KR970010602B1 - Process for producing taxol by cell culture of taxus - Google Patents

Abstract

The invention provides a process for producing taxol, a anticancer drug, by tissue culture of yew. the process comprises the steps of: serial culture callus from yew tissue in media containing sodium phosphate and KCl; adding 1-20% by weight coconut water in the middle stage of culture to promote cell growth; adding at least a kind of heavy metal in the late stage of culture to improve amount of taxol. Copper sulfate, ferrous sulfate, cadmium sulfate and lead acetate can be used as heavy metals.

Description

주목의 세포배양에 의한 택솔의 생산방법Production method of taxol by cell culture of yeast

제1도는 주목 세포의 현탁배양시 세포의 생장에 미치는 천연물 첨가의 효과를 보여주는 그래프이고,1 is a graph showing the effect of the addition of natural products on the growth of cells in suspension culture of cells of interest,

제2도는 택솔 표준물질의 고속액체크로마토그램이며,2 is a high performance liquid chromatography of Taxol standard

제3도는 주목 현탁배양세포에 황산구리, 초산납, 황산 카드미움 및 황산질을 첨가한 플라스크 추출물의 고속액제크로마토그램이고,3 is a high-performance chromatogram of flask extracts containing copper sulfate, lead acetate, cadmium sulfate, and sulfates in suspension cultured cells,

제4도는 주목 현탁배양세포에 중금속 이온을 첨가하지 않은 플라스크 추출물의 고속액체크로마토그램이다.4 is a fast liquid chromatogram of a flask extract without heavy metal ions added to suspension cultured cells.

본 발명은 주목으로부터 식물체의 일부를 채취하여 캘러스를 유도하고 이들 캘러스를 액체현탁배양하여 항암제인 택솔(Taxol) 및 택솔 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of extracting a part of a plant from the attention to induce callus and liquid suspension culture of these callus to produce Taxol and Taxol derivatives, which are anticancer agents.

주목은 주목속에 속하며 온대-한대지방에 분포하는 상록성침엽수로서 전 세계적으로 태평양주목(Taxus Brevifolia), 유럽주목(Taxus baccata), 캐나다 주목(Taxus canadenAttention is an evergreen conifer that belongs to the genus and is distributed in temperate-cold regions, and is widely used in the Pacific (Taxus Brevifolia), European (Taxus baccata), and Canadian (Taxus canaden).

sis), 히말라야주목(Taxus wallchiana) 및 국내자생주목(Taxus cuspidata)등이 자생되고 있다.sis), Taxus wallchiana, and Taxus cuspidata.

택솔은 이들의 잎, 줄기, 뿌리 및 종자등의 기관에 존재하는 물질로서 암세포에 탁월한 항앙특성을 나타내어 의약품으로 개발되고 있으며 특히 난소암에 대해서는 1993년 FDA에서 이의 사용허가가 이루어져 있다.Taxol is a substance present in organs such as leaves, stems, roots, and seeds, and has been developed as a medicine by showing excellent antiangiogenic properties to cancer cells. Especially, in 1993, the FDA approved the drug for ovarian cancer.

택솔은1971년 와니 등(M.C. Wani, H.L. Taylor, M.E. Wall, P.Coggon, A, T. McPhail J.Am. Chem. Soc.(1971), 93 : 2325)에 의해 그 화학적구조가 처음 밝혀졌고 이들 택솔의 분리방법 등이 상세히 알려져 있다.(Keith M. Witherwp, et al. Jr. Liquid Dhromatogram.(1989). 12(11) : 2117-2312, S. D. Harvey et al. Jr. Chrmato-graphy(1991)300-305).Taxol was first identified in 1971 by MC Wani, HL Taylor, ME Wall, P. Coggon, A, T. McPhail J. Am. Chem. Soc. (1971), 93: 2325. Methods for separating these taxols are known in detail (Keith M. Witherwp, et al. Jr. Liquid Dhromatogram. (1989). 12 (11): 2117-2312, SD Harvey et al. Jr. Chrmato-graphy (1991). 300-305).

이 물질은 주목의 줄기 껍질부위에 0.01 내지 0.02 퍼센트 정도로 가장 많이 함유되어 있으나 일부 품종을 제외하고는 성장 속도가 극히 느리고, 껍질을 채취한 후 주목나무의 생장이 이루어지지 않는 점, 환경보호 차원에서의 껍질 채취가 제한되는 점 및 껍질에서 얻을 수 있는 택솔의 함량이 극히 낮은 점 등의 문제로 대량추출이 어려운 실정이다. 예를 들어 1kg의 택솔을 얻기위해서는 50-200년 이상된 성목 3,000주 이상을 절단하여야(약 10톤 껍질소요)하는 비합리적인 면이 있으며 이들을 추출하기 위한 껍질 채취 운반 및 추출 방법이 복잡하고 까다롭다. 따라서 세계각국에서는 보다 효율적인 방법을 강구하고자 택솔의 합성 및 반합성법과 조직배양법, 주목의 직접 식재법 등이 모색되고 있으나, 택솔의 합성법은 합성의 단계가 불분명하고 수율이 극히 낮아 대량생산에는 부적절한 방법이며, 주목식재법은 이의 수확까지의 기간이 20-50년 이상소요되고 광대한 토지가 필요한 등의 단점이 있다. 반면 식물조직배양에 의한 생산법은 그 생육주기가 3주 내지 한달로 극히 짧고, 주목을 질단하지 않아도 되며, 노지배지가 필요 없는 점등의 장점을 가지고 있어 가장 이상적인 방법이 될 수 있다.This substance is most contained in the stem bark area of yew (0.01 to 0.02 percent), but except for some varieties, the growth rate is extremely slow, and the growth of yew tree is not possible after the bark is collected. It is difficult to extract a large amount due to the problem that the bark extraction is limited and the content of taxol obtained from the bark is extremely low. For example, in order to obtain 1 kg of taxol, there are some irrational aspects of cutting more than 3,000 strains of 50-200 year old trees (about 10 tonnes of bark), and the method of transporting and extracting bark to extract them is complicated and difficult. Therefore, in order to find a more efficient method, the synthesis and semi-synthesis of TAXOL, the method of tissue culture, and the direct planting method of attention are being sought in the world. However, the TAXOL synthesis method is unsuitable for mass production due to the unclear stage and the extremely low yield. For example, the attention planting method has disadvantages such as the time required for harvesting for 20-50 years or more and the need for vast land. On the other hand, the production method by plant tissue culture may be the most ideal method because the growth cycle is extremely short, 3 weeks to a month, do not have to be noticed, the advantage of no littering medium.

조직배양에 의한 택솔의 생산방법에 관한 연구는 극히 미흡한 편으로 최근에는 몃 편의 연구결과가 보고되어 있는 실정이다(Gary A. Strobel et al, Plant Sci. 1992 : 84 : 65-74, Enaksha R Widkremesinhe and Richard N. Arteca Plant Cell Rep. 1993. 12 : 80-83).The research on the production method of taxol by tissue culture is very poor, and recently, the results of the research on the larvae have been reported (Gary A. Strobel et al, Plant Sci. 1992: 84: 65-74, Enaksha R Widkremesinhe and Richard N. Arteca Plant Cell Rep. 1993. 12: 80-83).

이들에 의하면 고체배양 즉, 캘러스 수준에서의 택솔을 확인 동정하는 수준에 머물러 있으며 액체배양에 의한 생산의 결과는 나타나 있지 않다.According to them, they remain at the level of identifying and identifying taxols at the solid culture, ie callus level, and the results of the production by liquid culture are not shown.

선행 특허로는 1991년 미국의 크리스텐 등의 태평양주목의 조직배양에 의한 생산에 관한 특허(Alice A. Christen et al. usp 5,019,504)와 일본의 사이또 등이 주목종의 세포배양에 의한 택솔 공정에 관한 특허(Saito, Koii et al, WO92/13961)등이 있으나 크리스텐 등에 의한 미국 특허상에 기술된 방법에 따라 B5배지를 이용하여 캘러스를 유도할 경우 캘러스의 갈변 및 고사현상이 심하여 적절하지 못하고, 사이또 등이 기술한 SH배지 및 관련 생장조절물질, 예를 들어 지베렐린 및 벤질아데닌의 처리, 초산 나프탈렌 카이네틴의 처리 등의 방법을 사용했을 경우에도 캘러스의 갈변현상이 심하였고 세포의 현탁배양시 이의 성장속도가 느려서 택솔의 생산량도 매우 낮은 결과를 나타내었다.Prior patents include patents related to the production of tissue cultures in Pacific Ocean (Christian et al., 1991) (Alice Christen et al. Usp 5,019,504), and Saito, Japan. (Saito, Koii et al, WO92 / 13961), but the callus induction callus using B5 medium according to the method described in the US patent by Christen et al. In case of using SH medium described by Saito et al. And related growth regulators such as gibberellin and benzyladenin and naphthalene kainetin acetate, the browning of callus was severe. In suspension culture, the growth rate of the sol was also very low.

특히 조직배양에 의한 택솔의 생성만 보고되어 있을 뿐 유도물질의 사용에 의한 택솔 유도체의 생산에 대해서는 언급되어 있지 않고 있다.In particular, only the production of taxol by tissue culture has been reported, but there is no mention of the production of taxol derivatives by the use of inducers.

따라서 같변현상이 없으면서 세포를 높은 속도로 생장시켜 택솔을 고농도로 생산할 수 있는 배양방법의 제공이 요망되어 왔다.Therefore, it has been desired to provide a culture method capable of producing a high concentration of taxol by growing cells at high speed without the same phenomenon.

이러한 상황하에서 본 발명자들은 이러한 갈변현상을 개선하고 세포의 높은 생장속도를 얻기 위하여 예의 연구한 결과, 공지의 무라시게-스쿡배지(이하 MS배지라 칭함)에 산화방지제로 알려져 있는 몇가지 화합물을 첨가해 본 결과 인산나트륨 및 염화칼륨을 적당량 첨가한 처리구에서 갈변화가 적은 양호한 상태의 세포를 얻을 수 있었으며 코코넛워터를 1-20% 농도로 첨가한 결과 세포의 생장이 급속히 이루어짐을 발견하였다.Under these circumstances, the present inventors have diligently studied to improve such browning and obtain high cell growth rates. As a result, some compounds known as antioxidants have been added to the known Murashige-cook medium (hereinafter referred to as MS medium). As a result, it was found that the cells in good condition with little brown change were obtained in the treatment group to which sodium phosphate and potassium chloride were added in an appropriate amount, and the growth of the cells was rapidly achieved as the result of adding 1-20% of coconut water.

그러나, 한편 배양기간이 경과할수록 또는 코코넛워터를 함유한 배지에서 계속 계대배양을 반복할 경우 배양초기에 나타났던 세포의 생장효과가 없어지고 오히려 배지의 산화를 유발하여 세포의 생장을 억제하는 2중성을 갖고 있다는 것 또한 발견하였다.However, as the incubation period elapses, or if the subculture is continued in a medium containing coconut water, the growth effect of the cells that appeared at the beginning of the culture is lost, but rather the duality that inhibits the growth of the cells by inducing the oxidation of the medium. We also found that we have

따라서 이러한 코고넛워터의 2중성에 착안하여, 본 발명자들은 배지의 갈변방지와 세포의 생장을 촉진하는 방법으로 갈변억제용 배지에서 세포를 1주일간 생장시킨 후에 코코넛워터를 첨가하는 세포생육 단계와 코코넛워터 첨가 1주일 후 택솔의 생산을 유도하는 물질 즉, 중금속 이온물질을 첨가하는 택솔생산 단계로 이루어지는 방법을 발명하게 되었는데, 이 방법에 의해 택솔의 함량증가가 이루어졌을 뿐 아니라 택솔의 유도체인 10-디아세틸 바카틴 Ⅲ의 생성도 함께 이루어짐을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, focusing on the duality of such coconut nut water, the present inventors have grown the cells in browning medium for one week in a method for preventing browning of the medium and promoting the growth of the cells, and then adding the coconut water to the cell growth step and coconut. One week after the addition of water, the inventors invented a method comprising Taxol production, which adds a substance that induces the production of taxol, that is, a heavy metal ionic material. This method not only increased the content of Taxol but also a derivative of Taxol 10- It was found that the production of diacetyl baccatin III was also accomplished to complete the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 주목의 세포를 조직배양하여 택솔을 생산하는 방법에 있어서, 주목의 생체조직의 캘러스로부터 얻은 현탁세포를 인산나트륨과 염화칼륨이 첨가된 배지에서 계대배양하면서 배양증기에 코코넛워터를 첨가하는 세포 생육단계, 및 배양 말기에 중금속 이온물질을 첨가하는 택솔 생산 단계를 포함함을 특징으로 하는 택솔의 생산방법에 관한 것이다.Accordingly, an object of the present invention is a method for producing taxol by tissue culture of cells of interest, wherein the suspension cells obtained from the callus of the biological tissues of interest are cultured in a medium containing sodium phosphate and potassium chloride and cultured with coconut water. It relates to a cell growth step of adding, and a Taxol production method comprising the Taxol production step of adding a heavy metal ionic material at the end of the culture.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

조직배양에 사용한 식물제는 주목속의 국내자생주목(T.cuspidata), 유럽주목(T.baccata) 및 태평양주목(T.brevifolia)을 사용한다. 캘러스유도에 적절한 절편으로 주목의 줄기, 뿌리, 종자 및 잎을 사용하는 것이 양호하며 배양체의 오염방지를 위해 조직을 배양하기 전에 표면살균한다. 표면살균은 공지의 방법대로 차아 염소산용액에 의해 할 수 있으며 가정용 세제로도 행할 수가 있다. 종자의 경우, 표면살균 후 하루정도 물에 침지하고 핀셋과 칼로서 종피를 제거하고 종피내의 배유 및 배를 채취하여 사용한다.Plants used for tissue culture use T.cuspidata, T.baccata and T.brevifolia. Use stems, roots, seeds and leaves of interest as an appropriate section for callus induction and are surface sterilized before culturing the tissue to prevent contamination of the culture. Surface sterilization can be performed with hypochlorous acid solution according to a known method, and can also be performed with household detergents. Seeds are soaked in water for about a day after surface sterilization, and the seedlings are removed with tweezers and a knife.

이들 조직을 표 1과 같이 MS배재, B-배지, SH-배지, 화이트지 및 헬러배지에 치상하면 2-4주후 캘러스가 형성되고 이들 캘러스를 한천이 없는 액제배지에 옮겨 진탕하면 단세포 또는 및개의 세포로 구성된 세포괴를 얻을 수 있다.When these tissues were placed on MS medium, B-medium, SH-medium, white paper and HeLa medium as shown in Table 1, callus was formed after 2-4 weeks, and the callus was transferred to agar-free liquid medium and shaken to single cells or dogs. A cell mass composed of cells can be obtained.

이들 배양세포액에 배양중기, 즉 배양시작 약 1주일 경과 후에 코코넛워터를 l-20중량%로 첨가하면 세포의 생장을 더욱 촉진시킬 수가 있다. 약 2주 배양후 택솔의 생산을 증진시키기 위해 황산구리, 황산철, 황산카드미움 또는 초산납등의 중금속물질을 유도물질(elicitor)로서 첨가하고 배양이 완료된)세포 및 배지를 헥산과 메닐렌클로라이드와 같은 유기용매를 이용한 공지의 추출방법(Keith M. et al. J. of Natural products(1990) 53(5) : 1249-1255, Arthur G. et al. P1anta med.(1992)58 : 464-466)에 의해 택솔 및 택솔 유도제를 추출분리한다. 배양말기에 배지에 첨가되는 중금속 이온물질의 양은 0.1 -1.0mMd이다.When the medium is added to the cultured cell solution, that is, about 1 week after the start of culture, l-20% by weight of coconut water can further promote cell growth. After about two weeks of cultivation, heavy metals such as copper sulfate, iron sulfate, cadmium sulfate or lead acetate are added as elicitors to enhance the production of taxol, and the cultured cells and media such as hexane and menylene chloride are added. Known extraction methods using organic solvents (Keith M. et al. J. of Natural products (1990) 53 (5): 1249-1255, Arthur G. et al. P1anta med. (1992) 58: 464-466) Taxol and Taxol derivatives are separated by The amount of heavy metal ionic material added to the medium at the end of the culture is 0.1 -1.0mMd.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples.

(실시예 1)(Example 1)

국내자생구목, 태평양주목 및 유럽산 주목의 껍질, 껍질을 포함한 줄기, 잎 및 뿌리등 4가지를 채취하여 흐르는 수돗물에 하룻밤 동안 세척하였다. 세척한 각 시료를 가정용 세제에 2-3분간 담구어 표면의 오물을 제거하고 수돗물로 세제를 제거하였다. 시료를 적절한 크기로 세절하며 비이커에 넣고 70% 에탄올 용액을 가하여 30초간 살균한 다음 3% 과산화수소용액에 20 내지 30분 동안 진탕하여 시료를 재차 표면살균한다. 표면살균후 멸균된 이온수로 3회 이상 세척하여 시료에 남은 소독액을 제거하고 미리 멸균해 놓은 샤알레에 옮겨 껍질을 0.5평방센티미터로, 껍질을 포함한 줄기 및 뿌리는 1센티미터로 질단하고, 잎은 상부 및 하부의 손상조직을 제거한 후 MS배지, B-5배지 및 헬러배지에 생장조절물질로서 2.4-D의 농도를 달리하여 첨가한 한천배지에 치상하였다.Four kinds of Korean native tree, Pacific tree and European yew bark, stem including stem, leaf and root were collected and washed overnight under running tap water. Each washed sample was immersed in a household detergent for 2-3 minutes to remove surface dirt and to remove the detergent with tap water. The sample is cut into appropriate sizes, placed in a beaker, sterilized for 30 seconds by adding 70% ethanol solution, and shaken again for 20-30 minutes in 3% hydrogen peroxide solution. After surface sterilization, wash at least 3 times with sterilized deionized water to remove the disinfectant solution from the sample and transfer it to the pre-sterilized Shaale, and peel the stem to 0.5 square centimeters, stem and root including the shell to 1 centimeter, and the leaf is top After removal of the damaged tissues of the lower and MS agar, B-5 medium and Hela medium medium was added to the agar medium with different concentrations of 2.4-D as growth regulator.

시료의 배양은 25℃의 암배양실에서 행하면서 캘러스를 유도하였는데 기본배지를 MS배지로 하였을때 얻은 결과는 표 2와 같다.Incubation of the samples was carried out in a cancer culture room at 25 ℃ induction of callus, the results obtained when the basic medium to the MS medium is shown in Table 2.

결과의 산정은 치상한 시료에 대한 캘러스의 형성 비율로 나타내었다.The calculation of the results is expressed as the ratio of callus formation to the intact sample.

[표 1]. 조직배양용 배지의 조성TABLE 1 Composition of Tissue Culture Medium

[표 2]. 주목 채취부위별 캘러스 유도에 미치는 24-D의 효과TABLE 2 Effect of 24-D on Callus Induction by Attraction

표에서 보는 바와 같이 캘러스의 형성은 줄기 뿌리 및 잎 조직에서 2.4-D의 농도를 1.0-5.0mg/L의 비율로 첨가하였을때 가장 양호하였다.As shown in the table, callus formation was best when the concentration of 2.4-D was added at a ratio of 1.0-5.0 mg / L in stem root and leaf tissue.

(실시예 2)(Example 2)

자생주목의 암나무에서 결실된 미숙종자를 채취하여 하룻밤 동안 물에 침지하여 종자가 침윤한 상태로 한 다음 실시예 1의 살균방법에 의해 에탄올 및 과산화수소로서 표면살균을 행하였다.The immature seeds that had been deleted from the native trees were collected, soaked in water overnight, and the seeds were infiltrated. Then, the sterilization method of Example 1 was used for surface sterilization as ethanol and hydrogen peroxide.

살균이 끝난 종자를 메스 및 핀셋을 이용하여 종피를 제거하고 배유와 배유의 기부에 존재하는 배를 별도로 분리하여 그 조성이 알려져 있는 MS배지, B-5배지, 화이트배지 및 NT배지에 생장조절물질로서 카이네틴을 0.1mg/L 첨가하고 탄소원으로 이때 배로부터 캘러스의 발현이 적합한 오옥신으로서 2.4-D와 인돌초산(indole acetic acid, 1AA)를 첨가하였으며 그 결과는 표 3과 같다.Sterilized seeds are removed by using scalpels and tweezers and separated from the embryo and the embryo at the base of the embryo. Growth regulators in MS medium, B-5 medium, white medium and NT medium are known. 0.1 mg / L of cinetin was added as a carbon source, and 2.4-D and indole acetic acid (1AA) were added as oxins suitable for expression of callus from the embryo as a carbon source, and the results are shown in Table 3.

결과의 산정은 치상한 배에 대해 캘러스를 형성함 배의 비율로 나타내었다.The calculation of the results is expressed as the ratio of callus forming pears to pear embryos.

[표 3]. 배지로부터 캘러스 유도에 미치는 기본배지 및 오옥신의 영향TABLE 3 Effect of Basal Medium and Auxins on Callus Induction from Medium

(실시예 3)(Example 3)

실시예 1과 2에서 얻은 캘러스를 2.4-D가 0.1-5.0mg/L 함유된 MS 한전배지에 옮겨 캘러스의 증식을 도모하였다. 계대배양은 0.5g내의 캘러스가 배양 4주 내지 6주 정도 경과하면 5g내외의 캘러스로 성장하였을 때 행하였다.Callus obtained in Examples 1 and 2 was transferred to MS KEPCO medium containing 0.1-5.0 mg / L of 2.4-D to promote callus growth. Subculture was performed when callus in 0.5 g grew to callus in about 5 g after 4 to 6 weeks of culture.

몇번의 계대배양을 행하며 얻은 캘러스는 현탁배양을 시도하였는데 한천을 첨가하지 않은 MS액체배지 50ml를 200ml 삼각플라스크에 넣고 고압멸균한 다음, 5g내외의 켈러스를 접종하고 배양기의 회전속도를 100-110rpm으로 조절하여 배양하였다. 현탁배양 3-4주후 배양세포 10ml씩을 동일조건의 배지 40ml에 현탁하여 계대배양하였다.Callus obtained through several passages was suspended in culture. 50 ml of MS liquid medium without agar was added to a 200 ml Erlenmeyer flask and autoclaved, inoculated with 5 g of callus and the rotation speed of the incubator was 100-110 rpm. Cultured by adjusting to. After 3-4 weeks of suspension culture, 10 ml of cultured cells were subcultured by suspending in 40 ml of medium under the same conditions.

(실시예 4)(Example 4)

실시예 3에서 배양을 계속한 결과 세포의 갈변현상이 배양을 거듭할수록 심화되어 이를 방지하고자 갈변 방지 물질로서 아스코르브산, 구연산, 활성탄, 폴리미닐피리리돈(PVP), 아미노산 복합물(글루타민, 아르지닌 및 아스파라진 혼합물), L-시스테인, 또는 인산나트륨과 염화칼륨의 혼합물을 첨가하여 본 결과 표 4에서 보는 바와 같이 인산나트륨과 염화칼륨의 혼합첨가구에서 갈변의 억제 효과가 두드러지게 나타났다.As a result of continuing the culture in Example 3, the browning phenomenon of the cells is intensified as the culture is repeated, to prevent this, ascorbic acid, citric acid, activated carbon, polyminylpyrididone (PVP), amino acid complexes (glutamine, arginine and Asparagine mixture), L-cysteine, or a mixture of sodium phosphate and potassium chloride, the results showed that the browning inhibitory effect was noticeable in the mixed addition of sodium phosphate and potassium chloride as shown in Table 4.

[표 4]. 갈변억제 물질의 첨가효과TABLE 4 Effect of Browning Inhibitor

-:효과없음, [불균일함, + : 다소효과있음, +++ : 효과가 큼-: No effect, [Uniformity, +: Somewhat effective, +++: Great effect

(실시예 5)(Example 5)

실시예 4에서 얻은 결과로 주목의 세포배양시 발생되는 갈변물질의 억제효과가 두드러져 갈색의 세포액이 거의 황백색의 양호한 생육상을 나타내었다.As a result obtained in Example 4, the inhibitory effect of the browning material generated during the cell culture of attention was remarkable, and the brown cell solution showed almost yellowish white good growth.

따라서 인산나트륨 및 염화칼륨을 첨가한 MS배지에서 이들 배양세포의 생장기간을 더욱 단축시키고자 MS배지의 무기 영양원을 보충할 수 있는 효모추출물, 카제인 수화물, 감자전분, 사과즙, 옥수수 전분 또는 코코넛워터를 배양 1주된 세포액에 각각 첨가하였다.Therefore, yeast extracts, casein hydrates, potato starch, apple juice, corn starch or coconut water are cultured in MS medium supplemented with sodium phosphate and potassium chloride to further shorten the growth period of these cultured cells. Each was added to the main cell solution.

실험결과 제1도에 보는 바와 같이 코코넛워터를 비재액량 대비 15% 농도로 하며 첨가한 처리구에서 세포의 생장 과정중의 초기와 중기의 생장을 급속히 증가시켜 배양 2주후에 세포의 성장이 완료되었다. 이는 실시예 3에서 배양세포의 생육주기 3-4주 소요되었딘 것에 비해 1주일 이상의 배양기간을 단축하는 효과를 나타내는 것이다. 제1도에서 있어서, -■-는 태평양주목 15%를 첨가한 구, -+-는 효모추출물을 첨가한 구, -*-는 카제인 수화물을 첨가함 구, -□-는 옥수수 전분을 첨가한 구, -×-는 감자 전분을 첨가한 구, 그리고, -▲-는 아무것도 첨가하지 않은 구를 나타낸다.As shown in FIG. 1, the growth of the cells was completed two weeks after the cultivation by rapidly increasing the initial and middle stages of the growth of the cells. This shows the effect of shortening the culture period of one week or more as compared to the growth cycle of the cultured cells 3-4 weeks in Example 3. In FIG. 1,-■-is added with 15% of Pacific Note,-+-is added with yeast extract,-*-is added with casein hydrate, and-□-is added with corn starch. The phrase, -x-, represents a sphere to which potato starch is added, and-▲-represents a sphere to which nothing is added.

(실시예 6)(Example 6)

실시예 5에서 얻은 배양 2주된 배양세포에 황산구리를 1.0mM농도로 첨가하여 1주간 배양하였다.Cultured in Example 5 The cultured two-week cultured cells were added with 1.0 mM copper sulfate and cultured for one week.

배양이 끝난 후 여과지로 여과하여 배양세포는 마쇄기로 분쇄후 메탄올과 메틸렌클로라이드를 1 : 1의 비율로 혼합한 용매를 가하여 택솔을 추출하였다.After the incubation was completed, the resultant was filtered with a filter paper, and the cultured cells were crushed with a crusher, and methanol and methylene chloride were added in a ratio of 1: 1.

여과한 배지는 메틸렌클로라이드를 배지와 동량 가하여 추출한 다음 메틸렌클로라이드층을 분액깔대기를 이용하며 회수하고 배양세포 추출액과 합한 다음 37℃로 감압 농축하여 건조시킨 후 1ml 에탄올로 용해하여 고속액체크로마토그래피를 이용하여 중금속 첨가에 의한 택솔 및 이의 유도체의 생성을 확인하였다.The filtered medium was extracted by adding the same amount of methylene chloride to the medium, and then the methylene chloride layer was recovered using a separatory funnel, combined with the culture cell extract, concentrated under reduced pressure at 37 ° C, dried and dissolved in 1ml ethanol to use high-performance liquid chromatography. The production of taxol and its derivatives by heavy metal addition was confirmed.

고속액체크로마토그래피의 분석조건으로는 컬럼 Curosil-G를 사용하였고 용매계로 50% 아세토나이트릴용액을 사용하였다. 그 결과 95분대에서 10-디아세틸-바카틴 Ⅲ, 14.6분내에서 바카틴 Ⅲ, 그리고 26.9분대에서 택솔의 피크가 각각 출현하였다.Column Curosil-G was used as analytical conditions for high performance liquid chromatography and 50% acetonitrile solution was used as the solvent system. As a result, peaks of taxol appeared in 10-diacetyl-baccatin III in 95 minutes, bacatin III in 14.6 minutes, and 26.9 minutes in each.

(실시예 7)(Example 7)

실시예 5에서 얻은 배양 2주된 배양세포에 황산구리, 초산납, 황산카드미움 및 황산칠을 각각 0.5mM농도로 첨가하여 1주간 배양하였다.The cultured two-week cultured cells obtained in Example 5 were incubated for one week by adding copper sulfate, lead acetate, cadmium sulfate, and lacquer sulfate at 0.5 mM concentrations, respectively.

배양이 끝단후 여과지로 여과하여 배양세포는 마쇄기로 분쇄후 메탄올과 메틸렌클로라이드를 1 : 1의 비율로 혼합한 용매를 가하여 택솔을 추출하였다.After the incubation was completed, the cells were filtered with a filter paper, and the cultured cells were crushed with a crusher, and methanol and methylene chloride were added in a ratio of 1: 1, and taxol was extracted.

여과한 배지는 메틸렌클로라이드를 배지와 동량 가하여 추출한 다음 메틸렌클로라이드층을 분액깔대기를 이용하여 회수하고 배양세포 추출액파 합한다음 37℃로 감압 농축하여 건조시킨 후 1ml 에단올로 용해하며 고속액체크로마토그래피를 이용하여 중금속 첨가에 의한 택솔 및 이의 유도체의 생성을 확인하였다.The filtered medium was extracted by adding the same amount of methylene chloride to the medium, and then the methylene chloride layer was recovered using a separatory funnel, combined with the culture cell extract, concentrated under reduced pressure at 37 ° C, dried and dissolved in 1 ml of ethanol, followed by high-performance liquid chromatography. The production of taxol and its derivatives by heavy metal addition was confirmed.

고속액체크로마토그래피의 분석조건으로는 컬럼 쿠로실-지(Curosi1-G)를 사용하였고 용매계로 50% 아세토나이트릴 용액을 사용하였다.As analytical conditions of high performance liquid chromatography, column Kurosyl-G (Curosi1-G) was used and a 50% acetonitrile solution was used as a solvent system.

한편 미국 암연구소(NCI)에서 분양받은 택솔 표준물질에 대하여 동일 조건하에서 고속액체크로마토그레피하여 얻은 결과를 나타내는 제2도와 본 발명에서 얻은 배양물의 고속액체크로마토그래피의 결과를 나타내는 제3도를 비교하여 확인해 본 결과, 10-디아세닐-바카틴 Ⅲ은 9.5분대에서, 바카틴Ⅲ은 14.6분대에서, 택솔은 26.9분대에서 각각 그의 피크가 출현하여 본 발명에서 사용한 방법에 의해서 택솔 및 이의 유도체인 10-디아세틸-바카틴 Ⅲ과 바카틴 Ⅲ이 생성됨을 알 수 있다.On the other hand, compared to Figure 2 showing the results obtained by high-speed liquid chromatography on the Taxol standard material sold by the American Cancer Institute (NCI) under the same conditions and Figure 3 showing the results of high-speed liquid chromatography of the culture obtained in the present invention As a result, 10-diazenyl-baccatin III showed peaks at 9.5, bacatin at 14.6, and taxol at 26.9, respectively, according to the method used in the present invention. It can be seen that diacetyl-bakatin III and bacatin III are produced.

(비교예 1)(Comparative Example 1)

실시예 7과 동일하게 실시하되, 중금속으로 첨가된 물질들을 전혀 첨가하지 않고 배양을 하였다. 배양물을 고속액체크로마토그래피한 결과를 제4도에 나타내었다. 제4도에서 알 수 있는 바와 같이, 중금속을 첨가하지 않은 배양물에서는 택솔 또는 그의 유도체의 피크가 출현하지 않았다.Example 7 was carried out in the same manner as, but was cultured without adding any heavy metals. The result of the high performance liquid chromatography of the culture is shown in FIG. As can be seen in FIG. 4, no peak of Taxol or its derivatives appeared in cultures without addition of heavy metals.

본 발명자들은 실시예 7에서와 같이 택솔과 그의 유도체의 존재를 확인하였을 뿐만 아니라, 실시예 7에서 얻은 시료를 대량분리용 고속액체크로마토그래피를 이용하며 택솔 분액만을 취한후, 분리한 택솔을 미국 하와이 바이오테크놀로지그룹에서 개발 판매하고 있는 표준시약을 이용하여 공지의(Jaziri M et. al. J1. Pharm. BELG.(1991)46(2) : 93-99) 항원항체 면역반응법(ELISA)으로서 이의 생성을 재확인하였다.In addition to confirming the presence of taxol and its derivatives as in Example 7, the inventors took only the Taxol aliquots using the high-performance liquid chromatography for mass separation, and separated the Taxol separated from Hawaii, USA. Using a standard reagent developed and marketed by the Biotechnology Group, it is known as an antigen antibody immunoassay (ELISA) known in the art (Jaziri M et. Al. J1. Pharm. BELG. (1991) 46 (2): 93-99). The production was reconfirmed.

Claims (4)

주목의 세포를 조직배양하여 택솔을 생산하는 방법에 있어서, 주목의 생체조직의 캘러스로부터 얻은 현탁세포액을 인산나트륨과 염화칼륨이 첨가된 배지에서 계대배양하면서 배양중기에 코코넛워터를 첨가하여 세포의 생육을 촉진하는 세포생육단계; 및 배양말기에 중금속 이온물질을 첨가하여 택솔을 생상하는 택솔 생산단계를 포함함을 특징으로 하는 택솔의 생산방법.In the method for producing taxol by tissue culture of cells of interest, suspending cell solution obtained from callus of biological tissues of interest is cultured in medium containing sodium phosphate and potassium chloride, and the growth of cells is added to the medium during the culture. Promoting cell growth; And a taxol production step of producing taxols by adding heavy metal ionic substances at the end of the culture. 제1항에 있어서, 주목은 국내자생주목(Taxus cuspidata), 태평양주목(Taxus brevifokia) 또는 유럽산 주목(Taxus baccata)임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the yew is Taxus cuspidata, Taxus brevifokia or Taxus baccata. 제1항에 있어서, 세포생육단계에서 첨가되는 코코넛워터의 양은 1∼20중량%임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the amount of coconut water added in the cell growth step is 1 to 20% by weight. 제1항에 있어서, 택솔 생산단계에 첨가되는 중금속 이온물질은 황산구리, 황산철, 황산카드미움 또는 초산납에서 선택된 1종 또는 2종 이상이며, 그의 첨가량은 0.1∼1.0mM임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the heavy metal ionic material added to the taxol production step is one or two or more selected from copper sulfate, iron sulfate, cadmium sulfate, and lead acetate, and the amount thereof is 0.1-1.0 mM.