JPWO2020040166A1 - 腸管神経前駆細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
神経堤細胞(Neural Crest Cell: NCC)は、発生初期において神経板から神経管が形成される際に、神経外胚葉と表皮外胚葉の間から発生する細胞である。腸管神経前駆細胞(Enteric Neural Precursor: ENP)は、このNCCから発生し、腸管神経細胞系譜へと分化した細胞である。ENPは、腸管神経細胞およびグリア細胞への分化能を有する。
また、非特許文献3には、ヒトiPSCをTGFβ阻害剤、GSK3β阻害剤およびNRG1を含む培地で培養することにより、シュワン前駆細胞(Schwann cell precursor)を作製したことが記載されている。非特許文献3に記載される方法はレチノイン酸を用いておらず、得られるシュワン前駆細胞はENPとは異なる細胞である(例えば、ENPはPHOX2B発現が陽性であるが、同文献に記載されるシュワン前駆細胞は陰性である)。
[1] 以下の工程を含む、腸管神経前駆細胞の製造方法。
(A1)腸管神経前駆細胞を提供する工程。
(A2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中で腸管神経前駆細胞を培養する工程。
[2] 前記培地が、さらにTGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む、[1]の製造方法。
[3] 前記培地が、さらにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む、[1]または[2]の製造方法。
[4] 前記培地が、さらにGDNFを含む、[1]〜[3]のいずれかの製造方法。
[5] 前記培地が、さらにマトリゲルを含む、[1]〜[4]のいずれかの製造方法。
[6] 前記ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストが、NRG1である、[1]〜[5]のいずれかの製造方法。
[7] [1]〜[6]のいずれかの製造方法によって得られる腸管神経前駆細胞。
[9][7]の腸管神経前駆細胞を含む細胞医薬。
(B1)神経堤細胞を提供する工程。
(B2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニスト、ならびにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む培地中で神経堤細胞を培養する工程。
[11] 前記神経堤細胞が、迷走神経提細胞である、[10]の製造方法。
[12] 前記迷走神経堤細胞が、SOX10陽性、HOXB5陽性、HOXB9陰性かつPHOX2B陰性であり、
前記腸管神経前駆細胞が、SOX10陽性かつPHOX2B陽性である、[11]の製造方法。
[12a] 前記培地が、さらにTGFβ阻害剤および/またはGSK3β阻害剤を含む、[10]〜[12]の製造方法。
[12b]前記培地が、さらにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む、[10]〜[12a]のいずれかの製造方法。
[12c] 前記培地が、さらにGDNFを含む、[10]〜[12b]のいずれかの製造方法。
[12d] 前記培地が、さらにマトリゲルを含む、[10]〜[12c]のいずれかの製造方法。
[12e] 前記ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストが、NRG1である、[10]〜[12d]のいずれかの製造方法。
[12f] [10]〜[12e]のいずれかの製造方法によって得られる腸管神経前駆細胞。
[14] さらにTGFβ阻害剤および/またはGSK3β阻害剤を含む、[13]の培地。
[15] さらにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む、[13]または[14]の培地。
[16] さらにGDNFを含む、[13]〜[15]のいずれかの培地。
[17] さらにマトリゲルを含む、[13]〜[16]のいずれかの培地。
[18] 前記ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストが、NRG1である、[13]〜[17]のいずれかの培地。
(C1)腸管神経前駆細胞を提供する工程。
(C2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中で腸管神経前駆細胞を培養する工程。
[21] 腸管神経前駆細胞と後腸細胞とを共培養することにより腸管オルガノイドを得る工程と、前記腸管オルガノイドを生体内に移植して人工腸管を形成させる工程と、を含む人工腸管の製造方法。
[21a]腸管神経前駆細胞と後腸細胞とを共培養することにより腸管オルガノイドを得る工程と、前記腸管オルガノイドをヒト以外の哺乳動物の生体内に移植して人工腸管を形成させる工程と、を含む人工腸管の製造方法。
[22] 前記腸管神経前駆細胞が、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の製造方法によって得られた腸管神経前駆細胞である、[20]〜[21a]記載の製造方法。
[23] [20]または[22]の製造方法によって得られる腸管オルガノイド。
[24] [21]〜[22]のいずれかの製造方法によって得られる人工腸管。
[26] ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストの、腸管神経前駆細胞の拡大培養のための使用。
[27] 前記ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストが、NRG1である、[25]の添加剤または[26]の使用。
「迷走神経提細胞(Vagal NCC)」とは、発生期において体節1番〜7番に相当する部位から生じ、腸管神経系などに分化する細胞集団である。迷走神経提細胞は、神経堤細胞マーカーであるSOX10陽性であり、HOXB5陽性、HOXB9陰性、かつPHOX2B陰性である。好ましくは、SOX10陽性であり、HOXB1-7陽性、HOXB9陰性、HOXB10陰性、かつPHOX2B陰性である。
「体幹神経堤細胞(Trunk NCC)」とは、発生期において体節8番から尾側に相当する部位から生じ、自律神経系、感覚神経、色素細胞および副腎髄質のクロマフィン細胞などに分化する細胞集団である。体幹神経堤細胞は、神経堤細胞マーカーであるSOX10陽性であり、HOXB1-9陽性、HOXB10陰性かつPHOX2B陰性である。
「仙骨神経堤細胞(Sacral NCC)」とは、発生期において最尾側に相当する部位から生じ、大腸の一部の腸管神経系などに分化する細胞集団である。仙骨神経堤細胞は、神経堤細胞マーカーであるSOX10陽性でありHOXB1〜10陽性かつPHOX2B陰性である。
「腸管神経細胞」とは、腸管神経前駆細胞に由来し、PHOX2B陽性かつSOX10陰性である。
「グリア細胞」とは、S100β陽性、PLP1陽性かつSOX10陽性であるか、またはGFAP陽性である。本明細書においては、グリア細胞を特に「腸管グリア細胞」と称する場合がある。腸管グリア細胞は、例えば、腸管神経前駆細胞をグリア細胞へ分化させることにより得ることができる。
「腸管神経前駆細胞培地」とは、ENPの製造および/またはENPの拡大培養のために用いられる培地である。ENPの製造とは、iPS細胞、ES細胞およびNCC等の幹細胞からENPへ分化させることを含み得る。
「人工腸管」とは、腸管オルガノイドをヒトまたはヒト以外の哺乳動物の生体内に移植して成熟化させて得られる組織構造体であって、ヒト等の哺乳動物の腸が有する複数の機能(例えば、蠕動運動機能、粘液分泌機能、物質吸収機能等)あるいはこれらに類似した機能の1以上を有する組織構造体を意味する。人工腸管は、例えば、腸管オルガノイドをマウス等の哺乳動物の体内(例えば、腹腔内)に移植し、一定期間経過させることにより作製される。人工腸管は、例えば、後腸細胞、前腸細胞等の腸管を構成する種々の細胞の由来元の細胞、および、後腸細胞、前腸細胞、腸管神経細胞、腸管神経前駆細胞、腸幹細胞(LGR5陽性)、Paneth細胞(LYZ陽性)、杯細胞(Mucin陽性)および分泌細胞等の腸管を構成する種々の細胞、ならびにこれらの細胞の由来元の細胞から選ばれる少なくとも一種の細胞を含む細胞集団を含む。さらに、人工腸管は、例えば、筋肉細胞およびペースメーカー細胞などをも含み得るものであり、この場合において神経細胞は筋肉細胞間に配置される。
「後腸細胞」とは、発生の過程においては内胚葉から分化する細胞であり、CDX2陽性であることを特徴とする。後腸細胞塊は、後腸細胞に加えて、上皮細胞(E-cadherin陽性)および間葉系細胞(Vimentin陽性)を含み得る。
「胚体内胚葉」とは、発生の過程においては前方原始線条から分化する細胞であり、SOX17陽性かつFOXA2陽性であることを特徴とする。
「ERBB3アゴニスト」とは、ERBB3と結合してその下流のシグナル経路を活性化する能力(ERBB3アゴニスト活性)を有する物質であればよく、タンパク質、ペプチド、核酸および低分子化合物並びにこれらの誘導体などであってよい。ERBB3アゴニストには、例えば、NRG1、NRG2およびNRG6等のタンパク質がある。NRG1、NRG2およびNRG6等のタンパク質は、全長タンパク質であっても、ERBB3アゴニスト活性を有するその断片であってもよい。
「ERBB4」とは、ERBB4遺伝子によりコードされるチロシンキナーゼ受容体であり、EGFレセプターファミリーの一つである。HER4 (human epidermal growth factor receptor 4)とも呼ばれる。ERBB4は、ERBB2とヘテロダイマーを形成し、細胞の増殖や分化に関わるシグナル経路を活性化する。ERBB4には、種々のスプライシングバリアントが存在することが知られているが、本発明でのERBB4にはこれらのバリアントが特に限定されることなく包含される。
「ERBB4アゴニスト」とは、ERBB4と結合してその下流のシグナル経路を活性化する能力(ERBB4アゴニスト活性)を有する物質であればよく、タンパク質、ペプチド、核酸および低分子化合物並びにこれらの誘導体などであってよい。ERBB4アゴニストには、例えば、NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、NRG5、BTC、EPRおよびHBEGF等のタンパク質がある。NRG1-5、BTC、EPRおよびHBEGF等のタンパク質は、全長タンパク質であっても、ERBB4アゴニスト活性を有するその断片であってもよい。
「ニューレグリン1(Neuregulin-1: NRG1)」とは、NRG1遺伝子によりコードされるEGF様増殖因子である。Heregulinとも呼ばれる。ERBB3およびERBB4と結合し、その下流のシグナル経路を活性化することが知られている。
「グリア細胞由来神経栄養因子(Glial cell line Derived Neurotrophic Factor: GDNF)」とは、GDNF遺伝子によりコードされる因子であり、GFRα1およびRETのアゴニストとして作用する。神経細胞およびグリア細胞の保護や、腸管神経前駆細胞の増殖に関連することが知られている。
「拡大培養」とは、所望の細胞集団を増殖させ、細胞数を増加させることを目的として培養することを意味する。細胞数の増加は、細胞の増殖による増数が死滅による減数を超えることによって達成されるものであればよく、細胞集団の全ての細胞が増殖することを要さない。細胞数の増加は、拡大培養の開始前に比して1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍以上でありうる。
「維持培養」とは、所望の細胞集団をそれらの数を維持しながら培養することを意味する。細胞数の維持は、細胞が増殖することなく生存することにより達せられるものであっても、細胞の増殖による増数と死滅による減数とが拮抗することによって達せされるものであってもよい。細胞数の維持は、細胞の数が完全に同一に維持される必要はなく、本発明の目的に照らして細胞の数が実質的に同一に維持されればよい。
「細胞集団」とは、同じ種類又は異なる種類の2以上細胞を意味する。「細胞集団(population)」は、同じ種類又は異なる種類の細胞の一塊(mass)をも意味する。
「浮遊培養」とは、細胞を容器に付着させずに適切な培地中に分散させた状態で培養することを意味する。
マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーなどを利用して行うことができる。マーカータンパク質に特異的な抗体としては、マーカータンパク質における特定のアミノ酸配列又はマーカータンパク質に結合した特定の糖鎖等に結合する抗体を用いることができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないマーカータンパク質(例えば転写因子またはそのサブユニットなど)の場合は、当該マーカータンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするマーカータンパク質を検出できる(例えば、非特許文献4)。この方法は、適当な細胞表面マーカーが認められない場合に好ましく用いられ得る。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法および/又は核酸検出方法、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップおよびRNAseq等を利用して行うことができる。
「陽性(positive)」または「発現する」とは、タンパク質又は遺伝子が当該分野で公知の手法による検出可能量で発現していることを意味する。タンパク質の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質(例えば転写因子またはそのサブユニットなど)の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。遺伝子の検出は、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップ及びRNAseq等の核酸増幅方法及び/又は核酸検出方法を利用して行うことができる。
「陰性(negative)」または「発現されない」とは、タンパク質又は遺伝子の発現量が、上記のような公知手法の全てあるいはいずれかによる検出下限値未満であることを意味する。タンパク質又は遺伝子の発現の検出下限値は、各手法により異なりえる。
「HOXB5」は、迷走神経堤細胞、体幹神経堤細胞および仙骨神経堤細胞で発現しており、腸管神経細胞の正常発生に必要であることが知られている。一方、HOXB5は、頭部神経堤細胞では発現されない。
「HOXB9」は、体幹神経堤細胞および仙骨神経堤細胞で発現している。一方、HOXB9は、頭部神経堤細胞および迷走神経堤細胞では発現されない。
「PHOX2B」は、腸管神経前駆細胞およびそれに由来する腸管神経細胞で発現が認められる。
「GFAP (Glial fibrillary acidic protein)」は、グリア細胞で発現している。一方、GFAPは腸管神経前駆細胞および腸管神経細胞では発現していない。
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
この知見に基づき、本発明は、第一実施形態として、以下の工程(A1)および工程(A2)を含む、ENPの製造方法を提供する。
(A1)ENPを提供する工程、ならびに
(A2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中でENPを培養する工程。
(B1)NCCを提供する工程、ならびに
(B2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニスト、ならびにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む培地中でNCCを培養する工程。
(C1)ENPを提供する工程、ならびに
(C2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中でENPを培養する工程。
〔第一実施形態 工程(A1):腸管神経前駆細胞を提供する工程〕
本工程では、ENPが提供される。本工程には少なくともENPが提供されればよく、単一のENP細胞、ENPの細胞集団またはENPを含む細胞集団が提供されてもよい。
本工程で提供されるENPは、商業的に入手されたENPであっても、生体から分離されたENPであってもよく、さらに後述の方法によりNCC等から誘導したENPであってもよい。商業的に入手されるENPは、培養状態にあるENPであっても、凍結状態にあるENPであってもよい。また、ENPがNCC等からの誘導したENPである場合も、培養状態にあるENPであっても、凍結状態にあるENPであってもよい。
本工程では、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中でENPが培養される。
ERBB4アゴニストは、ERBB4と結合してその下流のシグナル経路を活性化する能力(ERBB4アゴニスト活性)を有する物質であればよく、タンパク質、ペプチド、核酸および低分子化合物並びにこれらの誘導体などであってよい。ERBB4アゴニストには、例えば、NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、NRG5、BTC、EPRおよびHBEGF等のタンパク質がある。NRG1-5、BTC、EPRおよびHBEGF等のタンパク質は、全長タンパク質であっても、ERBB4アゴニスト活性を有するその断片であってもよい。
NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、NRG5、NRG6、BTC、EPRおよびHBEGF等のタンパク質には、培養の対象とする細胞の由来種に合わせて、ヒト由来のタンパク質、あるいは例えばサル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来のタンパク質を適宜用いる。
これらのタンパク質は、通常の分子生物学的手法を用いてリコンビナントタンパク質として調製でき、また市販の試薬として入手することもできる。
ヒトNRG1の全長アミノ酸配列を配列番号1(NCBI Accession number: NP_039250)に示す。
ERBB3アゴニスト活性またはERBB4アゴニスト活性を有するNRG1の断片としては、配列番号1のアミノ酸配列から生じる、例えばアミノ酸数10〜300、20〜150、あるいは30〜100の断片が挙げられる。
NRG1の断片は、例えば、ERBB3又はERBB4への結合ドメイン(EGF-like domain)を含む断片であってよい。結合ドメインは、配列番号1中アミノ酸番号190〜220とされている。
NRG1およびその断片は、通常の分子生物学的手法を用いてリコンビナントタンパク質として調製でき、また市販の試薬として入手することもできる。ERBB3又はERBB4への結合ドメイン(EGF-like domain)を含むNRG1断片が商業的に入手可能である(例えば、Recombinant Human Heregulinβ-1, Catalog Number:100-03, PEPROTECH)。
NRG1又はその断片は、配列番号1記載のアミノ酸配列又はその部分配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された改変アミノ酸配列からなり、ERBB3アゴニスト活性またはERBB4アゴニスト活性を有するものであってもよい。
ここで、数個とは20個以下、好ましくは10個以下、より好ましくは5個以下、さらに好ましくは3個以下、最も好ましくは2個を意味する。
改変アミノ酸配列としては、配列番号1のアミノ酸配列に対して80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列とされ得る。アミノ酸配列の同一性は、汎用の解析ツールにより計算することができ、例えば全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)が提供するBLASTが利用できる。
また、NRG1又はその断片は、ERBB3アゴニスト活性またはERBB4アゴニスト活性を保持し得る限りにおいて、他のタンパク質との融合タンパク質あるいは他の分子が結合された修飾タンパク質であってもよい。
ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストとしてNRG1を用いる場合、その培地中の濃度は、例えば1〜1000 ng/mL、好ましくは50〜200 ng/mL、特に好ましくは約100 ng/mLとできる。
「TGFβ阻害剤」とは、TGFβ(トランスフォーミング増殖因子β)に対する阻害活性を有する物質である。TGFβは2種類のセリン/スレオニンプロテインキナーゼ型受容体に結合するサイトカインであり、Smad(R-Smad)の活性化を主としたシグナル伝達を介して細胞増殖、細胞分化、細胞死などを制御する。TGFβ阻害活性を有する物質としては、TGFβとその受容体の結合を阻害する物質、又は、TGFβが受容体に結合後の下流シグナルを阻害する物質が挙げられる。当該下流シグナルとしては、TGFβII型受容体によるTGFβI型受容体のリン酸化、リン酸化TGFβI型受容体によるSmadのリン酸化などが例示される。本発明で用いられる「TGFβ阻害剤」はTGFβ阻害活性を有すれば特に限定されない。
TGFβ阻害剤としてSB431542(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide)を用いる場合、その培地中の濃度は、例えば1〜100 μM、好ましくは5〜20 μM、特に好ましくは約10 μMとできる。
GSK3β阻害剤はこれらに限定されるものではなく、GSK3βのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、GSK3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK3β変異体等もGSK3β阻害剤として使用することができ、これらは商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
GSK3β阻害剤としてCHIR99021を用いる場合、その培地中の濃度は、例えば0.1〜10 μM、好ましくは0.5〜2 μM、特に好ましくは約1 μMとできる。
RA等としてRAを用いる場合、その培地中の濃度は、例えば0.001〜50 μM、好ましくは0.1〜10 μM、特に好ましくは約1 μMとできる。
基礎培地には、アポトランスフェリン、モノチオグリセロール、ウシ血清アルブミン(BSA)、インスリンおよび/又は抗生物質等の通常の細胞培養に用いられる物質が添加され得る。
この間の細胞の増殖速度は、細胞倍加時間で約75時間という非常に高い速度が達成される。
接着培養には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、およびOptiCell(製品名、Nunc)等の細胞培養シートなどの培養容器が用いられる。
接着培養に用いる容器は、細胞との接着性(親水性)を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていてもよいが、これらの表面処理やコーティングがなされていない容器を用いることがより好ましい。
浮遊培養では、培地中に細胞を分散させ、撹拌または振盪により培地成分および培地内酸素濃度を均一化しながら細胞凝集塊を形成させる。好適な撹拌速度は、細胞密度と培養容器の大きさに応じて、適宜設定されるが、過度の撹拌または振盪は細胞に対して物理的ストレスを与え、細胞凝集塊形成を阻害する。したがって、培地成分および培地内酸素濃度を均一化でき、かつ、細胞凝集塊形成を阻害しないように撹拌または振盪速度を制御する。撹拌または振盪することなく、静置して浮遊培養を行うこともできる。
浮遊培養には、Prime surface(製品名、住友ベークライト株式会社)などの低接着コートの容器を用いることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃(例えば、37℃)で行うことができる。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度とできる。
〔第二実施形態 工程(B1):神経堤細胞を提供する工程〕
本工程では、NCCが提供される。本工程には少なくともNCCが提供されればよく、単一のNCC細胞、NCCの細胞集団またはNCCを含む細胞集団が提供されてもよい。
本工程で提供されるNCCは、商業的に入手されたNCCであっても、生体から分離されたNCCであってもよく、さらに幹細胞(stem cell)等から分化させたNCCであってもよい。商業的に入手されるNCCは、培養状態にあるNCCであっても、凍結状態にあるNCCであってもよい。また、NCCが幹細胞等から分化させたNCCである場合も、NCCは、培養状態にあるNCCであっても、凍結状態にあるNCCであってもよい。
また、NCCは、受精後30日前後のヒト胚の神経管、胎生9日目前後のマウス胚の神経管、ヒト、ブタおよびげっ歯類の成体の皮膚等に存在していることが報告されている(Betters et al., Developmental biology, 2010, 344(2):578-592、Jiang et al., Development, 2000, 127(8):1607-1616、Dupin et al., Developmental biology, 2012, 366(1):83-95、Nagoshi et al., Cell Stem Cell 2, April 2008, 392-403)。NCCを公知の方法(例えば、Motohashi et al., Biology open, 2016, 5:311-322、Pfaltzgraffet al., Journal of Visualized Experiments, 2012, 64:4134)を用いて採取し、本工程に供することも可能である。
このほか、公開されているすべての論文(例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574;、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650;Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797)、あるいは特許(例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
人工多能性幹細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A1株、1231A3株等が挙げられ、1231A1株、1231A3株が好ましく、1231A3株がより好ましい。
TGFβ阻害剤としてSB431542(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide)を用いる場合、その培地中の濃度は、例えば1〜100 μM、好ましくは5〜20 μM、特に好ましくは約10 μMとできる。
GSK3β阻害剤としてCHIR99021を用いる場合、その培地中の濃度は、例えば0.1〜10 μM、好ましくは0.5〜2 μM、特に好ましくは約1 μMとできる。
ヒトiPSCから迷走神経提細胞あるいは体幹神経堤細胞分化させる場合のRA等の培地中の濃度は、例えば0.001〜50 μM、好ましくは0.1〜10 μMである。
ただし、RA等の培地中の濃度は、添加するRA等の種類によって適宜調整されるものである。
後段の工程(B2)において腸管神経細胞およびグリア細胞への高い分化能を有するENPを得るため、迷走神経提細胞(Vagal NCC)へ分化させることが好ましい。
RA等をさらに加えた培地での培養期間(工程ii)は、例えば1〜12日間とでき、特には約5日間とできる。
培養容器は、細胞との接着性(親水性)を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば約5%である。
本工程では、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニスト、ならびにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む培地中でNCCが培養される(図1、工程iii)。ここで用いられるNCCは、好ましくは迷走神経提細胞(Vagal NCC)である。
用いるTGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤、ならびにそれらの培地中の濃度は、工程(A2)と同じであってよい。
GDNFおよびマトリゲルの培地中の濃度、ならびに用いる基礎培地も、工程(A2)と同じであってよい。
この間の細胞の増殖速度は、細胞倍加時間で約75時間という高い速度が達成される。
〔第三実施形態 工程(C1):腸管神経前駆細胞を提供する工程〕
本工程では、ENPが提供される。
本工程で提供されるENPは、工程(A1)と同じであってよい。
本工程では、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中でENPが培養される。
用いるTGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤、ならびにそれらの培地中の濃度は、工程(A2)と同じであってよい。
用いるRA等、およびそれらの添加濃度は、工程(A2)と同じであってよい。
この間の細胞の増殖速度は、細胞倍加時間で約75時間という高い速度が達成される。
本発明は、上述のENPの製造方法または拡大培養方法で用いられるENP培地をも提供する。培地の好ましい組成は上述したとおりである。ENPの製造とは、iPSC、ESCおよびNCC等の幹細胞からENPへ分化させることを含み得る。
本発明の一態様において、腸管神経前駆細胞培地は、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む。 本発明の別の態様において、腸管神経前駆細胞培地は、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストに加えて、TGFβ阻害剤および/またはGSK3β阻害剤を含んでいてもよく、TGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤を含むことが好ましい。 本発明の別の態様において、腸管神経前駆細胞培地は、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストに加えて、GDNFを含んでいてもよい。本発明の別の態様において、腸管神経前駆細胞培地は、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストに加えて、マトリゲルを含んでいてもよい。本発明の別の態様において、腸管神経前駆細胞培地は、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストに加えて、GDNFおよびマトリゲルを含んでいてもよい。本発明の別の態様において、腸管神経前駆細胞培地は、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストに加えて、TGFβ阻害剤、GSK3β阻害剤、GDNFおよびマトリゲルを含んでいてもよい。これらの腸管神経前駆細胞培地はさらにRA等を含んでいてもよい。腸管神経前駆細胞培地中のERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニスト、TGFβ阻害剤、GSK3β阻害剤、GDNF、マトリゲルおよびRA等の濃度はそれぞれ工程(A2)と同じであってよい。
他の一側面において、本発明は、ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含むENP培地添加剤、およびERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストのENP拡大培養のための使用をも提供する。
本発明に係るENPの製造方法または拡大培養方法によれば、腸管神経細胞およびグリア細胞への分化能(多能性(multipotency))を維持したENPを大量に得ることができる。
別の方法では、例えば、マーカータンパク質や遺伝子の発現を測定する方法が挙げられる。評価対象であるENPにおいて、転写因子であるSOX10およびPHOX2Bが発現していれば、評価対象であるENPは「多能性(multipotency)を維持したENP」であると判断できる。
本発明に係る製造方法または拡大培養方法で得られるENPは、腸管神経細胞の欠損または異常に起因する疾患の予防または治療のための細胞医薬として適用され得る。このような疾患としては例えば、ヒルシュスプルング(Hirschsprung)病、食道アカラシア、胃運動機能不全、先天性肥厚性幽門狭窄症、慢性特発性偽性腸閉塞症、神経因性便秘あるいはシャーガス病などが挙げられる。
治療有効量とは、ENPを患者に投与した場合に、投与していない対照と比較して上記疾患に対して治療効果を得ることができるENPの量である。具体的な治療有効量としては、ENPの投与形態、投与方法、使用目的および患者の年齢、体重、症状等によって適宜設定され得る。ヒト(例えば成人)の1回の治療あたりの有効量は、例えば200,000〜1,00,000,000個/kg体重である。これらの細胞は単一細胞の状態に分散されていてもよいし、複数の細胞が集まった細胞塊(sphere)になっていてもよいし、これらが混合されたものであってもよい。
得られたENPおよびこれを文献公知の手法により分化させて得られる神経細胞およびグリア細胞は、再生医療用の細胞製剤として有用であり得、また各種スクリーニング系の構築にも好適に利用され得る。
本発明に係る腸管オルガノイドの製造方法は、ENPと後腸細胞とを共培養する工程を含む。
胚体内胚葉誘導時及び後腸細胞誘導時の基礎培地にも上述した基礎培地を用いることができる。
胚体内胚葉誘導時のActivin Aの培地中の濃度は、例えば10〜1000 ng/mL、好ましくは50〜500 ng/mL、より好ましくは約100 ng/mLとできる。また、BMP4の培地中の濃度は、例えば1〜100 ng/mL、好ましくは5〜50 ng/mL、より好ましくは約10 ng/mLとできる。bFGFの培地中の濃度は、例えば1〜200 ng/mL、好ましくは5〜100 ng/mL、より好ましくは約20 ng/mLとできる。培養期間は、例えば1〜10日、好ましくは2〜6日、より好ましくは約4日とされ得る。
後腸細胞誘導時のFGF4の培地中の濃度は、例えば10〜1000 ng/mL、好ましくは50〜500 ng/mL、より好ましくは約100 ng/mLとできる。GSK3β阻害剤の培地中の濃度は、例えばCHIR99021を用いる場合、例えば1〜30 μM、好ましくは4〜10 μM、より好ましくは約6 μMとできる。培養期間は、例えば4〜12日、好ましくは6〜10日、より好ましくは約8日とされ得る。
例えば、マトリゲル溶液に懸濁した後腸細胞とENPとをプレートに播種しゲル化させ、R-Spondin-1、Noggin、Wnt3a、EGF、Prostaglandin-E2およびROCK阻害剤を含む培地を添加して培養する手法がある。共培養により得られた腸管オルガノイドは、必要に応じて、マトリゲル溶液に再懸濁した上で同様の手法を再適用することで成熟化させることもできる。
また、例えば、マトリゲル溶液に懸濁した後腸細胞をプレートに播種しゲル化させ、R-Spondin-1、Noggin、Wnt3a、EGF、Prostaglandin-E2およびROCK阻害剤を含む培地を添加して培養を行って腸管オルガノイドを得た後、腸管オルガノイドを一旦分散させてENPの細胞懸濁液と混合し、混合液を遠心分離して得られる細胞ペレットをR-Spondin-1、Noggin、Wnt3a、EGF、Prostaglandin-E2およびROCK阻害剤を含む培地で培養する手法もある。この場合も、共培養により得られた腸管オルガノイドは、必要に応じて成熟化されてよい。
ENPと後腸細胞との共培養時の基礎培地にも上述した基礎培地を用いることができる。
R-Spondin-1の培地中の濃度は、例えば100〜10,000 ng/mL、好ましくは500〜5000 ng/mL、より好ましくは約1000 ng/mLとできる。
Nogginの培地中の濃度は、例えば10〜1000 ng/mL、好ましくは50〜500 ng/mL、より好ましくは約100 ng/mLとできる。
Wnt3aの培地中の濃度は、例えば10〜1000 ng/mL、好ましくは50〜500 ng/mL、より好ましくは約100 ng/mLとできる。
EGFの培地中の濃度は、例えば10〜1000 ng/mL、好ましくは50〜500 ng/mL、より好ましくは約100 ng/mLとできる。
Prostaglandin-E2の培地中の濃度は、例えば0.5〜10 μM、好ましくは1〜5 μM、より好ましくは約2.5μMとできる。
ROCK阻害剤は、例えばY27632を用いる場合、1〜100 μM、好ましくは5〜50 μM、より好ましくは約10 μMとできる。
培養期間は、例えば15〜40日、好ましくは20〜30日、より好ましくは24〜25日とされ得る。
移植先の動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ及びサルなどの非ヒト哺乳動物あるいはヒト動物であってよく、好ましくは非ヒト哺乳動物が選択される。また、免疫不全である動物が好ましく用いられ得る。
得られる人工腸管は、ENPに由来する神経細胞およびグリア細胞を含み、電気刺激に応答して収縮弛緩反応を示し得る。
また、当該神経細胞は、人工腸管内でアセチルコリンおよびアドレナリンを産生して筋肉を収縮させ、また一酸化窒素を産生して筋肉を弛緩させたり、電気刺激に応答して筋肉を弛緩させたりする機能を有している。
ヒトiPSCには、1231A3株(Scientific Reports, 2014, 4, 3594参照)を用いた。
iPSCの維持培養は、iMatrix 511 Silk(株式会社ニッピ)をコートしたプレートを用いて、フィーダー細胞を使用しないで行った。培養は、37℃、5%CO2下で行った。維持培養時の培地には、StemFit AK03N(味の素ヘルシーサプライ株式会社)のA液、B液およびC液を混合したものを用いた。
培地交換は毎日行い、継代は6〜7日ごとに行った。継代は、0.5 mM EDTAを添加したリン酸緩衝液(以下「PBS」と記載する)で2倍希釈したTrypLE Select CTS(Life Technologies)を用いてiPSCをシングルセル化してプレートから剥離させた後、剥離させたiPSCをiMatrix 511 Silkでコートした新しいプレート上に播種することにより行った。播種時の培地には、10 μMのY27632(富士フイルム和光純薬株式会社)を添加したStemFit AK03NのA液、B液およびC液を混合したものを用いた。
シングルセル化した上記ヒトiPSCに、Neon Transfection system(Life Technologies)を用いてSpCas9 D10A nickase発現プラスミド、SOX10 sgRNA発現プラスミド、SOX10-F2A-tdTomatoドナープラスミド、puromycin耐性遺伝子発現プラスミド(富士フイルム和光純薬株式会社)を共導入した。
得られた細胞をpuromycin処理による薬剤選抜後にコロニーピックアップし、拡大培養した。得られたコロニーのうち、PCRにより目的配列の挿入が確認されたものをSOX10::tdTomato株とした。
得られた細胞はpuromycin処理による薬剤選抜後にコロニーピックアップし、拡大培養した。得られたコロニーのうち、PCRにより目的配列の挿入が確認されたものをSOX10::tdTomato-PHOX2B::emGFP株とした。
(1)iPSCの前培養
試験例1に記載の方法で維持培養したヒトiPSC(SOX10::tdTomato-PHOX2B::emGFP株)を、iMatrix 511 Silkをコートした6穴プレートあるいは10 cmディッシュにそれぞれ2〜4×104あるいは2.4〜4.9×105個/ウェルまたはディッシュの密度で播種し、37℃、5%CO2下で3〜4日間培養(前培養)した。播種時の培養液には、10 μMのY27632(富士フイルム和光純薬株式会社)を添加したStemFit AK03NのA液、B液およびC液を混合したものを用いた。
前培養後、培地を、10 μM SB431542(富士フイルム和光純薬株式会社)および1 μM CHIR99021(Axon MedChem)を含む培地に交換し(培養0日目)、37℃、5%CO2下で6日間培養した。その後、さらに1 μM レチノイン酸(富士フイルム和光純薬株式会社)を含む培地に交換し、37℃、5%CO2下で5日間培養した(計11日間)。ここで、上記培地としては、StemFit AK03NのA液およびB液を混合したものを用いた。なお、これらの培養期間中、培地交換は毎日行った。
また、レチノイン酸を添加しない以外は同条件でiPSCの培養を行い、頭部神経提細胞を誘導した。
迷走神経堤細胞の分化マーカーの発現を調べるため、培養11日目の細胞を回収し、RNeasy(Qiagen)を用いて全RNA画分を精製した。Prime Script RT reagent kit(タカラバイオ)を用いてcDNAを合成した後、定量RT-PCRを実施して、迷走神経堤細胞マーカーであるSOX10およびendothelin receptor type B(EDNRB)ならびに前後軸の位置情報を規定するHOX遺伝子群のうち、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB7およびHOXB9遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量は、内在性コントロールのGAPDHの発現量に対する比として求めた。
各遺伝子の発現量を図2に示す。図中、縦軸は、Fold change(頭部神経提細胞における発現量を1とした比をlog2で表した値)を示す。SOX10、EDNRB、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5およびHOXB7を発現しており、HOXB9を発現していなかったことから、迷走神経堤細胞への分化が確認できた。
試験例3の方法で得られた、培養11日目の細胞(迷走神経堤細胞)を酵素的処理により分散させ回収した。酵素的処理は以下のようにして実施した。
培地を吸引除去してPBSに置換後、細胞をセルスクレーパーで剥離した。剥離した細胞塊はAccutase(Innovative Cell Technologies)中でピペッティングにより分散させた。その後、MACS Buffer(ミルテニーバイオテク)を加え、40 μmのセルストレイナーを通しシングルセル化した。得られた細胞懸濁液は300×g、3分間遠心後に上清を除去し、腸管神経前駆細胞培地に懸濁した。腸管神経前駆細胞培地には、StemFit AK03NのA液およびB液を混合したものに、10 μM SB431542(富士フイルム和光純薬株式会社)、1 μM CHIR99021(Axon MedChem)、1 μM レチノイン酸(富士フイルム和光純薬株式会社)、100 ng/mL Neuregulin1(NRG1)(Pepro Tech)および50 mg/mL Glial Cell-derived Neurotrophic Factor(GDNF)(富士フイルム和光純薬株式会社)を含むものを使用した。接着培養をする場合は、細胞懸濁液に2%となるようにマトリゲル(Corning)を添加し、マルチウェルプレート(Corning)で培養した。浮遊培養をする場合は細胞低接着処理を施したマルチウェルプレート(Corning)を使用した。培養はいずれも37℃、5%CO2下で実施した。
培地を吸引除去してPBSに置換後、PBSを吸引除去し、TrypLE Select CTS(Life Technologies)を加え、37℃で10分間静置した。その後、TrypLE Select CTSを吸引除去し、腸管神経前駆細胞培地を加え、ピペッティングにより細胞を分散させた。
分散後の細胞を2〜10×104個/cm2の密度で播種した。細胞播種後、2%(w/v)となるようにマトリゲルを添加した。
得られた細胞は1〜2週間に1回継代を実施した。継代ごとに自動セルカウンターで総細胞数、生細胞数および死細胞数をカウントした。継代時に播種した生細胞数および次回継代時に得られた生細胞数から総細胞数(accumulated cell number)を算出した。
総細胞数(accumulated cell number)の経時変化を図3に示す。細胞は少なくとも7回継代可能であり、線形の細胞増殖を示した。
試験例4で培養した細胞におけるSOX10-tdTomatoおよびPHOX2B-emGFPの発現を、フローサイトメトリーを用いて、継代の都度に解析した。
継代時に得られた細胞分散液を300×g、3分間遠心し、上清除去後、DAPIおよび1%の牛血清アルブミンを含むHBSSに細胞を懸濁し、FACS Aria Fusion(日本ベクトン・ディッキンソン)による解析に供した。
SOX10-tdTomatoおよびPHOX2B-emGFPの発現解析結果を図4に示す。図中、P1〜P6は継代回数(1〜6回)を意味する。継代を経るごとに、SOX1-tdTomatoおよびPHOX2B-emGFPを共発現する腸管神経前駆細胞の占める割合が上昇した。5回継代以降は腸管神経前駆細胞の占める割合は80%以上となった。
腸管神経前駆細胞培地にNRG1および/またはGDNFを添加しない以外は試験例4と同条件で腸管神経前駆細胞培地迷走神経堤細胞を培養し、蛍光顕微鏡(BZ-X700、キーエンス)で観察した。また、試験例5と同様の方法でフローサイトメトリー解析を実施した。
細胞の蛍光像とSOX10-tdTomatoおよびPHOX2B-emGFPの発現解析結果を図5に示す。NRG1を含まない条件では、細胞増殖が非常に遅く、フローサイトメトリーを実施するために必要な細胞数が得られなかった。GDNFを含まない条件では、SOX10-tdTomatoおよびPHOX2B-emGFPを共発現する腸管神経前駆細胞が得られるものの、GDNFを含む条件に比して細胞の増殖が遅かった。
試験例4において継代時に得られた細胞から全RNAを抽出し、腸管神経前駆細胞のマーカーであるSOX10、PHOX2B、HOXB5、EDNRBおよびret proto-oncogene(RET)の遺伝子発現を確認した。遺伝子発現解析は前述の方法と同様に実施した。
結果を図6に示す。図中、縦軸は、Expression level(内在性コントロールのGAPDHの発現量に対する比)あるいはFold change(iPSCにおける発現量を1とした比をlog2で表した値)を示す。腸管神経前駆細胞培地で培養した細胞は、継代を経てもSOX10、PHOX2B、HOXB5、EDNRBおよびRETを発現していた。
試験例4と同様にして得た腸管神経前駆細胞を腸管神経分化用培地で培養して腸管神経への分化を行った。腸管神経分化用培地には、Neurobasal Medium(Life Technologies)にB27(Life Technologies)、N2サプリメント(富士フイルム和光純薬株式会社)、L-グルタミン(富士フイルム和光純薬株式会社)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)、100 μM アスコルビン酸(富士フイルム和光純薬株式会社)および25 ng/mL GDNFを添加したものを使用した。
蛍光免疫染色像を図7に示す。ChAT、nNOS、GABAおよび5-HT陽性の神経が確認され、それぞれcholinergic neuron、inhibitory neuron、GABAergic neuronおよびserotonergic neuronであることが示された。従って、本培養方法で得られた腸管神経前駆細胞は種々の腸管神経サブタイプへの分化能を保持していることが示された。
ヒトiPSCには、253G1株(Nature Biotechnology, 2008, 26, (1):101-106参照)を用いた。
iPSCの維持培養は、Vitronection(TN-N)Recombinant Human Protein, Truncated(サーモフィッシャー社製)をコートしたプレートを用いて、フィーダー細胞を使用しないで行った。培養は、37℃、5%CO2下で行った。
維持培養時の培地には、Essential 8 Flex Medium Kit(サーモフィッシャー)のBasal MediumおよびSupplementを混合したものを用いた。培地交換は毎日行い、継代は6〜7日ごとに行った。
継代は、0.5 mM EDTAを添加したPBSを用いてiPSCをシングルセル化してプレートから剥離させた後、剥離させたiPSCをVitronection(TN-N)Recombinant Human Protein, Truncatedをコートした新しいプレート上に播種することにより行った。
播種時の培地には、Essential 8 Flex Medium kitのBasal MediumおよびSupplementを混合したものに10 μM Y27632(富士フイルム和光純薬株式会社)を添加して用いた。
試験例9のヒトiPSCをシングルセル化した後、NEPA21(ネッパジーン)を用いてSpCas9発現プラスミド、LGR5 sgRNA発現プラスミド、LGR5::emGFPドナープラスミド(LGR5のN末端に「キメリックイントロン+emGFP+SV40polyA」をノックイン可能なコンストラクト)を共導入した。
得られた細胞をpuromycin処理による薬剤選抜後にコロニーピックアップし、拡大培養した。得られたコロニーのうち、PCRにより目的配列の挿入が片アレル性に確認されたものをLGR5::emGFP株とした。
(1)iPSCの前培養
試験例10のLGR5::emGFP株を、マトリゲル(Corning)をコートした12穴プレートにそれぞれ4×105個/ウェルの密度で播種し、37℃、5%CO2下で2日間培養(前培養)した。播種時の培養液には、Essential 8 Flex Medium KitのBasal MediumおよびSupplementを混合したものに10 μM Y27632を添加して用いた。
前培養後、培地を100 ng/mL Activin A(PeproTech)、10 ng/mL BMP4(R&D Systems)、20 ng/mL bFGF(富士フイルム和光純薬株式会社)を含む培地に交換し(培養0日目)、37℃、5%CO2下で4日間培養した。上記培地としては、RPMI 1640(サーモフィッシャー)にB-27 Supplement, minus insulin(サーモフィッシャー)とPenicillin-Streptomycin(サーモフィッシャー)を混合したものを用いた。培養期間中、培地交換は毎日行った。
胚胎内胚葉への分化を確認するために、培養4日後の細胞を回収し、定量RT-PCRにより胚胎内胚葉マーカーであるSOX17およびFOXA2が発現していることを確認した。
胚体内胚葉分化後、培地を100 ng/mL FGF4(PeproTech)および6 μM CHIR99021(Axon MedChem)を含む培地に交換し(培養4日目)、37℃、5%CO2下で4日間培養した(計8日間)。上記培地には、RPMI 1640(サーモフィッシャー)にB-27 Supplement, minus vitamin A(サーモフィッシャー)とPenicillin-Streptomycin(サーモフィッシャー)を混合したものを用いた。培養4日目は培地の全量を交換した。培養5日目から7日目は培地の半量を交換した。後腸への分化を確認するために、培養8日後の細胞を回収し、定量RT-PCRにより後腸マーカーであるCDX2が発現していることを確認した。
ウェル内で形成された後腸細胞塊を培養上清とともに回収した。後腸細胞塊を含む溶液に、試験例4で作製した腸管神経前駆細胞を含む細胞懸濁液を添加し、遠心した後に培養上清を除去した。マトリゲル溶液に再懸濁した後腸細胞塊および腸管神経前駆細胞を、50 μL/ウェルで24穴プレート上に播種し、37℃、5%CO2下で30分間培養しマトリゲルをゲル化させた。ゲル化したマトリゲル上に1000 ng/mL R-Spondin-1(富士フイルム和光純薬株式会社)、100 ng/mL Noggin(PeproTech)、100 ng/mL Wnt3a(R&D Systems)、100 ng/mL EGF、2.5 μM Prostaglandin-E2を含む培地を添加し、37℃、5%CO2下で培養した。上記培地には、Advanced DMEM/F-12(サーモフィッシャー)にB-27 Supplement, mius vitamin A(サーモフィッシャー)、N-2 Supplement(サーモフィッシャー)、10 μM Y27632、10 mM HEPES(サーモフィッシャー)、Penicillin-Streptomycin(サーモフィッシャー)を混合したものを用いた。
培養約2週間後に、後腸細胞塊と腸管神経前駆細胞から分化した腸管オルガノイドを含むマトリゲルに4℃のD-PBS(-)(富士フイルム和光純薬株式会社)を添加し、マトリゲルを溶解させた。遠心して培養上清を除去した。マトリゲル溶液に再懸濁した腸管オルガノイドを、50 μL/ウェルで24穴プレート上に播種し、37℃、5%CO2下で30分間培養しマトリゲルをゲル化させた。ゲル化したマトリゲル上に1000 ng/mL R-Spondin-1、100 ng/mL Noggin、100 ng/mL Wnt3a、100 ng/mL EGF、2.5 μM Prostaglandin-E2、Y27632を含む培地を添加し、37℃、5%CO2下で培養した(腸管オルガノイド培養期間計24〜25日間)。
ウェル内で形成された後腸細胞塊を培養上清とともに回収した。遠心して培養上清を除去した。マトリゲル溶液に再懸濁した細胞塊を、50 μL/ウェルで24穴プレート上に播種し、37℃、5%CO2下で30分間培養しマトリゲルをゲル化させた。ゲル化したマトリゲル上に1000 ng/mL R-Sponding-1、100 ng/mL Noggin、100 ng/mL Wnt3a、100 ng/mL EGF、2.5 μM Prostaglandin-E2を含む培地を添加し、37℃、5%CO2下で培養した。上記培地には、Advanced DMEM/F-12(サーモフィッシャー)にB-27 Supplement, minus vitamin A(サーモフィッシャー)、N-2 Supplement(サーモフィッシャー)、10 μM Y27632、10 mM HEPES(サーモフィッシャー)、Penicillin-Streptomycin(サーモフィッシャー)を混合したものを用いた。
培養約2週間後に、後腸細胞塊から分化した腸管オルガノイドを含むマトリゲルに4℃のD-PBS(-)を添加し、マトリゲルを溶解させた。腸管オルガノイドを含む溶液に、試験例4で作製した腸管神経前駆細胞を含む細胞懸濁液を添加し、遠心して培養上清を除去した。上清除去後の細胞ペレットに1000 ng/mL R-Spondin-1、100 ng/mL Noggin、100 ng/mL Wnt3a、100 ng/mL EGF、2.5 μM Prostaglandin-E2、10 μM Y27632を含む培地を添加し、37℃、5%CO2下で2日間培養した。培養後にマトリゲル溶液に再懸濁した腸管オルガノイドを、50 μL/ウェルで24穴プレート上に添加し、37℃、5%CO2下で30分間培養しマトリゲルをゲル化させた。ゲル化したマトリゲル上に1000 ng/mL R-Spondin-1、100 ng/mL Noggin、100 ng/mL Wnt3a、100 ng/mL EGF、2.5 μM Prostaglandin-E2、Y27632を含む培地を添加し、37℃、5%CO2下で培養した(腸管オルガノイド培養期間計24〜25日間)。
(1)腸管オルガノイドのマウスへの移植
試験例11で得られた、腸管オルガノイドを含むマトリゲルを、4℃のD-PBS(-)を添加して溶解させた。腸管オルガノイドを含む溶液を遠心して培養上清を除去した。上清除去後の細胞ペレットにCollagen I(Corning)を添加した。ネオベールシート(グンゼ)とpoly-L-lactide(DURECT)を用いて作製したスキャフォルドに細胞ペレットとCollagen Iを含む溶液を添加して、細胞ペレットをスキャフォルドに接着させた。
6週齢の免疫不全マウス(雄性NOGマウス、実験動物中央研究所)をイソフルランによる麻酔下で開腹した。細胞ペレットを接着させたスキャフォルドを腸管膜脂肪上に留置し、縫合した。移植後13週間マウスを飼育した。
マウスをイソフルランによる麻酔下で開腹した。腸管膜脂肪上で形成された人工腸管を腸管膜脂肪から分離して採取した。
採取した人工腸管を4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液(富士フイルム和光純薬株式会社)により固定し、蛍光免疫染色に供した。1次抗体として抗TUBB3抗体(Abcam)、抗S100β抗体(Abcam)、抗GFAP抗体(Abcam)と反応させ、さらに2次抗体として1次抗体の免疫動物に合わせた蛍光標識2次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。
蛍光免疫染色像を図8、9に示す。図8のように、PHOX2B-emGFPおよびSOX10-tdTomatoが陽性である腸管神経前駆細胞に由来する細胞(神経細胞およびグリア細胞)が存在していた。また、図9のように、PHOX2B-emGFPまたはSOX10-tdTomato陽性像に一致してあるいは近接してS100β(A)、GFAP(B)またはTUBB3(C)の陽性像がみられ、腸管神経前駆細胞に由来する細胞が神経細胞およびグリア細胞に分化していることが確認された。実施例4で得られた腸管神経前駆細胞が、腸管神経細胞へ分化し人工腸管を構成する能力を有していることが示された。
採取した人工腸管を短冊状の組織片に切り、オーガンバスアッセイ装置(Panlab)のチャンバー内にその一端を吊るした。もう一端を圧トランスデューサー(バイオリサーチセンター社製)に接続し、組織片の収縮弛緩反応を定量的にモニターできるようにした。チャンバー内にクレブス溶液(NaCl:120.7 mM、KCl:5.9 mM、NaHCO3:15.5 mM、NaH2PO4:1.2 mM、MgCl2:1.2 mM、CaCl2:2.5 mM、Glucose:11.5 mM)を充填し、溶液中に95%O2を暴露させた。チャンバー内の組織片を電気刺激して、収縮弛緩反応を計測した。
試験例4と同様にして得た腸管神経前駆細胞を用いて凍結ストックを作製した。また、凍結ストック融解後の腸管神経前駆細胞の増殖能および分化能の確認を行った。
分化76日目の腸管神経前駆細胞の細胞分散液を300×g、3分間遠心し、上清除去後、Stemcell Banker GMP Grade(日本全薬工業株式会社)に20万個/200 μLの濃度で細胞を懸濁し、-80℃で凍結保存した。
凍結ストックを37℃で融解した。腸管神経前駆細胞培地に細胞を懸濁後、300×g、3分間遠心し、上清除去後、腸管神経前駆細胞培地に再懸濁した。試験例4に記載の方法で培養を行った。また、試験例4及び5に記載の方法で継代及びフローサイトメトリー解析を実施した。さらに、試験例8及び14に記載の方法に従って腸管神経細胞及びグリア細胞への分化能を確認した。
試験例4と同様にして得た腸管神経前駆細胞を用い、グリア細胞への分化を行った。
グリア細胞分化用培地には、Astrocyte maturation kit(Stem Cell Technologies)に、Penicillin-Streptomycin(Life Technologies)を添加したものを使用した。
培養46日目の細胞をパラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液により固定し、蛍光免疫染色に供した。1次抗体として抗GFAP抗体(CST#3670、Cell Signaling)と反応させ、さらに2次抗体として1次抗体の免疫動物に合わせた蛍光標識2次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。
蛍光免疫染色像を図14に示す。GFAP陽性グリア細胞が確認された。従って、本培養方法で得られた腸管神経前駆細胞はグリア細胞への分化能を保持していることが示された。
試験例4と同様にして得た腸管神経前駆細胞を用い、免疫不全マウス腸管における生着性確認を行った。
腸管神経前駆細胞を腸管神経前駆細胞培地に懸濁し、sphere culture plate(RB500 400 NA 24、クラレ)に320,000個/ウェルで播種し、3日間培養して細胞塊(sphere)を構築した。
得られた細胞塊(sphere)を回収し、麻酔下で開腹した免疫不全マウス(NOD. CB17-Prkdc <scid>/J、オス、6週齢、日本チャールス・リバー株式会社)の盲腸壁にシリンジニードル(30ゲージ)を用いて580 sphere/site/匹で移植した。移植時の媒体はマトリゲルと腸管神経前駆細胞培地を1:1(v/v)で混合したものを使用した。1週間後、動物を安楽死させ、移植部位周囲を採取し4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定した。
固定したサンプルを蛍光免疫染色に供した。1次抗体として抗TUBB3抗体(Abcam)と反応させ、さらに2次抗体として1次抗体の免疫動物に合わせた蛍光標識2次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。
Claims (22)
- 以下の工程を含む、腸管神経前駆細胞の製造方法:
(A1)腸管神経前駆細胞を提供する工程、ならびに
(A2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中で腸管神経前駆細胞を培養する工程。 - 前記培地が、さらにTGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記培地が、さらにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記培地が、さらにGDNFを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記培地が、さらにマトリゲルを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストが、NRG1である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法によって得られる腸管神経前駆細胞。
- 請求項7記載の腸管神経前駆細胞を含む凍結ストック。
- 請求項7記載の腸管神経前駆細胞を含む細胞医薬。
- 以下の工程を含む、腸管神経前駆細胞の製造方法:
(B1)神経堤細胞を提供する工程、ならびに
(B2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニスト、ならびにレチノイン酸および/またはその誘導体、を含む培地中で神経堤細胞を培養する工程。 - 前記神経堤細胞が、迷走神経提細胞である、請求項10に記載の製造方法。
- 前記迷走神経堤細胞が、SOX10陽性、HOXB5陽性、HOXB9陰性かつPHOX2B陰性であり、
前記腸管神経前駆細胞が、SOX10陽性かつPHOX2B陽性である、請求項11に記載の製造方法。 - ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む、腸管神経前駆細胞培地。
- さらにTGFβ阻害剤および/またはGSK3β阻害剤を含む、請求項13に記載の培地。
- さらにレチノイン酸および/またはその誘導体を含む、請求項13または14に記載の培地。
- さらにGDNFを含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載の培地。
- さらにマトリゲルを含む、請求項13〜16のいずれか1項に記載の培地。
- 前記ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストが、NRG1である、請求項13〜17のいずれか1項に記載の培地。
- 以下の工程を含む、腸管神経前駆細胞の拡大培養方法:
(C1)腸管神経前駆細胞を提供する工程、ならびに
(C2)ERBB3アゴニストおよび/またはERBB4アゴニストを含む培地中で腸管神経前駆細胞を培養する工程。 - 腸管神経前駆細胞と後腸細胞とを共培養する工程を含む、腸管オルガノイドの製造方法。
- 腸管神経前駆細胞と後腸細胞とを共培養することにより腸管オルガノイドを得る工程と、
前記腸管オルガノイドを生体内に移植して人工腸管を形成させる工程と、を含む人工腸管の製造方法。 - 前記腸管神経前駆細胞が、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法によって得られた腸管神経前駆細胞である、請求項20又は21記載の製造方法。
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