JP3434892B2 - Method for producing taxane-type diterpene - Google Patents
Method for producing taxane-type diterpeneInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等
の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型
ジテルペンの製造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a taxane-type diterpene containing taxol which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and the like.
【０００２】[0002]
【従来の技術】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有
用であるタキソール(Taxol) は、イチイ科イチイ属植物
であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT) よ
り単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と
関連する複雑なエステルグループを有している。タキソ
ールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在
し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。
現在、タキソールは天然の又は栽培された植物体から採
取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高さに
成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であり、
また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に大量
のタキソールを得ることは困難である。もし、タキソー
ル又はタキソールの前駆物質であるバッカチンIII(bacc
atin III)等のタキサン型ジテルペンを組織培養を利用
して生産することができれば、樹木を伐採することな
く、大量のタキソールを容易に得ることができるので有
利である。2. Description of the Related Art Taxol, which is useful as a therapeutic drug for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, etc., is a taxane-type diterpene isolated and identified from Taxus brevifolia NUTT, which is a Taxus genus plant. Yes, with complex ester groups associated with activity. It has been reported that taxol is present in every part of the yew plant, and its content is highest in the bark.
Currently, taxol is collected from natural or cultivated plants, but yew plants are slow growing plants that take more than 10 years to grow to a height of 20 cm above the ground,
Moreover, it is difficult to easily obtain a large amount of taxol because the tree will die when the bark is peeled off. If taxol or the precursor of taxol, baccatin III (baccin III
If taxane-type diterpenes such as atin III) can be produced by using tissue culture, it is advantageous because a large amount of taxol can be easily obtained without cutting trees.
【０００３】これまでの植物の培養細胞を利用したタキ
ソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ(Taxus
brevifolia NUTT) 培養細胞による生産方法が米国で特
許（米国特許第5019504 号）になっているが、そのタキ
ソール生産量は１〜3mg/l と記載されており、工業的生
産には不十分である。また、細胞培養によるタキソール
の生産性は不安定であり、選抜で一次的に生産性の高い
細胞が得られても、継代培養してその含量を維持するこ
とは難しい［E.R.M.Wickremesine et al., World Congr
ess on Cell and Tissue Culture(1992)］。Regarding the taxol production method using the cultured cells of the plant up to now, there is a method of producing Taxol (Taxus taxi).
brevifolia NUTT) The production method using cultured cells has been patented in the United States (US Pat. No. 5019504), but the taxol production is stated to be 1 to 3 mg / l, which is insufficient for industrial production. . Further, the productivity of taxol in cell culture is unstable, and it is difficult to maintain its content by subculture even if cells with high productivity are obtained by selection [ERMWickremesine et al., World Congr
ess on Cell and Tissue Culture (1992)].
【０００４】一方、タキソール生産法の先行技術として
は、タキソール生合成前駆体であるバッカチンIII から
の半合成法がHoltonらの米国特許第5015744 号明細書に
開示されている。植物の組織培養法を用いれば、バッカ
チンIII 等の半合成原料の生産も可能であり、前記半合
成法によるタキソール生産にも利用できる。On the other hand, as a prior art of the taxol production method, a semi-synthesis method from taxol biosynthesis precursor baccatin III is disclosed in US Pat. No. 5,015,744 to Holton et al. By using the tissue culture method of a plant, a semi-synthetic raw material such as baccatin III can be produced, and it can also be used for taxol production by the semi-synthetic method.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物組織培
養によるタキサン型ジテルペンの簡便な製造方法を提供
することを目的とする。An object of the present invention is to provide a simple method for producing taxane-type diterpenes by culturing plant tissues.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及
び／又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の
酸素濃度を大気中の酸素濃度未満の条件下に培養初期か
ら制御して培養を行うか、或いは組織及び／又は細胞と
接する流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度におけ
る飽和溶存酸素濃度未満である条件下に培養初期から制
御して培養を行うと、タキサン型ジテルペン生産性が向
上することを見出し、本発明を完成するに至った。As a result of earnest studies, the present inventors have found that when culturing tissues and / or cells of plants producing taxane-type diterpenes, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator was changed to atmospheric pressure. Under the condition that the oxygen concentration in the fluid medium that is in contact with the tissue and / or cells is less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature, the culture is carried out by controlling the culture from the initial stage of the culture under the condition of less than the oxygen concentration in the medium. It was found that the taxane-type diterpene productivity is improved by controlling the culture from the initial stage of the culture, and completed the present invention.
【０００７】即ち、本発明は、タキサン型ジテルペンを
産生する植物の組織及び／又は細胞を培養するに当た
り、培養器内の気相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未
満の条件下に培養初期から制御して培養を行うか、或い
は組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸
素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度未満である
条件下に培養初期から制御して培養を行い、得られる培
養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴と
するタキサン型ジテルペンの製造方法である。That is, the present invention is for culturing tissue and / or cells of a plant producing a taxane-type diterpene, in which the initial oxygen concentration in the gas phase in the incubator is less than the atmospheric oxygen concentration. Or controlled culture from the beginning of the culture under conditions where the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue and / or cells is less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature, the culture is performed, A method for producing a taxane-type diterpene, which comprises recovering the taxane-type diterpene from the obtained culture.
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、
タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はな
く、例えばタキソール、１０−デアセチルタキソール、
７−エピタキソ−ル、バッカチンIII 、１０−デアセチ
ルバッカチンIII 、７−エピバッカチンIII 、セファロ
マニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセ
ファロマニン、タキサギフィン及びその類縁体、キシロ
シルセファロマニン、キシロシルタキソール等が挙げら
れる。The present invention will be described in detail below. The taxane-type diterpene to be the subject of the production method of the present invention,
There is no particular limitation as long as it is a diterpene having a taxane skeleton, and for example, taxol, 10-deacetyltaxol,
7-Epitaxol, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-epibaccatin III, cephalomannine, 10-deacetylcephalomanin, 7-epicephalomanin, taxagifin and its analogs, xylosylcephalomanin, xylosyl Examples include taxol.
【０００９】本発明の製造方法に用いられるタキサン型
ジテルペンを産生する植物としては、例えば、セイヨウ
イチイ(Taxus baccata LINN)、イチイ(T. cuspidata SI
EB.et ZUCC) 、キャラボク(T. cuspidata SIEB.et ZUCC
var. nana REHDER)、タイヘイヨウイチイ(T. brevifol
ia NUTT)、カナダイチイ(T. canadiensis MARSH)、中国
イチイ(T. chinensis)、T.media 等のイチイ属植物が挙
げられる。The taxane-type diterpene-producing plants used in the production method of the present invention include, for example, common yew (Taxus baccata LINN) and yew (T. cuspidata SI
EB.et ZUCC), Karaboku (T. cuspidata SIEB.et ZUCC
var.nana REHDER), Taihei Yew (T. brevifol
ia NUTT), Canadian yew (T. canadiensis MARSH), Chinese yew (T. chinensis), and T. media.
【００１０】前記植物の培養は、本発明により、植物の
組織及び／又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気
相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未満の条件下に培養
初期から制御して培養を行うか、或いは組織及び／又は
細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度
における飽和溶存酸素濃度未満である条件下に培養初期
から制御して培養を行うこと以外は、従来から知られて
いる方法によって行うことができる。According to the present invention, when culturing plant tissues and / or cells, the plant culture is controlled from the initial stage of culture under conditions where the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is lower than the oxygen concentration in the atmosphere. Except that the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissue and / or cells is controlled from the initial stage of culture under the condition of being less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature. , Can be performed by a conventionally known method.
【００１１】従来、タキサン型ジテルペン産生植物の培
養において、組織及び／又は細胞を培養する培養器に供
給する気相中の酸素濃度、或いは組織及び／又は細胞と
接する培地の溶存酸素濃度を、大気中の酸素濃度未満の
条件下に制御して培養を行うか、或いは飽和溶存酸素濃
度未満の条件下に制御して培養を行った例は報告されて
おらず、しかもそれによりタキサン型ジテルペンの産生
量が増大することは予想外のことであった。Conventionally, in the culture of taxane-type diterpene-producing plants, the oxygen concentration in the gas phase supplied to the incubator for culturing tissues and / or cells, or the dissolved oxygen concentration of the medium in contact with the tissues and / or cells, is determined by the atmospheric pressure. No case has been reported in which culture was performed under controlled conditions of less than the oxygen concentration in the medium, or under controlled conditions of less than the saturated dissolved oxygen concentration, and the production of taxane-type diterpenes was thereby reported. The increase in volume was unexpected.
【００１２】本発明において、組織及び／又は細胞を培
養する培養器内の気相中の酸素濃度は、４ないし15％に
制御することが必要であり、特に６ないし12％に制御す
ることが好ましい。また、組織及び／又は細胞と接する
流動性の培地中の溶存酸素濃度は、その温度における飽
和溶存酸素濃度値の１ないし75％に制御することが必要
であり、特に10ないし75％に制御することが好ましい。In the present invention, it is necessary to control the oxygen concentration in the gas phase in the incubator for culturing tissues and / or cells to 4 to 15%, particularly 6 to 12%. preferable. Further, the dissolved oxygen concentration in the fluid medium contacting the tissue and / or cells needs to be controlled to 1 to 75% of the saturated dissolved oxygen concentration value at that temperature, and particularly 10 to 75% is controlled. It is preferable.
【００１３】本発明に使用される培地としては、従来か
ら知られている植物の組織培養に用いられる培地、例え
ばムラシゲ・スクーグ(1962 年) ［Murashige & Skoog
］の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965 年) ［Lin
smaier Skoog ］の培地、ウッディー・プラント・メデ
ィウム(1981 年) ［Woody Plant Medium］の培地、ガン
ボルグ［Gamborg ］のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等
が挙げられる。The medium used in the present invention is a conventionally known medium used for tissue culture of plants, such as Murashige & Skoog (1962) [Murashige & Skoog].
] Medium, Rinsmeier Scoog (1965) [Lin
smaier Skoog] medium, Woody Plant Medium (1981) [Woody Plant Medium] medium, Gamborg B-5 medium, Mitsui M-9 medium and the like.
【００１４】これら培地に植物ホルモンを添加し、更に
必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸
等を添加することもできる。炭素源としては、シュクロ
ース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコー
ス、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、デンプン
或いはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合した
ものを使用できる。Plant hormones may be added to these media, and if necessary, carbon sources, inorganic components, vitamins, amino acids and the like may be added. As the carbon source, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, monosaccharides such as glucose, fructose and galactose, starch, or a mixture of two or more of these sugar sources in an appropriate ratio can be used.
【００１５】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。Examples of the inorganic component include phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, sulfur, iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine, sodium, iodine and cobalt. These components are, for example, Potassium nitrate, sodium nitrate, calcium nitrate,
Potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium sulfate, ferrous sulfate, ferric sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, boric acid, copper sulfate, sodium molybdate, It can be added as a compound such as molybdenum trioxide, potassium iodide, or cobalt chloride.
【００１６】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA) 、ナフタレン酢酸(NAA)、２, ４−ジクロロ
フェノキシ酢酸(2,4-D) 等のオーキシン類、カイネチ
ン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類
が用いられる。ビタミン類としては、例えばビオチン、
チアミン（ビタミンＢ1 ）、ピリドキシン（ビタミンＢ
6 ）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用
いられる。Examples of plant hormones include auxins such as indoleacetic acid (IAA), naphthaleneacetic acid (NAA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and cytokinins such as kinetin, zeatin and dihydrozeatin. Kinds are used. Examples of vitamins include biotin,
Thiamin (vitamin B 1 ), pyridoxine (vitamin B 1
6 ), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid, etc. are used.
【００１７】アミノ酸類としては、例えばグリシン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。一般に前記の各成分は、炭素源が約１〜
約30g/l 、無機成分が約0.1 μM 〜約100mM 、植物ホル
モン類が約0.01〜約10μM 、ビタミン類及びアミノ酸類
がそれぞれ約0.1 〜約100mg/l の濃度で用いられる。As amino acids, for example, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine and the like can be added. Generally, each of the above components has a carbon source of about 1 to
It is used at a concentration of about 30 g / l, an inorganic component of about 0.1 μM to about 100 mM, a plant hormone of about 0.01 to about 10 μM, and vitamins and amino acids of about 0.1 to about 100 mg / l, respectively.
【００１８】なお、本発明には液体培地及び寒天やゲラ
ンガム等を通常0.1 〜１％含有する固形培地のいずれも
使用できる。本発明における組織培養においては、前記
植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の
組織片又は細胞、或いはこれらを前記培地或いは他の従
来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用
することができる。In the present invention, both a liquid medium and a solid medium containing agar, gellan gum or the like in an amount of usually 0.1 to 1% can be used. In the tissue culture of the present invention, the plant roots, growth points, leaves, stems, seeds, pollen, anthers, tissue pieces or cells such as sepals, or these tissue culture in the medium or other conventional medium The resulting cultured cells can be used.
【００１９】また、本発明は、Agrobacterium tumefaci
ens 又はAgrobacterium rhizogenesによる感染によって
得られる腫瘍細胞及び／又は毛状根に適用することもで
きる。これらの組織及び／又は細胞を培養するに当た
り、培養器内の気相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未
満の条件下に培養初期から制御して培養を行うか、或い
は組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸
素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度未満である
条件下に培養初期から制御して培養を行うと、通常の培
養条件下で組織培養した場合と比較してタキサン型ジテ
ルペン生産性の高い培養組織又は培養細胞が得られる。The present invention also relates to Agrobacterium tumefaci
It can also be applied to tumor cells and / or hairy roots obtained by infection with ens or Agrobacterium rhizogenes . When culturing these tissues and / or cells, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled from the initial stage of culture under conditions where the oxygen concentration in the incubator is less than the oxygen concentration in the atmosphere, or the tissues and / or cells are cultured. When the culture is carried out by controlling the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the culture medium from the initial stage of culture under the condition that the dissolved oxygen concentration at that temperature is less than the saturated dissolved oxygen concentration, compared with the case of tissue culture under normal culture conditions. A cultured tissue or cells having high taxane-type diterpene productivity can be obtained.
【００２０】本発明において、培養初期とは、培養開始
時ないし培養開始後７日目をいい、培養器内の気相中の
酸素濃度、又は組織及び／又は細胞と接する流動性の培
地中の溶存酸素濃度の制御は、培養開始時から行うこと
が好ましい。また、制御の期間としては、培養全期間を
通して該条件に制御してもよいし、培養全期間中の一部
期間のみを制御してもよく、特に限定するものではない
が、全培養期間中の、少なくとも３日間制御することが
好ましい。[0020] In the present invention, the term "early stage of culture" refers to the start of culture or the 7th day after the start of culture, and the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the fluid medium in contact with tissues and / or cells. It is preferable to control the dissolved oxygen concentration from the start of culture. The period of control may be controlled to the conditions throughout the entire culture period, or may be controlled only for a part of the entire culture period, and is not particularly limited, but during the entire culture period. It is preferable to control for at least 3 days.
【００２１】本発明の製造方法は、各種のタキサン型ジ
テルペンの生産促進物質の存在下に培養する方法と併用
することにより、タキサン型ジテルペンの生産性を更に
高めることができる。タキサン型ジテルペンの生産促進
物質としては、例えば、特願平６−１０４２１３号明細
書に開示されている一般式（Ｉ）：The productivity of the taxane-type diterpene can be further enhanced by using the production method of the present invention in combination with a method of culturing in the presence of various taxane-type diterpene production-promoting substances. Examples of the taxane-type diterpene production promoter include general formula (I) disclosed in Japanese Patent Application No. 6-104213:
【００２２】[0022]
【化２】
［式中、Ｒ1 は炭素数１〜４のアルキル基又は次式：
−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ−Ｒ6
（式中、Ｒ6 は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金
属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ4 を表す。）、
ＮＨＲ7 （ここで、Ｒ7 は、水素原子、炭素数１〜４の
アシル基、炭素数１〜４のアルキル基又はアミノ酸残基
を表す。）又はＯＲ8 （ここで、Ｒ8 は炭素数１〜４の
アルキル基又は炭水化物残基を表す。）を表し、ｎは１
〜７の整数を表す。）で示される基を表し；Ｒ2 、
Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は、それぞれ水素原子を表すか、或
いはＲ2 とＲ3 、Ｒ3 とＲ4 、又はＲ4とＲ5 は、共同
して二重結合を表してもよく；前記５員環は、更に水酸
基で置換されていてもよく、隣接する環員炭素原子間で
二重結合を形成してもよい。］で示されるジャスモン酸
類、特願平６−１０４２１１号明細書に開示されている
一般式（II）：[Chemical 2] [Wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or the following formula: — (CH 2 ) n —CO—R 6 (wherein, R 6 is a hydroxyl group, OM (where M is an alkali metal atom, Represents an alkaline earth metal atom or NH 4 ),
NHR 7 (here, R 7 represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or an amino acid residue) or OR 8 (wherein R 8 is the number of carbon atoms). 1 to 4 represents an alkyl group or a carbohydrate residue), and n is 1
Represents an integer of ~ 7. It represents a group represented by); R 2,
R 3 , R 4 and R 5 each represent a hydrogen atom, or R 2 and R 3 , R 3 and R 4 , or R 4 and R 5 may jointly represent a double bond; The 5-membered ring may be further substituted with a hydroxyl group, and may form a double bond between adjacent ring member carbon atoms. ] Jasmonic acid represented by the general formula (II) disclosed in Japanese Patent Application No. 6-104211:
【００２３】[0023]
【化３】
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は前記と同義
であり、Ｒ9 は水酸基又は−Ｏ−炭水化物残基を表
す。）で示されるジャスモン酸類、特願平６−１０４２
１２号明細書に開示されている一般式 (III)：[Chemical 3] (In the formula, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 have the same meanings as described above, and R 9 represents a hydroxyl group or an —O-carbohydrate residue.) -1042
No. 12 discloses the general formula (III):
【００２４】[0024]
【化４】
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は前記と同義
である。）で示されるジャスモン酸類が挙げられる。前
記一般式（Ｉ）、（II）及び (III)において、Ｒ1 、Ｒ
7 又はＲ8 で表される炭素数１〜４のアルキル基として
は、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソ
プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル
基、ｔ−ブチル基が挙げられる。[Chemical 4] (In the formula, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 have the same meanings as described above.) And the jasmonic acids. In the general formulas (I), (II) and (III), R 1 , R
Examples of the alkyl group having 1 to 4 carbon atoms represented by 7 or R 8 include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, t-butyl group. Groups.
【００２５】Ｒ6 がＯＭである場合において、Ｍで表さ
れるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子として
は、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げら
れる。Ｒ6 がＮＨＲ7 である場合において、Ｒ7 で表さ
れる炭素数１〜４のアシル基は、直鎖、分岐鎖のいずれ
でもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニ
ル基、ブチリル基、アクリロイル基が挙げられる。When R 6 is OM, examples of the alkali metal atom or the alkaline earth metal atom represented by M include sodium, potassium and calcium. When R 6 is NHR 7 , the acyl group having 1 to 4 carbon atoms represented by R 7 may be linear or branched and includes, for example, formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, acryloyl. Groups.
【００２６】Ｒ6 がＮＨＲ7 である場合において、Ｒ7
で表されるアミノ酸残基としては、例えばイソロイシル
基、チロシル基、トリプトフィル基が挙げられる。Ｒ6
がＯＲ8 である場合において、Ｒ8 で表される炭水化物
残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられ
る。前記一般式（II）において、Ｒ9 が−Ｏ−炭水化物
残基である場合における炭水化物残基としては、例えば
グルコピラノシル基が挙げられる。In the case where R 6 is NHR 7 , R 7
Examples of the amino acid residue represented by are an isoleucyl group, a tyrosyl group, and a tryptophyll group. R 6
When R is OR 8 , the carbohydrate residue represented by R 8 is, for example, a glucopyranosyl group. In the general formula (II), examples of the carbohydrate residue when R 9 is an —O-carbohydrate residue include a glucopyranosyl group.
【００２７】前記一般式（Ｉ）、（II）又は (III)で示
される化合物の好ましいものとしては、Ｒ1 が−（ＣＨ
2 ）n ＣＯＯＨ又は−（ＣＨ2 ）n ＣＯＯＣＨ3 であ
り、Ｒ 2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 が、それぞれ水素原子を
表すか、或いはＲ2 とＲ3 、Ｒ 3 とＲ4 、又はＲ4 とＲ
5 が、共同して二重結合を表す化合物が挙げられる。前
記一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸類の好ましい具
体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられ
る。The compound represented by the above general formula (I), (II) or (III)
Preferred compounds include1Is-(CH
2)nCOOH or-(CH2)nCOOCH3And
R 2, R3, RFourAnd RFiveBut each has a hydrogen atom
Represent or R2And R3, R 3And RFour, Or RFourAnd R
FiveHowever, compounds that jointly represent a double bond can be mentioned. Previous
Preferred ingredient of jasmonic acid represented by general formula (I)
Examples of the body include the compounds shown below.
It
【００２８】（化合物Ａ）
Ｒ1 ：−（ＣＨ2 ）n ＣＯＯＨ又は−（ＣＨ2 ）n ＣＯ
ＯＣＨ3
（ｎ＝１〜３）
Ｒ2 ，Ｒ3 ：Ｈ
Ｒ4 ＋Ｒ5 ：二重結合[0028] (Compound A) R 1 :-( CH 2) n COOH or - (CH 2) n CO
OCH 3 (n = 1 to 3) R 2 , R 3 : HR R 4 + R 5 : double bond
【００２９】（化合物Ｂ）
Ｒ1 ：−ＣＨ2 ＣＯＯＨ
Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 ，Ｒ5 ：Ｈ
また、前記一般式（Ｉ）で示される化合物は、５員環
が、更に水酸基で置換されていてもよく、隣接する環員
炭素原子間で二重結合を形成してもよい。５員環が、更
に水酸基で置換された化合物、又は隣接する環員炭素原
子間で二重結合が形成された化合物の具体例としては、
例えば、以下に示す化合物が挙げられる。(Compound B) R 1 : -CH 2 COOH R 2 , R 3 , R 4 , R 5 : H In the compound represented by the general formula (I), the 5-membered ring is further substituted with a hydroxyl group. Or a double bond may be formed between adjacent ring member carbon atoms. Specific examples of the compound in which the 5-membered ring is further substituted with a hydroxyl group, or the compound in which a double bond is formed between adjacent ring member carbon atoms are:
For example, the compounds shown below may be mentioned.
【００３０】（化合物Ｃ）(Compound C)
【化５】 （化合物Ｄ）[Chemical 5] (Compound D)
【化６】 [Chemical 6]
【００３１】（化合物Ｅ）(Compound E)
【化７】 [Chemical 7]
【００３２】（化合物Ｆ）(Compound F)
【化８】
前記一般式（II）で示されるジャスモン酸類の好ましい
具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられ
る。[Chemical 8] Preferred specific examples of the jasmonic acids represented by the general formula (II) include the compounds shown below.
【００３３】（化合物Ｇ）(Compound G)
【化９】 [Chemical 9]
【００３４】（化合物Ｈ）(Compound H)
【化１０】 [Chemical 10]
【００３５】（化合物Ｉ）(Compound I)
【化１１】 [Chemical 11]
【００３６】（化合物Ｊ）(Compound J)
【化１２】
前記一般式 (III)で示されるジャスモン酸類の好ましい
具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられ
る。[Chemical 12] Preferred specific examples of the jasmonic acids represented by the general formula (III) include the compounds shown below.
【００３７】（化合物Ｋ）(Compound K)
【化１３】 [Chemical 13]
【００３８】（化合物Ｌ）(Compound L)
【化１４】 [Chemical 14]
【００３９】（化合物Ｍ）(Compound M)
【化１５】 [Chemical 15]
【００４０】（化合物Ｎ）(Compound N)
【化１６】
前記ジャスモン酸類には種々の立体異性体（シストラン
ス異性体、光学異性体）が存在するが、それぞれの異性
体を単独で用いても、混合物の形で用いてもよい。[Chemical 16] The jasmonic acids have various stereoisomers (cis trans isomer, optical isomer), and each isomer may be used alone or in the form of a mixture.
【００４１】以上のジャスモン酸類は、全てタキサン型
ジテルペンの生産性向上に効果を有するが、中でも前記
一般式（Ｉ）においてＲ1 が−ＣＨ2 ＣＯＯＨ又は−Ｃ
Ｈ2ＣＯＯＣＨ3 であり、Ｒ2 及びＲ3 が水素原子であ
り、Ｒ4 とＲ5 が共同して二重結合を形成している化合
物であるジャスモン酸又はジャスモン酸メチル、ツベロ
ン酸又はツベロン酸メチル、及びククルビン酸又はクク
ルビン酸メチルが生産性向上に対する効果の大きさの点
から特に好ましい。The above jasmonic acids are all effective in improving the productivity of taxane-type diterpenes. Among them, in the general formula (I), R 1 is —CH 2 COOH or —C.
H 2 COOCH 3 , R 2 and R 3 are hydrogen atoms, and R 4 and R 5 jointly form a double bond, jasmonic acid or methyl jasmonate, tuberonic acid or tuberonic acid. Methyl and cucurbic acid or methyl cucurbitate are particularly preferable from the viewpoint of the degree of the effect on the productivity improvement.
【００４２】これらジャスモン酸類は、合成により、又
は植物からの抽出等により調製される（H. Yamane et a
l., Agric. Biol. Chem., 44, 2857-2864(1980) ）。一
方、ジャスモン酸類は、生長促進や組織の成熟、病害抵
抗性の発現にかかわる諸反応を誘起する植物ホルモン様
物質として、種々の植物が自ら生産することが、吉原照
彦著、植物細胞工学第２巻第４号５２３〜５３１頁（１
９９０年）に記載されている。These jasmonic acids are prepared synthetically or by extraction from plants (H. Yamane et a
L., Agric. Biol. Chem., 44 , 2857-2864 (1980)). On the other hand, jasmonic acid is a plant hormone-like substance that induces various reactions involved in growth promotion, tissue maturation, and expression of disease resistance. Volume 4, page 523-531 (1
990).
【００４３】従って、前記ジャスモン酸類は、培養系外
から添加するほかに、使用する培養細胞又は培養組織に
自ら生産させることもできる。この内在性ジャスモン酸
類の培養細胞又は培養組織による生産を促進する方法と
しては、微生物の培養物又はその抽出物、熱処理物或い
は植物抽出物などの培地への添加を例示することがで
き、具体的にはM.J.Mueller et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.,90(16),7490-7494 (1993) に記載の、
カビ細胞壁画分を添加する方法を例示することができ
る。更に、使用する培養細胞又は培養組織に、機械的に
又は紫外線、熱などによって部分的に傷害を与えること
によっても、内在性ジャスモン酸の生産量を高めること
が可能であり、具体的には、R.A.Cleeman et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,89(11), 4938-4941 (198
9) に記載の、機械的に一部の細胞を破壊する方法を例
示することができる。Therefore, the jasmonic acids can be produced by the cultured cells or tissue to be used, in addition to being added from outside the culture system. As a method of promoting the production of this endogenous jasmonic acid by the cultured cells or the cultured tissue, it is possible to exemplify the addition of the culture of the microorganism or its extract, the heat-treated product or the plant extract to the medium. MJ Mueller et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 90 (16), 7490-7494 (1993),
A method of adding the mold cell wall fraction can be exemplified. Furthermore, it is also possible to increase the production amount of endogenous jasmonic acid by mechanically or partially damaging the cultured cells or tissue to be used with ultraviolet rays, heat, etc., specifically, RACleeman et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (11), 4938-4941 (198
The method for mechanically destroying a part of cells described in 9) can be exemplified.
【００４４】ジャスモン酸類は、水に対して難溶性のた
め、通常エタノール、メタノール等の有機溶媒、又は界
面活性剤等に溶解した後、培地に添加する。また、遊離
形のジャスモン酸類は、そのまま用いてもよいし、アル
カリで中和して塩にして用いてもよい。ジャスモン酸類
は、５員環カルボニル基のα位が、酸、アルカリ、熱に
よってエピマー化を起こすため、不安定なシス型より安
定なトランス型になりやすい。天然又は合成ジャスモン
酸を用いた平衡実験では、トランス型が９０％、シス型
が１０％の状態で存在する。一般にはシス型の方が活性
が強いとされているが、本発明で使用することができる
ジャスモン酸類は、前記式（Ｉ）で示される全ての立体
異性体化合物及びその混合物を包含する。Since jasmonic acids are poorly soluble in water, they are usually dissolved in an organic solvent such as ethanol or methanol, or a surfactant, and then added to the medium. The free form of jasmonic acid may be used as it is, or may be neutralized with an alkali to form a salt. The α-position of the 5-membered ring carbonyl group of jasmonic acids causes epimerization by an acid, an alkali, or heat, and thus tends to be a stable trans type rather than an unstable cis type. In the equilibrium experiment using natural or synthetic jasmonic acid, the trans form is present in 90% and the cis form is present in 10%. Generally, the cis type is more active, but the jasmonic acids that can be used in the present invention include all stereoisomeric compounds represented by the above formula (I) and a mixture thereof.
【００４５】ジャスモン酸類は、培地における濃度が0.
01〜1000μＭとすることが必要であり、この中でも特に
ジャスモン酸類の濃度を 0.1〜500 μＭの範囲に調整す
ることが好ましい。ジャスモン酸類は、培養細胞の増殖
期ないし定常期に添加することが効果的であり、この中
でも特に増殖期から定常期に移行する時期にジャスモン
酸類を添加することが好ましい。また、内在性ジャスモ
ン酸類の生産量を高めるための処理の時期についてもこ
れと同様である。例えば、21日おきに細胞を移植してい
る場合には７〜16日目がジャスモン酸類の添加又は内在
性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の適期に
あたる。また、ジャスモン酸類の添加及び内在性ジャス
モン酸類の生産量を高める処理は、一度に行ってもよい
し、複数回に分けて行ってもよい。Jasmonic acids have a concentration of 0.
It is necessary to adjust the concentration to 01 to 1000 μM, and it is particularly preferable to adjust the concentration of jasmonic acids in the range of 0.1 to 500 μM. It is effective to add the jasmonic acids during the growth phase or stationary phase of the cultured cells, and among these, it is particularly preferable to add the jasmonic acids during the transition from the growth phase to the stationary phase. The timing of the treatment for increasing the production of endogenous jasmonic acids is also the same. For example, when cells are transplanted every 21 days, the 7th to 16th days are the appropriate period of the treatment for adding jasmonic acids or increasing the production amount of endogenous jasmonic acids. The addition of the jasmonic acids and the treatment for increasing the production amount of the endogenous jasmonic acids may be performed once or may be performed in multiple times.
【００４６】また、本発明は、特願平５−２８４８９３
号、同６−１０４２１３号明細書に開示されている、細
胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも１つ
の層に含まれる細胞を培養する方法と併用することもで
きる。細胞を比重によって分離する方法としては、一般
に遠心分離用媒体を用いて密度勾配を作成し、細胞を重
層した後、遠心分離する方法が知られている。The present invention also relates to Japanese Patent Application No. 5-284893.
No. 6-104213, the method of dividing cells into a plurality of layers according to the difference in specific gravity and culturing the cells contained in at least one layer can be used together. As a method for separating cells by specific gravity, generally known is a method in which a density gradient is created using a medium for centrifugation, the cells are overlaid, and then the cells are centrifuged.
【００４７】遠心分離用媒体としては、Ficoll、Percol
l （共にPharmacia LKB Biotechnology 社製）、ショ
糖、塩化セシウム等が用いられる。密度勾配を形成する
層の数に特に制限はない。各層の比重差は、特に限定さ
れるものではなく、また各比重差は同じであっても異な
っていてもよい。従って、この密度勾配の定義には勾配
が連続的に変化する場合（密度勾配を形成する層の数が
無限大、各層の比重差が０に近い状態）も含む。Ficoll and Percol are used as the medium for centrifugation.
l (both manufactured by Pharmacia LKB Biotechnology), sucrose, cesium chloride and the like are used. There is no particular limitation on the number of layers forming the density gradient. The specific gravity difference between the layers is not particularly limited, and the specific gravity differences may be the same or different. Therefore, the definition of the density gradient includes the case where the gradient changes continuously (the number of layers forming the density gradient is infinite, and the difference in specific gravity between layers is close to 0).
【００４８】このようにして密度勾配を形成し、細胞を
重層、遠心分離することにより細胞を比重の違いにより
複数の層に分けることができる。作成する層の比重は、
通常1.00〜1.20g/ml、好ましくは1.03〜1.11g/mlの範囲
である。培養の対象となる層としては、少なくとも１つ
の層を選択し、また全ての層を選択して培養してもよ
い。By thus forming a density gradient and superimposing the cells on one another and centrifuging, the cells can be divided into a plurality of layers according to the difference in specific gravity. The specific gravity of the layer to be created is
It is usually in the range of 1.00 to 1.20 g / ml, preferably 1.03 to 1.11 g / ml. As the layer to be cultured, at least one layer may be selected, or all layers may be selected and cultured.
【００４９】複数の層を選択して培養する場合、これら
の複数の層は、それぞれ個別に培養することもできる
が、選択した複数の層のうちの２層以上の層を混合して
培養することもできる。タキサン型ジテルペン産生能の
高い培養細胞は、通常、比重が1.07以下の層に含まれる
細胞を培養して得られるが、培養する細胞や培養の条件
により変動する場合があり、必ずしもこの範囲に限定さ
れるものではない。また、単に比重の違いによって分画
しただけでは、比重の高い層の細胞の方がタキサン型ジ
テルペン含量が高くなる傾向が認められる。従って、よ
り確実にタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を取得す
るためには、分画された全ての層の細胞を一定期間培養
した後、各層の細胞に含まれるタキサン型ジテルペン濃
度を測定し、それらの中からタキサン型ジテルペン高産
生細胞を含む層を選択することが望ましい。When a plurality of layers are selected and cultured, these plurality of layers can be individually cultured, but two or more layers of the selected plurality of layers are mixed and cultured. You can also Cultured cells with high taxane-type diterpene-producing ability are usually obtained by culturing cells contained in a layer having a specific gravity of 1.07 or less, but may vary depending on the cells to be cultivated and the conditions of the culture, and are not necessarily limited to this range. It is not something that will be done. Further, it is recognized that the cells in the layer having a high specific gravity tend to have a higher taxane-type diterpene content simply by fractionating the cells by the difference in the specific gravity. Therefore, in order to more reliably obtain the taxane-type diterpene high-producing cultured cells, after culturing the cells of all the fractionated layers for a certain period of time, the taxane-type diterpene concentration contained in the cells of each layer is measured, and Among these, it is desirable to select a layer containing highly taxane-type diterpene-producing cells.
【００５０】また、例えば1.07g/mlのように、ある１つ
の特定の比重の遠心分離媒体を作成し、前述の方法で遠
心分離することによっても、培養細胞を比重の違いによ
り複数の層に分けることができる。また、本発明の製造
方法は、前述したジャスモン酸類の存在下に培養する方
法と細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくと
も１つの層に含まれる細胞を培養する方法の両者と併用
することもできる。以上のようにして得られた培養組
織、培養細胞、培地等の培養物から、メタノール等の有
機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離
することができる。Further, by preparing a centrifuge medium having a specific gravity such as 1.07 g / ml and centrifuging by the above-mentioned method, the cultured cells are divided into a plurality of layers due to the difference in specific gravity. Can be divided. Further, the production method of the present invention is used in combination with both the aforementioned method of culturing in the presence of jasmonic acids and the method of culturing cells contained in at least one layer by dividing the cells into a plurality of layers according to the difference in specific gravity. You can also The taxane-type diterpenes can be separated from the cultures such as culture tissues, culture cells, and cultures obtained as described above by extraction with an organic solvent such as methanol.
【００５１】本発明における組織培養の好ましい一例と
しては、次の方法が挙げられる。先ず、イチイ属に属す
る植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子など
から採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固め
たウッディー・プラント・メディウムの固体培地上に置
床し、10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織片の一部
をカルス化させる。このようにして得られたカルスを継
代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが
得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカ
ルスの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態
を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるもの
をいう。The following method is mentioned as a preferred example of the tissue culture in the present invention. First, after sterilizing plant pieces of plants belonging to the genus Taxus, for example, roots, growing points, leaves, stems, seeds, etc., they are placed on a solid medium of Woody Plant Medium solidified with gellan gum. Allow a part of the tissue piece to callus at 10-35 ℃ for 14-60 days. When the callus thus obtained is subcultured, the growth rate gradually increases and a stable callus is obtained. The term "stabilized callus" as used herein refers to one in which a part of the callus does not differentiate into shoots or roots during culture and retains the state of the callus and has a uniform cell growth rate.
【００５２】この安定化したカルスを増殖に適した液体
培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体
培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速
度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又
は該カルスを構成する細胞は、培養器内の気相中の酸素
濃度が大気中の酸素濃度未満に培養初期から制御されて
いるか、或いは組織及び／又は細胞と接する流動性の培
地中の溶存酸素濃度がその温度における飽和溶存酸素濃
度未満に培養初期から制御された培養条件下にて培養さ
れる。The stabilized callus is transferred to a liquid medium suitable for growth, for example, a liquid medium of Woody Plant Medium and allowed to grow. The growth rate is further increased in the liquid medium. In the present invention, the stabilized callus or cells constituting the callus is controlled such that the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is lower than the oxygen concentration in the atmosphere from the beginning of the culture, or tissues and / or cells. It is cultured under the culture conditions controlled from the early stage of the culture so that the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with is less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature.
【００５３】組織及び／又は細胞は、酸素を消費（呼
吸）することで自らの個体の維持又は増殖に必要なエネ
ルギーを獲得する。一般に組織及び／又は細胞を培養す
ると、培養日数の経過に伴い細胞量が増加し、これと共
に酸素の消費量も増加することが知られている。従っ
て、組織及び／又は細胞を含む培養器内の気相中の酸素
濃度、或いは組織及び／又は細胞と接する培地中の溶存
酸素濃度も、培養日数の経過に伴い自然に大気中の酸素
濃度未満、或いはその温度における飽和溶存酸素濃度未
満の値に低下して行くこととなる。By consuming oxygen (breathing), tissues and / or cells acquire energy necessary for maintaining or growing their own individuals. It is generally known that when a tissue and / or cells are cultured, the amount of cells increases as the number of days of culture elapses, and the amount of oxygen consumption also increases. Therefore, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator containing the tissue and / or cells, or the dissolved oxygen concentration in the medium in contact with the tissue and / or cells naturally becomes less than the oxygen concentration in the atmosphere with the passage of culture days. Or, it will decrease to a value below the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature.
【００５４】本発明は、組織及び／又は細胞を含む培養
器内の気相中の酸素濃度或いは培地中の溶存酸素濃度
を、大気中の酸素濃度未満か或いはその温度における飽
和溶存酸素濃度未満である条件下に積極的に制御した条
件下で培養を行うという点で前述の知見とは内容を異に
する。特に本発明の効果を高める方法として、培養器内
の気相中の酸素濃度或いは流動性の培地中の溶存酸素濃
度を、組織及び／又は細胞を該培養器内に移植するより
前に、予め大気中の酸素濃度未満か或いはその温度にお
ける飽和溶存酸素濃度未満に制御する方法が例示され
る。In the present invention, the oxygen concentration in the gas phase or the dissolved oxygen concentration in the medium in the incubator containing the tissue and / or cells is set to be less than the atmospheric oxygen concentration or less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature. The content is different from the above-mentioned findings in that the culture is performed under a condition under positive control. In particular, as a method for enhancing the effect of the present invention, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium is adjusted in advance before transplanting the tissue and / or cells into the incubator. An example is a method of controlling the concentration to be less than the oxygen concentration in the atmosphere or less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature.
【００５５】また、制御の期間としては、前述したよう
に、特に制限はないが、全培養期間中の、少なくとも３
日間制御することが好ましい。更に制御の方法として
は、組織及び／又は細胞を含む培養器内の気相中の酸素
濃度、或いは組織及び／又は細胞と接する流動性の培地
中の溶存酸素濃度を、大気中の酸素濃度未満か、或いは
その温度における飽和溶存酸素濃度未満に制御可能な培
養条件下であれば特に制限はなく、例えば空気に窒素等
を混合して酸素濃度を低下させることにより酸素濃度を
調節した気体を、培養器内の気相中及び／又は培地中に
直接通気するか、或いは通気槽等の培養器外で培地中に
直接通気した後、該培地を培養器内に灌流するか、或い
は該培養器内に供給する空気等の気体を供給速度を制限
して気相中及び／又は培地中に直接通気するか、或いは
通気槽等の培養器外で該気体を供給速度を制限して培地
中に直接通気した後、該培地を培養器内に灌流するか、
或いは培養器を低酸素雰囲気下に置き培養するか、或い
は酸素吸着剤存在下で培養する方法等が挙げられる。As described above, the control period is not particularly limited, but at least 3 during the whole culture period.
It is preferable to control for a day. Further, as a control method, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator containing the tissue and / or cells or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the tissues and / or cells is less than the oxygen concentration in the atmosphere. Or, there is no particular limitation as long as it is a culture condition that can be controlled to be less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature, and for example, a gas whose oxygen concentration is adjusted by lowering the oxygen concentration by mixing nitrogen with air, The medium is directly aerated in the gas phase in the incubator and / or in the medium, or directly in the medium outside the incubator such as an aeration tank, and then the medium is perfused into the incubator, or the incubator. A gas such as air to be supplied into the medium is directly aerated in the gas phase and / or the medium by limiting the supply rate, or the gas is introduced into the medium by limiting the supply rate of the gas outside the incubator such as an aeration tank. After direct aeration, the medium is perfused into the incubator ,
Alternatively, a method of culturing by placing the incubator in a low oxygen atmosphere or culturing in the presence of an oxygen adsorbent can be used.
【００５６】本発明における組織培養の培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜約28℃が増殖速度
が大きいので好適である。また、培養期間としては、14
〜42日間が好適である。本発明における培養において液
体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカ
ンテーション又は濾過等の方法によって培地から分離
し、培養細胞及び／又は培地から目的とするタキサン型
ジテルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離
することができる。また、吸着剤や適当な有機溶媒を培
養系内に共存させ、培養中連続的に目的化合物を回収す
ることもできる。The culture temperature of the tissue culture in the present invention is preferably about 10 to about 35 ° C., particularly about 23 to about 28 ° C., since the growth rate is high. The culture period is 14
~ 42 days are preferred. When a liquid medium is used in the culture in the present invention, the cultured cells are separated from the medium by a method such as decantation or filtration after the culture is completed, and the target taxane-type diterpene is separated from the cultured cells and / or the medium by an organic solvent. It can be separated by a method such as extraction. Further, an adsorbent or a suitable organic solvent may be allowed to coexist in the culture system to continuously collect the target compound during the culture.
【００５７】[0057]
【実施例】以下、実施例、比較例及び参考例により本発
明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの
実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ナフタレン酢酸を10-5M の濃度になるよう
に添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培
地（ゲランガム0.25重量％）に、前もって市販のアンチ
ホルミン溶液を５倍希釈した溶液又は70％エタノール溶
液等で滅菌処理したセイヨウイチイ(Taxus baccata LIN
N)の茎の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してセ
イヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス１ｇ（新鮮
重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プ
ラント・メディウムの液体培地20ml入りの三角フラスコ
に移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25m
m、100rpm）し、21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速
度を速めた。The present invention will be described in more detail below with reference to Examples, Comparative Examples and Reference Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples. (Example 1) A solid medium of Woody Plant Medium (gellan gum 0.25% by weight) to which naphthalene acetic acid was added so as to have a concentration of 10 -5 M was diluted with a commercially available antiformin solution by a factor of 5 or 70 % Yew (Taxus baccata LIN) sterilized with 10% ethanol solution
A part of the stem (N) was placed on a bed and cultured at 25 ° C. in the dark to obtain Taxus callus. Next, 1 g of this callus (fresh weight) was transferred to an Erlenmeyer flask containing 20 ml of Woody Plant Medium liquid medium to which the above components were added at the same concentration, and swirling culture (amplitude 25 m) on a rotary shaker.
m, 100 rpm) and planted every 21 days to accelerate the growth rate of the callus.
【００５８】このようにして得られた培養細胞１ｇ（新
鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・
プラント・メディウムの液体培地20ml入りの三角フラス
コに移植した後、該フラスコを気体供給口と排出口を有
する容器（内容量3000ml）内に入れ密閉した。そして空
気と窒素を用いて、該培養細胞に供給する酸素濃度が４
ないし15％となるよう混合比を調節後、毎分25mlの割合
で該気体を供給口より供給しながら、25℃で21日間旋回
培養を行った。1 g of the cultured cells (fresh weight) thus obtained was added to Woody
After transplanting to an Erlenmeyer flask containing 20 ml of a liquid medium of Plant Medium, the flask was placed in a container having a gas supply port and a discharge port (internal volume: 3000 ml) and sealed. Then, by using air and nitrogen, the oxygen concentration supplied to the cultured cells is 4
After the mixing ratio was adjusted to be 15% to 15%, the culture was carried out at 25 ° C. for 21 days by swirling while supplying the gas at a rate of 25 ml / min from the supply port.
【００５９】培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞を濾
過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定
し、生育倍率を求めた。得られた乾燥カルスからメタノ
ール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液
体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セフ
ァロマニン、バッカチンIII と比較定量することによっ
てタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表
１に示す。After the completion of the culture, the Taxus vulgaris cultured cells were collected by filtration, lyophilized, and the dry weight thereof was measured to determine the growth rate. The taxane-type diterpene was extracted from the obtained dry callus with methanol or the like, and the taxane-type diterpene yield was measured by comparative quantification with standard products taxol, cephalomannine and baccatin III using high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 1.
【００６０】（比較例１）実施例１において、細胞に供
給する酸素濃度が２０％になるよう調節した混合気体を
供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結
果を表１に示す。
（参考例）実施例１において、培養細胞を移植したフラ
スコを大気中で培養すること以外は該実施例と同様に操
作した。その結果を表１に示す。(Comparative Example 1) The same operation as in Example 1 was carried out except that the mixed gas in Example 1 was adjusted so that the oxygen concentration supplied to the cells was 20%. The results are shown in Table 1. Reference Example The same operation as in Example 1 was performed except that the flask to which the cultured cells were transplanted was cultured in the atmosphere in Example 1. The results are shown in Table 1.
【００６１】（実施例２）実施例１において、細胞に供
給する酸素濃度が１０％になるよう調節した混合気体
を、培養開始時から３日間供給した後、培養終了時まで
（１８日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様
に操作した。その結果を表１に示す。
（実施例３）実施例１において、細胞に供給する酸素濃
度が１０％になるよう調節した混合気体を、培養開始時
から７日間供給した後、培養終了時まで（１４日間）空
気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表１に示す。(Example 2) In Example 1, a mixed gas adjusted to an oxygen concentration of 10% to be supplied to cells was supplied for 3 days from the start of culture, and then air was supplied until the end of culture (18 days). Was operated in the same manner as in this example except that The results are shown in Table 1. (Example 3) In Example 1, a mixed gas adjusted so that the oxygen concentration supplied to cells was adjusted to 10% was supplied for 7 days from the start of culture, and then air was supplied until the end of culture (14 days). Except for the above, the same operation as in the example was carried out. The results are shown in Table 1.
【００６２】（実施例４）実施例１において、細胞に供
給する酸素濃度が１０％になるよう調節した混合気体
を、培養開始時から１４日間供給した後、培養終了時ま
で（７日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様
に操作した。その結果を表１に示す。
（実施例５）実施例１において、培養14日目にジャスモ
ン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（式（Ｉ）
において、Ｒ1 が−ＣＨ2 ＣＯＯＣＨ3 であり、Ｒ2 及
びＲ 3 が水素原子であり、Ｒ4 とＲ5 が共同して二重結
合を形成する化合物、トランス型90％，シス型10％）を
その終濃度が10ないし1000μＭになるよう添加したこと
以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表２に示
す。低濃度酸素供給処理とジャスモン酸のメチルエステ
ルの添加とを組み合わせることによりタキサン型ジテル
ペンの生産性を大幅に向上させることができた。Example 4 In Example 1, cells were used.
Gas mixture adjusted to supply oxygen concentration of 10%
Was supplied for 14 days from the start of culture, and then until the end of culture.
Same as the example except that air was supplied for 7 days.
Operated. The results are shown in Table 1.
(Example 5) In Example 1, jasmo on day 14 of culture
Methyl ester of jasmonic acid as the acid (Formula (I)
Where R1Is -CH2COOCH3And R2Over
And R 3Is a hydrogen atom, and RFourAnd RFiveJointly double-bonded
Compound that forms a compound, trans type 90%, cis type 10%)
Added so that the final concentration is 10 to 1000 μM
Other than that, the same operation as in the example was carried out. The results are shown in Table 2.
You Low concentration oxygen supply treatment and methyl ester of jasmonic acid
Combined with the addition of
I was able to greatly improve the productivity of the pen.
【００６３】（実施例６）実施例１において得られる生
育の早くなった培養細胞８５ｇ（新鮮重）を、溶存酸素
濃度計及び溶存酸素濃度制御装置を備えた通気撹拌培養
槽（内容量3000ml）にウッディー・プラント・メディウ
ムの液体培地1700mlを入れた後、移植した。そして空気
と窒素を用いて、該培地中の溶存酸素濃度が0.1ppm以下
になるよう混合比を調節しながら25℃で21日間通気撹拌
培養を行った。培養装置の概略図を図１に示すと共に、
結果を表３に示す。(Example 6) 85 g (fresh weight) of the cultured cells obtained in Example 1 which had grown faster were aerated and stirred in a culture tank equipped with a dissolved oxygen concentration meter and a dissolved oxygen concentration control device (internal volume: 3000 ml). 1700 ml of a liquid medium of Woody Plant Medium was added to the above and transplanted. Then, aeration and agitation culture was carried out at 25 ° C. for 21 days while adjusting the mixing ratio using air and nitrogen so that the dissolved oxygen concentration in the medium was 0.1 ppm or less. A schematic diagram of the culture device is shown in FIG.
The results are shown in Table 3.
【００６４】（実施例７）実施例６において、溶存酸素
濃度が１ppm 以下になるよう混合比を調節したこと以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
（実施例８）実施例６において、溶存酸素濃度が２ppm
以下になるよう混合比を調節したこと以外は該実施例と
同様に操作した。その結果を表３に示す。Example 7 The procedure of Example 6 was repeated except that the mixing ratio was adjusted so that the dissolved oxygen concentration was 1 ppm or less. The results are shown in Table 3. (Example 8) In Example 6, the dissolved oxygen concentration was 2 ppm.
The same operation as in the example was carried out except that the mixing ratio was adjusted as follows. The results are shown in Table 3.
【００６５】（実施例９）実施例６において、溶存酸素
濃度が４ppm 以下になるよう混合比を調節したこと以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
（実施例10）実施例６において、溶存酸素濃度が６ppm
以下になるよう混合比を調節したこと以外は該実施例と
同様に操作した。その結果を表３に示す。Example 9 The procedure of Example 6 was repeated except that the mixing ratio was adjusted so that the dissolved oxygen concentration was 4 ppm or less. The results are shown in Table 3. (Example 10) In Example 6, the dissolved oxygen concentration was 6 ppm.
The same operation as in the example was carried out except that the mixing ratio was adjusted as follows. The results are shown in Table 3.
【００６６】（比較例２）実施例６において、空気を通
気したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果
を表３に示す。
（実施例11）実施例６において、培養開始時から３日間
培地の溶存酸素濃度が４ppm 以下になるよう混合比を調
節しながら培養した後、培養終了時までの間（18日間）
空気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。
その結果を表３に示す。(Comparative Example 2) The same operation as in Example 6 was carried out except that air was passed through in Example 6. The results are shown in Table 3. (Example 11) In Example 6, after culturing for 3 days from the start of culturing while adjusting the mixing ratio so that the dissolved oxygen concentration of the medium is 4 ppm or less, until the end of culturing (18 days)
The operation was the same as in the example except that air was supplied.
The results are shown in Table 3.
【００６７】（実施例12）実施例６において、培養開始
時から７日間培地の溶存酸素濃度が４ppm 以下になるよ
う混合比を調節しながら培養した後、培養終了時まで
（14日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様に
操作した。その結果を表３に示す。
（実施例13）実施例６において、培養開始時から14日間
培地の溶存酸素濃度が４ppm 以下になるよう混合比を調
節しながら培養した後、培養終了時まで（７日間）空気
を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その
結果を表３に示す。Example 12 In Example 6, after culturing for 7 days from the start of culturing while adjusting the mixing ratio so that the dissolved oxygen concentration of the medium was 4 ppm or less, air was supplied until the end of culturing (14 days). The same operation as in the example was carried out except that it was supplied. The results are shown in Table 3. (Example 13) In Example 6, after culturing for 14 days from the start of culturing while adjusting the mixing ratio so that the dissolved oxygen concentration of the medium was 4 ppm or less, air was supplied until the end of culturing (7 days). Other than that, the same operation as in the example was carried out. The results are shown in Table 3.
【００６８】[0068]
【表１】 [Table 1]
【００６９】[0069]
【表２】 [Table 2]
【００７０】[0070]
【表３】 [Table 3]
【００７１】[0071]
【発明の効果】本発明によれば、タキサン型ジテルペン
を産生する植物の組織及び／又は細胞を培養するに当た
り、培養器内の気相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未
満の条件下に培養初期から制御して培養を行うか、或い
は組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸
素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度未満である
条件下に培養初期から制御して培養を行うことにより、
大量のタキサン型ジテルペンを簡便に得ることが可能に
なった。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, in culturing tissue and / or cells of a taxane-type diterpene-producing plant, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is set to a value lower than the atmospheric oxygen concentration. Controlled culturing is performed from the initial stage of culturing, or controlled culturing is performed from the initial stage of culturing under the condition that the dissolved oxygen concentration in the fluid medium contacting the tissue and / or cells is less than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature. By doing
It has become possible to easily obtain a large amount of taxane-type diterpenes.
【図１】本発明により組織培養を行うに当たって用いら
れる培養装置の例を示した図である。FIG. 1 is a diagram showing an example of a culture device used in performing tissue culture according to the present invention.
１ 空気供給管 ２ 窒素供給管 ３ 培養槽 ４ 酸素含有ガス供給口 ５ 溶存酸素濃度計 ６ 溶存酸素濃度制御装置 ７ ガス排気管 ８ バルブ ９ 酸素流量制御バルブ 10 エアフィルター 11 撹拌翼 1 Air supply pipe 2 Nitrogen supply pipe 3 culture tank 4 Oxygen-containing gas supply port 5 Dissolved oxygen concentration meter 6 Dissolved oxygen concentration controller 7 gas exhaust pipe 8 valves 9 Oxygen flow control valve 10 air filter 11 Stirrer
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 平８−154694（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−255495（ＪＰ，Ａ) 米国特許5019504（ＵＳ，Ａ) ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏ ｌ．９（1991），ｐ．933−934，936, 938 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI C12R 1:91) (56) Reference JP-A-8-154694 (JP, A) JP-A-7-255495 (JP, A) U.S. Pat. No. 5,019,504 (US, A) BIO / TECHNOLOGY, Vol. 9 (1991), p. 933-934, 936, 938 (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) C12P 17/00-17/18 BIOSIS / WPI (DIALOG) PubMed
Claims (7)
組織及び／又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気
相中の酸素濃度を４ないし15％に培養初期から制御して
培養を行うか、或いは組織及び／又は細胞と接する流動
性の培地中の溶存酸素濃度をその温度における飽和溶存
酸素濃度値の１ないし75％に培養初期から制御して培養
を行い、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回
収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方
法。1. When culturing a tissue and / or cell of a plant producing a taxane-type diterpene, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled to 4 to 15% from the initial stage of culturing, or Alternatively, the dissolved oxygen concentration in a fluid medium contacting with tissues and / or cells can be saturated at that temperature.
A method for producing a taxane-type diterpene, which comprises culturing while controlling the concentration of oxygen to 1 to 75% from the initial stage of culturing, and recovering the taxane-type diterpene from the obtained culture.
組織及び／又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気
相中の酸素濃度を６ないし12％に制御するか、或いは組
織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃
度をその温度における飽和溶存酸素濃度値の10ないし75
％に制御することを特徴とする請求項１記載のタキサン
型ジテルペンの製造方法。2. When culturing plant tissues and / or cells that produce taxane-type diterpenes, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator is controlled to 6 to 12%, or with the tissues and / or cells. The dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with the saturated dissolved oxygen concentration value at that temperature was 10 to 75
%, And the method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1.
組織及び／又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気
相中の酸素濃度又は流動性の培地中の溶存酸素濃度を、
培養器及び／又は培地に供給する気体の酸素濃度を調節
することによって制御するか、或いは培養器及び／又は
培地に供給する気体の供給速度を調節することによって
制御することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジ
テルペンの製造方法。3. When culturing tissue and / or cells of a plant producing a taxane-type diterpene, the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium is adjusted to
The control is performed by adjusting the oxygen concentration of the gas supplied to the incubator and / or the medium, or the supply rate of the gas supplied to the incubator and / or the medium. 1. The method for producing a taxane-type diterpene according to 1.
及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度
の制御を培養開始時ないし培養開始後７日目に開始し、
その後少なくとも３日間行うことを特徴とする請求項１
記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。4. The control of the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium contacting the tissues and / or cells is started at the start of the culture or on the 7th day after the start of the culture,
The method according to claim 1, which is performed for at least 3 days thereafter.
A method for producing the taxane-type diterpene described.
１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール、バ
ッカチンIII、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エ
ピバッカチンIII、セファロマニン、１０−デアセチル
セファロマニン、７−エピセファロマニン、タキサギフ
ィン、キシロシルセファロマニン及び／又はキシロシル
タキソールであることを特徴とする請求項１記載のタキ
サン型ジテルペンの製造方法。5. The taxane-type diterpene is taxol,
10-deacetyl taxol, 7-epitaxol, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-epibaccatin III, cephalomannine, 10-deacetyl cephalomannine, 7-epicephalomanin, taxakifin, xylosyl cephalomannine and / or Alternatively, the method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, which is xylosyl taxol.
イチイ属植物であることを特徴とする請求項１記載のタ
キサン型ジテルペンの製造方法。6. The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the plant producing the taxane-type diterpene is a Taxus genus plant.
組織及び／又は細胞を一般式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、Ｒ1は炭素数１〜４のアルキル基又は次式： −（ＣＨ2）n−ＣＯ−Ｒ6 （式中、Ｒ6は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金
属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ4を表す。）、
ＮＨＲ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、炭素数１〜４のア
シル基、炭素数１〜４のアルキル基又はアミノ酸残基を
表す。）又はＯＲ8（ここで、Ｒ8は炭素数１〜４のアル
キル基又は炭水化物残基を表す。）を表し、ｎは１〜７
の整数を表す。）で示される基を表し；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4
及びＲ5は、それぞれ水素原子を表すか、或いはＲ2とＲ
3、Ｒ3とＲ4、又はＲ4とＲ5は、共同して二重結合を表
してもよく；前記５員環は、更に水酸基で置換されてい
てもよく、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成し
てもよい。］で示されるジャスモン酸類の存在下に培養
することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテル
ペンの製造方法。7. A plant tissue and / or cell that produces a taxane-type diterpene is represented by the general formula (I): [Wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or the following formula: — (CH 2 ) n —CO—R 6 (wherein, R 6 is a hydroxyl group, OM (where M is an alkali metal atom, Represents an alkaline earth metal atom or NH 4 ),
NHR 7 (here, R 7 represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or an amino acid residue) or OR 8 (wherein R 8 is the number of carbon atoms). 1 to 4 represents an alkyl group or a carbohydrate residue), and n is 1 to 7
Represents the integer. ) Represents a group represented by the formula; R 2 , R 3 , R 4
And R 5 each represent a hydrogen atom, or R 2 and R 5
3 , R 3 and R 4 , or R 4 and R 5 may jointly represent a double bond; the 5-membered ring may be further substituted with a hydroxyl group, and adjacent 5-membered carbon atoms A double bond may be formed between them. ] It culture | cultivates in presence of jasmonic acid shown by these, The manufacturing method of the taxane-type diterpene of Claim 1 characterized by the above-mentioned.
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