KR0169079B1 - Process for producing taxane diterpene - Google Patents

Abstract

본 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하든가 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 그 온도에서의 포화용존산소농도 미만인 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.According to the present invention, in culturing a tissue or cell of a plant producing taxane-type diterpene, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled from the beginning of the culture under conditions of less than the oxygen concentration in the atmosphere, or in contact with the tissue or cell. A method for producing a taxane diterpene, wherein the dissolved oxygen concentration in a fluid medium is controlled and cultured at the beginning of the culture under conditions that are less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature.

본 발명에 의하면 암치료제로서 유용한 탁솔 등의 탁산형 디테르펜의 공업적 생산이 가능해진다.Industrial Applicability According to the present invention, industrial production of taxane-type diterpenes such as Taxol, which is useful as a cancer treatment agent, becomes possible.

Description

탁산형 디테르펜의 제조방법Method for preparing taxane diterpene

[발명의 명칭][Name of invention]

[기술분야][Technical Field]

본 발명은 난소암, 유암, 폐암 등의 치료약으로서 유용한 탁솔[taxol]을 함유한 탁산[taxane]형 디테르펜의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing taxane-type diterpene containing taxol which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and the like.

[배경기술][Background]

난소암, 유암, 폐암등의 치료약으로서 유용한 탁솔[Taxol]은 주목과 주목속 식물인 태평양주목[Taxus brevifolia NUTT]로부터 단리동정된 탁산형 디테르펜이며, 활성과 관련한 복잡한 에스테르 그룹을 가지고 있다. 탁솔은 태평양 주목 식물중의 어느 부위에도 존재하며, 그 함량은 수피에서 가장 높다는 것이 보고되어 있다. 현재 탁솔은 천연 또는 재배된 식물체로 부터 채취되고 있으나, 주목속 식물은 지상 20㎝의 높이로 성장ksmsep 10년 이상이 걸리는 생육이 더딘 식물이며, 또 수피를 벗기면 나무가 말라버리므로 용이하게 대량의 탁속을 얻기가 곤란하다. 만일 탁솔 또는 탁솔의 전구물질인 바카틴 Ⅲ[baccation Ⅲ]등의 탁산형 디테르펜을 조직 배양을 이용하여 생산할 수가 있으면 수목을 벌채함이 없이 대량의 탁솔을 용이하게 얻을 수가 있으므로 유리하다.Taxol, which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, etc., is a taxane type diterpene isolated from Taxus brevifolia NUTT, a plant of the state of interest and attention, and has a complex group of esters related to activity. Taxol is present in any part of the Pacific plant, and its content is reported to be highest in bark. Currently, Taxol is harvested from natural or cultivated plants, but the genus plants are grown to a height of 20 cm above the ground. They are slow-growing plants that take more than 10 years. Difficult to get the table. If taxane-type diterpenes such as bacterium III [baccation III], which is a precursor of Taxol or Taxol, can be produced using tissue culture, it is advantageous because a large amount of Taxol can be easily obtained without felling trees.

지금까지 식물의 배양 세포를 이용한 탁솔 생산법에 대해서는 태평양 주목[Taxus brevifolia NUTT]배양세포에 의한 생산법이 미국에서 특허[미국특허 제5019504호]로 되어 있으나, 그 탁솔 생산량은 1~3㎎/ℓ로 기재되어 있어서, 공업적 생산으로는 불충분하다. 또 세포배양에 의한 탁솔의 생산성은 불안정하며, 선발해서 1차적으로 생산성이 높은 세포가 얻어져도 계대 배양하여 그 함량을 유지하기는 어렵다[E.R.M. Wickremesine et al., World Congress on Cell and Tissue Culture[1992]].So far, the Taxol production method using the cultured cells of plants has been patented in the United States [Taxus brevifolia NUTT] culture cell production method [US Patent No. 5019504], but the Taxol production amount is 1-3mg / It is described as l, which is insufficient for industrial production. In addition, the productivity of Taxol by cell culture is unstable, and it is difficult to maintain the content by passage culture even if cells with high productivity are selected firstly [E.R.M. Wickremesine et al., World Congress on Cell and Tissue Culture [1992].

한편, 탁솔 생산법의 선행기술로서는 탁솔 생합성전구체인 바카틴 Ⅲ로 부터의 반합성법이 Holton등의 미국특허제5015744호 명세서에 개시되어 있다. 식물의 조직배양법을 사용하면 바카틴 Ⅲ등의 반합성원료의 생산도 가능하고, 상기 반합성법에 의한 탁솔 생산에도 이용할 수 있다.Meanwhile, as a prior art of the Taxol production method, a semisynthesis method from Bacatin III, which is a Taxol biosynthetic precursor, is disclosed in US Pat. No. 5015744 to Holton et al. By using the tissue culture method of the plant, it is also possible to produce semisynthetic raw materials such as bacatin III, and also to produce taxol by the semisynthetic method.

[발명의 개시][Initiation of invention]

본 발명의 제1의 목적은 식물조직배양에 의한 탁산형 디테르펜의 간편한 제조방법을 제조하는 것에 있다.A first object of the present invention is to manufacture a simple method for producing a taxane-type diterpene by plant tissue culture.

본 발명의 제2의 목적은 탁산형 디테르펜 고생성 배약세포의 취득방법을 제공하는 것에 있다.A second object of the present invention is to provide a method for acquiring taxane-type diterpene-producing germ cells.

본원 제1의 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군에서 선택한 적어도 하나의 존재하에 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법이다.At least one selected from the group consisting of jasmine acids, compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, heavy metal ions, amines and antiethylene agents It is a manufacturing method of the taxane type diterpene characterized by culture | cultivating in presence of one, and recovering taxane type diterpene from the obtained culture.

본원 제2의 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 배양초기부터 제어하여 배양하거나 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소 농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 배양초기부터 제어하여 배양하여 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법이다.In the second invention of the present invention, in culturing a tissue or cell of a plant producing taxane-type diterpene, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled under the condition of less than the oxygen concentration in the atmosphere from the beginning of the culture or the tissue or Taxane-type diterpenes are recovered from a culture obtained by controlling the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the cells from the beginning of the culture under the condition of less than the saturated dissolved oxygen concentration at the temperature. It is a manufacturing method.

본원 제3의 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나누어 적어도 하나의 층에 포함된 세포를 배양하고, 이들중으로부터 탁산형 디테르펜 고생성 배양 세포를 선택하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포의 취득방법이다.According to the third invention of the present application, the cells of the plant producing the taxane-type diterpene are divided into a plurality of layers by the difference in specific gravity, and the cells contained in at least one layer are cultured. It is a method of obtaining a taxane-type diterpene high production culture cell, characterized in that the selection of.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 대상이 되는 탁산형 디테르펜으로서는 탁산 골격을 갖는 디테르펜이며 특히 제한이 없으며, 예를들어 탁솔[taxol], 7-에피탁솔, 바카틴Ⅲ[baccation Ⅲ], 7-에피바카틴 Ⅲ, 세팔로마닌[cephalomannine], 7-에피세팔로마닌, 10-데아세틸바카틴, 10-데아세틸세팔로마닌, 10-데아세틸탁솔, 탁사기핀[taxagifine] 및 그 유연체, 탁산 1a 및 그 유연체, 크실로실 세팔로마닌, 크실로실 탁솔 등을 들 수 있다.The taxane-type diterpenes which are the subject of the present invention are diterpenes having a taxane skeleton and are not particularly limited. Examples of the taxane-type diterpenes include taxol, 7-epitaxol, baccatin III, and 7-epivacatin III. , Cephalomannine, 7-epicepharomanin, 10-deacetylbaccatin, 10-deacetylcepharomanin, 10-deacetyltaxol, taxagifine and its flexibles, taxanes 1a and The flexible body, xyloxyl cepharomanin, a xyloxyl taxol, etc. are mentioned.

본 발명에 사용되는 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물로서는, 예를들어 서양주목[Taxus baccata LINN], 주목[T. cuspidata SIEB. eT ZUCC], 비자나무[T. Cuspidata SIEB. et ZUCC var. nana REHDER], 태평양주목(T. brevifolia NUTT), 캐나다주목[T. canadiensis MARSH], 중국주목[T. Chinensis], T. media등의 주목속 식물을 들 수 있다.As a plant which produces the taxane type diterpene used for this invention, for example, it is [Taxus baccata LINN], Attention [T. cuspidata SIEB. eT ZUCC], non-tree [T. Cuspidata SIEB. et ZUCC var. nana REHDER], T. brevifolia NUTT, Canada [T. canadiensis MARSH], attention to China [T. Chinensis], T. media, and the like plants are mentioned.

본원 제1의 발명에서 상기 식물의 배양은 식물의 조직 또는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나의 존재하에 배양하는 이외에는 종래부터 알려져 있는 방법에 의해 행할 수가 있다.The culture of the plant in the first invention of the present invention is at least one selected from the group consisting of plant tissues or cells from the group consisting of Jasmonic acid, compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, heavy metal ions, amines and anti-ethylene Except for culturing in the presence, it can be carried out by a conventionally known method.

본원 제1의 발명의 대상이 되는 자스몬산류로서는 일반식[Ⅰ]:As a Jasmonic acid targeted by the 1st invention of this application, General formula [I]:

[식중에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, 및 R^1f, 는 각각 수소원자, 수산기, 탄소수 1~6의 알킬기 또는 탄소수 1~6의 알콕시기를 표시하고;[Wherein R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , and R ^1f , each represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms;

R², R³, R⁴, R⁵및 R⁶는 각각 수소원자 또는 탄소수 1~6의 알킬기를 표시하고;R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;

C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶로 된 측쇄는 1개 또는 2개 이상의 2중 결합을 포함하여도 좋으며;The side chain of C ¹ -C ² -C ³ -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may include one or two or more double bonds;

R^6b는 수산기 또는 -O- 탄수화물 잔기를 표시하고;R ^6b represents a hydroxyl or —O— carbohydrate moiety;

R⁷은 수산기, OM[여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리 토류금속원자 또는 NH₄를 표시한다]. NHR⁸[여기에서 R⁸는 수소원자, 탄소수 1~6의 아실기, 탄소수 1~6의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다]. OR⁹[여기에서 R⁹는 탄소수 1~6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다]또는 탄소수 1~6의 알킬기를 표시하고;R ⁷ represents a hydroxyl group, OM, where M represents an alkali metal atom, alkaline earth metal atom or NH ₄ . NHR ⁸ [where R ⁸ represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an amino acid residue]. OR ⁹ [where R ⁹ represents an alkyl group or carbohydrate moiety having 1 to 6 carbon atoms] or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;

n은 1~7의 정수를 표시하고;n represents an integer of 1 to 7;

상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]The 5-membered ring may form a double bond between carbon atoms of adjacent rings]

로 나타내는 화합물, 일반식[Ⅱ]Compound represented by the general formula [II]

[식중에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, 및 R^1f, 는 각각 수소원자, 수산기, 탄소수 1~6의 알킬기 또는 탄소수 1~6의 알콕시기를 표시하고;[Wherein R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , and R ^1f , each represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms;

R², R³, R⁴, R⁵및 R⁶는 각각 수소원자 또는 탄소수 1~6의 알킬기를 표시하고;R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;

C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶로 된 측쇄는 1개 또는 2개 이상의 2중 결합을 포함해도 좋으며; R⁷은 수산기, OM[여기에서, M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH₄를 표시한다], NHR⁸[여기에서 R⁸는 수소원자, 탄소수 1~6의 아실기, 탄소수 1~6의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다], OR⁹[여기에서 R⁹은 탄소수 1~6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다]또는 탄소수 1~6의 알킬기를 표시하고;The side chain of C ¹ -C ² -C ³ -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may include one or two or more double bonds; R ⁷ represents a hydroxyl group, OM [where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ], NHR ⁸ [where R ⁸ represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, or 1 to C An alkyl group or amino acid residue of 6], OR ⁹ [where R ⁹ represents an alkyl group or carbohydrate moiety having 1 to 6 carbon atoms] or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;

n은 1~7의 정수를 표시하고;n represents an integer of 1 to 7;

상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]로 나타내는 화합물, 및 일반식[Ⅲ]:The five-membered ring may form a double bond between the carbon atoms of the adjacent ring; and a compound represented by the general formula [III]:

[식중에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, 및 R^1f는 각각 수소원자, 수산기, 탄소수 1~6의 알킬기 또는 탄소수 1~6의 알콕시기를 표시하고;[Wherein R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , and R ^1f each represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms;

R², R³, R⁴, R⁵및 R⁶는 각각 수소원자 또는 탄소수 1~6의 알킬기를 표시하고;R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;

C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶로 된 측쇄는 1개 또는 2개 이상의 2중 결합을 포함해도 좋으며; R⁷은 수산기, OM[여기에서, M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH₄를 표시한다], NHR⁸[여기에서 R⁸는 수소원자, 탄소수 1~6의 아실기, 탄소수 1~6의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다], OR⁹[여기에서 R⁹은 탄소수 1~6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다]또는 탄소수 1~6의 알킬기를 표시하고;The side chain of C ¹ -C ² -C ³ -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may include one or two or more double bonds; R ⁷ represents a hydroxyl group, OM [where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ], NHR ⁸ [where R ⁸ represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, or 1 to C An alkyl group or amino acid residue of 6], OR ⁹ [where R ⁹ represents an alkyl group or carbohydrate moiety having 1 to 6 carbon atoms] or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;

n은 1~7의 정수를 표시하고;n represents an integer of 1 to 7;

상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]The 5-membered ring may form a double bond between carbon atoms of adjacent rings]

로 나타내는 화합물을 들 수 있다.The compound represented by these is mentioned.

상기 일반식[Ⅰ]로 나타낸 자스몬산류로서는 바람직하기로는 일반식[Ⅰ']:As the jasmonic acid represented by the general formula [I], preferably, the general formula [I ']:

[식중에서 R¹는 수소원자 또는 수산기를 표시하고;[Wherein R ¹ represents a hydrogen atom or a hydroxyl group;

C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶로 된 측쇄는 C¹과 C², C²와 C³또는 C³과 C⁴간에서 2중결합을 포함하여도 좋고;The side chain of C ¹ -C ² -C ³ -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may include a double bond between C ¹ and C ² , C ² and C ³ or C ³ and C ⁴ ;

R^6b는 수산기 또는 -O- 탄수화물잔기를 표시하고;R ^6b represents a hydroxyl group or a —O— carbohydrate residue;

R⁷'는 수산기, OM[여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH₄를 표시한다], NHR^8'][여기에서 R⁸'는 수소원자, 탄소수 1~4의 아실기, 탄소수 1~4의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다]또는 OR^9'[여기에서 R^9'는 탄소수 1~4의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다]를 표시하고;R ⁷ 'represents a hydroxyl group, OM [where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ], NHR ^8' ] [where R ⁸ 'represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 4 carbon atoms, An alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or an amino acid residue] or OR ^{9 ',} wherein R ^9' represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a carbohydrate residue;

n은 1~7의 정수를 표시하고;n represents an integer of 1 to 7;

상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에서 2중결합을 형성하여도 좋다]The 5-membered ring may form a double bond between carbon atoms of adjacent rings]

로 나타내는 화합물을 들 수 있으며, 상기 일반식[Ⅱ]로 나타낸 자스몬산류로서는 바람직하기로는 일반식[Ⅱ']:The compound shown by these is mentioned, As Jasmonic acid represented by the said General formula [II], Preferably, it is general formula [II ']:

[식중에서 R¹는 수소원자 또는 수산기를 표시하고;[Wherein R ¹ represents a hydrogen atom or a hydroxyl group;

C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶로 된 측쇄는 C¹과 C², C²와 C³또는 C³과 C⁴간에서 2중결합을 포함하여도 좋고;The side chain of C ¹ -C ² -C ³ -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may include a double bond between C ¹ and C ² , C ² and C ³ or C ³ and C ⁴ ;

R⁷'는 수산기, OM[여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH₄를 표시한다], NHR^8'[여기에서 R^8'는 수소원자, 탄소수 1~4의 아실기, 탄소수 1~4의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다]또는 OR^9'[여기에서 R^9'는 탄소수 1~4의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다]를 표시하고;R ⁷ 'represents a hydroxyl group, OM [where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ], NHR ^8' [where R ^{8 '} represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 4 carbon atoms, An alkyl group or amino acid residue of 1 to 4] or OR ^{9 ',} wherein R ^9' represents an alkyl group or carbohydrate moiety having 1 to 4 carbon atoms;

n은 1~7의 정수를 표시하고;n represents an integer of 1 to 7;

상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에서 2중결합을 형성하여도 좋다]The 5-membered ring may form a double bond between carbon atoms of adjacent rings]

로 나타내는 화합물을 들 수 있으며, 상기 일반식[Ⅲ]으로 나타낸 자스몬산류로서는 바람직하기로는 일반식[Ⅲ']:The compound represented by these is mentioned, As Jasmonic acid represented by the said General formula [III], Preferably, it is general formula [III ']:

[식중에서 R¹는 수소원자 또는 수산기를 표시하고;[Wherein R ¹ represents a hydrogen atom or a hydroxyl group;

C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶로 된 측쇄는 C¹과 C², C²와 C³또는 C³과 C⁴간에서 2중결합을 포함하여도 좋고;The side chain of C ¹ -C ² -C ³ -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may include a double bond between C ¹ and C ² , C ² and C ³ or C ³ and C ⁴ ;

R⁷'는 수산기, OM[여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH₄를 표시한다], NHR⁸'[여기에서 R⁸'는 수소원자, 탄소수 1~4의 아실기, 탄소수 1~4의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다]또는 OR⁹'[여기에서 R⁹'는 탄소수 1~4의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다]를 표시하고;R ⁷ 'represents a hydroxyl group, OM [where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ], NHR ⁸ ' [where R ⁸ 'represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 4 carbon atoms, An alkyl group or amino acid residue of 1 to 4] or OR ⁹ ', wherein R ⁹ ' represents an alkyl group or a carbohydrate moiety having 1 to 4 carbon atoms;

n은 1~7의 정수를 표시하고;n represents an integer of 1 to 7;

상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에서 2중결합을 형성하여도 좋다]The 5-membered ring may form a double bond between carbon atoms of adjacent rings]

로 나타내는 화합물을 들 수 있다.The compound represented by these is mentioned.

상기 일반식[Ⅰ], [Ⅱ] 및 [Ⅲ]에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R^6a, R⁷, R⁸또는 R⁹으로 표시되는 탄소수 1~6의 알킬기로서는 예를들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기를 들 수 있다.R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , R ^1f , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ^{6a in} the general formulas [I], [II] and [III] Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R ⁷ , R ⁸ or R ⁹ are, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, t -Butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group is mentioned.

상기 일반식[Ⅰ], [Ⅱ] 및 [Ⅲ]에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e또는 R^1f로 표시되는 탄소수 1~6의 알콕시기로서는 예를들어 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 이소부톡시기, sec-부톡시기, t-부톡시기, n-펜틸옥시기, n-헥실옥시기를 들 수 있다.Examples of the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms represented by R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e or R ^1f in the general formulas [I], [II] and [III] include, for example, a methoxy group and an ethoxy group. A time period, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, t-butoxy group, n-pentyloxy group, and n-hexyloxy group are mentioned.

R⁷이 OM인 경우에는 M으로 표시되는 알칼리 금속원자 또는 알칼리토류금속원자로서는, 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘을 들 수 있다.When R <^7> is OM, as an alkali metal atom or alkaline earth metal atom represented by M, sodium, potassium, calcium is mentioned, for example.

R⁷인 NHR⁸인 경우에는 R⁸로 표시되는 탄소수 1~6의 아실기는 직쇄, 분기쇄의 어느 것이라도 좋으며, 예를들어 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐, 부티릴기, 발레릴기, 헥사노일기, 아크릴로일기를 들 수 있다.In the case of NHR ⁸ which is R ⁷ , the acyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R ⁸ may be either a straight chain or a branched chain. For example, formyl group, acetyl group, propionyl, butyryl group, valeryl group or hexanoyl group And acryloyl group.

R⁷이 NHR⁸인 경우에는 R⁸로 표시되는 아미노산기로서는 이소로이실기, 티로실기, 트리푸토필기를 들 수 있다.In the case where R ⁷ is NHR ⁸ , examples of the amino acid group represented by R ⁸ include an isoloyl group, a tyrosyl group, and a trifutofil group.

R⁷이 OR⁹인 경우에 R⁹으로 표시되는 탄수화물잔기, 및 상기 일반식[Ⅰ]에서 R^6b가 -O-탄수화물 잔기인 경우에서의 탄수화물 잔기로서는 글루코피라노실기를 들 수 있다.Examples of the carbohydrate residue represented by R ⁹ when R ⁷ is OR ⁹ and a carbohydrate residue in the case where R ^6b is an —O-carbohydrate residue in the general formula [I] include glucopyranosyl groups.

또 상기 일반식[Ⅰ], [Ⅱ] 및 [Ⅲ]로 나타낸 화합물에서는 5원환은 인접하는 환의탄소원자간에서 2중 결합을 형성하여도 좋다.In the compounds represented by the general formulas [I], [II] and [III], the 5-membered ring may form a double bond between the carbon atoms of the adjacent ring.

상기 일반식[Ⅰ]로 나타낸 화합물의 구체예로서는 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.The compound shown below is mentioned as a specific example of a compound represented by the said General formula [I].

상기 일반식[Ⅱ]로 나타낸 화합물의 구체예로서는 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.The compound shown below is mentioned as a specific example of the compound represented by the said General formula [II].

상기 일반식[Ⅲ]로 나타낸 화합물의 구체예로서는 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.The compound shown below is mentioned as a specific example of the compound shown by the said General formula [III].

[화합물I][Compound I]

[화합물J][Compound J]

상기 일반식[Ⅲ]으로 나타낸 화합물에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e또는 R^1f가 수산기인 화합물, 또는 5원환에서 인접하는 환원탄소원자간에 2중결합이 형성된 화합물의 구체예로서는 예를들어 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.In the compound represented by the general formula [III], a compound in which R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e or R ^1f is a hydroxyl group, or a compound in which a double bond is formed between adjacent reducing carbon atoms in a 5-membered ring As an example, the compound shown below is mentioned, for example.

상기 일반식[Ⅰ], [Ⅱ] 및 [Ⅲ]으로 나타낸 화합물의 바람직한 것으로서는 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵및 R⁶가 수소원자이며, R⁷이 수산기 또는 메톡시기이며, C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶로 된 측쇄가 2중결합을 포함하지 않거나, 또는 C¹과 C², C²와 C³또는 C³과 C⁴간에 2중결합을 포함하는 화합물을 들 수 있다.Preferable examples of the compounds represented by the general formulas [I], [II] and [III] include R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , R ^1f , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ is a hydrogen atom, R ⁷ is a hydroxyl group or a methoxy group, a C ¹ -C ² -C ³ -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ in the side chain does not contain a double bond, or with C ¹ C ^2, there may be mentioned a compound containing a double bond between C ² and C ³ or C ³ and C ^4.

본 발명에 사용되는 상기[Ⅰ],[Ⅱ] 또는 [Ⅲ]으로 나타낸 자스몬산류에는 여러가지 입체이성체[시스트란스이성체, 광학이성체]가 존재하나 각각의 이성체를 단독으로 사용하여도 또는 혼합물의 형태로 사용하여도 좋다.Jasmonic acid represented by [I], [II] or [III] used in the present invention has various stereoisomers [cistran isomer, optical isomer], but each isomer is used alone or in the form of a mixture. You may use it.

이상의 자스몬산류는 모두 탁산형 디테르펜의 생산성 향상에 효과를 가지나 그중에서도 상기 일반식[Ⅰ], [Ⅱ] 및 [Ⅲ]에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵및 R⁶가 수소원자이며, R⁷이 수산기 또는 메톡시기이며, [R⁷이 수산기 또는 메톡시기이며], n이 1이며, C³와 C⁴간에 2중결합을 포함하고 있는 화합물인 튜베론산, 또는 튜베론산메틸, 쿠쿠르빈산 또는 쿠쿠르빈산메틸, 및 자스몬산 또는 자스몬산 메틸이 생산성 향사에 대한 효과가 큰 점에서 특히 바람직하다.All of the above Jasmonic acids have the effect of improving the productivity of the taxane-type diterpene, but among them, in the general formulas [I], [II] and [III], R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , R ^1f , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are hydrogen atoms, R ⁷ is hydroxyl or methoxy, [R ⁷ is hydroxyl or methoxy], n is 1 and between C ³ and C ⁴ Particularly preferred are tuberonic acid, a compound containing a double bond, or methyl tuberonic acid, coucurvinic acid or methyl coucurate, and jasmonic acid or methyl jasmonate.

이들 자스몬산류는 합성에 의해 또는 식물로부터의 추출등에 의해 조제된다{H. Yamane et al. Agric. Biol. Chem., 44, 2857-2864[1980]}These jasmonic acids are prepared by synthesis or by extraction from plants, etc. {H. Yamane et al. Agric. Biol. Chem., 44, 2857-2864 [1980]}

한편, 자스몬산류는 생장촉진이나 조직의 성숙, 병해 저항성의 발현에 관한 여러가지 반응을 유기하는 식물 호르몬성 물질로서 여러가지 식물이 스스로 생산함이 요시하라 데루히꼬[吉原照彦]저, 식물세포공학 제2권 제4호 523~31면[1990년]에 기재되어 있다.Jasmonic acid, on the other hand, is a plant hormonal substance that induces various responses to growth promotion, tissue maturation, and expression of disease resistance. It is produced by various plants by Yoshihara Teruhiko. Vol. 4, pp. 523-31 [1990].

따라서 본 발명에 관한 자스몬산류는 배양계밖으로부터 첨가하는 이외에 사용하는 배양세포 또는 배양조직에서 스스로 생산시킬 수도 있다. 이 내재성 자스몬산류의 배양세포 또는 배양조직에 의한 생산을 촉진하는 방법으로서는 미생물의 배양물 또는 그 추출물, 열처리물 또는 식물추출물 등의 배지에 대한 첨가를 예시할 수가 있으며, 구체적으로는 MJ.Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90[16], 7490-7494[1993]에 기재된 곰팡이 세포벽획분을 첨가하는 방법을 예시할 수가 있다. 또 사용하는 배양세포 또는 배양조직에 기계적으로 또는 자외선, 열등에 의해 부분적으로 상해를 주는 것에 의해서도 내재성 자스몬산의 생산량을 높일 수가 있으며, 구체적으로는 R.A.Gleeman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89[Ⅱ], 4938-4941[1989]에 기재된 기계적으로 일부의 세포를 파괴하는 방법을 예시할 수가 있다.Therefore, the Jasmonic acid according to the present invention can be produced by itself in cultured cells or cultured tissues used in addition to addition from outside the culture system. As a method of promoting the production of the endogenous Jasmonic acid by the cultured cells or the cultured tissue, addition to the culture medium of the microorganisms or its extracts, heat treatments or plant extracts can be exemplified. Specifically, MJ. Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. The method of adding the fungal cell wall fraction as described in U.S.A., 90 [16], 7490-7494 [1993] can be illustrated. In addition, the production of endogenous jasmonic acid can be increased by mechanically or partially injuring the cultured cells or tissues by ultraviolet rays, inferior heat, and the like. Specifically, R.A.Gleeman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. The method of mechanically destroying some cells described in U.S.A., 89 [II], 4938-4941 [1989] can be illustrated.

자스몬산류는 물에 대한 난용성 때문에 통상 에타놀, 메타놀 등의 유기용매, 또는 계면 활성제 등에 용해한 후 배지에 첨가한다. 또 유리형의 자스몬산류는 그대로 사용하여도 좋고, 알칼리로 중화하여 염으로 해서 사용하여도 좋다.Jasmonic acids are usually dissolved in organic solvents such as ethanol and methanol, or surfactants and added to the medium due to poor water solubility. In addition, free-form Jasmonic acid may be used as it is, and it may be neutralized with alkali, and may be used as a salt.

자스몬산류 중에서 상기 식[Ⅰ] 또는 [Ⅲ]으로 나타낸 화합물을 5원환 카르보닐기의 α위치가 산,알칼리열에 의해 에피머화를 일으키기 때문에 불안정한 시스형보다 안정한 트란스형이 되기 쉽다. 천연 또는 합성 자스몬산을 사용한 평형 실험에서는 트란스형이 90%, 시스형이 10%의 상태로 존재한다. 일반적으로 시스형 쪽이 활성이 강한 것으로 되어 있으나, 본 발명에 사용되는 자스몬산류는 상기 식[Ⅰ] 또는 [Ⅲ]으로 나타낸 모든 입체 이성체 화합물 및 그 혼합물을 포함한다.Among the Jasmonic acids, the compound represented by the above formula [I] or [III] tends to be more stable than the unstable cis type since the α-position of the 5-membered ring carbonyl group causes epimerization by acid and alkali heat. In equilibrium experiments using natural or synthetic Jasmonic acid, the trans form is present at 90% and the cis form at 10%. In general, although the cis-type side is said to have strong activity, the Jasmonic acids used in the present invention include all stereoisomer compounds and mixtures thereof represented by the above formula [I] or [III].

자스몬산류는 배지에서의 농도를 0.01~1000μM로 하는 것이 필요하며, 이중에서도 특히 자스몬산류의 농도를 0.1~500μM의 범위로 조정하는 것이 본원 제1의 발명의 방법에서는 바람직하다.Jasmonic acid needs to be 0.01-1000 micrometers in density | concentration in a medium, and it is especially preferable to adjust the density | concentration of Jasmonic acid to the range of 0.1-500 micrometers especially in the method of 1st invention of this application.

식물세포 배양물에 자스몬 산류를 첨가하여 일부의 2차 대사산물이 유도되는 것은 독일에서 특허공고 DE 4122208 C1으로 되어 있으나, 탁산형 디테르펜 생성 식물의 조직배양에서 배지 첨가물로서 자스몬산류를 존재시켜서 조직배양을 행한 예는 보고되어 있지 않으며, 그 특허중에 개시되어 있는 2차 대사산물과는 생합성경로나 생합성 제어기구가 전혀 다른 탁산형 디테르펜의 생산량이 본원 제1의 발명의 방법에 의해 증대한다는 것은 예상밖의 일이었다.Induction of some of the secondary metabolites by adding Jasmonic acid to plant cell culture is described in German patent publication DE 4122208 C1. However, in the tissue culture of taxane type diterpene-producing plants, the presence of Jasmonic acid as a media additive No example of culturing has been reported, and the production of taxane-type diterpenes, which are completely different from the secondary metabolites disclosed in the patent, in the biosynthetic pathway and the biosynthetic control mechanism, is increased by the method of the first invention of the present application. It was unexpected.

또 본 발명에서 사용되는 상기 식[Ⅰ],[Ⅱ] 또는 [Ⅲ]으로 나타낸 자스몬산류와 구조적으로 유사한 자스몬 또는 메틸자스몬이 탁솔의 생산유도에 효과가 있다는 것이 국제공개 WO 93/17121호 공보에 기재되어 있다. 그러나 이들 화합물은 상기 자스몬산류와는 달리 상기식[Ⅰ],[Ⅱ], 또는 [Ⅲ]에서 식:-[CH₂]_n-CO-R⁷으로 나타낸 카르복실기등을 가지고 있지 않아서 이들의 탁솔 유도활성은 낮은 것이었다[비교예 24참조].In addition, the international publication WO 93/17121 discloses that jasmine or methyl jasmon, which are structurally similar to the jasmine acids represented by the formulas [I], [II] or [III] used in the present invention, have an effect on the induction of taxol production. It is described. However, these compounds do not have a carboxyl group represented by the formula:-[CH ₂ ] _n -CO-R ⁷ in the formula [I], [II], or [III], unlike the above Jasmonic acids, thus inducing their Taxol induction. The activity was low (see Comparative Example 24).

본원 제1의 발명의 대상이 되는 중금속류로서는 동족[the copper group] 또는 철족[the iron group]에 속하는 중금속류이면 특히 한정되는 것은 아니나 동족에 속하는 금속류로서는 특히 은을 사용하는 것이 바람직하고, 또 철족에 속하는 금속류로서는 코발트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 은 또는 코발을 사용할 때는 이 중금속류를 함유한 화합물, 이 금속류를 함유한 착이온류, 또는 이 금속이온의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 또 이들 화합물 등은 각각 단독으로 사용하여도 좋고 조합하여 사용하여도 좋다.The heavy metals to be the object of the first invention of the present application are not particularly limited as long as they are heavy metals belonging to the copper group or the iron group, but silver is particularly preferably used as the metals belonging to the same group. As metals which belong, it is preferable to use cobalt. Moreover, when using silver or cobalt, it is preferable to use in the form of the compound containing this heavy metal, the complex ion containing this metal, or this metal ion. Moreover, these compounds etc. may be used independently, respectively and may be used in combination.

은을 함유한 화합물로서는 예를들어 질산은 또는 황산은, 또는 불화은, 또는 염소산은 또는 과염소산은 또는 초산은, 또는 아황산은 또는 헥사플루오로인[Ⅴ]산은 또는 테트라플루오로 붕산은 또는 디아민은[Ⅰ]황산염, 또는 디아미노은[Ⅰ]산칼륨등의 화합물류를 예시할 수 있다.Examples of the compound containing silver include silver nitrate or silver sulfate, or silver fluoride, silver chlorate or silver perchlorate or silver acetate, or silver sulfite or hexafluoroin [V] silver or tetrafluoroborate or diamine silver [I]. Sulfate or diamino can illustrate compounds, such as [I] potassium acid.

이들 중에서도 특히 질산은, 황산은 등을 바람직한 화합물로 예시할 수 있다.Among these, silver nitrate especially silver sulfate etc. can be illustrated as a preferable compound.

은을 함유한 착이온류로서는 예를들어 [Ag[S₂O₃]₂]^3-, 또는 [Ag[S₂O₃]₃]^5-, 또는 [Ag[NH₃]₂]⁺, 또는 [Ag[CH]₂]-, 또는 [Ag[CN]₃]^2-, 또는 [Ag[SCN]₂]^-, 또는 [Ag[SCN]₄]^3-등의 착이온류를 예시할 수가 있다. 이들 중에서도 특히 [Ag[S₂O₃]₂]^3-, [Ag[S₂O₃]₃]^5-등을 가장 적합한 착이온류로서 예시할 수 있다.As silver-containing complex ions, for example, [Ag [S ₂ O ₃ ] ₂ ] ^3- , or [Ag [S ₂ O ₃ ] ₃ ] ^5- , or [Ag [NH ₃ ] ₂ ] ⁺ , or Complex ion such as [Ag [CH] ₂ ]-, [Ag [CN] ₃ ] ^2- , or [Ag [SCN] ₂ ] ^- , or [Ag [SCN] ₄ ] ^3- can be exemplified. . Among these, [Ag [S ₂ O ₃ ] ₂ ] ^3- and [Ag [S ₂ O ₃ ] ₃ ] ^5- and the like can be exemplified as most suitable complex ions.

코발트를 함유한 화합물로서는 예를들어 염화코발트, 또는 질산코발트, 또는 황산코발트 또는 불화코발트, 또는 과염소산코발트, 또는 취화코발트 또는 옥화코발트 또는 세렌산코발트, 또는 티오시안산코발트 또는 초산코발트, 또는 황산암모늄코발트, 또는 황산코발트[Ⅱ]칼륨, 또는 헥사암민코발트[Ⅲ]염화물, 또는 펜타암민아쿠아코발트[Ⅲ]염화물, 또는 니트로펜타암민코발트[Ⅲ]염화물, 또는 디클로로테트라암민코발트[Ⅲ]염화물 반수화물 또는 디니트로테트라암민코발트[Ⅲ]염화물, 또는 카르보나트테트라암민코발트[Ⅲ]염화물 또는 테트라니트로디암민코발트[Ⅲ]산 암모늄, 또는 헥사니트로코발트[Ⅲ]산 나트륨, 또는 트리스[에틸렌디아민]코발트[Ⅲ]염하물 3수화물, 또는 디클로로비스[에틸렌디아민]코발트[Ⅲ]염화물, 또는 트리스[옥사라트]코발트[Ⅲ]산칼륨3수화물, 또는 헥사시아노코발트[Ⅲ]산칼륨, 또는 [에틸렌 디아민 테트라아세타트]코발트[Ⅲ]산 칼륨2수화물, 또는 히드리드테트라카르보닐코발트[Ⅰ], 또는 디카르보닐[시클로펜타디에닐]코발트[Ⅰ], 또는 [디카르보닐[시클로펜타디에닐]코발트[Ⅰ], 또는 옥타카르보닐2코발트[O], 또는 헥사카르보닐[아세틸렌]2코발트[O], 비스[시클로펜타디에닐]코발트[Ⅰ], 도는 [시클로펜타디에닐] [1,5-시클로옥타디엔]코바리트[Ⅰ]등의 화합물류를 예시할 수가 있다. 이들 중에서도 특히 염화코발트, 질산코발트, 황산코발트 등을 가장 적합한 화합물로서 예시할 수 있다.Examples of the compound containing cobalt include, for example, cobalt chloride or cobalt nitrate, or cobalt sulfate or cobalt fluoride, or cobalt perchlorate, cobalt sulfide or cobalt oxide or cobalt sulphate, or cobalt thiocyanate or cobalt acetate, or ammonium sulfate. Cobalt or cobalt [II] potassium sulfate, or hexaamminecobalt [III] chloride, or pentaammine aquacobalt [III] chloride, or nitropentaammine cobalt [III] chloride, or dichlorotetraammine cobalt [III] chloride hemihydrate Or dinitrotetraammine cobalt [III] chloride, or carbonattetraammine cobalt [III] chloride or ammonium tetranitrodiammine cobalt [III], or hexanitrocobalt [III] acid, or tris [ethylenediamine] Cobalt [III] chloride trihydrate, or dichlorobis [ethylenediamine] cobalt [III] chloride, or tris [oxalat] co Potassium [III] potassium trihydrate, or hexacyanocobalt [III] acid, or [ethylene diamine tetraacet] cobalt [III] potassium dihydrate, or hydride tetracarbonyl cobalt [I], or dica Levonyl [cyclopentadienyl] cobalt [I], or [dicarbonyl [cyclopentadienyl] cobalt [I], or octacarbonyl2 cobalt [O], or hexacarbonyl [acetylene] 2 cobalt [O ], Bis [cyclopentadienyl] cobalt [I], or [cyclopentadienyl] [1, 5- cyclooctadiene] cobarit [I], etc. can be illustrated. Among these, cobalt chloride, cobalt nitrate, cobalt sulfate, etc. can be illustrated especially as a most suitable compound.

코발트를 함유한 착이온류로서는 펜타암민아쿠아코발트이온, 또는 니트로펜타암민코발트이온, 또는 디클로로테트라암민코발트이온, 또는 디니트로테트라암민코발트이온 또는 카르보나트테트라암민코발트이온 또는 테트라니트로디암민코발트이온, 또는 헥사니트로코발트이온, 또는 트리스[에틸렌디아민]코발트이온, 또는 디클로로비스[에틸렌디아민]코발트이온, 또는 트리스[옥사라트]코발트이온, 또는 헥사시아노코발트이온, 또는 [에틸렌디아민테트라아세타트]코발트 이온등의 차기온류를 예시할 수가 있다.Examples of complex ions containing cobalt include pentaammine aquacobalt ions, or nitropentaammine cobalt ions, or dichlorotetraammine cobalt ions, or dinitrotetraammine cobalt ions or carbonatetetraammine cobalt ions or tetranitrodymamine cobalt ions. Or hexanitrocobalt ions or tris [ethylenediamine] cobalt ions, or dichlorobis [ethylenediamine] cobalt ions, or tris [oxalat] cobalt ions, or hexacyanocobalt ions, or [ethylenediaminetetraacetate] Next-generation warming gases such as cobalt ions can be exemplified.

상기 중금속류 중에서 은을 함유한 화합물류, 은을 함유한 착이온류, 또는 은이온은 배지에서의 농도가 10^-8M~10^-1으로 하는 것이 바람직하며, 특히 10^-7M~10^-2M의 범위로 조정하는 것이 더욱 바람직하다. 또 코발트를 함유한 화합물류, 코발트를 함유한 착이온류, 또는 코발트이온은 배지에서의 농도가 10^-6~10^-1M으로 하는 것이 바람직하며, 특히 10^-5~10^-2M의 범위로 하는 것이 더욱 바람직하다.Among the heavy metals, compounds containing silver, complex ions containing silver, or silver ions preferably have a concentration in the medium of 10 ⁻⁸ M to 10 ⁻¹ , particularly 10 ⁻⁷ M to 10 ^−2. It is more preferable to adjust to the range of M. The cobalt-containing compounds, cobalt-containing complexes, or cobalt ions preferably have a concentration in the medium of 10 ⁻⁶ to 10 ⁻¹ M, particularly in the range of 10 ⁻⁵ to 10 ⁻² M. It is more preferable to set it as.

종래 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 배양에서 배지첨가물로서 은을 함유한 화합물류, 은을 함유한 착이온류, 또는 은이온을 존재시켜 조직 배양을 행한 예는 보고되어 있지 않다. 또 코발트를 함유한 화합물, 또는 코발트이온류는 주목속 식물의 조직배양용의 배지로서 일반적으로 사용되는 배지 예를들어 린스마이어스쿡[Linsmaier Skoog]의 배지 또는 무라시게스쿡[Murashige Skoog]의 배지, 또는 갬보르그[Gamborg]의 B-5 배지등에 배지성분의 하나로서 함유되어 있으나, 그 농도는 1×10⁷M~4×10^-7M로 [최신바이오테크놀로지 전서 편집위원회편, 목본식물의 증식과 육종, 농업도서, P265-268]본 발명의 방법에 비해 극히 낮은 농도로 사용되고 있다. 한편 본원 제1의 발명과 같이 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직배양에서 고농도의 코발트를 함유한 화합물, 또는 코발트 이온류를 존재시켜서 조직배양을 행한 예는 상술한 은화합물과 마찬가지로 보고되어 있지 않다. 더구나 이들 중금속류 존재하에서 배양함으로써 탁산형 디테르펜의 생성량이 증대한다는 것은 예상박의 일이었다.In the tissue culture of a plant producing a taxane-type diterpene, no compound containing silver as a medium additive, a complex containing silver or a culture of silver ions has been reported. Cobalt-containing compounds or cobalt ions are generally used as a medium for tissue culture of the plant of interest, for example, a medium of Linsmaier Skoog or a medium of Murashige Skoog, Or B-5 medium of Gamborg as a medium component, but its concentration is 1 × 10 ⁷ M ~ 4 × 10 ^-7 M. [Edition of the latest biotechnology editorial board, growth of wood plants And breeding, agricultural books, P265-268] is used at an extremely low concentration compared to the method of the present invention. On the other hand, as in the first invention of the present application, tissue cultures containing high concentrations of cobalt or cobalt ions in tissue culture of plants producing taxane-type diterpenes have not been reported in the same manner as the silver compounds described above. not. Moreover, it was expected that the production amount of the taxane diterpene increased by culturing in the presence of these heavy metals.

본원 제1의 발명에서 아민류라함은 아민 또는 그 염을 의미한다. 본원 제1의 발명의 대상이 되는 아민류로서는 모노아민류 또는 폴리아민류의 어느 것이나 이용가능하지만 특히 폴리아민류를 사용하는 것이 바람직하다.In the first invention of the present application, amines means amines or salts thereof. As the amines to be the object of the first invention of the present application, any of monoamines and polyamines can be used, but it is particularly preferable to use polyamines.

또한 본원 제1의 발명의 대상이 되는 아민류로서는 알킬기의 일부의 수소가 수산기로 치환되어 있어도 좋은 모노, 디 또는 트리알킬아민, 예를들어 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 디에타놀아민, 트리에타놀아민, 또는 그들의 염; 또는 폴리메틸렌부가 이미노기로 중단되어 있어도 좋고, 아미노기의 H가 저급알킬기로 치환되어 있어도 좋은 폴리메틸렌디아민, 예를들어 푸트렉신, 카다베린, 스페르미딘, 스페르민, 에틸렌디아민, N,N-디에틸-1,3-프로판디아민,트리에틸렌테트라민, 또는 그들의 염; 또는 환상알킬아민, 예를들어 시클로펜틸아민, 시클로헥실아민, 또는 그들의 염, 또느 메세나민, 피페라진 등의 환상아민 또는 그들의 염을 들 수 있다. 이들 아민류중에서 바람직한 것으로는 예를들어 푸트렉신[NH₂[CH₂]₄NH₂], 카다베린[NH₂[CH₂]₅NH₂], 스페르미딘[NH₂[CH₂]₃NH[CH₂]₄NH₂], 스페르민[[NH₂[CH₂]₃NH[CH₂]₄NH[CH₂]₃NH₂] 에틸렌 디아민[NH₂[CH₂]₂NH₂], N,N-디에틸-1,3-프로판디아민[[C₂H₅]₂N[CH₂]₃NH₂], 디에틸렌트리아민[NH₂[CH₂]₂NH₂(CH₂)₂NH₂NH₂]등의 폴리아민류 또는 그들의 염을 예시할 수가 있다.Moreover, as amines which are the object of 1st invention of this application, the mono, di, or trialkylamine which some hydrogen of an alkyl group may be substituted by the hydroxyl group, for example, methylamine, ethylamine, dimethylamine, diethylamine, triethyl Amines, diethanolamines, triethanolamines, or salts thereof; Or polymethylenediamine, in which the polymethylene portion may be interrupted by an imino group, and the H of the amino group may be substituted with a lower alkyl group, for example, putrexine, cadaverine, spermidine, spermine, ethylenediamine, N, N-diethyl-1,3-propanediamine, triethylenetetramine, or salts thereof; Or cyclic alkylamines such as cyclopentylamine, cyclohexylamine, or salts thereof, or cyclic amines such as mesenamin, piperazine or salts thereof. Preferred among these amines are, for example, putrexine [NH ₂ [CH ₂ ] ₄ NH ₂ ], cadaverine [NH ₂ [CH ₂ ] ₅ NH ₂ ], spermidine [NH ₂ [CH ₂ ] ₃ NH [CH ₂ ] ₄ NH ₂ ], spermine [[NH ₂ [CH ₂ ] ₃ NH [CH ₂ ] ₄ NH [CH ₂ ] ₃ NH ₂ ] ethylene diamine [NH ₂ [CH ₂ ] ₂ NH ₂ ], N, N-diethyl-1,3-propanediamine [[C ₂ H ₅ ] ₂ N [CH ₂ ] ₃ NH ₂ ], diethylenetriamine [NH ₂ [CH ₂ ] ₂ NH ₂ (CH ₂ ) ₂ Polyamines such as NH ₂ NH ₂ ] or salts thereof can be exemplified.

상기 아민류는 배지에서의 농도가 10^-8M~10^-1M으로 하는 것이 바람직하며, 이 중에서도 특히 10^-7M~10^-2M의 범위로 조정하는 것이 더욱 바람직하다.It is preferable that the concentration of the amines in the medium is 10 ^-8 M to 10 ^-1 M, and among these, it is particularly preferable to adjust the range of 10 ^-7 M to 10 ^-2 M.

식물의 조직배양물에 아민류를 첨가하여 2차 대사산물이 유도되는 것을 나타낸 예로서는 매일초의 배양세포에 아민류를 첨가함으로써 인돌알칼로이드의 생성이 유도되는 것을 나타낸 일본국 특개평 4-262788호 공보를 예시할 수가 있다. 그러나 매일초와는 식물의 종이 다른 탁산형 디테르펜생성 식물의 조직배양에서 배지 첨가물로서 아민류를 존재시켜서 조직배양을 행한예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 그것에 의해 인돌알칼로이드와는 생합성 경로가 전혀 다른 탁산형 디테르펜의 생성량이 증대한다는 것은 예상박의 일이었다.As an example showing the induction of secondary metabolites by adding amines to the tissue culture of a plant, Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 4-262788 showing that induction of indole alkaloids is induced by adding amines to cultured cells every day There is a number. However, there have been no reports of tissue culture by the presence of amines as a medium additive in the tissue culture of taxane-type diterpene-producing plants, which is different from indole alkaloids. It was anticipated that the production amount of an acidic diterpene increased.

본원 제1의 발명의 대상이 되는 항에틸렌제로서는 배양물의 에틸렌 생합성 기구를 저해하든가, 및/또는 이 배양물내에 저류하든가 또는 이 배양물을 함유한 배양기내의 기상중 또는 배지중에 존재하는 에틸렌을 제거하는 물질이면 특히 한정되는 것은 아니다.As the anti-ethylene agent of the present invention, the ethylene biosynthesis mechanism of the culture is inhibited, and / or stored in the culture, or the ethylene existing in the gas phase or the medium in the culture medium containing the culture is removed. The substance is not particularly limited.

에틸렌 생합성기구를 저해하는 방법으로서는 예를 들어 S-아데노실메티오닌으로부터 1-아미노시클로프로판-1-카르복실산으로의 변환을 촉매하는 효소의 활성을 저해하든가, 또는 1-아미노시클로프로판-1-카르복실산으로부터 에틸렌으로의 변환을 촉매하는 효소의 활성을 저해하는 방법이 예시되며, 전자의 기능을 갖는 화합물로서는 예를들어 아미노옥시초산, 아세틸살리실산, 리조비톡식[Rhizobitoxine], 이미노에톡시비닐글리신, 메톡시비닐글리시, α-아미노이소락산, 2,4-디니트로페놀등을 들 수가 있다. 또 상기 예시한 화합물의 염, 에스테르, 아미노산 유도체, 탄수화물 유도체이어도 좋다.As a method for inhibiting the ethylene biosynthetic mechanism, for example, the activity of an enzyme catalyzing the conversion of S-adenosylmethionine to 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, or 1-aminocyclopropane-1- A method of inhibiting the activity of an enzyme catalyzing the conversion of carboxylic acid to ethylene is exemplified, and examples of the compound having the former function include, for example, aminooxyacetic acid, acetylsalicylic acid, Rizobitoxine, and iminoethoxy. Vinylglycine, methoxy vinylglyci, α-aminoisolactic acid, 2,4-dinitrophenol and the like. The salts, esters, amino acid derivatives and carbohydrate derivatives of the above-exemplified compounds may also be used.

염으로서는 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염, 에스테르로서는 예를들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸에스테르, 아미노산 유도체로서는 예를들어 글리신, 메티오닌, 페닐알라닌유도체, 탄수화물유도체로서는 예를들어 글루코스, 말토스유도체 등을 들 수 있으나, 본 발명에 관한 물질의 염, 에스테르, 아미노산유도체, 탄수화물 유도체는 이들 화합물에 한정되는 것은 아니다.As salts, for example sodium, potassium, calcium, magnesium salts, esters, for example methyl, ethyl, propyl, butyl esters, amino acid derivatives, for example, glycine, methionine, phenylalanine derivatives, carbohydrate derivatives, for example, glucose, mal Tos derivatives and the like, but salts, esters, amino acid derivatives, carbohydrate derivatives of the substance of the present invention is not limited to these compounds.

또 후자의 기능을 갖는 화합물롯는 예를들어 몰식자산 및 그 화합물의 염, 에스테르, 아미노산유도체및 탄수화물 유도체를 들 수가 있다[효도히로시[兵藤宏], 소화 62년도 원예학회추계대회, 심포지엄, 강연요지, P.122,구라이시스스무[倉石晋], 식물호르몬, 도교대학출판 P.Ⅲ].In addition, the compound lot having the latter function may include, for example, a molar asset and salts, esters, amino acid derivatives and carbohydrate derivatives of the compound [Hyodo Hiroshi, 62nd Annual Conference of Horticultural Society, Symposium, Lecture Summary, P.122, Kuraisisusumu, Plant Hormone, Taoism University Press P.III].

여기에서 염으로서는 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염, 에스테르로서는 예를들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸에스테르, 아미노산유도체로서는 예를들어 글리신, 메티오닌, 페닐알라닌유도체, 탄수화물 유도체로서는 예를들어 글루코스, 말토스유도체 등을 들 수 있으나, 본 발명에 관한 물질의 염, 에스테르, 아미노산유도체, 탄수화물 유도체는 이들 화합물류에 한정되는 것은 아니다.As salts, for example, sodium, potassium, calcium, magnesium salts, esters, for example methyl, ethyl, propyl, butyl esters, amino acid derivatives, for example, glycine, methionine, phenylalanine derivatives, carbohydrate derivatives, for example, glucose , Maltose derivatives and the like, but salts, esters, amino acid derivatives, carbohydrate derivatives of the substances according to the present invention are not limited to these compounds.

또한 배양물내에 저류하든가, 또는 이 배양물을 포함한 배양기내의 기상중 또는 배지중에 존재하는 에틸렌을 제거하는 물질로서 예를들어 1.5-시클로옥타디엔및 이소티오시안산 및 이들 화합물의 염, 에스테르[예를들어 알릴이소티오시아네이트, 벤질이소티오시아네이트], 이미노산유도체 및 탄수화물유도체를 들 수가 있다[무나가다 메구무[宗像惠], 식물의 화학조절, 29[1], 89-93[1994]].In addition, as a substance for removing ethylene present in the culture or in the gas phase or in the culture medium containing the culture, for example, 1.5-cyclooctadiene and isothiocyanic acid and salts, esters of these compounds [eg For example, allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate], imino acid derivatives and carbohydrate derivatives [Munagada Megum, chemical control of plants, 29 [1], 89-93 [1994] ]].

여기에서 염으로서는 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염, 에스테르로서는 예를들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 알릴에스테르, 아미노산유도체로서는 예를들어 글리신, 메티오닌, 페닐알라닌유도체, 탄수화물 유도체로서는 예를들어 글루코스, 말토스유도체 등을 들 수 있으나, 본 발명에 관한 물질의 염, 에스테르, 아미노산유도체, 탄수화물유도체는 이들 화합물류에 한정되는 것은 아니다.As the salt, for example, sodium, potassium, calcium, magnesium salt, ester, for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, allyl ester, amino acid derivatives, for example, glycine, methionine, phenylalanine derivatives, carbohydrate derivatives, for example Examples thereof include glucose and maltose derivatives, but the salts, esters, amino acid derivatives and carbohydrate derivatives of the substances according to the present invention are not limited to these compounds.

항에틸렌제는 배지에서의 농도가 10^-8M~10^-1M로 할 필요가 있으며, 이중에서도 특히 항에틸렌제의 농도를 10^-7M~10^-2M의 범위로 조정하는 것이 바람직하다.The anti-ethylene agent needs to have a concentration in the medium of 10 ⁻⁸ M to 10 ⁻¹ M, and among these, it is particularly preferable to adjust the concentration of the anti-ethylene agent in the range of 10 ⁻⁷ M to 10 ⁻² M. .

에틸렌은 식물 호르몬의 하나이며, 개체의 생장이나 형태형성 또는 노화등, 식물내에 발생되는 여러가지 생리형상에 관여함이 알려져 있다. 또 식물의 2차 대사 산물 생성능의 향상에 에틸렌을 이용한 예로서는 예를들어 Kim, Dong Il et. al., Biotechnol. Bioeng., 38[4], 331-339[1991]에 기재된 보고를 예시할 수가 있다. 그러나 에틸렌의 제어를 2차 대사산물의 생산성향상에 이용한 사례는 상기 기재의 보고에 대표 되는 바와 같이, 그 어느것도 식물의 조직 배양물에 대한 에틸렌 공급에 의한 제어이며, 본 발명에 관한 방법과 같이 에틸렌 생성의억제적인 제어를 2차 대사산물의 생산향상에 이용한 사례는 현재에 이르기까지 보고되어 있지 않다.Ethylene is one of plant hormones and is known to be involved in various physiological patterns occurring in plants, such as growth, morphogenesis or aging of individuals. In addition, examples of using ethylene for improving the plant's secondary metabolite production capacity include, for example, Kim, Dong Il et. al., Biotechnol. The reports described in Bioeng., 38 [4], 331-339 [1991] can be exemplified. However, examples of using the control of ethylene to improve the productivity of secondary metabolites, as represented in the report described above, are all controlled by the supply of ethylene to the tissue culture of plants, as in the method of the present invention. The use of inhibitory control of ethylene production to improve the production of secondary metabolites has not been reported to date.

또한 항에틸렌제는 선도 보존제로서 화훼 또는 청과물 등에 일반적으로 사용되고 있으나, 이 항에틸렌제를 2차 대사산물의 생산향상의 목적으로 사용한 예는 보고되어 있지 않다.Moreover, although anti-ethylene agent is generally used as a freshener and a flower or a fruit and vegetable, the example which used this anti-ethylene agent for the production of a secondary metabolite is not reported.

이와같은 상황하에서 본 발명자들은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 및 세포에서는 에틸렌이 탁산형 디테르펜의 생성능을 현저히 저해한다는 것을 알아내었다. 따라서 상기 발견을 발판으로 이 조직배양물을 항에틸렌제의 존재하에 배양한 결과, 항에틸렌제가 그 저해를 억제할 뿐 아니라 그 배양물에 유래하는 탁산형 디테르펜의 생산량을 비약적으로 향상시키는 효과를 갖는다는 것을 알아내었다. 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 배양물을 항에틸렌제의 존재하에 배양함으로써 탁산형 디테르펜의 생산을 유도한예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 본원 제1의 발명의 방법에 의해 그 2차대사산물의 생산성이 증대한다는 것은 예상밖의 일이었다.Under these circumstances, the inventors have found that ethylene significantly inhibits the production of taxane-type diterpenes in tissues and cells of plants producing taxane-type diterpenes. Therefore, based on the above findings, the tissue culture was cultured in the presence of an anti-ethylene agent. As a result, the anti-ethylene agent not only inhibited the inhibition but also dramatically improved the amount of taxane-type diterpene derived from the culture. I found out. There has been no report of inducing the production of taxane-type terterpenes by culturing a tissue culture of a plant producing taxane-type diterpenes in the presence of an anti-ethylene agent. The increase in metabolite productivity was unexpected.

본원 제1의 발명에 사용되는 배지로서는 종래로부터 알려져 있는 식물의 조직배양에 사용되는 배지, 예를들어 무라시게 스쿡[1962년][Murashige Skoog]의 배지, 린스마이어 스쿡[1965년[Linsmaier Skoog]의 배지, 우디플랜트 미디엄[1981년][Woody Plant Medium], 갬보르그[Gamborg]의 B-5배지, 미쓰이[三井]의 M-9배지등을 들 수 있다.As a medium to be used for the first invention of the present application, a medium used for tissue culture of a plant known in the art, for example, a medium of Murashige Skoog [1962], Linsmaier Sukog [1965 [Linsmaier Skoog] Badges, Woody Plant Medium [1981], B-5 badges of Gamborg, and M-9 badges of Mitsui.

이들 배지에 식물 호르몬을 첨가하고, 다시 필요에따라 탄소원, 무기성분, 비타민류, 아미노산 등을 첨가할 수도 있다.Plant hormones may be added to these media, and carbon sources, inorganic components, vitamins, amino acids and the like may be added as necessary.

탄소원으로서는 슈크로스, 말토스, 락토스 등의 2당류, 글루코스, 프락토스, 갈락토스 등의 단당류, 전분 또는 이들 당원의 2종류 이상을 적당한 비율로 혼합한 것을 사용한다.As the carbon source, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, monosaccharides such as glucose, fructose and galactose, starch or a mixture of two or more kinds of these sugars in an appropriate ratio are used.

무기성분으로서는 예를들어 인, 질소, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 황, 철, 망간, 아연, 붕소, 동, 몰리브덴, 염소, 나트륨, 옥소, 코발트 등을 들 수 있으며, 이들 성분은 예를들어 질산칼륨, 질산나트륨, 질산칼륨, 염화칼륨, 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 황산나트륨, 황산제1철, 황산제2철, 황산망간, 황산아연, 붕산, 황산동, 몰리브덴산 나트륨, 3산화몰리브덴, 옥화칼륨, 염화코발트 등의 화합물로서 첨가할 수 있다.Examples of the inorganic components include phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, sulfur, iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine, sodium, oxo, cobalt, and the like. Potassium, sodium nitrate, potassium nitrate, potassium chloride, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium sulfate, ferrous sulfate, ferric sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, boric acid, copper sulfate, sodium molybdate And molybdenum trioxide, potassium iodide, and cobalt chloride.

식물호르몬으로서는 예를들어 인돌초산[IAA], 나프탈렌초산[NAA],2 ,4-디클로로페녹시초산[2,4-D]등의 오옥신[auxing]류, 카이네틴, 제아틴, 디히드로제아틴등의 사이토카이닌류가 사용된다.Examples of plant hormones include auxins such as indoleacetic acid [IAA] and naphthalene acetic acid [NAA], 2,4-dichlorophenoxyacetic acid [2,4-D], cinetin, zeatine, dihydro Cytokines, such as zeatine, are used.

비타민류로서는 예를들어 비오틴, 티아민[비타민 B₁], 피리독신[비타민B₆], 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등이 사용된다.As the vitamins, for example, biotin, thiamine [vitamin B ₁ ], pyridoxine [vitamin B ₆ ], pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like are used.

아민노산류로서는 예를들어 글리신, 페닐알라닌, 로이신, 글루타민, 시스테인 등을 첨가할 수 있다.As the amine acid, for example, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine and the like can be added.

일반적으로 상기의 각 성분은 탄소원이 약 1~약30g/ℓ, 무기성분이 약 0.1μM~약100mM, 식물호르몬류가 약 0.01~약10μM, 비타민류 및 아미노산류가 각각 0.1~약100mg/ℓ의 농도로 사용된다.Generally, each of the above components has a carbon source of about 1 to about 30 g / l, inorganic components of about 0.1 μM to about 100 mM, plant hormones of about 0.01 to about 10 μM, and vitamins and amino acids of 0.1 to about 100 mg / l, respectively. Used at a concentration of

또한 본 발명에는 액체배지 및 한천이나 게란검등을 통상 0.1~1% 함유하는 고형 배지의 어느것이나 사용할 수 있지만 통상은 액체 배지가 바람직하다.In the present invention, any of a liquid medium and a solid medium containing 0.1 to 1% of agar or geran gum can usually be used. Usually, a liquid medium is preferable.

본 발명의 조직배양에서는 상기 식물의 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자, 꽃가루, 꽃밥, 꽃받침등의 조직편 또는 세포, 이들을 상기 배지 또는 다른 종래의 배지에 의해 조직 배양하여 얻어지는 배양세포를 사용할 수가 있다.In the tissue culture of the present invention, tissues or cells such as roots, growth points, leaves, stems, seeds, pollen, anthers, and calyxes of the plants, and cultured cells obtained by tissue culture of these with the medium or other conventional medium can be used. .

또 본 발명은 Agrobacterium tumefaciens 또는 Agrobacterium rhizogenes를 식물조직에 감염함으로써 얻어지는 종양세포 및/또는 모상근에도 적용할 수 있다.The present invention can also be applied to tumor cells and / or hairy roots obtained by infecting plant tissues with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.

이들 조직 또는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 딘 군으로부터 선택한 적어도 하나의 존재하에 배양하면 통상의 배양조건하에 조직배양한 경우에 비해 탁산형 디테르펜 생산성이 높은 배양조직 또는 배양세포가 얻어진다.When these tissues or cells are cultured in the presence of at least one selected from the group consisting of jasmine acids, compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, heavy metal ions, amines and anti-ethylene agents, the tissues are cultured under normal culture conditions. In comparison, culture tissues or cultured cells having higher productivity of taxane-type diterpene are obtained.

중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나와 상기 일반식[Ⅰ],[Ⅱ] 또는 [Ⅲ]으로 나타낸 자스몬산류를 병용하면 본원 제1의 발명의 효과를 높일 수가 있다.Combination of at least one selected from the group consisting of compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, heavy metal ions, amines, and anti-ethylene agents and Jasmonic acid represented by the general formulas [I], [II] or [III] If it does, the effect of 1st invention of this application can be heightened.

이상과 같이 하여 얻어진 배양조직, 배양세포, 배지등의 배양물로부터 메타놀 등의 유기용매에 의한 추출에 의해 탁산형 디테르펜을 분리할 수가 있다. 또 배지중에 적당한 흡착제나 유기용매를 공존시켜서 배양중에 연속적으로 탁산형 디테르펜을 회수할 수도 있다.Taxane-type diterpenes can be separated from the cultured tissues, cultured cells, and cultures obtained as described above by extraction with an organic solvent such as methanol. Moreover, a taxane type diterpene can be collect | recovered continuously during culture | cultivation by coexisting a suitable adsorbent and organic solvent in a culture medium.

본 발명의 조직 배양의 바람직한 일례로서는 다음과 같은 방법을 들 수 있다.Preferred examples of the tissue culture of the present invention include the following methods.

우선 주목속에 속하는 식물의 식물체, 예를들어 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자 등으로부터 채취한 식물편을 살균처리후, 게란검으로 굳힌 우디플랜트 미디엄상에 치상[置床]하고, 10~35℃에서 14~60일 정도 경과시켜서 조직편의 일부를 칼루스[callus]화시킨다. 이와같이 하여 얻어진 칼루스를 계대 배양하면 생육속도가 점차 높아져서 안정화된 칼루스가 얻어진다. 여기에서 안정화된 칼루스라 함은 배양중에 칼루스의 일부가 슈트나 뿌리로 분화하지 않고 칼루스의 상태를 유지하는 성질을 가지며 세포의 생육속도가 균질한 것을 말한다.First of all, plants obtained from plants belonging to the genus of the genus, for example, roots, growth points, leaves, stems, seeds, etc., were sterilized and then placed on a woody plant medium hardened with a geran gum, and then treated at 10 to 35 ° C. After about 14 to 60 days, part of the tissue is called callus. Subsequent culturing of the callus obtained in this way increases the growth rate gradually, and the stabilized callus is obtained. Here, stabilized callus means that a part of callus is maintained in the state of callus without differentiating into a chute or root during culture, and the growth rate of cells is homogeneous.

이 안정화된 칼루스를 중식에 적합한 액체배지, 예를들어 액체우디 플랜드 미디엄에 옮겨서 중식시킨다. 액체배지에서 더욱 생육속도가 높아진다. 본 발명에서는 이 안정화된 칼루스 또는 이 칼루스를 구성하는 세포는 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나의 존재하에 고체배지 또는 액체배지에서 배양한다. 또 이 안정된 칼루스 또는 이 칼루스를 구성하는 세포는 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나누고, 적어도 하나의 층에 포함되는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나를 함유한 배지에서 배양하여도 좋다.This stabilized callus is transferred to a liquid medium suitable for lunch, such as a liquid woody plant medium, to be eaten. The growth rate is higher in the liquid medium. In the present invention, the stabilized callus or the cells constituting the callus are at least one selected from the group consisting of jasmine acids, compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, heavy metal ions, amines and antiethylene agents. Incubate in solid or liquid medium. The stable callus or the cells constituting the callus are divided into a plurality of layers due to the difference in specific gravity, and the cells contained in at least one layer are composed of jasmonic acid, compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, The medium may be cultured in a medium containing at least one selected from the group consisting of heavy metal ions, amines and antiethylene agents.

세포를 비중에 의해 분리하는 방법으로서는 일반적으로 원심분리용 매체를 사용하여 밀도구배를 작성하여 세포를 중층한 후, 원심분리하는 방법이 알려져 있다.As a method for separating cells by specific gravity, a method of centrifugation is generally known after forming a density gradient using a centrifugal separation medium to layer cells.

원심분리용매체로서는 Ficoll, Percoll[다같이 Pharmacia LKB Biotechnology사제], 자당[蔗糖], 염화세슘 등이 사용된다. 실시예 5등에서는 Ficoll을 사용하여 밀도구배를 작성하였으나, 세포에 상해를 주지 않은 것이면 특히 제한은 없다.As the centrifuge medium, Ficoll, Percoll (all manufactured by Pharmacia LKB Biotechnology), sucrose, cesium chloride and the like are used. In Example 5 and the like, density gradients were prepared using Ficoll, but there is no particular limitation as long as the cells are not injured.

밀도구배를 형성하는 층의 수에 특히 제한은 없다. 각 층의 비중차는 특히 한정되는 것은 아니고, 또 각 비중차는 같아도 좋고, 달라도 좋다.There is no particular limitation on the number of layers forming the density gradient. The specific gravity difference of each layer is not specifically limited, Moreover, each specific gravity difference may be the same and may differ.

따라서 이 밀도구배의 정의에는 구배가 연속적으로 변화할 경우[밀도구배를 형성하는 층의 수가 무한대, 각층의 비중차가 0에 가가운 상태]를 포함한다.Therefore, the definition of the density gradient includes the case where the gradient changes continuously (the number of layers forming the density gradient is infinite, and the specific gravity difference between each layer is close to zero).

이와같이 하여 밀도구배를 형성하여 세포를 중층, 원심분리함으로써 세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나눌 수가 있다.In this way, by forming a density gradient, the cells can be divided into a plurality of layers by the difference in specific gravity by forming the cells in a middle layer and centrifuging.

작성하는 층의 비중은 통상 1.00~1.20g/㎖, 바람직하기로는 1.03~1.11g/㎖의 범위이다. 배양의 대상이 되는 층으로서는 적어도 하나의 층을 선택하며, 또 모든 층을 선택하여 배양하여도 좋다.The specific gravity of the layer to prepare is 1.00-1.20g / ml normally, Preferably it is the range of 1.03-11.1g / ml. At least one layer may be selected as a layer to be cultured, and all layers may be selected and cultured.

복수의 층을 선택하여 배양할 경우에 이들 복수의 층은 각각 개별로 배양할 수도 있으나, 선택한 복수의 층 중의 층 이상의 층을 혼합하여 배양할 수도 있다.When a plurality of layers are selected and cultured, the plurality of layers may be individually cultured, but a plurality of layers may be mixed and cultured.

탁산형 디테르펜생성능이 높은 배양 세포는 통상비중이 1.07이하의 층에 포함된 세포를 배양하여 얻어지나, 배양하는 세포나 배양의 조건에 따라 변동하는 경우가 있어서, 반드시 이 범위에 한정되는 것은 아니다. 또 단순히 비중의 차이에 의해 분획한 것만으로는 비중이 높은 층의 세포쪽이 탁산형 디테르펜 함량이 높아지는 경향을 관찰할 수이 있다. 따라서 보다 확실하게 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포를 취득하기 위해서는 분획된 모든 층의 세포를 일정기간 배양한 후, 각층의 세포에 함유된 탁산형 디테르펜 농도를 측정하고, 그들 중에서부터 탁산형 디테르펜 고생성 세포를 포함한 층을 선택하는 것이 요망된다.Cultured cells having high taxane-type diterpene production ability are usually obtained by culturing cells contained in a layer having a specific gravity of 1.07 or less, but may vary depending on the cultured cells or culture conditions, and are not necessarily limited to this range. . In addition, it is possible to observe the tendency of the taxane-type diterpene content to increase in the cells of the layer having a high specific gravity by simply fractionating the difference by specific gravity. Therefore, in order to more reliably obtain the taxane-type diterpene-producing cultured cells, the cells of all the divided layers are cultured for a certain period of time, and then the concentration of the taxane-type diterpene contained in the cells of each layer is measured, and the taxane-type diterpene from them. It is desirable to select a layer containing terpene-producing cells.

또 예를들어 1.07g/㎖와 같이 어떤 하나의 특정 비중의 원심분리매체를 작성하고, 상술한 방법으로 원심분리하여도 배양세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나눌 수가 있다.In addition, even if a centrifuge medium having a specific specific gravity is prepared, for example, 1.07 g / ml, and centrifuged by the above-described method, the cultured cells can be divided into a plurality of layers by the difference in specific gravity.

또한 본원 제1의 발명은 본원 제2의 발명인 배양기내의 기상중의 산소농도를 배양초기부터 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 제어하여 배양하든가, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소 농도를 배양초기부터 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 제어하여 배양하는 방법도 병용할 수가 있다.In addition, the first invention of the present application controls the oxygen concentration in the gas phase in the incubator according to the second invention of the present application under the condition of less than the oxygen concentration in the atmosphere from the beginning of the culture, or the dissolved oxygen in the fluid medium in contact with tissue or cells. It is also possible to use a method of controlling and culturing the concentration under the condition of less than the saturated dissolved oxygen concentration at the temperature from the beginning of the culture.

여기에서 배양초기라 함은 배양개시시~배양개시 7일째를 말하며, 배양기내의 기상중의 산소농도, 또는 조기 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 요존산소 농도의 제어는 배양개시시부터 행하는 것이 바람직하다. 또 제어의 기간으로서는 배양 전기간을 통하여 이 조건으로 제어하여도 좋고, 배양 전기간중의 일부기간만을 제어하여도 좋으며, 특히 한정하는 것은 아니지만 전배양기간중의 적어도 3일간 제어하는 것이 바람직하다.The initial stage of culture refers to the beginning of culture to the 7th day of culture, and the control of the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the oxygen concentration in the early or fluid fluid medium in contact with the cells is preferably performed from the beginning of the culture. Do. The period of control may be controlled under these conditions throughout the whole culture period, and only a part of the period during the whole culture period may be controlled. Although not particularly limited, it is preferable to control at least three days during the entire culture period.

배양기내의 기상중의 산소농도는 4~15%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 6~12%로 제어하는 것이 바람직하다. 또 유동성의 배지중의 용존 산소농도는 그 온도에서의 포화용존 산소농도치의 1~75%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 10~75%로 제어하는 것이 바람직하다.The oxygen concentration in the gas phase in the incubator needs to be controlled at 4 to 15%, particularly preferably at 6 to 12%. In addition, the dissolved oxygen concentration in the fluid medium needs to be controlled to 1 to 75% of the saturated dissolved oxygen concentration value at that temperature, and particularly preferably to 10 to 75%.

본원 제1의 발명과 본원 제2의 발명 및 본원 제3의 발명과의 3가지 방법을 모두 조합하는 것도 가능하다.It is also possible to combine all three methods of the first invention of the present application, the second invention of the present application, and the third invention of the present application.

본원 제1의 발명에서 자스몬산류는 배양세포의 대수증식기(exponential growth phase)∼정상기에 첨가하는 것이 효과적이며, 이중에서도 특히 대수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기에 자스몬산류를 첨가하는 것이 바람직하다. 또 내재성 자스몬산류의 생산량을 높이기 위한 처리의 시기에 대해서도 이것과 마찬가지이다. 예를들어 21일마다 세포를 이식하고 있는 경우에는 7∼16일째가 자스몬산류의 첨가 또는 내재성 자스몬산류의 생산량을 높이기 위한 처리의 적기에 해당되고, 대수증식기, 예를들어 7∼14일째의 세포를 이식할 때는 이식직후가 적기에 해당된다. 또 자스몬산류의 첨가 및 내재성 자스몬산류의 생산량을 높이는 처리는 한꺼번에 행하여도 복수회로 나누어서 행하여도 좋고, 또 연속적으로 행하여도 좋다. 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 또는 중금속이온은 배양 개시기∼배양세포가 대수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기까지에 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 배양개시시에 첨가하는 것이 바람직하다. 또 이 화합물 또는 이온의 첨가는 한꺼번에 행하여도 좋고, 수회에 나누어서 행하여도 좋다.In the first invention of the present application, it is effective to add jasmonic acid to an exponential growth phase of a culture cell to a normal phase. Among them, it is preferable to add jasmonic acid, especially at the time of transition from a logarithmic growth phase to a normal phase. The same applies to the timing of treatment for increasing the production of endogenous Jasmonic acid. For example, when cells are transplanted every 21 days, the 7th to 16th days correspond to the addition of jasmonic acid or the timely treatment to increase the production of endogenous Jasmonic acid, and the logarithmic growth stage, for example, the 7th to 14th days. When transplanting cells, the time is right after the transplant. In addition, the addition of Jasmonic acid and the process which raises the production amount of intrinsic Jasmonic acid may be performed at once, divided into multiple times, and may be performed continuously. Compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, or heavy metal ions are effective to be added from the beginning of culture to the time when the cultured cell transitions from the logarithmic growth phase to the normal phase. desirable. In addition, this compound or ion may be added all at once, and may be divided into several times.

아민류는 세포가 대수증식기에서 정상기로 이행하는 시기까지에 첨가함이 효과적이며, 특히 배양개시시에 첨가함이 바람직하다. 또 이 화합물은 한꺼번에 첨가하여도 좋고, 수회에 나누어 첨가해도 좋다.It is effective to add amines until the time when cells transition from a logarithmic growth phase to a normal phase, and especially at the start of culture. Moreover, this compound may be added all at once, and may be divided and added several times.

항 에틸렌제는 세포가 대수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기까지에 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 정상기로 이행한 직후에 첨가하는 것이 바람직하다. 또 이 화합물은 한꺼번에 첨가하여도 좋고, 수회에 나누어서 첨가하여도 좋다.It is effective to add an anti-ethylene agent until the time when a cell transitions from a logarithmic phase to a normal phase, and it is especially preferable to add it immediately after transition to a normal phase. This compound may be added all at once or may be added in several portions.

본원 제1의 발명에서의 조직 배양의 배양온도로서는 통상 약 10∼약35℃, 특히 약 23∼28℃가 증식속도가 크므로 가장 적합하다. 또 배양기간으로서는 14∼42일간이 가장 적합하다.As a culture temperature of the tissue culture in the first invention of the present application, usually about 10 to about 35 ℃, particularly about 23 to 28 ℃ is most suitable because of the high growth rate. As the culture period, 14 to 42 days are most suitable.

본원 제1의 발명에서의 배양에서 액체배지를 사용한 경우에는 배양종료후에 배양세포를 데칸테이션 또는 여과등의 방법에 의해 배지로부터 분리하고, 배양세포 및/또는 배지로부터 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 유기용매에 의해 추출등의 방법으로 분리할 수가 있다.In the case of using the liquid medium in the culture of the first invention of the present application, after completion of culture, the cultured cells are separated from the medium by a method such as decantation or filtration, and the desired taxane-type diterpene is removed from the cultured cells and / or medium. The organic solvent can be separated by extraction or the like.

이하, 본원 제2의 발명에 대해 설명한다.Hereinafter, the second invention of the present application will be described.

본원 제2의 발명에서 식물의 배양은 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하든가, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소 농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만의 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하는 이외에는 종래로부터 알려져 있는 방법에 의해 행할 수가 있다.In the second invention of the present invention, in culturing a plant tissue or cells, the culture of the plant is carried out by controlling the oxygen concentration in the gas phase in the incubator from the beginning of the cultivation under a condition below the oxygen concentration in the atmosphere, or with tissue or cells. The dissolved oxygen concentration in the contacting fluid medium can be controlled by a method known in the art, except that the dissolved oxygen concentration in the contacting medium is controlled from the initial culture under the condition of less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature.

종래, 탁산형 디테르펜생성 식물의 배양에서 조직 또는 세포를 배양하는 배양기에 공급하는 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 배지의 용존 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 제어하여 배양하든가, 또는 포화용존 산소농도 미만의 조건하에 제어하여 배양한 예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 그것에 의해 탁산형 디테르펜에 생성량이 증가한다는 것은 예상밖의 일이었다.Conventionally, in the culture of taxane-type diterpene-producing plants, oxygen concentration in the gas phase supplied to the incubator for culturing tissues or cells, or dissolved oxygen concentration of the medium in contact with the tissues or cells is controlled under conditions of less than the oxygen concentration in the atmosphere. There have been no reports of cultivation or control and cultivation under conditions of less than saturated dissolved oxygen concentration, and furthermore, it was unexpected that the production amount of the taxane-type diterpene increased.

본원 제2의 발명에서 조직 또는 세포를 배양하는 배양기내의 기상중의 산소농도는 4∼15%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 6∼12%로 제어하는 것이 바람직하다. 또 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도는 그 온도에서의 포화용존 산소농도치의 1∼75%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 10∼75%로 제어하는 것이 바람직하다.In the second invention of the present application, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator for culturing tissues or cells is required to be controlled to 4 to 15%, particularly preferably to 6 to 12%. In addition, it is necessary to control the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissues or cells at 1 to 75% of the saturated dissolved oxygen concentration value at that temperature, and particularly preferably at 10 to 75%.

본원 제2의 발명에 사용되는 배지로서는 종래로부터 알려져 있는 식물의 조직 배양에 사용되는 배지, 예를들어 무라시게 스쿡(1962년)[Murashige Skoog]의 배지, 린스마이어 스쿡(1965년)[Linsmaier Skoog]의 배지, 우디 플랜드 미디엄(1981년)[Woody Plant Medium], 갬보르그[Gamborg]의 B-5배지, 미쓰이의 M-9배지등을 들 수 있다.As a medium used for the second invention of the present application, a medium used for tissue culture of conventionally known plants, for example, a medium of Murashige Skoog (1962) and Linsmaier Skoog (1965) ], Woody Plant Medium (1981), B-5 badges from Gamborg, and M-9 badges from Mitsui.

이들 배지에 식물 호르몬을 첨가하고, 다시 필요에 따라 탄소원, 무기성분, 비타민류, 아미노산 등을 첨가할 수도 있다.Plant hormones may be added to these mediums, and carbon sources, inorganic components, vitamins, amino acids, and the like may also be added as necessary.

탄소원으로서는 슈크로스, 말토스, 락토스 등의 2당류, 글루코스, 프락토스, 갈락토스 등의 단당류, 전분 또는 이들 당원의 2종 이상을 적당한 비율로 혼합한 것을 사용할 수 있다.As the carbon source, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, monosaccharides such as glucose, fructose and galactose, starch or a mixture of two or more kinds of these sugars can be used in an appropriate ratio.

무기성분으로서는 예를들어 인, 질소, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 황, 철, 망간, 아연, 붕소, 동, 몰리브덴, 염소, 나트륨, 옥소, 코발트 등을 들 수 있으며, 이들 성분은 예를들어 질산칼륨, 질산나트륨, 질산칼슘, 염화칼륨, 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 황산나트륨, 황산제1철, 황산제2철, 황산망간, 황산아염, 붕산, 황산동, 몰리브덴산 나트륨, 3산화몰리브덴, 옥화칼륨, 염화코발트등의 화합물로서 첨가할 수 있다.Examples of the inorganic components include phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, sulfur, iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine, sodium, oxo, cobalt, and the like. Potassium, Sodium Nitrate, Calcium Nitrate, Potassium Chloride, Potassium Hydrogen Phosphate, Potassium Dihydrogen Phosphate, Calcium Chloride, Magnesium Sulfate, Sodium Sulfate, Ferrous Sulfate, Ferric Sulfate, Manganese Sulfate, Sulfite Sulphate, Boric Acid, Copper Sulfate, Sodium Molybdate And molybdenum trioxide, potassium iodide, and cobalt chloride.

식물호르몬으로서는 예를들어 인돌초산(IAA), 나프탈렌초산(NAA), 2,4-디클로페녹시초산(2,4-D)등의 옥신류, 카이네틴, 제아틴, 디히드로 제아틴 등의 사이토 카이닌류가 사용된다.Examples of plant hormones include auxins such as indoleacetic acid (IAA), naphthalene acetate (NAA), and 2,4-diclophenoxyacetic acid (2,4-D), cinetin, zeatine, and dihydrozetin. Cytokines such as these are used.

비타민류로서는 예를들어 비오틴, 티아민(비타민B₁), 피리독신(비타민B₆), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산, 등이 사용된다.As the vitamins, for example, biotin, thiamine (vitamin B ₁ ), pyridoxine (vitamin B ₆ ), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid, and the like are used.

아미노산류로서는 예를들어 글리신, 페닐알라닌, 로이신, 글루타민, 시스테인 등을 첨가할 수 있다.As amino acids, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine, etc. can be added, for example.

일반적으로 상기의 각 성분은 탄소원이 약 1∼약30g/ℓ, 무기성분이 약 0.1㎛∼약100mM, 식물호르몬류가 약 0.01∼약10μM, 비타민류 및 아미노산류가 각각 0.1∼약100㎎/ℓ의 농도로 사용된다.Generally, each of the above components has a carbon source of about 1 to about 30 g / l, an inorganic component of about 0.1 μm to about 100 mM, plant hormones of about 0.01 to about 10 μM, and vitamins and amino acids of 0.1 to about 100 mg / l, respectively. Used at a concentration of l.

또한 본원 제2의 발명에는 액체배지 및 한천이나 게란검 등을 통상 0.1∼1% 함유하는 고형배지의 어느 것이나 사용할 수 있다.Further, in the second invention of the present application, any of a liquid medium and a solid medium containing 0.1 to 1% of agar, geran gum and the like can be used.

본원 제2의 발명의 조직 배양에서는 상기 식물의 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자, 꽃가루, 꽃밥, 꽃받침 등의 조직편 또는 세포, 또는 이들을 상기 배지 또는 다른 종류의 배지에 의해 조직 배양하여 얻어지는 배양세포를 사용할 수가 있다.In the tissue culture of the second invention of the present application, tissues or cells such as roots, growth points, leaves, stems, seeds, pollen, anthers, and calyxes of the plants, or cultured cells obtained by tissue culture with these media or other kinds of media Can be used.

또 본원 제2의 발명은 Agrobacterium tumefaciens 또는 Agrobacterium rhizogenes에 의한 감염에 의해 얻어지는 종양 세포 및/또는 모상근에 적용할 수도 있다.In addition, the second invention of the present application can be applied to tumor cells and / or hairy roots obtained by infection with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.

이들의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에서 배양초기로부터 제어하여 배양하거나 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하면 통상의 배양조건하에서 조직 배양한 경우에 비해 탁산형 디테르펜 생산성이 높은 배양조직 또는 배양세포가 얻어진다.In culturing these tissues or cells, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled from the beginning of the culture under conditions below the oxygen concentration in the atmosphere, or dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue or cells is determined. When controlled and cultured at the beginning of the culture under the condition of less than the saturated dissolved oxygen concentration at the temperature, cultured tissue or cultured cells having higher productivity of taxane-type diterpene can be obtained than when cultured under normal culture conditions.

본원 제2의 발명에서 배양초기라 함은 배양개시시∼배양개시 7일째를 말하며, 배양기내의 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도의 제어는 배양개시시부터 행하는 것이 바람직하다.In the second invention of the present invention, the initial culture refers to the beginning of the culture to the seventh day of the culture, and the control of the oxygen concentration in the gaseous phase in the incubator or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue or cells is initiation of the culture. It is preferable to perform from.

또 제어의 기간으로서는 배양 전기간을 통하여 이 조건으로 제어하여도 좋고, 배양 전기간중의 일부기간만을 제어하여도 좋으며, 특히 한정하는 것은 아니지만 전배양기간중의 적어도 3일간 제어하는 것이 바람직하다.The period of control may be controlled under these conditions throughout the whole culture period, and only a part of the period during the whole culture period may be controlled. Although not particularly limited, it is preferable to control at least three days during the entire culture period.

본원 제2의 발명의 제조방법은 각종 탁산형 디테르펜의 생산촉진 물질의 존재하에 배양하는 방법과 병용함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 더욱 높일 수가 있다.The production method of the second invention of the present application can further increase the productivity of the taxane-type diterpene by using in combination with a method of culturing in the presence of various kinds of taxane-type diterpene production promoting substances.

탁산형 디테르펜의 생산촉진물질로서는 예를들어 본원 제1의 발명에 사용하는 상기 일반식 (Ⅰ), (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류, 항에틸렌제를 들 수 있다.Examples of the promoter for the production of the taxane diterpene include Jasmonic acid represented by the general formulas (I), (II) or (III), compounds containing heavy metals, and heavy metals used in the first invention of the present application. Complex ions, heavy metal ions, amines, and anti-ethylene agents.

또 본원 제2의 발명은 후에 상술하는 본원 제3의 발명인 세포를 비중의 차이에 따라 복수의 차이에 따라 복수의 층으로 나누어 적어도 하나의 층에 포함된 세포를 배양하는 방법과 병용할 수도 있다.Moreover, 2nd invention of this application can also be used together with the method of culturing the cell contained in at least one layer by dividing the cell which is 3rd invention mentioned above into a several layer according to a some difference according to the difference of specific gravity.

또 본원 제2의 발명은 제조방법은 상술한 자스몬산류 등의 존재하에 배양하는 본원 제1의 발명의 방법과 세포를 배중의 차이에 의해 복수의 층으로 나누어 적어도 하나의 층에 포함된 세포를 배양하는 본원 제3의 발명의 방법의 양자를 병용할 수도 있다.In the second invention of the present application, the method of the first invention of the present invention, which is cultured in the presence of Jasmonic acid and the like described above, is divided into a plurality of layers according to the difference in fold, and the cells contained in at least one layer are cultured. You may use both of the method of the 3rd invention of this application together.

이상과 같이 하여 얻어진 배양조직, 배양세포, 배지등의 배양물로부터 메타놀등의 유기용매에 의한 추출에 의해 탁산형 디테르펜을 분리할 수가 있다.Taxane-type diterpenes can be separated from the cultured tissues, cultured cells, and cultures obtained as described above by extraction with an organic solvent such as methanol.

본원 제2의 발명의 조직배양의 바람직한 일례로서는 다음과 같은 방법을 들 수 있다.As a preferable example of the tissue culture of 2nd invention of this application, the following method is mentioned.

우선 주목속에 속하는 식물의 식물체, 예를들어 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자 등으로부터 채취한 식물편을 살균처리후, 게란검으로 굳힌 우디플랜드 미디엄상에 치상(置床)하고, 10∼35℃에서 14∼60일 정도 경과시켜서 조직편의 일부를 칼루스(callus)화시킨다. 이와같이 하여 얻어진 칼루스를 계대 배양하면 생육속도가 점차 높아져서 안정화된 칼루스가 얻어진다. 여기에서 안정화된 칼루스라 함은 배양중에 칼루스의 일부가 슈트나 뿌리로 분화하지 않고 칼루스의 상태를 유지하는 성질을 가지며 세포의 생육속도가 균질한 것을 말한다.First of all, plants obtained from plants belonging to the genus of the genus, for example, roots, growth points, leaves, stems, seeds, etc., were sterilized and then placed on a woody medium medium hardened with a geran gum. After 14 to 60 days at a temperature, a part of the tissue piece is callus (callus). Subsequent culturing of the callus obtained in this way increases the growth rate gradually, and the stabilized callus is obtained. Here, stabilized callus means that a part of callus is maintained in the state of callus without differentiating into a chute or root during culture, and the growth rate of cells is homogeneous.

이 안정화된 칼루스를 증식에 적합한 액체배지, 예를들어 액체우디 플랜드 미디엄에 옮겨서 증식시킨다. 액체배지에서 더욱 생육속도가 높아진다. 본 발명에서는 이 안정화된 칼루스 또는 이 칼루스를 구성하는 세포는 배양기내의 기상중의 산소농도가 대기중의 산소농도 미만으로 배양초기부터 제어되어 있든가, 또는 조직 및/또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도가 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만으로 배양초기부터 제어된 배양조건하에서 배양한다.This stabilized callus is transferred to a liquid medium suitable for growth, for example, a liquid woody plant medium. The growth rate is higher in the liquid medium. In the present invention, the stabilized callus or the cells constituting the callus are controlled from the beginning of the culture to the oxygen concentration in the gas phase in the incubator below the oxygen concentration in the atmosphere, or in the fluid medium in contact with the tissue and / or cells. The dissolved oxygen concentration is incubated under controlled culture conditions from the beginning of the culture to less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature.

조직 또는 세포는 산소를 소비(호흡)함으로써 스스로의 개체유지 또는 증식에 필요한 에너지를 획득한다.Tissues or cells consume energy (breath) to obtain the energy necessary for their own retention or proliferation.

일반적으로 조직 또는 세포를 배양하면 배양열수의 경과에 따라 세포량이 증가하고, 이와 동시에 산소의 소비량도 증가함이 알려져 있다.In general, it is known that when a tissue or cell is cultured, the cell volume increases with the progress of the hydrothermal water, and at the same time, the consumption of oxygen also increases.

따라서 계외로부터 강제적으로 통기 가스를 공급하지 않는 한, 조직 또는 세포를 포함한 플라스크 등의 배양기내의 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 배지중의 용존산소농도도 배양일수의 경과에 따라 자연히 대기중의 산소농도 미만, 또는 그 온도에서의 포화용존산소농도 미만의 값으로 저하하게 된다.Therefore, the oxygen concentration in the gaseous phase in the incubator such as a flask containing tissues or cells, or the dissolved oxygen concentration in the medium in contact with the tissues or cells also naturally stands by the course of the culture days, unless a forced gas is supplied from outside the system. It will fall to the value below the oxygen concentration in water, or below the saturated dissolved oxygen concentration in the temperature.

본 발명은 조직 또는 세포를 포함한 배양기내의 기상중의 산소농도 또는 배지중의 용존 산소농도를 대기중의 산소농도 미만이거나 또는 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만의 조건하에 적극적으로 제어한 조건하에 배양하는 점에서 상술한 사항과는 내용을 달리한다.The present invention cultivates under conditions in which the oxygen concentration in the gas phase or the dissolved oxygen concentration in the medium in the incubator containing tissues or cells is actively controlled under the conditions below the oxygen concentration in the atmosphere or below the saturated dissolved oxygen concentration at the temperature. It differs from the above in that it does.

특히 본 발명의 효과를 높이는 방법으로서 배양기내의 기상중의 산소농도 또는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 조직 또는 세포를 이 배양기내로 이식하기 전에 미리 대기중의 산소농도 미만이거나 또 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만으로 제어하는 방법이 예시된다.In particular, as a method of enhancing the effect of the present invention, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium is less than or equal to the oxygen concentration in the atmosphere before transplanting the tissue or cells into the incubator. A method of controlling below the dissolved oxygen concentration is illustrated.

또 제어의 기간으로서는 상술한 바와 같이 특히 제한은 없으나 전배양기간중의 적어도 3일간 제어하는 것이 바람직하다.The control period is not particularly limited as described above, but is preferably controlled for at least three days during the entire culture period.

또한 제어의 방법으로서는 조직 또는 세포를 포함한 배양기내의 기상중의 산소농도 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 대기중의 산소농도 미만이거나 또는 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만으로 제어가능한 배양조건하이면 특히 제한은 없으며, 예를들어 공기에 질소등을 혼합하여 산소농도를 저하시킴으로써 산소농도를 조절한 기체를 배양기내의 기상중 및/또는 배지중에 직접 통기하든가, 또는 통기조 등의 배양기 밖에서 배지중으로 직접 통기한 후, 이 배지를 배양기내에 관류(灌流)하든가, 또는 이 배양기내에 공급하는 공기등의 기체를 공급속도를 제한하여 기상중 및/또는 배지중으로 직접 통기하든가, 또는 통기조등의 배양기 밖에서 이 기체를 공급속도를 제한하여 배지중으로 직접 통기한 후, 이 배지를 배양기내에 관류하든가, 또는 배양기를 저산소 분위기에 놓고 배양하든가, 또는 산소흡착제 존재하에 배양하는 방법등을 들 수 있다.As a control method, the oxygen concentration in the gas phase or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue or cells is less than the oxygen concentration in the atmosphere or the saturated dissolved oxygen concentration at the temperature. There is no restriction in particular under controllable culture conditions. For example, by mixing nitrogen with air to lower the oxygen concentration, the gas whose oxygen concentration is adjusted is directly aerated in the gas phase and / or medium in the incubator, or in an aeration tank. After direct aeration into the medium from outside the incubator, the medium is perfused into the incubator, or gas such as air supplied into the incubator is directly aerated in the gas phase and / or in the medium by limiting the feed rate, or the aeration tank. Outside the incubator, such a gas is limited to the feed rate and aerated directly into the medium, and then the medium is Perfusion in the incubator, or incubating with the incubator in a low oxygen atmosphere, or culturing in the presence of an oxygen adsorbent.

본 발명의 조직배양의 배양온도로서는 통상은 약10∼약35℃, 특히 약23∼약28℃가 증식속도가 크므로 가장 적합하다. 또 배양기간으로서는 14∼42일간이 가장 적합하다.As a culture temperature of the tissue culture of the present invention, usually about 10 to about 35 ° C, particularly about 23 to about 28 ° C is most suitable because the growth rate is large. As the culture period, 14 to 42 days are most suitable.

본 발명의 배양에서 액체배양을 사용할 경우에는 배양 종료후에 배양세포를 데칸테이션 또는 여과 등의 방법에 의해 배지로부터 분리하여 배양세포 및/또는 배지로부터 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 유기용매에 의한 추출등의 방법에 의해 분리할 수가 있다. 또 흡착제나 적당한 유기용매를 배양기내에 공존시켜 배양중에 연속적으로 목적 화합물을 회수할 수도 있다.In the case of using liquid culture in the culture of the present invention, after completion of the culture, the cultured cells are separated from the medium by a method such as decantation or filtration, and the desired taxane-type diterpene is extracted from the cultured cell and / or medium by an organic solvent. It can isolate | separate by such methods. In addition, an adsorbent or a suitable organic solvent can coexist in an incubator, and the target compound can be collect | recovered continuously during culture.

이하 본원 제3의 발명에 대해 설명한다.Hereinafter, the third invention of the present application will be described.

본원 제3의 발명에서 배양후, 탁산형 디테르펜생성능이 높아지는 배양세포를 포함한 층으로서는 예를들면 비중 1.07이하의 층을 들 수 있다.In the third invention of the present application, as the layer containing the cultured cells having high taxane-type diterpene production performance, for example, a layer having a specific gravity of 1.07 or less may be mentioned.

세포를 비중에 의해 분리하는 방법으로서는 일반적으로 원심분리용 매체를 사용하여 밀도구배를 작성하여 세포를 중층한 후, 원심분리하는 방법이 알려져 있다.As a method for separating cells by specific gravity, a method of centrifugation is generally known after forming a density gradient using a centrifugal separation medium to layer cells.

원심분리용 매체로서는 Ficoll, Percoll(다같이 Pharmacia LKB Biotechnology사제), 자당(蔗糖), 염화세슘 등이 사용된다. 실시예등에서는 Ficoll을 사용하여 밀도구배를 작성하였으나, 세포에 상해를 주지 않은 것이면 특히 제한은 없다. Ficoll은 세포과립등의 분리(Hess, R. et al., Nature, 208(1965) 856-858)나 동물세포의 분리(Walder, I.A. et al., Proc. Soc. exptl. Biol. Med., 112(1963), 494-496)등에 사용되고 있다.As the centrifuge medium, Ficoll, Percoll (all manufactured by Pharmacia LKB Biotechnology), sucrose, cesium chloride and the like are used. In Examples and the like, density gradients were prepared using Ficoll, but there is no particular limitation as long as the cells are not injured. Ficoll can be isolated from cell granules (Hess, R. et al., Nature, 208 (1965) 856-858) or from animal cells (Walder, IA et al., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 112 (1963) and 494-496).

밀도구배를 형성하는 층의 수에 특히 제한은 없다.There is no particular limitation on the number of layers forming the density gradient.

실시예에서는 비중 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11(g/ml)와 같이 각 층의 비중차가 0.02의 밀도구배를 작성하고 있으나, 비중차는 이 값에 한정되는 것은 아니고, 또 각 비중차는 같아도 좋고, 달라도 좋다.In the embodiment, the specific gravity difference of each layer has a density gradient of 0.02 such as specific gravity 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11 (g / ml), but the specific gravity difference is not limited to this value, and the specific gravity difference may be the same. May be different.

따라서 이 밀도구배의 정의에는 구배가 연속적으로 변화할 경우(밀도구배를 형성하는 층의 수가 무한대, 각층의 비중차가 0에 가까운 상태)를 포함한다.Therefore, the definition of the density gradient includes the case where the gradient changes continuously (the number of layers forming the density gradient is infinite, and the specific gravity difference of each layer is close to zero).

이와같이 하여 밀도구배를 형성하여 세포를 중층, 원심분리함으로써 세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나눌 수가 있다.In this way, by forming a density gradient, the cells can be divided into a plurality of layers by the difference in specific gravity by forming the cells in a middle layer and centrifuging.

작성하는 층의 비중은 통상 1.00∼1.20g/㎖, 바람직하기로는 1.03∼1.11g/㎖의 범위이다. 배양의 대상이 되는 층으로서는 적어도 하나의 층을 선택하며, 또 모든 층을 선택하여 배양하여도 좋다.The specific gravity of the layer to be prepared is usually in the range of 1.00 to 1.20 g / ml, preferably 1.03 to 1.11 g / ml. At least one layer may be selected as a layer to be cultured, and all layers may be selected and cultured.

복수의 층을 선택하여 배양할 경우에 이들 복수의 층은 각각 개별로 배양할 수도 있으나, 선택한 복수의 층 중의 2층 이상의 층을 혼합하여 배양할 수도 있다.When a plurality of layers are selected and cultured, the plurality of layers may be individually cultured, but two or more layers of the selected plurality of layers may be mixed and cultured.

탁산형 디테르펜생성능이 높은 배양 세포는 통상 비중이 1.07이하의 층에 포함된 세포를 배양하여 얻어지나, 배양하는 세포나 배양의 조건에 따라 변동하는 경우가 있어서, 반드시 이 범위에 한정되는 것은 아니다. 또 단순히 비중의 차이에 의해 분획된 것만으로는 비중이 높은 층의 세포쪽이 탁산형 디테르펜 함량이 높아지는 경향을 관찰할 수 있다. 따라서 보다 확실하게 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포를 취득하기 위해서는 분획된 모든 층의 세포를 일정기간 배양한 후, 각층의 세포에 함유된 탁산형 디테르펜 농도를 측정하고, 그들중으로부터 탁산형 디테르펜 고생성 세포를 포함한 층을 선택하는 것이 요망된다.Cultured cells with high taxane-type diterpene production ability are usually obtained by culturing cells contained in a layer having a specific gravity of 1.07 or less, but may vary depending on the cultured cells and the culture conditions, and are not necessarily limited to this range. . In addition, it is possible to observe the tendency of the taxane-type diterpene content to increase in the cell side of the layer having a high specific gravity simply by fractionation due to the difference in specific gravity. Therefore, in order to more reliably obtain the taxane-type diterpene-producing cultured cells, the cells of all the fractionated layers are cultured for a certain period of time, and the concentration of the taxane-type diterpene contained in the cells of each layer is measured, and the taxane-type diterpene from them. It is desirable to select a layer containing terpene-producing cells.

종래, 탁산형 디테르펜생성 식물의 배양세포를 세포의 비중에 의해서 분획후, 배양한 예는 보고되어 있지 않으며, 비중의 차이에 의해 탁산형 디테르펜생성능이 각각 다른 세포의 층으로 나눌 수가 있고, 더구나 분획한 시점에서 탁산형 디테르펜 함량이 그다지 높지 않은 비중 1.07이하에 포함되는 세포를 배양함으로써 탁산형 디테르펜고생성 세포가 취득된다는 것은 예상밖의 일이였다.Conventionally, examples of cultured cells of taxane-type diterpene-producing plants after fractionation by the specific gravity of the cells have not been reported, and due to the difference in specific gravity, the taxane-type diterpene-producing ability can be divided into layers of cells having different performances. Furthermore, it was unexpected that the taxane-type diterpene producing cells were obtained by culturing cells contained at a specific gravity of 1.07 or less having a very high taxane-type diterpene content at the time of fractionation.

또 본 발명에서는 예를들어 1.07g/ml와 같이 어떤 하나의 특정 비중의 원심분리용 매체를 작성하여 상술한 방법으로 원심분리하여도 배양세포를 비중차이에 의해 복수의 층으로 나눌수가 있다.In addition, in the present invention, the cultured cells can be divided into a plurality of layers by specific gravity difference even when a centrifugal medium having a specific specific gravity is prepared, for example, 1.07 g / ml, and centrifuged by the above-described method.

본 발명에서 사용되는 배지는 보통의 배지성분을 함유한다. 이와같은 성분으로서 일반적으로 무기성분 및 탄소원이 사용되고 이것에 식물 호르몬류, 비타민류를 첨가하고, 또한 필요에 따라 아미노산류를 첨가할 수가 있다. 탄소원으로서는 슈크로스, 말토스, 락토스 등의 2당류, 글루코스, 프락토스, 갈락토스 등의 단당류, 전분 또는 이들 당원의 2종 이상을 적당한 비율로 혼합한 것을 사용할 수 있다.The medium used in the present invention contains ordinary medium components. As such a component, an inorganic component and a carbon source are generally used, and plant hormones and vitamins can be added to it, and amino acids can be added as needed. As the carbon source, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, monosaccharides such as glucose, fructose and galactose, starch or a mixture of two or more kinds of these sugars can be used in an appropriate ratio.

무기성분으로서는 예를들어 인, 질소, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 황, 철, 망간, 아연, 붕소, 동, 몰리브덴, 염소, 나트륨, 옥소, 코발트 등을 들 수 있으며, 이들 성분은 예를들어 질산칼륨, 질산나트륨, 질산칼슘, 염화칼륨, 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 황산나트륨, 황산제1철, 황산제2철, 황산망간, 황산아염, 붕산, 황산동, 몰리브덴산 나트륨, 3산화몰리브덴, 옥화칼륨, 염화코발트 등의 화합물로서 첨가할 수 있다.Examples of the inorganic components include phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, sulfur, iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine, sodium, oxo, cobalt, and the like. Potassium, Sodium Nitrate, Calcium Nitrate, Potassium Chloride, Potassium Hydrogen Phosphate, Potassium Dihydrogen Phosphate, Calcium Chloride, Magnesium Sulfate, Sodium Sulfate, Ferrous Sulfate, Ferric Sulfate, Manganese Sulfate, Sulfite Sulphate, Boric Acid, Copper Sulfate, Sodium Molybdate And molybdenum trioxide, potassium iodide, and cobalt chloride.

식물호르몬으로서는 예를들어 인돌초산(IAA), 나프탈렌초산(NAA), 2,4-디클로로페녹시초산(2,4-D)등의 옥신(auxing)류, 카이네틴, 제아틴, 디히드로제아틴 등의 사이토카이닌류가 사용된다.Examples of plant hormones include auxins, such as indoleacetic acid (IAA), naphthalene acetate (NAA), and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), cinetin, zeatine, and dihydro. Cytokines, such as zeatine, are used.

비타민류로서는 예를들어 비오틴, 티아민(비타민B₁), 피리독신(비타민B₆), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등이 사용된다.As the vitamins, for example, biotin, thiamine (vitamin B ₁ ), pyridoxine (vitamin B ₆ ), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like are used.

아미노산류로서는 예를들어 글리신, 페닐알라닌, 로이신, 글루타민, 시스테인 등을 첨가할 수 있다.As amino acids, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine, etc. can be added, for example.

일반적으로 상기의 각 성분은 무기성분이 약 0.1M∼약100mM, 탄소원이 약 1∼약30g/ℓ, 식물호르몬류가 약 0.01∼약10μM, 비타민류 및 아미노산류가 각각 0.1∼약100㎎/ℓ의 농도로 사용된다.Generally, each of the above components is about 0.1M to about 100mM of inorganic components, about 1 to about 30g / L of carbon source, about 0.01 to about 10μM of plant hormones, and about 0.1 to about 100mg / of vitamins and amino acids, respectively. Used at a concentration of l.

본 발명의 조직배양에 사용되는 배지로서는 종래로부터 알려지고 있는 식물의 조직 배양에 사용되는 배지, 예를들어 무라시게 스쿡(1962년)[Murashige Skoog]의 배지, 린스마이어 스쿡(1965년)[Linsmaier Skoog]의 배지, 우디 플랜드 미디엄(1981년)[Woody Plant Medium], 갬보르그[Gamborg]의 B-5배지, 미쓰이의 M-9배지등에 상기의 식물호르몬을 첨가하고, 다시 필요에 따라 상기한 탄소원, 비타민류, 아미노산 등을 첨가하여 조제되는 배지를 예시할 수 있다.As a medium to be used for tissue culture of the present invention, a medium used for tissue culture of conventionally known plants, for example, a medium of Murashige Skoog (1962) and Linsmaier Cook (1965) [Linsmaier] Skoog], Woody Plant Medium (1981), B-5 medium of Gamborg, M-9 medium of Mitsui, etc. are added to the above-mentioned plant hormones, and again if necessary The medium prepared by adding one carbon source, vitamins, amino acids and the like can be exemplified.

본 발명에는 액체배지 및 한천이나 게란검 등을 통상 0.1∼1% 함유하는 고형배지의 어느 것이나 사용할 수 있으나, 통상은 액체배지가 바람직하다.In the present invention, any one of a liquid medium and a solid medium containing 0.1 to 1% of agar, geran gum and the like can be used. Usually, a liquid medium is preferable.

본 발명의 조직배양에서는 상기 식물의 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자, 꽃가루, 꽃밥, 꽃받침 등의 조직편 또는 세포, 또는 이들을 상기 배지 또는 다른 종래의 배지에 의해 조직 배양하여 얻어지는 배양세포를 사용할 수가 있다.In the tissue culture of the present invention, tissues or cells such as roots, growth points, leaves, stems, seeds, pollen, anthers, and calyxes of the plants, or cultured cells obtained by tissue culture of them with the medium or other conventional medium, can be used. have.

이들 세포를 본 발명에 의해 특정한 비중범위로 분획한 후에 배양하면 분획을 하지 않았던 대조구에 비해 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포가 얻어진다. 이 배양세포로부터 메타놀등의 유기용매에 의한 추출에 의해 탁산형 디테르펜을 분리할 수가 있다.When these cells are fractionated in a specific specific gravity range and cultured according to the present invention, taxane-type diterpene-producing cultured cells are obtained as compared to the control which was not fractionated. The taxane diterpene can be separated from the cultured cells by extraction with an organic solvent such as methanol.

본 발명의 조직배양의 바람직한 일례로서는 다음과 같은 방법을 들 수 있다.Preferred examples of tissue culture of the present invention include the following methods.

우선 주목속에 속하는 식물의 식물체, 예를들어 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자 등으로부터 채취되는 식물편을 살균처리후, 게란검으로 굳힌 우디플렌트 미디엄상에 치상(置床)하고, 10∼35℃에서 14∼60일 정도 경과시켜서 조직편의 일부를 칼루스(callus)화시킨다. 이와 같이 하여 얻어진 칼루스를 계대 배양하면 생육속도가 점차 높아져서 안정화된 칼루스가 얻어진다. 여기에서 안정화된 칼루스라 함은 배양중에 칼루스의 일부가 슈트나 뿌리로 분화하지 않고 칼루스의 상태를 유지하는 성질을 가지며 세포의 생육속도가 균질한 것을 말한다.Firstly, plants of plants belonging to the genus of the genus, for example, plant pieces collected from roots, growth points, leaves, stems, seeds, etc., are sterilized and then tooth-pasted on a woody plant medium hardened with a geran gum, and then subjected to 10 to 35 ° C. After about 14 to 60 days in a portion of the tissue piece callus (callus). Subsequent culturing of the callus obtained in this way increases the growth rate gradually, and the stabilized callus is obtained. Here, stabilized callus means that a part of callus is maintained in the state of callus without differentiating into a chute or root during culture, and the growth rate of cells is homogeneous.

이 안정화된 칼루스를 증식에 적합한 액체배지, 예를들어 액체우디 플랜드 미디엄에 옮겨서 증식시킨다. 액체배지에서 더욱 생육속도가 높아진다.This stabilized callus is transferred to a liquid medium suitable for growth, for example, a liquid woody plant medium. The growth rate is higher in the liquid medium.

본 발명의 조직배양의 배양온도로서는 통상은 약10∼약35℃, 특히 약23∼28℃가 증식속도가 크므로 가장 적합하다. 또 배양기간으로서는 14∼42일간이 가장 적합하다.As a culture temperature of the tissue culture of the present invention, usually about 10 to about 35 ° C, particularly about 23 to 28 ° C is most suitable because the growth rate is large. As the culture period, 14 to 42 days are most suitable.

본 발명의 배양에서 액체배지를 사용한 경우에는 배양종료후에 배양세포를 데칸테이션 또는 여과 등의 방법에 의해 배지로부터 분리하고, 이것으로부터 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 유기용매에 의한 추출등의 방법에 의해 분리할 수가 있다.In the case of using the liquid medium in the culture of the present invention, after completion of the culture, the cultured cells are separated from the medium by a method such as decantation or filtration, and the taxane-type diterpene of interest is extracted from the medium by an organic solvent. Can be separated by.

본원 제1의 발명 및 본원 제2의 발명에 의하면 탁산형 디테르펜을 대량으로, 그리고 간편하게 얻을 수가 있다.According to the first invention of the present application and the second invention of the present application, the taxane type diterpene can be obtained in large quantities and simply.

본원 제3의 발명에 의하면 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포를 간이한 조작에 의해 취득할 수가 있다.According to the third invention of the present application, the taxane-type diterpene highly produced cultured cells can be obtained by a simple operation.

본원 제1∼제3의 발명을 공업적으로 실시함에 있어서는 이하에 나타내는 본원 제4∼제7의 발명을 단독 또는 그 조합의 형태로 채용함으로써 더욱 효과를 높일 수 있다.In industrially implementing the first to third applications of the present application, the effect can be further enhanced by employing the fourth to seventh inventions described below in the form of a single or a combination thereof.

즉 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어 배양액에 산소함유 가스를 공급할 필요가 있다. 통상은 이 목적으로 공기를 사용하나, 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양조를 사용하여 배양할 때 조내에 도입하는 산소함유가스로서 0.03∼10%, 바람직하기로는 0.1∼5%의 탄산가스를 함유한 가스를 사용하면 탁산형 디테르펜의 생성이 효율적으로 이루어진다는 것을 알아내어, 본원 제4의 발명의 발명을 완성하였다.That is, it is necessary to supply an oxygen-containing gas to the culture medium in culturing the tissues or cells of plants that produce the taxane-type diterpenes. Although air is usually used for this purpose, the present inventors have diligently studied, and as a result, 0.03 to 10 is introduced as an oxygen-containing gas introduced into the tank when the tissues or cells of the plant producing the taxane-type terterpene are cultured using a culture tank. When the gas containing the carbon dioxide gas of%, preferably 0.1 to 5% was used, the taxane-type diterpene was efficiently produced, and thus, the fourth invention of the present application was completed.

또 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어, 다음 공정의 탁산형 디테르펜의 생산에 대해 활성화된 조직 또는 세포를 얻기 위하여 산화제 또는 수용성의 함산소유기화합물을 첨가한 배지를 사용하여 행하는 1단째 배양과, 탁산형 디테르펜의 생산을 촉진하는 조건하에 행하는 2단째 배양의 2개의 공정으로 되는 2단 배양을 행함으로써 배양물중의 탁산형 디테르펜 생산성이 현저하게 향상함과 동시에 계대 배양에 수반되는 탁산형 디테르펜 생산성의 변동이 억제되는 것을 알아내어, 본원 제5의 발명의 발명을 완성하였다. 여기에서 산화제로서 퍼옥소 2황산 칼륨 등의 퍼옥소 2 황산염, 과산화수소 등을 또 수용성의 함산소유기화합물로서는 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭시드, 에틸렌 글리콜 등을 예시할 수 있다. 상기 첨가물의 배지에서의 총 농도는 첨가직후에 10^-6M∼10^-1M으로 하는 것이 바람직하며, 특히 10^-5M∼10^-2M의 범위로 조정하는 것이 더욱 바람직하다.Also, in culturing the tissues or cells of plants producing taxane-type diterpenes, a medium to which an oxidizing agent or a water-soluble oxygen-containing organic compound is added to obtain the tissues or cells activated for the production of the taxane-type diterpenes in the following process is used. The productivity of the taxane-type diterpene in a culture can be remarkably improved by carrying out the two-stage culture which consists of two processes of the 1st stage culture | cultivation performed using and the 2nd stage culture | cultivation performed on the conditions which promote the production of a taxane type diterpene. At the same time, it was found that the fluctuation in the taxane-type diterpene productivity accompanying passage culture was suppressed, and the invention of the fifth invention of the present application was completed. As the oxidizing agent, peroxo disulphate such as potassium peroxo disulphate, hydrogen peroxide, and the like, and water-soluble oxygen-containing organic compounds include dimethyl formamide, dimethyl sulfoxide, ethylene glycol and the like. The total concentration in the medium of the additive is preferably 10 ^-6 M to 10 ^-1 M immediately after addition, and more preferably in the range of 10 ^-5 M to 10 ^-2 M.

또 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어, 당 농도가 2∼50g/ℓ, 바람직하기로는 10∼30g/ℓ 및/또는 질산이온농도가 2∼50mmol/ℓ, 바람직하기로는 10∼30mmol/ℓ인 배지에 조직 또는 세포를 이식한 후, 이 배지의 초기 용량에 대해 1일당 0.2∼5g/ℓ, 바람직하기로는 0.5∼3g/ℓ의 당 및/또는 0.2∼5mmol/ℓ, 바람직하기로는 0.5∼3mmol/ℓ의 질산이온을 함유한 영양원 용액을 연속적 또는 간헐적으로 첨가하여 배양하면 이 조직 또는 세포의 고밀도 배양이 가능해지고, 이에 따라 배양기 당의 탁산형 디테르펜 생산량이 비약적으로 향상하는 것을 알아내어, 본원 제6의 발명을 완성하였다. 여기에서 밀도라 함은 배양조중의 배양액용적당의 세포량을 표시하며, 배양액 1리터당의 건조세포중량(g)으로 나타낸다. 본원 제6의 발명에서는 영양원 용액을 첨가할 때, 같은 용량의 배지를 조직 또는 세포로부터 분리하여 배출함으로써 배지를 갱신하면서 배양하고, 얻어지는 배양물, 배양도중에 배출하여 회수되는 배지 및 배양종료시에 얻어지는 배지로부터 선택되는 적어도 1종이상으로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것이 바람직하다. 또 본원 제6의 발명은 배양개시시의 이 식물의 조직 또는 세포의 밀도가 배지 용량에 대해 50g 신선중/ℓ이상의 고밀도 배양에서 탁산형 디테르펜의 생산성 향상에 대한 효과가 특히 크다.In culturing tissues or cells of plants producing taxane-type diterpenes, the sugar concentration is 2 to 50 g / l, preferably 10 to 30 g / l and / or the nitrate ion concentration is 2 to 50 mmol / l, preferably Is 0.2 to 5 g / l per day, preferably 0.5 to 3 g / l of sugar and / or 0.2 to 5 mmol / l, based on the initial dose of the medium after transplanting the tissue or cells to a medium of 10 to 30 mmol / l. In particular, continuous or intermittent addition of a nutrient solution containing 0.5 to 3 mmol / l nitrate ions enables high density culture of this tissue or cell, thereby significantly increasing the amount of taxane-type diterpene per incubator. It discovered that it carried out and completed 6th invention of this application. Here, the density means the cell amount per the volume of the culture solution in the culture tank, and is expressed as the dry cell weight (g) per liter of the culture solution. In the sixth invention of the present application, when the nutrient solution is added, the same volume of medium is separated from the tissue or cells and discharged, followed by culturing while renewing the medium, the culture obtained, the medium recovered by discharging during the culture, and the medium obtained at the end of the culture. It is preferable to recover the taxane type diterpene from at least one or more selected from. In addition, the sixth invention of the present application is particularly effective in improving the productivity of the taxane-type diterpene in the high-density culture in which the density of the tissue or cells of the plant at the start of culture is 50 g fresh / l or more with respect to the medium capacity.

또한 통상적으로는 고밀도의 세포가 얻어진 단계에서 배양을 종료하나, 본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 세포를 배출하면서 배양을 계속함으로써 연속 배양을 실현하고, 더욱 검토를 거듭하여 본원 제7의 발명인 연속배양법을 완성하였다. 즉 배양조중의 배양액의 총용량을 V, 신선배지의 공급속도를 V₁, 조직 또는 세포의 비증식도를 μ라 할때 무차원수 F=V₁/V/μ로 정의하는 배지의 비갱신율을 0.1∼10의 범위가 되도록 연속적 또는 간헐적으로 신선배지를 첨가하고, 연속적 또는 간헐적으로 조외로 배출되는 조직 또는 세포를 포함한 배양액 및/또는 연속적 또는 간헐적으로 조외로 배출되는 조직 또는 세포를 포함하지 않는 배양액으로부터 탁산형 디테르펜을 회수함으로써 종래의 방법으로는 도저히 불가능으로 예측되는 높은 효율로 탁산형 디테르펜을 제조할 수 있게 되어 본원 제7의 발명을 완성하였다. 배지의 비갱신율 F는 0.5∼5로 하는 것이 더욱 바람직하다. 배양액의 당농도는 5∼40g/ℓ, 배양액의 질산이온농도는 10∼40mmol/ℓ인 것이 바람직하다. 세포밀도는 1리터당 생세포중량으로 50∼500g에서 본 발명의 효과가 달성되나, 극단적으로 강한 교반을 필요로 하지 않는 범위에서 높은 편이 좋은 효율로 탁산형 디테르펜을 생산할 수 있어, 1리터당 200g 이상이 바람직하다.Normally, the culture is terminated at the stage where cells of high density are obtained, but the present inventors have intensively studied, and as a result of continuing the cultivation while discharging the cells, continuous cultivation is realized, and further studies have been carried out. The continuous culture method was completed. In other words, when the total volume of the culture medium in the culture tank is V, the supply rate of fresh medium is V ₁ , and the specific growth rate of the tissue or cells is μ, the specific renewal rate of the medium defined as dimensionless number F = V ₁ / V / μ. Fresh medium is added continuously or intermittently to be in the range of 0.1 to 10, and does not include culture medium containing tissues or cells continuously or intermittently discharged to the outside and / or tissues or cells continuously or intermittently discharged to the outside. By recovering the taxane-type diterpene from the culture solution, it is possible to produce the taxane-type diterpene with high efficiency that is hardly predictable by the conventional method, thereby completing the seventh invention of the present application. The specific renewal rate F of the medium is more preferably 0.5 to 5. The sugar concentration of the culture solution is preferably 5-40 g / l, and the nitrate ion concentration of the culture solution is 10-40 mmol / l. The cell density is 50 to 500 g of live cell weight per liter, but the effect of the present invention is achieved, but it is possible to produce taxane-type diterpenes with high efficiency in the range that does not require extremely strong agitation, and more than 200 g per liter desirable.

그리고 상기 본원 제4∼제7의 발명을 상기 본원 제3의 발명과 조합시키기 위해서는 본원 제3의 발명에 의해 취득한 세포를 본원 제4∼제7의 발명에 따라 배양해서 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 제조하면 좋다.In order to combine the fourth and seventh inventions of the present application with the third and third inventions of the present application, the cells obtained by the third invention of the present application are cultured according to the fourth and seventh inventions of the present application, and a taxane-type diterpene of interest is used. It is good to manufacture.

[도면의 간단한 설명][Brief Description of Drawings]

제1도는 자스몬산 메틸 100μM을 첨가후의 배지중의 탁솔 수량(收量)의 변화를 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing the change in the amount of Taxol in the medium after adding 100 µM of methyl jasmonate.

제2도는 자스몬산 메틸 100μM을 첨가후의 배지중의 바카틴Ⅲ수량의 변화를 나타낸 도면이다.FIG. 2 is a graph showing changes in the amount of baccatin III in the medium after adding 100 µM of methyl jasmonate.

제3도는 본원 제2의 발명에 의해 조직 배양을 할 때 사용되는 배양장치의 예를 나타낸 도면이다. 제3도의 각 부호는 이하의 의미를 갖는다.3 is a diagram showing an example of a culture apparatus used for tissue culture according to the second invention of the present application. Each code in Fig. 3 has the following meaning.

제4도는 분획 배양후의 생육을 나타낸 도면이다.4 is a diagram showing the growth after fraction culture.

제5도는 분획 배양후의 탁산함량을 나타낸 도면이다.5 is a diagram showing the taxane content after fraction culture.

제6도는 분획시의 세포의 존재비를 나타낸 도면이다.6 shows the abundance of cells in fractionation.

제7도는 분획시의 탁산함량(세포중)을 나타낸 도면이다.7 is a diagram showing the taxane content (in cells) at the time of fractionation.

제8도는 본원 제6 또는 제7의 발명에 의해 조직배양을 할 때 사용되는 배양장치의 예를 나타낸 도면이다. 제8도의 각 부호는 이하의 의미를 갖는다.8 is a diagram showing an example of a culture apparatus used for tissue culture according to the sixth or seventh invention of the present application. Each code in Fig. 8 has the following meaning.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명* Explanation of symbols for main parts of the drawings

1 : 공기공급관 2 : 질소공급관1: air supply pipe 2: nitrogen supply pipe

3 : 배양조 4 : 산소함유 가스 공급구3: culture tank 4: oxygen-containing gas supply port

5 : 용존산소농도계 6 : 용존산소농도 제어장치5: dissolved oxygen concentration meter 6: dissolved oxygen concentration controller

7 : 가스배기관 8 : 밸브7: gas exhaust pipe 8: valve

9 : 산소유량제어밸브 10 : 에어필터9: oxygen flow control valve 10: air filter

11 : 교반날개11: stirring blade

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]Best Mode for Carrying Out the Invention

이하 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.

[실시예1]Example 1

나프탈렌 초산을 10^-5M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커(rotary shaker)상에서 선회배양(진폭 25㎜, 120rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.Taxus baccata linn, previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, in solid woody plant medium (0.25% by weight of geran gum) containing naphthalene acetate at a concentration of 10 ^-5 M A part of the stem was wounded, and was cultivated in a cow at 25 ° C. in a cow to obtain an olecus callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml liquid woody plant medium flask containing the same concentration of the above components, and incubated on a rotary shaker (amplitude 25 mm, 120 rpm) to give 21 Implantation every day accelerated the growth of this callus.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 우디 플랜트 미디엄의 액체 배지 20ml들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 일반식(Ⅰ)로 나타낸 화합물로서 투베론산의 메틸 에스테르(상기식(Ⅰ)에서 R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵및 R^6a가 수소원자이며, R^6b가 수산기이며, R⁷이 메톡시기이며, n이 1이며, C³와 C⁴사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 0.01∼1000㎛가 되도록 첨가하여 다시 7일간 배양하였다.1 g of the cultured cells (in fresh) thus obtained were transferred to a three-necked flask of 20 ml of liquid medium of the woody plant medium to which the above components were added at the same concentration, followed by shaking culture at 25 ° C. for 14 days. Methyl ester of tuberonic acid (in Formula (I) above, R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , R ^1f , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ^6a are hydrogen atoms, R ^6b is a hydroxyl group, R ⁷ is a methoxy group, n is 1 and a double bond between C ³ and C ⁴ ) It was added to the concentration of 0.01 ~ 1000㎛ and incubated again for 7 days.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of the western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth weight of the cultured cells per 1 L of the liquid medium. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol, etc., and the amount of the taxane type diterpene was measured by comparative quantification with standard Taxol, Sepharomanin, and Bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 1.

[비교예1]Comparative Example 1

실시예1에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.The operation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the methyl ester of tuberonic acid was not added in Example 1. The results are shown in Table 1.

[실시예2]Example 2

실시예1에서 투베론사의 메틸에스테르를 배양 7일째부터 하루 건너로 계 4회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 25㎛, 합계 100μM)한 이외에는 실시예1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.In Example 1, the methyl ester of Tuberon company was operated in the same manner as in Example 1, except that the sequential addition of the methyl ester four times a day from the seventh day of culture (a final concentration of 25 μm and 100 μM in total) was carried out. The results are shown in Table 1.

[실시예3]Example 3

실시예1에서 투베론산의 메틸에스테르 100μM를 배양 1일째에 첨가하고, 다시 20일간 배양한 이외에는 실시예1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.In Example 1, 100 µM of methyl ester of tuberonic acid was added on the first day of culture, and the same operation as in Example 1 was carried out except that the culture was carried out for 20 days. The results are shown in Table 1.

[실시예4]Example 4

실시예1에서 투베론산의 메틸에스테르 100μM를 배양 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양한 이외에는 실시예1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.In Example 1, 100 µM of methyl ester of tuberonic acid was added on the 7th day of culture, and the same operation as in Example 1 was performed except for incubation for 14 days. The results are shown in Table 1.

[실시예5]Example 5

실시예1의 방법으로 얻어지는 생육속도를 빠르게 한 세포를 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840㎛ 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Ficoll을 사용하여 비중 1.07(g/ml)인 밀도의 매체를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심을 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 2층으로 분리하였다. 1.07g/ml 이하의 층에 포함되는 세포를 분획하고, 2% 자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Ficoll을 씻어내었다. 세정후 세포 1g(신선중)을 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 투베론산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 250μM가 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다. 특정 비중의 세포의 선별과 투베론산 메틸 에스테르의 첨가를 조합함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.Cells having a rapid growth rate obtained by the method of Example 1 were first classified into cell aggregates having a size of 250 to 840 µm by stainless steel mesh. Next, Ficoll was used to prepare a medium having a specific gravity of 1.07 (g / ml), and the cells were stratified and centrifuged at 700 revolutions for 6 minutes. Cells were separated into two layers by difference in specific gravity. Cells contained in the layer of 1.07 g / ml or less were fractionated, and the Ficoll was washed by washing at least three times with 2% sucrose. After washing, 1 g of cells (in fresh) were transferred to a three-necked flask containing 20 ml of liquid woody plant medium, followed by shaking culture at 25 ° C. for 14 days. On day 14 of culturing, methyl ester of tuberonic acid was added so as to have a final concentration of 250 µM, and cultured for another 7 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 2. By combining the selection of cells with a specific specific gravity and the addition of tuberonic acid methyl ester, the productivity of the taxane-type diterpenes can be greatly improved.

[비교예2]Comparative Example 2

실시예5에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예5와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.The same operation as in Example 5 was carried out except that the methyl ester of tuberonic acid was not added in Example 5. The results are shown in Table 2.

[실시예6]Example 6

실시예1과 마찬가지 방법에 의해 얻어지는 태평양 주목의 배양세포(배양 14일째)에 투베론산의 메틸에스테르 250μM를 첨가하여 7일간 배양하였다. 배양 종료후에는 실시예1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.To the cultured cells of Pacific yeast obtained by the same method as in Example 1 (day 14 of culture), 250 μM of methyl ester of tuberonic acid was added and cultured for 7 days. After the completion of the culture, the same operation as in Example 1 was performed. The results are shown in Table 3.

[비교예3]Comparative Example 3

실시예6에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예6과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.The same operation as in Example 6 was carried out except that the methyl ester of tuberonic acid was not added in Example 6. The results are shown in Table 3.

[실시예7]Example 7

실시예6에서 T. media의 배양세포를 사용한 이외에는 실시예6과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.The same procedure as in Example 6 was repeated except that the cultured cells of T. media were used in Example 6. The results are shown in Table 3.

[비교예4]Comparative Example 4

실시예7에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.The operation was carried out in the same manner as in Example 7, except that the methyl ester of tuberonic acid was not added in Example 7. The results are shown in Table 3.

[실시예8]Example 8

나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 우디 플랜트 미디엄의 고체배지(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커(rotary shaker)상에서 선회배양(진폭 25㎜, 120rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.10 Naphthalene Acetic Acid A part of the stem of Taxus baccata Linn, which was sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, in a solid medium (0.25 wt% of geran gum) of woody plant medium added to the concentration of M It was wound, and was cultured in a cow at 25 ° C. in a cow to obtain a western juju callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml liquid woody plant medium flask containing the same concentration of the above components, and incubated on a rotary shaker (amplitude 25 mm, 120 rpm) to give 21 Implantation every day accelerated the growth of this callus.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산류로서 쿠쿠르빈산의 메틸 에스테르(상기식(Ⅱ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 0.01∼1000㎛가 되도록 첨가하여 다시 7일간 배양하였다.1 g (in fresh) of the cultured cells thus obtained were transferred to a three-necked flask of 20 ml of liquid woody plant medium to which the above components were added at the same concentration, followed by shaking culture at 25 ° C for 14 days. Methyl ester of coucurvinic acid as Jasmonic acid on the 14th day of culture (R in Formula (II) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is a methoxy group, n is 1 and C And C Compound having a double bond in between) was added to the final concentration of 0.01 ~ 1000㎛ and incubated for 7 days again.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of the western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth weight of the cultured cells per 1 L of the liquid medium. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol, etc., and the amount of the taxane type diterpene was measured by comparative quantification with standard Taxol, Sepharomanin, and Bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 4.

[비교예5]Comparative Example 5

실시예8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.The same operation as in Example 8 was carried out except that the methyl ester of coucurvinic acid was not added in Example 8. The results are shown in Table 4.

[실시예9]Example 9

실시예8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 배양 7일째부터 하루 건너로 계 4회 축차 첨가(1회당의 최종농도는 25㎛, 합계 100μM)한 이외에는 실시예8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.In Example 8, operation was carried out in the same manner as in Example 8, except that the methyl ester of coucurvinic acid was sequentially added four times a day from the seventh day of culture (the final concentration per serving was 25 µm and 100 µM in total). The results are shown in Table 4.

[실시예10]Example 10

실시예8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르 100μM를 배양 1일째에 첨가하고, 다시 20일간 배양한 이외에는 실시예8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.In Example 8, 100 µM of methyl ester of coucurvinic acid was added on the first day of culture, and the same operation as in Example 8 was performed except for incubation for 20 days. The results are shown in Table 4.

[실시예11]Example 11

실시예8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르 100μM를 배양 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양한 이외에는 실시예8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.In Example 8, 100 µM of methyl ester of coucurvinic acid was added on the 7th day of culture, and then operated in the same manner as in Example 8 except for incubating for 14 days. The results are shown in Table 4.

[실시예12]Example 12

실시예8의 방법으로 얻어지는 생육속도를 빠르게 한 세포를 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840㎛ 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Fcoil을 사용하여 비중 1.07(g/ml)인 밀도의 매체를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심을 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 2층으로 분리하였다. 1.07g/ml 이하의 층에 포함되는 세포를 분획하고, 2% 자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Fcoil을 씻어내었다. 세정후 세포 1g(신선중)을 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 250μM가 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표5에 나타낸다. 특정 비중의 세포의 선별과 쿠쿠르빈산 메틸 에스테르의 첨가를 조합함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.Cells having a rapid growth rate obtained by the method of Example 8 were first classified into cell aggregates having a size of 250 to 840 µm by stainless steel mesh. Next, a medium having a density of 1.07 (g / ml) was prepared using Fcoil to stack the cells, and centrifuged at 700 revolutions for 6 minutes. Cells were separated into two layers by difference in specific gravity. Cells contained in the layer of 1.07 g / ml or less were fractionated and washed with at least 3 times with 2% sucrose to wash off the Fcoil. After washing, 1 g of cells (in fresh) were transferred to a three-necked flask containing 20 ml of liquid woody plant medium, followed by shaking culture at 25 ° C. for 14 days. On day 14 of cultivation, methyl ester of coucurvinic acid was added so as to have a final concentration of 250 µM, and further cultured for 7 days. After the completion of the culture, the same operation as in Example 8 was performed. The results are shown in Table 5. By combining the selection of cells with a specific specific gravity and the addition of coucurvinic acid methyl ester, the productivity of the taxane-type diterpenes can be greatly improved.

[비교예6]Comparative Example 6

실시예12에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예12와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표5에 나타낸다.The same operation as in Example 12 was carried out except that the methyl ester of coucurvinic acid was not added in Example 12. The results are shown in Table 5.

[실시예13]Example 13

실시예8과 마찬가지의 방법에 의해 얻어지는 태평양 주목의 배양세포(배양 14일째)에 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르 250μM를 첨가하여 7일간 배양하였다. 배양 종료후에는 실시예8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표6에 나타낸다.To the cultured cells of Pacific yeast obtained by the same method as in Example 8 (day 14 of culture), 250 μM of methyl ester of coucurvinic acid was added and cultured for 7 days. After the completion of the culture, the same operation as in Example 8 was performed. The results are shown in Table 6.

[비교예7]Comparative Example 7

실시예13에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표6에 나타낸다.The same operation as in Example 13 was carried out except that the methyl ester of coucurvinic acid was not added in Example 13. The results are shown in Table 6.

[실시예14]Example 14

실시예13에서 T. media의 배양세포를 사용한 이외에는 실시예13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표6에 나타낸다.The same procedure as in Example 13 was repeated except that the culture cells of T. media were used in Example 13. The results are shown in Table 6.

[비교예8]Comparative Example 8

실시예14에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예14와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표6에 나타낸다.The same operation as in Example 14 was carried out except that the methyl ester of coucurvinic acid was not added in Example 14. The results are shown in Table 6.

[실시예15]Example 15

나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 우디 플란트 미디엄 고체 배지(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25㎜, 120rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.10 Naphthalene Acetic Acid A part of the stem of Taxus baccata Linn, which was previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, was added to woody plant medium solid medium (0.25 wt% of geran gum) added to the concentration of M. It was wound, and was cultured in a cow at 25 ° C. in a cow to obtain a western juju callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml liquid woody plant medium flask containing the same concentration of the above components, and then rotated on a rotary shaker (amplitude 25 mm, 120 rpm) and transplanted every 21 days. In addition, the growth rate of the callus was accelerated.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산류로서 자스몬산의 메틸 에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물, 트랜스형 90%, 시스형 10%)를 그 최종 농도가 0.01∼1000㎛가 되도록 첨가하여 다시 7일간 배양하였다.1 g (in fresh) of the cultured cells thus obtained were transferred to a three-necked flask of 20 ml of liquid woody plant medium to which the above components were added at the same concentration, followed by shaking culture at 25 ° C for 14 days. Methyl ester of jasmonic acid as Jasmonic acid on the 14th day of culture (R in Formula (III) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is a methoxy group, n is 1 and C And C Compounds containing double bonds, trans type 90%, cis type 10%) were added to the final concentrations of 0.01 to 1000 µm and cultured for another 7 days.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of the western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth weight of the cultured cells per 1 L of the liquid medium. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol, etc., and the amount of the taxane type diterpene was measured by comparative quantification with standard Taxol, Sepharomanin, and Bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 7.

[비교예9]Comparative Example 9

실시예15에서 자스몬산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예15과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.The same operation as in Example 15 was carried out except that the methyl ester of jasmonic acid was not added in Example 15. The results are shown in Table 7.

[실시예16]Example 16

실시예15에서 자스몬산의 메틸에스테르를 배양 7일째부터 하루 건너로 계 4회 축차 첨가(1회당의 최종농도는 25㎛, 합계 100μM)한 이외에는 실시예15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.In Example 15, the methyl ester of jasmonic acid was operated in the same manner as in Example 15, except that the sequential addition of the methyl ester of jasmonic acid was carried out four times a day from the seventh day of culture (a final concentration of 25 μm and 100 μM in total). The results are shown in Table 7.

[실시예17]Example 17

실시예15에서 자스몬산의 메틸에스테르 100μM를 배양 1일째에 첨가하고, 다시 20일간 배양한 이외에는 실시예15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.In Example 15, 100 µM of methyl ester of jasmonic acid was added on the first day of culture, and then operated in the same manner as in Example 15, except that the mixture was cultured for 20 days. The results are shown in Table 7.

[실시예18]Example 18

실시예15에서 자스몬산의 메틸에스테르 100μM를 배양 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양한 이외에는 실시예15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.In Example 15, 100 µM of methyl ester of jasmonic acid was added on the 7th day of culture, and then operated in the same manner as in Example 15 except that the cells were cultured for another 14 days. The results are shown in Table 7.

[실시예19]Example 19

실시예15에서 자스몬산류로서는 자스몬산(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 수산기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물, 트랜스형 90%, 시스형 10%)를 그 최종 농도가 0.01∼1000M가 되도록 첨가한 이외에는 실시예15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표8에 나타낸다.Examples of Jasmonic acids in Example 15 include Jasmonic acid (R in Formula (III) above) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is hydroxyl, n is 1, C And C The same procedure as in Example 15 was carried out except that the compound containing the double bond, 90% trans, 10% cis) was added so as to have a final concentration of 0.01 to 1000M. The results are shown in Table 8.

[비교예10]Comparative Example 10

실시예19에서 자스몬산을 첨가하지 않은 이외에는 실시예19와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표8에 나타낸다.The same operation as in Example 19 was carried out except that jasmonic acid was not added in Example 19. The results are shown in Table 8.

[실시예20]Example 20

실시예15에서 자스몬산 메틸에스테르 100μM를 첨가하기전, 첨가후 3일째, 및 7일째의 배지중에 존재하는 탁산형 디테르펜을 분석한 결과를 제1도 및 제2도에 나타낸다. 배양 7일째에는 탁솔의 약 5할, 바카틴Ⅲ의 약 7할이 배지에 누출하고 있었다.The results of analyzing the taxane type diterpene present in the medium before adding 100 µM of the jasmonic acid methyl ester in Example 15 and on the third and seventh days of the addition are shown in FIGS. 1 and 2. On day 7 of the culture, about 50% of Taxol and about 70% of Bacatin III leaked into the medium.

[비교예11]Comparative Example 11

실시예20에서 자스몬산 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예20과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 제1도 및 제2도에 나타낸다.The same operation as in Example 20 was carried out except that jasmonic acid methyl ester was not added in Example 20. The results are shown in FIGS. 1 and 2.

[실시예21]Example 21

실시예15의 방법으로 얻어지는 생육속도를 빠르게 한 세포를 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840㎛ 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Fcoil을 사용하여 비중 1.07(g/ml)인 밀도의 매체를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심분리를 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 2층으로 분리하였다. 1.07g/ml 이하의 층에 포함되는 세포를 분획하고, 2% 자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Fcoil을 씻어내었다. 세정후 세포 1g(신선중)을 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 250μM가 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예15과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표9에 나타낸다. 특정 비중의 세포의 선별과 자스몬산 메틸 에스테르의 첨가를 조합함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.Cells having a rapid growth rate obtained by the method of Example 15 were first classified into cell aggregates having a size of 250 to 840 µm by stainless steel mesh. Next, a medium having a density of 1.07 (g / ml) was prepared using Fcoil to stack the cells, and centrifuged at 700 revolutions for 6 minutes. Cells were separated into two layers by difference in specific gravity. Cells contained in the layer of 1.07 g / ml or less were fractionated and washed with at least 3 times with 2% sucrose to wash off the Fcoil. After washing, 1 g of cells (in fresh) were transferred to a three-necked flask containing 20 ml of liquid woody plant medium, followed by shaking culture at 25 ° C. for 14 days. On day 14 of cultivation, methyl ester of jasmonic acid was added so as to have a final concentration of 250 µM, and further cultured for 7 days. After the completion of the culture, the same operation as in Example 15 was performed. The results are shown in Table 9. By combining the selection of cells with a specific specific gravity and the addition of jasmonic acid methyl ester, the productivity of the taxane-type diterpenes can be greatly improved.

[비교예12]Comparative Example 12

실시예21에서 자스몬산 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예21과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표9에 나타낸다.The same operation as in Example 21 was carried out except that jasmonic acid methyl ester was not added in Example 21. The results are shown in Table 9.

[실시예22]Example 22

실시예15와 마찬가지 방법에 의해 얻어지는 태평양 주목의 배양세포(배양 14일째)에 자스몬산 메틸에스테르 250μM를 첨가하여 7일간 배양하였다. 배양 종료후에는 실시예15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표10에 나타낸다.To the cultured cells of the Pacific yeast obtained by the same method as in Example 15 (day 14 of culture), 250 µM of jasmonic acid methyl ester was added and cultured for 7 days. After the completion of the culture, the same operation as in Example 15 was performed. The results are shown in Table 10.

[비교예13]Comparative Example 13

실시예22에서 자스몬산 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예22와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표10에 나타낸다.The same operation as in Example 22 was carried out except that jasmonic acid methyl ester was not added in Example 22. The results are shown in Table 10.

[실시예23]Example 23

실시예22에서 T. media의 배양세포를 사용한 이외에는 실시예22와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표10에 나타낸다.The same operation as in Example 22 was carried out except that the culture cells of T. media were used in Example 22. The results are shown in Table 10.

[비교예14]Comparative Example 14

실시예23에서 자스몬산 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예23과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표10에 나타낸다.The same operation as in Example 23 was carried out except that jasmonic acid methyl ester was not added in Example 23. The results are shown in Table 10.

[실시예24]Example 24

나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25㎜, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.10 Naphthalene Acetic Acid A portion of the stem of Taxus baccata Linn, previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, was added to the solid woody plant medium (0.25 wt% of geran gum) added to the concentration of M. Then, the mixture was cultured in a cow at 25 ° C. in the dark to obtain Western juca callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml flask of liquid woody plant medium to which the same concentration was added, followed by swivel culture (amplitude 25 mm, 100 rpm) on a rotary shaker and transplanted every 21 days. In addition, the growth rate of the callus was accelerated.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮긴후, 중금속을 함유한 화합물로서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가하였다. 그리고 25℃에서 21일간 선회배양하였다.1 g (in fresh) of the cultured cells thus obtained were transferred to a 20 ml flask of medium liquid woody plant in which the above components were added at the same concentration, and then [Ag (SO)] The final concentration is 10 It added so that it might become M-1M. And was incubated for 21 days at 25 ℃.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of Western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth rate. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol, etc., and the amount of the taxane type diterpene was measured by comparative quantification with standard Taxol, Sepharomanin, and Bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 11.

[실시예25]Example 25

실시예24에서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 표시한다.In Example 24 [Ag (SO)] The final concentration is 10 M was added on the 7th day of the start of the culture, and cultured again for 14 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 24. The results are shown in Table 11.

[실시예26]Example 26

실시예24에서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 14일째에 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.In Example 24 [Ag (SO)] The final concentration is 10 M was added at the beginning of culture to 14 days, and cultured again for 7 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 24. The results are shown in Table 11.

[실시예27]Example 27

실시예24에서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.In Example 24 [Ag (SO)] The final concentration is 10 M was added at the beginning of culture to 18 days, and cultured again for 3 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 24. The results are shown in Table 11.

[실시예28]Example 28

실시예24에서 [Ag(SO)] 를 배양개시(0일째)로부터 4일간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)하는 것 이외에는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.In Example 24 [Ag (SO)] 5 consecutive sequential additions at intervals of 4 days from the initiation of culture (day 0). M, total 10 Except for M), it operated like Example 24. The results are shown in Table 11.

[실시예29]Example 29

실시예24에서 배양 14일째에 자스몬산류로서는 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11 나타낸다.In Example 24, on the 14th day of culture, methyl ester of jasmonic acid (R in the above formula (III)) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is a methoxy group, n is 1 and C And C Compound containing a double bond between) and its final concentration is 10 It operated in the same manner as in Example 24 except that the additive was added so as to be M. The results are shown in Table 11.

[실시예30]Example 30

실시예24에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급한 것 이외에는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.In Example 24, the flask was placed in a container having a gas supply port and an outlet (capacity 3000 ml) and sealed, and then the mixing ratio was adjusted so that the oxygen concentration supplied to the culture cells using air and nitrogen was 10%, and then every minute Operation was carried out in the same manner as in Example 24, except that this gas was supplied from the supply port at a rate of 25 ml. The results are shown in Table 11.

[실시예31]Example 31

실시예30에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예30과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.In Example 30, the methyl ester of jasmonic acid was added at the 14th day of culture to obtain a final concentration of 10 It operated in the same manner as in Example 30 except that the additive was added so as to be M. The results are shown in Table 11.

[실시예32]Example 32

실시예24에서 [Ag(SO)] 대신에 질산온(AgNO) 10 M을 배양개시시(0일째)에 첨가한 것 이외에는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.In Example 24 [Ag (SO)] Instead, nitric acid (AgNO) 10 The same operation as in Example 24 was carried out except that M was added at the start of culture (day 0). The results are shown in Table 11.

[실시예33]Example 33

실시예32에서 질산온 10 M을 배양개시 14일째에 첨가한 것 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.Nitrate Temperature 10 in Example 32 The same operation as in Example 32 was carried out except that M was added on the 14th day of incubation. The results are shown in Table 11.

[비교예15]Comparative Example 15

실시예24에서 [Ag(SO)] 를 첨가하지 않은 이외에는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표11에 나타낸다.In Example 24 [Ag (SO)] The operation was carried out in the same manner as in Example 24 except that no addition was made. The results are shown in Table 11.

[실시예34]Example 34

실시예24에서 중금속을 함유한 화합물로서 [Ag(SO)] 대신에 염화코발트(CoCl)를 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.Example 24 [Ag (SO)] as a compound containing a heavy metal Instead, cobalt chloride (CoCl) is added to a final concentration of 10 It operated in the same manner as in Example 24 except that the additive was added so as to be M to 1M. The results are shown in Table 12.

[실시예35]Example 35

실시예34에서 [Ag(SO)] 대신에 염화코발트를 그 최종온도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.In Example 34 [Ag (SO)] Instead, cobalt chloride has a final temperature of 10 M was added on the 7th day of the start of the culture, and cultured again for 14 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 34. The results are shown in Table 12.

[실시예36]Example 36

실시예34에서 염화코발트를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 14일째에 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.In Example 34, cobalt chloride was used at a final concentration of 10. M was added at the beginning of culture to 14 days, and cultured again for 7 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 34. The results are shown in Table 12.

[실시예37]Example 37

실시예34에서 염화코발트를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.In Example 34, cobalt chloride was used at a final concentration of 10. M was added at the beginning of culture to 18 days, and cultured again for 3 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 34. The results are shown in Table 12.

[실시예38]Example 38

실시예34에서 염화코발트를 배양개시시(0일째)로부터 4일 간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)한 것 이외에는 실시예34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.In Example 34, cobalt chloride was sequentially added five times at intervals of four days from the start of culture (day 0) (the final concentration per dose was 2 × 10 M, total 10 The same operation as in Example 34 was carried out except for M. The results are shown in Table 12.

[실시예39]Example 39

실시예34에서 배양 14일째에 자스몬산류로서 자스몬산의 메틸 에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 이 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.Methyl ester of jasmonic acid as Jasmonic acid on day 14 of culture in Example 34 (R in Formula (III) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is a methoxy group, n is 1 and C And C Compound containing a double bond between) and its final concentration is 10 It operated in the same manner as in Example 34 except that the additive was added so as to be M. The results are shown in Table 12.

[실시예40]Example 40

실시예34에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급하는 것 이외에는 실시예34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.In Example 34, the flask was placed in a container having a gas supply port and an outlet port (3000 ml of internal capacity), and then sealed. Then, the mixing ratio was adjusted so that the oxygen concentration supplied to the cultured cells using air and nitrogen was 10%. Operation was carried out in the same manner as in Example 34 except that this gas was supplied from the supply port at a rate of 25 ml. The results are shown in Table 12.

[실시예41]Example 41

실시예40에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예40과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표12에 나타낸다.In Example 40, the methyl ester of jasmonic acid was prepared at 14 days of culture. It operated in the same manner as in Example 40 except that the additive was added as M. The results are shown in Table 12.

[실시예42]Example 42

나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25㎜, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.10 Naphthalene Acetic Acid A portion of the stem of Taxus baccata Linn, previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, was added to the solid woody plant medium (0.25 wt% of geran gum) added to the concentration of M. Then, the mixture was cultured in a cow at 25 ° C. in the dark to obtain Western juca callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml flask of liquid woody plant medium to which the same concentration was added, followed by swivel culture (amplitude 25 mm, 100 rpm) on a rotary shaker and transplanted every 21 days. In addition, the growth rate of the callus was accelerated.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮긴후 아민류로서 스페르미딘을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가하였다. 그리고 25℃에서 21일간 선회 배양하였다.1 g of the cultured cells (in fresh) thus obtained were transferred to a 20 ml liquid woody plant medium flask in which the above components were added at the same concentration. It added so that it might become M-1M. And it was orbital culture for 21 days at 25 ℃.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표13에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of Western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth rate. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol, etc., and the amount of the taxane type diterpene was measured by comparative quantification with standard Taxol, Sepharomanin, and Bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 13.

[실시예43]Example 43

실시예42에서 스페르미딘을 그 최종 농도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13에 표시한다.In Example 42 spermidine has a final concentration of 10 M was added on the 7th day of the start of the culture, and cultured again for 14 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 42. The results are shown in Table 13.

[실시예44]Example 44

실시예42에서 스페르미딘을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 14일째에 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13에 나타낸다.Example 42 spermidine to its final concentration of 10 M was added at the beginning of culture to 14 days, and cultured again for 7 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 42. The results are shown in Table 13.

[실시예5]Example 5

실시예42에서 스페르미딘을 그 최종 농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13에 나타낸다.In Example 42 spermidine has a final concentration of 10 M was added at the beginning of culture to 18 days, and cultured again for 3 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 42. The results are shown in Table 13.

[실시예46]Example 46

실시예42에서 스페르미딘을 배양개시시(0일째)로부터 4일간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)한 것 이외에는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13에 나타낸다.In Example 42, sfermidine was added five times in succession every four days from the start of culture (day 0) (the final concentration per serving was 2 × 10). M, total 10 Except for M), it operated like Example 42. The results are shown in Table 13.

[실시예47]Example 47

실시예42에서 배양 14일째에 자스몬산류로서 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 이 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13에 나타낸다.Methyl ester of jasmonic acid as Jasmonic acid on the 14th day of culture in Example 42 (R in Formula (III) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is a methoxy group, n is 1 and C And C Compound containing a double bond between) and its final concentration is 10 It operated in the same manner as in Example 42 except that the additive was added so as to be M. The results are shown in Table 13.

[실시예48]Example 48

실시예42에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급한 것 이외에는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13에 나타낸다.In Example 42, the flask was sealed in a container having a gas supply port and an outlet port (inner capacity 3000 ml), and then the mixing ratio was adjusted so that the oxygen concentration to be supplied to the cultured cells using air and nitrogen was 10%, and again every minute. Operation was carried out in the same manner as in Example 42, except that this gas was supplied from the supply port at a rate of 25 ml. The results are shown in Table 13.

[실시예49]Example 49

실시예48에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예48과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13에 나타낸다.In Example 48, on the 14th day of culture, the methyl ester of jasmonic acid was added to a final concentration of 10 It operated in the same manner as in Example 48 except that the additive was added so as to be M. The results are shown in Table 13.

[비교예16]Comparative Example 16

실시예42에서 스페르미딘을 첨가하지 않은 것 이외는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표13-15에 나타낸다.The same operation as in Example 42 was carried out except that spermidine was not added in Example 42. The results are shown in Table 13-15.

[실시예50]Example 50

실시예42에서 스페르미딘 대신에 스페르민을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표14에 나타낸다.In Example 42 spermine instead of spermidine was replaced with a final concentration of 10 It operated in the same manner as in Example 42 except that the additive was added to be M to 1M. The results are shown in Table 14.

[실시예51]Example 51

실시예42에서 스페르미딘 대신에 프토레신을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표15에 나타낸다.In Example 42, instead of spermidine, ptorresin was used at a final concentration of 10 It operated in the same manner as in Example 42 except that the additive was added to be M to 1M. The results are shown in Table 15.

[실시예52]Example 52

나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25㎜, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.10 Naphthalene Acetic Acid A portion of the stem of Taxus baccata Linn, previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, was added to the solid woody plant medium (0.25 wt% of geran gum) added to the concentration of M. Then, the mixture was cultured in a cow at 25 ° C. in the dark to obtain Western juca callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml flask of liquid woody plant medium to which the same concentration was added, followed by swivel culture (amplitude 25 mm, 100 rpm) on a rotary shaker and transplanted every 21 days. In addition, the growth rate of the callus was accelerated.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮기고, 25℃에서 14일간 선회 배양하였다. 그리고 배양개시 14일째에 항에틸렌제 아세틸 살리실산(HOOCCHOCOCH)을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 후, 다시 7일간 배양하였다.1 g (in fresh) of the cultured cells thus obtained were transferred to a 20 ml flask containing 20 ml of liquid woody plant medium to which the above components were added at the same concentration, and the cells were swiveled at 25 ° C for 14 days. On the 14th day of incubation, the anti-ethylene acetyl salicylic acid (HOOCCHOCOCH) was added to a final concentration of 10 After adding to M-1M, it incubated again for 7 days.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of Western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth rate. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol, etc., and the amount of the taxane type diterpene was measured by comparative quantification with standard Taxol, Sepharomanin, and Bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 16.

[실시예53]Example 53

실시예52에서 아세틸살리실산을 그 최종 농도가 10 M이 되도록 배양개시시(0일째)에 첨가하고, 21일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 표시한다.In Example 52, acetylsalicylic acid had a final concentration of 10 It was added at the beginning of culture (day 0) so as to be M, and cultured for 21 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 52. The results are shown in Table 16.

[실시예54]Example 54

실시예52에서 아세틸살리실산을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.In Example 52, acetylsalicylic acid was added at a final concentration of 10. M was added on the 7th day of the start of the culture, and cultured again for 14 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 52. The results are shown in Table 16.

[실시예55]Example 55

실시예52에서 아세틸살리실산을 그 최종 농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.In Example 52, acetylsalicylic acid had a final concentration of 10 M was added at the beginning of culture to 18 days, and cultured again for 3 days. After the completion of the culture, it was operated in the same manner as in Example 52. The results are shown in Table 16.

[실시예56]Example 56

실시예52에서 아세틸살리실산을 배양개시 7일째부터 2일 간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)한 것 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.In Example 52, 5 consecutive sequential additions of acetylsalicylic acid were carried out at intervals of 2 days from the 7th day of initiation (the final concentration of 2x10 was M, total 10 Except for M), it operated like Example 52. The results are shown in Table 16.

[실시예57]Example 57

실시예52에서 배양 14일째에 자스몬산류로서 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 이 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.Methyl ester of jasmonic acid as Jasmonic acid on the 14th day of culture in Example 52 (R in formula (III) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is a methoxy group, n is 1 and C And C Compound containing a double bond between) and its final concentration is 10 The same operation as in Example 52 was carried out except that the additive was M. The results are shown in Table 16.

[실시예58]Example 58

실시예52에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급한 것 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.In Example 52, the flask was placed in a container having a gas supply port and an outlet (3000 ml of internal capacity) and sealed, and then the mixing ratio was adjusted so that the oxygen concentration supplied to the cultured cells using air and nitrogen was 10%, followed by a minute It operated in the same manner as in Example 52 except that this gas was supplied from the supply port at a rate of 25 ml. The results are shown in Table 16.

[실시예59]Example 59

실시예58에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예58과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.In Example 58, the methyl ester of jasmonic acid was added at the 14th day of culture to obtain a final concentration of 10 It operated in the same manner as in Example 58 except that the additive was added so as to be M. The results are shown in Table 16.

[비교예17]Comparative Example 17

실시예52에서 아세틸살리실산을 첨가하지 않은 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.The operation was performed in the same manner as in Example 52 except that acetylsalicylic acid was not added in Example 52. The results are shown in Table 16.

[참고예1]Reference Example 1

실시예52에서 아세틸살리실산 대신에 에틸렌 발생제로서 에트렐(Ethrel)(CHOClP) 10 M을 배양개시시(0일째)에 첨가한 것 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표16에 나타낸다.Ethrel (CHOClP) 10 as the ethylene generator instead of acetylsalicylic acid in Example 52. The same operation as in Example 52 was carried out except that M was added at the start of culture (day 0). The results are shown in Table 16.

[참고예2]Reference Example 2

실시예52에서 아세틸살리실산 대신에 에트렐 10 M을 배양개시 14일째에 첨가한 것 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표17에 나타낸다.Etrel 10 instead of acetylsalicylic acid in Example 52 The same operation as in Example 52 was carried out except that M was added on the 14th day of the start of the culture. The results are shown in Table 17.

[실시예60]Example 60

실시예52에서 항에틸렌제로서 아미노옥시초산·염산염[(HNOCHCOOH)·HCl]을, 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표17에 나타낸다.In Example 52, aminooxyacetic acid hydrochloride [(HNOCHCOOH) .HCl] was used as an anti-ethylene agent, and its final concentration was 10. It operated in the same manner as in Example 52 except that the additive was added so as to be M to 1M. The results are shown in Table 17.

[실시예61]Example 61

실시예52에서 항에틸렌제로서 몰식자산 프로필[(HO)CHCOOCHCHCH]을 그 최종 농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표18에 나타낸다.In Example 52, as an anti-ethylene agent, a phosphate propyl [(HO) CHCOOCHCHCH] was prepared with a final concentration of 10 It operated in the same manner as in Example 52 except that the additive was added so as to be M to 1M. The results are shown in Table 18.

[실시예62]Example 62

나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25㎜, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.10 Naphthalene Acetic Acid A portion of the stem of Taxus baccata Linn, previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, was added to the solid woody plant medium (0.25 wt% of geran gum) added to the concentration of M. Then, the mixture was cultured in a cow at 25 ° C. in the dark to obtain Western juca callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml flask of liquid woody plant medium to which the same concentration was added, followed by swivel culture (amplitude 25 mm, 100 rpm) on a rotary shaker and transplanted every 21 days. In addition, the growth rate of the callus was accelerated.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 이식한 후, 이 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용기 3000ml)내에 넣어 밀폐하였다. 그리고 공기와 질소를 사용하여 그 배양포에 공급하는 산소농도가 4∼15%가 되도록 혼합비를 조절한 후, 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급하면서 25℃에서 21일간 선회 배양하였다.1 g (in fresh) of the cultured cells thus obtained were transplanted into a three-necked flask containing 20 ml of liquid woody plant medium added with the same concentration, and then the flask was a container having a gas supply port and an outlet (inner container 3000 ml). It was sealed inside. And after adjusting the mixing ratio so that the oxygen concentration supplied to the culture cloth by using air and nitrogen was 4-15%, it was incubated at 25 ° C for 21 days while supplying this gas at a rate of 25 ml per minute.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표19에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of Western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth rate. Taxane type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol, etc., and the amount of the taxane type diterpene was measured by comparative quantification with standard Taxol, Sepharomanin, and Bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 19.

[비교예18]Comparative Example 18

실시예62에서 세포에 공급하는 산소농도가 20%가 되도록 조절한 혼합기체를 공급한 것 이외에는 실시예62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표19에 나타낸다.The operation was carried out in the same manner as in Example 62 except that the mixed gas was adjusted so that the oxygen concentration supplied to the cells in Example 62 was 20%. The results are shown in Table 19.

[참고예3]Reference Example 3

실시예62에서 배양세포를 이식한 플라스크를 대기중에서 배양하는 것 이외에는 실시예62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표19에 나타낸다.A flask in which the cultured cells were transplanted in Example 62 was operated in the same manner as in Example 62 except that the flask was cultured in the air. The results are shown in Table 19.

[실시예63]Example 63

실시예62에서 세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 조절한 혼합기체를 배양개시시로부터 3일간 공급한 후, 배양종료시까지(18일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표19에 나타낸다.The mixed gas adjusted to the oxygen concentration supplied to the cell in Example 62 to 10% was supplied for 3 days from the start of the culture, and then operated in the same manner as in Example 62 except that the air was supplied until the end of the culture (18 days). . The results are shown in Table 19.

[실시예64]Example 64

실시예62에서 세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 조절한 혼합기체를 배양개시시로부터 7일간 공급한 후, 배양종료시까지(14일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표19에 나타낸다.In the same manner as in Example 62 except that the mixed gas adjusted to the oxygen concentration supplied to the cells in Example 62 was set to 10% for 7 days from the start of the culture, and then air was supplied until the end of the culture (14 days). . The results are shown in Table 19.

[실시예65]Example 65

실시예62에서 세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 조절한 혼합기체를 배양개시시로부터 14일간 공급한 후, 배양종료시까지(7일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표19에 나타낸다.The mixed gas adjusted to the oxygen concentration supplied to the cells in Example 62 to 10% was supplied for 14 days from the start of the culture, and then operated in the same manner as in Example 62 except that the air was supplied until the end of the culture (7 days). . The results are shown in Table 19.

[실시예66]Example 66

실시예62에서 배양14일째에 자스몬산류로서 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 이 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물, 트랜스형 90%, 시스형 10%)를 그 최종 농도가 10∼1000μM이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표20에 나타낸다. 저농도 산소공급처리와 자스몬산의 메틸에스테르의 첨가를 조합시킴으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.Methyl ester of jasmonic acid as Jasmonic acid on day 14 of culture in Example 62 (R in formula (III) , R , R , R , R , R , R , R , R , R And R Is a hydrogen atom, R Is a methoxy group, n is 1 and C And C The same procedure as in Example 62 was carried out except that the compound containing the double bond, 90% trans, and 10% cis) was added so as to have a final concentration of 10 to 1000 µM. The results are shown in Table 20. By combining the low concentration oxygen supply treatment with the addition of methyl ester of jasmonic acid, the productivity of the taxane-type diterpenes can be greatly improved.

[실시예67]Example 67

실시예62에서 얻어지는 생육이 빨라진 배양세포 85g(신선중)을 용존 산소농도계 및 용존 산소농도 제어장치를 갖춘 통기교반배양조(내용량 3000ml)에 액체 우디 플랜트 미디엄 1700ml를 넣은 후, 이식하였다. 그리고 공기와 질소를 사용하여 이 배지중의 용존산소 농도가 0.1ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 25℃에서 21일간 통기 교반배양을 행하였다. 배양장치의 개략도를 제3도에 나타냄과 동시에 결과를 표21에 나타낸다.85 g of the fast-growing cultured cells obtained in Example 62 (fresh) were placed in an aeration agitating culture vessel (3000 ml) equipped with a dissolved oxygen concentration meter and a dissolved oxygen concentration controller, and then transplanted after 1700 ml of liquid woody plant medium. Aeration and agitation were performed at 25 ° C. for 21 days while adjusting the mixing ratio so that the dissolved oxygen concentration in the medium was 0.1 ppm or less using air and nitrogen. A schematic diagram of the incubator is shown in FIG. 3 and the results are shown in Table 21.

[실시예68]Example 68

실시예67에서 용존 산소농도가 1ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.In Example 67, the same operation as in Example 67 was carried out except that the mixing ratio was adjusted so that the dissolved oxygen concentration was 1 ppm or less. The results are shown in Table 21.

[실시예69]Example 69

실시예67에서 용존 산소농도가 2ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.In Example 67, the same operation as in Example 67 was carried out except that the mixing ratio was adjusted so that the dissolved oxygen concentration was 2 ppm or less. The results are shown in Table 21.

[실시예70]Example 70

실시예67에서 용존 산소농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.In the same manner as in Example 67 except that the mixing ratio was adjusted so that the dissolved oxygen concentration was 4 ppm or less in Example 67. The results are shown in Table 21.

[실시예71]Example 71

실시예67에서 용존 산소농도가 6ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.In Example 67, the same operation as in Example 67 was carried out except that the mixing ratio was adjusted so that the dissolved oxygen concentration was 6 ppm or less. The results are shown in Table 21.

[비교예19]Comparative Example 19

실시예67에서 공기를 통기한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.The same operation as in Example 67 was carried out except that the air was vented in Example 67. The results are shown in Table 21.

[실시예72]Example 72

실시예67에서 배양개시시로부터 3일간 배지의 용존산소 농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 배양한 후, 배양종료시까지의 사이에(18일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.In Example 67, the same procedure as in Example 67 was carried out except that the culture was adjusted with a mixing ratio such that the dissolved oxygen concentration of the medium was 4 ppm or less for 3 days from the start of the culture, and then the air was supplied (18 days) until the end of the culture. It was. The results are shown in Table 21.

[실시예73]Example 73

실시예67에서 배양개시시로부터 7일간 배지의 용존산소 농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 배양한 후, 배양종료시까지(14일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.In Example 67, the culture was carried out by adjusting the mixing ratio so that the dissolved oxygen concentration of the medium was 4 ppm or less for 7 days from the start of the culture, and then operated in the same manner as in Example 67 except that air was supplied until the end of the culture (14 days). The results are shown in Table 21.

[실시예74]Example 74

실시예67에서 배양개시시로부터 14일간 배지의 용존산소 농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 배양한 후, 배양종료시까지(7일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표21에 나타낸다.In Example 67, the culture was carried out by adjusting the mixing ratio so that the dissolved oxygen concentration of the medium was 4 ppm or less for 14 days from the start of the culture, and then operated in the same manner as in Example 67 except that air was supplied until the end of the culture (7 days). The results are shown in Table 21.

[실시예75]Example 75

나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25㎜, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.10 Naphthalene Acetic Acid A portion of the stem of Taxus baccata Linn, previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, was added to the solid woody plant medium (0.25 wt% of geran gum) added to the concentration of M. Then, the mixture was cultured in a cow at 25 ° C. in the dark to obtain Western juca callus. Next, 1 g of this callus (in fresh) was transferred to a 20 ml flask of liquid woody plant medium to which the same concentration was added, followed by swivel culture (amplitude 25 mm, 100 rpm) on a rotary shaker and transplanted every 21 days. In addition, the growth rate of the callus was accelerated.

이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선중)을 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840㎛ 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Ficoll을 사용하여 비중 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11(g/ml)의 밀도구배를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심 분리를 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 각층으로 분리하였다. 각각의 층에 분리한 세포를 혼합하지 않도록 분획하고, 2% 자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Ficoll을 씻어내었다. 세정후 세포 0.1g(신선중)을 액체 우디 플랜드 미디엄 0.8ml들이의 내경 18mm웰에 옮겨서 25℃에서 21일간 진탕 배양하였다. 21일간 배양후 세포전량을 상기 액체 배지 3ml들이의 내경 36mm웰에 옮겨서 25℃에서 다시 28일간 진탕배양하였다.1 g (in fresh) of the cultured cells thus obtained were first classified into cell aggregates having a size of 250 to 840 µm using a stainless steel mesh. Next, density gradients of specific gravity 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, and 1.11 (g / ml) were prepared using Ficoll to stack the cells, and centrifuged at 700 revolutions for 6 minutes. Cells were separated into each layer by the difference in specific gravity. The separated cells in each layer were fractionated so as not to mix, and the Ficoll was washed by washing at least three times with 2% sucrose. After washing, 0.1 g (fresh) of cells were transferred to 18 mm wells of 0.8 ml of liquid woody plant medium and shaken at 25 ° C. for 21 days. After 21 days of incubation, the whole cell was transferred to 36 mm wells of 3 ml of the liquid medium and shaken for another 28 days at 25 ° C.

배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 함량을 측정하였다. 그 결과를 표22, 제4도 및 제5도에 나타낸다.After the end of the culture, the main cells of the western cultures were collected by filtration and freeze-dried, and the dry weight thereof was measured to determine the growth weight of the cultured cells per 1 L of the liquid medium. Taxane type diterpene content was measured by extracting taxane type diterpene from the obtained dry callus using methanol, etc., and comparing with standard taxol, cepharomanin, and bacatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Tables 22, 4 and 5.

[비교예20]Comparative Example 20

실시예75에서 스테인리스 메쉬에 의해 세포집괴를 분별후, 밀도구배에 의한 분획을 하지 않은 이외에는 실시예75와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표22, 제4도 및 제6도에 나타낸다.In Example 75, the cell mass was fractionated by a stainless steel mesh, and the same operation as in Example 75 was carried out except that fractionation by density gradient was not performed. The results are shown in Tables 22, 4 and 6.

[실시예76]Example 76

실시예75에서 친식물은 같으나 칼루스화 유도시기가 다른 배양세포를 사용한 이외에는 실시예75와 마찬가지로 조작하였다. 단 비중 1.07 이상의 층에 포함된 세포는 하나로 합친 후 배양하였다. 그 결과를 표22에 나타낸다.In Example 75, the same procedure was followed as in Example 75 except for using cultured cells having the same parentage but different callus induction period. However, cells contained in the layer having a specific gravity of 1.07 or more were combined and cultured. The results are shown in Table 22.

[비교예21]Comparative Example 21

실시예76에서 스테인리스 메쉬에 의해 세포집괴를 분별후 밀도구배에 의한 분획을 하지 않은 이외는 실시예76과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표22에 나타낸다.In Example 76, the same procedure was followed as in Example 76 except that the cell aggregates were not fractionated by the density gradient after fractionation using a stainless steel mesh. The results are shown in Table 22.

[참고예4]Reference Example 4

실시예75에서 비중범위 1.03 이하의 층으로 분획후 배양한 세포(표22) 약 0.2g(신선중ㅊ)을 액체 우디 플랜트 미디엄 3ml들이의 내경 36mm웰에 옮기고 25℃에서 다시 28일간 진탕 배양하였다. 배양종료후 세포를 비중 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11(g/ml)의 밀도구배에 의해 재차 분획하였다. 밀도구배 분획직후에 세포를 회수하여 분획된 세포의 존재비, 탁산형 티테르펜 함량을 정량하였다. 그 결과를 표23, 제6도 및 제7도에 나타낸다.In Example 75, about 0.2 g (fresh) of cells cultured after dividing into layers having a specific gravity of 1.03 or less (Table 22) were transferred to a 36 mm inner diameter of 3 ml of liquid woody plant medium and shaken for another 28 days at 25 ° C. . After incubation, the cells were fractionated again by density gradients of specific gravity 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11 (g / ml). The cells were recovered immediately after the density gradient fractions to quantify the abundance and the taxane-type terterpene content of the fractionated cells. The results are shown in Tables 23, 6 and 7.

[실시예77]Example 77

실시예1에서 사용한 것과 같은 배양세포 1g(신선중)을 퍼옥소 2황산 칼륨을 10 M∼10 M 함유한 액체배지 20ml들이의 3각 플라스크에 옮기고 25℃에서 21일간 진탕하여 1단째의 배양을 하였다.1 g (in fresh) of the cultured cells as used in Example 1 was added 10 times peroxo potassium bisulfate. M-10 20 ml of M-containing liquid medium was transferred to a three-necked flask, and shaken at 25 ° C. for 21 days to incubate at the first stage.

배양종료후, 배양세포를 여과에 의해 채취하여 일부를 2단째 배양의 종세포로써 사용하고, 나머지 세포는 배양세포의 생육 중량 및 세포중의 탁산함량의 측정에 제공하였다. 즉 채취한 배양세포의 1g(신선중)을 나프탈렌초산을 10M의 농도가 되도록 첨가하나 액체 우디 플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮기고, 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산 메틸을 배지중의 농도가 100μM이 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 한편, 1단째 배양에서 얻어진 세포중의 남은 배양세포를 동결 건조한 후, 그 건조중량을 측정하여 액체 배지 1L당의 배양세포의 생육중량을 구하였다. 얻어진 건조세포의 탁솔함량을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다. 2단째 배양에 대해서도 1단째 배양과 마찬가지로 하여 세포수량 및 탁솔수량을 측정하였다.After the end of the culture, the cultured cells were collected by filtration and partly used as the seed cells of the second stage culture, and the remaining cells were used for the growth weight of the cultured cells and the measurement of the taxane content in the cells. That is, 1 g (fresh) of the collected culture cells were added to a concentration of 10 M of naphthalene acetate, but transferred to a three-necked flask containing 20 ml of liquid woody plant medium, followed by shaking culture at 25 ° C. for 14 days. On day 14 of cultivation, methyl jasmonate was added so that the concentration in the medium was 100 μM, and cultured again for 7 days. On the other hand, after freeze-drying the remaining cultured cells in the cells obtained in the first stage culture, the dry weight was measured to determine the growth weight of the cultured cells per liter of liquid medium. The Taxol content of the obtained dry cells was measured using high performance liquid chromatography. As for the second stage culture, the cell quantity and the taxol quantity were measured in the same manner as the first stage culture.

그 결과를 표24에 나타낸다.The results are shown in Table 24.

[비교예22]Comparative Example 22

실시예77에서 퍼옥소 2황산 칼륨을 사용하지 않은 이외에는 실시예77과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표24에 나타낸다.The operation was carried out in the same manner as in Example 77, except that in Example 77 potassium peroxo sulfate was not used. The results are shown in Table 24.

[실시예78]Example 78

실시예1에서 사용한 것과 같은 배양세포 100g(신선중)을 표준의 액체 우디 플랜트 미디엄 1리터(자당농도: 20g/ℓ, 질산이온농도: 14.7mM, α-나프탈렌 초산: 10 M)에 2mM의 [Ag(SO)] 를 첨가한 배지를 주입한 통기 교반 배양조(내용량 2리터; 제8도)에 이식하고, 25℃, 암소하에서 교반 속도 40rpm, 통기속도 매분 0.1리터로 공기를 통기하면서 배양을 개시하여 배양2일째로부터 14일째의 기간동안에 20g/ℓ의 자당 및 20mM의 질산나트륨을 함유한 배지를 1일당의 자당 첨가량이 2g/ℓ 또 1일당의 질산이온 첨가량이 2mmol/ℓ가 되도록 연속적으로 첨가하고, 그 영양원 용액의 첨가와 같은 속도로 영양원 첨가구와는 별도의 100메쉬의 스테인리스 필터를 부착한 배출구로부터 배양액을 연속적으로 배출시키면서(배양기내의 배지 갱신율: 10%/일) 21일간 통기 교반배양을 행하였다. 배양종료후 배양세포 및 배지를 회수하고, 상기 실시예1과 마찬가지 방법으로 탁솔 수량을 측정하였다. 그 결과를 표25에 나타낸다.100 g of the cultured cells as used in Example 1 (in fresh) were used as a standard liquid woody plant medium 1 liter (sucrose concentration: 20 g / l, nitrate ion concentration: 14.7 mM, α-naphthalene acetate: 10 2 mM to [Ag (SO)] The culture medium was added to the aeration stirred culture tank (inner volume 2 liters; Fig. 8) to which the medium was added, and the culture was started with aeration at 40 rpm and aeration rate of 0.1 liters per minute at 25 ° C. in the dark. The medium containing 20 g / l sucrose and 20 mM sodium nitrate was continuously added during the period of 14 days from the end so that the amount of sucrose added per day was 2 g / l and the amount of nitrate ion added per day was 2 mmol / l. Aeration and agitation were carried out for 21 days while continuously discharging the culture solution from the outlet equipped with a 100 mesh stainless steel filter separate from the nutrient-adding port (10% / day in the incubator). After completion of the culture, the cultured cells and the medium were recovered, and the amount of Taxol was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 25.

[비교예23]Comparative Example 23

실시예78에서 영양원의 도중첨가를 실시하지 않은 이외에는 실시예78과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표25에 나타낸다.The same operation as in Example 78 was carried out except that the nutrient source was not added midway in Example 78. The results are shown in Table 25.

[실시예79]Example 79

실시예1에서 사용한 것과 같은 배양세포 50g(신선중)과 액체 우디 플랜트 미디엄 1리터를 용적 2리터의 배양조에 옮기고, 통기속도 매분 0.1리터, 교반속도 40rpm, 25℃, 암소에서 14일간 배양한 후, 배양개시 14일째에 세포의 침강용적(PCV)을 측정한 결과, PCV는 0.2리터이었다. 14일째부터 초기 배지와 같은 조성의 배지에 3mM의 [Ag(SO)] 를 첨가한 신선배지의 공급과 세포를 포함하지 않은 배양액의 배출을 개시하였다.50 g of the cultured cells (in fresh) and 1 liter of liquid woody plant medium, which were used in Example 1, were transferred to a culture tank of 2 liters in volume, and incubated for 14 days in aeration rate of 0.1 liters, stirring speed of 40 rpm, 25 ° C, and cows for 14 days. On the 14th day of culture, the settling volume (PCV) of the cells was measured. As a result, the PCV was 0.2 liter. From day 14, 3 mM [Ag (SO)] was added to a medium of the same composition as the initial medium. The addition of fresh medium and the discharge of the culture medium containing no cells were started.

신선배지의 공급량은 1일당 그 시점의 PCV의 2/5용적으로 하고, 세포를 포함하지 않은 배양액은 배양액량을 1리터로 유지하도록 배출하였다. 배양개시 35일째에 PCV는 0.6리터에 달하고 있었다. 이후, 매일 1회 세포를 포함한 배양액을 배출하여 평균의 PCV를 0.6리터로 유지하면서 세포를 포함하지 않은 배양액을 배출함으로써 배양액량을 1리터로 유지하여 정상상태를 얻었다. 배양개시후 90일까지 배양을 계속하였다. 60일간의 정상상태에서 공급한 신선배지의 양은 15리터, 배양조로부터 꺼낸 배지량은 14리터, 얻어진 세포의 양은 0.15㎏(건조중량)이며, 비증식속도 μ는 0.08(day ), 평균의 배지비 갱신율은 2.88이었다. 정상상태에서 배양조로부터 꺼내어진 세포 및 배지를 분석한 결과, 탁솔 525㎎이 생산되었음을 알았다. 이는 8.8㎎/리터/일의 생산량에 상당한다.Fresh medium was supplied at a volume of 2/5 of the PCV at that time per day, and the culture medium containing no cells was discharged to maintain the culture medium at 1 liter. At 35 days of incubation, PCV reached 0.6 liters. Thereafter, the culture medium containing the cells was discharged once daily and the culture medium was maintained at 1 liter by discharging the culture medium containing no cells while maintaining the average PCV at 0.6 liter to obtain a steady state. The culture was continued until 90 days after the start of the culture. The amount of fresh medium supplied under normal conditions for 60 days was 15 liters, the amount of medium taken out of the culture tank was 14 liters, the amount of cells obtained was 0.15 kg (dry weight), and the specific growth rate μ was 0.08 (day ), The average medium ratio renewal rate was 2.88. Analysis of the cells and the medium taken out of the culture tank in the steady state revealed that 525 mg of Taxol was produced. This corresponds to a yield of 8.8 mg / liter / day.

세포중 및 배지중에 함유된 탁솔의 양은 실시예1과 마찬가지 방법으로 정량하였다.The amount of Taxol contained in the cells and in the medium was quantified in the same manner as in Example 1.

[실시예80]Example 80

실시예1에서 사용한 것과 같은 배양세포 50g(신선중)과 액체 우디 플랜트 미디엄 1리터를 용적 2리터의 배양조에 옮기고, 탄산가스 2%를 가한 공기를 매분 0.1리터로 통기하여, 교반속도 40rpm, 25℃, 암소에서 14일간 배양하였다. 배양종료후에 세포 및 배지를 회수하여 건조세포 15.2g을 얻었다. 세포 및 배지중에 함유된 탁솔의 양을 실시예1과 마찬가지 방법으로 정량한 결과, 탁솔 31㎎이 생산되었음을 알았다.50 g of the cultured cells (in fresh) and 1 liter of liquid woody plant medium, which were used in Example 1, were transferred to a culture volume of 2 liters in volume, and air with 2% carbon dioxide gas was aerated at 0.1 liters per minute, and the stirring speed was 40 rpm, 25 Incubated for 14 days in the dark, ℃. After completion of the culture, the cells and the medium were recovered to obtain 15.2 g of dry cells. The amount of Taxol contained in the cells and medium was quantified in the same manner as in Example 1, and it was found that Taxol 31 mg was produced.

[비교예24]Comparative Example 24

실시예1에서 투베론산 메틸 대신에 자스몬을 그 최종 농도가 0.1∼1000μM이 되도록 첨가한 이외에는 실시예1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표26에 나타낸다.The same operation as in Example 1 was carried out except that jasmon was added so that the final concentration was 0.1 to 1000 µM instead of methyl tubeberate in Example 1. The results are shown in Table 26.

[비교예25]Comparative Example 25

비교예24에서 자스몬을 첨가하지 않은 이외에는 비교예24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표26에 나타낸다.The same operation as in Comparative Example 24 was performed except that Jasmon was not added in Comparative Example 24. The results are shown in Table 26.

[산업상의 이용분야][Industrial use]

본 발명에 의하면 난소암, 유압, 폐암 등의 치료약으로서 유용한 탁솔을 함유한 탁산형 디테르펜을 공업적으로 생산하는 것이 가능해진다.INDUSTRIAL APPLICATION According to this invention, it becomes possible to industrially produce the taxane type diterpene containing taxol useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, oil pressure, lung cancer, etc.

Claims (12)

탁산형 디테르펜을 생성하는 주목(Taxus)속 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양을 행하든가, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 배양 초기로부터 제어하여 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.In culturing tissues or cells of a plant of Taxus genus that produces a taxane-type diterpene, culturing is performed by controlling the oxygen concentration in the gas phase in the incubator from the beginning of the cultivation under a condition below the oxygen concentration in the atmosphere, or The taxane type characterized in that the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue or cell is controlled and cultured from the beginning of the cultivation under conditions of less than the saturated dissolved oxygen concentration at the temperature, and the taxane type diterpene is recovered from the obtained culture. Method for preparing diterpene. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 4∼15%로 제어하든가, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소 농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도치의 1∼75%로 제어하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.The method according to claim 1, wherein in culturing the tissue or cells of the plant of the genus that produces the taxane-type diterpene, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled to 4 to 15%, or a fluid medium in contact with the tissue or cells. A method for producing a taxane diterpene, wherein the dissolved oxygen concentration in the mixture is controlled to be 1 to 75% of the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 6∼12%로 제어하든가, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도치의 10∼75%로 제어하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.The method according to claim 1, wherein in culturing the tissue or cells of the genus plants that produce the taxane-type diterpene, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled to 6 to 12%, or a fluid medium in contact with the tissue or cells. A method for producing a taxane diterpene, wherein the dissolved oxygen concentration in the mixture is controlled to 10 to 75% of the saturated dissolved oxygen concentration value at that temperature. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도 또는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 배양기 및/또는 배지에 공급하는 기체의 산소농도를 조절함으로써 제어하든가 또는 배양기 및/또는 배지에 공급하는 기체의 공급속도를 조절함으로써 제어하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.The method according to claim 1, wherein in culturing the tissue or cells of the plant of the genus that produces the taxane-type diterpene, the oxygen concentration in the gas phase or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in the incubator is supplied to the incubator and / or the medium. A method for producing a taxane diterpene characterized in that it is controlled by adjusting the oxygen concentration of the gas or by adjusting the supply rate of the gas supplied to the incubator and / or the medium. 제1항에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소농도의 제어를 배양개시시 내지 배양개시후 7일째에 개시하고, 그후 적어도 3일간 행하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.2. The method according to claim 1, wherein the control of oxygen concentration in the gas phase in the incubator or dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue or cells is initiated at the start of culture or 7 days after the start of the culture, followed by at least 3 days. A method for producing a taxane diterpene, characterized in that. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜이 탁솔, 7-에피탁솔, 바카틴 Ⅲ, 7-에피바카틴Ⅲ, 세팔로마닌, 7-에피세팔로마닌, 10-데아세틸 바카틴Ⅲ, 10-데아세틸세팔로마닌, 10-데아세틸탁솔, 탁사기핀, 크실로실세팔로마닌 및 크실로실탁솔로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나인 탁산형 디테르펜의 제조방법.The method according to claim 1, wherein the taxane-type diterpenes are Taxol, 7-Epitaxol, Bacatin III, 7-Epivacatin III, Cepharomanin, 7-Epicepalomanin, 10-Deacetyl Bacatin III, 10- A method for producing a taxane-type diterpene, which is at least one selected from the group consisting of deacetyl cepharomanin, 10-deacetyltaxol, taxapine, xyloxycephalominine and xylosiltaxol. 제1항에 있어서, 자스몬산류의 존재하에서 배양함을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.The method for producing a taxane diterpene according to claim 1, which is cultured in the presence of Jasmonic acid. 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목(Taxus)속 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 산화제 또는 수용성의 함산소유기화합물을 첨가한 배지를 사용하여 행하는 1단째 배양과, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하든가 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 배양 초기로부터 제어하여 배양하는 2단째 배양의 2개의 공정으로 된 2단 배양을 행하고, 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.In culturing tissues or cells of a Taxus genus plant that produces a taxane-type diterpene, the first stage culture is performed using a medium containing an oxidizing agent or a water-soluble oxygen-containing organic compound, and the oxygen concentration in the gas phase in the incubator. Cultured by controlling from the beginning of the culture under the condition of oxygen concentration in the atmosphere or controlling the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue or cell from the beginning of the culture under the condition of less than the saturated dissolved oxygen concentration at the temperature. A method for producing a taxane diterpene, characterized in that two-step culturing of two stages of culturing is carried out, and the taxane diterpene is recovered from the culture obtained. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 당농도가 2∼50g/ℓ 및/또는 질산이온농도가 2∼50mmol/ℓ인 배지에 조직 또는 세포를 이식한 후, 이 배지의 초기 용량에 대하여 1일당 0.2∼5g/ℓ의 당 및/또는 0.2∼5mmol/ℓ의 질산이온을 함유한 영양원 용액을 연속적 또는 간헐적으로 첨가하여 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.The method of claim 1, wherein in culturing the tissues or cells of the genus plant that produces the taxane-type diterpene, the tissues or the medium having a sugar concentration of 2 to 50 g / l and / or a nitrate ion concentration of 2 to 50 mmol / l. After transplanting the cells, the culture obtained by continuously or intermittently adding a nutrient solution containing 0.2-5 g / l sugar and / or 0.2-5 mmol / l nitrate ion per day to the initial dose of the medium A method for producing a taxane diterpene, wherein the taxane diterpene is recovered from water. 제9항에 있어서, 영양원 용액을 첨가함에 있어서, 같은 용량의 배지를 조직 또는 세포로부터 분리하여 배출함으로써 배지를 갱신하면서 배양하고, 얻어진 배양물, 배양도중에 배출함으로써 회수되는 배지 및 배양종료시에 얻어지는 배지로부터 선택된 적어도 1종 이상으로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.10. The culture according to claim 9, wherein in the addition of the nutrient solution, the same volume of medium is separated from the tissues or cells, and the culture is updated while the medium is renewed, and the obtained culture, the medium recovered by discharging during the culture, and the medium obtained at the end of culture A method for producing a taxane diterpene, the taxane diterpene being recovered from at least one selected from the group consisting of: 제1항에 있어서, 배양조중의 배양액의 총용량을 V, 신선배지의 공급속도를 V₁, 조직 또는 세포의 비증식도를 μ라 할때 무차원수 F=V₁/V/μ로 정의하는 배지의 비갱신율 0.1∼10의 범위가 되도록 연속적 또는 간헐적으로 신선배지를 첨가하고, 연속적 또는 간헐적으로 조외로 배출되는 조직 또는 세포를 포함한 배양액 및/또는 연속적 또는 간헐적으로 조외로 배출되는 조직 또는 세포를 포함하지 않는 배양액으로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.The method of claim 1, wherein the total volume of the culture medium in the culture tank is defined as V, the feed rate of fresh medium is V ₁ , and the non-proliferation of tissues or cells is defined as a dimensionless number F = V ₁ / V / μ. Fresh medium is added continuously or intermittently so that the specific renewal rate of the medium is in the range of 0.1 to 10, and the culture medium and / or the tissue or cells continuously or intermittently discharged to the outside, continuously or intermittently. A method for producing a taxane type diterpene, the method comprising recovering taxane type diterpene from a culture medium that does not include the same. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물의 조직 또는 세포를 배양조를 사용하여 배양함에 있어서, 조내에 도입하는 산소함유 가스로서 0.03∼10%의 탄산가스를 함유한 가스를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.A gas containing 0.03 to 10% of carbon dioxide gas as an oxygen-containing gas to be introduced into the tank when culturing the tissue or cells of the plant of interest, which produces the taxane-type diterpene, using a culture tank. Method for producing a taxane-type diterpene, characterized in that the culture.