JPH08149984A - Production of taxane type diterpene - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To efficiently obtain a taxane type diterpene which is useful as a medicine for treating ovarian cancer, mammalian cancer and lung cancer by culturing plant cells or tissues producing taxane type diterpene at a prescribed specific replacement rate and recovering the product from the culture mixture. CONSTITUTION: When cells or tissues of a plant (Taxus baccata) producing a taxane type diterpene such as taxol are cultured at a specific replacement rate of the culture medium, the make-up culture medium is continuously or intermittently added at 0.1-10 specific replacement rate defined as a dimensionless number F=v/V/μ where V is total volume of the culture medium in the tank, v is the feed rate of the make-up medium and μ is specific proliferation rate of cells or tissues. In the meantime, the culture mixture containing the cells or tissues are continuously or intermittently taken out of the tank and/or the culture mixture free from the cells or tissues taken out of the tank is extracted to recover the product. Thus, this taxane type diterpene useful as a remedy for ovarian cancer, mammalian cancer or lung cancer is simply obtained in a large amount.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等
の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型
ジテルペンの製造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a taxane-type diterpene containing taxol which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and the like.

【０００２】[0002]

【従来の技術】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有
用であるタキソール(Taxol) は、イチイ科イチイ属植物
であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT) よ
り単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と
関連する複雑なエステルグループを有している。タキソ
ールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在
し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。
現在、タキソールは天然の又は栽培された植物体から採
取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高さに
成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であり、
また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから、大量のタ
キソールを得ることは経済的に困難である。もし、タキ
ソール又はタキソールの前駆物質であるバッカチンIII
(baccatinIII ) 等のタキサン型ジテルペンを組織培養
を利用して生産することができれば、樹木を伐採するこ
となく、大量のタキソールを容易に得ることができるの
で有利である。2. Description of the Related Art Taxol, which is useful as a therapeutic drug for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, etc., is a taxane-type diterpene isolated and identified from Taxus brevifolia NUTT, which is a Taxus genus plant. Yes, with complex ester groups associated with activity. It has been reported that taxol is present in every part of the yew plant, and its content is highest in the bark.
Currently, taxol is collected from natural or cultivated plants, but yew plants are slow growing plants that take more than 10 years to grow to a height of 20 cm above the ground,
In addition, it is economically difficult to obtain a large amount of taxol because the tree will die when the bark is peeled off. Baccatin III, which is taxol or a precursor of taxol
If taxane-type diterpenes such as (baccatinIII) can be produced by utilizing tissue culture, a large amount of taxol can be easily obtained without cutting trees, which is advantageous.

【０００３】これまでの植物の培養細胞を利用したタキ
ソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（Taxu
s brevifolia NUTT ）培養細胞によるタキソール生産方
法が米国で特許（米国特許第5019504 号）になっている
が、そのタキソール生産量は１〜３mg/lと記載されてお
り、工業的生産には不十分である。また、これまでの細
胞培養によるタキソール生産方法の生産性は不安定であ
り、選抜で一次的に生産性の高い細胞が得られても、継
代培養してその含量を維持することは難しい[E.R.M.Wic
kremesine et al., World Congress on Cell and Tiss
ue Culture(1992)] 。[0003] For the taxol production method using the cultured cells of the plant up to now, see
s brevifolia NUTT) A taxol production method using cultured cells has been patented in the United States (US Patent No. 5019504), but the taxol production amount is described as 1 to 3 mg / l, which is insufficient for industrial production. Is. Further, the productivity of the taxol production method by cell culture so far is unstable, and it is difficult to subculture and maintain its content even if cells with high productivity are temporarily obtained by selection [ ERMWic
kremesine et al., World Congress on Cell and Tiss
ue Culture (1992)].

【０００４】また、タキソール生産方法の先行技術とし
ては、タキソール生合成前駆体であるバッカチンIII か
らの半合成法がHoltonらの米国特許第5015744 号明細書
に開示されている。植物の組織培養法を用いれば、バッ
カチンIII 等の半合成原料の生産も可能であり、前記半
合成法によるタキソール生産にも利用できる。一方、一
般的に実施されている植物細胞又は組織の培養において
は、細胞又は組織の増殖に必要な栄養源や植物ホルモン
は、培養開始時に一括して仕込まれ（回分培養法）、操
作が煩雑になる等の問題点から、栄養源の途中添加（流
加培養法）や栄養源の途中添加と培養液の抜き出しを組
み合わせた培地の更新（灌流培養）は行われることが少
ない。また、植物細胞は、高濃度の栄養源や植物ホルモ
ンに曝されると、高浸透圧によって原形質分離を起こし
たり、あるいは特定成分に対する生理的過剰障害によっ
て増殖停止及び壊死に至る。従って、回分培養法で使用
される培地成分の濃度は低くせざるを得ず、従って移植
できる細胞又は組織の密度にも上限がある。As a prior art method for producing taxol, a semisynthesis method from taxol biosynthetic precursor baccatin III is disclosed in US Pat. No. 5,015,744 to Holton et al. By using the tissue culture method of a plant, a semi-synthetic raw material such as baccatin III can be produced, and it can also be used for taxol production by the semi-synthetic method. On the other hand, in the culture of plant cells or tissues that is generally carried out, the nutrients and plant hormones necessary for the growth of the cells or tissues are collectively charged at the start of the culture (batch culture method), and the operation is complicated. Due to problems such as the above-mentioned problems, it is rare to perform the medium addition of the nutrient source (fed-batch culture method) or the renewal of the medium (perfusion culture) that combines the medium addition of the nutrient source and the withdrawal of the culture solution. In addition, when plant cells are exposed to a high concentration of nutrients and plant hormones, hyperosmolarity causes protoplast separation, or physiological excess damage to specific components leads to growth arrest and necrosis. Therefore, the concentration of the medium components used in the batch culture method must be lowered, and therefore, the density of cells or tissues that can be transplanted has an upper limit.

【０００５】しかし、このような低い密度で細胞又は組
織を移植して培養した場合には、培養終了時にも、培養
器には更に細胞又は組織を培養できるスペースの余裕を
残しており、培養器を経済的に使用しているとはいえな
い。このような問題を解決するため、微生物や動物細胞
の培養では、流加培養法や灌流培養法が開発されている
が、植物細胞又は組織の培養においては、特開昭６２−
１７５１６９号公報に開示されているキンポウゲ科オウ
レン細胞の培養や特開平２−３０３４３１号公報に開示
されているナス科ズボイシア根の培養等に、わずかな例
があるだけで、本発明が対象としているタキサン型ジテ
ルペン産生植物、例えばイチイ科イチイ属植物の細胞又
は組織の培養については、前記のような問題は全く考慮
されていなかった。However, when cells or tissues are transplanted and cultured at such a low density, a room for culturing the cells or tissues still remains in the incubator even after completion of the culturing. Is not economically used. In order to solve such a problem, a fed-batch culture method and a perfusion culture method have been developed for culturing microorganisms and animal cells.
There are only a few examples in the cultivation of buttercup Coptis cells disclosed in Japanese Patent No. 175169 and the cultivation of Solanaceae Zboisia roots disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2-303431, and the present invention is intended for the present invention. Regarding the culture of cells or tissues of taxane-type diterpene-producing plants, for example, Taxus genus Taxus plants, the above problems have not been considered at all.

【０００６】流加培養法や灌流培養法は、どちらも古く
から知られた培養プロセス技術ではあるが、植物細胞又
は組織の培養への利用に当たっては、植物細胞が微生物
等と違った特殊な性質を持っているため、その方法を適
用すること自体が不可能であったり、極めて高度な技術
の開発を要することが多い。例えば、植物ホルモンやリ
ン酸源は、その他の培地成分に比べて急速に植物細胞に
取り込まれることが知られており、また、カルシウムや
マグネシウムは、培地中の濃度がある一定以上でない
と、細胞はこれらを取り込むことができない。更に、二
次代謝産物の多くは、細胞の増殖速度が低下し始める対
数増殖期から定常期にかけての時期に生産が開始される
ことが知られている。The fed-batch culture method and the perfusion culture method are both known culture process technologies from ancient times, but when used for culturing plant cells or tissues, plant cells have a special property different from microorganisms. Therefore, it is often impossible to apply the method itself, or it is necessary to develop extremely advanced technology. For example, plant hormones and phosphate sources are known to be taken up by plant cells more rapidly than other medium components, and calcium and magnesium must be present at a certain concentration in the medium unless they reach a certain level. Cannot capture these. Furthermore, it is known that most of the secondary metabolites start to be produced during the period from the logarithmic growth phase to the stationary phase where the cell growth rate begins to decrease.

【０００７】このような状況から、植物の細胞又は組織
の培養においては、前述の培養器の低い経済性に甘んじ
て、回分培養法が使用されているのが実状である。Under such circumstances, in the culture of plant cells or tissues, the batch culture method is actually used in favor of the low economic efficiency of the incubator described above.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
組織培養により効率よくタキサン型ジテルペンを製造す
る方法を提供することである。An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing taxane-type diterpenes by culturing plant tissue.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞又
は組織を培養するに当たって、特別な条件を採用するこ
とにより細胞又は組織を抜き出しながら培養を継続する
連続培養を実現し、更に検討を加えて連続培養法を完成
した。Means for Solving the Problems As a result of intensive research, the present inventors have found that when culturing cells or tissues of plants producing taxane-type diterpenes, while extracting cells or tissues by adopting special conditions. The continuous culture was realized by continuing the culture, and further studies were conducted to complete the continuous culture method.

【００１０】即ち、本発明は、タキサン型ジテルペンを
産生する植物の細胞又は組織を培養槽を用いて培養する
に当たり、培養槽中の培養液の総容量をＶ、新鮮培地の
供給速度をｖ、細胞又は組織の比増殖速度をμとすると
き、無次元数Ｆ＝ｖ／Ｖ／μで定義する培地の比更新率
を０．１〜１０の範囲となるように連続的又は間欠的に
新鮮培地を添加し、連続的もしくは間欠的に槽外に抜き
出される細胞もしくは組織を含む培養液、及び／又は連
続的もしくは間欠的に槽外に抜き出される細胞もしくは
組織を含まない培養液からタキサン型ジテルペンを回収
することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法
である。That is, in the present invention, when culturing cells or tissues of a plant producing a taxane-type diterpene in a culture tank, the total volume of the culture solution in the culture tank is V, the supply rate of the fresh medium is v, When the specific growth rate of cells or tissues is μ, the specific renewal rate of the medium defined by the dimensionless number F = v / V / μ is continuously or intermittently fresh so as to be in the range of 0.1 to 10. A taxane from a culture solution containing cells or tissues that are continuously or intermittently extracted from the tank by adding a medium, and / or a culture solution that does not contain cells or tissues that are continuously or intermittently extracted from the tank. A method for producing a taxane-type diterpene, which comprises recovering the diterpene-type diterpene.

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、
タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はな
く、例えばタキソール、１０−デアセチルタキソール、
７−エピタキソ−ル、バッカチンIII 、１０−デアセチ
ルバッカチンIII 、７−エピバッカチンIII 、セファロ
マニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセ
ファロマニン、タキサギフィン及びその類縁体、タキサ
ン１ａ及びその類縁体、キシロシルセファロマニン、キ
シロシルタキソール等が挙げられる。The present invention will be described in detail below. The taxane-type diterpene to be the subject of the production method of the present invention,
There is no particular limitation as long as it is a diterpene having a taxane skeleton, for example, taxol, 10-deacetyltaxol,
7-epitaxol, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-epibaccatin III, cephalomannine, 10-deacetylcephalomannin, 7-epicephalomanin, taxakifine and its analogs, taxane 1a and its analogs, Examples include xylosyl cephalomannine and xylosyl taxol.

【００１２】本発明の製造方法に用いられるタキサン型
ジテルペンを産生する植物としては、例えばセイヨウイ
チイ(Taxus baccata LINN)、イチイ(T. cuspidata SIE
B.etZUCC) 、キャラボク(T. cuspidata SIEB.et ZUCC v
ar. nana REHDER)、タイヘイヨウイチイ(T. brevifolia
NUTT)、カナダイチイ(T. canadiensis MARSH)、中国イ
チイ(T. chinensis)、T. media等のイチイ属植物が挙げ
られる。The taxane-type diterpene-producing plants used in the production method of the present invention include, for example, common yew (Taxus baccata LINN) and yew (T. cuspidata SIE).
B.etZUCC), Carabok (T. cuspidata SIEB.et ZUCC v
ar. nana REHDER), T. brevifolia
NUTT), Canadian yew (T. canadiensis MARSH), Chinese yew (T. chinensis), and T. media.

【００１３】本発明における培地の供給と培養液及び細
胞・組織の抜き取りは以下のように行われる。即ち、培
養槽中の培養液の総容量をＶ、新鮮培地の供給速度を
ｖ、細胞又は組織の比増殖速度をμとするとき、無次元
数Ｆ＝ｖ／Ｖ／μで定義する培地の比更新率を０．１〜
１０の範囲となるように連続的又は間欠的に新鮮培地を
添加し、連続的又は間欠的に細胞又は組織を含む培養液
と、細胞又は組織を含まない培養液とを槽外に抜き出す
ことにより、培地中の細胞密度を実質的に変化させるこ
となく連続培養を達成する。槽外に抜き出されることに
よって得られる培養細胞・組織及び／又は培養液からタ
キサン型ジテルペンを回収することにより、従来の方法
では到底不可能と予測される高い効率でタキサン型ジテ
ルペンを製造できる。培地の比更新率Ｆは０．５〜５と
することが好ましい。細胞密度は１リットル当たり生細
胞重量で５０〜５００ｇで本発明の効果が達成される
が、極端に強い撹拌が必要とされない範囲で高い方が効
率よくタキサン型ジテルペンを生産でき、１リットル当
たり２００ｇ以上が好ましいが、当該初期密度が５０ｇ
新鮮重／ｌ未満の場合であっても、本発明の方法を適用
することによって、生産性の増大効果を得ることができ
る。The supply of the medium and the withdrawal of the culture medium and the cells / tissues in the present invention are carried out as follows. That is, where V is the total volume of the culture solution in the culture tank, v is the supply rate of the fresh medium, and μ is the specific growth rate of the cells or tissues, the dimensionless number F = v / V / μ of the medium Specific update rate is 0.1
By adding fresh medium continuously or intermittently so as to be in the range of 10, and extracting the culture medium containing cells or tissues and the culture medium containing no cells or tissues from the tank continuously or intermittently. , Continuous culture is achieved without substantially changing the cell density in the medium. By recovering the taxane-type diterpene from the cultured cells / tissue and / or the culture solution obtained by extracting the taxane-type diterpene from the tank, it is possible to produce the taxane-type diterpene with high efficiency which is predicted to be impossible by the conventional method. The specific renewal rate F of the medium is preferably 0.5-5. The effect of the present invention can be achieved when the cell density is 50 to 500 g of live cell weight per liter, but a higher taxane-type diterpene can be efficiently produced within a range where extremely strong stirring is not required, and 200 g per liter is obtained. The above is preferable, but the initial density is 50 g
Even when the fresh weight is less than 1 / l, the productivity increasing effect can be obtained by applying the method of the present invention.

【００１４】本発明に関わる培地の更新を実施するに当
たっては、新鮮培地の添加と同時あるいはそれに前後し
て、実質的に培地の全容量を変化させないように培養槽
内から培地を抜き出す方法によるが、特に槽内の細胞の
培地に対する比率を高めた高密度の状態で連続培養を実
施する場合には、槽内の培養液の組成を保ったまま培養
液を抜き出すための抜き出し口と別に、細胞・組織が実
質的に通過不可能なフィルターを備えた抜き出し口か
ら、実質的に細胞・組織を含まない培養液を抜き出す方
法を併用する方法が有効である。この培地の抜き出し
は、連続的又は間欠的に実施することができ、その速度
と頻度及び前記２種類の抜き出し口から抜き出す量の割
合は、実質的に培地の全容量及び培養液中の細胞密度を
変化させない範囲内であれば変更することができる。In carrying out the renewal of the medium according to the present invention, the medium is withdrawn from the culture tank at the same time as or before or after the addition of the fresh medium so that the total volume of the medium is not substantially changed. , In particular, when performing continuous culture in a high-density state in which the ratio of cells in the tank to the medium is increased, cells should be removed separately from the outlet for extracting the culture solution while maintaining the composition of the culture solution in the tank. -A combined method is effective in which a culture solution containing substantially no cells / tissues is extracted from an extraction port equipped with a filter through which tissues cannot substantially pass. This medium extraction can be carried out continuously or intermittently. The rate and frequency and the ratio of the amounts extracted from the two types of extraction ports are substantially the total volume of the medium and the cell density in the culture solution. Can be changed as long as it does not change.

【００１５】本発明をタンク等の培養槽を用いて実施す
る場合は、細胞に酸素を供給する目的で酸素含有ガスを
培養液内に通気する。酸素含有ガスとしては通常空気が
用いられ本発明においても空気が好適に使用できるが、
窒素等の不活性ガスを主体とするガスであって、酸素濃
度が５％以上で炭酸ガス濃度が大気中の炭酸ガス濃度
（０．０３％）以上であるものが好ましく、酸素濃度が
１０〜２５％かつ炭酸ガス濃度が０．１〜１０％、好ま
しくは０．５〜５％の酸素含有ガスを使用することが特
に好ましい。When the present invention is carried out by using a culture tank such as a tank, an oxygen-containing gas is aerated in the culture solution for the purpose of supplying oxygen to cells. Air is usually used as the oxygen-containing gas and air can be preferably used in the present invention.
A gas mainly composed of an inert gas such as nitrogen and having an oxygen concentration of 5% or more and a carbon dioxide concentration of not less than the atmospheric carbon dioxide concentration (0.03%) is preferable, and the oxygen concentration is 10 to 10. It is particularly preferable to use an oxygen-containing gas having a concentration of 25% and a carbon dioxide gas concentration of 0.1 to 10%, preferably 0.5 to 5%.

【００１６】本発明における組織培養に用いられる培地
としては、従来から知られている植物の組織培養に用い
られる培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962 年) 〔Mu
rashige & Skoog 〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ
(1965 年) 〔Linsmaier Skoog 〕の培地、ウッディー・
プラント・メディウム(1981 年) 〔Woody Plant Mediu
m〕、ガンボルグ〔Gamborg 〕のＢ−５培地、三井のＭ
−９培地等が挙げられる。The medium used for tissue culture in the present invention is a conventionally known medium used for tissue culture of plants, such as Murashige Scoog (1962) [Mu
Rashige &Skoog's Medium, Rinsmeier Scoog
(1965) Medium of [Linsmaier Skoog], Woody
Plant Medium (1981) 〔Woody Plant Mediu
m], B-5 medium of Gamborg, M of Mitsui
-9 medium and the like.

【００１７】これら培地に植物ホルモンを添加し、更に
必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸
等を添加することもできる。植物ホルモンとしては、例
えばインドール酢酸(IAA) 、ナフタレン酢酸(NAA)、２,
４−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D) 等のオーキシン
類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイ
トカイニン類が用いられる。Plant hormones may be added to these media, and if necessary, carbon sources, inorganic components, vitamins, amino acids, etc. may be added. Examples of plant hormones include indole acetic acid (IAA), naphthalene acetic acid (NAA) and 2,
Auxins such as 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and cytokinins such as kinetin, zeatin and dihydrozeatin are used.

【００１８】炭素源としては、シュクロース、マルトー
ス、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等の単糖類、デンプン等の多糖類ある
いはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したも
のを使用できる。無機成分としては、例えばリン、窒
素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、
鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、
ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの
成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カル
シウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸
二水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、
硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガ
ン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウ
ム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト
等の化合物として添加できる。As the carbon source, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, monosaccharides such as glucose, fructose and galactose, polysaccharides such as starch, or a mixture of two or more of these sugar sources in an appropriate ratio. Can be used. As the inorganic component, for example, phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, sulfur,
Iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine,
Sodium, iodine, cobalt and the like, and these components are, for example, potassium nitrate, sodium nitrate, calcium nitrate, potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium chloride, magnesium sulfate,
It can be added as a compound such as sodium sulfate, ferrous sulfate, ferric sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, boric acid, copper sulfate, sodium molybdate, molybdenum trioxide, potassium iodide and cobalt chloride.

【００１９】ビタミン類としては、例えばビオチン、チ
アミン（ビタミンＢ₁ ）、ピリドキシン（ビタミン
Ｂ₆ ）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が
用いられる。アミノ酸類としては、例えばグリシン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B ₁ ), pyridoxine (vitamin B ₆ ), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like. As the amino acids, for example, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine and the like can be added.

【００２０】一般に前記の各成分は、植物ホルモン類が
約0.01〜約10μM 、炭素源が約1 〜約30g/l 、無機成分
が約0.1 μM 〜約100mM 、ビタミン類及びアミノ酸類が
それぞれ約0.1 〜約100mg/l の濃度で用いられる。な
お、本発明には液体培地及び寒天やゲランガム等を通常
0.1 〜1 ％含有する固形培地のいずれも使用できるが、
液体培地を用いる方がより効果的である。Generally, each of the above-mentioned components comprises about 0.01 to about 10 μM of plant hormones, about 1 to about 30 g / l of carbon source, about 0.1 μM to about 100 mM of inorganic components, and about 0.1 of vitamins and amino acids, respectively. ~ Used at a concentration of about 100 mg / l. In the present invention, liquid medium and agar or gellan gum are usually used.
Any solid medium containing 0.1 to 1% can be used,
It is more effective to use a liquid medium.

【００２１】本発明における組織培養においては、前記
植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の
組織片又は細胞、あるいはこれらを前記培地又は他の従
来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用
することができる。また本発明は、Agrobacterium tume
faciens 又はAgrobacterium rhizogenesを植物組織に感
染することによって得られる腫瘍細胞及び／又は毛状根
にも適用できる。In the tissue culture of the present invention, pieces or cells of the roots, growth points, leaves, stems, seeds, pollens, anthers, sepals, etc. of the above-mentioned plants, or the above-mentioned medium or other conventional medium is used for tissue culture. Cultured cells obtained by culturing can be used. The present invention also relates to Agrobacterium tume
It can also be applied to tumor cells and / or hairy roots obtained by infecting plant tissues with faciens or Agrobacterium rhizogenes .

【００２２】本発明の製造方法は、各種のタキサン型ジ
テルペンの生産促進物質の存在下に培養する方法と併用
することにより、タキサン型ジテルペンの生産性を更に
高めることができる。タキサン型ジテルペンの生産促進
物質としては、特願平６−１０４２１１、６−１０４２
１２、６−１０４２１３号明細書等に開示されているジ
ャスモン酸類；コロナチン類、又はコロナチン類産生菌
又はその培養液もしくは培養抽出物；特願平６−２０１
１５０号明細書に開示されている重金属を含む化合物
類、重金属を含む錯イオン類及び重金属イオン；特願平
６−２０１１５１号明細書に開示されているアミン類；
特願平６−２５２５２８号明細書に開示されている抗エ
チレン剤が挙げられる。The productivity of the taxane-type diterpene can be further enhanced by using the production method of the present invention together with a method of culturing in the presence of various taxane-type diterpene production-promoting substances. Examples of taxane-type diterpene production promoters include Japanese Patent Application Nos. 6-104211, 6-1042.
Jasmonic acids disclosed in Japanese Patent No. 12,6-104213, etc .; coronatine, or a coronatine-producing bacterium or a culture solution or culture extract thereof; Japanese Patent Application No. 6-201.
Compounds containing heavy metals disclosed in Japanese Patent No. 150, complex ions containing heavy metals and heavy metal ions; amines disclosed in Japanese Patent Application No. 6-201151;
The anti-ethylene agent disclosed in Japanese Patent Application No. 6-252528 can be mentioned.

【００２３】前記ジャスモン酸類としては、一般式
（Ｉ）：Examples of the jasmonic acids include those represented by the general formula (I):

【００２４】[0024]

【化１】 Embedded image

【００２５】［式中、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e及
びＲ^1fは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６の
アルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ
² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ^6aは、それぞれ水素原子又
は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ¹ −Ｃ² −Ｃ³
−Ｃ⁴ −Ｃ⁵ −Ｃ⁶ からなる側鎖は、１個又は２個以上
の二重結合を含んでいてもよく；Ｒ^6bは水酸基又は−Ｏ
−炭水化物残基を表し；Ｒ⁷ は水酸基、ＯＭ（ここで、
Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ
₄ を表す。）、ＮＨＲ⁸ （ここで、Ｒ⁸ は水素原子、炭
素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又は
アミノ酸残基を表す。）、ＯＲ⁹ （ここで、Ｒ⁹ は炭素
数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は
炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜７の整数を
表し；前記５員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結
合を形成してもよい。］で示される化合物、一般式（I
I）：[In the formula, R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e and R ^1f are each a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. Representation; R
² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ^6a each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; C ¹ -C ² -C ³
Side chain consisting of -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may contain one or more double bonds; R ^6b is hydroxyl or -O
Represents a carbohydrate residue; R ⁷ is a hydroxyl group, OM (where
M is an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH
Represents ₄ . ), NHR ⁸ (wherein R ⁸ represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an amino acid residue), OR ⁹ (wherein R ⁹ is carbon. Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms) or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; n represents an integer of 1 to 7; and the 5-membered ring is between adjacent ring member carbon atoms. May form a double bond. ] The compound shown by the general formula (I
I):

【００２６】[0026]

【化２】 Embedded image

【００２７】［式中、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e及
びＲ^1fは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６の
アルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ
² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、それぞれ水素原子又
は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ¹ −Ｃ² −Ｃ³
−Ｃ⁴ −Ｃ⁵ −Ｃ⁶ からなる側鎖は、１個又は２個以上
の二重結合を含んでいてもよく；Ｒ⁷ は水酸基、ＯＭ
（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原
子又はＮＨ₄ を表す。）、ＮＨＲ⁸ （ここで、Ｒ⁸ は水
素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアル
キル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ⁹ （ここで、
Ｒ⁹ は炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表
す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜
７の整数を表し；前記５員環は、隣接する環員炭素原子
間で二重結合を形成してもよい。］で示される化合物、
及び一般式(III) ：[In the formula, R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e and R ^1f are each a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. Representation; R
² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; C ¹ -C ² -C ³
Side chain consisting of -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may contain one or more double bonds; R ⁷ is a hydroxyl group, OM
(Here, M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH _4. ), NHR ⁸ (wherein R ⁸ is a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms). Represents an alkyl group or an amino acid residue), OR ⁹ (wherein
R ⁹ represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carbohydrate residue. ) Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; n is 1 to
Represents an integer of 7; the 5-membered ring may form a double bond between adjacent ring-member carbon atoms. ] The compound shown by
And the general formula (III):

【００２８】[0028]

【化３】 Embedded image

【００２９】［式中、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e及
びＲ^1fは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６の
アルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ
² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、それぞれ水素原子又
は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ¹ −Ｃ² −Ｃ³
−Ｃ⁴ −Ｃ⁵ −Ｃ⁶ からなる側鎖は、１個又は２個以上
の二重結合を含んでいてもよく；Ｒ⁷ は水酸基、ＯＭ
（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原
子又はＮＨ₄ を表す。）、ＮＨＲ⁸ （ここで、Ｒ⁸ は水
素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアル
キル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ⁹ （ここで、
Ｒ⁹ は炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表
す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜
７の整数を表し；前記５員環は、隣接する環員炭素原子
間で二重結合を形成してもよい。］で示される化合物が
挙げられる。[In the formula, R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e and R ^1f are each a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. Representation; R
² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; C ¹ -C ² -C ³
Side chain consisting of -C ⁴ -C ⁵ -C ⁶ may contain one or more double bonds; R ⁷ is a hydroxyl group, OM
(Here, M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH _4. ), NHR ⁸ (wherein R ⁸ is a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms). Represents an alkyl group or an amino acid residue), OR ⁹ (wherein
R ⁹ represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carbohydrate residue. ) Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; n is 1 to
Represents an integer of 7; the 5-membered ring may form a double bond between adjacent ring-member carbon atoms. ] The compound shown by these is mentioned.

【００３０】前記一般式（Ｉ）、（II）及び(III) にお
いて、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ ^1e、Ｒ^1f、Ｒ² 、Ｒ
³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 、Ｒ⁶ 、Ｒ^6a、Ｒ⁷ 、Ｒ⁸ 又はＲ⁹ で表
される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチ
ル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ
−ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ｔ−ブチル
基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基が挙げられる。In the above formulas (I), (II) and (III),
And R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R ^1e, R^1f, R², R
³, R^Four, R^Five, R⁶, R^6a, R⁷, R⁸Or R⁹Table
Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include
Group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n
-Butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, t-butyl group
Group, n-pentyl group, and n-hexyl group.

【００３１】前記一般式（Ｉ）、（II）及び(III) にお
いて、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ ^1e又はＲ^1fで表され
る炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメトキ
シ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ
基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ
基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキ
シルオキシ基が挙げられる。In the above general formulas (I), (II) and (III),
And R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R ^1eOr R^1fRepresented by
Examples of the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include
Si group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy
Group, n-butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group
Group, t-butoxy group, n-pentyloxy group, n-hexyl
Examples include a siloxy group.

【００３２】Ｒ⁷ がＯＭである場合において、Ｍで表さ
れるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子として
は、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げら
れる。Ｒ⁷ がＮＨＲ⁸ である場合において、Ｒ⁸ で表さ
れる炭素数１〜６のアシル基は、直鎖、分岐鎖のいずれ
でもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニ
ル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、アク
リロイル基が挙げられる。When R ⁷ is OM, examples of the alkali metal atom or the alkaline earth metal atom represented by M include sodium, potassium and calcium. When R ⁷ is NHR ⁸ , the acyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R ⁸ may be linear or branched and includes, for example, formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, valeryl. Group, a hexanoyl group, and an acryloyl group.

【００３３】Ｒ⁷ がＮＨＲ⁸ である場合において、Ｒ⁸
で表されるアミノ酸残基としては、イソロイシル基、チ
ロシル基、トリプトフィル基が挙げられる。Ｒ⁷ がＯＲ
⁹ である場合において、Ｒ⁹ で表される炭水化物残基、
及び前記一般式（Ｉ）においてＲ^6bが−Ｏ−炭水化物残
基である場合における炭水化物残基としては、例えばグ
ルコピラノシル基が挙げられる。In the case where R ⁷ is NHR ⁸ , R ⁸
Examples of the amino acid residue represented by are an isoleucyl group, a tyrosyl group, and a tryptophyll group. R ⁷ is OR
⁹ is a carbohydrate residue represented by R ⁹ ,
In the above general formula (I), when R ^6b is an —O-carbohydrate residue, examples of the carbohydrate residue include a glucopyranosyl group.

【００３４】また、前記一般式（Ｉ）、（II）及び(II
I) で示される化合物においては、５員環は、隣接する
環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。前記一般
式（Ｉ）で示される化合物の具体例としては、以下に示
す化合物が挙げられる。 （化合物Ａ）Further, the above general formulas (I), (II) and (II)
In the compound represented by I), the 5-membered ring may form a double bond between adjacent ring member carbon atoms. Specific examples of the compound represented by the general formula (I) include the compounds shown below. (Compound A)

【００３５】[0035]

【化４】 [Chemical 4]

【００３６】（化合物Ｂ）(Compound B)

【００３７】[0037]

【化５】 Embedded image

【００３８】（化合物Ｃ）(Compound C)

【００３９】[0039]

【化６】 [Chemical 6]

【００４０】（化合物Ｄ）(Compound D)

【００４１】[0041]

【化７】 [Chemical 7]

【００４２】前記一般式（II）で示される化合物の具体
例としては、以下に示す化合物が挙げられる。 （化合物Ｅ）Specific examples of the compound represented by the general formula (II) include the compounds shown below. (Compound E)

【００４３】[0043]

【化８】 Embedded image

【００４４】（化合物Ｆ）(Compound F)

【００４５】[0045]

【化９】 [Chemical 9]

【００４６】（化合物Ｇ）(Compound G)

【００４７】[0047]

【化１０】 [Chemical 10]

【００４８】（化合物Ｈ）(Compound H)

【００４９】[0049]

【化１１】 [Chemical 11]

【００５０】前記一般式(III) で示される化合物の具体
例としては、以下に示す化合物が挙げられる。 （化合物Ｉ） Ｒ^1a，Ｒ^1b，Ｒ^1c，Ｒ^1d，Ｒ^1e，Ｒ^1f，Ｒ² ，Ｒ³ ，Ｒ
⁴ ，Ｒ⁵ ，Ｒ⁶ ：Ｈ Ｃ³ とＣ⁴ の間で二重結合形成 Ｒ⁷ ：−ＯＨ又は−ＯＣＨ₃ ｎ：１〜３ （化合物Ｊ） Ｒ^1a，Ｒ^1b，Ｒ^1c，Ｒ^1d，Ｒ^1e，Ｒ^1f，Ｒ² ，Ｒ³ ，Ｒ
⁴ ，Ｒ⁵ ，Ｒ⁶ ：Ｈ Ｒ⁷ ：−ＯＨ ｎ ：１ 前記一般式(III) で示される化合物において、Ｒ^1a、Ｒ
^1b、Ｒ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e又はＲ^1fが水酸基である化合物、
又は５員環において隣接する環員炭素原子間で二重結合
が形成された化合物の具体例としては、例えば、以下に
示す化合物が挙げられる。 （化合物Ｋ）Specific examples of the compound represented by the general formula (III) include the compounds shown below. (Compound I) R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e , R ^1f , R ² , R ³ , R
⁴ , R ⁵ , R ⁶ : H Double bond formation between C ³ and C ⁴ R ⁷ : -OH or -OCH ₃ n: 1 to 3 (Compound J) R ^1a , R ^1b , R ^1c , R ^1d. , R ^1e , R ^1f , R ² , R ³ , R
⁴ , R ⁵ , R ⁶ : H R ⁷ : -OH n: 1 In the compound represented by the general formula (III), R ^1a , R ^1
A compound in which ^1b , R ^1c , R ^1d , R ^1e or R ^1f is a hydroxyl group,
Alternatively, specific examples of the compound in which a double bond is formed between adjacent ring member carbon atoms in the 5-membered ring include the compounds shown below. (Compound K)

【００５１】[0051]

【化１２】 [Chemical 12]

【００５２】（化合物Ｌ）(Compound L)

【００５３】[0053]

【化１３】 [Chemical 13]

【００５４】（化合物Ｍ）(Compound M)

【００５５】[0055]

【化１４】 Embedded image

【００５６】（化合物Ｎ）(Compound N)

【００５７】[0057]

【化１５】 [Chemical 15]

【００５８】前記一般式（Ｉ）、（II）又は(III) で示
される化合物の好ましいものとしては、Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ
^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e、Ｒ^1f、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ
⁶ が水素原子であり、Ｒ⁷ が水酸基又はメトキシ基であ
り、Ｃ¹ −Ｃ² −Ｃ³ −Ｃ⁴−Ｃ⁵ −Ｃ⁶ からなる側鎖
が、二重結合を含まないか、あるいはＣ¹ とＣ² 、Ｃ ²
とＣ³ 又はＣ³ とＣ⁴ の間で二重結合を含む化合物が挙
げられる。The compound represented by the general formula (I), (II) or (III)
Preferred compounds include^1a, R^1b, R
^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R^Four, R^FiveAnd R
⁶Is a hydrogen atom, and R⁷Is a hydroxyl group or a methoxy group
C¹-C²-C³-C^Four-C^Five-C⁶Side chain consisting of
Does not contain a double bond, or C¹And C², C ²
And C³Or C³And C^FourCompounds containing double bonds between
You can

【００５９】本発明で使用される前記一般式（Ｉ）、
（II）又は(III) で示されるジャスモン酸類には種々の
立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）が存在
するが、それぞれの異性体を単独で用いても、混合物の
形で用いてもよい。以上のジャスモン酸類は、全てタキ
サン型ジテルペンの生産性向上に効果を有するが、中で
も前記一般式（Ｉ）、（II）及び(III) において、
Ｒ^1a、Ｒ^1b、Ｒ ^1c、Ｒ^1d、Ｒ^1e、Ｒ^1f、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ
⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ が水素原子であり、Ｒ ⁷ が水酸基又は
メトキシ基であり、ｎが１であり、Ｃ³ とＣ⁴ の間で二
重結合を含んでいる化合物であるツベロン酸、又はツベ
ロン酸メチル、ククルビン酸又はククルビン酸メチル、
及びジャスモン酸又はジャスモン酸メチルが生産性向上
に対する効果の大きさの点から特に好ましい。The above-mentioned general formula (I) used in the present invention,
There are various types of jasmonic acids represented by (II) or (III).
Stereoisomers (cis trans isomer, optical isomer) exist
However, even if each isomer is used alone,
It may be used in the form. The above jasmonic acids are all tachy
It is effective in improving the productivity of sun-type diterpenes.
Also in the above general formulas (I), (II) and (III),
R^1a, R^1b, R ^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R
^Four, R^FiveAnd R⁶Is a hydrogen atom, and R ⁷Is a hydroxyl group or
A methoxy group, n is 1, and C³And C^FourBetween two
Tuberonic acid, which is a compound containing a heavy bond, or tube
Methyl ronate, cucurbic acid or methyl cucurbitate,
And jasmonic acid or methyl jasmonate improve productivity
It is particularly preferable from the viewpoint of the magnitude of the effect on.

【００６０】これらジャスモン酸類は、合成により、又
は植物からの抽出等により調製される（H.Yamane et a
l. Agric. Biol. Chem., 44, 2857-2864(1980) ）。一
方、ジャスモン酸類は、生長促進や組織の成熟、病害抵
抗性の発現にかかわる諸反応を誘起する植物ホルモン様
物質として、種々の植物が自ら生産することが、吉原照
彦著、植物細胞工学第２巻第４号523 〜531 頁（1990
年）に記載されている。These jasmonic acids are prepared synthetically or by extraction from plants (H. Yamane et a
l. Agric. Biol. Chem., 44 , 2857-2864 (1980)). On the other hand, jasmonic acid is a plant hormone-like substance that induces various reactions involved in growth promotion, tissue maturation, and expression of disease resistance. Volume 4, pages 523-531 (1990
Year).

【００６１】従って、ジャスモン酸類は、培養系外から
添加するほかに、使用する培養細胞又は培養組織に自ら
生産させることもできる。この内在性ジャスモン酸類の
培養細胞又は培養組織による生産を促進する方法として
は、微生物の培養物又はその抽出物、熱処理物あるいは
植物抽出物などの培地への添加を例示することができ、
具体的にはM.J.Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i.U.S.A., 90(16), 7490-7494 (1993)に記載の、カビ細
胞壁画分を添加する方法を例示することができる。ま
た、使用する培養細胞又は培養組織に、機械的に又は紫
外線、熱などによって部分的に傷害を与えることによっ
ても、内在性ジャスモン酸の生産量を高めることが可能
であり、具体的には、R.A.Cleeman et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A.,89(11), 4938-4941 (1989) に記
載の、機械的に一部の細胞を破壊する方法を例示するこ
とができる。Therefore, the jasmonic acids can be produced by the cultured cells or tissue to be used, in addition to being added from the outside of the culture system. As a method of promoting the production of the endogenous jasmonic acids by the cultured cells or the cultured tissue, a culture of a microorganism or an extract thereof, a heat-treated product, a plant extract or the like can be added to the medium, and the like.
Specifically, MJ Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sc
The method of adding a mold cell wall fraction described in iUSA, 90 (16), 7490-7494 (1993) can be exemplified. In addition, it is possible to increase the production amount of endogenous jasmonic acid by mechanically or partially injuring the cultured cells or tissue to be used, by ultraviolet rays, heat, etc., and specifically, RACleeman et al., Proc. Nat
The method of mechanically destroying a part of cells described in I. Acad. Sci. USA, 89 ( 11), 4938-4941 (1989) can be exemplified.

【００６２】ジャスモン酸類は、水に対して難溶性のた
め、通常エタノール、メタノール等の有機溶媒、又は界
面活性剤等に溶解した後、培地に添加する。また、遊離
形のジャスモン酸類は、そのまま用いてもよいし、アル
カリで中和して塩にして用いてもよい。ジャスモン酸類
のうち、前記式（Ｉ）又は(III) で示される化合物は、
５員環カルボニル基のα位が、酸、アルカリ、熱によっ
てエピマー化を起こすため、不安定なシス型より安定な
トランス型になりやすい。天然又は合成ジャスモン酸を
用いた平衡実験では、トランス型が９０％、シス型が１
０％の状態で存在する。一般にはシス型の方が活性が強
いとされているが、本発明で使用されるジャスモン酸類
は、前記式（Ｉ）又は(III) で示される全ての立体異性
体化合物及びその混合物を包含する。Since jasmonic acids are poorly soluble in water, they are usually dissolved in an organic solvent such as ethanol or methanol or a surfactant, and then added to the medium. The free form of jasmonic acid may be used as it is, or may be neutralized with an alkali to form a salt. Among the jasmonic acids, the compound represented by the above formula (I) or (III) is
Since the α-position of the 5-membered ring carbonyl group causes epimerization by acid, alkali or heat, it tends to be a stable trans type rather than an unstable cis type. In equilibrium experiments with natural or synthetic jasmonic acid, 90% trans type and 1 cis type
It exists in the state of 0%. Generally, the cis type is considered to have stronger activity, but the jasmonic acids used in the present invention include all stereoisomeric compounds represented by the above formula (I) or (III) and a mixture thereof. .

【００６３】ジャスモン酸類を使用する場合、培地にお
ける濃度が0.01〜1000μＭとすることが必要であり、こ
の中でも特にジャスモン酸類の濃度を0.1 〜500 μＭの
範囲に調整することが好ましい。タキサン型ジテルペン
の生産促進物質として用いることができるコロナチン類
としては、一般式（IV）：When using jasmonic acids, it is necessary to adjust the concentration in the medium to 0.01 to 1000 μM, and among these, it is particularly preferable to adjust the concentration of jasmonic acids to the range of 0.1 to 500 μM. Examples of coronatines that can be used as a taxane-type diterpene production promoter include compounds represented by the general formula (IV):

【００６４】[0064]

【化１６】 Embedded image

【００６５】又は一般式（Ｖ）：Or general formula (V):

【００６６】[0066]

【化１７】 [Chemical 17]

【００６７】［式中、Ｒ¹⁰は、水酸基、ＯＲ¹¹（ここ
で、Ｒ¹¹は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残
基を表す。）、ＯＭ¹ （ここで、Ｍ¹ は、アルカリ金属
原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ₄ を表す。）又は
ＮＲ^12a Ｒ^12b （ここで、Ｒ^12a及びＲ^12b は、それぞ
れ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１
〜６のアルキル基、アミノ酸残基又は一般式（VI）：[Wherein R ¹⁰ is a hydroxyl group, OR ¹¹ (wherein R ¹¹ represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carbohydrate residue), OM ¹ (where M ¹ is Represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ) or NR ^12a R ^12b (wherein R ^12a and R ^12b are each independently a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, or 1 carbon atom).
~ 6 alkyl group, amino acid residue or general formula (VI):

【００６８】[0068]

【化１８】 Embedded image

【００６９】（ここで、Ｒ¹³は、水素原子、水酸基、炭
素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基
又は次式 ーＣＯ−Ｒ¹⁶ （式中、Ｒ¹⁶は、水酸基、ＯＭ² （ここで、Ｍ² は，ア
ルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ₄ を表
す。）、ＮＲ^17a Ｒ^17b （ここで、Ｒ^17a 及びＲ
^17b は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシ
ル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表
す。）又はＯＲ¹⁸（ここで、Ｒ¹⁸は、炭素数１〜６のア
ルキル基又は炭水化物残基を表す。）を表す。）で示さ
れる基を表し；Ｒ ^14a 、Ｒ^14b 、Ｒ^15a 及びＲ^15b は、
それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアル
キル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。）で示
される基を表す。）を表し；Ｒ^19a 、Ｒ^19b 、Ｒ^20a 、
Ｒ^20b 、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ^23a 、Ｒ^23b 、Ｒ^24a 、
Ｒ^{24 b} ，Ｒ^25a 、Ｒ^25b 、Ｒ²⁶及びＲ²⁸は、それぞれ独
立に水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は
炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ²⁷は、水素原
子、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表
し；式中の五員環及び六員環は、隣接する炭素原子間で
二重結合を形成してもよい。］で示される化合物等が挙
げられる。(Where R¹³Is a hydrogen atom, hydroxyl group, charcoal
Alkyl groups having 1 to 6 primes and alkoxy groups having 1 to 6 carbons
Or the following formula-CO-R¹⁶ (In the formula, R¹⁶Is a hydroxyl group, OM²(Where M²Is
Lucari metal atom, alkaline earth metal atom or NH_FourThe table
You. ), NR^17aR^17b(Where R^17aAnd R
^17bAre each independently a hydrogen atom or an acyl group having 1 to 6 carbon atoms.
Group, alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or amino acid residue
You. ) Or OR¹⁸(Where R¹⁸Is a carbon number of 1 to 6
It represents a rukyl group or a carbohydrate residue. ) Represents. )
Represents a group represented by R ^14a, R^14b, R^15aAnd R^15bIs
Independently hydrogen atom, hydroxyl group, C1-6 al
It represents a kill group or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. )
Represents a group represented by ) Represents; R^19a, R^19b, R^20a,
R^20b, R^{twenty one}, R^{twenty two}, R^23a, R^23b, R^24a,
R^{twenty four b}, R^25a, R^25b, R²⁶And R²⁸Are each German
Vertically hydrogen atom, hydroxyl group, alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or
Represents an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; R²⁷Is the hydrogen source
Child, alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or carbohydrate residue
A 5-membered ring and a 6-membered ring in the formula are
A double bond may be formed. ] And other compounds
You can

【００７０】前記一般式（IV）、（Ｖ）及び（VI）にお
いて、Ｒ¹¹、Ｒ^12a 、Ｒ^12b 、Ｒ¹³、Ｒ^14a 、Ｒ^14b 、
Ｒ^15a 、Ｒ^15b 、Ｒ^17a 、Ｒ^17b 、Ｒ¹⁸、Ｒ^19a 、Ｒ
^19b 、Ｒ^20a 、Ｒ^20b 、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ^23a 、Ｒ^23b 、
Ｒ^24a 、Ｒ^24b ，Ｒ^25a 、Ｒ^{25 b} 、Ｒ²⁶、又はＲ²⁷で表
される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチ
ル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ
−ブチル基、イソブチル基、sec −ブチル基、ｔ−ブチ
ル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル
基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。In the above formulas (IV), (V) and (VI), R ¹¹ , R ^12a , R ^12b , R ¹³ , R ^14a , R ^14b ,
R ^15a , R ^15b , R ^17a , R ^17b , R ¹⁸ , R ^19a , R
^19b , R ^20a , R ^20b , R ²¹ , R ²² , R ^23a , R ^23b ,
The ^{R 24a, R 24b, R 25a} , R 25 b, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R ^26, or R ^27, for example a methyl group, an ethyl group, n- propyl group, an isopropyl radical, n
-Butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, t-pentyl group, n-hexyl group, isohexyl group and the like.

【００７１】前記一般式（IV）、（Ｖ）及び（VI）にお
いて、Ｒ¹³、Ｒ^14a 、Ｒ^14b 、Ｒ^{15 a} 、Ｒ^15b 、
Ｒ^19a 、Ｒ^19b 、Ｒ^20a 、Ｒ^20b 、Ｒ²¹、Ｒ²²、
Ｒ^23a 、Ｒ^23b 、Ｒ^24a 、Ｒ^24b ，Ｒ^25a 、Ｒ^25b 、又
はＲ²⁶で表される炭素数１〜６のアルコキシ基として
は、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ
基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ
基、sec −ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチル
オキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ
基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基等が
挙げられる。[0071] In the general formula (IV), (V) and ^{(VI), R 13, R} 14a, R 14b, R 15 a, R 15b,
R ^19a , R ^19b , R ^20a , R ^20b , R ²¹ , R ²² ,
Examples of the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms represented by R ^23a , R ^23b , R ^24a , R ^24b , R ^25a , R ^25b , or R ²⁶ include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, and isopropoxy group. Group, n-butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, t-butoxy group, n-pentyloxy group, neopentyloxy group, t-pentyloxy group, n-hexyloxy group, isohexyloxy group and the like. To be

【００７２】Ｒ¹⁰又はＲ¹⁶が、ＯＭ¹ 又はＯＭ² である
場合において、Ｍ¹ 又はＭ² で表されるアルカリ金属原
子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウ
ム、カリウム、カルシウム等が挙げられる。Ｒ¹⁰又はＲ
¹⁶が、ＮＲ^12a ＮＲ^12b 又はＮＲ^17a Ｒ^17b である場合
において、Ｒ^12a 、Ｒ^12b 、Ｒ^17a 又はＲ^17b で表され
る炭素数１〜６のアシル基は、直鎖、分岐鎖のいずれで
もよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル
基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、アクリ
ロイル基等が挙げられる。When R ¹⁰ or R ¹⁶ is OM ¹ or OM ² , examples of the alkali metal atom or alkaline earth metal atom represented by M ¹ or M ² include sodium, potassium and calcium. To be R ¹⁰ or R
^{In the case where 16} is NR ^12a NR ^12b or NR ^17a R ^17b , the acyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R ^12a , R ^12b , R ^17a or R ^17b may be straight chain or branched chain. Well, for example, formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, valeryl group, hexanoyl group, acryloyl group and the like can be mentioned.

【００７３】Ｒ¹⁰又はＲ¹⁶が、ＮＲ^12a ＮＲ^12b 又はＮ
Ｒ^17a Ｒ^17b である場合において、Ｒ^12a 、Ｒ^12b 、Ｒ
^17a 又はＲ^17b で表されるアミノ酸残基としては、例え
ばイソロイシル基、バリル基、グルタミル基、リジル基
等が挙げられる。Ｒ¹⁰又はＲ¹⁶が、ＯＲ¹¹又はＯＲ¹⁸で
ある場合において、Ｒ¹¹又はＲ¹⁸で表される炭水化物残
基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられる。R ¹⁰ or R ¹⁶ is NR ^12a NR ^12b or N
In the case of R ^17a R ^17b , R ^12a , R ^12b , R
Examples of the amino acid residue represented by ^17a or R ^17b include isoleucyl group, valyl group, glutamyl group, lysyl group and the like. When R ¹⁰ or R ¹⁶ is OR ¹¹ or OR ¹⁸ , examples of the carbohydrate residue represented by R ¹¹ or R ¹⁸ include a glucopyranosyl group.

【００７４】前記一般式（Ｖ）において、Ｒ²⁷で表され
る炭水化物残基としては、例えばグルコピラノシル基が
挙げられる。コロナチン類の好ましい化合物としては、
次式(VII) ：In the general formula (V), examples of the carbohydrate residue represented by R ²⁷ include a glucopyranosyl group. As preferred compounds of coronatine,
The following formula (VII):

【００７５】[0075]

【化１９】 [Chemical 19]

【００７６】で示されるコロナチン、又は次式(VIII)：Coronatine represented by the following formula (VIII):

【００７７】[0077]

【化２０】 Embedded image

【００７８】で示されるコロナファシック酸が挙げられ
る。また、コロナチン類産生菌としては、Pseudomonas
属、Xanthomonas 属が知られている。Pseudomonas 属と
しては、具体的には、P. syringae 、P. glycinea、P.
tabaci 、P. aptata 、P. coronafaciens、P. phaseoli
cola 、P. mori 、P. helianthi等を例示できる。ま
た、Xanthomonas 属としては、X. campestris、X. citr
i、X. cucurbitae 、X. phaseoli 、X. pruni等を例示
できる。The coronafasic acid represented by Also, as coronatine-producing bacteria, Pseudomonas
The genus Xanthomonas is known. Specific examples of the genus Pseudomonas include P. syringae, P. glycinea, and P.
tabaci, P. aptata, P. coronafaciens, P. phaseoli
Examples include cola, P. mori, P. helianthi, and the like. The genus Xanthomonas includes X. campestris and X. citr.
Examples include i, X. cucurbitae, X. phaseoli, and X. pruni.

【００７９】コロナチン類産生菌の増殖は、一般細菌培
養用培地又は最少培地で行うことができる。本発明に使
用するコロナチン類産生菌培養液としては、一例として
それら菌類を培養した培養液を無菌ろ過したものが挙げ
られる。また、コロナチン類産生菌培養抽出物として
は、一例としてそれら菌類を培養した培養液をオートク
レーブ（１２０℃、１５分間）したもの、あるいはそれ
ら菌類の培養液を酸性条件で酢酸エチルなどの有機溶媒
により抽出したもの、あるいはさらにコロナチン、コロ
ナファシック酸を含む画分としてSephadex LH 20カラム
などにより部分精製したものが挙げられる。The growth of coronatin-producing bacteria can be carried out in a general bacterial culture medium or a minimal medium. Examples of the coronatine-producing bacterium culture medium used in the present invention include those obtained by aseptic filtration of the culture medium in which these fungi are cultivated. As the coronatine-producing bacterium culture extract, for example, a culture solution obtained by culturing those fungi is autoclaved (120 ° C. for 15 minutes), or a culture solution of those fungi is treated with an organic solvent such as ethyl acetate under acidic conditions. The extracted ones, or the fractions further containing coronatine and coronafasic acid, which are partially purified by a Sephadex LH 20 column or the like, can be mentioned.

【００８０】タキサン型ジテルペンの生産促進物質とし
て用いることができる重金属を含む化合物類、重金属を
含む錯イオン類及び重金属イオンにおける重金属類とし
ては、銅族或いは鉄族に属する重金属類であれば特に限
定するものではないが、銅族に属する金属類としては特
に銀を使用することが好ましく、また鉄族に属する金属
類としてはコバルトを使用することが好ましい。更に、
銀或いはコバルトを使用する際は、当該重金属類を含む
化合物、当該金属類を含む錯イオン類、又は当該金属イ
オンの形で使用することが好ましい。また、これらの化
合物等は、それぞれ単独で使用してもよく、組み合わせ
て使用してもよい。Compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, and heavy metals in heavy metal ions that can be used as a taxane-type diterpene production promoter are not particularly limited as long as they are heavy metals belonging to the copper group or iron group. However, silver is preferably used as the metal belonging to the copper group, and cobalt is preferably used as the metal belonging to the iron group. Furthermore,
When silver or cobalt is used, it is preferably used in the form of a compound containing the heavy metal, a complex ion containing the metal, or the metal ion. Further, these compounds and the like may be used alone or in combination.

【００８１】銀を含む化合物類としては、例えば硝酸
銀、或いは硫酸銀、或いはフッ化銀、或いは塩素酸銀、
或いは過塩素酸銀、或いは酢酸銀、或いは亜硫酸銀、或
いはヘキサフルオロリン（Ｖ）酸銀、或いはテトラフル
オロホウ酸銀、或いはジアミン銀（Ｉ）硫酸塩、或いは
ジアミノ銀（Ｉ）酸カリウム等の化合物類を例示するこ
とができる。これらの中でも特に硝酸銀、硫酸銀等を好
適な化合物類として例示できる。Examples of compounds containing silver include silver nitrate, silver sulfate, silver fluoride, silver chlorate, and the like.
Or silver perchlorate, or silver acetate, or silver sulfite, or silver hexafluorophosphate (V), or silver tetrafluoroborate, or silver diamine (I) sulfate, or potassium diaminosilver (I), etc. The compounds can be exemplified. Among these, silver nitrate, silver sulfate and the like can be exemplified as suitable compounds.

【００８２】銀を含む錯イオン類としては、例えば[Ag
(S₂O₃)₂]^3-、或いは[Ag(S₂O₃)₃]^5-、或いは[Ag(NH₃)₂]
⁺ 、或いは[Ag(CN)₂]^-、或いは[Ag(CN)₃]^2-、或いは[Ag
(SCN)₂]^- 、或いは[Ag(SCN)₄]^3-の等の錯イオン類を例
示することができる。これらの中でも特に[Ag(S₂O₃)₂]
^3-、[Ag(S₂O₃)₃]^5-等を好適な錯イオン類として例示で
きる。Examples of complex ions containing silver include [Ag
(S ₂ O ₃ ) ₂ ] ^3- , or [Ag (S ₂ O ₃ ) ₃ ] ^5- , or [Ag (NH ₃ ) ₂ ]
⁺ , Or [Ag (CN) ₂ ] ^- , or [Ag (CN) ₃ ] ^2- , or [Ag
Examples thereof include complex ions such as (SCN) ₂ ] ^- , or [Ag (SCN) ₄ ] ^3- . Among these, [Ag (S ₂ O ₃ ) ₂ ]
^3- , [Ag (S ₂ O ₃ ) ₃ ] ^{5-, and the} like can be illustrated as suitable complex ions.

【００８３】コバルトを含む化合物としては、例えば塩
化コバルト、或いは硝酸コバルト、或いは硫酸コバル
ト、或いはフッ化コバルト、或いは過塩素酸コバルト、
或いは臭化コバルト、或いはヨウ化コバルト、或いはセ
レン酸コバルト、或いはチオシアン酸コバルト、或いは
酢酸コバルト、或いは硫酸アンモニウムコバルト、或い
は硫酸コバルト（II）カリウム、或いはヘキサアンミン
コバルト(III) 塩化物、或いはペンタアンミンアクアコ
バルト(III) 塩化物、或いはニトロペンタアンミンコバ
ルト(III) 塩化物、或いはジクロロテトラアンミンコバ
ルト(III) 塩化物半水和物、或いはジニトロテトラアン
ミンコバルト(III) 塩化物、或いはカルボナトテトラア
ンミンコバルト(III) 塩化物、或いはテトラニトロジア
ンミンコバルト(III) 酸アンモニウム、或いはヘキサニ
トロコバルト(III) 酸ナトリウム、或いはトリス（エチ
レンジアミン）コバルト(III) 塩化物三水和物、或いは
ジクロロビス（エチレンジアミン）コバルト(III) 塩化
物、或いはトリス（オキサラト）コバルト(III) 酸カリ
ウム三水和物、或いはヘキサシアノコバルト(III) 酸カ
リウム、或いは（エチレンジアミンテトラアセタト）コ
バルト(III) 酸カリウム二水和物、或いはヒドリドテト
ラカルボニルコバルト（Ｉ）、或いはジカルボニル（シ
クロペンタジエニル）コバルト（Ｉ）、或いはオクタカ
ルボニル二コバルト（０）、或いはヘキサカルボニル
（アセチレン）二コバルト（０）、ビス（シクロペンタ
ジエニル）コバルト（Ｉ）、或いは（シクロペンタジエ
ニル）（1,5-シクロオクタジエン）コバルト（Ｉ）等の
化合物類を例示することができる。これらの中でも特に
塩化コバルト、硝酸コバルト、硫酸コバルト等を好適な
化合物類として例示できる。As the compound containing cobalt, for example, cobalt chloride, cobalt nitrate, cobalt sulfate, cobalt fluoride, or cobalt perchlorate,
Or cobalt bromide, or cobalt iodide, or cobalt selenate, or cobalt thiocyanate, or cobalt acetate, or ammonium cobalt sulfate, or potassium cobalt (II) sulfate, or hexaammine cobalt (III) chloride, or pentaammine aqua Cobalt (III) chloride, or nitropentaamminecobalt (III) chloride, or dichlorotetraamminecobalt (III) chloride hemihydrate, or dinitrotetraamminecobalt (III) chloride, or carbonatotetraamminecobalt (III) Chloride, or ammonium tetranitrodiamminecobaltate (III), or sodium hexanitrocobaltate (III), or tris (ethylenediamine) cobalt (III) chloride trihydrate, or dichlorobis (ethylenediamine) cobalt. Ortho (III) chloride, or potassium tris (oxalato) cobalt (III) trihydrate, or potassium hexacyanocobalt (III), or (ethylenediaminetetraacetato) cobalt (III) dihydrate, Alternatively, hydridotetracarbonylcobalt (I), dicarbonyl (cyclopentadienyl) cobalt (I), octacarbonyldicobalt (0), hexacarbonyl (acetylene) dicobalt (0), bis (cyclopentadienyl) ) Cobalt (I), or compounds such as (cyclopentadienyl) (1,5-cyclooctadiene) cobalt (I) can be exemplified. Among these, cobalt chloride, cobalt nitrate, cobalt sulfate and the like can be exemplified as suitable compounds.

【００８４】コバルトを含む錯イオン類としては、ペン
タアンミンアクアコバルトイオン、或いはニトロペンタ
アンミンコバルトイオン、或いはジクロロテトラアンミ
ンコバルトイオン、或いはジニトロテトラアンミンコバ
ルトイオン、或いはカルボナトテトラアンミンコバルト
イオン、或いはテトラニトロジアンミンコバルトイオ
ン、或いはヘキサニトロコバルトイオン、或いはトリス
（エチレンジアミン）コバルトイオン、或いはジクロロ
ビス（エチレンジアミン）コバルトイオン、或いはトリ
ス（オキサラト）コバルトイオン、或いはヘキサシアノ
コバルトイオン、或いは（エチレンジアミンテトラアセ
タト）コバルトイオン等の錯イオン類を例示することが
できる。The complex ions containing cobalt include pentaammine aquacobalt ion, nitropentaamminecobalt ion, dichlorotetraamminecobalt ion, dinitrotetraamminecobalt ion, carbonatotetraamminecobalt ion, and tetranitrodiamminecobalt ion. Or hexanitrocobalt ion, tris (ethylenediamine) cobalt ion, dichlorobis (ethylenediamine) cobalt ion, tris (oxalato) cobalt ion, hexacyanocobalt ion, or (ethylenediaminetetraacetato) cobalt ion or other complex ions Can be illustrated.

【００８５】前記重金属類の内、銀を含む化合物類、銀
を含む錯イオン類、又は銀イオンは、培地における濃度
が10^-8M 〜10^-1M とすることが好ましく、特に10^-7M 〜
10^-2M の範囲に調整することが更に好ましい。またコバ
ルトを含む化合物類、コバルトを含む錯イオン類、又は
コバルトイオンは、培地における濃度が10^-6〜10^-1Mと
することが好ましく、特に10^-5〜10^-2M の範囲にするこ
とが更に好ましい。Of the above-mentioned heavy metals, the compounds containing silver, the complex ions containing silver, or the silver ions preferably have a concentration in the medium of 10 ^-8 M to 10 ^-1 M, and particularly 10 ^-7 M M ~
It is more preferable to adjust to the range of 10 ^-2 M. Further, compounds containing cobalt, complex ions containing cobalt, or cobalt ions, the concentration in the medium is preferably 10 ^-6 ~ 10 ^-1 M, particularly in the range of 10 ^-5 ~ 10 ^-2 M More preferably.

【００８６】タキサン型ジテルペンの生産促進物質とし
て用いることができるアミン類とは、アミン又はその塩
を意味するが、かかるアミン類としては、モノアミン類
或いはポリアミン類のいずれも利用可能であるが、特に
ポリアミン類を使用することが好ましい。更に、前記ア
ミン類としては、アルキル基の一部の水素が水酸基で置
換されていてもよいモノ、ジ又はトリアルキルアミン、
例えばメチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、
ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン、もしくはそれらの塩；或い
はポリメチレン部がイミノ基で中断されていてもよく、
アミノ基のＨが低級アルキル基で置換されていてもよい
ポリメチレンジアミン、例えばプトレッシン、カダベリ
ン、スペルミジン、スペルミン、エチレンジアミン、N,
N-ジエチル-1,3- プロパンジアミン、ジエチレントリア
ミン、トリエチレンテトラミン、もしくはそれらの塩；
或いは環状アルキルアミン、例えばシクロペンチルアミ
ン、シクロヘキシルアミン、もしくはそれらの塩、或い
はメセナミン、ピペラジン等の環状アミン、もしくはそ
れらの塩が挙げられる。これらアミン類の内で好ましい
ものとしては、例えばプトレッシン〔NH₂(CH₂)₄NH₂〕、
カダベリン〔NH₂(CH₂)₅NH₂〕、スペルミジン〔NH₂(CH₂)
₃NH(CH₂)₄NH₂〕、スペルミン〔NH₂(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH
₂)₃NH₂〕、エチレンジアミン〔NH₂(CH₂)₂NH₂〕、N,N-ジ
エチル-1,3- プロパンジアミン〔(C₂H₅)₂N(CH₂)₃N
H₂ 〕、ジエチレントリアミン〔NH₂(CH₂)₂NH(CH₂)₂N
H₂〕等のポリアミン類、もしくはそれらの塩を例示する
ことができる。As a taxane-type diterpene production promoter
And amines that can be used as an amine
, But as such amines, monoamines
Alternatively, any of the polyamines can be used, but especially
Preference is given to using polyamines. In addition,
In the case of mines, some hydrogen atoms in the alkyl group are replaced by hydroxyl groups.
Optionally substituted mono-, di- or trialkylamines,
For example, methylamine, ethylamine, dimethylamine,
Diethylamine, triethylamine, diethanolamine
Or triethanolamine, or their salts; or
The polymethylene part may be interrupted by an imino group,
H of the amino group may be substituted with a lower alkyl group
Polymethylenediamine, such as putrescine, cadaveri
, Spermidine, spermine, ethylenediamine, N,
N-diethyl-1,3-propanediamine, diethylene tria
Min, triethylenetetramine, or salts thereof;
Or cyclic alkyl amines such as cyclopentylami
Amine, cyclohexylamine, or their salts, or
Is a cyclic amine such as mesenamine or piperazine, or
These include salts. Preferred among these amines
For example, putrescine [NH₂(CH₂)_FourNH₂],
Cadaverine [NH₂(CH₂)_FiveNH₂], Spermidine [NH₂(CH₂)
₃NH (CH₂)_FourNH₂], Spermine [NH₂(CH₂)₃NH (CH₂)_FourNH (CH
₂)₃NH₂], Ethylenediamine [NH₂(CH₂)₂NH₂], N, N-Di
Ethyl-1,3-propanediamine [(C₂H_Five)₂N (CH₂)₃N
H₂], Diethylenetriamine [NH₂(CH₂)₂NH (CH₂)₂N
H₂] And other polyamines, or salts thereof are exemplified.
be able to.

【００８７】前記アミン類は、培地における濃度が10^-8
M 〜10^-1M とすることが好ましく、この中でも特に10^-7
M 〜10^-2M の範囲に調整することが更に好ましい。タキ
サン型ジテルペンの生産促進物質として用いることがで
きる抗エチレン剤としては、培養物のエチレン生合成機
構を阻害するか、及び／又は該培養物内に貯留するかも
しくは該培養物を含む培養器内の気相中或いは培地中に
存在するエチレンを除去する物質であれば特に制限はな
い。The amines have a concentration of 10 ⁻⁸ in the medium.
It is preferable to be M to 10 ^-1 M, and among these, 10 ^-7 is particularly preferable.
It is more preferable to adjust to the range of M to 10 ^-2 M. As an anti-ethylene agent that can be used as a taxane-type diterpene production-promoting substance, it is possible to inhibit the ethylene biosynthesis mechanism of a culture and / or store it in the culture or in an incubator containing the culture. There is no particular limitation as long as it is a substance that removes ethylene existing in the gas phase or medium.

【００８８】エチレン生合成機構を阻害する方法として
は、例えばＳ−アデノシルメチオニンから１−アミノシ
クロプロパン−１−カルボン酸への変換を触媒する酵素
の活性を阻害するか、或いは１−アミノシクロプロパン
−１−カルボン酸からエチレンへの変換を触媒する酵素
の活性を阻害する方法が例示され、前者の機能を有する
化合物としては、例えばアミノオキシ酢酸、アセチルサ
リチル酸、リゾビトキシン、アミノエトキシビニルグリ
シン、メトキシビニルグリシン、α−アミノイソ酪酸、
２，４−ジニトロフェノール等を挙げることができる。
また、前記に例示する化合物の塩、エステル、アミノ酸
誘導体、炭水化物誘導体であってもよい。As a method for inhibiting the ethylene biosynthesis mechanism, for example, the activity of an enzyme which catalyzes the conversion of S-adenosylmethionine to 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid is inhibited, or 1-aminocyclo A method of inhibiting the activity of an enzyme that catalyzes the conversion of propane-1-carboxylic acid to ethylene is exemplified, and examples of the compound having the former function include aminooxyacetic acid, acetylsalicylic acid, rhizobitoxine, aminoethoxyvinylglycine, and methoxy. Vinylglycine, α-aminoisobutyric acid,
2,4-dinitrophenol etc. can be mentioned.
Further, it may be a salt, ester, amino acid derivative or carbohydrate derivative of the compounds exemplified above.

【００８９】塩としては、例えばナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム塩、エステルとしては、
例えばメチル、エチル、プロピル、ブチルエステル、ア
ミノ酸誘導体としては、例えばグリシン、メチオニン、
フェニルアラニン誘導体、炭水化物誘導体としては、例
えばグルコース、マルトース誘導体等が挙げられる。ま
た後者の機能を有する化合物としては、例えば没食子
酸、並びに当該化合物の塩、エステル、アミノ酸誘導体
及び炭水化物誘導体を挙げることができる〔兵藤宏、 昭
和62年度園芸学会秋季大会、 シンポジウム講演要旨、p.1
22、倉石晋、 植物ホルモン、 東京大学出版、p.111〕。As salts, for example, sodium, potassium, calcium, magnesium salts, and as esters,
For example, methyl, ethyl, propyl, butyl ester, amino acid derivatives such as glycine, methionine,
Examples of the phenylalanine derivative and the carbohydrate derivative include glucose and maltose derivatives. Examples of the compound having the latter function include gallic acid, and salts, esters, amino acid derivatives and carbohydrate derivatives of the compound (Hiroto Hyodo, 1987 Autumn Meeting of the Horticultural Society, Symposium Abstract, p. 1
22, Shin Kuraishi, Plant Hormone, The University of Tokyo Press, p.111].

【００９０】ここで塩としては、例えばナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム塩、エステルとして
は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチルエステ
ル、アミノ酸誘導体としては、例えばグリシン、メチオ
ニン、フェニルアラニン誘導体、炭水化物誘導体として
は、例えばグルコース、マルトース誘導体等が挙げられ
る。更に、培養物内に貯留するか、又は該培養物を含む
培養器内の気相中もしくは培地中に存在するエチレンを
除去する物質としては、例えば１，５−シクロオクタジ
エン、並びにイソチオシアン酸及び当該化合物の塩、エ
ステル（例えばアリルイソチオシアネート、ベンジルイ
ソチオシアネート）、アミノ酸誘導体及び炭水化物誘導
体を挙げることができる〔宗像恵、 植物の化学調節, 29
(1), 89-93(1994)〕。Examples of the salts include sodium, potassium, calcium, magnesium salts, esters such as methyl, ethyl, propyl and butyl esters, amino acid derivatives such as glycine, methionine, phenylalanine derivatives and carbohydrate derivatives. Examples include glucose and maltose derivatives. Further, as a substance that removes ethylene stored in the culture or existing in the gas phase or medium in the incubator containing the culture, for example, 1,5-cyclooctadiene, and isothiocyanic acid and Mention may be made of salts, esters (for example, allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate), amino acid derivatives and carbohydrate derivatives of the compound [Megumi Munakata, Chemical Regulation of Plants, 29
(1), 89-93 (1994)].

【００９１】ここで塩としては、例えばナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム塩、エステルとして
は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル
エステル、アミノ酸誘導体としては、例えばグリシン、
メチオニン、フェニルアラニン誘導体、炭水化物誘導体
としては、例えばグルコース、マルトース誘導体等が挙
げられるが、本発明に係る物質の塩、エステル、アミノ
酸誘導体、炭水化物誘導体は当該化合物類に限定される
ものではない。Here, the salt includes, for example, sodium, potassium, calcium, magnesium salt, the ester includes, for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, allyl ester, and the amino acid derivative includes, for example, glycine,
Examples of the methionine, phenylalanine derivative, and carbohydrate derivative include glucose and maltose derivative, but the salt, ester, amino acid derivative, and carbohydrate derivative of the substance according to the present invention are not limited to the compounds.

【００９２】抗エチレン剤は、培地における濃度が10^-8
M 〜10^-1M とすることが必要であり、この中でも特に抗
エチレン剤の濃度を10^-7M 〜10^-2M の範囲に調整するこ
とが好ましい。前述のようにタキサン型ジテルペンの生
産促進物質の存在下に培養する場合、ジャスモン酸類
は、培養細胞の対数増殖期ないし定常期に添加すること
が効果的であり、この中でも特に対数増殖期から定常期
に移行する時期にジャスモン酸類を添加することが好ま
しい。また、内在性ジャスモン酸類の生産量を高めるた
めの処理の時期についてもこれと同様である。例えば、
21日おきに細胞を移植している場合には７〜16日目がジ
ャスモン酸類の添加又は内在性ジャスモン酸類の生産量
を高めるための処理の適期にあたり、対数増殖期、例え
ば７〜14日目の細胞を移植する際には、移植直後が適期
にあたる。また、ジャスモン酸類の添加及び内在性ジャ
スモン酸類の生産量を高める処理は、一度に行っても、
複数回に分けて行ってもよいし、また連続的に行っても
よい。The anti-ethylene agent has a concentration of 10 ⁻⁸ in the medium.
It is necessary to adjust the concentration of M to 10 ^-1 M, and it is particularly preferable to adjust the concentration of the anti-ethylene agent in the range of 10 ^-7 M to 10 ^-2 M. When culturing in the presence of a taxane-type diterpene production-promoting substance as described above, it is effective to add jasmonic acid during the logarithmic growth phase or stationary phase of the cultured cells. It is preferable to add jasmonic acids at the time of transition to the stage. The timing of the treatment for increasing the production of endogenous jasmonic acids is also the same. For example,
When cells are transplanted every 21 days, the 7th to 16th days are the appropriate period of the addition of jasmonic acid or the treatment for increasing the production amount of endogenous jasmonic acid, and the logarithmic growth phase, for example, 7th to 14th day. Immediately after the transplantation, the appropriate time is reached when the cells are transplanted. In addition, the addition of jasmonic acids and the treatment for increasing the production amount of endogenous jasmonic acids are performed at a time,
It may be divided into a plurality of times or continuously.

【００９３】コロナチン類、又はコロナチン類産生菌又
はその培養液もしくは培養抽出物は、培養細胞の対数増
殖期ないし定常期に添加することが効果的であり、この
中でも特に対数増殖期から定常期に移行する時期に添加
することが好ましい。例えば、21日おきに細胞を移植し
ている場合には７〜16日目がコロナチン類、又はコロナ
チン類産生菌又はその培養液もしくは培養抽出物の添加
の適期にあたる。また、添加方法としては、一度に所定
の量を添加してもよいし、数回に分けて逐次添加しても
よい。It is effective to add the coronatine, or the coronatin-producing bacterium, or the culture solution or culture extract thereof during the logarithmic growth phase or stationary phase of the cultured cells. It is preferable to add it at the time of transition. For example, when cells are transplanted every 21 days, the 7th to 16th days correspond to the appropriate period of addition of coronatine, a coronatin-producing bacterium, or a culture solution or extract thereof. Further, as a method of addition, a predetermined amount may be added at once, or may be added several times and sequentially added.

【００９４】重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イ
オン類、又は重金属イオンは、培養開始時ないし培養細
胞が対数増殖期から定常期に移行する時期までに添加す
ることが効果的であり、特に培養開始時に添加すること
が好ましい。また当該化合物又はイオンの添加は、一度
に行ってもよいし、数回に分けて行ってもよい。アミン
類は、細胞が対数増殖期から定常期に移行する時期まで
に添加することが効果的であり、特に培養開始時に添加
することが好ましい。また当該化合物は、一度に行って
もよいし、数回に分けて行ってもよい。It is effective to add compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metals, or heavy metal ions at the start of the culture or from the time when the cultured cells transition from the logarithmic growth phase to the stationary phase. It is preferable to add it at the start of culture. Further, the addition of the compound or ion may be performed at once or may be performed in several times. It is effective to add amines by the time cells transition from the logarithmic growth phase to the stationary phase, and it is particularly preferable to add them at the start of culture. Moreover, the said compound may be performed at once, and may be divided into several times and may be performed.

【００９５】抗エチレン剤は、細胞が対数増殖期から定
常期に移行する時期までに添加することが効果的であ
り、特に定常期に移行した直後に添加することが好まし
い。また当該化合物は、一度に行ってもよいし、数回に
分けて行ってもよい。また、タキサン型ジテルペンの生
産促進物質としては、特願平６−２９１７８３号明細書
に記載されているサイクロデキストリン等の環状多糖類
を用いてもよい。It is effective to add the anti-ethylene agent during the period from the logarithmic growth phase to the transition to the stationary phase, and it is particularly preferable to add it immediately after the transition to the stationary phase. Moreover, the said compound may be performed at once, and may be divided into several times and may be performed. In addition, as the taxane-type diterpene production promoting substance, a cyclic polysaccharide such as cyclodextrin described in Japanese Patent Application No. 6-291783 may be used.

【００９６】更に、本発明の製造方法は、特願平６−１
４６８２６号に係る発明である、培養器内の気相中の酸
素濃度を培養初期より大気中の酸素濃度未満の条件下に
制御して培養を行うか、或いは組織又は細胞と接する流
動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度に
於ける飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して培
養する方法とも併用することができる。Furthermore, the manufacturing method of the present invention is described in Japanese Patent Application No. 6-1.
No. 46826, which is a fluid medium in which the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled to be less than the oxygen concentration in the atmosphere from the initial stage of the culture, or the culture medium is brought into contact with tissues or cells. It can also be used in combination with a method of controlling the dissolved oxygen concentration in the medium from the initial stage of culture under conditions where the dissolved oxygen concentration is less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature.

【００９７】ここで、培養初期とは、培養開始時ないし
培養開始後７日目をいい、培養器内の気相中の酸素濃
度、又は組織もしくは細胞と接する流動性の培地中の溶
存酸素濃度の制御は、培養開始時から行うことが好まし
い。また、制御の期間としては、培養全期間を通して該
条件に制御してもよいし、培養全期間中の一部期間のみ
を制御してもよく、特に限定するものではないが、全培
養期間中の、少なくとも３日間制御することが好まし
い。Here, the term "initial stage of culture" refers to the start of culture or the seventh day after the start of culture, and the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with tissues or cells. The control is preferably performed from the start of culture. The period of control may be controlled to the conditions throughout the entire culture period, or may be controlled only for a part of the entire culture period, and is not particularly limited, but during the entire culture period. It is preferable to control for at least 3 days.

【００９８】培養器内の気相中の酸素濃度は、４ないし
15％に制御することが必要であり、特に６ないし12％に
制御することが好ましい。また、流動性の培地中の溶存
酸素濃度は、その温度における飽和溶存酸素濃度値の１
ないし75％に制御することが必要であり、特に10ないし
75％に制御することが好ましい。また、本発明の製造方
法は、特願平５−２８４８９３号、同６−１０４２１３
号明細書に開示されている、細胞を比重の違いにより複
数の層に分け、少なくとも１つの層に含まれる細胞を培
養する方法と併用することもできる。The oxygen concentration in the gas phase in the incubator is 4 to
It is necessary to control to 15%, and it is particularly preferable to control to 6 to 12%. Further, the dissolved oxygen concentration in the fluid medium is 1 of the saturated dissolved oxygen concentration value at that temperature.
To 75%, especially 10 to
It is preferable to control to 75%. The production method of the present invention is described in Japanese Patent Application Nos. 5-284893 and 6-104213.
It can also be used in combination with the method disclosed in the specification, in which cells are divided into a plurality of layers according to the difference in specific gravity and the cells contained in at least one layer are cultured.

【００９９】細胞を比重によって分離する方法として
は、一般に遠心分離用媒体を用いて密度勾配を作成し、
細胞を重層した後、遠心分離する方法が知られている。
遠心分離用媒体としては、Ficoll、Percoll （共にPhar
macia LKB Biotechnology 社製）、ショ糖、塩化セシウ
ム等が用いられる。密度勾配を形成する層の数に特に制
限はない。各層の比重差は、特に限定されるものではな
く、また各比重差は同じであっても異なっていてもよ
い。As a method for separating cells by specific gravity, a density gradient is generally prepared using a medium for centrifugation,
A method in which cells are layered and then centrifuged is known.
Ficoll and Percoll (both Phar and
macia LKB Biotechnology), sucrose, cesium chloride, etc. are used. There is no particular limitation on the number of layers forming the density gradient. The specific gravity difference between the layers is not particularly limited, and the specific gravity differences may be the same or different.

【０１００】従って、この密度勾配の定義には勾配が連
続的に変化する場合（密度勾配を形成する層の数が無限
大、各層の比重差が０に近い状態）も含む。このように
して密度勾配を形成し、細胞を重層、遠心分離すること
により細胞を比重の違いにより複数の層に分けることが
できる。作成する層の比重は、通常1.00〜1.20g/ml、好
ましくは1.03〜1.11g/mlの範囲である。培養の対象とな
る層としては、少なくとも１つの層を選択し、また全て
の層を選択して培養してもよい。Therefore, the definition of the density gradient includes the case where the gradient continuously changes (the number of layers forming the density gradient is infinite, and the difference in specific gravity between layers is close to 0). By forming a density gradient in this way, cells can be layered and centrifuged to separate cells into a plurality of layers due to the difference in specific gravity. The specific gravity of the formed layer is usually 1.00 to 1.20 g / ml, preferably 1.03 to 1.11 g / ml. As the layer to be cultured, at least one layer may be selected, or all layers may be selected and cultured.

【０１０１】複数の層を選択して培養する場合、これら
の複数の層は、それぞれ個別に培養することもできる
が、選択した複数の層のうちの２層以上の層を混合して
培養することもできる。タキサン型ジテルペン産生能の
高い培養細胞は、通常、比重が1.07以下の層に含まれる
細胞を培養して得られるが、培養する細胞や培養の条件
により変動する場合があり、必ずしもこの範囲に限定さ
れるものではない。また、単に比重の違いによって分画
しただけでは、比重の高い層の細胞の方がタキサン型ジ
テルペン含量が高くなる傾向が認められる。従って、よ
り確実にタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を取得す
るためには、分画された全ての層の細胞を一定期間培養
した後、各層の細胞に含まれるタキサン型ジテルペン濃
度を測定し、それらの中からタキサン型ジテルペン高産
生細胞を含む層を選択することが望ましい。When a plurality of layers are selected and cultured, the plurality of layers can be individually cultured, but two or more layers of the selected plurality of layers are mixed and cultured. You can also Cultured cells with high taxane-type diterpene-producing ability are usually obtained by culturing cells contained in a layer having a specific gravity of 1.07 or less, but may vary depending on the cells to be cultivated and the conditions of the culture, and are not necessarily limited to this range. It is not something that will be done. Further, it is recognized that the cells in the layer having a high specific gravity tend to have a higher taxane-type diterpene content simply by fractionating the cells by the difference in the specific gravity. Therefore, in order to more reliably obtain the taxane-type diterpene high-producing cultured cells, after culturing the cells of all the fractionated layers for a certain period of time, the taxane-type diterpene concentration contained in the cells of each layer is measured, and Among these, it is desirable to select a layer containing highly taxane-type diterpene-producing cells.

【０１０２】また、例えば1.07g/mlのように、ある１つ
の特定の比重の遠心分離媒体を作成し、前述の方法で遠
心分離することによっても、培養細胞を比重の違いによ
り複数の層に分けることができる。また、本発明の製造
方法と、前述の先願特許に記載の方法のいくつか又は全
てを組み合わせることも可能である。Also, by preparing a centrifuge medium having a specific gravity such as 1.07 g / ml and centrifuging by the above-mentioned method, the cultured cells are divided into a plurality of layers due to the difference in specific gravity. Can be divided. Further, it is possible to combine some or all of the methods described in the above-mentioned prior patents with the production method of the present invention.

【０１０３】更に、本発明において、タキサン型ジテル
ペンを産生する植物の細胞又は組織を培養するに当た
り、特定の糖及び／又は硝酸イオン供給条件の下で培養
することにより、当該細胞又は組織の高密度培養が可能
になり、これによって培養器当たりのタキサン型ジテル
ペン生産量が飛躍的に向上する。ここで、密度とは培養
槽中の培養液容積当たりの細胞量を表し、培養液１リッ
トル当たりの乾燥細胞重量（ｇ）で示す。Further, in the present invention, when culturing a cell or tissue of a plant that produces a taxane-type diterpene, by culturing under the condition of supplying a specific sugar and / or nitrate ion, a high density of the cell or tissue can be obtained. Cultivation becomes possible, which dramatically improves the amount of taxane-type diterpene produced per incubator. Here, the density represents the amount of cells per volume of the culture solution in the culture tank, and is shown as the dry cell weight (g) per liter of the culture solution.

【０１０４】この場合の糖の供給方法としては、培養開
始時の培地中の濃度を２〜５０ｇ／ｌとすることが好ま
しく、中でも１０〜３０ｇ／ｌとすることが特に好まし
い。また、培養途中の糖の添加速度は、培養開始時の培
地の初期容量に対して、１日当たり０. ２〜５ｇ／ｌと
することが好ましく、中でも０. ５〜２ｇ／ｌとするこ
とが特に好ましい。この糖の添加は、前記範囲内にある
限り、一定速度であってもよいし、また適宜変更するこ
ともできる。適宜変更する方法としては、予め設定した
一定の濃度範囲に培地中の糖濃度を維持できるように、
培養経過とともに増加する細胞密度に応じて、前記添加
速度の範囲内で添加速度を増加又は減少する方法が例示
される。As a method of supplying sugar in this case, the concentration in the medium at the start of culture is preferably 2 to 50 g / l, and particularly preferably 10 to 30 g / l. In addition, the rate of addition of sugar during the culture is preferably 0.2 to 5 g / l per day with respect to the initial volume of the medium at the start of the culture, and particularly 0.5 to 2 g / l. Particularly preferred. The addition of this sugar may be carried out at a constant rate as long as it is within the above range, or it may be appropriately changed. As a method of changing appropriately, so that the sugar concentration in the medium can be maintained within a preset constant concentration range,
A method of increasing or decreasing the addition rate within the range of the addition rate depending on the cell density that increases with the progress of culture is exemplified.

【０１０５】また、硝酸イオンの供給方法としては、培
養開始時の培地中の濃度を２〜５０ｍｍｏｌ／ｌとする
ことが好ましく、中でも１０〜３０ｍｍｏｌ／ｌとする
ことが特に好ましい。また、培養途中の硝酸イオンの添
加速度は、培養開始時の培地の初期容量に対して、１日
当たり０. ２〜５ｍｍｏｌ／ｌとすることが好ましく、
中でも０. ５〜２ｍｍｏｌ／ｌとすることが特に好まし
い。この硝酸イオンの添加は、前記範囲内にある限り、
一定速度であってもよいし、また適宜変更することもで
きる。適宜変更する方法としては、予め設定した一定の
濃度範囲に培地中の硝酸イオン濃度を維持できるよう
に、培養経過とともに増加する細胞密度に応じて、前記
添加速度の範囲内で添加速度を増加又は減少する方法が
例示される。As the method for supplying nitrate ions, the concentration in the medium at the start of culture is preferably 2 to 50 mmol / l, and particularly preferably 10 to 30 mmol / l. Further, the rate of addition of nitrate ions during the culture is preferably 0.2 to 5 mmol / l per day with respect to the initial volume of the medium at the start of the culture,
Above all, it is particularly preferable to set it to 0.5 to 2 mmol / l. As long as the addition of this nitrate ion is within the above range,
The speed may be constant or may be changed appropriately. As a method of appropriately changing, so that the nitrate ion concentration in the medium can be maintained in a preset constant concentration range, depending on the cell density that increases with the progress of culture, the addition rate is increased within the range of the addition rate or A method of reducing is illustrated.

【０１０６】前記の糖及び／又は硝酸イオンの添加は、
連続的に行ってもよいし、間欠的に行ってもよい。ま
た、間欠的に添加を行う場合、１日当たりの添加回数に
は制限はなく、また、添加を行わない日が途中にあって
もよい。当該態様において、糖及び／又は硝酸イオン
は、培養開始直後から培養終了までの間のどの時期に行
ってもかまわないが、細胞の増殖が対数増殖期にある間
に添加することが細胞の増殖速度増加にとって特に効果
的であることから、培養開始後２日目から１４日目の期
間に行うことが特に好ましい。The addition of the sugar and / or nitrate ion described above
It may be carried out continuously or intermittently. In addition, when the addition is performed intermittently, the number of times of addition per day is not limited, and there may be days when the addition is not performed. In this embodiment, the sugar and / or nitrate ion may be added at any time from immediately after the start of the culture until the end of the culture, but it is necessary to add the sugar and / or nitrate ions during the logarithmic growth phase of the cell growth. Since it is particularly effective for increasing the speed, it is particularly preferable to carry out the culture from the 2nd day to the 14th day after the start of culture.

【０１０７】定常期において、培養液の糖濃度は５〜４
０ｇ／ｌが、培養液の硝酸イオン濃度は１０〜４０ｍｍ
ｏｌ／ｌであることが好ましい。ここで、定常とは、培
地の供給と培養液、細胞・組織の抜き取りの速度が平衡
状態にあり、槽内の細胞濃度が一定している状態をい
う。当該態様で使用される糖としては、前述したものが
挙げられるが、中でもシュクロースを用いることが最も
好ましい。In the stationary phase, the sugar concentration in the culture solution was 5 to 4
0 g / l, the nitrate concentration of the culture solution is 10-40 mm
It is preferably ol / l. Here, “steady” refers to a state in which the supply rate of the medium and the extraction rates of the culture solution and the cells / tissues are in equilibrium, and the cell concentration in the tank is constant. Examples of the sugar used in this embodiment include those mentioned above, and of these, sucrose is most preferable.

【０１０８】また、硝酸イオンの起源としては、一般に
植物組織培養に用いられている硝酸塩化合物が利用可能
であり、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウ
ム、硝酸アンモニウムを例示することができる。中でも
硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウムの中か
ら選ばれる少なくとも１種類以上を使用することが最も
好ましい。As a source of nitrate ions, nitrate compounds generally used in plant tissue culture can be used, and sodium nitrate, potassium nitrate, calcium nitrate, and ammonium nitrate can be exemplified. Among them, it is most preferable to use at least one selected from sodium nitrate, potassium nitrate and calcium nitrate.

【０１０９】前記の糖源及び硝酸塩化合物の種類は、培
養期間中適宜変更することが可能であり、糖及び硝酸イ
オンの濃度が前記の範囲内にあれば、複数の糖及び／又
は硝酸塩を混合して使用することも可能である。イチイ
属植物などのタキサン型ジテルペン産生植物の細胞又は
組織を培養する場合、前記の供給条件範囲をはずれて
も、細胞又は組織の増殖速度を著しく低下させたり細胞
又は組織の壊死を引き起こしたりすることはないが、細
胞の増殖速度を最大にし、かつタキサン型ジテルペンの
生産性を高レベルに保つには、前記供給条件で糖を添加
することが好ましい。The types of the above-mentioned sugar source and nitrate compound can be appropriately changed during the culturing period, and if the sugar and nitrate ion concentrations are within the above ranges, a plurality of sugars and / or nitrates are mixed. It is also possible to use it. When culturing cells or tissues of taxane-type diterpene-producing plants such as Taxus plants, even if they fall outside the range of the above-mentioned supply conditions, the growth rate of cells or tissues may be significantly reduced, or necrosis of cells or tissues may occur. However, in order to maximize the cell growth rate and keep the taxane-type diterpene productivity at a high level, it is preferable to add sugar under the above-mentioned feeding conditions.

【０１１０】一般に、植物の細胞又は組織の培養に用い
られる培地の成分の中でも、モル数換算すると糖は比較
的多量に含まれる成分であり、また、窒素源などの他の
多量成分に比べると細胞への取り込み速度が小さいた
め、細胞移植後長時間にわたって、培地の浸透圧に大き
な影響を及ぼすことが知られている。また、培地の浸透
圧が高いと、細胞が原形質分離を起こすことから、細胞
の増殖速度は小さくなることも知られており、培養中の
培地中糖濃度は、細胞の増殖速度を最大にする上で、厳
密な管理を要することが指摘できる。Generally, among the components of the medium used for culturing plant cells or tissues, sugar is a component that is contained in a relatively large amount in terms of moles, and compared with other large components such as nitrogen sources. It is known that since the uptake rate into cells is low, it exerts a great influence on the osmotic pressure of the medium for a long time after cell transplantation. It is also known that when the osmotic pressure of the medium is high, the cells undergo cytoplasmic separation, and thus the growth rate of the cells decreases, and the sugar concentration in the medium during culture maximizes the growth rate of the cells. It can be pointed out that strict management is required for this.

【０１１１】一方、硝酸イオンは、細胞に取り込まれた
後、硝酸態のまま貯蔵されるか、硝酸態窒素によって誘
導される硝酸還元酵素及び亜硝酸還元酵素によってアン
モニア態窒素に変換される。しかし、何らかの原因によ
ってこの硝酸還元の制御が異常をきたした場合には、ア
ンモニア態窒素が細胞内に過剰蓄積し、その毒性のため
に細胞が壊死するおそれもあり、細胞の増殖速度を最大
にする上で、培地中の硝酸イオン濃度も厳密に管理され
るべき因子であると思われる。On the other hand, nitrate ions are taken up by cells and then stored in the nitrate state, or converted into ammonia nitrogen by nitrate reductase and nitrite reductase induced by nitrate nitrogen. However, if the control of nitrate reduction becomes abnormal due to some cause, ammonia nitrogen excessively accumulates in the cells, and its toxicity may cause necrosis of the cells, thus maximizing the growth rate of the cells. In this regard, the concentration of nitrate ion in the medium seems to be a factor to be strictly controlled.

【０１１２】以上のようにして得られた培養組織、培養
細胞、培地等の培養物から、メタノール等の有機溶媒に
よる抽出によってタキサン型ジテルペンを分離すること
ができる。本発明における組織培養の好ましい一例とし
ては、次の方法が挙げられる。先ず、イチイ属に属する
植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子等から
採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウ
ッディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床
し、10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織片の一部を
カルス化させる。このようにして得られたカルスを継代
培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得
られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカル
スの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を
保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものを
いう。The taxane-type diterpenes can be separated from the cultures such as the cultured tissues, cultured cells, and media obtained as described above by extraction with an organic solvent such as methanol. The following method is mentioned as a preferable example of the tissue culture in the present invention. First, a plant of a plant belonging to the genus Taxus, for example, roots, growing points, leaves, stems, after sterilizing plant pieces collected from seeds, etc., placed on a solid medium of Woody Plant Medium solidified with gellan gum. Allow a part of the tissue piece to callus at 10-35 ℃ for 14-60 days. When the callus thus obtained is subcultured, the growth rate gradually increases and a stable callus is obtained. The term "stabilized callus" as used herein refers to one in which a part of the callus does not differentiate into shoots or roots during culture and retains the state of the callus and has a uniform cell growth rate.

【０１１３】この安定化したカルスを増殖に適した液体
培地、例えばウッディー・プラント液体培地に移して増
殖させる。液体培地において更に生育速度が高められ
る。本発明では、この安定化したカルス又は該カルスを
構成する細胞は、培養槽中の培養液の総容量をＶ、新鮮
培地の供給速度をｖ、細胞又は組織の比増殖速度をμと
するとき、無次元数Ｆ＝ｖ／Ｖ／μで定義する培地の比
更新率を０．１〜１０の範囲となるように連続的又は間
欠的に新鮮培地を添加することにより培養され、連続的
もしくは間欠的に槽外に抜き出される細胞もしくは組織
を含む培養液、及び／又は連続的もしくは間欠的に槽外
に抜き出される細胞もしくは組織を含まない培養液から
タキサン型ジテルペンが回収される。The stabilized callus is transferred to a liquid medium suitable for growth, for example, Woody plant liquid medium and grown. The growth rate is further increased in the liquid medium. In the present invention, the stabilized callus or cells constituting the callus is defined as follows: V is the total volume of the culture solution in the culture tank, v is the supply rate of fresh medium, and μ is the specific growth rate of cells or tissues. , A non-dimensional number F = v / V / μ is defined as a specific renewal rate of the medium to be in the range of 0.1 to 10 continuously or intermittently by culturing by adding a fresh medium, continuously or A taxane-type diterpene is recovered from a culture medium containing cells or tissues intermittently extracted from the tank and / or a culture medium containing no cells or tissues extracted continuously or intermittently from the tank.

【０１１４】本発明における組織培養の培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜約28℃が増殖速度
が大きいので好適である。また、培養期間としては、14
〜42日間が好適である。本発明における培養において液
体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカ
ンテーション又は濾過等の方法によって培地から分離
し、培養細胞及び／又は培地から目的とするタキサン型
ジテルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離
することができる。The culture temperature of the tissue culture in the present invention is preferably about 10 to about 35 ° C., particularly about 23 to about 28 ° C. because the growth rate is high. The culture period is 14
~ 42 days are preferred. When a liquid medium is used in the culture in the present invention, the cultured cells are separated from the medium by a method such as decantation or filtration after the culture is completed, and the target taxane-type diterpene is separated from the cultured cells and / or the medium by an organic solvent. It can be separated by a method such as extraction.

【０１１５】[0115]

【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。 （実施例１）ナフタレン酢酸を10^-5M の濃度になるよう
に添加したウッディー・プラント・メディウム（表１）
の固体培地（ゲランガム0.25重量％）に、前もって２％
アンチホルミン溶液又は70％エタノール溶液等で滅菌処
理したセイヨウイチイ(Taxusbaccata LINN)の茎の一部
を置床し、25℃で暗所にて静置培養してセイヨウイチイ
カルスを得た。次にこのカルス１ｇ（新鮮重）を、前記
成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メデ
ィウムの液体培地20ml入りの三角フラスコに移し、ロー
タリーシェーカー上で旋回培養（振幅25mm、100rpm）
し、21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples and comparative examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples. (Example 1) Woody plant medium to which naphthalene acetic acid was added at a concentration of 10 ^-5 M (Table 1)
2% in solid medium (gellan gum 0.25% by weight) in advance
A part of the stem of Taxus baccata LINN, which had been sterilized with an antiformin solution or a 70% ethanol solution, was placed on a bed and cultivated at 25 ° C. in the dark to obtain Taxus callus. Next, 1 g of this callus (fresh weight) was transferred to an Erlenmeyer flask containing 20 ml of Woody Plant Medium liquid medium to which the above components were added at the same concentration, and swirling culture (amplitude 25 mm, 100 rpm) on a rotary shaker.
Then, the callus was planted every 21 days to accelerate the growth rate of the callus.

【０１１６】このようにして得られた培養細胞５０ｇ
（新鮮重）と、ウッディー・プラント・メディウムの液
体培地１リットルを容積２リットルの培養槽に移し、毎
分０．０５リットルの速度で空気を通気しながら、撹拌
速度40rpm 、25℃、暗所で培養を行った。１０日目より
通気速度を０．１リットルに調整して１４日目まで培養
した結果、細胞の沈降容積（ＰＣＶ）は０．２リットル
であった。１４日目から初期培地と同じ組成の新鮮培地
の供給と、細胞濾過フィルターを備えた培地抜きだし口
からの細胞を含まない培養液の抜き出しを開始した。通
気はＰＣＶの１／２容を毎分通気した。新鮮培地の供給
量は１日当たり該時点のＰＣＶの１／２容を指標とし、
細胞を含まない培養液は培養液量を１リットルに保つよ
うに抜き出した。培養開始３０日目にＰＣＶは０．６リ
ットルに達していた。以後、毎日１回細胞を含む培養液
を抜き出して平均のＰＣＶを０．６リットルに保ちなが
ら、細胞を含まない培養液を抜き出すことによって培養
液量を１リットルに保って定常状態を得た。培養開始後
９０日まで培養を継続し、表２に示す結果を得た。６０
日間の定常状態において供給した新鮮培地の量は１８リ
ットル、培養槽から取り出された培地量は１７リット
ル、細胞の収量は０．１９ｋｇ（乾燥重量）で、比増殖
速度μは０．１０（day^-1）、平均の培地比更新率は
３．０であった。得られた細胞及び培地の分析により、
タキソール５５ｍｇが生産されたことが分かった。これ
は０．９２ｍｇ／リットル／日の生産性に相当する。50 g of the cultured cells thus obtained
(Fresh weight) and 1 liter of Woody Plant Medium liquid medium were transferred to a 2 liter capacity culture tank, while aeration was carried out at a rate of 0.05 liter per minute, stirring speed 40 rpm, 25 ° C, dark place Culture was carried out in. From the 10th day, the aeration rate was adjusted to 0.1 liter and the cells were cultured until the 14th day. As a result, the sedimentation volume (PCV) of the cells was 0.2 liter. From the 14th day, the supply of fresh medium having the same composition as the initial medium and the extraction of the cell-free culture medium from the medium extraction port equipped with the cell filtration filter were started. Ventilation was carried out at 1/2 volume of PCV every minute. The amount of fresh medium supplied is 1/2 volume of PCV at that time point per day as an index,
The cell-free culture broth was withdrawn so as to keep the culture volume at 1 liter. PCV reached 0.6 liters 30 days after the start of culture. Thereafter, the culture medium containing cells was extracted once a day to maintain the average PCV at 0.6 liters, while the culture medium containing no cells was extracted to maintain the culture medium volume at 1 liter to obtain a steady state. The culture was continued until 90 days after the start of the culture, and the results shown in Table 2 were obtained. 60
The amount of fresh medium supplied in the steady state for 18 days was 18 liters, the amount of medium taken out from the culture tank was 17 liters, the cell yield was 0.19 kg (dry weight), and the specific growth rate μ was 0.10 (day ^-1 ), and the average medium ratio renewal rate was 3.0. By analysis of the cells and medium obtained,
It was found that 55 mg taxol was produced. This corresponds to a productivity of 0.92 mg / l / day.

【０１１７】細胞中に含まれるタキソールの量は、凍結
乾燥した細胞からメタノール等を用いてタキサン型ジテ
ルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて
標準品タキソール、セファロマニン、バッカチンIII 等
と比較定量して測定した。The amount of taxol contained in the cells was quantified by extracting taxane-type diterpenes from freeze-dried cells with methanol or the like, and using high performance liquid chromatography to compare with taxol, cephalomannine, baccatin III, etc. as standard products. Measured.

【０１１８】[0118]

【表１】 [Table 1]

【０１１９】（実施例２）実施例１と全く同様に培養を
開始し、培養開始１４日目（ＰＣＶ＝０．２リットル）
から、初期培地と同じ組成の培地１リットル当たり、予
め１２ｍＭ硝酸銀水溶液と９６ｍＭチオ硫酸ナトリウム
水溶液を混合して調製したＳＴＳ水溶液を２．１ｍＬ加
えて０．２ｍＭ濃度とした新鮮培地の供給と、細胞を含
まない培養液の抜き出しを開始した。新鮮培地の供給量
は１日当たり該時点のＰＣＶの２／５容とし、細胞を含
まない培養液は培養液量を１リットルに保つように抜き
出した。培養開始３５日目にＰＣＶは０．６リットルに
達していた。以後、毎日１回細胞を含む培養液を抜き出
して平均のＰＣＶを０．６リットルに保ちながら、細胞
を含まない培養液を抜き出すことによって培養液量を１
リットルに保って定常状態を得た。培養開始後９０日ま
で培養を継続し、表２に示す結果を得た。６０日間の定
常状態において供給した新鮮培地の量は１５リットル、
培養槽から取り出された培地量は１４リットル、細胞の
収量は０．１５ｋｇ（乾燥重量）で、比増殖速度μは
０．０８（day^-1）、平均の培地比更新率は２．８８で
あった。得られた細胞及び培地の分析により、タキソー
ル５２５ｍｇが生産されたことが分かった。これは８．
７５ｍｇ／リットル／日の生産性に相当する。Example 2 Culture was started exactly as in Example 1, and 14 days after the start of culture (PCV = 0.2 liter).
From the above, 2.1 mL of STS aqueous solution prepared by previously mixing 12 mM silver nitrate aqueous solution and 96 mM sodium thiosulfate aqueous solution was added to 1 liter of a medium having the same composition as the initial medium to supply a fresh medium having a concentration of 0.2 mM, and cells were added. The extraction of the culture solution containing no broth was started. The supply amount of the fresh medium was set to 2/5 volume of PCV at that time point per day, and the cell-free culture solution was extracted so as to keep the culture solution volume at 1 liter. The PCV reached 0.6 liters 35 days after the start of culture. Thereafter, the culture solution containing cells was extracted once a day to maintain the average PCV at 0.6 liters, and the culture solution containing no cells was withdrawn so that the volume of the culture solution was 1%.
A steady state was obtained by keeping at liter. The culture was continued until 90 days after the start of the culture, and the results shown in Table 2 were obtained. The amount of fresh medium supplied in the steady state for 60 days was 15 liters,
The amount of the medium taken out from the culture tank was 14 liters, the cell yield was 0.15 kg (dry weight), the specific growth rate μ was 0.08 (day ⁻¹ ), and the average medium ratio update rate was 2.88. there were. Analysis of the cells and media obtained revealed that 525 mg taxol was produced. This is 8.
This corresponds to a productivity of 75 mg / liter / day.

【０１２０】（実施例３）定常状態のＦ値を４．７にし
た以外は実施例１と同様に操作した。結果は表２に示し
た。 （実施例４）定常状態のＦ値を４．８にした以外は実施
例２と同様に操作した。結果は表２に示した。Example 3 The same operation as in Example 1 was carried out except that the F value in the steady state was set to 4.7. The results are shown in Table 2. (Example 4) The same operation as in Example 2 was performed except that the F value in the steady state was set to 4.8. The results are shown in Table 2.

【０１２１】（実施例５）定常状態のＦ値を０．７２に
した以外は実施例２と同様に操作した。結果は表２に示
した。 （実施例６）定常状態のＦ値を２．７に、ＳＴＳ水溶液
の代わりにジャスモン酸メチルを０．２ｍＭ添加した以
外は実施例２と同様に操作した。結果は表２に示した。Example 5 The same operation as in Example 2 was carried out except that the F value in the steady state was set to 0.72. The results are shown in Table 2. (Example 6) The operation was performed in the same manner as in Example 2 except that the F value in the steady state was set to 2.7 and 0.2 mM of methyl jasmonate was added instead of the STS aqueous solution. The results are shown in Table 2.

【０１２２】（実施例７）定常状態のＦ値を０．７２に
した以外は実施例６と同様に操作した。結果は表２に示
した。 （実施例８）ＳＴＳ水溶液の代わりにジャスモン酸メチ
ルを０．１ｍＭ濃度で添加した以外は実施例２と同様に
操作した。結果は表２に示した。Example 7 The same operation as in Example 6 was carried out except that the F value in the steady state was set to 0.72. The results are shown in Table 2. (Example 8) The same operation as in Example 2 was performed except that methyl jasmonate was added at a concentration of 0.1 mM instead of the STS aqueous solution. The results are shown in Table 2.

【０１２３】（実施例９）通気する酸素含有ガスの酸素
濃度を１５％にした以外は実施例１と同様に操作した。
結果は表２に示した。 （実施例１０）通気する酸素含有ガスの酸素濃度を７％
にした以外は実施例１と同様に操作した。結果は表２に
示した。(Example 9) The same operation as in Example 1 was carried out except that the oxygen concentration of the oxygen-containing gas to be aerated was changed to 15%.
The results are shown in Table 2. (Example 10) The oxygen concentration of the oxygen-containing gas to be aerated was set to 7%.
The same operation as in Example 1 was carried out except that The results are shown in Table 2.

【０１２４】（実施例１１）通気する酸素含有ガスの炭
酸ガス濃度を加えて４％にした空気を用いた以外は実施
例１と同様に操作した。結果は表２に示した。 （実施例１２）通気する酸素含有ガスの炭酸ガス濃度を
加えて０．５％にした空気を用いた以外は実施例１と同
様に操作した。結果は表２に示した。(Example 11) The same operation as in Example 1 was carried out except that the air was adjusted to 4% by adding the carbon dioxide concentration of the oxygen-containing gas. The results are shown in Table 2. (Example 12) The same operation as in Example 1 was carried out except that the concentration of carbon dioxide gas of the oxygen-containing gas to be aerated was adjusted to 0.5%. The results are shown in Table 2.

【０１２５】（実施例１３）定常状態のＦ値を０．３３
とした以外は実施例２と同様に操作した。結果は表２に
示した。 （実施例１４）定常状態のＦ値を０．３５とした以外は
実施例６と同様に操作した。結果は表２に示した。(Embodiment 13) The F value in the steady state is 0.33.
The same operation as in Example 2 was carried out except that The results are shown in Table 2. (Example 14) The operation was performed in the same manner as in Example 6 except that the F value in the steady state was set to 0.35. The results are shown in Table 2.

【０１２６】（比較例１）実施例１の定常状態の期間に
おけるＦ値を１２とした以外は実施例１と同様に操作し
た。その結果、細胞が変色して壊死したため定常状態は
実現せず、増殖速度が極めて小さくなる現象が認められ
た。その他の結果を表２に示す。 （比較例２）実施例２の定常状態の期間におけるＦ値を
１２とした以外は実施例２と同様に操作した。その結
果、細胞が変色して壊死したため定常状態は実現せず、
増殖速度が極めて小さくなる現象が認められた。その他
の結果を表２に示す。Comparative Example 1 The same operation as in Example 1 was carried out except that the F value in the steady state period of Example 1 was set to 12. As a result, a steady state was not realized because the cells were discolored and necrotic, and a phenomenon in which the growth rate was extremely low was observed. Other results are shown in Table 2. (Comparative Example 2) The same operation as in Example 2 was carried out except that the F value in the steady state period of Example 2 was set to 12. As a result, the cells discolored and became necrotic, so a steady state was not realized,
It was observed that the growth rate was extremely low. Other results are shown in Table 2.

【０１２７】[0127]

【表２】 [Table 2]

【０１２８】[0128]

【発明の効果】本発明によれば、タキサン型ジテルペン
を産生する植物の細胞又は組織を連続的にかつ高密度で
培養することができ、タキサン型ジテルペンを経済的か
つ大量・簡便に得ることが可能となった。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, cells or tissues of a taxane-type diterpene-producing plant can be cultured continuously and at high density, and taxane-type diterpenes can be obtained economically, in large quantities, and easily. It has become possible.

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 タキサン型ジテルペンを産生する植物の
細胞又は組織を培養槽を用いて培養するに当たり、培養
槽中の培養液の総容量をＶ、新鮮培地の供給速度をｖ、
細胞又は組織の比増殖速度をμとするとき、無次元数Ｆ
＝ｖ／Ｖ／μで定義する培地の比更新率を０．１〜１０
の範囲となるように連続的又は間欠的に新鮮培地を添加
し、連続的もしくは間欠的に槽外に抜き出される細胞も
しくは組織を含む培養液、及び／又は連続的もしくは間
欠的に槽外に抜き出される細胞もしくは組織を含まない
培養液からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴
とするタキサン型ジテルペンの製造方法。1. When culturing cells or tissues of a plant producing a taxane-type diterpene in a culture tank, the total volume of the culture solution in the culture tank is V, the supply rate of fresh medium is v,
When the specific growth rate of cells or tissues is μ, the dimensionless number F
= The specific renewal rate of the medium defined by v / V / μ is 0.1 to 10
The culture medium containing cells or tissues that are continuously or intermittently added to the outside of the tank by continuously or intermittently so as to be in the range of, and / or continuously or intermittently outside the tank. A method for producing a taxane-type diterpene, which comprises recovering a taxane-type diterpene from a culture medium that does not contain cells or tissues to be extracted. 【請求項２】 培地の比更新率Ｆが０．５〜５の範囲で
あることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテル
ペンの製造方法。2. The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the specific renewal rate F of the medium is in the range of 0.5 to 5. 【請求項３】 タキサン型ジテルペンを産生する植物が
イチイ属植物であることを特徴とする請求項１又は２記
載のタキサン型ジテルペンの製造方法。3. The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the plant producing the taxane-type diterpene is a Taxus genus plant. 【請求項４】 イチイ属植物が、セイヨウイチイ(Taxus
baccata LINN)、イチイ(T. cuspidata SIEB.et ZUC
C）、キャラボク(T. cuspidata SIEB.et ZUCC var. nan
a REHDER)、タイヘイヨウイチイ(T. brevifolia NUT
T)、カナダイチイ(T. canadiensis MARSH)、中国イチイ
（T. chinensis) 及び T. media よりなる群から選ばれ
た少なくとも１種であることを特徴とする請求項３記載
のタキサン型ジテルペンの製造方法。4. The Taxus is Taxus (Taxus)
baccata LINN), yew (T. cuspidata SIEB.et ZUC
C), Karaboku (T. cuspidata SIEB.et ZUCC var. Nan
a REHDER), T. brevifolia NUT
T), Canadian yew (T. canadiensis MARSH), Chinese yew (T. chinensis), and at least one selected from the group consisting of T. media, The taxane-type diterpene according to claim 3 characterized by the above-mentioned. Method. 【請求項５】 タキサン型ジテルペンが、タキソール、
１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バ
ッカチンIII 、１０−デアセチルバッカチンIII 、７−
エピバッカチンIII 、セファロマニン、１０−デアセチ
ルセファロマニン、７−エピセファロマニン、タキサギ
フィン、タキサン１ａ、キシロシルセファロマニン及び
キシロシルタキソールよりなる群から選ばれる少なくと
も１種であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか
１項に記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。5. The taxane-type diterpene is taxol,
10-deacetyltaxol, 7-epitaxole, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-
2. At least one member selected from the group consisting of epibaccatin III, cephalomannine, 10-deacetylcephalomanin, 7-epicephalomanin, taxifin, taxane 1a, xylosyl cephalomannine and xylosyl taxol. 5. The method for producing a taxane-type diterpene according to any one of items 1 to 4. 【請求項６】 培養槽に通気するガスの炭酸ガス濃度を
大気中の炭酸ガス濃度以上とすることを特徴とする請求
項１〜５のいずれか１項に記載のタキサン型ジテルペン
の製造方法。6. The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the carbon dioxide concentration of the gas aerated in the culture tank is equal to or higher than the carbon dioxide concentration in the atmosphere.