JP3549594B2

JP3549594B2 - Method for producing taxane-type diterpene

Info

Publication number: JP3549594B2
Application number: JP29178394A
Authority: JP
Inventors: 敬人行宗; 康弘原
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1994-11-25
Filing date: 1994-11-25
Publication date: 2004-08-04
Anticipated expiration: 2019-08-04
Also published as: JPH08140690A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型ジテルペンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソール（Ｔａｘｏｌ）は、イチイ科イチイ属植物であるタイヘイヨウイチイ（ＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａＮＵＴＴ）より単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と関連する複雑なエステルグループを有している。タキソールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。現在、タキソールの製造は天然のまたは栽培された植物体中から採取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に大量のタキソールを得ることは困難である。もし、タキソールまたはタキソールの前駆物質であるバッカチンＩＩＩ等のタキサン型ジテルペンの合成が組織培養を利用して行なうことができれば、樹木を伐採する事なく、大量のタキソールを容易に得ることができるので有利である。
【０００３】
これまでの植物の培養細胞を利用したタキソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（ＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａＮＵＴＴ）培養細胞によるタキソール生産が米国で特許〔ＵＳＰａｔｅｎｔ：５０１９５０４〕になっており、そして、そのタキソール生産量は１〜３ｍｇ／ｌと記載されているが、工業的生産には不十分である。また、細胞培養によるタキソールの生産性は不安定であり、選抜で一次的には生産性の高い細胞が得られるが、継代培養してその含量を維持することは難しい〔Ｅ．Ｒ．Ｍ．Ｗｉｃｋｒｅｍｅｓｉｎｅｅｔａｌ．，ＷｏｒｌｄＣｏｎｇｒｅｓｓｏｎＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ（１９９２）〕。
【０００４】
一方、タキソール生産法の先行技術としては、タキソール生合成前駆体であるバッカチンＩＩＩ（ｂａｃｃａｔｉｎＩＩＩ）からの半合成法がＨｏｌｔｏｎらの米国特許に開示されている〔ＵＳＰａｔｅｎｔ：５０１５７４４〕。植物の組織培養法を用いれば、半合成原料の生産も可能であり、さらにタキソール生産に有利である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、植物組織培養により、タキサン型ジテルペンの簡便な製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
タキサン型ジテルペンは、水に対して難溶性であり、また、水溶液中の安定性も低い。タキサン型ジテルペンの水に対する溶解性を向上させるとともに、安定化させることができれば生産性を向上させることが可能と考えられる。
本発明者らは、鋭意研究の結果、タキサン型ジテルペン産生植物の培養細胞又は培養組織の組織培養培地中に環状多糖類を添加して組織培養を行なうと、培養物中のタキサン型ジテルペン生産性が向上することを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明はタキサン型ジテルペンを産生する植物の培養細胞又は培養組織を環状多糖類を含む組織培養培地中で組織培養し、得られる組織培養物よりタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はなく、例えばタキソール、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、７−エピバッカチンＩＩＩ、セファロマニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセファロマニン、タキサギフィン及びその類縁体、タキサン１ａ及びその類縁体、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソール等が挙げられる。
【０００９】
本発明の方法において組織培養に用いられるタキサン型ジテルペンを産生する植物としては、例えばセイヨウイチイ（ＴａｘｕｓｂａｃｃａｔａＬＩＮＮ）、イチイ（Ｔ．ｃｕｓｐｉｄａｔａＳＩＥＢ．ｅｔＺＵＣＣ）、キャラボク（Ｔ．ｃｕｓｐｉｄａｔａＳＩＥＢ．ｅｔＺＵＣＣｖａｒ．ｎａｎａＲＥＨＤＥＲ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔ．ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａＮＵＴＴ）、カナダイチイ（Ｔ．ｃａｎａｄｉｅｎｓｉｓＭＡＲＳＨ）、中国イチイ（Ｔ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｔ．ｍｅｄｉａ等のイチイ属植物をあげることができる。
【００１０】
前記植物の組織培養は、本発明により環状多糖類を添加する以外は、従来から知られている方法によって行なうことができる。
【００１１】
本発明で使用される環状多糖類としては、サイクロデキストリン、サイクロフラクタン、それらの誘導体を例示することができる。
環状多糖類は、環状構造のため内部には空洞があり、空洞開口部と外側は親水性、環の内側は水になじみにくい性質を示し、この空洞内に油性物質などを取り込む包接作用がある。この性質を利用して、水に難溶性の物質を水溶性に変えたり、不安定物質の安定化、香料などの揮発性物質の保持、特異臭の抑制など多くの用途があり、商業的にはフリーズドライ紅茶、ハム・ソーセージなどの特異臭抑制などの食品向けとして使われている。
サイクロデキストリンは、グルコースが６個から８個ドーナツ状に結合した物質で、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓなどの特殊な微生物が生産するサイクロデキストリン合成酵素の作用により、デンプンから合成される。また、サイクロフラクタンは、フルクトースが６個から８個ドーナツ状に結合した物質で、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓなどの特殊な微生物が生産するサイクロフラクタン合成酵素の作用により、イヌリンから合成される。
本発明の対象となるサイクロデキストリン又はその誘導体としては、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリン、或いはそれらの分枝サイクロデキストリン、部分メチル化サイクロデキストリンなどいずれも利用可能である。分枝サイクロデキストリンとしては、例えばグリコシル−α−サイクロデキストリン、マルトシル−α−サイクロデキストリン、マルトトリオシル−α−サイクロデキストリン、グリコシル−β−サイクロデキストリン、グリコシル−γ−サイクロデキストリン、ガラクトシル−α−サイクロデキストリン等、環に糖が分枝上に結合した化合物が挙げられる。また、サイクロフラクタン又はその誘導体としては、果糖が６〜８個、β２−１フラクシド結合した化合物、それらの分枝サイクロフラクタン、部分メチル化サイクロフラクタン等のいずれも利用可能である。
【００１２】
上記環状多糖類は、培地における濃度が０．０１〜５０ｍＭとすることが好ましく、この中でも特に０．１〜３０ｍＭの範囲に調製することが本発明の方法にとって更に好ましい。
【００１３】
従来、タキサン型ジテルペン産生植物の組織培養において培地添加物として環状多糖類を存在させて組織培養をおこなった例は報告されておらず、しかもそれによりタキサン型ジテルペンの培地への漏出が促進され、かつ産生量が増大することは予想外のことであった。
【００１４】
本発明の組織培養に使用される培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ・スクーグ（１９６２年）〔Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（１９６５年）〔ＬｉｎｓｍａｉｅｒＳｋｏｏｇ〕の培地、ウッディー・プラント・メディウム（１９８１年）〔ＷｏｏｄｙＰｌａｎｔＭｅｄｉｕｍ〕の培地、ガンボルグ〔Ｇａｍｂｏｒｇ〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等が挙げられる。
これら培地に植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸等を添加することもできる。
【００１５】
炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。
【００１６】
無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。
【００１７】
植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用いられる。
【００１８】
ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。
【００１９】
アミノ酸類としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等を添加できる。
一般に前記の各成分は、無機成分が約０．１μＭ、ないし１００ｍＭ、炭素源が約１〜約３０ｇ／ｌ、植物ホルモン類が約０．０１〜約１０μＭ、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約０．１〜約１００ｍｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００２０】
尚、本発明には液体培地及び寒天やゲランガム等を通常０．１〜１％含有する固形培地のいずれも使用できるが、通常は液体培地が好ましい。
本発明の組織培養においては、上記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片または細胞、あるいはこれらを上記培地あるいは他の従来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用することができる。
また、本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ或いはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを植物組織に感染することによって得られる腫瘍細胞及び／又は毛状根にも使用できる。
【００２１】
これらの組織または細胞を本発明により環状多糖類を添加した培地を用いて組織培養すると、無添加の場合と比較してタキサン型ジテルペンの高生産性培養組織又は培養細胞が得られる。
【００２２】
本発明の効果を高める方法として、特願平６−３６１５６、６−１０４２１１、６−１０４２１２、６−１０４２１３号明細書にタキサン系化合物の生産促進物質として開示されている、ジャスモン酸及びその誘導体の存在下に培養する方法との併用が挙げられる。
ジャスモン酸類としては、例えば、一般式（Ｉ）：
【００２３】
【化４】

【００２４】
［式中、Ｒ^０は次式：
−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−Ｒ^７
｛式中、Ｒ^７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ_４を表す。）、ＮＲ^８ａＲ^８ｂ（ここで、Ｒ^８ａ，Ｒ^８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ^９（ここで、Ｒ^９は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ及びＲ^１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６ａは、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ^１−Ｃ^２−Ｃ^３−Ｃ^４−Ｃ^５−Ｃ^６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ^６ｂは、水酸基又は−Ｏ−炭水化物残基を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物、または一般式（ＩＩ）：
【００２５】
【化５】

【００２６】
［式中、Ｒ^０は次式：
−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−Ｒ^７
｛式中、Ｒ^７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ_４を表す。）、ＮＲ^８ａＲ^８ｂ（ここで、Ｒ^８ａ，Ｒ^８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ^９（ここで、Ｒ^９は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ及びＲ^１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ^１−Ｃ^２−Ｃ^３−Ｃ^４−Ｃ^５−Ｃ^６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物、又は一般式（ＩＩＩ）：
【００２７】
【化６】

【００２８】
［式中、Ｒ^０は次式：
−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−Ｒ^７
｛式中、Ｒ^７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ_４を表す。）、ＮＲ^８ａＲ^８ｂ（ここで、Ｒ^８ａ，Ｒ^８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ^９（ここで、Ｒ^９は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ及びＲ^１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ^１−Ｃ^２−Ｃ^３−Ｃ^４−Ｃ^５−Ｃ^６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物等が挙げられる。
【００２９】
前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｒ^０、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ、Ｒ^１ｆ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６ａ、Ｒ^７、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、又はＲ^９で表される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。
前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ又はＲ^１ｆで表される炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００３０】
Ｒ^７がＯＭである場合において、Ｍで表されるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げられる。
Ｒ^７がＮＲ^８ａＲ^８ｂである場合において、Ｒ^８ａ，Ｒ^８ｂで表される炭素数１〜６のアシル基は、直鎖、分岐鎖のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基等が挙げられる。
【００３１】
Ｒ^７がＮＲ^８ａＲ^８ｂである場合において、Ｒ^８ａ，Ｒ^８ｂで表されるアミノ酸残基としては、例えばイソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基が挙げられる。Ｒ^７がＯＲ^９である場合において、Ｒ^９で表される炭水化物残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられる。
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ^６ｂが−Ｏ−炭水化物残基である場合における炭水化物残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられる。
【００３２】
前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物の好ましいものとしては、Ｒ^０が−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ又は−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＣＨ_３であり、Ｒ^０、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ、Ｒ^１ｆ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６ａ、Ｒ^６が、それぞれ水素原子を表すか、或いはＣ^１とＣ^２、Ｃ^３とＣ^４、又はＣ^３とＣ^４の間で二重結合を含んでいる化合物が挙げられる。
【００３３】
前記一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ａ）
【００３４】
【化７】

【００３５】
（化合物Ｂ）
【００３６】
【化８】

【００３７】
（化合物Ｃ）
【００３８】
【化９】

【００３９】
（化合物Ｄ）
【００４０】
【化１０】

【００４１】
前記一般式（ＩＩ）で示されるジャスモン酸類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｅ）
【００４２】
【化１１】

【００４３】
（化合物Ｆ）
【００４４】
【化１２】

【００４５】
（化合物Ｇ）
【００４６】
【化１３】

【００４７】
（化合物Ｈ）
【００４８】
【化１４】

【００４９】
前記一般式（ＩＩＩ）で示されるジャスモン酸類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｉ）
Ｒ^０：−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ又は−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＣＨ_３
（ｎ＝１〜３）
Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ、Ｒ^１ｆ、Ｒ^２，Ｒ^３，Ｒ^４，Ｒ^５，Ｒ^６：Ｈ
Ｃ^３−Ｃ^４間：二重結合
（化合物Ｊ）
Ｒ^０：−ＣＨ_２ＣＯＯＨ
Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ、Ｒ^１ｆ，Ｒ^２，Ｒ^３，Ｒ^４，Ｒ^５，Ｒ^６：Ｈ
また、前記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物は、５員環が、更に水酸基で置換されていてもよく、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。
【００５０】
５員環が、更に水酸基で置換された化合物、又は隣接する環員炭素原子間で二重結合が形成された化合物の具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｋ）
【００５１】
【化１５】

【００５２】
（化合物Ｌ）
【００５３】
【化１６】

【００５４】
（化合物Ｍ）
【００５５】
【化１７】

【００５６】
（化合物Ｎ）
【００５７】
【化１８】

【００５８】
前記ジャスモン酸類には種々の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）が存在するが、それぞれの異性体を単独で用いても、混合物の形で用いてもよい。
以上のジャスモン酸類は、全てタキサン型ジテルペンの生産性向上に効果を有するが、中でも前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）においてＲ^０が−ＣＨ_２ＣＯＯＨ又は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３であり、Ｒ^１ａ、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ、Ｒ^１ｆ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６ａが水素原子であり、Ｃ^３とＣ^４の間で二重結合を形成している化合物であるジャスモン酸又はジャスモン酸メチル、ツベロン酸又はツベロン酸メチル、及びククルビン酸又はククルビン酸メチルが生産性向上に対する効果の大きさの点から特に好ましい。
【００５９】
これらジャスモン酸類は、合成により、又は植物からの抽出等により調製される（Ｈ．Ｙａｍａｎｅｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，２８５７−２８６４（１９８０））。一方、ジャスモン酸類は、生長促進や組織の成熟、病害抵抗性の発現にかかわる諸反応を誘起する植物ホルモン様物質として、種々の植物が自ら生産することが、吉原照彦著、植物細胞工学第２巻第４号５２３〜５３１頁（１９９０年）に記載されている。
【００６０】
従って、前記ジャスモン酸類は、培養系外から添加するほかに、使用する培養細胞又は培養組織に自ら生産させることもできる。この内在性ジャスモン酸類の培養細胞又は培養組織による生産を促進する方法としては、微生物の培養物又はその抽出物、熱処理物或いは植物抽出物などの培地への添加を例示することができ、具体的にはＭ．Ｊ．Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０（１６），７４９０−７４９４（１９９３）に記載の、カビ細胞壁画分を添加する方法を例示することができる。更に、使用する培養細胞又は培養組織に、機械的に又は紫外線、熱などによって部分的に傷害を与えることによっても、内在性ジャスモン酸の生産量を高めることが可能であり、具体的には、Ｒ．Ａ．Ｃｌｅｅｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１１），４９３８−４９４１（１９８９）に記載の、機械的に一部の細胞を破壊する方法を例示することができる。
【００６１】
ジャスモン酸類は、水に対して難溶性のため、通常エタノール、メタノール等の有機溶媒、又は界面活性剤等に溶解した後、培地に添加する。また、遊離形のジャスモン酸類は、そのまま用いてもよいし、アルカリで中和して塩にして用いてもよい。
ジャスモン酸類は、５員環カルボニル基のα位が、酸、アルカリ、熱によってエピマー化を起こすため、不安定なシス型より安定なトランス型になりやすい。天然又は合成ジャスモン酸を用いた平衡実験では、トランス型が９０％、シス型が１０％の状態で存在する。一般にはシス型の方が活性が強いとされているが、本発明で使用することができるジャスモン酸類は、前記式（Ｉ）（ＩＩ）（ＩＩＩ）で示される全ての立体異性体化合物及びその混合物を包含する。
【００６２】
ジャスモン酸類は、培地における濃度が０．０１〜１０００μＭとすることが必要であり、この中でも特にジャスモン酸類の濃度を０．１〜５００μＭの範囲に調整することが好ましい。
ジャスモン酸類は、培養細胞の増殖期ないし定常期に添加することが効果的であり、この中でも特に増殖期から定常期に移行する時期にジャスモン酸類を添加することが好ましい。また、内在性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の時期についてもこれと同様である。例えば、２１日おきに細胞を移植している場合には７〜１６日目がジャスモン酸類の添加又は内在性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の適期にあたる。また、ジャスモン酸類の添加及び内在性ジャスモン酸類の生産量を高める処理は、一度に行ってもよいし、複数回に分けて行ってもよい。
【００６３】
また本発明は、特願平６−１４６８２６号明細書に開示されている、培養器内の気相中の酸素濃度を培養初期より大気中の酸素濃度未満の条件下に制御して培養を行うか、或いは組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度に於ける飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して培養する方法とも併用することができる。
【００６４】
ここで、培養初期とは、培養開始時ないし培養開始後７日目をいい、培養器内の気相中の酸素濃度、又は組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度の制御は、培養開始時から行うことが好ましい。また、制御の期間としては、培養全期間を通して該条件に制御してもよいし、培養全期間中の一部期間のみを制御してもよく、特に限定するものではないが、全培養期間中の、少なくとも３日間制御することが好ましい。
【００６５】
培養器内の気相中の酸素濃度は、４ないし１５％に制御することが必要であり、特に６ないし１２％に制御することが好ましい。また、流動性の培地中の溶存酸素濃度は、その温度における飽和溶存酸素濃度値の１ないし７５％に制御することが必要であり、特に１０ないし７５％に制御することが好ましい。
【００６６】
また、本発明は、特願平５−２８４８９３号、同６−１０４２１３号明細書に開示されている、細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも１つの層に含まれる細胞を培養する方法と併用することもできる。
細胞を比重によって分離する方法としては、一般に遠心分離用媒体を用いて密度勾配を作成し、細胞を重層した後、遠心分離する方法が知られている。
【００６７】
遠心分離用媒体としては、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ（共にＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ショ糖、塩化セシウム等が用いられる。
密度勾配を形成する層の数に特に制限はない。各層の比重差は、特に限定されるものではなく、また各比重差は同じであっても異なっていてもよい。
従って、この密度勾配の定義には勾配が連続的に変化する場合（密度勾配を形成する層の数が無限大、各層の比重差が０に近い状態）も含む。
【００６８】
このようにして密度勾配を形成し、細胞を重層、遠心分離することにより細胞を比重の違いにより複数の層に分けることができる。
作成する層の比重は、通常１．００〜１．２０ｇ／ｍｌ、好ましくは１．０３〜１．１１ｇ／ｍｌの範囲である。培養の対象となる層としては、少なくとも１つの層を選択し、また全ての層を選択して培養してもよい。
【００６９】
複数の層を選択して培養する場合、これらの複数の層は、それぞれ個別に培養することもできるが、選択した複数の層のうちの２層以上の層を混合して培養することもできる。
タキサン型ジテルペン産生能の高い培養細胞は、通常、比重が１．０７以下の層に含まれる細胞を培養して得られるが、培養する細胞や培養の条件により変動する場合があり、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。また、単に比重の違いによって分画しただけでは、比重の高い層の細胞の方がタキサン型ジテルペン含量が高くなる傾向が認められる。従って、より確実にタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を取得するためには、分画された全ての層の細胞を一定期間培養した後、各層の細胞に含まれるタキサン型ジテルペン濃度を測定し、それらの中からタキサン型ジテルペン高産生細胞を含む層を選択することが望ましい。
【００７０】
また、例えば１．０７ｇ／ｍｌのように、ある１つの特定の比重の遠心分離媒体を作成し、前述の方法で遠心分離することによっても、培養細胞を比重の違いにより複数の層に分けることができる。
【００７１】
また、本発明は、特願平６−２０１１５０号明細書に記載されている、重金属を含む化合物類、重金属イオンを含む錯イオン類、及び重金属イオンから選ばれた少なくとも一つの存在下に培養する方法との併用が挙げられる。
ここで、重金属としては、銀に代表される銅族、コバルトに代表的される鉄族を使用することが好ましく、当該重金属を含む化合物、当該重金属を含む錯イオン類、又は当該金属イオンの形で使用することが好ましい。
また、本発明は、特願平６−２０１１５１号明細書に記載されている、アミン類の存在下に培養する方法との併用が挙げられる。
ここでアミン類としては、ポリアミン類、具体的にはプトレッシン、スペルミジン、スペルミン、エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３− プロパンジアミン、ジエチレントリアミン、及びこれらの化合物の塩より成る群から選ばれる少なくとも一種以上を使用することが好ましい。
【００７２】
また、本発明にかかる方法と、上述の先願特許に記載の方法のいくつか又はすべてを組み合わせることも可能である。
【００７３】
以上のようにして得られた培養組織又は培養細胞から、メタノール等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。
本発明の組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。
【００７４】
先ずイチイ属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、１０〜３５℃で１４〜６０日程度経過させて組織片の一部をカルス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをいう。
【００７５】
この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又は該カルスを構成する細胞は、環状多糖類を含有する固体培地又は液体培地で培養される。環状多糖類は、培養初期から培地に添加しても良いし、培養途中に培地に添加しても良く、添加時期については特に限定しない。
【００７６】
本発明の組織培養における培養温度としては、通常は約１０〜約３５℃、特に約２３〜２８℃が増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、１４〜４２日間が好適である。
【００７７】
本発明の培養方法において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーションまたは濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞および／または培地から目的とするタキサン型ジテルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。
【００７８】
【実施例】
以下、実施例及び比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
〔実施例１〕
ナフタレン酢酸を１０^−５Ｍの濃度になるように添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培地（ゲランガム０．２５重量％）に、前もって２％アンチホルミン溶液または７０％エタノール溶液等で滅菌処理したセイヨウイチイ（ＴａｘｕｓｂａｃｃａｔａＬＩＮＮ）の茎の一部を置床し、２５℃で暗所にて静置培養してセイヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス０．１ｇ（新鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加した液体ウッディー・プラント・メディウム１ｍｌ入りのφ１８ｍｍウェルに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１２０ｒｐｍ）し、２８日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。
【００８０】
このようにして得られた培養細胞１ｇ（新鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加した液体ウッディー・プラント・メディウム２０ｍｌ入りの三角フラスコに移して２５℃で１４日間振盪培養した。培養１４日目にβ−サイクロデキストリンの終濃度が０．０１ｍＭになるように添加し、さらに７日間培養した。
【００８１】
培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカチンＩＩＩと比較定量することによってタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表１に示す。
【００８２】
〔比較例１〕
実施例１において、β−サイクロデキストリンを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８３】
〔実施例２〕
実施例１において、添加したβ−サイクロデキストリンの終濃度が０．１ｍＭである以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８４】
〔実施例３〕
実施例１において、添加したβ−サイクロデキストリンの終濃度が１ｍＭである以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８５】
〔実施例４〕
実施例１において、添加したβ−サイクロデキストリンの終濃度が１０ｍＭである以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８６】
〔実施例５〕
実施例１において、β−サイクロデキストリンの代わりに６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−サイクロデキストリンをその終濃度が５０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８７】
〔実施例６〜１０〕
実施例１〜５において、さらにジャスモン酸メチルエステルをその終濃度が１００μＭになるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表２に示す。
【００８８】
〔比較例２〕
比較例１において、さらにジャスモン酸メチルエステルをその終濃度が１００μＭになるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表２に示す。
【００８９】
〔実施例１１〕
実施例９において、β−サイクロデキストリンのかわりにα−サイクロデキストリンをその終濃度が１０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
【００９０】
〔実施例１２〕
実施例９において、β−サイクロデキストリンのかわりにγ−サイクロデキストリンをその終濃度が１０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
【００９１】
〔実施例１３〕
実施例９において、β−サイクロデキストリンのかわりにサイクロフラクタン（フルクトース７個が結合した化合物）をその終濃度が１０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
【００９２】
【表１】

【００９３】
【表２】

【００９４】
【表３】

【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、環状多糖類を含む組織培養培地を用いたタキサン型ジテルペン産生植物の組織培養によって、大量のタキサン型ジテルペンを簡便に得ることが可能になった。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a method for producing a taxane-type diterpene containing taxol, which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and the like.
[0002]
[Prior art]
Taxol, which is useful as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, etc., is a taxane-type diterpene isolated and identified from Taxus brevifolia NUTT, a plant of the genus Taxus, Taxus genus. Have complex ester groups. It has been reported that taxol is present in any part of the yew tree plant and its content is highest in bark. At present, taxol is produced from natural or cultivated plants, but Taxus plants are slow-growing plants that take more than 10 years to grow to a height of 20 cm above the ground, and also produce bark. It is difficult to easily obtain a large amount of taxol because the tree will die when peeled. If taxol or a taxane-type diterpene such as baccatin III, which is a precursor of taxol, can be synthesized using tissue culture, a large amount of taxol can be easily obtained without cutting down trees. It is.
[0003]
Regarding the conventional method of producing taxol using cultured cells of a plant, taxol production by cultured cells of Taxus brevifolia NUTT has been patented in the United States [US Patent: 5019504] in the United States, and the amount of taxol produced Is described as 1-3 mg / l, but is insufficient for industrial production. In addition, the productivity of taxol by cell culture is unstable, and cells with high productivity can be obtained primarily by selection, but it is difficult to maintain the content by subculture [E. R. M. Wickremesine et al. , World Congress on Cell and Tissue Culture (1992)].
[0004]
On the other hand, as a prior art of taxol production method, a semi-synthesis method from baccatin III which is a precursor of taxol biosynthesis is disclosed in a US patent of Holton et al. [US Patent: 5015744]. If a plant tissue culture method is used, semi-synthetic raw materials can be produced, which is advantageous for taxol production.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a simple method for producing a taxane-type diterpene by plant tissue culture.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Taxane-type diterpenes are poorly soluble in water and have low stability in aqueous solutions. It is considered that the solubility of the taxane-type diterpene in water can be improved and, if it can be stabilized, the productivity can be improved.
The present inventors have conducted intensive studies and found that, when a tissue culture is performed by adding a cyclic polysaccharide to a tissue culture medium of a cultured cell or a cultured tissue of a taxane-type diterpene-producing plant, the productivity of the taxane-type diterpene in the culture is improved. Have been found, and the present invention has been completed.
[0007]
That is, the present invention is characterized in that a cultured cell or a cultured tissue of a plant that produces a taxane-type diterpene is tissue-cultured in a tissue culture medium containing a cyclic polysaccharide, and the taxane-type diterpene is recovered from the obtained tissue culture. This is a method for producing a taxane-type diterpene.
[0008]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The taxane-type diterpene to be subjected to the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a diterpene having a taxane skeleton. For example, taxol, 10-deacetyltaxol, 7-epitaxol, baccatin III, 10-deacetyl Examples include baccatin III, 7-epibaccatin III, cephalomanine, 10-deacetylcephalomanin, 7-epicephalomanine, taxagifin and its analogs, taxane 1a and its analogs, xylosylcephalomanine, xylosyltaxol and the like.
[0009]
Examples of a plant that produces a taxane-type diterpene used for tissue culture in the method of the present invention include Taxus baccata LINN, Taxus (T. cuspidata SIEB. Et ZUCC), and T. cuspidata SIEB. Et ZUCC. var.nana REHDER, T. brevifolia NUTT, T. canadiensis MARSH, T. chinensis, T. chinensis medias and other Taxus genus plants.
[0010]
The tissue culture of the plant can be performed by a conventionally known method except that a cyclic polysaccharide is added according to the present invention.
[0011]
Examples of the cyclic polysaccharide used in the present invention include cyclodextrin, cyclofructan, and derivatives thereof.
Cyclic polysaccharides have a cavity inside because of the cyclic structure, the opening and the outside of the cavity are hydrophilic, and the inside of the ring is hardly water-compatible, and the inclusion action of taking in oily substances etc. into this cavity is there. Utilizing this property, there are many uses such as changing poorly water-soluble substances to water-soluble, stabilizing unstable substances, retaining volatile substances such as fragrances, and suppressing specific odors. Is used for foods such as freeze-dried black tea, ham and sausage, etc.
Cyclodextrin is a substance in which 6 to 8 glucoses are bound in a donut shape.Bacillus maceransIt is synthesized from starch by the action of cyclodextrin synthase produced by such special microorganisms. Cyclofructan is a substance in which 6 to 8 fructoses are bound in a donut shape.Bacillus circulansIt is synthesized from inulin by the action of cyclofructan synthase produced by such special microorganisms.
As the cyclodextrin or a derivative thereof which is an object of the present invention, any of α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, a branched cyclodextrin thereof, a partially methylated cyclodextrin and the like can be used. Examples of the branched cyclodextrin include glycosyl-α-cyclodextrin, maltosyl-α-cyclodextrin, maltotriosyl-α-cyclodextrin, glycosyl-β-cyclodextrin, glycosyl-γ-cyclodextrin, and galactosyl-α-cyclodextrin. Compounds in which a sugar is linked to the ring on the branch, such as dextrin, may be mentioned. Further, as the cyclofructan or its derivative, any of 6-8 fructose, β2-1 frucside-bonded compounds, their branched cyclofractans, partially methylated cyclofructans and the like can be used.
[0012]
It is preferable that the concentration of the cyclic polysaccharide in the medium is 0.01 to 50 mM, and it is particularly preferable that the cyclic polysaccharide is prepared in the range of 0.1 to 30 mM.
[0013]
Conventionally, in the tissue culture of taxane-type diterpene-producing plants, there has not been reported an example of performing tissue culture in the presence of a cyclic polysaccharide as a culture medium additive, and furthermore, leakage of the taxane-type diterpene to the culture medium is promoted, And the increase in production was unexpected.
[0014]
As the medium used for the tissue culture of the present invention, conventionally known mediums used for tissue culture of plants, for example, the medium of Murashige & Skoog (1962) [Murashige & Skoog], and Rinsmeyer Skoog (1965) Year) [Linsmeier Skoog] medium, Woody Plant Medium (1981) [Woody Plant Medium] medium, Gamborg [Gamborg] B-5 medium, and Mitsui M-9 medium.
Plant hormones can be added to these media, and if necessary, carbon sources, inorganic components, vitamins, amino acids and the like can be added.
[0015]
As the carbon source, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, monosaccharides such as glucose, fructose and galactose, starch and those obtained by mixing two or more of these sugar sources at an appropriate ratio can be used.
[0016]
Examples of the inorganic component include phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, sulfur, iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine, sodium, iodine, cobalt, and the like. Sodium, calcium nitrate, potassium chloride, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium sulfate, ferrous sulfate, ferric sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, boric acid, copper sulfate , Sodium molybdate, molybdenum trioxide, potassium iodide, cobalt chloride and the like.
[0017]
As the plant hormone, for example, auxins such as indoleacetic acid (IAA), naphthaleneacetic acid (NAA), and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and cytokinins such as kinetin, zeatin, and dihydrozeatin are used. Can be
[0018]
As the vitamins, for example, biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like are used.
[0019]
As amino acids, for example, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine and the like can be added.
Generally, each of the above components contains about 0.1 μM to 100 mM of an inorganic component, about 1 to about 30 g / l of a carbon source, about 0.01 to about 10 μM of plant hormones, and about 0 to about 10 μM of vitamins and amino acids. 0.1 to about 100 mg / l.
[0020]
In the present invention, any of a liquid medium and a solid medium containing usually 0.1 to 1% of agar, gellan gum and the like can be used, but a liquid medium is usually preferable.
In the tissue culture of the present invention, the roots, growth points, leaves, stems, seeds, pollen, anthers, stems and other tissue fragments or cells of the above-mentioned plants, or these are cultured in the above-mentioned medium or other conventional medium. The cultured cells obtained can be used.
Also, the present inventionAgrobacterium tumefaciensOrA. rhizogenesCan also be used for tumor cells and / or hairy roots obtained by infecting plant tissue with.
[0021]
When these tissues or cells are tissue-cultured using a medium to which a cyclic polysaccharide is added according to the present invention, a cultured tissue or cells with high productivity of taxane-type diterpene can be obtained as compared with the case without the addition.
[0022]
As a method for enhancing the effects of the present invention, jasmonic acid and its derivatives disclosed in Japanese Patent Application Nos. 6-36156, 6-104211, 6-104212, and 6-104213 as a taxane-based compound production promoting substance are disclosed. The method may be used in combination with the method of culturing in the presence.
Jasmonic acids include, for example, those represented by the general formula (I):
[0023]
Embedded image

[0024]
[Wherein, R⁰Is:
− (CH₂)_n-CO-R⁷
中 where R⁷Is a hydroxyl group, OM (where M is an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH₄Represents ), NR^8aR^8b(Where R^8a, R^8bEach independently represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an amino acid residue. ), OR⁹(Where R⁹Represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carbohydrate residue. ) Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 7. Represents a group represented by｝;
R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1eAnd R^1fRepresents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, respectively;
R², R³, R⁴, R⁵And R^6aRepresents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, respectively;
C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶A side chain consisting of may contain one or more double bonds;
R^6bRepresents a hydroxyl group or an —O-carbohydrate residue;
The five-membered ring may form a double bond between adjacent ring-membered carbon atoms. ]
Or a compound represented by the general formula (II):
[0025]
Embedded image

[0026]
[Wherein, R⁰Is:
− (CH₂)_n-CO-R⁷
中 where R⁷Is a hydroxyl group, OM (where M is an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH₄Represents ), NR^8aR^8b(Where R^8a, R^8bEach independently represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an amino acid residue. ), OR⁹(Where R⁹Represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carbohydrate residue. ) Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 7. Represents a group represented by｝;
R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1eAnd R^1fRepresents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, respectively;
R², R³, R⁴, R⁵And R⁶Represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, respectively;
C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶A side chain consisting of may contain one or more double bonds;
The five-membered ring may form a double bond between adjacent ring-membered carbon atoms. ]
Or a compound represented by the general formula (III):
[0027]
Embedded image

[0028]
[Wherein, R⁰Is:
− (CH₂)_n-CO-R⁷
中 where R⁷Is a hydroxyl group, OM (where M is an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH₄Represents ), NR^8aR^8b(Where R^8a, R^8bEach independently represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an amino acid residue. ), OR⁹(Where R⁹Represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carbohydrate residue. ) Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 7. Represents a group represented by｝;
R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1eAnd R^1fRepresents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, respectively;
R², R³, R⁴, R⁵And R⁶Represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, respectively;
C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶A side chain consisting of may contain one or more double bonds;
The five-membered ring may form a double bond between adjacent ring-membered carbon atoms. ]
And the like.
[0029]
In the general formulas (I), (II) and (III), R⁰, R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R^6a, R⁷, R^8a, R^8bOr R⁹Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by are a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a t-butyl group, and an n- Examples include a pentyl group, an isopentyl group, a neopentyl group, a t-pentyl group, an n-hexyl group, and an isohexyl group.
In the general formulas (I), (II) and (III), R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1eOr R^1fAs the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms represented by, for example, methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, t-butoxy group, n -Pentyloxy group, isopentyloxy group, neopentyloxy group, t-pentyloxy group, n-hexyloxy group, isohexyloxy group and the like.
[0030]
R⁷Is OM, examples of the alkali metal atom or alkaline earth metal atom represented by M include sodium, potassium, and calcium.
R⁷Is NR^8aR^8bIn the case where^8a, R^8bThe acyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by may be linear or branched, and examples thereof include a formyl group, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, a valeryl group, a hexanoyl group, and an acryloyl group.
[0031]
R⁷Is NR^8aR^8bIn the case where^8a, R^8bExamples of the amino acid residue represented by are an isoleucyl group, a tyrosyl group, and a tryptophyll group. R⁷Is OR⁹In the case where⁹Examples of the carbohydrate residue represented by include a glucopyranosyl group.
In the general formula (I), R^6bIs a —O-carbohydrate residue, examples of the carbohydrate residue include a glucopyranosyl group.
[0032]
Preferred examples of the compound represented by the general formula (I), (II) or (III) include R⁰Is-(CH₂)_nCOOH or-(CH₂)_nCOOCH₃ And R⁰, R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R^6a, R⁶Each represents a hydrogen atom, or C¹And C², C³And C⁴Or C³And C⁴Compounds containing a double bond between
[0033]
Preferred specific examples of the jasmonic acids represented by the general formula (I) include, for example, the following compounds.
(Compound A)
[0034]
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[0035]
(Compound B)
[0036]
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[0037]
(Compound C)
[0038]
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[0039]
(Compound D)
[0040]
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[0041]
Preferred specific examples of the jasmonic acids represented by the general formula (II) include, for example, the following compounds.
(Compound E)
[0042]
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[0043]
(Compound F)
[0044]
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[0045]
(Compound G)
[0046]
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[0047]
(Compound H)
[0048]
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[0049]
Preferred specific examples of the jasmonic acids represented by the general formula (III) include the following compounds.
(Compound I)
R⁰:-( CH₂)_nCOOH or-(CH₂)_nCOOCH₃
(N = 1 to 3)
R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶: H
C³-C⁴Between: Double bond
(Compound J)
R⁰: -CH₂COOH
R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶: H
In the compound represented by the general formula (III), the 5-membered ring may be further substituted with a hydroxyl group, and a double bond may be formed between adjacent ring-membered carbon atoms.
[0050]
Specific examples of the compound in which the 5-membered ring is further substituted with a hydroxyl group, or the compound in which a double bond is formed between adjacent ring-membered carbon atoms, include the following compounds.
(Compound K)
[0051]
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[0052]
(Compound L)
[0053]
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[0054]
(Compound M)
[0055]
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[0056]
(Compound N)
[0057]
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[0058]
The jasmonic acids have various stereoisomers (cis trans isomers, optical isomers), and each isomer may be used alone or in the form of a mixture.
All of the above jasmonic acids are effective in improving the productivity of taxane-type diterpenes. Among them, in the general formulas (I), (II) and (III),⁰Is -CH₂COOH or -CH₂COOCH₃And R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R^6aIs a hydrogen atom, and C³And C⁴Among them, jasmonic acid or methyl jasmonate, tuberonic acid or methyl tuberonate, and cucurbic acid or methyl cucurate, which are compounds forming a double bond between them, are particularly preferable from the viewpoint of the effect of improving productivity.
[0059]
These jasmonic acids are prepared by synthesis or by extraction from plants (H. Yamane et al., Agric. Biol. Chem.,44, 2857-2864 (1980)). On the other hand, jasmonic acids are produced by various plants as plant hormone-like substances that induce various reactions related to growth promotion, tissue maturation, and development of disease resistance. Vol. 4, pages 523-531 (1990).
[0060]
Therefore, the jasmonic acids can be produced by a cultured cell or tissue to be used, in addition to being added from outside the culture system. Examples of a method for promoting the production of endogenous jasmonic acids by cultured cells or cultured tissues include the addition of a culture of a microorganism or an extract thereof, a heat-treated product or a plant extract to a culture medium. M. J. Mueller et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,90(16), 7490-7494 (1993), the method of adding a mold cell wall fraction can be exemplified. Furthermore, it is also possible to increase the production of endogenous jasmonic acid by mechanically or partially damaging the cultured cells or tissues to be used by ultraviolet light, heat, or the like. R. A. Cleman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,89(11), 4938-4941 (1989), a method for mechanically destroying some cells can be exemplified.
[0061]
Since jasmonic acids are hardly soluble in water, they are usually dissolved in an organic solvent such as ethanol or methanol, or a surfactant, and then added to the medium. The jasmonic acids in free form may be used as they are, or may be neutralized with an alkali to form a salt.
Jasmonic acids tend to be more stable trans-forms than unstable cis-forms because the α-position of the 5-membered ring carbonyl group undergoes epimerization by acid, alkali or heat. In an equilibrium experiment using natural or synthetic jasmonic acid, the trans-form is present at 90% and the cis-form is present at 10%. In general, the cis form is considered to have higher activity. Jasmonic acids that can be used in the present invention include all the stereoisomeric compounds represented by the above formulas (I), (II) and (III) and their stereoisomers. And mixtures.
[0062]
It is necessary that the concentration of the jasmonic acid in the medium be 0.01 to 1000 μM, and it is particularly preferable to adjust the concentration of the jasmonic acid to the range of 0.1 to 500 μM.
It is effective to add jasmonic acids during the growth phase or stationary phase of the cultured cells, and among them, it is particularly preferable to add jasmonic acids during the transition from the growth phase to the stationary phase. The same applies to the timing of the treatment for increasing the production amount of endogenous jasmonic acids. For example, when cells are transplanted every 21 days, the 7th to 16th days correspond to the appropriate period of the treatment for adding jasmonic acids or increasing the production of endogenous jasmonic acids. Further, the treatment of adding jasmonic acids and increasing the production amount of endogenous jasmonic acids may be performed at one time or may be performed in a plurality of times.
[0063]
In addition, the present invention discloses that the cultivation is performed by controlling the oxygen concentration in the gas phase in the incubator to be lower than the oxygen concentration in the atmosphere from the initial stage of the culture, as disclosed in Japanese Patent Application No. 6-146826. Alternatively, the method can be used in combination with a method in which the concentration of dissolved oxygen in a fluid medium in contact with tissues and / or cells is controlled to be lower than the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature from the initial stage of culture, followed by culturing. .
[0064]
Here, the initial stage of the cultivation means the time from the start of the cultivation to the seventh day after the start of the cultivation, and the oxygen concentration in the gas phase in the incubator or the dissolved oxygen concentration in the fluid medium in contact with tissues and / or cells The control is preferably performed from the start of the culture. In addition, the control period may be controlled under the same conditions throughout the entire culture period, or may be controlled only for a part of the entire culture period, and is not particularly limited. Is preferably controlled for at least three days.
[0065]
It is necessary to control the oxygen concentration in the gas phase in the incubator to 4 to 15%, particularly preferably to 6 to 12%. Further, the dissolved oxygen concentration in the fluid medium needs to be controlled to 1 to 75% of the saturated dissolved oxygen concentration at that temperature, and particularly preferably to 10 to 75%.
[0066]
In addition, the present invention discloses that the cells are divided into a plurality of layers according to the difference in specific gravity and the cells contained in at least one layer are disclosed in Japanese Patent Application Nos. 5-284893 and 6-104213. It can also be used in combination with the method.
As a method for separating cells by specific gravity, a method is generally known in which a density gradient is created using a medium for centrifugation, cells are overlaid, and then centrifugation is performed.
[0067]
As a medium for centrifugation, Ficoll, Percoll (both manufactured by Pharmacia LKB Biotechnology), sucrose, cesium chloride and the like are used.
There is no particular limitation on the number of layers forming the density gradient. The specific gravity difference of each layer is not particularly limited, and each specific gravity difference may be the same or different.
Therefore, the definition of the density gradient includes a case where the gradient changes continuously (the number of layers forming the density gradient is infinite, and the specific gravity difference of each layer is close to 0).
[0068]
By forming a density gradient in this way and overlaying and centrifuging the cells, the cells can be divided into a plurality of layers depending on the difference in specific gravity.
The specific gravity of the layer to be formed is usually in the range of 1.00 to 1.20 g / ml, preferably 1.03 to 1.11 g / ml. As a layer to be cultured, at least one layer may be selected, or all layers may be selected and cultured.
[0069]
When a plurality of layers are selected and cultured, each of the plurality of layers can be individually cultured, or two or more layers of the selected plurality of layers can be mixed and cultured. .
Cultured cells having a high taxane-type diterpene-producing ability are usually obtained by culturing cells contained in a layer having a specific gravity of 1.07 or less, but may vary depending on the cells to be cultured and the conditions of cultivation. However, the present invention is not limited to this. In addition, a simple fractionation based on the difference in specific gravity indicates that cells in a layer having a higher specific gravity tend to have a higher taxane-type diterpene content. Therefore, in order to more reliably obtain the taxane-type diterpene high-producing culture cells, after culturing the cells of all the fractionated layers for a certain period, the concentration of the taxane-type diterpene contained in the cells of each layer was measured. It is desirable to select a layer containing the taxane-type diterpene high-producing cells from the above.
[0070]
Alternatively, a culture medium may be divided into a plurality of layers by a difference in specific gravity by preparing a certain specific gravity centrifugation medium such as 1.07 g / ml and performing centrifugation by the above-described method. Can be.
[0071]
In addition, the present invention provides culturing in the presence of at least one selected from compounds containing heavy metals, complex ions containing heavy metal ions, and heavy metal ions described in Japanese Patent Application No. 6-201150. Combination with the method is mentioned.
Here, as the heavy metal, it is preferable to use a copper group represented by silver or an iron group represented by cobalt, and a compound containing the heavy metal, a complex ion containing the heavy metal, or a form of the metal ion is used. It is preferable to use them.
In addition, the present invention may be used in combination with the method of culturing in the presence of amines described in Japanese Patent Application No. 6-201151.
Here, the amines include polyamines, specifically at least one selected from the group consisting of putrescine, spermidine, spermine, ethylenediamine, N, N-diethyl-1,3-propanediamine, diethylenetriamine, and salts of these compounds. It is preferred to use one or more.
[0072]
It is also possible to combine the method according to the present invention with some or all of the methods described in the above-mentioned prior patents.
[0073]
The taxane-type diterpene can be separated from the cultured tissue or cultured cell obtained as described above by extraction with an organic solvent such as methanol.
A preferred example of the tissue culture of the present invention includes the following method.
[0074]
First, plants of plants belonging to the genus Yew, for example, roots, growth points, leaves, stems, after sterilization of plant pieces collected from seeds, etc., placed on a solid medium of woody plant medium solidified with gellan gum, After about 14 to 60 days have passed at 10 to 35 ° C, a portion of the tissue piece is callusized. When the callus thus obtained is subcultured, the growth rate gradually increases, and a stabilized callus is obtained. Here, the stabilized callus refers to a callus having a property that a part of the callus does not differentiate into shoots or roots during culture and retains the state of the callus and has a uniform cell growth rate.
[0075]
The stabilized callus is transferred to a liquid medium suitable for growth, for example, Woody Plant Medium, and grown. The growth rate is further increased in the liquid medium. In the present invention, the stabilized callus or cells constituting the callus is cultured in a solid medium or a liquid medium containing a cyclic polysaccharide. The cyclic polysaccharide may be added to the medium from the beginning of the culture, or may be added to the medium during the culture, and the timing of addition is not particularly limited.
[0076]
As the culture temperature in the tissue culture of the present invention, usually about 10 to about 35 ° C., particularly about 23 to 28 ° C. is preferable because the growth rate is high. The culture period is preferably 14 to 42 days.
[0077]
When a liquid medium is used in the culture method of the present invention, the cultured cells are separated from the medium by a method such as decantation or filtration after the completion of the culture, and the desired taxane-type diterpene is separated from the cultured cells and / or medium by an organic solvent. Can be separated by extraction or other methods.
[0078]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Comparative Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
[0079]
[Example 1]
10 naphthalene acetic acid^-5Woody plant medium (Guerin gum 0.25% by weight) added to a concentration of M in a solid medium (gelus gum 0.25% by weight) was previously sterilized with 2% antiformin solution or 70% ethanol solution, etc. (Taxus baccata LINN). A part of the stem was placed on the floor and cultured at 25 ° C. in a dark place for static calligraphy. Next, 0.1 g of this callus (fresh weight) was transferred to a φ18 mm well containing 1 ml of liquid woody plant medium to which the above-mentioned components were added at the same concentration, and subjected to vortex culture (amplitude: 25 mm, 120 rpm) on a rotary shaker. Planting was continued every day, and the growth rate of the callus was increased.
[0080]
1 g of the cultured cells (fresh weight) thus obtained was transferred to an Erlenmeyer flask containing 20 ml of Liquid Woody Plant Medium to which the above components were added at the same concentration, and cultured with shaking at 25 ° C. for 14 days. On the 14th day of the culture, β-cyclodextrin was added to a final concentration of 0.01 mM, and the cells were further cultured for 7 days.
[0081]
After completion of the culture, cultured cells of the yew tree were collected by filtration, freeze-dried, and the dried weight was measured to determine the growth weight of the cultured cells per 1 L of the liquid medium. The taxane-type diterpene was extracted from the obtained dried callus using methanol or the like, and the yield of the taxane-type diterpene was measured by high-performance liquid chromatography and quantitatively quantified with taxol, cephalomannine, and baccatin III. Table 1 shows the results.
[0082]
[Comparative Example 1]
The procedure of Example 1 was repeated, except that β-cyclodextrin was not added. Table 1 shows the results.
[0083]
[Example 2]
The operation was performed in the same manner as in Example 1 except that the final concentration of the added β-cyclodextrin was 0.1 mM. Table 1 shows the results.
[0084]
[Example 3]
The operation was performed in the same manner as in Example 1 except that the final concentration of β-cyclodextrin added was 1 mM. Table 1 shows the results.
[0085]
[Example 4]
The procedure of Example 1 was repeated, except that the final concentration of β-cyclodextrin added was 10 mM. Table 1 shows the results.
[0086]
[Example 5]
The same operation as in Example 1 was performed, except that 6-O-α-D-glucosyl-β-cyclodextrin was added so as to have a final concentration of 50 mM instead of β-cyclodextrin. Table 1 shows the results.
[0087]
[Examples 6 to 10]
The same operation as in Examples 1 to 5 was carried out except that jasmonic acid methyl ester was further added so as to have a final concentration of 100 μM. Table 2 shows the results.
[0088]
[Comparative Example 2]
In Comparative Example 1, the same operation as in Example 1 was performed except that jasmonic acid methyl ester was further added so as to have a final concentration of 100 μM. Table 2 shows the results.
[0089]
[Example 11]
The procedure of Example 9 was repeated, except that α-cyclodextrin was added instead of β-cyclodextrin so that the final concentration was 10 mM. Table 3 shows the results.
[0090]
[Example 12]
The same operation as in Example 9 was performed, except that γ-cyclodextrin was added instead of β-cyclodextrin so that the final concentration was 10 mM. Table 3 shows the results.
[0091]
[Example 13]
The same operation as in Example 9 was performed, except that cyclofructan (a compound to which seven fructoses were bound) was added instead of β-cyclodextrin so that the final concentration was 10 mM. Table 3 shows the results.
[0092]
[Table 1]

[0093]
[Table 2]

[0094]
[Table 3]

[0095]
【The invention's effect】
According to the present invention, a large amount of taxane-type diterpene can be easily obtained by tissue culture of a taxane-type diterpene-producing plant using a tissue culture medium containing a cyclic polysaccharide.

Claims

タキサン型ジテルペンを産生する植物の培養細胞及び／又は培養組織を環状多糖類を含む組織培養培地中で組織培養し、得られる組織培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。A taxane-type diterpene characterized in that a cultured cell and / or a cultured tissue of a plant that produces a taxane-type diterpene is tissue-cultured in a tissue culture medium containing a cyclic polysaccharide, and the taxane-type diterpene is recovered from the obtained tissue culture. Manufacturing method.

タキサン型ジテルペンが、タキソール、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、７−エピバッカチンＩＩＩ、セファロマニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセファロマニン、タキサギフィン及びその類縁体、タキサン１ａ及びその類縁体、キシロシルセファロマニン、及びキシロシルタキソールよりなる群から選ばれる少なくとも１種類以上であることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。The taxane type diterpene is taxol, 10-deacetyltaxol, 7-epitaxol, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-epibaccatin III, cephalomannin, 10-deacetylcephalomanin, 7-epicephalomanine, 2. The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the taxane-type diterpene is at least one selected from the group consisting of taxagifin and its analogs, taxane 1a and its analogs, xylosylcephalomanine, and xylosyltaxol. 3. .

環状多糖類がα−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the cyclic polysaccharide is α-cyclodextrin.

環状多糖類がβ−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the cyclic polysaccharide is β-cyclodextrin.

環状多糖類がγ−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the cyclic polysaccharide is γ-cyclodextrin.

環状多糖類がサイクロフラクタンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the cyclic polysaccharide is cyclofructan.

タキサン型ジテルペンを産生する植物がイチイ属植物であることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the plant producing the taxane-type diterpene is a Taxus genus plant.

組織培養培地中の環状多糖類の濃度が０．０１〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the concentration of the cyclic polysaccharide in the tissue culture medium is 0.01 to 50 mM.

タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及び／又は細胞を下記の一般式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^０は次式：
−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−Ｒ^７
｛式中、Ｒ^７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ_４を表す。）、ＮＲ^８ａＲ^８ｂ（ここで、Ｒ^８ａ, Ｒ^８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ^９（ここで、Ｒ^９は、炭素数１〜６のアルキル基又はグルコピラノシル基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^１ ^a、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ及びＲ^１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６アルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６ａは、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ^１−Ｃ^２−Ｃ^３−Ｃ^４−Ｃ^５−Ｃ^６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ^６ｂは、水酸基又は−Ｏ−グルコピラノシル基を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。Plant tissues and / or cells producing taxane-type diterpenes are represented by the following general formula (I):

[Wherein R ⁰ is the following formula:
— (CH ₂ ) _n —CO—R ⁷
In the formula, R ⁷ is a hydroxyl group, OM (where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ), NR ^8a R ^8b (where R ^8a and R ^8b are each independently Represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an amino acid residue.), OR ⁹ (where R ⁹ is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or Represents a glucopyranosyl group ) or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 7. Represents a group represented by｝;
^{^{^{^{R 1 a, R 1b, R}}}} 1c, R 1d, R 1e and ^{R 1f} are each a hydrogen atom, a hydroxyl group, a C 1 -C 6 alkyl group carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms;
R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ^6a each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;
Side chain consisting of ^{^{^{^{C 1 -C 2 -C 3 -C 4}}}} -C 5 -C 6 may contain one or more double bonds;
R ^6b represents a hydroxyl group or an —O- glucopyranosyl group ;
The five-membered ring may form a double bond between adjacent ring-membered carbon atoms. ]
The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the culture is performed in the presence of jasmonic acids represented by

タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及び／又は細胞を下記の一般式（II） :

［式中、Ｒ^０は次式：
−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−Ｒ^７
｛式中、Ｒ^７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ_４を表す。）、ＮＲ^８ａＲ^８ｂ（ここで、Ｒ^８ａ,Ｒ^８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ^９（ここで、Ｒ^９は、炭素数１〜６のアルキル基又はグルコピラノシル基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^１ ^a、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ及びＲ^１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ^１−Ｃ^２−Ｃ^３−Ｃ^４−Ｃ^５−Ｃ^６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。Plant tissues and / or cells that produce taxane-type diterpenes have the following general formula (II):

[Wherein R ⁰ is the following formula:
— (CH ₂ ) _n —CO—R ⁷
In the formula, R ⁷ is a hydroxyl group, OM (where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ), NR ^8a R ^8b (where R ^8a and R ^8b are each independently Represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an amino acid residue.), OR ⁹ (where R ⁹ is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or Represents a glucopyranosyl group ) or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 7. Represents a group represented by｝;
^{^{^{^{R 1 a, R 1b, R}}}} 1c, R 1d, R 1e and ^{R 1f} are each a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms;
R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;
Side chain consisting of ^{^{^{^{C 1 -C 2 -C 3 -C 4}}}} -C 5 -C 6 may contain one or more double bonds;
The five-membered ring may form a double bond between adjacent ring-membered carbon atoms. ]
The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the culture is performed in the presence of jasmonic acids represented by

タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及び／又は細胞を下記の一般式（III) ：

［式中、Ｒ^０は次式：
-（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−Ｒ^７
｛式中、Ｒ^７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ_４を表す。）、ＮＲ^８ａＲ^８ｂ（ここで、Ｒ^８ａ, Ｒ^８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ^９（ここで、Ｒ^９は、炭素数１〜６のアルキル基又はグルコピラノシル基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ^１ ^a、Ｒ^１ｂ、Ｒ^１ｃ、Ｒ^１ｄ、Ｒ^１ｅ及びＲ^１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ^１−Ｃ^２−Ｃ^３−Ｃ^４−Ｃ^５−Ｃ^６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。A plant tissue and / or cell producing a taxane-type diterpene is represented by the following general formula (III):

[Wherein R ⁰ is the following formula:
_{_{- (CH 2) n -CO-}} R 7
In the formula, R ⁷ is a hydroxyl group, OM (where M represents an alkali metal atom, an alkaline earth metal atom or NH ₄ ), NR ^8a R ^8b (where R ^8a and R ^8b are each independently Represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an amino acid residue.), OR ⁹ (where R ⁹ is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or Represents a glucopyranosyl group ) or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 7. Represents a group represented by｝;
^{^{^{^{R 1 a, R 1b, R}}}} 1c, R 1d, R 1e and ^{R 1f} are each a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms;
R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;
Side chain consisting of ^{^{^{^{C 1 -C 2 -C 3 -C 4}}}} -C 5 -C 6 may contain one or more double bonds;
The five-membered ring may form a double bond between adjacent ring-membered carbon atoms. ]
The method for producing a taxane-type diterpene according to claim 1, wherein the culture is performed in the presence of jasmonic acids represented by