhenne ORIEC replikaatioalkukohta colissa REP replikaatiolle välttämätön proteiini 5 ORI+ +-säikeen replikaatioalkukohta ORI- —säikeen replikaatioalkukohta KMR kanamysiinille resistenssin tuottava geeni BLMR bleomysiinille resistenssin tuottava geeni AMPR ampisilliinille resistenssin tuottava geeni 10 PP pre-pro-sekvenssi BLIAPR sekvenssi, joka koodittaa B^ licheniformik- sen alkalista proteaasia 5'BLIAPR 5'-sekvenssi, joka sijaitsee ylävirtaan B.
licheniformiksen alkalista proteaasia koo-15 dittavasta sekvenssistä 3'BLIAPR 3'-sekvenssi, joka sijaitsee alavirtaan B.
licheniformiksen alkalista proteaasia koodattavasta sekvenssistä BDEPUL sekvenssi, joka koodittaa B_^ deramificans- 20 pullulanaasia
Esillä olevaa keksintöä havainnollistetaan seuraa-villa esimerkeillä.
* *
Esimerkki 1 25 Bacillus deramificans-kannan eristäminen ja karak- i * t terisointi t · » < Bacillus deramificans-kanta T89.117D eristettiin V · maaperästä gelatiiniravintokasvualustalle ja valikoitiin kykynsä suhteen hajottaa värillistä pullulaanijohdannais-: : 30 ta, joka tunnetaan nimellä AZCL-pullulaani ja jota myy : yritys Megazyme.
Tätä kantaa kasvatettiin 37 °C:ssa MYE-kasvualus-
I I
tässä, jonka koostumus on seuraava: KH2P04 33 mM; K2HP04·-3H20 6 mM; (NH4)2S04 45 mM; MgCl2‘6H20 1 mM; CaCl2*2H20 1 mM; * 116531 19 hiivauutetta 0,5 % (w/v); glukoosia 0,5 % (w/v). Kasvualustan pH säädettiin pHihon 4,5 H3P04:llä.
Gelatiinikasvualusta (MYE/agar) sisältää lisäksi 2 % (w/v) agaria.
5 Esillä olevan keksinnön mukainen kanta identifioi tiin biokemiallisten ominaisuuksiensa perusteella: gram-positiivinen, aerobinen bakteeri, joka esiintyy sauvan muodossa, se muodostaa bakteerinsisäisen itiön. Se kuuluu siis Bacillus-sukuun.
10 Tämän kannan vegetatiiviset solut viljelmässä MYE-kasvualustalla 37 °C:ssa ovat kooltaan 0,7 x 3,0 - 3,5 pm:n basillin muotoisia. Vegetatiivisten solujen liikkuvuus on vähäinen.
3 päivän kasvatuksen 37 °C:ssa MYE-kasvualustalla 15 jälkeisessä mikroskooppitarkastelussa ilmenee lievästi epämuotoisten ja ellipsin muotoisten (sub)terminaalisten itiöpesäkkeiden läsnäolo.
Katalaasikoe on heikosti positiivinen 10 %:n vetyperoksidia läsnä ollessa. Oksidaasikoe on positiivinen 20 1 %:n tetrametyyli-1,4-fenyleenidiammoniumdikloridia läsnä ollessa.
Tämä kanta on aerobinen, eli se kasvaa aerobisissa . olosuhteissa. Se ei kasva anaerobisissa olosuhteissa, eli ;; ilmakehässä, jossa on 84 % (v/v) N2:ta, 8 % (v/v) C02:ta, ,' 25 8 % (v/v) H2:ta, 37 °C:ssa, sitä vastoin se kasvaa mikro-
• t I
·;· ' anaerobisissa olosuhteissa, eli ilmakehässä, jossa on • ·* 82,5 % (v/v) N2:ta, 6 % (v/v) 02:ta, 7,5 % (v/v) H2:ta, 4 % v * (v/v) C02:ta, 37 °C:ssa. Lyhenne % (v/v) merkitsee tila- vuus/tilavuus-suhteena ilmaistua prosenttiosuutta.
: ", 30 Tämä kanta ei ole termofiilinen. Sen kehitys on normaali inkuboitaessa MYE-kasvualustalla 20 °C:ssa, 30 °C:ssa, 37 °C:ssa ja 45 °C:ssa, sitä vastoin se ei kasva 50 °C:ssa ja 55 °C:ssa. Sen kehitys on normaali inkuboi-·;’ taessa MYE-kasvualustalla, joka on puskuroitu fosfaatti- : 35 puskurilla seuraaviin pH arvoihin: pH 4,0; pH 4,5; pH 5,0;
* I
116531 20 ja pH 5,5, sitä vastoin se ei kasva pH:ssa 7,0. Sen kehitys on normaali inkuboitaessa MYE-kasvualustalla NaClrn läsnä ollessa pitoisuuksina 2,0 % (w/v) ja 3,5 % (w/v), sen kasvu on heikkoa 5,0 %:n (w/v) NaCl:ää läsnä ollessa 5 ja se ei kasva 7,0 %:n (w/v) NaCl:ää läsnä ollessa. Lyhenne % (w/v) merkitsee paino/tilavuus-suhteena ilmaistua prosenttiosuutta.
Tämä kanta ei hydrolysoi kaseiinia: itse asiassa minkäänlaista lyysivyöhykettä ei voitu havaita yli 2 vii-10 kon inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen. Se hajottaa tyrosiinia heikosti, ei tuota asetoiinia pyruvaatista eikä pelkistä nitraattia nitriitiksi tai N2:ksi.
Keksinnön mukainen Bacillus deramificans-kanta T89.117D poikkeaa taksonomisesti Bacillus acidopullulyti-15 cus-kannasta, jota kuvataan EP-patenttijulkaisussa 0 063 909, ja Bacillus naganoensis-kannasta, jota kuvataan US-patenttijulkaisussa 5 055 403. Bacillus deramifi-cans-kanta T89.117D kasvaa pH:ssa, joka on 4,7 - 5,5, se ei kasva pH:ssa 7,0, kasvaa 3,5 %:n (w/v) NaCl:ää läsnä 20 ollessa, hajottaa tyrosiinia ja ei pelkistä nitraattia nitriitiksi.
.···. Bacillus deramif icans-kanta T89.117D on talletettu . talletuskokoelmaan Belgian Coordinated Collections of
Microorganisms (LMG-viljelmäkokoelma), jossa se on saanut . 25 hakunumeron LMG P-13056.
Esimerkki 2
Pullulanaasin valmistus , * ·’ Bacillus deramificans-kantaa T89.117D kasvatettiin nestemäisessä kasvualustassa (MYA), jonka koostumus on 30 identtinen MYE-kasvualustan koostumukseen nähden lukuun : ottamatta hiivauutteen ja tärkkelyksellä korvatun glukoo sin pitoisuutta, eli: hiivauute 2,5 % (w/v) perunatärkkelys 2,5% (w/v) 116531 21
Kasvatus suoritetaan sekoittaen ja tehokkaasti ilmastaen 37 °C:n lämpötilassa.
68 tunnin kasvatuksen jälkeen pullulanaasi ja so-lubiomassa erotetaan sentrifugoimalla (5 000 kierrosta/-5 min 30 minuutin ajan, Beckman JA-10). Bacillus deramifl-cans-kannan T89.117D tuottama pullulanaasi on solunul-koista.
Sitten pullulanaasi konsentroidaan ultrasuodatta-malla (membraanina Amicon S10 Y10) pullulanaasin konsen-10 troidun vesiliuoksen saamiseksi.
Mitataan saadun liuoksen entsyymiaktiivisuus.
Pullulanaasi- (PUN-) entsyymiyksiköksi määritellään se entsyymimäärä, joka pH:ssa 4,5, lämpötilassa 60 °C:ssa ja pullulaanin läsnä ollessa katalysoi pelkistä-15 vien sokerien vapautumista nopeudella 1 μΜ glukoosiekvi-valentti/min.
Pullulanaasin entsyymiaktiivisuuden mittaus suoritetaan seuraavan menettelyjärjestelyn mukaan. 1 ml liuosta, jossa on 1 % pullulaania 50 mM asetaattipuskurissa 20 pHissa 4,5, inkuboidaan 60 °C:ssa 10 minuutin ajan. Siihen lisätään 0,1 ml pullulanaasiliuosta, joka vastaa ak- ,*··. tiivisuutta 0,2 - 1 PUN/ml. Reaktio pysäytetään 15 minuu- tin kuluttua lisäämällä 0,4 ml 0,5 M NaOH-liuosta. Vapautuneiden pelkistävien sokereiden määritys suoritetaan So-, 25 mogyi-Nelsonin menetelmällä [J. Biol. Chem. 153 (1944) • * a ;;· · 375 - 380; J. Biol. Chem. 160 (1945) 61 - 68] ja kuten • *’ tämän hakemuksen muissa esimerkeissä.
V * Toista menetelmää käytetään pullulanaasimääritys- ten suorittamiseksi. Entsyymireaktio pullulaanin läsnä I j 30 ollessa suoritetaan kokeen mukaisissa olosuhteissa, min- 1 kä jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä rikkihappoa -!.§ (0,1 N). Pullulaanin hydrolyysituotteilla suoritetaan sit- ten HPLC-kromatografia-ajo (Bio-Radin HPX-87H-kolonni; liikkuvan faasin muodostaa 10 mM H2S04-liuos) eri aines- » * 116531 22 osien erottamiseksi. Muodostuneen maltotrioosin määrä arvioidaan mittaamalla saadun piikin pinta-ala.
Haarautumia katkaisevaksi kutsuttu aktiivisuus, eli amylopektiinin sisältämien a-1,6-glukosidisidosten hydro-5 lyysi, voidaan kvantitoida amyloosin vapautumisen amylo-pektiinistä jodin läsnä ollessa aiheuttaman sinisen värin lisääntymisestä.
Haarautumia katkaisevan entsyymiaktiivisuuden mittaus suoritetaan seuraavan menettelyjärjestelyn mukaan. 10 0,4 ml liuosta, jossa on 1 % amylopektiiniä 50 mM ase- taattipuskurissa pH:ssa 4,5, inkuboidaan 60 °C:ssa 10 minuutin ajan. Reaktio käynnistetään lisäämällä 0,2 ml pul-lulanaasia ja se pysäytetään 30 minuutin kuluttua lisäämällä 0,4 ml 0,3 M HClrää. Sitten 0,8 ml 0,0025-%:ista 15 (v/v) jodiliuosta lisätään 0,2 ml:aan tätä reaktioseosta ja mitataan optinen tiheys 565 nm:ssä.
Pullulanaasin puhdistamiseksi pullulanaasin konsentroitu vesiliuos diasuodatetaan käyttämällä 6 kertaan 500 ml NaCl:n vesiliuosta, jossa pitoisuus on 9 g/litra, 20 ja näin saadun vesiliuoksen pH säädetään pH:hon 3,5 lisäämällä 25-%:ista (v/v) HCl:ää ympäristön lämpötilassa. Diasuodatus käsittää pullulanaasiliuoksen sekoittamisen ·. NaCl-liuokseen ja sitten saadun liuoksen ultrasuodatuk- ’ sen.
t 25 Saatu sakka poistetaan sentrifugoimalla (5 000 « kierr./min 30 minuutin ajan, Beckman JA-10) ja sentrifu- » » * ·’ goinnista saatu supernatantti otetaan talteen. Tämän su- • ‘ ‘ pernatantin pH säädetään pH:hon 6,0 lisäämällä 5 M NaOH- liuosta. Saatu sakka poistetaan sentrifugoimalla.
,· · 30 Sentrifugoinnista saatu supernatantti otetaan tal- : : teen ja sitä kuumennetaan 55 °C:ssa 15 minuutin ajan.
, ·|·_ Muodostunut sakka poistetaan taas sentrifugoimalla i * (5 000 kierr./min 30 minuutin ajan, Beckman JA-10). Sent- rifugoinnista saatu supernatantti otetaan talteen.
» 116531 23 Tähän supernatanttiin lisätään asetonia loppupi-toisuuteen 60 % (v/v) ja muodostunut suspensio jätetään 4 °C:seen 2 tunniksi. 4 °C:ssa muodostunut sakka liuotetaan 20 mM MES- [2-(N-morfolino)etaanisulfonihappo-] puskuriin, 5 joka sisältää pitoisuuden 1 mM CaCl2 (pH 6,0). Tätä pullu-lanaasiliuosta kutsutaan liuokseksi A.
Tämä liuos A konsentroidaan toistamiseen ionin-vaihtokromatografisesti sen puhdistamiseksi. Kolonnia, jonka sisätilavuus on noin 20 ml ja jota myydään nimellä 10 S-SepharoseR HP HI LOAD 16/10, tasapainoitetaan etukäteen 50 mM CH3COONa-puskurilla, joka sisältää pitoisuuden 100 mM NaCl (pH 4,0), virtauksen ollessa 5 ml/min. Liuos A laimennetaan 10-kertaisesti asetaattipuskuriin ja 15 ml tätä laimennettua liuosta viedään kolonniin. Isokraattinen faa-15 si varmistetaan eluoimalla 80 ml:11a asetaattipuskuria (100 mM NaCl) ja sitten eluoimalla 200 ml:11a 50 mM asetaattipuskuria (pH 4,0), joka sisältää lineaarisen NaCl-gradientin (100 -> 500 mM).
Pullulanaasiaktiivisuus mitataan kustakin frak- 20 tiosta.
Aktiivisimmat fraktiot yhdistetään B:ksi kutsutuk- si liuokseksi (12 ml, joka sisältää 0,025 mg/ml proteii- ···, ne ja ja jonka pullulanaasiaktiivisuus on 0,7 PUN/ml).
• j.'t Tämä liuos B seostetaan asetonilla, jonka loppupi- < · 25 toisuus on 80 % (v/v). Saatu sakka liuotetaan 0,6 ml:n * · t tilavuuteen 20 mM MES-puskuria, 1 mM CaCl2 (pH 6,0).
*’ Tätä pullulanaasiliuosta kutsutaan liuokseksi C.
* > * ‘ Liuoksen C proteiinipitoisuus on 0,4 mg/ml, sen entsyymiaktiivisuus on 12 PUN/ml ja sen spesifinen aktii-· 30 visuus on 30 PUN/mg.
: : Tulokset on koottu taulukkoon 1.
> * » » * * » 116531 24
Taulukko 1
Frak- Tila- Proteiineja Pullulanaa- Spesifitkö vuus siaktiivisuus nen ak- 5 ml mg/ml Total % PUN/ml Total % tiivi- suus PUN/mg
Liuos 1,5 6,48 9,7 100 17,5 26,3 100 2,7
A
10 Liuos 12 0,025 0,3 3 0,7 8,4 32 28
B
Taulukosta 1 ilmenee, että tämä puhdistusvaihe nostaa tekijän 10 verran entsyymiliuoksen spesifistä pul-15 lulanaasiaktiivisuutta.
Pullulanaasin haarautumia katkaiseva aktiivisuus, eli amylopektiinin a-1,6-sidosten hydrolyysiaktiivisuus, mitattiin myös kuten edellä kuvattiin jodivärjäytymisestä amylopektiinin hydrolyysin jälkeen. Tulokset osoittavat, 20 että myös haarautumia katkaiseva aktiivisuus on rikastunut.
. Esimerkki 3
Molekyylipainon määritys
Esimerkissä 2 saatu liuos C saostetaan trikloori- I » 25 etikkahapolla [loppupitoisuus 10 % (v/v)]. Saatu sakka I * * » liuotetaan puskuriin, joka käsittää pitoisuudet 10 mM : Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 2,5 % (w/v) SDS:ää (nat- '·’ * riumdodesyylisulfaatti), 5 % (v/v) β-merkaptoetanolia ja 0,01 % (w/v) bromifenolisinistä.
;,· · 30 4 μΐ puskuriin liuotetun sakan käsittävää liuosta : : sijoitetaan polyakryyliamidigeelille. Käytetty geelisys- teemi on valmistajan Pharmacia LKB Biotechnology Phast-system-systeemi, jossa geelit sisältävät 10 - 15 %:n (v/v) ; polyakryyliamidigradientin SDS:n läsnä ollessa. Elektrofo- * 35 reesiolosuhteet ovat valmistajan suosittelemat. Värjäämäl- 116531 25 lä geeli Coomassie-sinisellä saadaan näkyviin polypeptidi, jonka molekyylipaino on noin 105 kDa ja joka on liuoksen C pääasiallinen ainesosa.
Tämä varmistetaan arvioinnilla, joka tehdään läh-5 tien pullulanaasin kypsän muodon aminohapposekvenssistä (ilman signaalisekvenssiä) kuten kuvataan esimerkissä 4, jolloin laskennallisesti saadaan molekyylipainoksi 102 kDa.
Esimerkki 4 10 1. N-pään sekvenssin määritys
Esimerkissä 3 kuvatusta geelistä lähtien identifioidaan pullulanaasin N-pään sekvenssi noudattaen tekniikkaa, jota kuvaavat Bauw et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 4806 - 4810.
15 Tämä näin määritetty sekvenssi (sekvenssi tunnus- nro 1) on amino-karboksyylisuunnassa ja vasemmalta oikealle seuraava:
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Vai His Tyr Phe Cys Pro 20 Ala Gly Asp Tyr Gin Pro 2. Pullulanaasin aminohapposekvenssin määritys . ·, Plasmidin pUBCDEBRAll pullulanaasia koodittavan, esimerkissä 21 saadun, geenin sisältävän noin 4,5 ke:n . 25 BamHI-Pstl-fragmentin nukleotidisekvenssi (sekvenssi tun- ' nusnro 8) määritettiin ketjupäämenetelmällä dideoksinuk- : ' leotidejä käyttämällä Sangerin et ai. mukaan, Proc. Natl.
V Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467.
Synteettiset oligonukleotidit, joita käytettiin j 30 pidennysreaktioiden T7-DNA-polymeraasilla käynnistämiseksi si, syntetisoitiin Beaucagen et ai. menetelmällä, Tetra- hedron Letters 22 (1981) 1859 - 1882. Sekventoini suoritettiin noudatten sekventointipakkauksen valmistajan ;* (Pharmacia) toimittamaa menettelyjärjestelyä suorittamal- ► 116531 26 la kaksisäikeisen DNA:n denaturointi NaOH:lla käsittelemällä.
Sekventointistrategiaa kuvaa Sambrook, 1989, s. 13.15 ja 13.17. Sekventointiajot polyakryyliamidigeeleis-5 sä suoritettiin Sambrookin, 1989, s. 13.45 - 13.58, kuvaaman tekniikan mukaan.
DNA-fragmentin nukleotidisekvenssi (sekvenssi tun-nusnro 8) pUBCDEBRAll:n BamHI-keskuksesta keskukseen Pstl, sekä pullulanaasin kypsän sekvenssin ja signaalisekvenssi 10 translaatio aminohapoiksi (sekvenssi tunnusnro 9) identifioitiin (kuvio 5). Nukleotidit, joita ei varmuudella määritetty, on merkitty symbolilla N.
Tätä sekvenssiä analysoimalla todetaan, että läsnä on avoin lukualue, joka koodittaa pullulanaasia. Identi-15 fioidaan nukleotidisekvenssi, joka koodittaa kypsää pullulanaasia (sekvenssi tunnusnro 10). Täten päätellään kypsän pullulanaasin aminohapposekvenssi (sekvenssi tunnusnro 11) suorittamalla tämän avoimen lukualueen translaatio. Kuviossa 4 esitetään kypsää pullulanaasia koodittava 20 nukleotidisekvenssi sekä sen translaatio aminohapoiksi.
Varmistutaan siitä, että edellä kuvatun mukaisesta proteiinista kokeellisesti määritetty N-pään sekvenssi ", vastaa DNA-sekvenssistä translaatiolla saatua.
« Tämä osoittaa, että pullulanaasi syntetisoidaan 25 prekursorin muodossa, joka sisältää ylimääräisen 29 aminohapon sekvenssin (esisekvenssi). Tämä 29 aminohapon r » sekvenssi identifioidaan (sekvenssi tunnusnro 12), kuten < » ‘ myös vastaava nukleotidisekvenssi (sekvenssi tunnusnro 13). Tämä ylimääräinen sekvenssi osoittaa ominaispiirtei-. * 30 tä, jotka ovat tyypilliset erityksen signaalisekvenssil- : le, joka poistuu entsyymin kuljetuksen solun ulkopuolelle aikana [Freudl, Journal of Biotechnology 23 (1992) 231 -240].
Tämä 29 aminohapon sekvenssi on seuraava: 116531 27 ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT TTA AGT GTT Mt Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys Leu Ser Val -25 -20 TGT TTA GTG TTG ACC TGG GCT TTT AAT GTA AAA GGG CAA TCT 5 Cys Leu Val Leu Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gin Ser -15 -10 -5 GCT CAT GCT Ala His Ala -1 10
Esimerkki 5 Aminohappoj akauma
Kypsän pullulanaasin aminohappojakauma, joka on määritetty pullulanaasin aminohapposekvenssistä (esimerk-15 ki 4), esitetään taulukossa 2.
♦ » · • · » t i a f a * t 116531 28
Taulukko 2 %
Symboli Aminohappo Lukumäärä (molekyyli- painosta) 5 D asparagiinihappo 75 8,5 N asparagiini 69 7,7 V väliini 72 7,0 T treoniini 70 6,9 10 Y tyrosiini 42 6,7 L leusiini 60 6,7 K lysiini 48 6,0 S seriini 64 5,5 I isoleusiini 47 5,2 15 E glutamiinihappo 40 5,1 Q glutamiini 39 4,9 A alaniini 69 4,8 P proliini 46 4,4 G glysiini 75 4,2 20 F fenyylialaniini 27 3,9 W tryptofaani 18 3,3 ·. M metioniini 23 3,0 H histidiini 22 3,0 R arginiini 18 2,8 25 X tuntematon 3 0,3 : C kysteiini 1 0,1 116531 29
Esimerkki 6
Isoelektrisen pisteen määritys
Esimerkissä 2 saadulla liuoksella C suoritetaan IEF- (isoelektrofokusointi-) elektroforeesi käyttäen 5 pH-gradienttia 4,0 - 6,5.
0,12 pullulanaasiyksikköä vastaava tilavuus sijoitetaan geelille kolminkertaisin määrityksin. Migraation jälkeen kolmasosa geelistä värjätään Coomassie-sinisellä.
Kaksi muuta geelipalaa peitetään agargeeleillä 10 (l-%:isia, w/v), jotka on puskuroitu liuoksella, joka käsittää pitoisuudet 100 mM CH3C00Na, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 (pH 4,5), ja jotka sisältävät vastaavasti 0,1 % (w/v) AZCL-pullulaania tai 1 % (w/v) amylopektiiniä. Näin saatua yhdistelmää (akryyliamidigeeli-agargeeli) inkuboidaan 15 sitten 60 °C:ssa kosteudella kyllästetyssä ilmakehässä 16 tunnin ajan. Amylopektiinipäälikerroksella peitettyä geeliä inkuboidaan sitten ympäristön lämpötilassa liuoksessa, joka sisältää pitoisuudet 3 mM I2, 50 mM KI, haarautumia katkaisevan aktiivisuuden osoittamiseksi sinisen 20 värin ilmaantumisesta.
Amylopektiinigeeli jodilla kehitettäessä saadaan esillä olevan keksinnön mukaiselle entsyymille haarautu- * mia katkaisevaa aktiivisuutta osoittava tummansininen kehä isoelektrisessä pisteessä, joka on välillä noin 4,1 - , 25 noin 4,5. Pullulanaasiaktiivisuuden osoituksessa saadaan * · ;; · sama tulos.
·’ ' Tämä osoittaa, että esillä olevan keksinnön mukai- ‘ sella pullulanaasilla on pullulanaasiaktiivisuutta sekä haarautumia katkaisevaa aktiivisuutta.
: j 30 Tämä osoittaa, että esillä olevan keksinnön mukai- : nen pullulanaasi pystyy hydrolysoimaan tyypin a-l,6-si- doksia sekä pullulaanissa että amylopektiinissä. Tämä osoittaa esillä olevan keksinnön mukaisen pullulanaasin heikkoa spesifisyyttä substraattinsa suhteen.
116531 30 Tämä varmistetaan arvioinnilla, joka tehdään lähtien pullulanaasin kypsän muodon aminohapposekvenssistä (ilman signaalisekvenssiä), esimerkissä 4 kuvatun mukaisesti, jolloin laskennallisesti isoelektriseksi pisteeksi 5 saadaan 4,5.
Esimerkki 7
Aktiivisuusprofiili pH:n ja lämpötilan funktiona luonnollisen kannan (Bacillus deramificans) tuottamalle pullulanaasille 10 Mitataan pullulanaasin entsyymiaktiivisuus eri lämpötiloissa (55, 60 ja 65 °C) ja eri pH-arvoissa (välillä 3,25 - 7) 50 mM sitraatti-fosfaattipuskurissa mittaamalla vapautuneet pelkistävät sokerit. Käytetään esimerkissä 2 saatua pullulanaasiliuosta C laimennettuna ak-15 tiivisuuteen noin 1 PUN/ml.
Tulokset on koottu taulukkoon 3.
Tämän kokeen puitteissa mitattiin maksimaalinen entsyymiaktiivisuus mittaamalla vapautuneet pelkistävät sokerit näytteelle, joka sijoitettiin pH:hon noin 4,3 ja 20 noin 60 °C:n lämpötilaan 15 minuutiksi. Määritelmän mukaan tämän näytteen suhteelliseksi entsyymiaktiivisuudeksi asetettiin siten 100 %.
Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaiselle pullulanaasille mitataan optimaalinen entsyymiaktiivisuus 25 noin 60 °C:n lämpötilassa pH-alueella 4,0 - 4,8.
: Tämä esimerkki osoittaa niinikään, että keksinnön mukaiselle pullulanaasille mitataan optimaalinen entsyy-v · miaktiivisuus pH:ssa noin 4,3 lämpötila-alueella 55 - 65 °C.
; ; 30 Lisäksi tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön : ; mukainen pullulanaasi osoittaa entsyymiaktiivisuutta, jo ka on yli 80 % maksimaalisesta entsyymiaktiivisuudesta, pH-alueella noin 3,8 - noin 4,9.
116531 31
Taulukko 3
Suhteellinen entsyymiaktiivisuus, %
pH Lämpötila °C
5 55 60 65 3,25 5,7 2,2 4,3 3,75 80,8 83,7 11,5 4,30 87,9 100 84,1 10 4,90 82,4 87,1 68 5,50 50,6 39,6 13,5 6,00 7,5 2,9 0 6,40 000 15 Esimerkki 8
Luonnollisen kannan (Bacillus derami f icans) tuottaman pullulanaasin stabiilisuus pH:n suhteen
Esimerkissä 2 saatua pullulanaasiliuosta A laimennetaan 100 mM sitraatti-fosfaattipuskureihin, joiden pH 20 vaihtelee 3,0:sta 7,Oraan, siten, että sen entsyymiaktiivisuudeksi tulee noin 0,7 PUN/ml. Pullulanaasia sisältä-·. viä laimennettuja eri liuoksia inkuboidaan 60 minuutin ajan 60 °C:ssa.
Sitten mitataan näiden eri liuosten entsyymiaktii-25 visuus 60 minuutin inkuboinnin jälkeen pHrssa 4,2 60 °C:ssa / 1,6 %:n (w/v) pullulaania läsnä ollessa. Muodostunut mal- * *’ totrioosimäärä mitataan HPLC-kromatografisesti (kuten ku- V * vattiin esimerkissä 2). Tulokset on koottu taulukkoon 4.
Tämän kokeen puitteissa mitattiin maksimaalinen j 30 entsyymiaktiivisuus näytteelle, joka sijoitettiin pHrhon : : noin 4,5 ja noin 60 °C:n lämpötilaan. Määritelmän mukaan J _ tämän näytteen suhteelliseksi entsyymiaktiivisuudeksi asetettiin siten 100 %.
Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen 35 pullulanaasi on stabiili laajalla happamalla pH-alueella, i 116531 32 itse asiassa sille mitataan vähintään 85 %:n suhteellinen entsyymiaktiivisuus 60 minuutin inkuboinnin jälkeen noin 60 °C:n lämpötilassa substraatin puuttuessa ja pH-alueel-la noin 3,5 - 5,8. Tämä esimerkki osoittaa samoin, että 5 sille mitataan yli 90 %:n suhteellinen entsyymiaktiivisuus pH-alueella noin 3,8 - noin 5 näissä samoissa olosuhteissa ja että se inaktivoituu vasta pH:ssa, joka on alle tai yhtä kuin 3 tai yli tai yhtä kuin 7.
10 Taulukko 4 pH Suhteellinen aktiivisuus, % 3 0 3.5 90 15 4 98 4.5 100 5 96 5.5 92 6 89 20 6,5 75 7 0
Esimerkki 9
Luonnollisen kannan (Bacillus derami f icans) tuot-25 tämän pullulanaasin puoliintumisajan määritys
Esimerkissä 2 saatua pullulanaasiliuosta C laimen-• ·' netaan 100 mM natriumasetaattipuskuriin, pH 4,5, siten, < t v · että sen entsyymiaktiivisuudeksi saadaan noin 0,7 PUN/ml.
Pullulanaasia sisältävää laimennettua liuosta inkuboidaan \j · 30 60 °C:ssa ja eri ajankohtina otetaan näytteitä.
*: Entsyymiaktiivisuus mitataan sitten pelkistävien ] sokerien menetelmällä (edellä kuvattu Somogyin menetel- !.. mä).
; Tämän kokeen puitteissa maksimaalinen entsyymiak- 35 tiivisuus mitattiin näytteelle ajankohtana 0. Määritelmän 116531 33 mukaan tämän näytteen suhteelliseksi entsyymiaktiivisuudeksi asetettiin siten 100 %.
Tulokset on koottu taulukkoon 5.
5 Taulukko 5
Aika Suhteellinen aktiivisuus (tuntia) (%) 0 100 10 16 76 24 74 40 57 48 54 64 47 15 Tämä esimerkki osoittaa, että pullulanaasi on läm-pöstabiili happamassa pH:ssa.
Tämä esimerkki osoittaa, että pullulanaasin puoliintumisaika on noin 55 tuntia näissä olosuhteissa. Itse 20 asiassa pullulanaasille mitataan vähintään 50 %:n suhteellinen entsyymiaktiivisuus 55 tunnin inkuboinnin jälkeen noin 60 °C:n lämpötilassa liuoksessa, joka on puskuroitu pH:hon noin 4,5, substraatin puuttuessa.
’ Tämä esimerkki osoittaa lisäksi, että keksinnön mu- 25 kaiselle pullulanaasille mitataan vähintään 55 %:n suh-V teellinen entsyymiaktiivisuus 40 tunnin inkuboinnin jäl keen noin 60 °C:n lämpötilassa liuoksessa, joka on pusku-' roitu pH:hon noin 4,5, substraatin puuttuessa. Tämä esi merkki osoittaa samoin, että sille mitataan vähintään , ; * 30 70 %:n suhteellinen entsyymiaktiivisuus 24 tunnin inku- : boinnin jälkeen näissä samoissa olosuhteissa.
Esimerkki 10 ja (vertailu-) esimerkki 11R
Sokerointi «
Valmistetaan sokerointiympäristö suspendoimalla ,,· 35 veteen maissitärkkelystä pitoisuuteen 35 % (w/w) tärkke- 116531 34 lyskuiva-ainetta ja kalsiumkloridia pitoisuuteen 0,02 % (w/v).
Tätä maissitärkkelyssuspensiota nesteytetään valmistajan Solvay Enzymes nimellä Takatherm* L-340 myymän 5 a-amylaasin läsnä ollessa 105 °C:ssa 5 minuutin ajan pH:ssa 6,0.
Näin saatu nesteytetty tärkkelys jäähdytetään nopeasti 95 °C:n lämpötilaan ja hydrolyysiä jatketaan 120 minuutin ajan 95 °C:ssa samalla sekoittaen. Tässä vai-10 heessa hydrolyysiaste on 10 - 12 DE (DE merkitsee deks-troosiekvivalenttiyksikköä, eli glukoosiekvivalenttina ilmaistua pelkistävien päiden lukumäärää).
Näin saatu nesteytetty tärkkelys laimennetaan lop-pupitoisuuteen 32 g kuiva-ainetta/100 g sokerointiympä-15 ristöä.
Saatu sokerointiympäristö jäähdytetään 60 °C:n lämpötilaan.
Tämän sokerointiympäristön pH säädetään eri arvoihin välillä 3,9 - 4,8 etikkahapolla ja se pidetään vakio-20 na sokeroinnin aikana.
Sokerointiympäristöön lisätään glukoamylaasia mää-·. rä, joka vastaa 0,176 DU:ta/g k.-a. (glukoamylaasientsyy- miyksikkö/g kuiva-ainetta sokerointiympäristössä), käytettyä glukoamylaasia myy valmistaja Solvay Enzymes ni-25 mellä Diazyme L-200.
• Keksinnön mukaisessa esimerkissä 10 sokerointiym- • ·’ päristöön lisätään myös pullulanaasia määrä, joka vastaa 0,075 PUN:ia/g k.-a., pullulanaasin esimerkissä 2 kuvatun konsentroidun vesiliuoksen (liuos A) muodossa.
, | 30 Vertailuesimerkki 11R suoritetaan kuten kuvattiin edellä esimerkille 10 mutta pullulanaasia lisäämättä.
J 48 tunnin kuluttua sokeroituminen pysäytetään ja saadut tuotteet analysoidaan kromatografisesti (kuten ku-; vattiin esimerkissä 2).
: 35 Tulokset on koottu taulukkoon 6.
116531 35 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen pullulanaasi on sokeroinnissa tehokas. Keksinnön mukaisella pullulanaasilla on siten kaikki tarkoituksenmukaiset ominaisuudet, jotka sopivat tärkkelyksen sokeroinnis-5 sa teollisuudessa todella käytettyihin olosuhteisiin.
Tämä esimerkki osoittaa, että tärkkelyksen konver-siotaso on korkeampi keksinnön mukaisen pullulanaasin läsnä ollessa eri pH-arvoilla, jolloin näin on aina hyvin happamaan pH:hon asti, eli pH:hon vähintään 3,9.
10
Taulukko 6 pH Esimerkki Saadut tuotteet, %
Glukoosi DP2 DP3 > DP3 15 3,9 11R 94,18 2,92 0,54 2,37 10 95,63 2,90 0,73 0,73 4,2 11R 94,18 2,98 0,56 2,29 10 94,79 4,30 0,56 0,38 4,5 11R 93,72 2,88 0,57 2,83 20 10 95,49 3,00 0,75 0,76 4,8 11R 93,32 2,79 0,60 3,30 ·. 10 95,25 2,70 0,87 1,18 DP2 merkitsee oligosakkarideja, jotka sisältävät 25 kaksi glukoosiyksikköä (glukoosidimeeri), DP3 merkitsee ;; oligosakkarideja, jotka sisältävät kolme glukoosiyksikköä • ' (glukoositrimeeri), ja > DP3 merkitsee oligosakkarideja, v * jotka sisältävät yli kolme glukoosiyksikköä.
Esimerkki 12 ja (vertailu-) esimerkki 13R *,· j 30 Sokerointi : : Toistetaan esimerkki 10 mutta säätäen sokerointi- *’·, ympäristön pH 4,2:een.
Sokerointiympäristöön lisätään glukoamylaasia määrä, joka vastaa 0,17 DU:ta/g k.-a. (entsyymiyksikkö/g 35 kuiva-ainetta sokerointiympäristössä), käytettyä gluko- 36 116551 amylaasia myy valmistaja Solvay Enzymes nimellä Diazyme L-200.
Keksinnön mukaisessa esimerkissä 12 sokerointiym-päristöön lisätään samoin vaihtelevia pullulanaasimääriä, 5 jotka vastaavat vastaavasti aktiivisuuksia 0,0325 PUN/g k.-a., 0,050 PUN/g k.-a., 0,075 PUN/g k.-a. ja 0,10 PUN/g k.-a. (pullulanaasientsyymiyksikkö/g kuiva-ainetta soke-rointiympäristössä), pullulanaasin esimerkissä 2 kuvatun konsentroidun vesiliuoksen (liuos Λ) muodossa.
10 Vertailuesimerkki 13R suoritetaan kuten kuvattiin edellä esimerkille 12 mutta pullulanaasia lisäämättä. Tulokset on koottu taulukkoon 7.
Tämä esimerkki osoittaa, että pullulanaasin määrä, joka on käytettävä tuotetun glukoosin prosentuaalisen 15 osuuden kasvun havaitsemiseksi, on alle 0,0325 PUN/g k.-a.
Taulukko 7
Esimerkki Pullulanaasi Saadut tuotteet, % 20 PUN/g k.-a. Glukoosi DP2 DP3 > DP3 13R 0 94,78 3,55 0,73 0,94 *. 12 0,0325 95,16 3,45 0,78 0,61 0,050 95,30 3,39 0,74 0,56 0,075 95,25 3,47 0,74 0,55 / 25 0,10 95,27 3,49 0,70 0,53
Esimerkki 14
Plasmidin pUBDEBRAl rakentaminen
Plasmidi pUBDEBRAl (kuvio 1) sisältää Bacillus der-·,; * 30 amificans-kannan T 89.117D pullulanaasia koodittavan gee- : nin sen oman transkriptiopromoottorin kontrollissa vietynä j· vektoriin pUB131. Seuraavassa kuvataan plasmidin pUBDEBRAl i * rakentamista.
» 116531 37
Kromosomi.-DNA eristetään ja puhdistetaan lähtien Bacillus deramificans-kannan T 89.117D viljelmästä (iden-tifiointinumero LMG P-13056).
Tämän suorittamiseksi valmistetaan tämän basillin 5 200 ml:n viljelmä nestemäiseen MYE-kasvualustaan (esi merkki 1).
Kun tämä viljelmä on valmistettu ja se on kasvanut stationaarifaasiin, sitä sentrifugoidaan (roottori Beckman JA-10) 5 000 kierr./min kierrosnopeudella 10 minuutin 10 ajan. Näin saatu sentrifugointipelletti suspendoidaan 9 ml:aan 0,1 M Tris-HCl- [tris(hydroksimetyyli)aminometaa-ni, joka on tehty happamaksi HCl:llä] puskuria, pH 8, joka käsittää pitoisuudet 0,1 M EDTA (etyleenidiamiinitet-raetikkahappo), 0,15 M NaCl, ja sisältää 18 mg lysotsyy-15 miä, minkä jälkeen näin saatua suspensiota inkuboidaan 15 minuutin ajan 37 °C:ssa.
Näin saatua lysaattia käsitellään sitten 200 pl:lla RN-aasiliuosta, jonka pitoisuus on 10 mg/ml, 20 minuutin ajan 50 °C:ssa. Sitten tähän lysaattiin lisätään 1 ml 20 10-%:ista SDS- (natriumdodesyylisulfaatti-) liuosta, minkä jälkeen tätä lysaattia inkuboidaan 30 minuutin ajan 70 °C:ssa.
i ·, Sitten lysaatti jäähdytetään noin 45 °C:seen ja si- ' ihen lisätään sitten 0,5 ml proteinaasi-K-liuosta, jonka 25 pitoisuus on 20 mg/ml (ja joka valmistetaan käyttöäjankoh-;; / tana).
* ‘ Lysaattia inkuboidaan 45 °C:ssa käsin sekoittaen V * kunnes saadaan läpinäkyvä liuos.
Tälle läpinäkyvälle liuokselle suoritetaan useita t ·.· j 30 fenoliuuttoja seuraten olosuhteita ja menettelyjä, joita ; : kuvataan julkaisussa Sambrook, Fritsch, Maniatis, "Molecu lar Cloning - A Laboratory Manual", 2. painos, 1989, s. E.3, kunnes saadaan ko. julkaisussa kuvatun mukaisesti oikeanlainen rajapinta.
i 38 116531 DNA seostetaan 20 ml:11a etanolia. Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla kierrosnopeudella 5 000 kierr./-min 5 minuutin ajan, minkä jälkeen se suspendoidaan 2 ml:aan TE-puskuria, pH 8,0 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 5 pH 8,0).
Sitten näin saatu DNA pilkotaan osittain restrik-tioentsyymillä Sau3AI. Restriktiopilkkomisen olosuhteet tässä esimerkissä ja kaikissa muissa tämä hakemuksen esimerkeissä ovat Sambrookin et ai. kuvaamat (s. 5.28 - 5.32) 10 lukuun ottamatta, että restriktio-olosuhteita lisätään tekijän 10 verran riittävän DNA-määrän saamiseksi seuraa-viin puhdistusvaiheisiin.
Käytetyn DNA-määrän ja entsyymimäärän välinen suhde säädetään maksimaalisen määrän sellaisia fragmentteja 15 saamiseksi, jotka ovat kooltaan 5-10 kep (kep: 103 emäsparia).
Näin saatujen fragmenttien kokonaisuudella suoritetaan sitten elektroforeesi agaroosigeelissä (0,8-%:inen) Sambrookin et ai. (s. 6.01 - 6.19) kuvaaman mukaisesti ja 20 kooltaan 5-10 kep:n fragmentit eristetään ja puhdistetaan Gene Clean-menetelmällä. Sitten ne ligatoidaan plas-*. midiin pBR322, jota myy valmistaja Biolabs [Clontech Labo ratories (U.S.A.), kataloginro 6210-1] ja joka on leikattu ! BamHI-keskuksesta ja defosforyloitu kuten kuvaavat Sam- 25 brook et ai. (s. 1.60 - 1.61). Tätä samaa tekniikkaa käy- ' » tetään muissa esimerkeissä.
* '* Näin saatu ligatointiseos transformoidaan coli '· ’ MC1061-soluihin (Clontech Laboratories, kataloginro C- 1070-1) elektroporaatiolla (Sambrook et ai., s. 1.75 -
» I
;,· · 30 1.81); transformoidut kannat valikoidaan petrimaljoilla, : : jotka sisältävät LB- (Luria-Bertani-) gelatiinikasvualus- taa ja 100 pg/ml ampisilliiniä, noin 18 tunnin kasvatuksen 37 °C:ssa jälkeen. LB-kasvualustaa kuvaavat Sambrook et ai. (s. A.4). Tämä kasvualusta sisältää 10 g/litra i 116531 39 tryptonia, 5 g/litra hiivauutetta ja 10 g/litra natrium-kloridia.
Näille maljoille saadut pesäkkeet noukitaan sitten kahteen maljaan, jotka sisältävät samaa kasvualustaa.
5 Yksi näistä kahdesta maljasta peitetään gelatiini- kasvualustalla, joka sisältää 1 % (w/v) agaria, pitoisuuden 100 mM natriumasetaatti (pH 4,5) ja 0,1 % (w/v) AZCL-pullulaania. 18 tunnin inkuboinnin 60 °C:ssa jälkeen pesäke, joka osoittaa huomattavinta AZCL-pullulaanin hydro-10 lyysivyöhykettä, todetaan ja vastaava pesäke eristetään noukkimalla toiseen maljaan.
Näin saadaan kanta, josta eristetään plasmidi, joka nimetään pBRDEBRA3:ksi. Plasmidin pBRDEBRA3 noin 4,6 kep:n EcoRI-BaraHI-fragmentti saadaan kaksoispilkko-15 maila plasmidia pBRDEBRA3 BamHIrllä ja EcoRI:llä ja puhdistamalla sitten elektroforeettisesti agaroosigeelissä (0,8-%:inen, w/v). Sitten tämä fragmentti ligatoidaan vektoriin pUB131 (jota kuvataan EP-patenttihakemusjulkaisussa 0 415 296), jota on etukäteen pilkottu sekä BamHI:llä et-20 tä EcoRI:llä, BamHI- ja EcoRI-keskuksiin, käyttäen Bacillus subtilis-kantaa PSL1 isäntänä.
Bacillus subtilis-kanta PSL1 voidaan saada kokoelmasta B.G.S.C., jossa sen hakunumero on 1A510 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, USA).
25 Näin saatu plasmidi pUBDEBRAl eristetään ja puh- • distetaan lähtien transformoiduista PSLl-soluista ja käyttäen alkalinen lyysitekniikkaa (Sambrook et ai., . : s. 1.25 - 1.28). Tätä samaa tekniikkaa käytetään muissa esimerkeissä.
| 30 Kaikki transformoidut Bacillus subtilis-kannat pystyvät ilmentämään pullulanaasigeenin ja erittämään pullulanaasia.
I,, Plasmidin pUBDEBRAl sisältävät transformoidut PSL1- kannat noukitaan petrimaljaan, joka sisältää LB-kasvualus-: 35 taa, jossa on 25 pg/ml kanamysiiniä.
116531 40
Saadut pesäkkeet peitetään agaroosipäälikerroksel-la (l-%:inen, w/v), joka sisältää AZCL-pullulaania (0,1 % w/v) ja natriumasetaattia (100 mM, pH 4,5). 18 tunnin in-kuboinnin 60 °C:ssa jälkeen havaitaan, että kaikkia trans-5 formoitujen kantojen pesäkkeitä ympäröi AZCL-pullulaanin hydrolyysikehä.
Esimerkki 15
Bacillus licheniformis SE2 delapl-kannan valmistus
Isäntäkannan Bacillus licheniformis SE2 alkalisen 10 proteaasin geenin päässä sijaitsevien osien identi fiointi Tämä esimerkki koskee Bacillus licheniformis-isän-täkannan alkalisen proteaasin geenin päässä sijaitsevien osien identifiointia, jotta voitaisiin valmistaa delee-15 tioplasmidi mainitun geenin deletoimiseksi Bacillus licheniformis -kannasta SE2.
1. Kromosomi-DNA:n uuttaminen B^ licheniformis- kannasta SE2
Alkalinen proteaasigeenin eristämiseksi Bacillus 20 licheniformis-kannan SE2 kromosomi-DNA:sta ensin uutetaan kromosomi-DNA noudattaen esimerkissä 14 kromosomi-DNA:n ·. uuttamiseksi kuvattua menetelmää lukuun ottamatta LB-kas- vualustan muodostamaa kasvualustaa, ja puhdistetaan se.
2. Alkalinen proteaasigeenin C-terminaalisen osan 25 identifiointi * · ’ Uutetulle kromosomi-DNA:lie suoritetaan restrik- tioanalyysi, jota analyysiä kuvataan julkaisuissa Sam-< ' brook et ai., "Molecular Cloning", s. 1.85, ja Maniatis et ai., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold :: 30 Spring Harbor Laboratory, 1982, ss. 374 - 379. Näistä : pilkkomisista saadut DNA-fragmentit erotetaan niiden koon perusteella 0,8-%:isessa (w/v) agaroosigeelissä.
Agaroosigeeliä analysoidaan sitten Southern blot-;·’ tekniikalla (jota tekniikkaa kuvaavat Sambrook et ai., ; 35 s. 9.31) niiden fragmenttien identifioimiseksi, jotka si- 41 1 1 6531 sältävät alkalinen proteaasigeenin C-terminaalisen osan nukleotidisekvenssej ä.
Hybridisoinneissa käytettäväksi rakennettu koetin on synteettinen oligonukleotidi, joka vastaa alkalinen 5 proteaasigeenin C-terminaalista osaa. Synteettisen oligo-nukleotidin rakentamiseksi käytettyä tekniikkaa kuvataan julkaisussa Beaucage, S.L., et ai., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859 - 1882, ja siinä käytetään β-syanoetyylifos-foramidiitteja ja valmistajan Biosearch Cyclone Synthesi-10 zer laitetta. Rakennetun synteettisen oligonukleotidin sekvenssi (sekvenssi tunnusnro 2) on seuraava: 5'-GGCGGAGCAAGCTTTGTGG-3' 15 Nämä tulokset osoittavat, että alkalinen proteaa sigeenin C-terminaalinen osa sijaitsee noin 2,7 kep:n PstI-fragmentissa.
Hybridisointi DNA-koettimiin suoritetaan noudattaen tekniikkaa, jota kuvataan julkaisussa Sambrook et 20 ai., "Molecular Cloning", s. 9.52 - 9.55. Tätä samaa tekniikkaa käytetään muissa esimerkeissä.
·. Bacillus licheniformis-kannasta SE2 peräisin ole- . vaa kromosomi-DNA-uutevalmistetta pilkotaan sitten Pstl- entsyymillä ja saadut fragmentit erotetaan niiden koon 25 perusteella elektroforeettisesti agaroosigeelissä ; ·' (0,8-%:inen).
Saadut noin 2,7 kep:n Pstl-fragmentit uutetaan ’ geeleistä ja niitä puhdistetaan valmistajan BI0101 (USA) markkinoimalla, "Gene Clean"-tekniikaksi kutsutulla tek-; : ; 30 nilkalla käyttäen lasihelmiä.
Sitten 2,7 kep:n Pstl-fragmentit ligatoidaan (Sam-,λ brook et ai., s. 1.68 - 1.69) plasmidiin pUC18 (Clontech
Laboratories, nro 6110-1), jota on etukäteen pilkottu '*·’ PstI-keskuksesta ja joka on defosforyloitu. Näin saatu ; ; 35 ligatointiseos transformoitiin sitten Escherichia coli 116531 42 MC1061-soluihin CaCl2-tekniikalla (Sambrook et ai., s. 1.82 - 1.84). Tekniikkaa, jolla voidaan defosforyloida DNA-fragmentit tai linearisoida vektorit, kuvaavat Sambrook et ai. (s. 1.60 - 1.61). Ligatointitekniikkaa kuvaa-5 vat samoin Sambrook et ai. (s. 1.68 - 1.69).
Transformoidut kannat valikoidaan petrimaljoilla, jotka sisältävät LB-gelatiinikasvualustaa, jota on täydennetty 100 pg:lla/ml ampisilliiniä. Näin saadut transformoidut E^_ coli MC1061-kannat valikoidaan sitten hybri-10 disoimalla leimattuun synteettiseen oligonukleotidiin käyttäen Southern-kokeessa käytettyä C-terminaalista koe-tinta, ja eristetään plasmidi pKCl.
Synteettinen oligonukleotidi on leimattu fosfory-loimalla [gamma-32P]-ATP:llä käyttäen T4-fagin T4-poly-15 nukleotidikinaasia ja noudattaen Sambrookin et ai.
(s. 11.31 - 11.33) kuvaamaa tekniikkaa.
3. Aikaiinen proteaasigeenin N-terminaalisen osan identifiointi
Uutetulle kromosomi-DNA:lie suoritetaan restrik-20 tioanalyysi. Näistä pilkkomisista saadut DNA-fragmentit erotetaan niiden koon perusteella 0,8-%:isessa agaroosi-geelissä.
Sitten agaroosigeeliä analysoidaan Southern blot- * tekniikalla niiden fragmenttien identifioimiseksi, jotka , . 25 sisältävät alkalinen proteaasigeenin N-terminaalisen osan nukleotidisekvenssejä.
» I > ' ’ Hybridisoinneissa käytetty koetin on synteettinen • ’ oligonukleotidi, joka vastaa alkalinen proteaasigeenin N-terminaalista osaa. Rakennetun synteettisen oligonukleo- · 30 tidin sekvenssi (sekvenssi tunnusnro 3) on seuraava: • · _.:. 5’-ATGGCTCCTGGCGCAGGC-3’ ·;’ Nämä tulokset osoittavat, että alkalinen proteaa- •35 sigeenin N-terminaalinen osa sijaitsee noin 5,5 kep:n 116531 43
Pstl-fragmentissa ja samoin pienemmässä, noin 2 kep:n BclI-Pstl-fragmentissa. Tämä fragmentti ei sisällä res-triktiokeskuksia Xbal, Clal, Hpal ja SphI.
Bacillus licheniformis-kannasta SE2 peräisin ole-5 vaa kromosomi-DNA-uutevalmistetta pilkotaan sitten Pstl-entsyymillä ja saadut fragmentit erotetaan niiden koon perusteella elektroforeettisesti agaroosigeelissä (0,8-%:inen).
Saadut noin 5,5 kep:n fragmentit uutuetaan gee-10 leistä ja niitä puhdistetaan "Gene Clean"-tekniikaksi kutsutulla tekniikalla.
Näin saaduille 5,5 kep:n PstI-fragmenteille suoritetaan sitten sarja pilkkomisia entsyymeillä Bell, Xbal, Clal, Hpal ja SphI. Näin saadut DNA-fragmentit ligatoi-15 daan plasmidiin pMK4 [jota kuvataan julkaisussa Sullivan et ai., Gene 29 (1984) 21 - 26], joka on edeltäpäin tehty lineaariseksi BamHI:llä ja Pstl:llä. Plasmidi pMK4 voidaan saada kokoelmasta B.G.S.C. [Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State University) Columbus, Ohio, USA], jos-20 sa sen hakunumero on 1E29.
Näin saadut ligatointiseokset transformoidaan sit-*. ten Escherichia coli MC1061-soluihin CaCl2-tekniikalla.
Transformoidut kannat valikoidaan petrimaljoilla, jotka sisältävät gelatiini-LB-kasvualustaa, jota on täy-25 dennetty 100 pg:lla/ml ampisilliiniä. Näin saadut trans-formoidut E. coli MC1061-kannat valikoidaan sitten hybri- • · disoimalla leimattuun synteettiseen oligonukleotidiin
* I
• ‘ käyttäen N-terminaalista koetinta Southern-kokeessa, ja eristetään plasmidi pKPl.
* 30 Esimerkki 16
Alkalisen proteaasin sekvenssejä • J.t Plasmideihin pKPl ja pKCl vietyjen fragmenttien sekvenssit määritetään PstI-keskuksista Sacl-keskuksiin ';· noudattaen Sambrookin et ai. (ss. 13.15 ja 13.17 ja kuvio ,! 35 13.3B) kuvaamaa tekniikkaa.
116531 44
Esimerkki 17
Plasmidin pLDl rakentaminen
Plasmidi pLDl (kuvio 2) rakennetaan Bacillus liche-niformis-kannan SE2 delapl valmistamiseksi. Plasmidin pLDl 5 rakentamista kuvataan jäljempänä.
Plasmidi pKPl (joka saatiin esimerkissä 15) on epästabiili coli-kannassa MC1061. Tämän vuoksi B.
1icheniformis-kannan SE2 alkalinen proteaasigeenin N-ter-minaalisen osan sisältävä kromosomi-DNA-fragmentti vie-10 tiin vektoriin pACYC184 (Biolabs, USA, numero #401-M). Tämä vieminen suoritettiin viemällä plasmidin pKPl 1 849 ep:n EcoRI-EcoRI-fragmentti plasmidin pACYC184 EcoRI-kes-kukseen, minkä jälkeen ligatointiseoksella transformoitiin E^ coli MC1061-soluja. Näin saadaan plasmidi pKPNll. 15 Transformoidut kannat valikoidaan petrimaljalla, joka sisältää LB-gelatiinikasvualustaa, jota on täydennetty 12,5 pg:lla/ml tetrasykliiniä. 1 849 ep:n EcoRI-EcoRI-fragmentin suuntautuminen plasmidissa pKPNll määritetään restriktioanalyysillä (Sambrook et ai., s. 1.85, ja 20 Maniatis et ai., s. 374 - 379).
Plasmidi pKPN12 saadaan seuraavalla tavalla: 1 671 ep:n Styl-StyI-fragmentti otetaan plasmidista pKPNll pilkkomalla Styl:llä, minkä jälkeen tämä fragmentti kor-' vataan seuraavalla, etukäteen valmistetulla synteettisel- 25 lä kaksisäikeisellä DNA:11a: • * ‘ ·: 5' - CTTG GAGCTC GTTAAC AGATCT - 3' ' · · - ‘ (sekvenssi tunnusnro 4) 3' - CTCGAG CAATTG TCTAGA GTTC - 5' lii 30 (sekvenssi tunnusnro 5) (StyI) Sacl Hpal Balll (StyI) t s »
Plasmidien pilkkominen restriktioentsyymeillä suoritetaan noudattaen Sambrookin et ai., 1989, luvut 5.28 -: : 35 5.32, kuvaamaa tekniikkaa.
116531 45
Plasmidista pUB131 peräisin oleva DNA-fragmentti, joka koodittaa kanamysiini- ja bleomysiini- tai fleomy-siiniresistenssiä, saatiin seuraavasti: 2 666 ep:n Pstl-TaqI-fragmentti, joka käsittää ka-5 namysiini- ja bleomysiini- tai fleomysiiniresistenssiä koodittavat geenit, saadaan plasmidia pUBl31 sekä Pstl:llä että Taqltllä pilkkomalla. Tämä fragmentti viedään plas-midin pBS- (Stratagene, USA, numero 211202) Pstl-Accl-keskuksiin, jolloin saadaan plasmidi pBSKMPM.
10 Plasmidia pBSKMPM valmistettaessa ilmenee pieni deleetio sidosalueella plasmidin pBS- kanssa, mistä seuraa Sphl- ja Pstl-keskusten menetys plasmidissa pBSKMPM. Plasmidia pBSKMPM käytetään yksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi, jota käytetään kohdennetun mutagenisoinnin suo-15 rittamiseksi, jotta saataisiin mukaan kaksi synteettistä nukleotidia, joiden Smal-keskukset identifioidaan jäljempänä, yksi sijaitsee ylävirtaan ja toinen alavirtaan kanamysiini- ja fleomysiiniresistenssigeeneistä.
Kohdennetun mutagenisoinnin tekniikkaa kuvaavat 20 Sambrook et ai., s. 15.74 - 15.79. Siinä käytetään Bio-Radin myymää mutagenisointipakkausta (nro 170-3576).
Mutagenisoinnissa käytettyjen synteettisten oligo-nukleotidien sekvenssit ovat seuraavat (sekvenssit tun-nusnrot 6 ja vastaavasti 7): 25 5 ' -CATCTAATCTTCAACACCCGGGCCCGTTTGTTGAAC-3 ’ t t * ’ Smal :: 5'-CAAAATAAAAAAGATACAACCCGGGTCTCTCGTATCTTTTAT-3' ;.· * 30 Tällä mutagenisoinnilla kahden oligonukleotidin : : läsnä ollessa saatu plasmidi on plasmidi pBSKMPMl. Tämä plasmidi sisältää kaksi Smal-restriktiokeskusta, mikä mahdollistaa DNA-fragmentin eristyksen, joka sisältää ka- > · ';· namysiini- ja fleomysiiniresistenssiä koodittavat geenit.
116531 46
Sitten plasmidin pBSKMPMPl 1 597 ep:n Smal-Smal-fragmentti viedään plasmidin pKPN12 Smal-keskukseen, jolloin saadaan plasmidi pKPN14.
Plasmidiin pKPN14 viedyn fragmentin hyvästä suun-5 tautumisesta varmistutaan suorittamalla plasmidi-DNA-val-misteiden valikointi restriktioanalyysillä (Sambrook et ai., s. 1.85).
DNA-fragmentti, joka esiintyy plasmidissa pKCl ja sijaitsee alavirtaan alkalisen proteaasin N-terminaali-10 sesta sekvenssistä, eristetään plasmidin pKCl 1,2 kep:n SacI-Hindlll-fragmentissa (jollainen saatiin esimerkissä 15) pilkkomalla ensin HindIII:lla.
HindIII:n esiintyöntyvästä 5'-päästä tehdään tylppä käsittelemällä DNA-polymeraasin Klenow-fragmentilla (Sam-15 brook et ai., s. F.2 - F.3). Sitten suoritetaan pilkkominen Sacl:llä halutun tylppäpäisen SacI-Hindlll-fragmentin valmistamiseksi. Tämä fragmentti viedään plasmidin pKPN14 Hpal- ja Sacl-keskuksiin, jolloin saadaan plasmidi pLIDl.
Kaikki nämä rakentamiset suoritetaan transformoi-20 maila coli-kantaan MC1061 tetrasykliinin (12 pg/ml) läsnä ollessa transformoitujen kantojen valikoimiseksi.
B. subtiliksessa ja B^ licheniformiksessa monistumaan pystyvä plasmidi rakennetaan lähtemällä plasmidista pLIDl korvaten coli-replikaatiofunktiot, jotka käsit-25 tää plasmidin pLIDl 3 623 ep:n Bglll-Bglll-fragmentti, • fragmentilla, joka käsittää Bacilluksen replikaatiofunk- tiot: plasmidista pUB131 eristetty 2 238 ep:n Bglll-
BamHI-fragmentti.
Tämä Ej_ coli - replikaat iof unkt joiden korvaaminen j 30 Bacilluksen vastaavilla suoritettiin eristämällä ensin 3,6 kep:n Bglll-Bglll-fragmentti plasmidista pLIDl pilkkomalla plasmidi pLIDl Bglllilla ja BamHI:llä. Ylimääräinen pilkkominen BamHI:llä oli välttämätön, itse asiassa pilkkomal-la vain BglII:lla saataisiin samankokoisia fragmentteja, : 35 joita ei voitaisi erottaa elektroforeettisesti agaroosi- » 116531 47 geelissä. Sitten 3,6 kep:n Bglll-Bglll-fragmentti kloonataan Bacillus subtilis-kannassa SE3 2 238 ep:n Bglll-
BamHI-fragmentissa, joka on eristetty plasmidista pUB131, jolloin saadaan plasmidi pLDl (kuvio 2).
5 Bacillus subtilis-kanta SE3 on talletettu Budapes tin sopimuksen nojalla 21. kesäkuuta 1993 talletuskokoel-maan Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, jossa se on saanut hakunumeron LMG P-14035.
Esimerkki 18 10 Bacillus licheniformis-kannan SE2 delapl rakenta minen
Bacillus licheniformis-kannan SE2 kromosomi-DNAthan toivotut modifikaatiot suoritetaan homologiseen DNA-yhdistämiseen perustuvilla tekniikoilla. Modifikaa-15 tiot suoritetaan Bacillus licheniformis-kannan SE2 delapl valmistamiseksi.
Plasmidi pLDl transformoidaan B^ licheniformis-kantaan SE2 julkaisussa "Molecular Biological Methods for Bacillus" (ss. 150 - 151) kuvatulla protoplastitekniikal-20 la ja määritellyissä olosuhteissa lukuun ottamatta seu-raavia modifikaatioita: lysotsyymijauhetta lisätään *. SMMP:hen pitoisuus 5 mg/ml eikä 1 mg/ml kuten määritel- *, lään kuvatun menettelyn vaiheessa 7, inkubointi maksimaa lisen lyysin saamiseksi lysotsyymillä kestää 60 minuut- , . 25 tia, regenerointi suoritetaan DM3-kasvualustassa, jota kuvataan julkaisussa Harwood et ai., toim., "Molecular * I* Biological Methods for Bacillus", John Wiley & Sons, 1990, * * · ·' * ss. 150 - 151, ja joka sisältää 200 pg/ml kanamysiiniä.
Transformoitu kanta eristetään ja varmistetaan tä- ;,· | 30 hän kantaan viedyn plasmidin pLDl restriktiokartta.
: : Transformoitua kantaa viljellään 50 ml:ssa LB-kas- t vualustaa, jota on täydennetty 2 g:lla/litra glukoosia ja 25 pg:lla/ml kanamysiiniä, 18 tunnin ajan 37 °C:ssa.
'.** Otetaan viljelmänäyte (0,1 ml), jolla siirroste- 35 taan 50 ml samaa LB-kasvualustaa erlenmeyerissä. Viljel- 116531 48 mää inkuboidaan 37 °C:ssa 18 tunnin ajan. Tästä viljelmästä otetaan näyte, jota testataan petrimaljalla, joka sisältää LB-gelatiinikasvualustaa, jota on täydennetty 25 pg:lla/ml kanamysiiniä ja 1 %:lla (w/v) kuorittua mai-5 toa (Difco) proteaasin läsnäolon toteamiseksi.
Hydrolyysikehän puuttuminen pesäkkeiden ympäriltä, jotka kasvavat näillä petrimaljoilla, osoittaa, että nämä pesäkkeet eivät pysty tuottamaan alkalista proteaasia.
Kasvatuksia ja kokeita toistetaan, kunnes saadaan 10 kanta (apr", Kmr), eli kanta, joka yhtä aikaa ei enää tuota alkalista proteaasia (apr') ja on kanamysiiniresis-tentti (Kmr).
Tässä Bacillus licheniformis-kannassa SE2 delapl esiintyvä plasmidi pLDl otetaan sitten tästä viljelemällä 15 kasvualustalla 37 °C:ssa antibiootin puuttuessa.
Tätä kantaa kasvatetaan 50 ml:ssa LB-kasvualustaa, jota on täydennetty 2 g:lla/litra glukoosia, 18 tunnin ajan 37 °C:ssa. Tästä viljelmästä otetaan 0,1 ml:n tilavuus, jolla siirrostetaan toinen erlenmeyer, joka sisäl-20 tää samoin 50 ml samaa kasvualustaa; kasvatus kestää 18 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten otetaan näyte, joka levite-tään LB-kasvualustaa käsittävälle petrimaljalle. Eriste- ♦ ·. tyt pesäkkeet noukitaan toiselle LB-kasvualustaa käsit tävälle maljalle, jossa kasvualustaa on täydennetty 25 25 pg:lla/ml kanamysiiniä. Eristetään kanamysiinile herkkä kanta (Kms). Varmistetaan sen fenotyyppi (apr', Kms).
' Sitten tämän kannan kromosomi-DNA eristetään ja ·' * puhdistetaan ja kromosomideleetion rakenne vahvistetaan
Southern blot-tekniikalla. Identifioidut deleetiot ovat , * 30 oikeita asemansa osalta niiden tapahduttua homologisen ! : kaksois-DNA-yhdistymisen tuloksena sekvensseissä, jotka , sijaitsevat ylävirtaan (5') ja alavirtaan (3') alkalinen proteaasigeenistä.
* *
Saatu kanta nimetään kannaksi B^ licheniformis SE2 35 delapl. Se ei tuota alkalista proteaasia.
116531 49
Esimerkki 19
Bacillus lichenifonmis-kannan SE2 delapl transfor- mointi ilmentämisvektorilla
Plasmidi pUBDEBRAl (kuvio 1), jota kuvataan esi-5 merkissä 14, uutetaan isännästään, eristetään ja puhdistetaan (Sambrook et ai., 1989, s. 1.25 - 1.28).
Valmistetaan esimerkissä 18 kuvatun B_^ lichenifor-mis-kannan SE2 delapl viljelmä, minkä jälkeen tämä kanta transformoidaan tällä plasmidilla Maniatiksen et ai♦ 10 (s. 150 - 151) kuvaaman protoplastitekniikan mukaan.
Transformoitu kanta valikoidaan petrimaljalla, eristetään ja puhdistetaan seulomalla.
Esimerkki 20
Pullulanaasin tuottaminen licheniformis-kannal-15 la SE2 delapl (pUBDEBRAl)
Esimerkissä 19 saadun mukaista, plasmidilla pUBDEBRAl transformoitua B^ licheniformis-kantaa SE2 delapl viljellään 17 tunnin ajan 37 °C:ssa LB-esikasvualustas-sa, jota on täydennetty 0,5 %:lla (w/v) glukoosia ja 20 20 pg:lla/ml kanamysiiniä. Tällä esiviljelmällä siirroste- taan (5 % v/v) 50 ml M2-kasvualustaa, jota on täydennetty ·. 20 pg:lla/ml kanamysiiniä. M2-kasvualusta sisältää 30 g » soijajauhoa, 75 g liukoista tärkkelystä, 2 g natriumsul-’ faattia, 5 mg magnesiumkloridia, 3 g NaH2P04:ää, 0,2 g 25 CaCl2*H20:ta ja 1 000 ml vettä. Tämän M2-kasvualustan pH säädetään 5,8:ksi lisäämällä 10 N NaOH-liuosta ennen sen
• I
sterilointia. Viljelmää inkuboidaan ravistellen 80 tunnin ajan 37 °C:ssa. 80 tunnin kuluttua biomassa poistetaan sentrifugoimalla 5 000 kierr./min 10 minuutin ajan. Sent-,· j 30 rifugointisupernatantti otetaan talteen. Mitattaessa tä-: : män supernatantin entsyymiaktiivisuus todetaan pullula- . naasiaktiivisuuden läsnäolo.
116531 50
Esimerkki 21
Bacillus licheniform!s-kannan SE2 delapl (pUBCDEB- RAllDNSI) rakentaminen - Kromosomi-integraatio Tämä esimerkki koskee pullulanaasia koodittavan 5 geenin integraatiota Bacillus llchenlformis-kannan SE2 delapl kromosomiin.
Tämän tekemiseksi plasmidin pBRDEBRA3 4,6 ke: n EcoRI-BamHI-fragmentti kloonataan vektorin pUBC131 EcoRI-ja BamHI-keskuksiin transformoimalla coli-kanta MC1061, 10 jolloin muodostuu plasmidi pUBCDEBRAll.
Sitten rakennetaan integraatiovektori pUBCDEBRAll-DNS1 (kuvio 3) deletoimalla 886 ep:n Nsil-Nsil-fragmentti plasmidista pUBCDEBRAll. Näin saatu plasmidi on menettänyt mahdollisuuden replikoitua Bacilluksessa menettäes-15 sään 886 ep:n Nsil-fragmentin.
Tämän rakentamisen suorittamiseksi plasmidia pUBCDEBRAll pilkotaan restriktioentsyymillä Nsil, ja noin 9,4 kep:n Nsil-Nsil-fragmentti puhdistetaan elektroforeet-tisesti agaroosigeelissä. Sitten tämä fragmentti ligatoi-20 daan sen saattamiseksi jälleen ympyrän muotoon. Ligatoin-tiseos transformoidaan E^ coli-kantaan MC1061, jolloin \ saadaan plasmidi pUBCDEBRAllDNSIl.
Plasmidin pUBCDEBRAllDNSIl integroimiseksi B^ » licheniformis-kantaan SE2 delapl tämän plasmidin on vält-25 tämättä käsitettävä kromosomi-DNA:hän nähden homologinen DNA-fragmentti. Integraatiovektorin pUBCDEBRAllDNSIl BamHI-keskukseen kloonattiin siten B_^ licheni f ormiksesta peräisin olevia Sau3Al-kromosomifragmentteja.
Tämän suorittamiseksi Bacillus licheniformis-kan- ; 30 nasta SE2 delapl uutettu kromosomi-DNA pilkotaan osittain restriktioentsyymillä Sau3Al. Sitten kooltaan 1,5 - 3 ke:n DNA-fragmentit puhdistetaan agaroosigeelissä ja ligatoi- • * » daan plasmidiin pUBCDEBRAHDNSl, jota on pilkottu restriktioentsyymillä BamHI ja joka on defosforyloitu. Näin saatu 35 ligatointiseos transformoidaan MC1061-soluihin elektropo- 116531 51 raatiolla. Valikoimalla 100 μg/ml ampisilliiniä sisältävällä LB-gelatiinikasvualustalla saadaan noin 3 000 pesäkettä. Kaikki nämä pesäkkeet suspendoidaan LB-kasvualus-taan ja plasmidiuutto suoritetaan alkalinen lyysiteknii-5 kalla (Sambrook et ai., s. 1.25 - 1.28).
Näin saatu plasmidivalmiste viedään sitten transformoimalla protoplastitekniikalla Bacillus lichenifor-mis-kantaan SE2 delapl. Transformoidut solut valikoidaan regenerointikasvualustalla DM3 (jota kuvataan julkaisussa 10 "Molecular Biological Methods for Bacillus", Harwood, C.R., ja Cutting, S.M., toim, J.Wiley & Sons, 1990, s. 150 - 151) niiden resistenssin suhteen fleomysiinille (17 pg/ml), jolloin tätä resistenssiä ei niille voi tuoda kuin jonkin edellä rakennetun plasmidin kromosomi-integ-15 raatio.
Näin saadut pesäkkeet noukitaan LB-gelatiinikasvu-alustalle, jota on täydennetty 5 pg:lla/ml fleomysiiniä ja 0,06 %:lla AZCL-pullulaania. Sitten pesäke, jonka AZCL-pullulaanihydrolyysikehä on suurin, eristetään ja nouki-20 taan LB-gelatiinikasvualustalle.
Sitten suoritetaan tämän kannan plasmidisisällön uuttaminen. Näin saatu valmiste analysoidaan elektrofo-reettisesti agaroosigeelissä, jolloin ilmenee plasmidin puuttuminen.
25 Kromosomi-DNA eristetään ja puhdistetaan kuten ku vattiin esimerkissä 14 ja analysoidaan Southern-tekniikalla, jolloin ilmenee, että plasmidi pUBCDEBRAHDNSI on ’ integroitunut kromosomi-DNA:hän homologisen DNA-yhdisty- misen tuloksena noin 3 ke:n Sau3Al-fragmentissa.
30 Tämä osoittaa, että B^ deramificans-pullulanaasia koodittava geeni ilmentyy B^ licheniformiksessa kromosomiin integroituneessa muodossa.
116531 52
Esimerkki 22
Menetelmä pullulanaasin tuottamiseksi Bacillus licheni f onni s-kannalla SE2 delapl (pUBCDEBRAllDNSI) B. licheniformis-kantaa SE2 delapl, joka sisältää 5 pullulanaasin geenin kromosomi-DNA:hän integroituneessa muodossa esimerkissä 21 kuvatun mukaisesti, viljellään 17 tunnin ajan 37 °C:ssa LB-esikasvualustassa, jota on täydennetty 0,5 %:lla (w/w) glukoosia ja 5 pg:lla/ml fleomy-siiniä. 10 ml:n tilavuus tätä esiviljelmää siirrostetaan 10 250 ml:aan M2-kasvualustaa (jota kuvataan esimerkissä 20), jota on täydennetty 5 pg:lla/ml fleomysiiniä, ravistelu-kolvissa.
24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa ravistellen näin saatu viljelmä kokonaisuudessaan viedään fermen-15 toriin, joka sisältää 6,5 litraa M2-kasvualustaa. Fermen-toinnin annetaan kestää 72 tunnin ajan 37 °C:ssa. pH pidetään arvossa alle 7,0 lisäämällä konsentroitua fosfori-happoa, ilmavirtaus pidetään 4 litrana/min ja ravistelu säädetään siten, että liuenneen hapen pitoisuudeksi saa-20 daan yli 30 % (v/v) kyllästyspitoisuudesta.
Saatuun viljelmään lisätään 50 ml flokkulointiai-netta, jossa pohjana on polyamiini ja jota myy nimellä OptiflocR FC 205 valmistaja Solvay Deutschland, minkä jälkeen biomassa poistetaan sentrifugoimalla (Beckman 25 JA-10) 5 000 kierr./min 15 minuutin ajan ja saatu superna- tantti tehdään happamaksi pH:hon 4,5 lisäämällä 1 N HC1-liuosta. Saatua liuosta sentrifugoidaan jälkeen 8 000 ' kierr./min 15 minuutin ajan (Beckman JA-10).
Sitten supernatantti konsentroidaan 1 litran lop-> 30 putilavuuteen ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatus- ; yksikköä, joka on varustettu membraanilla, jonka resoluu- tioraja on 5 000 daltonia.
... Sitten tähän konsentroituun liuokseen lisätään asetonia loppupitoisuuteen 60 % (v/v). Muodostunutta sus-35 pensiota inkuboidaan 4 °C:ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen 116531 53 sitä sentrifugoidaan 15 minuutin ajan 8 000 kierr./min (Beckman JA-10). Saatu sentrifugointipelletti suspendoi-daan 100 ml:aan vesiliuosta, joka sisältää 30 % (w/v) leimattua tärkkelystä Maltrinr 250 (Grain Processing Corpo-5 ration), 0,3 % (w/v) natriumbentsoaattia ja 0,15 % (w/v) kaliumsorbaattia, pH 4,5. Näin saatu, yhdistelmä-DNA-kan-nan tuottaman pullulanaasin puhdistettu valmiste nimetään liuokseksi D.
Pullulanaasiliuoksen D aktiivisuus mitattuna pel-10 kistävien sokerien menetelmällä on 150 PUN/ml.
Esimerkki 23
Bacillus licheniformis-kannan SE2 delapl (pUBCDEB- RAllDNSI) tuottaman pullulanaasin stabiilisuus lämpötilan suhteen 15 Esimerkissä 22 saatua pullulanaasiliuosta D lai mennetaan siten, että sen entsyymiaktiivisuudeksi tulee 10 - 15 PUN/ml, 0,05 M sitraatti-fosfaattipuskuriin, pH 4,75.
Tämä laimennettu, pullulanaasia sisältävä liuos 20 jaetaan 9 putkeen annoksina 5 ml laimennettua liuosta putkea kohden.
Laimennettua liuosta sisältäviä eri putkia inku-boidaan vesihauteissa lämpötiloissa, jotka ovat 40 - 80 °C, ' 75 minuutin ajan.
25 Tämän inkuboinnin jälkeen ne sijoitetaan jäähau- teeseen niiden jäähdyttämiseksi nopeasti.
·’ ·’ Sitten mitataan eri liuosten entsyymiaktiivisuus ’ (mittausolosuhteet: lämpötila 60 °C, pH 4,5, inkuboinnin kesto 15 minuuttia).
·,· | 30 Tämän kokeen puitteissa maksimaalinen entsyymiak- : : tiivisuus mitattiin näytteelle, joka sijoitettiin pH:hon j. noin 4,75 ja noin 55 °C:n lämpötilaan. Määritelmän mukaan tämän näytteen suhteelliseksi entsyymiaktiivisuudeksi ase-·; ' tettiin siten 100 %.
: : 35 Tulokset on koottu taulukkoon 12.
116531 54
Taulukko 12
Suhteellinen Lämpötila entsyymiaktiivisuus % 5 40 99 45 99 50 100 55 100 60 96 10 65 83 70 2 80 1 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaiselle 15 pullulanaasille mitataan vähintään 80 %:n suhteellinen entsyymiaktiivisuus 75 minuutin inkuboinnin jälkeen pH:ssa 4,75 substraatin puuttuessa ja lämpötilassa, joka on alle tai yhtä kuin 65 °C. 1 Ψ 55 1 1 6531
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION : (i) APPLICANT : (A) NAME : SOLVAY (Societe Anonyme) (B) STREET : rue du Prince Albert, 33 (C) CITY : Bruxelles (E) COUNTRY : Belgique (F) POSTAL CODE : 1050 (G) PHONE : (02) 509.61.11 (ii) TITLE OF INVENTION : Pullulanase, microorganisms which produce it, processes for the preparation of this pullulanase and the uses thereof .
(iii) NUMBER OF SEQUENCES : 15 (iv) COMPUTER READABLE FORM : (A) MEDIUM TYPE : Floppy disk (B) COMPUTER : IBM PC compatible
: (C) OPERATING SYSTEM : PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE : Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB) * 1 • (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: :.: I (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH : 20 amino acids * (B) TYPE : amino acid ‘ (D) TOPOLOGY : linear * » (ii) MOLECULE TYPE : peptide 56 1 1 6 5 31 (v) FRAGMENT TYPE : N-terminal fragment (vi) ORIGINE SOURCE : (A) ORGANISME : Bacillus deramificans
(B) STRAIN : T 89.117D
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:1:
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Cys Pro Ala Gly 15 10 15
Asp Tyr Gin Pro 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH : 19 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear . (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (oligonucleotide • synthetique) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:2: : GGCGGAGCAA GCTTTGTGG 19 *;; * (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3 : (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH : 18 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single , (D) TOPOLOGY : linear 116531 57 (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (synthetic oligonucleotide) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:3: ATGGCTCCTG GCGCAGGC 18 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH : 22 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (synthetic oligonucleotide) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID.NO :4: CTTGGAGCTC GTTAACAGAT CT 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : * (A) LENGTH : 22 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear ; (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (synthetic oligonucleotide) 116531 58 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:5: CTTGAGATCT GTTAACGAGC TC 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH : 36 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (synthetic oligonucleotide) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:6: CATCTAATCT TCAACACCCG GGCCCGTTTG TTGAAC 36 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : : (A) LENGTH : 42 base pairs (B) TYPE : nucleic acid ' (C) STRANDEDNESS : single : : (D) TOPOLOGY : linear (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (synthetic oligonucleotide) ; (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:7: CAAAATAAAA AAGATACAAC CCGGGTCTCT CGTATCTTTT AT 42 ‘ ; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: 116531 59 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH : 4464 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear
(ii) MOLECULE TYPE : genomic DNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:8: GGATCCTGTT AGACTATTTG AGGAGTTTGC AACACTTGAT GTTTTATCCA AAGGAAGGGC 60 CGGAGATCAT CGCTGGTCGA GGTGCTTTCG GTGAAGCATT TTCGCTATTT TGGGTATAAC 120 CGGGCGCATT ACGATCAATT GTTTGAAGAG CATCTTGATT TACTTCAAAA GCTGAATGCT 180 TCGAAAAGAA TAACATGGAG CGGGCTTTAT CGAACACCTA TACATGATGC AGATATCGCA 240 CCCCGCCCTG TTCAGAAAAA CATTCCTTTG TGGGTTGGGG TGGGTGGGAC NMNTGAAASC 300 NSYKCKYYGT GCRNVSNNNT ATGGTGCCGG CTTAGCATGG GTATTTTGTC AGGCGATTGG 360 CTTCGGTTTA AGGCACTTTC GGACCTTTAT CGGCAGGCCG GCCAACAAGC ANGGTATTCA 420 CCGAACGATC TGAAAGTAGG AGTGACAGGG CATGCGTTTA TTGGAAAGAC GTCGCAGCAG 480 GCACTCAATG ACTATTACCC CTATCACGCG AATTATTGGC TAACACTGAA CCAACAATTA 54 0 GGGCAGCCGT TACCCCAGCA ATACGTGAGG GAATTTAATT TATTAGCCTC CCCAGAGCAA 600 GCCTTATATG TGGGAAGCTC TCAACAAGTG GGCAGGNAAA AATTTTGCGC CAACATGAGG 660 NATTTGGTNA TAAACGTTTT ATCGCACAGA TCGACATTGG CGGAATGCCC TTTAAAACAG 720 TGGCCAAGAA TATTGAGCGG TTAGGCCACT GAGGTTGCAC CTGTCGTACG AAGAGCAACA 780 AGAGGGTAAT GGTAATAATC TATTTAACTG TTTATTAGAA AACTTGGTAT CTGTTTAATT 840 AAATAACAGG AGCCTGGAAG TGGGCCAAGG CTCCTTTCTA GGGAAACCTT TTTCTATTTA 900 TATAGGCGTT GTTGCCTAAG GCTAAAGTAG GATTTTATTA AAAATATAGG AATTGCTCTT 960 TTATTCGACA CAATTATTCA ATGGAATACG ATAAAATGGA GAGTGTATGT AAGCGTTATA 102 0 TTTTATTGGG GGGCTGATAG AAGAAAAGGG ATGCGACAGG GTCTATTAGC TAGTTTGGTA 1080 TTCGATTTCA GATCAATGCA ACGTACGAGT TTTTTATTGA CTGCTTTGTG CAAGCGATTG 1140 CATTGAAACA AAGGAGGACA TTATGGCTAA AAAACTAATT TATGTGTGTT TAAGTGTTTG 1200 . TTTAGTGTTG ACCTGGGCTT TTAATGTAAA AGGGCAATCT GCTCATGCTG ATGGGAACAC 1260 GACAACGATC ATTGTCCACT ATTTTTGCCC TGCTGGTGAT TATCAACCTT GGAGTCTATG 132 0 • GATGTGGCCA AAAGACGGAG GTGGGGCTGA ATACGATTTC AATCAACCGG CTGACTCTTT 1380 TGGAGCTGTT GCAAGTGCTG ATATTCCAGG AAACCCAAGT CAGGTAGGAA TTATCGTTCG 144 0 CACTCAAGAT TGGACCÄAAG ATGTGAGCGC TGACCGCTAC ATAGATTTAA GCAAAGGAAA 1500 : TGAGGTGTGG CTTGTAGAAG GAAACAGCCA AATTTTTTAT AATGAAAAAG ATGCTGAGGA 1560 TGCAGCTAAA CCCGCTGTAA GCAACGCTTA TTTAGATGCT TCAAACCAGG TGCTGGTTAA 1620 • ACTTAGCCAG CCGTTAACTC TTGGGGAAGG NNNAAGCGGC TTTACGGTTC ATGACGACAC 1680 AGCAAATAAG GATATTCCAG TGACATCTGT GAAGGATGCA AGTCTTGGTC AAGATGTAAC 1740 • CGCTGTTTTG GCAGGTACCT TCCAACATAT TTTTGGAGGT TCCGATTGGG CACCTGATAA 1800 TCACAGTACT TTATTAAAAA AGGTGACTAA CAATCTCTAT CAATTCTCAG GAGATCTTCC 1860 • TGAAGGAAAC TACCAATATA AAGTGGCTTT AAATGATAGC TGGAATAATC CGAGTTACCC 192 0 ATCTGACAAC ATTAATTTAA CAGTCCCTGC CGGCGGTGCA CACGTCACTT TTTCGTATAT 1980 TCCGTCCACT CATGCAGTCT ATGACACAAT TAATAATCCT AATGCGGATT TACAAGTAGA 2040 AAGCGGGGTT AAAACGGATC TCGTGACGGT TACTCTAGGG GAAGATCCAG ATGTGAGCCA 2100 ..:: TACTCTGTCC ATTCAAACAG ATGGCTATCA GGCAAAGCAG GTGATACCTC GTAATGTGCT 2160 TAATTCATCA CAGTACTACT ATTCAGGAGA TGATCTTGGG AATACCTATA CACAGAAAGC 2220 1 · ‘ AACAACCTTT AAAGTCTGGG CACCAACTTC TACTCAAGTA AATGTTCTTC TTTATGACAG 22 80 TGCAACGGGT TCTGTAACAA AAATCGTACC TATGACGGCA TCGGGCCATG GTGTGTGGGA 2340 : : : AGCAACGGTT AATCAAAACC TTGAAAATTG GTATTACATG TATGAGGTAA CAGGCCAAGG 2400 CTCTACCCGA ACGGCTGTTG ATCCTTATGC AACTGCGATT GCACCAAATG GAACGAGAGG 2460 : : CATGATTGTG GACCTGGCTA AAACAGATCC TGCTGGCTGG AACAGTGATA AACATATTAC 2520 GCCAAAGAAT ATAGAAGATG AGGTCATCTA TGAAATGGAT GTCCGTGACT TTTCCATTGA 2580 .·*. CCCTAATTCG GGTATGAAAA ATAAAGGGAA GTATTTGGCT CTTACAGAAA AAGGAACAAA 2640 GGGCCCTGAC AACGTAAAGA CGGGGATAGA TTCCTTAAAA CAACTTGGGA TTACTCATGT 2700 TCAGCTTATG CCTGTTTTCG CATCTAACAG TGTCGATGAA ACTGATCCAA CCCAAGATAA 2760 TTGGGGTTAT GACCCTCGCA ACTATGATGT TCCTGAAGGG CAGTATGCTA CAAATGCGAA 2820 TGGTAATGCT CGTATAAAAG AGTTTAAGGA AATGGTTCTT TCACTCCATC GTGAACACAT 2880 116531 60 TGGGGTTAAC ATGGATGTTG TCTATAATCA TACCTTTGCC ACGCAAATCT CTGACTTCGA 2940 TAAAATTGTA CCAGAATATT ATTACCGTAC GATGATGCAG GTAATTATAC CAACGGATCA 3 000 GGTACTGGAA ATGAAATTGC ANGCNGAAAG GCCAATGGTT CAAAAATTTA TTATTGATTC 3060 CCTTAAGTAT TGGGTCAATG AGTATCATAT TGACGGCTTC CGTTTTGACT TAATGGCGCT 3120 GCTTGGAAAA GACACGATGT CCAAAGCTGC CTCGGAGCTT CATGCTATTA ATCCAGGAAT 3180 TGCACTTTAC GGTGAGCCAT GGACGGGTGG AACCTCTGCA CTGCCAGATG ATCAGCTTCT 324 0 GACAAAAGGA GCTCAAAAAG GCATGGGAGT AGCGGTGTTT AATGACAATT TACGAAACGC 3300 GTTGGACGGC AATGTCTTTG ATTCTTCCGC TCAAGGTTTT GCGACAGGTG CAACAGGCTT 3360 AACTGATGCA ATTAAGAATG GCGTTGAGGG GAGTATTAAT GACTTTACCT CTTCACCAGG 3420 TGAGACAATT AACTATGTCA CAAGTCATGA TAACTACACC CTTTGGGACA AAATAGCCCT 3480 AAGCAATCCT AATGATTCCG AAGCGGATCG GATTAAAATG GATGAACTCG CACAAGCAGT 3540 TGTTATGACC TCACAAGGCG TTCCATTCAT GCAAGGCGGG GAAGAAATGC TTCGTANAAA 3600 AGGCGGCAAC GACAATAGTT ATAATGCAGG CGATGCGGTC AATGAGTTTG ATTGGAGCAG 3660 GAAAGCTCAA TATCCAGATG TTTTCAACTA TTATAGCGGG CTAATCCACC TTCGTCTTGA 3720 TCACCCAGCC TTCCGCATGA CGACAGCTAA TGAAATCAAT AGCCACCTCC AATTCCTAAA 3780 TAGTCCAGAG AACACAGTGG CCTATGAATT AACTGATCAT GTTAATAAAG ACAAATGGGG 3 84 0 AAATATCATT GTTGTTTATA ACCCAAATAA AACTGTAGCA ACCATCAATT TGCCGAGCGG 39 0 0 GAAATGGGCA ATCAATGCTA CGAGCGGTAA GGTAGGAGAA TCCACCCTTG GTCAAGCAGA 3960 GGGAAGTGTC CAAGTACCAG GTATATCTAT GATGATCCTT CATCAAGAGG TAAGCCCAGA 4 02 0 CCACGGTAAA AAGTAATAGA AAAAAGTAAA ATCCCCTCAA GATGTTTGAG GGGGATTTAG 4080 TTACTTATTA TCCAATTAAT TTGCGGCTTC GGTGTTTTCA ATGGGCTCCG TATCCGTTCG 4140 GTTGTGTGAT CGGACAAATG GGAGTGAATA GGTCACAAGA GCAGCAGCCA TTTCAAGCAG 4200 ACCAGCGAAA GTAAACATTC GTTCTGGTGC AAATCGGGTC ATCAACCAAC CGGTAATTGC 4260 TTGGGAAATA GGGATGGACC CTGACATCAC GATAATCATA ATACTAATAA CACGACCGAA 4320 TAACTTAGGT GGAATAAGCG TATGGTTAAC GCTTGGAGCA ATAATATTAA CCGCCGTTTC 4380 ATGAGCGCCA ACAAGCACTA GAAGGGCTAA AATAACCCAT AAGTTGTGTG TAAATCCTAT 444 0 AAAAAATAAC ATAAGGCCCT GCAG 44 64 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : \ (A) LENGTH : 4464 base pairs .! (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear
'* (ii) MOLECULE TYPE : genomic DNA
. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:9: ,: GGATCCTGTT AGACTATTTG AGGAGTTTGC AACACTTGAT GTTTTATCCA AAGGAAGGGC 60 ,Ί': CGGAGATCAT CGCTGGTCGA GGTGCTTTCG GTGAAGCATT TTCGCTATTT TGGGTATAAC 120 CGGGCGCATT ACGATCAATT GTTTGAAGAG CATCTTGATT TACTTCAAAA GCTGAATGCT 180 TCGAAAAGAA TAACATGGAG CGGGCTTTAT CGAACACCTA TACATGATGC AGATATCGCA 240 CCCCGCCCTG TTCAGAAAAA CATTCCTTTG TGGGTTGGGG TGGGTGGGAC NMNTGAAASC 300 NSYKCKYYGT GCRNVSNNNT ATGGTGCCGG CTTAGCATGG GTATTTTGTC AGGCGATTGG 360 116531 61 CTTCGGTTTA AGGCACTTTC GGACCTTTAT CGGCAGGCCG GCCAACAAGC ANGGTATTCA 420 CCGAACGATC TGAAAGTAGG AGTGACAGGG CATGCGTTTA TTGGAAAGAC GTCGCAGCAG 480 GCACTCAATG ACTATTACCC CTATCACGCG AATTATTGGC TAACACTGAA CCAACAATTA 540 GGGCAGCCGT TACCCCAGCA ATACGTGAGG GAATTTAATT TATTAGCCTG CCCAGAGCAA 600 GCCTTATATG TGGGAAGCTC TCAACAAGTG GGCAGGNAAA AATTTTGCGC CAACATGAGG 660 NATTTGGTNA TAAACGTTTT ATCGCACAGA TCGACATTGG CGGAATGCCC TTTAAAACAG 720 TGGCCAAGAA TATTGAGCGG TTAGGCCACT GAGGTTGCAC CTGTCGTACG AAGAGCAACA 780 AGAGGGTAAT GGTAATAATC TATTTAACTG TTTATTAGAA AACTTGGTAT CTGTTTAATT 840 AAATAACAGG AGCCTGGAAG TGGGCCAAGG CTCCTTTCTA GGGAAACCTT TTTCTATTTA 900 TATAGGCGTT GTTGCCTAAG GCTAAAGTAG GATTTTATTA AAAATATAGG AATTGCTCTT 960 TTATTCGACA CAATTATTCA ATGGAATACG ATAAAATGGA GAGTGTATGT AAGCGTTATA 1020 TTTTATTGGG GGGCTGATAG AAGAAAAGGG ATGCGACAGG GTCTATTAGC TAGTTTGGTA 1080 TTCGATTTCA GATCAATGCA ACGTACGAGT TTTTTATTGA CTGCTTTGTG CAAGCGATTG 1140 CATTGAAACA AAGGAGGACA TT ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT 1189
Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys -25 TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG ACC TGG GCT TTT AAT GTA AAA GGG CAA 1237
Leu Ser Val Cys Leu Val Leu Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gin -20 -15 -10 -5 TCT GCT CAT GCT GAT GGG AAC ACG ACA ACG ATC ATT GTC CAC TAT TTT 1285
Ser Ala His Ala Asp Gly Asn Thr Thr Thr lie lie Val His Tyr Phe -1 +1 5 10 TGC CCT GCT GGT GAT TAT CAA CCT TGG AGT CTA TGG ATG TGG CCA AAA 1333 ‘ Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gin Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys . 15 20 25 GAC GGA GGT GGG GCT GAA TAC GAT TTC AAT CAA CCG GCT GAC TCT TTT 1381
Asp Gly Gly Gly Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gin Pro Ala Asp Ser Phe 30 35 40 ; GGA GCT GTT GCA AGT GCT GAT ATT CCA GGA AAC CCA AGT CAG GTA GGA 14 29
Gly Ala Vai Ala Ser Ala Asp He Pro Gly Asn Pro Ser Gin Val Gly 45 50 55 60 ATT ATC GTT CGC ACT CAA GAT TGG ACC AAA GAT GTG AGC GCT GAC CGC 14 77
He He Val Arg Thr Gin Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg ; ; : 65 70 75 TAC ATA GAT TTA AGC AAA GGA AAT GAG GTG TGG CTT GTA GAA GGA AAC 1525
Tyr He Asp Leu Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn ;·. 80 85 90 I * AGC CAA ATT TTT TAT AAT GAA AAA GAT GCT GAG GAT GCA GCT AAA CCC 1573 ’...· Ser Gin He Phe Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro 95 100 105 62 1 1 6531 GCT GTA AGC AAC GCT TAT TTA GAT GCT TCA AAC CAG GTG CTG GTT AAA 1621
Ala Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gin Val Leu Val Lys 110 115 120 CTT AGC CAG CCG TTA ACT CTT GGG GAA GGN NNA AGC GGC TTT ACG GTT 1669
Leu Ser Gin Pro Leu Thr Leu Gly Glu Gly Xaa Ser Gly Phe Thr Val 125 130 135 140 CAT GAC GAC ACA GCA AAT AAG GAT ATT CCA GTG ACA TCT GTG AAG GAT 1717
His Asp Asp Thr Ala Asn Lys Asp lie Pro Val Thr Ser Val Lys Asp 145 150 155 GCA AGT CTT GGT CAA GAT GTA ACC GCT GTT TTG GCA GGT ACC TTC CAA 1765 Ala Ser Leu Gly Gin Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gin 160 165 170 CAT ATT TTT GGA GGT TCC GAT TGG GCA CCT GAT AAT CAC AGT ACT TTA 1813 His lie Phe Gly Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu 175 180 185 TTA AAA AAG GTG ACT AAC AAT CTC TAT CAA TTC TCA GGA GAT CTT CCT 18 61 Leu Lys Lys Val Thr Asn Asn Leu Tyr Gin Phe Ser Gly Asp Leu Pro 190 195 200 GAA GGA AAC TAC CAA TAT AAA GTG GCT TTA AAT GAT AGC TGG AAT AAT 19 09 Glu Gly Asn Tyr Gin Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn 205 210 215 220 CCG AGT TAC CCA TCT GAC AAC ATT AAT TTA ACA GTC CCT GCC GGC GGT 1957 Pro Ser Tyr Pro Ser Asp Asn lie Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly 225 230 235 GCA CAC GTC ACT TTT TCG TAT ATT CCG TCC ACT CAT GCA GTC TAT GAC 2005 Ala His Val Thr Phe Ser Tyr lie Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp 240 245 250 ACA ATT AAT AAT CCT AAT GCG GAT TTA CAA GTA GAA AGC GGG GTT AAA 2053 Thr lie Asn Asn Pro Asn Ala Asp Leu Gin Val Glu Ser Gly Val Lys \ 255 260 265 ACG GAT CTC GTG ACG GTT ACT CTA GGG GAA GAT CCA GAT GTG AGC CAT 2101 Thr Asp Leu Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His 270 275 280 ; ACT CTG TCC ATT CAA ACA GAT GGC TAT CAG GCA AAG CAG GTG ATA CCT 2149 * Thr Leu Ser lie Gin Thr Asp Gly Tyr Gin Ala Lys Gin Val lie Pro ; 285 290 295 300 CGT AAT GTG CTT AAT TCA TCA CAG TAC TAC TAT TCA GGA GAT GAT CTT 2197 Arg Asn Val Leu Asn Ser Ser Gin Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu 305 310 315 ; ; GGG AAT ACC TAT ACA CAG AAA GCA ACA ACC TTT AAA GTC TGG GCA CCA 224 5
Gly Asn Thr Tyr Thr Gin Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro : 320 325 330 : , ACT TCT ACT CAA GTA AAT GTT CTT CTT TAT GAC AGT GCA ACG GGT TCT 2293 ' Thr Ser Thr Gin Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser ,··, 335 340 345 * * ,:, GTA ACA AAA ATC GTA CCT ATG ACG GCA TCG GGC CAT GGT GTG TGG GAA 2341 ’ ,* Val Thr Lys lie Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu 350 355 360 63 1 1 6531 GCA ACG GTT AAT CAA AAC CTT GAA AAT TGG TAT TAC ATG TAT GAG GTA 2389
Ala Thr Val Asn Gin Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val 365 370 375 380 ACA GGC CAA GGC TCT ACC CGA ACG GCT GTT GAT CCT TAT GCA ACT GCG 2437
Thr Gly Gin Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala 385 390 395 ATT GCA CCA AAT GGA ACG AGA GGC ATG ATT GTG GAC CTG GCT AAA ACA 24 85 lie Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met lie Val Asp Leu Ala Lys Thr 400 405 410 GAT CCT GCT GGC TGG AAC AGT GAT AAA CAT ATT ACG CCA AAG AAT ATA 2533
Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp Lys His lie Thr Pro Lys Asn lie 415 420 425 GAA GAT GAG GTC ATC TAT GAA ATG GAT GTC CGT GAC TTT TCC ATT GAC 2581
Glu Asp Glu Val lie Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser lie Asp 430 435 440 CCT AAT TCG GGT ATG AAA AAT AAA GGG AAG TAT TTG GCT CTT ACA GAA 2 629
Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu 445 450 455 460 AAA GGA ACA AAG GGC CCT GAC AAC GTA AAG ACG GGG ATA GAT TCC TTA 2 677
Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly lie Asp Ser Leu 465 470 475 AAA CAA CTT GGG ATT ACT CAT GTT CAG CTT ATG CCT GTT TTC GCA TCT 2725
Lys Gin Leu Gly lie Thr His Val Gin Leu Met Pro Val Phe Ala Ser 480 485 490 AAC AGT GTC GAT GAA ACT GAT CCA ACC CAA GAT AAT TGG GGT TAT GAC 2773
Asn Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gin Asp Asn Trp Gly Tyr Asp 495 500 505 CCT CGC AAC TAT GAT GTT CCT GAA GGG CAG TAT GCT ACA AAT GCG AAT 2821
Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gin Tyr Ala Thr Asn Ala Asn 510 515 520 GGT AAT GCT CGT ATA AAA GAG TTT AAG GAA ATG GTT CTT TCA CTC CAT 2869 .* Gly Asn Ala Arg lie Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His 525 530 535 540 CGT GAA CAC ATT GGG GTT AAC ATG GAT GTT GTC TAT AAT CAT ACC TTT 2917 I Arg Glu His lie Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe . *, 545 550 555 , GCC ACG CAA ATC TCT GAC TTC GAT AAA ATT GTA CCA GAA TAT TAT TAC 2965 ’* ’ Ala Thr Gin lie Ser Asp Phe Asp Lys lie Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr 560 565 570 I ,CGT ACG ATG ATG CAG GTA ATT ATA CCA ACG GAT CAG GTA CTG GAA ATG 3 013 **' · Arg Thr Met Met Gin VaL lie lie Pro Thr Asp Gin Val Leu Glu Met 575 580 585 AAA TTG CAN GCN GAA AGG CCA ATG GTT CAA AAA TTT ATT ATT GAT TCC 3061 ί I · Lys Leu Xaa Ala Glu Arg Pro Met Val Gin Lys Phe lie lie Asp Ser 590 595 600 I « CTT AAG TAT TGG GTC AAT GAG TAT CAT ATT GAC GGC TTC CGT TTT GAC 3109
Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His lie Asp Gly Phe Arg Phe Asp 605 610 615 620
• t t I
64 1 1 6531 TTA ATG GCG CTG CTT GGA AAA GAC ACG ATG TCC AAA GCT GCC TCG GAG 3157
Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu 625 630 635 CTT CAT GCT ATT AAT CCA GGA ATT GCA CTT TAC GGT GAG CCA TGG ACG 3205
Leu His Ala lie Asn Pro Gly lie Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr 640 645 650 GGT GGA ACC TCT GCA CTG CCA GAT GAT CAG CTT CTG ACA AAA GGA GCT 3 253
Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gin Leu Leu Thr Lys Gly Ala 655 660 665 CAA AAA GGC ATG GGA GTA GCG GTG TTT AAT GAC AAT TTA CGA AAC GCG 33 01
Gin Lys Gly Met Gly Vai Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala 670 675 680 TTG GAC GGC AAT GTC TTT GAT TCT TCC GCT CAA GGT TTT GCG ACA GGT 3 349
Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala Gin Gly Phe Ala Thr Gly 685 690 695 700 GCA ACA GGC TTA ACT GAT GCA ATT AAG AAT GGC GTT GAG GGG ACT ATT 3397
Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala lie Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser lie 705 710 715 AAT GAC TTT ACC TCT TCA CCA GGT GAG ACA ATT AAC TAT GTC ACA AGT 344 5
Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr lie Asn Tyr Val Thr Ser 720 725 730 CAT GAT AAC TAC ACC CTT TGG GAC AAA ATA GCC CTA AGC AAT CCT AAT 3493
His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys lie Ala Leu Ser Asn Pro Asn 735 740 745 GAT TCC GAA GCG GAT CGG ATT AAA ATG GAT GAA CTC GCA CAA GCA GTT 3541
Asp Ser Glu Ala Asp Arg lie Lys Met Asp Glu Leu Ala Gin Ala Val 750 755 760 GTT ATG ACC TCA CAA GGC GTT CCA TTC ATG CAA GGC GGG GAA GAA ATG 3589
Val Met Thr Ser Gin Gly Val Pro Phe Met Gin Gly Gly Glu Glu Met 765 770 775 780 ·. CTT CGT ANA AAA GGC GGC AAC GAC AAT AGT TAT AAT GCA GGC GAT GCG 3637 ·* Leu Arg Xaa Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala 785 790 795 ; GTC AAT GAG TTT GAT TGG AGC AGG AAA GCT CAA TAT CCA GAT GTT TTC 3685 • Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gin Tyr Pro Asp Val Phe ; 800 805 810 AAC TAT TAT AGC GGG CTA ATC CAC CTT CGT CTT GAT CAC CCA GCC TTC 3733 ’ Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu lie His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe 815 820 825 • CGC ATG ACG ACA GCT AAT GAA ATC AAT AGC CAC CTC CAA TTC CTA AAT 3781 ’)* * Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu lie Asn Ser His Leu Gin Phe Leu Asn 830 835 840 AGT CCA GAG AAC ACA GTG GCC TAT GAA TTA ACT GAT CAT GTT AAT AAA 3829 ’,· ‘ Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys 845 850 855 860 GAC AAA TGG GGA AAT ATC ATT GTT GTT TAT AAC CCA AAT AAA ACT GTA 3877 ; ’ ; Asp Lys Trp Gly Asn lie lie Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val 865 870 875 65 116531 GCA ACC ATC AAT TTG CCG AGC GGG AAA TGG GCA ATC AAT GCT ACG AGC 3925
Ala Thr lie Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala lie Asn Ala Thr Ser 880 885 890 GGT AAG GTA GGA GAA TCC ACC CTT GGT CAA GCA GAG GGA AGT GTC CAA 3973
Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gin Ala Glu Gly Ser Val Gin 895 900 905 GTA CCA GGT ATA TCT ATG ATG ATC CTT CAT CAA GAG GTA AGC CCA GAC 4021
Val Pro Gly lie Ser Met Met lie Leu His Gin Glu Val Ser Pro Asp 910 915 920 CAC GGT AAA AAG TAATAGAAAA AAGTAAAATC CCCTCAAGAT GTTTGAGGGG 4073
His Gly Lys Lys 925 GATTTAGTTA CTTATTATCC AATTAATTTG CGGCTTCGGT GTTTTCAATG GGCTCCGTAT 4133 CCGTTCGGTT GTGTGATCGG ACAAATGGGA GTGAATAGGT CACAAGAGCA GCAGCCATTT 4193 CAAGCAGACC AGCGAAAGTA AACATTCGTT CTGGTGCAAA TCGGGTCATC AACCAACCGG 4253 TAATTGCTTG GGAAATAGGG ATGGACCCTG ACATCACGAT AATCATAATA CTAATAACAC 4313 GACCGAATAA CTTAGGTGGA ATAAGCGTAT GGTTAACGCT TGGAGCAATA ATATTAACCG 4373 CCGTTTCATG AGCGCCAACA AGCACTAGAA GGGCTAAAAT AACCCATAAG TTGTGTGTAA 4433 ATCCTATAAA AAATAACATA AGGCCCTGCA G 44 64 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH : 2784 base pairs ’ (B) TYPE : nucleic acid ' (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear
* ‘ (ii) MOLECULE TYPE : genomic DNA
'·->! (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO :10: GATGGGAACA CGACAACGAT CATTGTCCAC TATTTTTGCC CTGCTGGTGA TTATCAACCT 60 V : TGGAGTCTAT GGATGTGGCC AAAAGACGGA GGTGGGGCTG AATACGATTT CAATCAACCG 120 GCTGACTCTT TTGGAGCTGT TGCAAGTGCT GATATTCCAG GAAACCCAAG TCAGGTAGGA 180 :,, : ATTATCGTTC GCACTCAAGA TTGGACCAAA GATGTGAGCG CTGACCGCTA CATAGATTTA 24 0 AGCAAAGGAA ATGAGGTGTG GCTTGTAGAA GGAAACAGCC AAATTTTTTA TAATGAAAAA 300 GATGCTGAGG ATGCAGCTAA ACCCGCTGTA AGCAACGCTT ATTTAGATGC TTCAAACCAG 3 60 ’ ’ ‘ GTGCTGGTTA AACTTAGCCA GCCGTTAACT CTTGGGGAAG GNNNAAGCGG CTTTACGGTT 420 CATGACGACA CAGCAAATAA GGATATTCCA GTGACATCTG TGAAGGATGC AAGTCTTGGT 4 80 CAAGATGTAA CCGCTGTTTT GGCAGGTACC TTCCAACATA TTTTTGGAGG TTCCGATTGG 540 GCACCTGATA ATCACAGTAC TTTATTAAAA AAGGTGACTA ACAATCTCTA TCAATTCTCA 600 66 - 116531 GGAGATCTTC CTGAAGGAAA CTACCAATAT AAAGTGGCTT TAAATGATAG CTGGAATAAT 660 CCGAGTTACC CATCTGACAA CATTAATTTA ACAGTCCCTG CCGGCGGTGC ACACGTCACT 720 TTTTCGTATA TTCCGTCCAC TCATGCAGTC TATGACACAA TTAATAATCC TAATGCGGAT 780 TTACAAGTAG AAAGCGGGGT TAAAACGGAT CTCGTGACGG TTACTCTAGG GGAAGATCCA 84 0 GATGTGAGCC ATACTCTGTC CATTCAAACA GATGGCTATC AGGCAAAGCA GGTGATACCT 9 00 CGTAATGTGC TTAATTCATC ACAGTACTAC TATTCAGGAG ATGATCTTGG GAATACCTAT 9 60 ACACAGAAAG CAACAACCTT TAAAGTCTGG GCACCAACTT CTACTCAAGT AAATGTTCTT 1020 CTTTATGACA GTGCAACGGG TTCTGTAACA AAAATCGTAC CTATGACGGC ATCGGGCCAT 1080 GGTGTGTGGG AAGCAACGGT TAATCAAAAC CTTGAAAATT GGTATTACAT GTATGAGGTA 1140 ACAGGCCAAG GCTCTACCCG AACGGCTGTT GATCCTTATG CAACTGCGAT TGCACCAAAT 1200 GGAACGAGAG GCATGATTGT GGACCTGGCT AAAACAGATC CTGCTGGCTG GAACAGTGAT 1260 AAACATATTA CGCCAAAGAA TATAGAAGAT GAGGTCATCT ATGAAATGGA TGTCCGTGAC 1320 TTTTCCATTG ACCCTAATTC GGGTATGAAA AATAAAGGGA AGTATTTGGC TCTTACAGAA 1380 AAAGGAACAA AGGGCCCTGA CAACGTAAAG ACGGGGATAG ATTCCTTAAA ACAACTTGGG 1440 ATTACTCATG TTCAGCTTAT GCCTGTTTTC GCATCTAACA GTGTCGATGA AACTGATCCA 1500 ACCCAAGATA ATTGGGGTTA TGACCCTCGC AACTATGATG TTCCTGAAGG GCAGTATGCT 1560 ACAAATGCGA ATGGTAATGC TCGTATAAAA GAGTTTAAGG AAATGGTTCT TTCACTCCAT 1620 CGTGAACACA TTGGGGTTAA CATGGATGTT GTCTATAATC ATACCTTTGC CACGCAAATC 1680 TCTGACTTCG ATAAAATTGT ACCAGAATAT TATTACCGTA CGATGATGCA GGTAATTATA 1740 CCAACGGATC AGGTACTGGA AATGAAATTG CANGCNGAAA GGCCAATGGT TCAAAAATTT 1800 ATTATTGATT CCCTTAAGTA TTGGGTCAAT GAGTATCATA TTGACGGCTT CCGTTTTGAC 1860 TTAATGGCGC TGCTTGGAAA AGACACGATG TCCAAAGCTG CCTCGGAGCT TCATGCTATT 1920 AATCCAGGAA TTGCACTTTA CGGTGAGCCA TGGACGGGTG GAACCTCTGC ACTGCCAGAT 1980 GATCAGCTTC TGACAAAAGG AGCTCAAAAA GGCATGGGAG TAGCGGTGTT TAATGACAAT 2040 TTACGAAACG CGTTGGACGG CAATGTCTTT GATTCTTCCG CTCAAGGTTT TGCGACAGGT 2100 GCAACAGGCT TAACTGATGC AATTAAGAAT GGCGTTGAGG GGAGTATTAA TGACTTTACC 2160 TCTTCACCAG GTGAGACAAT TAACTATGTC ACAAGTCATG ATAACTACAC CCTTTGGGAC 2220 AAAATAGCCC TAAGCAATCC TAATGATTCC GAAGCGGATC GGATTAAAAT GGATGAACTC 2280 GCACAAGCAG TTGTTATGAC CTCACAAGGC GTTCCATTCA TGCAAGGCGG GGAAGAAATG 234 0 CTTCGTANAA AAGGCGGCAA CGACAATAGT TATAATGCAG GCGATGCGGT CAATGAGTTT 2400 GATTGGAGCA GGAAAGCTCA ATATCCAGAT GTTTTCAACT ATTATAGCGG GCTAATCCAC 2460 CTTCGTCTTG ATCACCCAGC CTTCCGCATG ACGACAGCTA ATGAAATCAA TAGCCACCTC 2520 CAATTCCTAA ATAGTCCAGA GAACACAGTG GCCTATGAAT TAACTGATCA TGTTAATAAA 2580 GACAAATGGG GAAATATCAT TGTTGTTTAT AACCCAAATA AAACTGTAGC AACCATCAAT 2640 TTGCCGAGCG GGAAATGGGC AATCAATGCT ACGAGCGGTA AGGTAGGAGA ATCCACCCTT 2700 GGTCAAGCAG AGGGAAGTGT CCAAGTACCA GGTATATCTA TGATGATCCT TCATCAAGAG 2760 GTAAGCCCAG ACCACGGTAA AAAG 2784 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :11: I (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH : 928 amino acids (B) TYPE : amino acids (D) TOPOLOGY : linear '1' (ii) MOLECULE TYPE : protein ‘I’ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO :11: 67 1 1 6531
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Vai His Tyr Phe Cys Pro Ala Gly 15 10 15
Asp Tyr Gin Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly 20 25 30
Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gin Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Vai Ala 35 40 45
Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gin Vai Gly Ile Ile Vai Arg 50 55 60
Thr Gin Asp Trp Thr Lys Asp Vai Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu 65 70 75 80
Ser Lys Gly Asn Glu Vai Trp Leu Vai Glu Gly Asn Ser Gin Ile Phe 85 90 95
Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Vai Ser Asn 100 105 110
Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gin Vai Leu Vai Lys Leu Ser Gin Pro 115 120 125
Leu Thr Leu Gly Glu Gly Xaa Ser Gly Phe Thr Vai His Asp Asp Thr 130 135 140
Ala Asn Lys Asp Ile Pro Vai Thr Ser Vai Lys Asp Ala Ser Leu Gly 145 150 155 160
Gin Asp Vai Thr Ala Vai Leu Ala Gly Thr Phe Gin His Ile Phe Gly 165 170 175
Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Vai 180 185 190
Thr Asn Asn Leu Tyr Gin Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr 195 200 205
Gin Tyr Lys Vai Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro 210 215 220 V, Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Vai Pro Ala Gly Gly Ala His Vai Thr · 225 230 235 240 ·· ! Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Vai Tyr Asp Thr Ile Asn Asn 245 250 255 ,'!', Pro Asn Ala Asp Leu Gin Vai Glu Ser Gly Vai Lys Thr Asp Leu Vai V ‘ 260 265 270
Thr Vai Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Vai Ser His Thr Leu Ser Ile I 275 280 285
Gin Thr Asp Gly Tyr Gin Ala Lys Gin Vai Ile Pro Arg Asn Vai Leu 290 295 300 · Asn Ser Ser Gin Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr 305 310 315 320 • Thr Gin Lys Ala Thr Thr Phe Lys Vai Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gin 325 330 335 V. Vai Asn Vai Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Vai Thr Lys Ile ' ·’ 340 345 350 68 1 1 6531
Vai Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Vai Trp Glu Ala Thr Val Asn 355 360 365
Gin Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gin Gly 370 375 380
Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala lie Ala Pro Asn 385 390 395 400
Gly Thr Arg Gly Met lie Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly 405 410 415
Trp Asn Ser Asp Lys His lie Thr Pro Lys Asn lie Glu Asp Glu Val 420 425 430 lie Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser lie Asp Pro Asn Ser Gly 435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys 450 455 460
Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly lie Asp Ser Leu Lys Gin Leu Gly 465 470 475 480
He Thr His Val Gin Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp 485 490 495
Glu Thr Asp Pro Thr Gin Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr 500 505 510
Asp Val Pro Glu Gly Gin Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Ar 515 520 525
He Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His He 530 535 540
Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gin He 545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys He Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Met Met ·'*. 565 570 575
Gin Val He He Pro Thr Asp Gin Val Leu Glu Met Lys Leu Xaa Ala ’ 580 585 590 >· : Glu Arg Pro Met Val Gin Lys Phe He He Asp Ser Leu Lys Tyr Trp 595 600 605 • 5
Val Asn Glu Tyr His He Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu '·' * 610 615 620
Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala He I ; ; 625 630 635 640
Asn Pro Gly He Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser 645 650 655 V · Ala Leu Pro Asp Asp Gin Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gin Lys Gly Met i * ' _ 660 665 670 * Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn ; ; 675 680 685 ;' >"; Val Phe Asp Ser Ser Ala Gin Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu : *’ 690 695 700 69 1 1 6531
Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Vai Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr 705 710 715 720
Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Vai Thr Ser His Asp Asn Tyr 725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala 740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gin Ala Vai Vai Met Thr Ser 755 760 765
Gin Gly Vai Pro Phe Met Gin Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Xaa Lys 770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Vai Asn Glu Phe 785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gin Tyr Pro Asp Vai Phe Asn Tyr Tyr Ser 805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr 820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gin Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn 835 840 845
Thr Vai Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Vai Asn Lys Asp Lys Trp G1 850 855 860
Asn Ile Ile Vai Vai Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Vai Ala Thr Ile Asn 865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Vai Gly 885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gin Ala Glu Gly Ser Vai Gin Vai Pro Gly Ile 900 905 910 *··1 Ser Met Met Ile Leu His Gin Glu Vai Ser Pro Asp His Gly Lys Lys 915 920 925 « ; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12: ’·' 1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: : ; (A) LENGTH : 29 amino acids • (B) TYPE : peptide ' ; ’ ’ (D) TOPOLOGY : linear » (ii) MOLECULE TYPE : peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO:12: 70 116551
Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Val Leu -25 -20 -15
Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gin Ser Ala His Ala -10 -5 -1 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH : 87 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO :13: ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG 60
Met Ala Lys Lys Leu lie Tyr Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Val Leu -25 -20 -15 *. ACC TGG GCT TTT AAT GTA AAA GGG CAA TCT GCT CAT GCT 87 , Thr Trp A]_a phe Asn Lys Q1y Gin Ser Ala His Ala -10 -5 -l 1 : (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :14: ί ' (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : ; I (A) LENGTH : 1162 base pairs (B) TYPE : nucleic acid
I I
T (C) STRANDEDNESS : single : (D) TOPOLOGY : linear 71 1 1 6531 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO :14: GGATCCTGTT AGACTATTTG AGGAGTTTGC AACACTTGAT GTTTTATCCA AAGGAAGGGC 60 CGGAGATCAT CGCTGGTCGA GGTGCTTTCG GTGAAGCATT TTCGCTATTT TGGGTATAAC 12 0 CGGGCGCATT ACGATCAATT GTTTGAAGAG CATCTTGATT TACTTCAAAA GCTGAATGCT 180 TCGAAAAGAA TAACATGGAG CGGGCTTTAT CGAACACCTA TACATGATGC AGATATCGCA 240 CCCCGCCCTG TTCAGAAAAA CATTCCTTTG TGGGTTGGGG TGGGTGGGAC NMNTGAAASC 300 NSYKCKYYGT GCRNVSNNNT ATGGTGCCGG CTTAGCATGG GTATTTTGTC AGGCGATTGG 360 CTTCGGTTTA AGGCACTTTC GGACCTTTAT CGGCAGGCCG GCCAACAAGC ANGGTATTCA 42 0 CCGAACGATC TGAAAGTAGG AGTGACAGGG CATGCGTTTA TTGGAAAGAC GTCGCAGCAG 480 GCACTCAATG ACTATTACCC CTATCACGCG AATTATTGGC TAACACTGAA CCAACAATTA 540 GGGCAGCCGT TACCCCAGCA ATACGTGAGG GAATTTAATT TATTAGCCTC CCCAGAGCAA 600 GCCTTATATG TGGGAAGCTC TCAACAAGTG GGCAGGNAAA AATTTTGCGC CAACATGAGG 660 NATTTGGTNA TAAACGTTTT ATCGCACAGA TCGACATTGG CGGAATGCCC TTTAAAACAG 720 TGGCCAAGAA TATTGAGCGG TTAGGCCACT GAGGTTGCAC CTGTCGTACG AAGAGCAACA 780 AGAGGGTAAT GGTAATAATC TATTTAACTG TTTATTAGAA AACTTGGTAT CTGTTTAATT 840 AAATAACAGG AGCCTGGAAG TGGGCCAAGG CTCCTTTCTA GGGAAACCTT TTTCTATTTA 900 TATAGGCGTT GTTGCCTAAG GCTAAAGTAG GATTTTATTA AAAATATAGG AATTGCTCTT 960 TTATTCGACA CAATTATTCA ATGGAATACG ATAAAATGGA GAGTGTATGT AAGCGTTATA 1020 TTTTATTGGG GGGCTGATAG AAGAAAAGGG ATGCGACAGG GTCTATTAGC TAGTTTGGTA 1080 TTCGATTTCA GATCAATGCA ACGTACGAGT TTTTTATTGA CTGCTTTGTG CAAGCGATTG 1140 CATTGAAACA AAGGAGGACA TT 1162 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH : 431 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : linear t > : (ii) MOLECULE TYPE : nucleic acid » (xi) SEQUENCE DESCRIPTION : SEQ ID NO :15: ’ TAATAGAAAA AAGTAAAATC CCCTCAAGAT GTTTGAGGGG GATTTAGTTA CTTATTATCC 60 : AATTAATTTG CGGCTTCGGT GTTTTCAATG GGCTCCGTAT CCGTTCGGTT GTGTGATCGG 120 • ACAAATGGGA GTGAATAGGT CACAAGAGCA GCAGCCATTT CAAGCAGACC AGCGAAAGTA 180 AACATTCGTT CTGGTGCAAA TCGGGTCATC AACCAACCGG TAATTGCTTG GGAAATAGGG 240 ' ATGGACCCTG ACATCACGAT AATCATAATA CTAATAACAC GACCGAATAA CTTAGGTGGA 3 00 ATAAGCGTAT GGTTAACGCT TGGAGCAATA ATATTAACCG CCGTTTCATG AGCGCCAACA 360 AGCACTAGAA GGGCTAAAAT AACCCATAAG TTGTGTGTAA ATCCTATAAA AAATAACATA 42 0 AGGCCCTGCA G 431

Claims (28)

116531 72
1. Eristetty pullulanaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa kannasta Bacillus deramificans LMG P-5 13056, jolloin pullulanaasi katalysoi a-1,6-glukosidisi- dosten hydrolyysiä, ja sen N-pään sekvenssi (sekvenssi tunnusnro 1) on amino-karboksyylisuunnassa vasemmalta oikealle s euraava:
10 Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Vai His 15 10 Tyr Phe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gin Pro 15 20
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että se käsittää kuviossa 4 (sekvenssi tunnusnro 11) esitetyn aminohapposekvenssin aminohapot 1 - 928 .
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen pullulanaasi, 20 tunnettu siitä, että se syntetisoidaan prekursorin muodossa, joka sisältää ylimääräisen 29 aminohapon sekvenssin (sekvenssi tunnusnro 12).
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että se kehittää optimaalisen entsyy- 25 miaktiivisuuden mitattuna noin 60 °C:n lämpötilassa pH:ssa ·, noin 4,3. ^ 5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen * pullulanaasi, tunnettu siitä, että sen molekyylipaino on noin 100 kDa. ;· 30 6. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että sen isoelektrinen piste on välillä 4,1 - 4,5.
7. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että se kehittää entsyy-; 35 miaktiivisuuden, joka on yli 80 prosenttia maksimientsyy miaktiivisuudesta pH-alueella noin 3,8 - 4,9 lämpötilassa 116531 73 noin 60 °C, mitattaessa maksimaalinen entsyymiaktiivisuus noin 60 °C:n lämpötilassa pHrssa noin 4,3.
8. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että se osoittaa yli 90 5 prosentin suhteellista entsyymiaktiivisuutta mitattaessa lämpötilassa noin 60 °C substraatin poissa ollessa, pH-alueella noin 3,8 - 5.
9. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että se hydrolysoi amylo- 10 pektiinissä olevia a-1,6-glukosidisidoksia.
10. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että se hajottaa pullu-laanin maltotrioosiksi.
11. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen 15 pullulanaasi, tunnettu siitä, että se hydrolysoi amylo- pektiinin oligosakkaridien muodostamiseksi.
12. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että se katalysoi maltoo-sin kondensaatioreaktiota tetraholosidien muodostamiseksi.
13. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen pullulanaasi, tunnettu siitä, että sen on tuottanut Ba- .*·. cillus deramificans -kanta LMG P-13056 tai sen iohdannai- * · -—- .···, nen tai mutantti. • · ,’1^ 14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen . 25 pullulanaasi, tunnettu siitä, että se on tuotettu hete- :;V rologisesti Bacillus-suvun mikro-orqanismilla, joka sisäl- * * · • ·' tää alkalista proteaasia koodittavan geenin ollessaan vil- • » · '·' ’ limuodossa, jolloin alkalista proteaasia koodittava geeni on poistettu Bacillus-suvun mikro-organismista. • t ·,* I 30 15. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-13 i' : mukaisen pullulanaasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, .·.··. että se käsittää Bacillus deramificans -kannan tai tämän • * · kannan pullulanaasia tuottamaan kykenevän johdannaisen h" viljelyn sopivassa ravintokasvualustassa, joka sisältää 35 hiili- ja typpilähteitä ja mineraalisuoloja, aerobisissa 116531 74 olosuhteissa ja näin saadun pullulanaasin ottamisen talteen .
16. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen pullulanaasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, 5 että se käsittää pullulanaasia koodittavan DNA-fragmentin eristämisen, tämän DNA-fragmentin insertoinnin sopivaan vektoriin, tämän vektorin viemisen sopivaan isäntään tai tämän DNA-fragmentin viemisen sopivan isännän kromosomiin, tämän isännän viljelyn, pullulanaasin ilmentämisen ja pul- 10 lulanaasin ottamisen talteen.
17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukaisen pullulanaasin käyttö tärkkelyksen sokeroimiseksi.
18. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää nukleotidisekvenssin (sekvenssi tunnusnro 10), joka 15 koodittaa jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukaista pul lulanaasia.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää Bacillus deramificans LMG P-13056 pullulanaasin geenin (sekvenssi tunnusnro 8) 20 kokonaisuudessaan.
20. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 18 mukaisen DNA-molekyylin. .···, 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen ilmentämisvek- * · .•;’t tori, tunnettu siitä, että se on kuviossa 1 esitetty 25 pUBDEBRAl. » » · ;;1/ 22. Kromosomi-integraatiovektori, tunnettu sii- • 1 · • ·’ tä, että se sisältää patenttivaatimuksen 18 mukaisen DNA- * 1 · ' molekyylin.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen kromosomi-*,j · 30 integraatiovektori, tunnettu siitä, että se on kuviossa 3 esitetty pUBCDEBRAHDNSI. '·'·> 24. Transformoitu Bacillus licheniformis -kanta, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 18 * » 'M mukaisen DNA-molekyylin. • · • · · 116531 75
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen transformoitu Bacillus licheniformis -kanta, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 20 mukaisen ilmentämisvekto-rin tai patenttivaatimuksen 22 mukaisen kromosomi-inte- 5 graatiovektorin.
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen transformoitu Bacillus licheniformis -kanta, tunnettu siitä, että se käsittää kuviossa 1 esitetyn ilmentämisvektorin pUBDEBRAl tai kuviossa 3 esitetyn kromosomaalisen-integraatiovek- 10 torin pUBCDEBRAHDNSI.
27. Viljelmä, tunnettu siitä, että se on Bacillus deramificans LMG P-13056 -viljelmä.
28. Entsyymi koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukaista pullu- 15 lanaasia. • * · * * · ! · · » # * » # » » · i t I » • « * * · * > » • f · * » » • » ♦ * · * » » · t · » ·
4. I *44 * « · * ( · 4 · 1. t 4 > 116531 76
FI935900A 1992-12-28 1993-12-28 Pullulanaasi, sitä tuottavia mikro-organismeja, menetelmiä pullulanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö FI116531B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9201156 1992-12-28
BE9201156A BE1006483A3 (fr) 1992-12-28 1992-12-28 Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase, utilisations et compositions comprenant celle-ci.
BE9300744A BE1007313A3 (fr) 1993-07-15 1993-07-15 Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci.
BE9300744 1993-07-15
BE9301278 1993-11-19
BE9301278A BE1007723A6 (fr) 1993-11-19 1993-11-19 Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI935900A0 FI935900A0 (fi) 1993-12-28
FI935900A FI935900A (fi) 1994-06-29
FI116531B true FI116531B (fi) 2005-12-15

Family

ID=27159793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI935900A FI116531B (fi) 1992-12-28 1993-12-28 Pullulanaasi, sitä tuottavia mikro-organismeja, menetelmiä pullulanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö

Country Status (13)

Country Link
US (6) US5731174A (fi)
EP (1) EP0605040B1 (fi)
JP (1) JPH06217770A (fi)
KR (1) KR100319442B1 (fi)
CN (1) CN1061089C (fi)
AT (1) ATE183236T1 (fi)
AU (2) AU686574B2 (fi)
CA (1) CA2112028C (fi)
DE (1) DE69325981T2 (fi)
DK (1) DK0605040T3 (fi)
ES (1) ES2137222T3 (fi)
FI (1) FI116531B (fi)
MX (1) MX9400123A (fi)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE183236T1 (de) * 1992-12-28 1999-08-15 Genencor Int Pullulanase, mikroorganismen die sie produzieren, verfahren zur herstellung und ihre anwendung
CN1199424A (zh) * 1995-09-13 1998-11-18 金克克国际有限公司 嗜碱和嗜热微生物及由其所获得的酶
US6962263B2 (en) 1996-01-24 2005-11-08 Sambrailo Packaging, Inc. Produce packaging system having produce containers with double-arched ventilation channels
DE19627932A1 (de) * 1996-07-11 1998-01-15 Boehringer Mannheim Gmbh Sensitiver Epstein-Barr-Virus DNA-Nachweis
US7279316B2 (en) * 1996-12-06 2007-10-09 Verenium Corporation Enzymes having glycosidase activity and methods of use thereof
ATE295850T1 (de) 1996-12-06 2005-06-15 Diversa Corp Glycosidase-enzyme
EP1060253A2 (en) 1998-03-04 2000-12-20 Genencor International, Inc. Modified forms of pullulanase
US6639126B1 (en) 1999-12-06 2003-10-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of modified polysaccharides
US6350599B1 (en) 2000-01-12 2002-02-26 Novozymes A/S Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties
US7081261B2 (en) * 2002-05-14 2006-07-25 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Resistant starch prepared by isoamylase debranching of low amylose starch
EP2534961A1 (en) * 2003-03-10 2012-12-19 POET Research, Inc. Method for producing ethanol using raw starch
US20050233030A1 (en) 2004-03-10 2005-10-20 Broin And Associates, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation
WO2005025327A2 (en) * 2003-09-08 2005-03-24 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Resistant starch with cooking properties similar to untreated starch
US20050239181A1 (en) * 2004-03-10 2005-10-27 Broin And Associates, Inc. Continuous process for producing ethanol using raw starch
US20070037267A1 (en) * 2005-05-02 2007-02-15 Broin And Associates, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation
CN101268195A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 诺维信北美公司 产生发酵产物的方法
US7919289B2 (en) * 2005-10-10 2011-04-05 Poet Research, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and selecting plant material
WO2007144393A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 Novozymes, Inc. Mashing process
US8765199B2 (en) 2006-06-15 2014-07-01 Novozymes A/S Mashing process
US20090280553A1 (en) * 2006-08-04 2009-11-12 Amano Enzyme Inc. Method for designing mutated enzyme, method for preparing the same, and mutated enzyme
US9969996B2 (en) 2006-08-04 2018-05-15 Amano Enzyme Inc. Method for making mutated pullulanase enzyme, mutated pullulanase enzyme, and microorganism expressing the same
US7968691B2 (en) * 2006-08-23 2011-06-28 Danisco Us Inc. Pullulanase variants with increased productivity
CN105623937A (zh) * 2007-12-12 2016-06-01 诺维信公司 糖化方法
BRPI0819869B1 (pt) 2007-12-12 2019-07-16 Novozymes A/S Processo enzimático para a produção de um mosto de cervejeiro a partir de cereal não maltado, e, uso de um processo para produção de cerveja
BRPI0920179A2 (pt) 2008-10-15 2019-09-24 Novozymes As processos para produzir um mosto e para produzir cerveja
US8450094B1 (en) 2009-03-03 2013-05-28 Poet Research, Inc. System for management of yeast to facilitate the production of ethanol
MX2011009269A (es) * 2009-03-03 2011-09-26 Poet Res Inc Fermentacion de biomasa para la produccion de etanol.
WO2010102060A2 (en) * 2009-03-03 2010-09-10 Poet Research, Inc. System for pre-treatment of biomass for the production of ethanol
US9068206B1 (en) 2009-03-03 2015-06-30 Poet Research, Inc. System for treatment of biomass to facilitate the production of ethanol
WO2010132157A2 (en) * 2009-05-11 2010-11-18 Danisco Us Inc. Improved production of maltotetraose syrup using a pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolase variant and a debranching enzyme
CA2771071C (en) 2009-08-07 2020-03-10 Danisco Us Inc. Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof
DK2499227T3 (en) 2009-11-13 2015-07-13 Novozymes As A method for brewing
RU2600885C2 (ru) 2011-04-15 2016-10-27 Новозимс А/С Способ получения пивного сусла
JP2014528241A (ja) 2011-09-29 2014-10-27 ダニスコ・ユーエス・インク 高濃度デンプン粒の液化及び糖化
CN113930458A (zh) 2011-10-11 2022-01-14 诺维信北美公司 用于产生发酵产物的方法
WO2013148152A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 Danisco Us Inc. Method for making high maltose syrup
EP2847316A1 (en) 2012-05-11 2015-03-18 Novozymes A/S A brewing method
CA2878988A1 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification
US20150275158A1 (en) 2012-10-17 2015-10-01 Novozymes A/S Method for Production of Brewers Wort
EP3321353A1 (en) 2012-12-11 2018-05-16 Danisco US Inc. Yeast host cells epxressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof
EP2904105A1 (en) 2012-12-20 2015-08-12 Danisco US Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification
JP6502314B2 (ja) * 2013-03-15 2019-04-17 ビーエーエスエフ エンザイムズ エルエルシー プルラナーゼ活性を有する酵素
WO2015007639A1 (en) 2013-07-17 2015-01-22 Novozymes A/S Pullulanase chimeras and polynucleotides encoding same
CN103571812B (zh) * 2013-11-26 2015-06-24 江南大学 一种分泌效率和热稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其制备方法
HUE056192T2 (hu) 2014-01-22 2022-01-28 Novozymes As Pullulanázvariánsok és azokat kódoló polinukleotidok
EP3712240B1 (en) 2014-02-07 2023-09-27 Novozymes A/S Compositions for producing glucose syrups
WO2016087327A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Novozymes A/S Polypeptides having pullulanase activity comprising the x25, x45 and cbm41 domains
WO2016087445A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Novozymes A/S Improved production of glucose syrups
CN107532155B (zh) 2015-02-04 2019-06-25 南京百斯杰生物工程有限公司 截短普鲁兰酶及其生产方法和应用方法
US11427811B2 (en) 2015-07-21 2022-08-30 Novozymes A/S Polypeptides having pullulanase activity suitable for use in liquefaction
US20190330612A1 (en) 2016-06-30 2019-10-31 Danisco Us Inc Aspartic proteases
WO2018118815A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods of using thermostable serine proteases
EP3596211B1 (en) 2017-03-15 2021-06-02 DuPont Nutrition Biosciences ApS Methods of using an archaeal serine protease
EP3583210B1 (en) 2017-03-15 2021-07-07 Danisco US Inc. Trypsin-like serine proteases and uses thereof
US20200015499A1 (en) 2017-03-15 2020-01-16 Dupont Nutrition Biosciences Aps Trypsin-like serine proteases and uses thereof
CN111032856A (zh) 2017-08-07 2020-04-17 诺维信公司 基于pH的FCA控制的用途
FR3091703B1 (fr) 2019-01-11 2021-02-12 Fermentalg Procédé d’extraction de phycocyanines
FR3091640B1 (fr) 2019-01-11 2021-06-11 Fermentalg Procédé de purification de phycocyanines
FR3092586A1 (fr) 2019-02-08 2020-08-14 Fermentalg Procédé optimisé d’exploitation industrielle d’algues rouges unicellulaires
CN113490740A (zh) 2019-03-18 2021-10-08 诺维信公司 适合用于液化中的具有普鲁兰酶活性的多肽
BR112022008292A2 (pt) 2019-11-08 2022-07-26 Novozymes As Composição enzimática líquida, e, método para produzir um mosto para fabricação de cerveja
CN111560077A (zh) * 2020-05-21 2020-08-21 中国海洋大学 一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4560651A (en) * 1981-04-20 1985-12-24 Novo Industri A/S Debranching enzyme product, preparation and use thereof
JPS57174089A (en) * 1981-04-20 1982-10-26 Novo Industri As Chain dividing enzyme product
US4628031A (en) * 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
US4612287A (en) * 1985-05-23 1986-09-16 Cpc International Inc. Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids
US4628028A (en) * 1985-05-23 1986-12-09 Cpc International Inc. Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production
CA1285896C (en) * 1986-09-26 1991-07-09 Kuniharu Nakai .alpha.-1, 6-GLUCOSIDASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
JPH0223872A (ja) * 1988-07-12 1990-01-26 Ezaki Glico Co Ltd 組換えプラスミド，それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法
US5055403A (en) * 1989-06-26 1991-10-08 Enzyme Bio-Systems, Ltd. Thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production
EP0405283A3 (en) * 1989-06-26 1991-03-06 Enzyme Bio-Systems Ltd. Novel thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production
DK47291D0 (da) * 1991-03-15 1991-03-15 Novo Nordisk As Pullulanase
JP3026857B2 (ja) * 1991-07-05 2000-03-27 ナガセ生化学工業株式会社 新規プルラナーゼおよびその製造法
JP3173849B2 (ja) * 1992-02-26 2001-06-04 天野エンザイム株式会社 新規な枝切り酵素及びその製造法
JPH05236959A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Yoshiyuki Takasaki プルラナーゼ、その製造法及び該酵素を用いる澱粉の 糖化法
DE4244107C2 (de) * 1992-12-24 1996-02-08 Hirschmann Richard Gmbh Co Hochfrequenz-Übertrager
ATE183236T1 (de) * 1992-12-28 1999-08-15 Genencor Int Pullulanase, mikroorganismen die sie produzieren, verfahren zur herstellung und ihre anwendung
GB2279955B (en) * 1993-07-15 1998-02-18 Solvay Xylanase derived from a Bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US5731174A (en) 1998-03-24
CA2112028C (fr) 2003-03-11
JPH06217770A (ja) 1994-08-09
AU686574B2 (en) 1998-02-12
CN1090325A (zh) 1994-08-03
US6074854A (en) 2000-06-13
AU5275993A (en) 1994-07-07
US5721128A (en) 1998-02-24
EP0605040B1 (fr) 1999-08-11
CA2112028A1 (fr) 1994-06-29
MX9400123A (es) 1994-07-29
ATE183236T1 (de) 1999-08-15
KR940014776A (ko) 1994-07-19
US5736375A (en) 1998-04-07
EP0605040A1 (fr) 1994-07-06
FI935900A0 (fi) 1993-12-28
AU6483198A (en) 1998-07-30
DK0605040T3 (da) 2000-03-13
US5817498A (en) 1998-10-06
FI935900A (fi) 1994-06-29
ES2137222T3 (es) 1999-12-16
DE69325981T2 (de) 2000-02-03
CN1061089C (zh) 2001-01-24
DE69325981D1 (de) 1999-09-16
KR100319442B1 (ko) 2002-11-18
US5721127A (en) 1998-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI116531B (fi) Pullulanaasi, sitä tuottavia mikro-organismeja, menetelmiä pullulanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö
US7622291B2 (en) Agarase and gene thereof
CN103261409B (zh) 甘露聚糖酶、其编码基因及其生产
Ohishi et al. Purification and properties of two chitinases from Vibrio alginolyticus H-8
Lee et al. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis
JP4259169B2 (ja) 新規α−１，２−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法
FI58157B (fi) Vaerme- och syrastabilt alfa-amylasenzym och foerfarande foer dess framstaellning
JP4380874B2 (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
KR100874873B1 (ko) 신규한 자일라네이즈 효소 및 이를 암호화하는 유전자
JP4340382B2 (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
ES2252302T3 (es) Amidasa de glutaril cefalosporina a partir de pseudomonas diminuta bs-203.
KR100954296B1 (ko) 기능성 천연 항산화 바이오플라보노이드 당전이 특이성바실루스 에스피 비엘-31 유래 사이클로덱스트린글리코실트랜스퍼레이즈 및 이의 열안정성 개선 돌연변이효소
BE1007723A6 (fr) Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci.
JP4358984B2 (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
WO2020213604A1 (ja) 新規βアミラーゼ及びその利用・製造法
JP2001258577A (ja) ポリガラクツロナーゼ
KR102440862B1 (ko) 신규한 고정화 효소를 이용한 올리고당 감소 방법
BE1007313A3 (fr) Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci.
JP4311799B2 (ja) β−プリメベロシダーゼ遺伝子
KR101102010B1 (ko) 신규 미생물 정읍피아 내장산에시스 및 상기 미생물 유래의 셀룰로오스 유전자
JP2003180364A (ja) ペクチン酸リアーゼ
AU8932401A (en) Enzyme or cell preparation with inulinase activity
KR20070079106A (ko) 엘-아스코르브산-알파-글리코사이드 당전이 특이성바실루스 에스피 비엘-12 유래 사이클로덱스트린글리코실트랜스퍼레이즈와 활용
JP2003250571A (ja) ペクチン酸リアーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.

FG Patent granted

Ref document number: 116531

Country of ref document: FI

MA Patent expired