JP2013223446A - 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP)ファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域からなるポリペプチド、または、該インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質を、表面に固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。
【選択図】図1
Description
IGFBP(Insulin−like Growth Factor Binding Protein)ファミリータンパク質は、高等生物において、インスリン様成長因子(IGF、Insulin−like growth factors)IおよびIIと特異的に結合するタンパク質として、IGFBP1〜6の6種類が報告されている。インスリン様成長因子の活性制御や分解阻害といった機能を有することが示唆されている。中でも、IGFBP4が好ましい。
本発明においては、基層に固定する融合タンパク質が、エラスチン様ポリペプチド中の主要な繰り返しペプチド配列を含むことが好ましく、Gly−Val−Gly−Val−Pro(以下GVGVP)の繰り返し配列を含むことが好ましい。GVGVPの繰り返し数は、65以上が好ましく、70以上がより好ましい。
低温下では、親水性が強まることにより、これらのポリペプチドは基層から遊離する。エラスチン様ポリペプチドのTg(t)は、GVGVPリピートの数に依存する(非特許文献13)。従って、エラスチン様ポリペプチド、(GVGVP)nは、様々な因子の固定化に有用である。本発明においては、ThyのN末と(GVGVP)nが結合するようにして、(GVGVP)n−IGFBP4とした融合タンパク質が特に好ましい。
本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とするものである。
本発明の心筋細胞の製造方法は、上記本発明の細胞培養基材と、液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする。
<(GVGVP)nプラスミドの作製>
プラスミドは、非特許文献(McPherson DT et al., Biotechnol. Prog. 1992;8:347−52. McPherson DT et al., Protein Expr. Purif. 1996;7:51−7.)の記載に準拠して作製した。Xho I、PflMI、Not I、Bam HIサイトをコードするオリゴヌクレオチドと、PflMI−(GVGVP)11−PflMI配列をOperon バイオテクノロジー社から購入した。これらのオリゴヌクレオチドを、Mighty TA−cloning キットfor PrimeSTAR(タカラバイオ社製)を用いて、pMD20−T(タカラバイオ社製)にサブクローンした。このベクターをPflMIで消化し、(GVGVP)11のPflMI断片と、Xho I、PflMI、Not I、Bam HIサイトを有するpMD20−TのPFlMI断片を得た。セルフライゲーションの防止のためpMD20−TのPFlMI断片を脱リン酸化した。上記酵素処理断片とベクターをT4リガーゼを用いてライゲーションした。同様にして、(GVGVP)12、(GVGVP)23、(GVGVP)45、(GVGVP)67、をそれぞれ含むpMD20ベクターを得た。上記断片とベクターが共に、両側にPflMIサイトを有しており、ベクターを脱リン酸化したため、上記断片のコンカテマーを得ることができた。得られたプラスミドをXho IおよびBam HIで処理した。(GVGVP)nのXho I/Bam HI処理断片と、pET14bのXho I/Bam HI処理断片をライゲーションして、Hisタグ−(GVGVP)12、(GVGVP)23、(GVGVP)45、(GVGVP)67を発現する組換えプラスミドを作製した。
IGFBP4のThyドメインをコードするcDNA断片をP19CL6細胞のcDNAライブラリーからPCRにより増幅した。Thyドメイン(アミノ酸の位置:167−245)をコードするDNA断片のPCRは、Not I、Xho I、Bam HIサイトを有するプライマーを用いて行われた。用いたプライマーは、IGFBPのセンスプライマーとして、5’−ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATCAGGGTTCCTGCCAGAGCGAGCTG−3’、および、5’−CGCTCGAGCGGCAGGGTTCCTGCCAGAGCGA−3’を用いた。アンチセンスプライマーとして、5’−CGGGATCCCGTCACTCTTGGAAGCTGTCAGCCAG−3’を用いた。
cDNA断片をMighty TA−cloning キットfor PrimeSTAR(タカラバイオ社製)を用いて、pMD20−Tベクターにサブクローンした。得られたプラスミドをNot IまたはXho Iと、Bam HIで処理した。Thyドメイン配列を含むNot I/Bam HI処理断片を、(GVGVP)nを含むpMD20のNot I/Bam HI断片に挿入した。(GVGVP)n−IGFBP4を含むプラスミドをXho IとBam HIで処理し、(GVGVP)n−IGFBP4断片を得た。(GVGVP)n−IGFBP4のXho I/Bam HI処理断片、または、IGFBP4(Thy) のXho I/Bam HI処理断片と、pET14bベクターのXho I/Bam HI処理断片とをライゲーションすることにより、6−Hisタグのついた、(GVGVP)12−IGFBP4、(GVGVP)23−IGFBP4、(GVGVP)45−IGFBP4、(GVGVP)67−IGFBP4、または、IGFBP4(Thy)を発現する組換えプラスミドを構築した。
組換えタンパク質は、E. coli KRX細胞(プロメガ社製)を用いて発現させた。E coli内での凝集、不溶化を防止する為に、タンパク質の発現は、相転移温度以下である20℃で行った。発現させたタンパク質は、COSMOGEL His Accept purification system(ナカライテスク社製)を用いて精製した。タンパク質は、リン酸バッファー(PBS)に溶解した。
(GVGVP)nタンパク質が、疎水性が温度依存的に変化するという挙動を示すタンパク質であるため、Tg(t)を超えた温度における凝集挙動を調べた。Tg(t)はGVGVPリピートの繰り返し数に依存する。(GVGVP)12、(GVGVP)23、(GVGVP)45、(GVGVP)67のTgを濁度アッセイ(turbidity assay)により決定した。Tg(t)値の決定に用いられる、凝集の温度プロファイルは、島津社製の分光光度計を用いて測定した。波長は、350nmに固定した。それぞれのタンパク質(1mg/mL)の濁度は、15℃〜60℃の間で、1℃/minで温度を上昇または下降させながら測定した。Tg(t)値は、50%の濁度が測定された温度として定義した。
(GVGVP)n−IGFBP4およびIGFBP4(Thy)溶液(0〜50μg/mL)をポリスチレンディッシュ上でTg(t)より高い温度、37℃、4℃のそれぞれの温度のもとで3時間インキュベートした。各タンパク質の最適濃度および吸着安定性を評価するために、抗IGFBP4抗体(ミリポア社製)を用いたELISAアッセイを行った。インキュベーション後、ディッシュを1%牛血清アルブミン含有PBSで1時間ブロックし、ラビットポリクローナル抗IGFBP4抗体(1:20000希釈)で2時間、室温でインキュベーションした。ULTRA−SENSITIVE TMB LIQUID HORSERADISH SUBSTRATE SYSTEM(ミリポア社製)を用いて検出を行った。マイクロプレートリーダー(GEヘルスケア社製)により450nmの吸収を測定した。
P19CL6細胞を10%の牛血清(FBS)、100U/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを含有するDulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)上で、37℃、95%空気/5% CO2下、培養した。ES細胞を未分化で維持するため、ES細胞(1x106細胞/35mmディッシュ)をフィーダー層上で培養した。フィーダー層は、COMPLETE ES CELL MEDIA W/15% ウシ血清、LIFを培地としたマウス胎仔繊維芽細胞により形成した。
(GVGVP)n−IGFBP4固定化ディッシュ上での、初期および後期におけるES細胞の心筋細胞分化を調べた。初期は、ES細胞(1x105細胞/35mmディッシュ)を、(GVGVP)n−IGFBP4固定化ディッシュ、または、0.1%ゼラチンコートディッシュ上で培養した。後期は、胚様体(EB、embryoid body)形成後(懸滴標本検査法、5日間)、胚様体を、(GVGVP)n−IGFBP4固定化ディッシュ、または、0.1%ゼラチンコートディッシュ上で、培養した。20%FBS、1mM ピルビン酸ナトリウム、0.1mM MEM非必須アミノ酸(ギブコ社製)および0.05mM 2−メルカプトエタノール(シグマ社製)を含有するIscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM、ギブコ社製)を、ES細胞の心筋細胞分化用培地として使用した。
P19CL6細胞を、(GVGVP)n−IGFBP4上で3時間培養した後、細胞をlysisバッファー(25mM Tris−HCl 2.5mM EDTA、137mM NaCl、2.7mM KCl、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、1% Triton X−100およびプロテアーゼインヒビターカクテル(ナカライテスク社製))を用いて破砕した。破砕液を4℃、20000×gで30分間遠心した。上清を取り出し、PureProteome protein G−conjugated 磁気ビーズ(ミリポア社製)とインキュベートし、抗LRP5/6抗体(Acris antibody GmbH製)に結合させた。インキュベーション後、ビーズに結合したタンパク質を5〜20%のSDS−PAGEグラジエントゲル(DRC CO.Ltd製)により分離した。分離したタンパク質をPVDFメンブレンにトランスファーした。メンブレンをラビットポリクローナル抗IGFBP4抗体(1:10000希釈)でインキュベーションし、その後、HRP結合抗ラビットIgG抗体(ジャクソンイムノリサーチラボラトリー社製)でインキュベーションした。メンブレンに、Immobilon Western detection reagents(ミリポア社製)を使用して、検出を行った。
全RNA抽出を、Tripure Isolation Reagent(ロシュダイアグノスティクス社製)を用いて行った。Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis kit (ロシュ社製)を用いて、cDNA合成を行った。RT―PCRは、以下のタンパク質検出用プライマーを用いて行った。マウスβアクチン、マウスGATA 4、マウス αミオシン重鎖(αMHC)、マウスE−カドヘリン、マウス N−カドヘリン、マウスOct−3、マウス Sox1、マウス Sox17、マウス BrachyuryT、マウス Wnt3a、マウスIGFBP4、マウスFrizzled8。PCRは、Ex−Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を使用して行った。
細胞を24×24mm カバーグラス上で培養した。細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBSで15分間固定し、50mM グリシン−PBSで洗浄し、0.1% Triton X−100/PBSで5分間透過処理を行って、1% BSA/PBSで1時間ブロッキングをした。固定化および透過処理後、細胞を室温で1時間、抗ヒトαMHCモノクローナル抗体(MF20、R&D systems社製。1:100希釈。)、または、抗IGFBP4抗体(1:100希釈)を用いて、インキュベーションした。細胞をPBSで洗浄し、FITC結合第2抗体またはCy3結合第2抗体(ジャクソンイムノリサーチラボラトリー社製)を用いて室温で1時間インキュベーションした。細胞核を0.1μg/mL DAPIで染色した。細胞は全て、共焦点顕微鏡(A1/A1Rシステム。ニコン社製)を使用して観察した。蛍光イメージは、NIS−Elements Imaging Software(ニコン社製)を用いて処理した。MF20陽性領域の割合は、それぞれのサンプルのランダムな20箇所におけるMF20染色領域/DAPI染色領域の割合の平均から求めた。
細胞実験は3回行い、結果は、平均±標準偏差で示した。
<(GVGVP)n−IGFBP4のTg(t)および温度依存的凝集プロファイルの決定>
IGFBP4(Thy)、(GVGVP)12−IGFBP4、(GVGVP)23−IGFBP4、(GVGVP)45−IGFBP4、(GVGVP)67−IGFBP4、(GVGVP)45、(GVGVP)67の産生を、SDS−PAGEおよびウェスタンブロットにて確認した(図1 A)。
(GVGVP)n−IGFBP4のTg(t)を決定するために、濁度アッセイを行って、(GVGVP)12、(GVGVP)23、(GVGVP)45、(GVGVP)67、の凝集の温度依存的態様を調べた。(GVGVP)45、(GVGVP)67の温度依存的凝集は、50℃以上で観察されたが、(GVGVP)12、(GVGVP)23はそうではなかった(図1 B)。GVGVPの23回繰り返しでは凝集を引き起こすのに短すぎるものと考えられる。(GVGVP)45、(GVGVP)67の温度プロファイルから、(GVGVP)45、(GVGVP)67のTgはそれぞれ32℃、42℃であると算出した。
IGFBP4(Thy)、(GVGVP)12−IGFBP4、(GVGVP)23−IGFBP4、(GVGVP)45−IGFBP4、(GVGVP)67−IGFBP4のポリスチレンディッシュに対する吸着安定性を調べるために、それぞれのタンパク質でコートされたディッシュを1日または1週間、4℃または37℃でインキュベートした。吸着タンパク質量はELISAにより測定した。(GVGVP)67−IGFBP4の吸着量が最も多かった。1日インキュベート後において、(GVGVP)12−、(GVGVP)23−、(GVGVP)45−IGFBP4は、IGFBP4(Thy)と同等であった(図2 A)。これら全てのタンパク質は、4℃および37℃の双方で、10μg/mLを超えると吸着が飽和した(図1 AおよびB)。(GVGVP)67−IGFBP4、(GVGVP)45−IGFBP4の、Tgより低い温度、4℃での吸着量が小さいこと、および、37℃において、(GVGVP)67−IGFBP4の吸着量が(GVGVP)45−IGFBP4よりも少ないことが明らかになった(図2 A)。IGFBP4(Thy)単独では1週間にわたる安定的な吸着は起きないことがわかった。一方、(GVGVP)67−IGFBP4は、37℃において1週間ディッシュに安定的に吸着した(図2 BおよびC)。上記結果より、IGFBP4(Thy)は、(GVGVP)67を介して安定してポリスチレンディッシュ上に固定化できることがわかった。
IGFBP4(Thy)、(GVGVP)12−IGFBP4、(GVGVP)23−IGFBP4、(GVGVP)45−IGFBP4、 (GVGVP)67−IGFBP4がWnt受容体であるLRP5/6と結合するかどうかを調べる為、抗LRP5/6抗体を用いた免疫沈降を行った。免疫沈降は、10μg/mLのIGFBP4(Thy)、(GVGVP)12−IGFBP4、(GVGVP)23−IGFBP4、(GVGVP)45−IGFBP4、または、(GVGVP)67−IGFBP4でコートされたディッシュ上で培養されたP19CL6細胞を用いて行った。P19CL6細胞は、Wnt受容体であるLRP5/6およびFrizzled 8を発現しており、これらの受容体はIGFBP4に結合しうることが報告されている(文献4)。P19CL6細胞が、(GVGVP)n−IGFBP4コートされたディッシュに、IGFBP4とWnt受容体との相互作用を通じて吸着するかどうかを調べた。P19CL6細胞は、これらのタンパク質でコートされたディッシュに吸着したが、IGFBP4(Thy)ドメインが無い(GVGVP)67単独でコートされたディッシュには吸着しなかった(データ無し)。これらディッシュ上で培養されたP19Cl6細胞において、抗LRP5/6抗体結合ビーズと共に沈降した(GVGVP)12,23,45,67−IGFBP4、IGFBP4(Thy)は、抗IGFBP4抗体を用いたウェスタンブロットで検出した(図3)。これらの結果により、P19CL6細胞は、IGFBP4(Thy)とWnt受容体との相互作用を通じて、(GVGVP)n−IGFBP4コートされたディッシュに吸着すると考えられることが明らかになった。
(GVGVP)67−IGFBP4コートされたディッシュを使用したマウスES細胞の心筋細胞への分化を調べるため、マウスES細胞を、0.1%ゼラチンコートディッシュ(コントロール)、10μg/mL (GVGVP)67−IGFBP4コートされたディッシュ、1μg/mL IGFBP4(Thy)コートされたディッシュ、または、1μg/mL (GVGVP)67−IGFBP4が可溶性因子として添加されたゼラチンコートディッシュを用いて、24日間培養した。培地は、1日おきに交換した。マウスES細胞は、全ての条件において同様に吸着、増殖した(図4 A)。心臓系の遺伝子発現を、GATA4およびαMHCのRT−PCRにより調べた。(GVGVP)67−IGFBP4コートされたディッシュ上で培養したマウスES細胞では、24日培養後のGATA4およびαMHCの発現量が多かった(図4 B)。また、抗αMHC抗体(MF20)による免疫染色で陽性となった(図4 C)。MF20陽性領域の、DAPI陽性領域に対する割合は、コントロール、IGFBP4(Thy)添加、(GVGVP)67−IGFBP4添加、(GVGVP)67−IGFBP4固定化、の順で、それぞれ5%、7%、7%、18%であった(図4 C)。これらの結果から、(GVGVP)67−IGFBP4の固定化は、マウスES細胞の心筋細胞への分化を促進することが明らかになった。
IGFBP4は、胚様体形成後の後期段階におけるマウスES細胞の心筋細胞への分化を促進することが報告されている(文献4)。胚様体を形成したマウスES細胞の心筋細胞への分化が、(GVGVP)67−IGFBP4固定化ディッシュにより促進されるかを調べた。懸滴標本検査法における胚様体形成過程のES細胞の遺伝子発現プロファイルをRT−PCRにより調べた。3日目の懸滴培地において、胚様体が形成された。胚様体は、N−カドヘリン、Sox17、BrachyuryT、GATA4、Wnt3a、およびIGFBP4を発現した(図5)。この結果より、ES細胞は、懸滴培地において、胚様体の形成を通して、内胚葉系中胚葉の細胞に分化することが明らかになった。また、5日目の培地において、IGFBP4が強く発現していた一方、Wnt3aの発現は弱まっていた(図5 B)。これは、5日目において、心臓発生が開始したことを示唆している。そこで、懸滴培養法5日後において、胚様体を、10μg/mL (GVGVP) 67−IGFBP4固定化ディッシュまたは、0.1%ゼラチンコートディッシュ(コントロール)上で培養した。1μg/mL IGFBP4(Thy)、10μg/mL (GVGVP)67−IGFBP4を、溶解性因子として、ゼラチンコートディッシュに20日間添加した(図6 A)。培地は一日おきに交換した。GATA4、αMHCの遺伝子発現をRT−PCRを用いて確認した。(GVGVP) 67−IGFBP4上で20日間培養した胚様体で、GATA4およびαMHCの双方の高い発現が見られた(図6 C)。20日後において、心筋分化したES細胞の自律拍動が見られた。(GVGVP) 67−IGFBP4上で培養した胚様体の拍動領域を図6Bに示す。MF20を用いた免疫染色において、DAPI陽性領域に対するMF20陽性領域の割合は、コントロール、IGFBP4(Thy)添加、(GVGVP) 67−IGFBP4添加、(GVGVP) 67−IGFBP4固定化ディッシュの順で、それぞれ約30%、40%、40%、65%であった。図7は、(GVGVP) 67−IGFBP4固定化ディッシュ上で培養したES細胞のMF20陽性領域の共焦点顕微鏡による観察結果を示す。
Claims (11)
- インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP)ファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域からなるポリペプチド、または、該インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質を、表面に固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。
- 前記インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP)ファミリーに属するタンパク質がIGFBP4、または、IGFBP4と相同性を有するタンパク質である請求項1記載の細胞培養基材。
- 前記インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP)ファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域からなるポリペプチド、または、該インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質が、IGFBP4のThyドメインまたはIGFBP4のThyドメインと相同なアミノ酸配列を含むものである請求項1または2記載の細胞培養基材。
- 前記インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質が、エラスチン様ポリペプチドの全部または一部を含む請求項1〜3のいずれか一項記載の細胞培養基材。
- 前記インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質が、(GVGVP)n(nは2以上の数である。)で表される繰り返し配列を含む請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞培養基材。
- 前記繰り返し配列が、(GVGVP)n(nは65以上の数である。)で表される請求項5記載の細胞培養基材。
- 前記融合タンパク質が、N末側に、(GVGVP)n(nは65以上の数である。)を含み、C末側にIGFBP4の全部または一部を含むタンパク質である請求項1〜6のいずれか一項記載の細胞培養基材。
- 前記融合タンパク質が、N末側に、(GVGVP)n(nは65以上の数である。)を含み、C末側にIGFBP4のThyドメインまたはIGFBP4のThyドメインと相同なアミノ酸配列を含むタンパク質である請求項7記載の細胞培養基材。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞培養基材と、液体培地とを用いて、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させることを特徴とする心筋細胞の製造方法。
- Wnt/βカテニンシグナリング経路を阻害することにより多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させる請求項10記載の心筋細胞の製造方法。
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