KR20210049779A - 장관 신경전구세포의 제조 방법 - Google Patents

장관 신경전구세포의 제조 방법 Download PDF

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KR20210049779A
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nerve
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마코토 이케야
야요이 가미야
다이스케 가미야
데루요시 야마시타
가즈미 다케
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

장관 신경전구세포를, 장관 신경세포 및 글리아세포로의 분화능을 유지한 채 배양하여 증식시키기 위한 기술로서, (1) 장관 신경전구세포를 제공하는 공정, 및 (2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 장관 신경전구세포를 배양하는 공정을 포함하는, 장관 신경전구세포의 제조 방법을 제공한다.

Description

장관 신경전구세포의 제조 방법
본 발명은, 장관 신경전구세포의 제조 방법 및 확대 배양 방법 그리고 이들에 사용되는 배지에 관한 것이다.
신경제세포 (Neural Crest Cell : NCC) 는, 발생 초기에 있어서 신경판으로부터 신경관이 형성될 때에, 신경외 배엽과 표피외 배엽 사이로부터 발생하는 세포이다. 장관 신경전구세포 (Enteric Neural Precursor : ENP) 는, 이 NCC 로부터 발생하고, 장관 신경세포 계보로 분화한 세포이다. ENP 는, 장관 신경세포 및 글리아세포로의 분화능을 갖는다.
선천적인 장관 신경절세포의 결손에서 기인하는 질환으로서, 소화관의 운동의 억제를 나타내는 히르쉬스프룽 (Hirschsprung) 병이 있다. 최근, 환자로부터 채취하여 ex vivo 에서 증식시킨 ENP 를 자가 이식함으로써 히르쉬스프룽병을 치료하는 것을 목표로 한 기초적인 시도가 보고되어 있다 (비특허문헌 1).
ENP 를 포함하는 세포 의약의 제조를 위해서, 유도성 다능성 간세포 (inducible Pluripotent Stem Cell : iPSC) 등의 다능성 간세포로부터 NCC 를 유도하고, 또한 NCC 로부터 ENP 를 유도하는 것이 검토되고 있다.
예를 들어, 비특허문헌 2 에는, 인간 다능성 간세포로부터 장관 신경계 전구세포 (enteric nervous system progenitor) 를 제조한 것이 기재되어 있다. 비특허문헌 2 에는, PHOX2B 양성의 장관 신경전구세포는 나타나 있지 않고, 또한, 뉴레귤린 1 (Neuregulin-1 : NRG1) 에 관한 기재도 되어 있지 않다.
또, 비특허문헌 3 에는, 인간 iPSC 를 TGFβ 저해제, GSK3β 저해제 및 NRG1 을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 슈반 전구세포 (Schwann cell precursor) 를 제조한 것이 기재되어 있다. 비특허문헌 3 에 기재된 방법은 레티노산을 사용하고 있지 않아, 얻어지는 슈반 전구세포는 ENP 와는 상이한 세포이다 (예를 들어, ENP 는 PHOX2B 발현이 양성이지만, 동문헌에 기재된 슈반 전구세포는 음성이다).
ENP 를 사용한 세포 치료 등의 실현을 위해, ENP 를 대량으로 공급 가능한 기술이 요구된다. 상기 서술한 바와 같이, 인간 다능성 간세포로부터 장관 신경계 전구세포 (enteric nervous system progenitor) 를 유도하는 방법이 보고되어 있지만 (비특허문헌 2), 유도된 ENP 를 증식시켜 확대 배양하기 위한 수법은 아직 개발되어 있지 않다.
본 발명은, ENP 를, 장관 신경세포 및 글리아세포로의 분화능 (다능성 (multipotency)) 을 유지한 채 증식시키기 위한 기술을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
상기 과제 해결을 위해, 본 발명은, 이하의 [1] ∼ [27] 을 제공한다.
[1] 이하의 공정을 포함하는, 장관 신경전구세포의 제조 방법.
(A1) 장관 신경전구세포를 제공하는 공정.
(A2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 장관 신경전구세포를 배양하는 공정.
[2] 상기 배지가, 추가로 TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함하는, [1] 의 제조 방법.
[3] 상기 배지가, 추가로 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는, [1] 또는 [2] 의 제조 방법.
[4] 상기 배지가, 추가로 GDNF 를 포함하는, [1] ∼ [3] 중 어느 하나의 제조 방법.
[5] 상기 배지가, 추가로 마트리겔을 포함하는, [1] ∼ [4] 중 어느 하나의 제조 방법.
[6] 상기 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트가, NRG1 인, [1] ∼ [5] 중 어느 하나의 제조 방법.
[7] [1] ∼ [6] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 얻어지는 장관 신경전구세포.
[8] [7] 의 장관 신경전구세포를 포함하는 동결 스톡.
[9] [7] 의 장관 신경전구세포를 포함하는 세포 의약.
[10] 이하의 공정을 포함하는, 장관 신경전구세포의 제조 방법.
(B1) 신경제세포를 제공하는 공정.
(B2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트, 그리고 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는 배지 중에서 신경제세포를 배양하는 공정.
[11] 상기 신경제세포가, 미주 신경제세포인, [10] 의 제조 방법.
[12] 상기 미주 신경제세포가, SOX10 양성, HOXB5 양성, HOXB9 음성 또한 PHOX2B 음성이고,
상기 장관 신경전구세포가, SOX10 양성 또한 PHOX2B 양성인, [11] 의 제조 방법.
[12a] 상기 배지가, 추가로 TGFβ 저해제 및/또는 GSK3β 저해제를 포함하는, [10] ∼ [12] 의 제조 방법.
[12b] 상기 배지가, 추가로 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는, [10] ∼ [12a] 중 어느 하나의 제조 방법.
[12c] 상기 배지가, 추가로 GDNF 를 포함하는, [10] ∼ [12b] 중 어느 하나의 제조 방법.
[12d] 상기 배지가, 추가로 마트리겔을 포함하는, [10] ∼ [12c] 중 어느 하나의 제조 방법.
[12e] 상기 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트가, NRG1 인, [10] ∼ [12d] 중 어느 하나의 제조 방법.
[12f] [10] ∼ [12e] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 얻어지는 장관 신경전구세포.
[13] ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는, 장관 신경전구세포 배지.
[14] 추가로 TGFβ 저해제 및/또는 GSK3β 저해제를 포함하는, [13] 의 배지.
[15] 추가로 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는, [13] 또는 [14] 의 배지.
[16] 추가로 GDNF 를 포함하는, [13] ∼ [15] 중 어느 하나의 배지.
[17] 추가로 마트리겔을 포함하는, [13] ∼ [16] 중 어느 하나의 배지.
[18] 상기 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트가, NRG1 인, [13] ∼ [17] 중 어느 하나의 배지.
[19] 이하의 공정을 포함하는, 장관 신경전구세포의 확대 배양 방법.
(C1) 장관 신경전구세포를 제공하는 공정.
(C2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 장관 신경전구세포를 배양하는 공정.
[20] 장관 신경전구세포와 후장세포를 공배양하는 공정을 포함하는, 장관 오르가노이드의 제조 방법.
[21] 장관 신경전구세포와 후장세포를 공배양함으로써 장관 오르가노이드를 얻는 공정과, 상기 장관 오르가노이드를 생체내에 이식하여 인공 장관을 형성시키는 공정을 포함하는 인공 장관의 제조 방법.
[21a] 장관 신경전구세포와 후장세포를 공배양함으로써 장관 오르가노이드를 얻는 공정과, 상기 장관 오르가노이드를 인간 이외의 포유 동물의 생체내에 이식하여 인공 장관을 형성시키는 공정을 포함하는 인공 장관의 제조 방법.
[22] 상기 장관 신경전구세포가, [1] ∼ [6] 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 장관 신경전구세포인, [20] ∼ [21a] 에 기재된 제조 방법.
[23] [20] 또는 [22] 의 제조 방법에 의해 얻어지는 장관 오르가노이드.
[24] [21] ∼ [22] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 얻어지는 인공 장관.
[25] ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는, 장관 신경전구세포 배지용 첨가제.
[26] ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트의, 장관 신경전구세포의 확대 배양을 위한 사용.
[27] 상기 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트가, NRG1 인, [25] 의 첨가제 또는 [26] 의 사용.
본 발명에 있어서, 「신경제세포 (Neural Crest Cell : NCC)」란, 발생 초기에 있어서 신경판으로부터 신경관이 형성될 때에 신경외 배엽과 표피외 배엽 사이로부터 발생하는 세포이며, 신경세포, 글리아세포, 간엽계 간질세포, 골세포, 연골세포, 각막세포 및 색소세포 등의 많은 종류의 세포로 분화하는 다능성 (multipotency) 과 자기 증식능을 갖는다. NCC 는, SOX10 양성이다.
「두부 신경제세포 (Cranial NCC)」란, 발생기에 있어서 이포보다 두부 측으로부터 발생하고, 안면의 뼈, 연골 및 신경 등으로 분화하는 세포 집단이다. 두부 신경제세포는, 신경제세포 마커인 SOX10 양성이며, HOXB 유전자군 (HOXB1-10) 이 음성의 세포이다.
「미주 신경제세포 (Vagal NCC)」란, 발생기에 있어서 체절 1 번 ∼ 7 번에 상당하는 부위로부터 발생하고, 장관 신경계 등으로 분화하는 세포 집단이다. 미주 신경제세포는, 신경제세포 마커인 SOX10 양성이며, HOXB5 양성, HOXB9 음성, 또한 PHOX2B 음성이다. 바람직하게는, SOX10 양성이며, HOXB1-7 양성, HOXB9 음성, HOXB10 음성, 또한 PHOX2B 음성이다.
「체간 신경제세포 (Trunk NCC)」란, 발생기에 있어서 체절 8 번부터 꼬리 측에 상당하는 부위로부터 발생하고, 자율 신경계, 감각 신경, 색소세포 및 부신수질의 크로마핀세포 등으로 분화하는 세포 집단이다. 체간 신경제세포는, 신경제세포 마커인 SOX10 양성이며, HOXB1-9 양성, HOXB10 음성 또한 PHOX2B 음성이다.
「선골 신경제세포 (Sacral NCC)」란, 발생기에 있어서 최꼬리 측에 상당하는 부위로부터 발생하고, 대장의 일부의 장관 신경계 등으로 분화하는 세포 집단이다. 선골 신경제세포는, 신경제세포 마커인 SOX10 양성이며 HOXB1 ∼ 10 양성 또한 PHOX2B 음성이다.
「장관 신경전구세포 (Enteric Neural Precursor : ENP)」란, 미주 신경제세포 및 선골 신경제세포로부터 분화하고, 신경제세포 및 글리아세포의 마커인 SOX10 양성 또한 PHOX2B 양성의 세포이다. ENP 는, PHOX2B 양성 또한 SOX10 음성의 장관 신경세포, 및, S100β 양성, PLP1 양성 또한 SOX10 양성의 글리아세포로의 분화능을 갖는다.
「장관 신경세포」란, 장관 신경전구세포에서 유래하고, PHOX2B 양성 또한 SOX10 음성이다.
「글리아세포」란, S100β 양성, PLP1 양성 또한 SOX10 양성이거나, 또는 GFAP 양성이다. 본 명세서에 있어서는, 글리아세포를 특히 「장관 글리아세포」로 칭하는 경우가 있다. 장관 글리아세포는, 예를 들어, 장관 신경전구세포를 글리아세포로 분화시킴으로써 얻을 수 있다.
「장관 신경전구세포 배지」란, ENP 의 제조 및/또는 ENP 의 확대 배양을 위해서 사용되는 배지이다. ENP 의 제조란, iPS 세포, ES 세포 및 NCC 등의 간세포로부터 ENP 로 분화시키는 것을 포함할 수 있다.
「장관 오르가노이드」란, 생체외에서 제조되는 조직 구조체이고, 인간 등의 포유 동물의 장이 갖는 복수의 기능 (예를 들어, 연동 운동 기능, 점액 분비 기능, 물질 흡수 기능 등) 혹은 이들과 유사한 기능의 1 이상을 갖는 조직 구조체를 의미한다. 장관 오르가노이드는, 예를 들어, 후장세포, 전장세포 등의 장관을 구성하는 여러 가지 세포의 유래원 (由來元) 의 세포, 및, 후장세포, 전장세포, 장관 신경세포, 장관 신경전구세포, 장간세포 (腸幹細胞) (LGR5 양성), Paneth 세포 (LYZ 양성), 배세포 (Mucin 양성) 및 분비세포 등의 장관을 구성하는 여러 가지 세포, 그리고 이들 세포의 유래원의 세포에서 선택되는 적어도 1 종의 세포를 포함하는 세포 집단에 의해 구성된다.
「인공 장관」이란, 장관 오르가노이드를 인간 또는 인간 이외의 포유 동물의 생체내에 이식하여 성숙화시켜 얻어지는 조직 구조체이고, 인간 등의 포유 동물의 장이 갖는 복수의 기능 (예를 들어, 연동 운동 기능, 점액 분비 기능, 물질 흡수 기능 등) 혹은 이들과 유사한 기능의 1 이상을 갖는 조직 구조체를 의미한다. 인공 장관은, 예를 들어, 장관 오르가노이드를 마우스 등의 포유 동물의 체내 (예를 들어, 복강내) 에 이식하고, 일정 기간 경과시킴으로써 제조된다. 인공 장관은, 예를 들어, 후장세포, 전장세포 등의 장관을 구성하는 여러 가지 세포의 유래원의 세포, 및, 후장세포, 전장세포, 장관 신경세포, 장관 신경전구세포, 장간세포 (LGR5 양성), Paneth 세포 (LYZ 양성), 배세포 (Mucin 양성) 및 분비세포 등의 장관을 구성하는 여러 가지 세포, 그리고 이들 세포의 유래원의 세포에서 선택되는 적어도 1 종의 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 또한, 인공 장관은, 예를 들어, 근육세포 및 페이스메이커세포 등도 포함할 수 있는 것이며, 이 경우에 있어서 신경세포는 근육세포 사이에 배치된다.
「후장세포」란, 발생의 과정에 있어서는 내배엽으로부터 분화하는 세포이며, CDX2 양성인 것을 특징으로 한다. 후장세포 덩어리는, 후장세포에 추가하여, 상피세포 (E-cadherin 양성) 및 간엽계 세포 (Vimentin 양성) 를 포함할 수 있다.
「배체내 배엽」이란, 발생의 과정에 있어서는 전방 원시선조로부터 분화하는 세포이며, SOX17 양성 또한 FOXA2 양성인 것을 특징으로 한다.
「ERBB3」이란, ERBB3 유전자에 의해 코드되는 티로신 키나아제 수용체이며, EGF 리셉터 패밀리의 하나이다. HER3 (human epidermal growth factor receptor 3) 이라고도 불린다. ERBB3 은, ERBB2 와 헤테로 다이머를 형성하고, 세포의 증식이나 분화에 관련된 시그널 경로를 활성화한다. ERBB3 은, 장관 신경전구세포에서 발현하는 것이 알려져 있다. ERBB3 에는 스플라이싱 배리언트가 존재하는 것이 알려져 있지만, 본 발명에서의 ERBB3 에는 이들 배리언트가 특별히 한정되지 않고 포함된다.
「ERBB3 아고니스트」란, ERBB3 과 결합하여 그 하류의 시그널 경로를 활성화하는 능력 (ERBB3 아고니스트 활성) 을 갖는 물질이면 되고, 단백질, 펩티드, 핵산 및 저분자 화합물 그리고 이들의 유도체 등이어도 된다. ERBB3 아고니스트에는, 예를 들어, NRG1, NRG2 및 NRG6 등의 단백질이 있다. NRG1, NRG2 및 NRG6 등의 단백질은, 전장 단백질이어도 되고, ERBB3 아고니스트 활성을 갖는 그 단편이어도 된다.
「ERBB4」란, ERBB4 유전자에 의해 코드되는 티로신 키나아제 수용체이며, EGF 리셉터 패밀리의 하나이다. HER4 (human epidermal growth factor receptor 4) 로도 불린다. ERBB4 는, ERBB2 와 헤테로 다이머를 형성하고, 세포의 증식이나 분화에 관련된 시그널 경로를 활성화한다. ERBB4 에는, 여러 가지 스플라이싱 배리언트가 존재하는 것이 알려져 있지만, 본 발명에서의 ERBB4 에는 이들 배리언트가 특별히 한정되지 않고 포함된다.
「ERBB4 아고니스트」란, ERBB4 와 결합하여 그 하류의 시그널 경로를 활성화하는 능력 (ERBB4 아고니스트 활성) 을 갖는 물질이면 되고, 단백질, 펩티드, 핵산 및 저분자 화합물 그리고 이들의 유도체 등이어도 된다. ERBB4 아고니스트에는, 예를 들어, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRG5, BTC, EPR 및 HBEGF 등의 단백질이 있다. NRG1-5, BTC, EPR 및 HBEGF 등의 단백질은, 전장 단백질이어도 되고, ERBB4 아고니스트 활성을 갖는 그 단편이어도 된다.
「뉴레귤린 1 (Neuregulin-1 : NRG1)」이란, NRG1 유전자에 의해 코드되는 EGF 유사 증식 인자이다. Heregulin 이라고도 불린다. ERBB3 및 ERBB4 와 결합하여, 그 하류의 시그널 경로를 활성화하는 것이 알려져 있다.
「글리아세포 유래 신경 영양 인자 (Glial cell line Derived Neurotrophic Factor : GDNF)」란, GDNF 유전자에 의해 코드되는 인자이며, GFRα1 및 RET 의 아고니스트로서 작용한다. 신경세포 및 글리아세포의 보호나, 장관 신경전구세포의 증식에 관련하는 것이 알려져 있다.
「마트리겔」은, 세포외 매트릭스 단백질을 풍부하게 포함하는 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종으로부터 추출한 가용성 기저막 조제품이며, 주성분은, 라미닌, 콜라겐 IV, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 그리고 엔탁틴/니도젠 1 및 2 이며, 이들에 TGFβ, 상피 세포 증식 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 선유아세포 증식 인자 (FGF), 조직 플라스미노겐 활성화 인자 3 및 4, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 종양에 자연적으로 산생되는 다른 증식 인자가 포함되는 것이다.
「배양」이란, 세포를 인비트로 환경에 있어서 유지하고, 증식시키고 (성장시키고), 또한/또는 분화시키는 것을 가리킨다. 「배양한다」란, 조직외 또는 체외에서, 예를 들어, 세포 배양 디시 또는 플라스크 중에서 세포를 유지하고, 증식시키고 (성장시키고), 또한/또는 분화시키는 것을 의미한다.
「확대 배양」이란, 원하는 세포 집단을 증식시켜, 세포수를 증가시키는 것을 목적으로 하여 배양하는 것을 의미한다. 세포수의 증가는, 세포의 증식에 의한 증수가 사멸에 의한 감수를 초과하는 것에 의해 달성되는 것이면 되고, 세포 집단의 모든 세포가 증식하는 것을 필요로 하지 않다. 세포수의 증가는, 확대 배양의 개시 전과 비교해 1.1 배, 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배, 20 배, 30 배 이상일 수 있다.
「유지 배양」이란, 원하는 세포 집단을 그들의 수를 유지하면서 배양하는 것을 의미한다. 세포수의 유지는, 세포가 증식하지 않고 생존함으로써 달성되는 것이어도 되고, 세포의 증식에 의한 증수와 사멸에 의한 감수가 길항함으로써 달성되는 것이어도 된다. 세포수의 유지는, 세포의 수가 완전히 동일하게 유지될 필요는 없고, 본 발명의 목적에 비추어 보아 세포의 수가 실질적으로 동일하게 유지되면 된다.
「세포 집단」이란, 동일한 종류 또는 상이한 종류의 2 이상 세포를 의미한다. 「세포 집단 (population)」은, 동일한 종류 또는 상이한 종류의 세포의 한 덩어리 (mass) 도 의미한다.
「접착 배양」이란, 세포를 용기에 부착시킨 상태, 예를 들어 적절한 배지의 존재하에서 세포를 멸균 플라스틱 (또는 코팅된 플라스틱) 의 세포 배양 디시 또는 플라스크에 부착시킨 상태에서 배양하는 것을 의미한다.
「부유 배양」이란, 세포를 용기에 부착시키지 않고 적절한 배지 중에 분산시킨 상태에서 배양하는 것을 의미한다.
「다능성 (pluripotency)」이란, 여러 가지 상이한 형태나 기능을 가지는 조직이나 세포로 분화할 수 있고, 3 배엽의 어느 계통의 세포로도 분화할 수 있는 능력을 의미한다. 「다능성 (pluripotency)」은, 배반으로는 분화할 수 없고, 따라서 개체를 형성하는 능력은 없다는 점에서, 배반을 포함하여, 생체의 모든 조직으로 분화할 수 있는 「전능성 (totipotency)」과는 구별된다.
「다능성 (multipotency)」이란, 복수의 한정적인 수의 계통의 세포로 분화할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 간엽계 간세포, 조혈 간세포, 신경 간세포는 multipotent 이지만, pluripotent 는 아니다. ENP 는, 신경세포 및 글리아세포로 분화하는 다능성 (multipotency) 을 갖는다.
「마커」란, 「마커 단백질」 또는 「마커 유전자」이고, 소정의 세포형에 있어서 세포 표면, 세포질내 및/또는 핵내 등에서 특이적으로 발현되는 단백질 또는 그 유전자를 의미한다. 마커는, 양성 선택 마커 혹은 음성 선택 마커일 수 있다. 바람직하게는, 마커는 세포 표면 마커이며, 특히 세포 표면 양성 선택 마커에 의하면, 생존 세포의 농축, 단리, 및/또는 검출이 실시 가능해진다.
마커 단백질의 검출은, 당해 마커 단백질에 특이적인 항체를 사용한 면역학적 어세이, 예를 들어, ELISA, 면역 염색, 플로 사이토메트리 등을 이용하여 실시할 수 있다. 마커 단백질에 특이적인 항체로는, 마커 단백질에 있어서의 특정 아미노산 서열 또는 마커 단백질에 결합한 특정 당사슬 등에 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 또, 세포내에서 발현하고, 세포 표면에는 나타나지 않는 마커 단백질 (예를 들어 전사 인자 또는 그 서브 유닛 등) 의 경우에는, 당해 마커 단백질과 함께 리포터 단백질을 발현시키고, 당해 리포터 단백질을 검출함으로써 대상으로 하는 마커 단백질을 검출할 수 있다 (예를 들어, 비특허문헌 4). 이 방법은, 적당한 세포 표면 마커가 확인되지 않는 경우에 바람직하게 사용될 수 있다. 마커 유전자의 검출은, 당해 분야에서 공지된 핵산 증폭 방법 및/또는 핵산 검출 방법, 예를 들어, RT-PCR, 마이크로어레이, 바이오 칩 및 RNAseq 등을 이용하여 실시할 수 있다.
「발현 (expression)」이란, 세포 내의 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
「양성 (positive)」 또는 「발현한다」란, 단백질 또는 유전자가 당해 분야에서 공지된 수법에 의한 검출 가능량으로 발현하고 있는 것을 의미한다. 단백질의 검출은, 항체를 사용한 면역학적 어세이, 예를 들어, ELISA, 면역 염색, 플로 사이토메트리를 이용하여 실시할 수 있다. 또, 세포 내에서 발현하고, 세포 표면에는 나타나지 않는 단백질 (예를 들어 전사 인자 또는 그 서브 유닛 등) 의 경우에는, 당해 단백질과 함께 리포터 단백질을 발현시키고, 당해 리포터 단백질을 검출함으로써 대상으로 하는 단백질을 검출할 수 있다. 유전자의 검출은, 예를 들어, RT-PCR, 마이크로어레이, 바이오 칩 및 RNAseq 등의 핵산 증폭 방법 및/또는 핵산 검출 방법을 이용하여 실시할 수 있다.
「음성 (negative)」 또는 「발현되지 않는다」란, 단백질 또는 유전자의 발현량이, 상기와 같은 공지 수법의 모두 혹은 어느 것에 의한 검출 하한값 미만인 것을 의미한다. 단백질 또는 유전자의 발현의 검출 하한값은, 각 수법에 따라 상이할 수 있다.
「SOX10」은, 모든 신경제세포, 장관 신경전구세포 및 그것에서 유래하는 글리아세포에서 발현이 확인된다. 한편, SOX10 은, 장관 신경세포에서는 발현되지 않는다.
「HOXB5」는, 미주 신경제세포, 체간 신경제세포 및 선골 신경제세포에서 발현하고 있고, 장관 신경세포의 정상 발생에 필요한 것이 알려져 있다. 한편, HOXB5 는, 두부 신경제세포에서는 발현되지 않는다.
「HOXB9」는, 체간 신경제세포 및 선골 신경제세포에서 발현하고 있다. 한편, HOXB9 는, 두부 신경제세포 및 미주 신경제세포에서는 발현되지 않는다.
「PHOX2B」는, 장관 신경전구세포 및 그것에서 유래하는 장관 신경세포에서 발현이 확인된다.
「GFAP (Glial fibrillary acidic protein)」는, 글리아세포에서 발현하고 있다. 한편, GFAP 는 장관 신경전구세포 및 장관 신경세포에서는 발현하고 있지 않다.
「∼ 를 포함한다 (comprise(s) 또는 comprising)」란, 그 어구에 이어지는 요소의 포함을 나타내지만 이것으로 한정되지 않는 것을 의미한다. 따라서, 그 어구에 이어지는 요소의 포함은 시사하지만, 다른 임의의 요소의 제외는 시사하지 않는다.
「약」 또는 「대략」이란, 기준값에 대해 플러스 또는 마이너스 각각 30 ％, 25 ％, 20 ％, 15 ％, 10 ％, 8 ％, 6 ％, 5 ％, 4 ％, 3 ％, 2 ％ 또는 1 ％ 까지 변동하는 값을 나타낸다. 바람직하게는, 「약」 또는 「대략」이라는 용어는, 기준값에 대해 플러스 또는 마이너스 각각 15 ％, 10 ％, 5 ％, 또는 1 ％ 의 범위를 나타낸다.
본 발명에 의해, ENP 를, 장관 신경세포 및 글리아세포로의 분화능을 유지한 채 증식시키기 위한 기술이 제공된다.
도 1 은 본 발명의 제 2 실시형태에 관련된 ENP 의 제조 방법의 공정의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2 는 인간 iPSC 로부터 분화된 미주 신경제세포의 유전자 발현 프로파일을 나타내는 도면이다. (A) 는 HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB7 및 HOXB9 의 발현량을 나타내고, (B) 는 SOX10 및 EDNRB 의 발현량을 나타낸다. 세로축은, 발현량 (Fold change) 을 두부 신경제세포에 있어서의 발현량을 1 로 한 비를 log2 로 나타낸 값에 의해 나타낸다.
도 3 은 장관 신경전구세포 배지에서 미주 신경제세포를 계대 배양했을 때의 총 세포수 (accumulated cell number) 의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 4 는 장관 신경전구세포 배지에서 미주 신경제세포를 배양하여 얻어진 세포의 플로 사이토메트리 해석 결과를 나타내는 도면이다. (A) 는 배양 11 일째의 미주 신경제세포에 있어서의 SOX10-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 의 발현을, (B) 는 계대 횟수 (1 ∼ 6 회) 의 장관 신경전구세포에 있어서의 SOX10-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 의 발현을 나타낸다.
도 5 는 장관 신경전구세포 배지 혹은 그 배지로부터 NRG1 또는 GDNF 를 제거한 배지에서 미주 신경제세포를 배양하여 얻어진 세포의 형광상과 플로 사이토메트리에 의한 SOX10-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 의 발현 해석 결과를 나타내는 도면이다. 형광상에 있어서, 적 (赤) 이 SOX10-tdTomato 의 형광을, 녹 (綠) 이 PHOX2B-emGFP 의 형광을 나타낸다.
도 6 은 장관 신경전구세포 배지에서 미주 신경제세포를 배양하여 얻어진 세포의 유전자 발현 프로파일을 나타내는 도면이다. EDNRB 및 RET 는, 각각 「endothelin receptor type B」 및 「ret proto-oncogene」을 나타낸다.
도 7 은 장관 신경 유도 배지에서 장관 신경전구세포를 배양하여 얻어진 세포의 형광 면역 염색 화상이다. 형광 면역 염색 화상에 있어서, 녹이 PHOX2B-emGFP 의 형광을 나타내고, 자 (紫) 가 ChAT, nNOS, GABA 또는 5-HT 의 발현을 나타낸다.
도 8 은 장관 오르가노이드로부터 형성된 인공 장관의 형광 면역 염색 화상이며, PHOX2B-emGFP 및 SOX10-tdTomato 양성의 장관 신경전구세포에서 유래하는 세포를 나타낸다. 상단 우측 화상은 상단 좌측 화상의 부분 확대이며, 하단 우측 화상은 하단 좌측 화상의 부분 확대이다. 형광 면역 염색 화상에 있어서, 적이 SOX10-tdTomato 의 형광을, 녹이 PHOX2B-emGFP 의 형광을 나타내고, 청 (靑) 은 핵을 나타낸다.
도 9 는 장관 오르가노이드로부터 형성된 인공 장관의 형광 면역 염색 화상이며, 장관 신경전구세포에서 유래하는 S100β 양성 (A), GFAP 양성 (B) 또는 TUBB3 (C) 양성의 신경세포 또는 글리아세포를 나타낸다. 형광 면역 염색 화상에 있어서, 적이 SOX10-tdTomato 의 형광을, 녹이 PHOX2B-emGFP 의 형광을 나타내고, 황이 S100β, GFAP 또는 TUBB3 의 발현을 나타내고 청은 핵을 나타낸다.
도 10 은 장관 오르가노이드로부터 형성된 인공 장관의 전기 자극에 대한 수축 이완 반응을 계측한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11 은 장관 오르가노이드로부터 형성된 인공 장관의 전기 자극에 대한 수축 이완 반응을 계측한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12 는 장관 오르가노이드로부터 형성된 인공 장관의 전기 자극에 대한 수축 이완 반응을 계측한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13 은 확대 배양 후에 동결 융해한 장관 신경전구세포의 증식능과 분화능을 평가한 결과를 나타낸다. (A) 는, 확대 배양 시의 세포수의 시간 경과에 따른 변화 (좌측 도면) 와, 전체 세포에서 차지하는 장관 신경전구세포의 비율의 시간 경과에 따른 변화 (우측 도면) 를 나타낸다. (B) 는, 장관 신경전구세포 (ENP, 좌측 도면) 와 이것으로부터 분화시킨 장관 신경세포 (ENS, 우측 도면) 에 있어서의 PHOX2B 및 SOX10 의 발현을 플로 사이토메트리에 의해 해석한 결과를 나타낸다. (C) 는, 장관 신경전구세포로부터 분화시킨 장관 신경세포 및 글리아세포의 형광 면역 염색상을 나타낸다. 형광 면역 염색상에 있어서, 녹이 PHOX2B-emGFP 의 형광 또는 GFAP 의 발현을 나타내고, 자는 Peripherin, ChAT, nNOS, GABA, TH 또는 SST 의 발현을 나타낸다.
도 14 는 확대 배양 후의 장관 신경전구세포로부터 분화시킨 글리아세포의 형광 면역 염색 화상이다.
도 15 는 확대 배양 후의 장관 신경전구세포를 마우스 맹장벽에 이식하여 1 주간 경과 후의 이식 부위의 형광 면역 염색 화상이다. 형광 면역 염색 화상에 있어서, 청은 핵을 나타내고, 녹이 PHOX2B-emGFP 의 형광을, 적이 SOX10-tdTomato 의 형광을 나타내고, 자는 TUBB3 의 발현을 나타낸다. (b) 는 (a) 의 부분 확대이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 대해 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태의 일례를 나타낸 것이며, 이것에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 일은 없다.
본 발명자들은, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트의 존재하에서 장관 신경전구세포 (ENP) 를 배양함으로써, ENP 를 장관 신경세포 및 글리아세포로의 분화능을 유지한 채 증식시킬 수 있는 것을 알아냈다.
이 지견에 기초하여, 본 발명은, 제 1 실시형태로서, 이하의 공정 (A1) 및 공정 (A2) 를 포함하는, ENP 의 제조 방법을 제공한다.
(A1) ENP 를 제공하는 공정, 그리고
(A2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 ENP 를 배양하는 공정.
공정 (A2) 에 있어서 ENP 는 증식하는 것이며, 이 관점에 있어서 제 1 실시형태에 관련된 ENP 의 제조 방법은 ENP 의 확대 배양 방법과 동일한 의미이다.
본 발명에 관련된 ENP 의 제조 방법에 있어서는, ENP 는 신경제세포 (NCC) 로부터 분화되어 증식되는 것이어도 된다. 이 관점에 있어서, 본 발명은, 제 2 실시형태로서, 이하의 공정 (B1) 및 공정 (B2) 를 포함하는, ENP 의 제조 방법을 제공한다.
(B1) NCC 를 제공하는 공정, 그리고
(B2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트, 그리고 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는 배지 중에서 NCC 를 배양하는 공정.
본 발명은, 제 3 실시형태로서, 이하의 공정 (C1) 및 공정 (C2) 를 포함하는, ENP 의 확대 배양 방법을 제공한다.
(C1) ENP 를 제공하는 공정, 그리고
(C2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 ENP 를 배양하는 공정.
이하, 제 1 실시형태에 관련된 ENP 의 제조 방법의 공정 (A1) 및 (A2), 제 2 실시형태에 관련된 ENP 의 제조 방법의 공정 (B1) 및 (B2), 그리고 제 3 실시형태에 관련된 ENP 의 확대 배양 방법의 공정 (C1) 및 (C2) 에 대해 순서대로 설명한다.
[제 1 실시형태에 관련된 제조 방법 (ENP 의 증식 공정을 수반하는 방법)]
〔제 1 실시형태 공정 (A1) : 장관 신경전구세포를 제공하는 공정〕
본 공정에서는, ENP 가 제공된다. 본 공정에는 적어도 ENP 가 제공되면 되고, 단일의 ENP 세포, ENP 의 세포 집단 또는 ENP 를 포함하는 세포 집단이 제공되어도 된다.
본 공정에서 제공되는 ENP 는, 상업적으로 입수된 ENP 여도 되고, 생체로부터 분리된 ENP 여도 되고, 또한 후술하는 방법에 의해 NCC 등으로부터 유도한 ENP 여도 된다. 상업적으로 입수되는 ENP 는, 배양 상태에 있는 ENP 여도 되고, 동결 상태에 있는 ENP 여도 된다. 또, ENP 가 NCC 등으로부터의 유도한 ENP 인 경우도, 배양 상태에 있는 ENP 여도 되고, 동결 상태에 있는 ENP 여도 된다.
생체로부터 ENP 를 분리하는 방법으로는, 예를 들어, 장관 조직을 1 mm 사방으로 잘라내고, 효소적 처리 (디스파제 및 콜라게나아제 타입 XI, 37 ℃, 90 분) 를 실시한 후에, 얻어진 세포를 EGF 및 FGF 를 포함하는 배지에서 배양하고, 응집 세포로서 ENP 를 분리하는 방법 등이 알려져 있다. 분리 시에, 항 CD271 항체에 의한 셀 소팅을 조합하여, ENP 의 순도를 높이는 것도 가능하다.
〔제 1 실시형태 공정 (A2) : 장관 신경전구세포를 배양하는 공정〕
본 공정에서는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 ENP 가 배양된다.
ERBB3 아고니스트는, ERBB3 과 결합하여 그 하류의 시그널 경로를 활성화하는 능력 (ERBB3 아고니스트 활성) 을 갖는 물질이면 되고, 단백질, 펩티드, 핵산 및 저분자 화합물 그리고 이들의 유도체 등이어도 된다. ERBB3 아고니스트에는, 예를 들어, NRG1, NRG2 및 NRG6 등의 단백질이 있다. NRG1, NRG2 및 NRG6 등의 단백질은, 전장 단백질이어도 되고, ERBB3 아고니스트 활성을 갖는 그 단편이어도 된다.
ERBB4 아고니스트는, ERBB4 와 결합하여 그 하류의 시그널 경로를 활성화하는 능력 (ERBB4 아고니스트 활성) 을 갖는 물질이면 되고, 단백질, 펩티드, 핵산 및 저분자 화합물 그리고 이들의 유도체 등이어도 된다. ERBB4 아고니스트에는, 예를 들어, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRG5, BTC, EPR 및 HBEGF 등의 단백질이 있다. NRG1-5, BTC, EPR 및 HBEGF 등의 단백질은, 전장 단백질이어도 되고, ERBB4 아고니스트 활성을 갖는 그 단편이어도 된다.
NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRG5, NRG6, BTC, EPR 및 HBEGF 등의 단백질에는, 배양의 대상으로 하는 세포의 유래종에 맞춰, 인간 유래의 단백질, 혹은 예를 들어 원숭이, 돼지, 소, 염소, 양, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 포유 동물 유래의 단백질을 적절히 사용한다.
이들 단백질은, 통상적인 분자생물학적 수법을 이용하여 리콤비넌트 단백질로서 조제할 수 있고, 또 시판되는 시약으로서 입수할 수도 있다.
ERBB3 아고니스트 및 ERBB4 아고니스트는, NRG1 혹은 ERBB3 아고니스트 활성 또는 ERBB4 아고니스트 활성을 갖는 그 단편인 것이 바람직하다.
인간 NRG1 의 전장 아미노산 서열을 서열 번호 1 (NCBI Accession number : NP_039250) 에 나타낸다.
ERBB3 아고니스트 활성 또는 ERBB4 아고니스트 활성을 갖는 NRG1 의 단편으로는, 서열 번호 1 의 아미노산 서열로부터 발생하는, 예를 들어 아미노산수 10 ∼ 300, 20 ∼ 150, 혹은 30 ∼ 100 의 단편을 들 수 있다.
NRG1 의 단편은, 예를 들어, ERBB3 또는 ERBB4 에의 결합 도메인 (EGF-like domain) 을 포함하는 단편이어도 된다. 결합 도메인은, 서열 번호 1 중 아미노산 번호 190 ∼ 220 으로 되어 있다.
NRG1 및 그 단편은, 통상적인 분자생물학적 수법을 이용하여 리콤비넌트 단백질로서 조제할 수 있고, 또 시판되는 시약으로서 입수할 수도 있다. ERBB3 또는 ERBB4 에의 결합 도메인 (EGF-like domain) 을 포함하는 NRG1 단편이 상업적으로 입수 가능하다 (예를 들어, Recombinant Human Heregulinβ-1, Catalog Number : 100-03, PEPROTECH).
NRG1 또는 그 단편은, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열 또는 그 부분 서열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 개변 아미노산 서열로 이루어지고, ERBB3 아고니스트 활성 또는 ERBB4 아고니스트 활성을 갖는 것이어도 된다.
여기서, 몇 개란 20 개 이하, 바람직하게는 10 개 이하, 보다 바람직하게는 5 개 이하, 더욱 바람직하게는 3 개 이하, 가장 바람직하게는 2 개를 의미한다.
개변 아미노산 서열로는, 서열 번호 1 의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게는 98 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 될 수 있다. 아미노산 서열의 동일성은, 범용의 해석 툴에 의해 계산할 수 있고, 예를 들어 전미 바이오테크놀러지 정보 센터 (NCBI) 가 제공하는 BLAST 를 이용할 수 있다.
또, NRG1 또는 그 단편은, ERBB3 아고니스트 활성 또는 ERBB4 아고니스트 활성을 유지할 수 있는 한에 있어서, 다른 단백질과의 융합 단백질 혹은 다른 분자가 결합된 수식 단백질이어도 된다.
단백질 단편 등에 대한 ERBB3 아고니스트 활성 또는 ERBB4 아고니스트 활성의 평가는, 시판되는 키트를 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어 PathHunter (등록상표) ERBB2-ERBB3 Functional Assay 혹은 PathHunter (등록상표) ERBB4 Functional Assay (모두 DiscoverX 사) 를 사용하여, 키트에 포함된 세포주를 다양한 농도의 아고니스트 후보 물질 존재하에서 배양 후에 β-갈락토시다아제 활성을 측정한다. β-갈락토시다아제 활성이 높은 값을 나타낸 후보 물질은 아고니스트 활성을 갖는다.
본 공정에 있어서의 배지 중의 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트의 농도는, 첨가하는 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트의 종류에 따라 적절히 조정되지만, 예를 들어 1 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 200 ng/mL 로 할 수 있다.
ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트로서 NRG1 을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 예를 들어 1 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 200 ng/mL, 특히 바람직하게는 약 100 ng/mL 로 할 수 있다.
배지는, TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함하고 있어도 된다.
「TGFβ 저해제」란, TGFβ (트랜스포밍 증식 인자 β) 에 대한 저해 활성을 갖는 물질이다. TGFβ 는 2 종류의 세린/트레오닌 프로테인 키나아제형 수용체에 결합하는 사이토카인이며, Smad(R-Smad) 의 활성화를 주로 한 시그널 전달을 통하여 세포 증식, 세포 분화, 세포사 등을 제어한다. TGFβ 저해 활성을 갖는 물질로는, TGFβ 와 그 수용체의 결합을 저해하는 물질, 또는, TGFβ 가 수용체에 결합 후의 하류 시그널을 저해하는 물질을 들 수 있다. 당해 하류 시그널로는, TGFβII 형 수용체에 의한 TGFβI 형 수용체의 인산화, 인산화 TGFβI 형 수용체에 의한 Smad 의 인산화 등이 예시된다. 본 발명에서 사용되는 「TGFβ 저해제」는 TGFβ 저해 활성을 가지면 특별히 한정되지 않는다.
TGFβ 저해제로는, SB431542 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드), A83-01 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드), LDN193189 (4-[6-[4-(1-피페라지닐)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린), GW788388 (4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드), SM16 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-비시클로[2.2.2]옥탄-1-카르복사미드), IN-1130 (3-[[5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-(6-퀴녹살리닐)-1H-이미다졸-2-일]메틸]-벤즈아미드), GW6604 (2-페닐-4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리딘) 및 SB505124 (2-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-(1,1-디메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-6-메틸-피리딘) 등을 들 수 있다. 이들은, 2 이상을 조합하여 사용해도 된다.
본 공정에 있어서의 배지 중의 TGFβ 저해제의 농도는, 첨가하는 TGFβ 저해제의 종류에 따라 적절히 조정되지만, 예를 들어 0.1 ∼ 50 μM, 바람직하게는 1 ∼ 20 μM 로 할 수 있다.
TGFβ 저해제로서 SB431542 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드) 를 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 예를 들어 1 ∼ 100 μM, 바람직하게는 5 ∼ 20 μM, 특히 바람직하게는 약 10 μM 로 할 수 있다.
「GSK3β 저해제」란, GSK3β (글리코겐 신타아제 키나아제 3β) 에 대한 저해 활성을 갖는 물질이다. GSK3 (글리코겐 신타아제 키나아제 3) 은, 세린/트레오닌 프로테인 키나아제의 일종이며, 글리코겐의 산생이나 아포토시스, 간세포의 유지 등에 관련된 많은 시그널 경로에 관여한다. GSK3 에는 α 와 β 의 2 개의 아이소폼이 존재한다. 본 발명에서 사용되는 「GSK3β 저해제」는, GSK3β 저해 활성을 가지면 특별히 한정되지 않고, GSK3β 저해 활성과 아울러 GSK3α 저해 활성을 겸비하는 물질이어도 된다.
GSK3β 저해제로는, CHIR98014 (N6-[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(1H-이미다졸-1-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]-3-니트로-2,6-피리딘디아민), CHIR99021 (6-{2-[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노]에틸아미노}니코티노니트릴), CP21R7 (3-(3-아미노페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), LY2090314 (3-[9-플루오로-1,2,3,4-테트라히드로-2-(1-피페리디닐카르보닐)피롤로[3,2,1-jk][1,4]벤조디아제핀-7-일]-4-이미다조[1,2-a]피리딘-3-일-1h-피롤-2,5-디온), TDZD-8(4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), TWS-119 (3-[[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]옥시페놀 디트리플루오로아세테이트), 켄파울론 (Kenpaullone), 1-아자켄파울론 (Azakenpaullone), SB415286 (3-[(3-클로로-4-히드록시페닐)-아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온) 및 AR-AO144-18 (1-[(4-메톡시페닐)메틸]-3-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아), CT99021, CT20026, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), BIO-아세톡심, 피리도카르바졸-시클로펜타디에닐루테늄 복합체, OTDZT, 알파-4-디브로모아세토페논, 리튬 등을 들 수 있다. 이들은, 2 이상을 조합하여 사용해도 된다.
GSK3β 저해제는 이들로 한정되는 것이 아니고, GSK3β 의 mRNA 에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드나 siRNA, GSK3β 에 결합하는 항체, 도미넌트 네거티브 GSK3β 변이체 등도 GSK3β 저해제로서 사용할 수 있고, 이들은 상업적으로 입수 가능하거나 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다.
본 공정에 있어서의 배지 중의 GSK3β 저해제의 농도는, 첨가하는 GSK3β 저해제의 종류에 따라 적절히 조정되지만, 예를 들어 0.1 ∼ 10 μM, 바람직하게는 0.5 ∼ 2 μM 로 할 수 있다.
GSK3β 저해제로서 CHIR99021 을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 예를 들어 0.1 ∼ 10 μM, 바람직하게는 0.5 ∼ 2 μM, 특히 바람직하게는 약 1 μM 로 할 수 있다.
본 공정에 있어서의 배지는, 추가로 레티노산 (RA) 및/또는 그 유도체 (이하, 간단히 「RA 등」으로도 칭한다), 글리아세포 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 및 마트리겔 중 어느 하나 이상을 포함하고 있어도 된다.
레티노산 (RA) 의 유도체로는, 레티놀, 레티날, 레티노인, 이소레티노인, 알리트레티노인, 에트레티네이트, 아시트레틴, 타자로텐, 벡사로텐, 아다팔렌이 사용될 수 있다. 이들은, 2 이상을 조합하여 사용해도 된다.
본 공정에 있어서의 배지 중의 RA 등의 농도는, 첨가하는 RA 등의 종류에 따라 적절히 조정되지만, 예를 들어 0.001 ∼ 50 μM, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM 로 할 수 있다.
RA 등으로서 RA 를 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 예를 들어 0.001 ∼ 50 μM, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM, 특히 바람직하게는 약 1 μM 로 할 수 있다.
본 공정에 있어서의 배지 중의 GDNF 의 농도는, 예를 들어 1 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 200 ng/mL 로 할 수 있다.
본 공정에 있어서의 배지 중의 마트리겔의 농도는, 예를 들어 0.2 ∼ 20 ％(v/v), 바람직하게는 1-4 ％(v/v), 특히 바람직하게는 약 2 ％(v/v) 이다.
기초 배지는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 StemFit AK03 (아지노모토 헬시 서플라이) 의 A 액 및 B 액을 혼합한 것, TeSR1 배지 그리고 Chemically Defined Medium (CDM) 배지가 바람직하게 사용된다. 이 외, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM (IMEM) 배지, Improved MDM (IMDM) 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지 (High glucose, Low glucose), DMEM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등도 사용될 수 있다.
CDM 배지로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, Iscove's modified Dulbecco's medium (GE 헬스케어사 제조) 으로부터 조제되는 배지가 사용될 수 있다.
기초 배지에는, 아포트랜스페린, 모노티오글리세롤, 소 혈청 알부민 (BSA), 인슐린 및/또는 항생 물질 등의 통상적인 세포 배양에 사용되는 물질이 첨가될 수 있다.
ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하고, 바람직하게는 추가로 TGFβ 저해제, GSK3β 저해제, RA 등, GDNF 및 마트리겔 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지 중에서 ENP 를 배양함으로써, ENP 를 다능성 (multipotency) 을 유지한 채 배양하고, 증식시킬 수 있다.
본 공정의 배양 기간은, ENP 가 증식하여 목적의 세포수에 도달하는 기간이면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 7 일간 이상, 10 일간 이상, 14 일간 이상, 20 일간 이상, 25 일간 이상, 30 일간 이상, 40 일간 이상, 50 일간 이상, 60 일간 이상, 70 일간 이상, 80 일간 이상, 90 일간 이상, 7 ∼ 100 일간, 100 일간 이상으로 할 수 있다.
이 동안의 세포의 증식 속도는, 세포 배가 시간으로 약 75 시간이라는 매우 높은 속도가 달성된다.
본 공정은, 접착 배양에 의한 것이 바람직하지만, 부유 배양에 의해서도 된다.
접착 배양에는, 디시, 플라스크, 마이크로 플레이트, 및 OptiCell (제품명, Nunc) 등의 세포 배양 시트 등의 배양 용기가 사용된다.
접착 배양에 사용하는 용기는, 세포와의 접착성 (친수성) 을 향상시키기 위한 표면 처리나, 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴, 마트리겔, 비트로넥틴 등의 세포 접착용 기질로 코팅되어 있어도 되지만, 이들 표면 처리나 코팅이 되어 있지 않은 용기를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
부유 배양에서는, 배지 중에 세포를 분산시키고, 교반 또는 진탕에 의해 배지 성분 및 배지 내 산소 농도를 균일화하면서 세포 응집 덩어리를 형성시킨다. 바람직한 교반 속도는, 세포 밀도와 배양 용기의 크기에 따라 적절히 설정되지만, 과도한 교반 또는 진탕은 세포에 대해 물리적 스트레스를 주어, 세포 응집 덩어리 형성을 저해한다. 따라서, 배지 성분 및 배지 내 산소 농도를 균일화할 수 있고, 또한, 세포 응집 덩어리 형성을 저해하지 않도록 교반 또는 진탕 속도를 제어한다. 교반 또는 진탕하지 않고, 정치하여 부유 배양을 실시할 수도 있다.
부유 배양에는, Prime surface (제품명, 스미토모 베이클라이트 주식회사) 등의 저접착 코트의 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ (예를 들어, 37 ℃) 에서 실시할 수 있다. 또, 배양 용기 중의 이산화탄소 농도는 예를 들어 5 ％ 정도로 할 수 있다.
[제 2 실시형태에 관련된 제조 방법 (NCC 의 ENP 로의 분화와 ENP 의 증식을 수반하는 방법)]
〔제 2 실시형태 공정 (B1) : 신경제세포를 제공하는 공정〕
본 공정에서는, NCC 가 제공된다. 본 공정에는 적어도 NCC 가 제공되면 되고, 단일의 NCC 세포, NCC 의 세포 집단 또는 NCC 를 포함하는 세포 집단이 제공되어도 된다.
본 공정에서 제공되는 NCC 는, 상업적으로 입수된 NCC 여도 되고, 생체로부터 분리된 NCC 여도 되고, 또한 간세포 (stem cell) 등으로부터 분화시킨 NCC 여도 된다. 상업적으로 입수되는 NCC 는, 배양 상태에 있는 NCC 여도 되고, 동결 상태에 있는 NCC 여도 된다. 또, NCC 가 간세포 등으로부터 분화된 NCC 인 경우도, NCC 는, 배양 상태에 있는 NCC 여도 되고, 동결 상태에 있는 NCC 여도 된다.
시판되는 NCC 로는, 예를 들어, 인간 모포 외모근초세포 (코스모·바이오사 제조), O9-1 Mouse Cranial Neural Crest Cell Line (머크 밀리포어사 제조) 등을 들 수 있다.
또, NCC 는, 수정 후 30 일 전후의 인간 배 (胚) 의 신경관, 태생 9 일째 전후의 마우스 배의 신경관, 인간, 돼지 및 설치류의 성체의 피부 등에 존재하고 있는 것이 보고되어 있다 (Betters et al., Developmental biology, 2010, 344(2) : 578-592, Jiang et al., Development, 2000, 127(8) : 1607-1616, Dupin et al., Developmental biology, 2012, 366(1) : 83-95, Nagoshi et al., Cell Stem Cell 2, April 2008, 392-403). NCC 를 공지된 방법 (예를 들어, Motohashi et al., Biology open, 2016, 5 : 311-322, Pfaltzgraffet al., Journal of Visualized Experiments, 2012, 64 : 4134) 을 이용하여 채취하고, 본 공정에 제공하는 것도 가능하다.
NCC 로의 분화에 사용되는 간세포는, 예를 들어, 다능성 간세포 (pluripotent stem cell) 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서 사용 가능한 「다능성 간세포 (pluripotent stem cell)」란, 생체의 여러 가지 상이한 형태나 기능을 가지는 조직이나 세포로 분화할 수 있고, 3 배엽 (내배엽, 중배엽, 외배엽) 의 어느 계통의 세포로도 분화할 수 있는 능력을 갖는 간세포를 가리킨다. 그것에는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 배성 간세포 (ESC), 핵이식에 의해 얻어지는 클론배 유래의 배성 간세포, 정자 간세포, 배성 생식세포, 인공 다능성 간세포 (본 명세서 중, 「iPSC」로 칭하는 경우도 있다) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서 사용 가능한 「다능성 간세포 (multipotent stem cell)」란, 복수의 한정적인 수의 계통의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 간세포를 가리킨다. 본 발명에 있어서 사용 가능한 「다능성 간세포 (multipotent stem cell)」로는, 예를 들어, 치수 간세포, 구강 점막 유래 간세포, 모포 간세포, 배양 선유아세포나 골수 간세포 유래의 체성 간세포 등을 들 수 있다. 바람직한 다능성 간세포 (pluripotent stem cell) 는, ESC 및 iPSC 이다.
「ESC」로는, 마우스 ESC 이면, inGenious targeting laboratory 사, 이연 (이화학 연구소) 등이 수립한 각종 마우스 ESC 주 (株) 가 이용 가능하고, 인간 ESC 이면, 위스콘신 대학, NIH, 이화학 연구소, 쿄토 대학, 국립 성육 의료 연구 센터 및 Cellartis 사 등이 수립한 각종 인간 ESC 주가 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 ESC 주로는, ESI Bio 사가 분양하는 CHB-1 ∼ CHB-12 주, RUES1 주, RUES2 주, HUES1 ∼ HUES28 주 등, WiCell Research 가 분양하는 H1 주, H9 주 등, 이화학 연구소가 분양하는 KhES-1 주, KhES-2 주, KhES-3 주, KhES-4 주, KhES-5 주, SSES1 주, SSES2 주, SSES3 주 등을 이용할 수 있다.
「인공 다능성 간세포」란, 포유 동물 체세포 또는 미분화 간세포에, 특정 인자 (핵 초기화 인자) 를 도입하여 재프로그래밍함으로써 얻어지는 세포를 가리킨다. 현재, 「인공 다능성 간세포」에는 다양한 것이 있고, 야마나카 등에 의해, 마우스 선유아세포에 Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc 의 4 인자를 도입함으로써, 수립된 iPSC (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126 : 663-676) 외, 동일한 4 인자를 인간 선유아세포에 도입하여 수립된 인간 세포 유래의 iPSC (Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131 : 861-872.), 상기 4 인자 도입 후, Nanog 의 발현을 지표로 하여 선별하고, 수립한 Nanog-iPSC (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), c-Myc 를 포함하지 않는 방법으로 제작된 iPSC (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106), 바이러스 프리법으로 6 인자를 도입하여 수립된 iPSC (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May ; 8(5) : 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3) : 458-66.) 등도 사용할 수 있다. 또, Thomson 등에 의해 제조된 OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28 의 4 인자를 도입하여 수립된 인공 다능성 간세포 (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318 : 1917-1920.), Daley 등에 의해 제조된 인공 다능성 간세포 (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451 : 141-146), 사쿠라다 등에 의해 제조된 인공 다능성 간세포 (일본 공개특허공보 2008-307007호) 등도 사용할 수 있다.
이 외, 공개되어 있는 모든 논문 (예를 들어, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5, 568-574 ; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650 ; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797), 혹은 특허 (예를 들어, 일본 공개특허공보 2008-307007호, 일본 공개특허공보 2008-283972호, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007-069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009-006930, WO2009-006997, WO2009-007852) 에 기재되어 있는 당해 분야에서 공지된 인공 다능성 간세포의 어느 것이나 사용할 수 있다.
인공 다능성 간세포주로는, NIH, 이화학 연구소, 쿄토 대학 등이 수립한 각종 iPSC 주가 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 iPSC 주이면, 이화학 연구소의 HiPS-RIKEN-1A 주, HiPS-RIKEN-2A 주, HiPS-RIKEN-12A 주, Nips-B2 주 등, 쿄토 대학의 253G1 주, 201B7 주, 409B2 주, 454E2 주, 606A1 주, 610B1 주, 648A1 주, 1231A1 주, 1231A3 주 등을 들 수 있고, 1231A1 주, 1231A3 주가 바람직하고, 1231A3 주가 보다 바람직하다.
간세포로부터 NCC 로의 분화는, 문헌 공지 (예를 들어, 비특허문헌 2) 의 방법에 따라 실시할 수 있다. 인간 iPSC 로부터 NCC 로 분화시키는 경우의 공정의 일례를 도 1 에 나타낸다. 먼저, iPSC 를 디시 등에 파종하여 접착 배양한 후, TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함하는 배지에서 접착 배양하고 (도 1, 공정 i), 그 후 RA 및/또는 그 유도체를 추가로 첨가한 배지에서 접착 배양함으로써 NCC 로 분화시킨다 (공정 ii).
본 공정에 있어서의 배지 중의 TGFβ 저해제의 농도는, 첨가하는 TGFβ 저해제의 종류에 따라 적절히 조정되지만, 예를 들어 0.1 ∼ 50 μM, 바람직하게는 1 ∼ 20 μM 로 할 수 있다.
TGFβ 저해제로서 SB431542 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드) 를 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 예를 들어 1 ∼ 100 μM, 바람직하게는 5 ∼ 20 μM, 특히 바람직하게는 약 10 μM 로 할 수 있다.
본 공정에 있어서의 배지 중의 GSK3β 저해제의 농도는, 첨가하는 GSK3β 저해제의 종류에 따라 적절히 조정되지만, 예를 들어 0.1 ∼ 10 μM, 바람직하게는 0.5 ∼ 2 μM 이다.
GSK3β 저해제로서 CHIR99021 을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 예를 들어 0.1 ∼ 10 μM, 바람직하게는 0.5 ∼ 2 μM, 특히 바람직하게는 약 1 μM 로 할 수 있다.
간세포는, 공정 ii 에 있어서의 RA 등의 배지 중의 농도에 따라, 두부 신경제세포 (Cranial NCC), 미주 신경제세포 (Vagal NCC), 체간 신경제세포 (Trunk NCC), 선골 신경제세포 (Sacral NCC) 중 어느 것으로 분화시킬 수 있다.
예를 들어, 인간 iPSC 로부터 두부 신경제세포로 분화시키는 경우, RA 등은 첨가되지 않는다.
인간 iPSC 로부터 미주 신경제세포 혹은 체간 신경제세포로 분화시키는 경우의 RA 등의 배지 중의 농도는, 예를 들어 0.001 ∼ 50 μM, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM 이다.
단, RA 등의 배지 중의 농도는, 첨가하는 RA 등의 종류에 따라 적절히 조정되는 것이다.
후단의 공정 (B2) 에 있어서 장관 신경세포 및 글리아세포로의 높은 분화능을 갖는 ENP 를 얻기 위해, 미주 신경제세포 (Vagal NCC) 로 분화시키는 것이 바람직하다.
TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함하는 배지에서의 배양 기간 (도 1, 공정 i) 은, 예를 들어 0 ∼ 12 일간으로 할 수 있고, 특히로는 약 6 일간으로 할 수 있다.
RA 등을 추가로 첨가한 배지에서의 배양 기간 (공정 ii) 은, 예를 들어 1 ∼ 12 일간으로 할 수 있고, 특히로는 약 5 일간으로 할 수 있다.
기초 배지에는 상기 서술한 것을 사용할 수 있다.
접착 배양에는, 상기 서술한 배양 용기를 사용할 수 있다.
배양 용기는, 세포와의 접착성 (친수성) 을 향상시키기 위한 표면 처리나, 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴, 마트리겔, 비트로넥틴 등의 세포 접착용 기질로 코팅되어 있는 것이 바람직하다.
배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ (예를 들어, 37 ℃) 에서 실시한다. 또, 배양 용기 중의 이산화탄소 농도는 예를 들어 약 5 ％ 이다.
〔제 2 실시형태 공정 (B2) : 신경제세포를 배양하는 공정〕
본 공정에서는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트, 그리고 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는 배지 중에서 NCC 가 배양된다 (도 1, 공정 iii). 여기서 사용되는 NCC 는, 바람직하게는 미주 신경제세포 (Vagal NCC) 이다.
사용하는 ERBB3 아고니스트, ERBB4 아고니스트 및 RA 등, 그리고 그들의 배지 중의 농도는, 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
배지는, 추가로 TGFβ 저해제 및/또는 GSK3β 저해제를 포함하고 있어도 된다.
사용하는 TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제, 그리고 그들의 배지 중의 농도는, 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
배지는, 추가로 GDNF 및 마트리겔 중 어느 하나 이상을 포함하고 있어도 된다.
GDNF 및 마트리겔의 배지 중의 농도, 그리고 사용하는 기초 배지도, 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
본 공정은, 공정 (A2) 와 동일하게 접착 배양에 의한 것이 바람직하지만, 부유 배양에 의해서도 된다.
ERBB3 아고니스트 및 ERBB4 아고니스트 및 RA 등을 포함하고, 바람직하게는 추가로 TGFβ 저해제, GSK3β 저해제, GDNF 및 마트리겔 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지 중에서 ENP 를 배양함으로써, ENP 를 다능성 (multipotency) 을 유지한 채 증식시킬 수 있다.
본 공정의 배양 기간은, ENP 가 증식하여 목적의 세포수에 도달하는 기간이면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 7 일간 이상, 10 일간 이상, 14 일간 이상, 20 일간 이상, 25 일간 이상, 30 일간 이상, 40 일간 이상, 50 일간 이상, 60 일간 이상, 70 일간 이상, 80 일간 이상, 90 일간 이상, 7 ∼ 100 일간, 100 일간 이상으로 할 수 있다.
이 동안의 세포의 증식 속도는, 세포 배가 시간으로 약 75 시간이라는 높은 속도가 달성된다.
[제 3 실시형태에 관련된 확대 배양 방법]
〔제 3 실시형태 공정 (C1) : 장관 신경전구세포를 제공하는 공정〕
본 공정에서는, ENP 가 제공된다.
본 공정에서 제공되는 ENP 는, 공정 (A1) 과 동일해도 된다.
〔제 3 실시형태 공정 (C2) : 장관 신경전구세포를 배양하는 공정〕
본 공정에서는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 ENP 가 배양된다.
사용하는 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트, 그리고 그들의 배지 중의 농도는, 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
배지는, 추가로 TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함하고 있어도 된다.
사용하는 TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제, 그리고 그들의 배지 중의 농도는, 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
배지는, 추가로 RA 등, 글리아세포 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 및 마트리겔 중 어느 하나 이상을 포함하고 있어도 된다.
사용하는 RA 등, 및 그들의 첨가 농도는, 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
GDNF 및 마트리겔의 배지 중의 농도, 그리고 사용되는 기초 배지도, 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
본 공정은, 공정 (A2) 와 동일하게 접착 배양에 의한 것이 바람직하지만, 부유 배양에 의해서도 된다.
ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트 그리고 RA 등을 포함하고, 바람직하게는 추가로 TGFβ 저해제, GSK3β 저해제, GDNF 및 마트리겔 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지 중에서 ENP 를 배양함으로써, ENP 를 다능성 (multipotency) 을 유지한 채 배양하고, 증식시킬 수 있다.
본 공정의 배양 기간은, ENP 가 증식하여 목적의 세포수에 도달하는 기간이면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 7 일간 이상, 10 일간 이상, 14 일간 이상, 20 일간 이상, 25 일간 이상, 30 일간 이상, 40 일간 이상, 50 일간 이상, 60 일간 이상, 70 일간 이상, 80 일간 이상, 90 일간 이상, 7 ∼ 100 일간, 100 일간 이상으로 할 수 있다.
이 동안의 세포의 증식 속도는, 세포 배가 시간으로 약 75 시간이라는 높은 속도가 달성된다.
[장관 신경전구세포 배지]
본 발명은, 상기 서술한 ENP 의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에서 사용되는 ENP 배지도 제공한다. 배지의 바람직한 조성은 상기 서술한 바와 같다. ENP 의 제조란, iPSC, ESC 및 NCC 등의 간세포로부터 ENP 로 분화시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 장관 신경전구세포 배지는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 장관 신경전구세포 배지는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트에 추가하여, TGFβ 저해제 및/또는 GSK3β 저해제를 포함하고 있어도 되고, TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 장관 신경전구세포 배지는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트에 추가하여, GDNF 를 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 장관 신경전구세포 배지는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트에 추가하여, 마트리겔을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 장관 신경전구세포 배지는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트에 추가하여, GDNF 및 마트리겔을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 장관 신경전구세포 배지는, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트에 추가하여, TGFβ 저해제, GSK3β 저해제, GDNF 및 마트리겔을 포함하고 있어도 된다. 이들 장관 신경전구세포 배지는 추가로 RA 등을 포함하고 있어도 된다. 장관 신경전구세포 배지 중의 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트, TGFβ 저해제, GSK3β 저해제, GDNF, 마트리겔 및 RA 등의 농도는 각각 공정 (A2) 와 동일해도 된다.
다른 일측면에 있어서, 본 발명은, ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 ENP 배지 첨가제, 및 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트의 ENP 확대 배양을 위한 사용도 제공한다.
[장관 신경전구세포]
본 발명에 관련된 ENP 의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의하면, 장관 신경세포 및 글리아세포로의 분화능 (다능성 (multipotency)) 을 유지한 ENP 를 대량으로 얻을 수 있다.
「다능성 (multipotency) 을 유지한 ENP」인 것은, 복수의 방법에 의해 평가할 수 있다. 그 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 평가 대상인 ENP 를 장관 신경세포 및 글리아세포로 분화시키는 방법을 들 수 있다. 평가 대상인 ENP 가 실제로 장관 신경세포 및 글리아세포로 분화 가능하면, 평가 대상인 ENP 는 「다능성 (multipotency) 을 유지한 ENP」라고 판단할 수 있다.
다른 방법으로는, 예를 들어, 마커 단백질이나 유전자의 발현을 측정하는 방법을 들 수 있다. 평가 대상인 ENP 에 있어서, 전사 인자인 SOX10 및 PHOX2B 가 발현하고 있으면, 평가 대상인 ENP 는 「다능성 (multipotency) 을 유지한 ENP」라고 판단할 수 있다.
SOX10 및 PHOX2B 의 검출은, 당해 마커 단백질에 특이적인 항체를 사용한 면역학적 어세이, 예를 들어, ELISA, 면역 염색, 플로 사이토메트리 등을 이용하여 실시할 수 있다. 마커 유전자의 검출은, 당해 분야에서 공지된 핵산 증폭 방법 및/또는 핵산 검출 방법, 예를 들어, RT-PCR, 마이크로 어레이, 바이오 칩 등을 이용하여 실시할 수 있다. 또, SOX10 및 PHOX2B 유전자의 하류에 리포터 단백질 (예를 들어, Nano-Lantern (Saito K. et al., "Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging." Nat. Commun., 2012 ; 3 : 1262.)) 을 코드하는 염기 서열이 삽입된 세포이고, SOX10 등의 프로모터의 제어하에서 리포터 단백질 혹은 이것과 SOX10 등의 융합 단백을 발현하는 세포이면, 그 리포터 단백질을 검출하는 (예를 들어, 형광 강도를 측정한다) 방법도 이용할 수 있다.
[세포 의약·동결 스톡]
본 발명에 관련된 제조 방법 또는 확대 배양 방법으로 얻어지는 ENP 는, 장관 신경세포의 결손 또는 이상에서 기인하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포 의약으로서 적용될 수 있다. 이와 같은 질환으로는 예를 들어, 히르쉬스프룽 (Hirschsprung) 병, 식도 아칼라시아, 위 운동 기능 부전, 선천성 비후성 유문 협착증, 만성 특발성 위성 장폐색증, 신경인성 변비 혹은 샤가스병 등을 들 수 있다.
세포 의약이 함유하는 ENP 는, 예를 들어 배양 중의 세포를 박리하여 회수된 세포여도 되고, 동결 보존액 중에 동결된 세포여도 된다. 확대 배양하여 얻어지는 동일 로트의 세포를 소분하여 동결 보존한 것을 사용하면, 안정적으로 동일한 작용 효과가 얻어지는 점, 취급성이 우수한 점 등에 있어서 바람직하다.
세포 의약은, 용도나 형태에 따라, 통상적인 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체나 첨가물 등의 기타 성분을 함유시켜도 된다. 담체나 첨가물로는, 예를 들어, 등장화제, 증점제, 당류, 당알코올류, 방부제 (보존제), 살균제 또는 항균제, pH 조절제, 안정화제, 킬레이트제, 유성 기제, 겔 기제, 계면 활성제, 현탁화제, 유동화제, 분산제, 완충제, 항산화제 등을 들 수 있다.
세포 의약에 의해, 그 세포 의약의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 치료 방법이 제공된다.
치료 유효량이란, ENP 를 환자에게 투여한 경우에, 투여하고 있지 않은 대조와 비교하여 상기 질환에 대해 치료 효과를 얻을 수 있는 ENP 의 양이다. 구체적인 치료 유효량으로는, ENP 의 투여 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 환자의 연령, 체중, 증상 등에 따라 적절히 설정될 수 있다. 인간 (예를 들어 성인) 의 1 회의 치료당의 유효량은, 예를 들어 200,000 ∼ 1,00,000,000 개/kg체중이다. 이들 세포는 단일 세포의 상태로 분산되어 있어도 되고, 복수의 세포가 모인 세포 덩어리 (sphere) 로 되어 있어도 되고, 이들이 혼합된 것이어도 된다.
세포 의약의 투여 방법으로는, 예를 들어, 복강내 주사, 피하 주사, 림프절내 주사, 정맥내 주사, 흉강내 주사, 개복에 의한 소화기관의 국소 (예를 들어, 식도, 위, 십이지장, 소장, 공장, 회장, 결장, 직장) 에의 직접 주사, 그리고 직장강내 투여 등을 들 수 있다.
본 발명은, 상기 서술한 제조 방법 또는 확대 배양 방법으로 얻어지는, ENP 를 포함하는 동결 스톡도 제공한다.
동결 스톡은, 얻어진 ENP 를 원심 분리에 의해 배지로부터 분리하고, 동결 보존액 중에 현탁하여 동결함으로써 제조할 수 있다. 동결 보존액에는, 종래 세포의 동결 보존에 사용되고 있는 시약을 사용하면 된다. 예를 들어, Cryostem Freezing Medium (상품명) 및 Stemcell Banker GMP Grade (닛폰 전약 공업 주식회사) 등이 시판되고 있다.
동결 스톡은, ENP 를 분화시켜 장관 신경세포 및 글리아세포를 얻기 위한 출발 재료로서 이용될 수 있다. 또, 동결 스톡은, ENP 를 구성 요소로 하는 조직 모델의 제조를 위해서 이용될 수 있다.
[장관 신경전구세포의 장관 신경세포 또는 글리아세포로의 유도]
얻어진 ENP 및 이것을 문헌 공지된 수법에 의해 분화시켜 얻어지는 신경세포 및 글리아세포는, 재생 의료용의 세포 제제로서 유용할 수 있고, 또 각종 스크리닝계의 구축에도 바람직하게 이용될 수 있다.
ENP 의 장관 신경세포로의 유도는, 예를 들어 비특허문헌 2 를 참조할 수 있다. 또, ENP 의 글리아세포로의 유도에는, 종래 공지된 수법 (예를 들어 "A novel bidirectional interaction between endothelin-3 and retinoic acid in rat enteric nervous system precursors", Gisser, J. M. et al., PLosOne 2013) 을 적용할 수 있다.
[장관 오르가노이드·인공 장관의 제조 방법]
본 발명에 관련된 장관 오르가노이드의 제조 방법은, ENP 와 후장세포를 공배양하는 공정을 포함한다.
ENP 는, 상기 서술한 ENP 의 제조 방법 또는 확대 배양 방법에 의해 얻어진 것으로 할 수 있다.
후장세포는, 종래 공지된 수법에 따라 간세포로부터 분화시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 인공 다능성 간세포를 Activin A, BMP4 및 bFGF 를 포함하는 배지에서 배양하고, 배체내 배엽을 얻어, 배체내 배엽을 FGF4 및 GSK3β 저해제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 후장세포를 얻는 수법이 있다.
배체내 배엽 유도 시 및 후장세포 유도 시의 기초 배지에도 상기 서술한 기초 배지를 사용할 수 있다.
배체내 배엽 유도 시의 Activin A 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 10 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 500 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL 로 할 수 있다. 또, BMP4 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 1 ∼ 100 ng/mL, 바람직하게는 5 ∼ 50 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 10 ng/mL 로 할 수 있다. bFGF 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 1 ∼ 200 ng/mL, 바람직하게는 5 ∼ 100 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 20 ng/mL 로 할 수 있다. 배양 기간은, 예를 들어 1 ∼ 10 일, 바람직하게는 2 ∼ 6 일, 보다 바람직하게는 약 4 일로 될 수 있다.
후장세포 유도 시의 FGF4 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 10 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 500 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL 로 할 수 있다. GSK3β 저해제의 배지 중의 농도는, 예를 들어 CHIR99021 을 사용하는 경우, 예를 들어 1 ∼ 30 μM, 바람직하게는 4 ∼ 10 μM, 보다 바람직하게는 약 6 μM 로 할 수 있다. 배양 기간은, 예를 들어 4 ∼ 12 일, 바람직하게는 6 ∼ 10 일, 보다 바람직하게는 약 8 일로 될 수 있다.
ENP 와 후장세포의 공배양에는, 종래 공지된 NCC 와 후장세포의 공배양에 의한 장관 오르가노이드의 제조 수법을 적절히 개변 후 적용할 수 있다.
예를 들어, 마트리겔 용액에 현탁한 후장세포와 ENP 를 플레이트에 파종하여 겔화시키고, R-Spondin-1, Noggin, Wnt3a, EGF, 프로스타글란딘-E2 (Prostaglandin-E2) 및 ROCK 저해제를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하는 수법이 있다. 공배양에 의해 얻어진 장관 오르가노이드는, 필요에 따라, 마트리겔 용액에 재현탁한 후에 동일한 수법을 재적용함으로써 성숙화시킬 수도 있다.
또, 예를 들어, 마트리겔 용액에 현탁한 후장세포를 플레이트에 파종하여 겔화시키고, R-Spondin-1, Noggin, Wnt3a, EGF, 프로스타글란딘-E2 및 ROCK 저해제를 포함하는 배지를 첨가하여 배양을 실시해 장관 오르가노이드를 얻은 후, 장관 오르가노이드를 일단 분산시켜 ENP 의 세포 현탁액과 혼합하고, 혼합액을 원심 분리하여 얻어지는 세포 펠릿을 R-Spondin-1, Noggin, Wnt3a, EGF, 프로스타글란딘-E2 및 ROCK 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 수법도 있다. 이 경우도, 공배양에 의해 얻어진 장관 오르가노이드는, 필요에 따라 성숙화되어도 된다.
ENP 와 후장세포의 공배양 시의 기초 배지에도 상기 서술한 기초 배지를 사용할 수 있다.
R-Spondin-1 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 100 ∼ 10,000 ng/mL, 바람직하게는 500 ∼ 5000 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 1000 ng/mL 로 할 수 있다.
Noggin 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 10 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 500 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL 로 할 수 있다.
Wnt3a 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 10 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 500 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL 로 할 수 있다.
EGF 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 10 ∼ 1000 ng/mL, 바람직하게는 50 ∼ 500 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL 로 할 수 있다.
프로스타글란딘-E2 의 배지 중의 농도는, 예를 들어 0.5 ∼ 10 μM, 바람직하게는 1 ∼ 5 μM, 보다 바람직하게는 약 2.5 μM 로 할 수 있다.
ROCK 저해제는, 예를 들어 Y27632 를 사용하는 경우, 1 ∼ 100 μM, 바람직하게는 5 ∼ 50 μM, 보다 바람직하게는 약 10 μM 로 할 수 있다.
배양 기간은, 예를 들어 15 ∼ 40 일, 바람직하게는 20 ∼ 30 일, 보다 바람직하게는 24 ∼ 25 일로 될 수 있다.
본 발명에 관련된 인공 장관의 제조 방법은, 상기에서 얻어진 장관 오르가노이드를 생체내에 이식하여 인공 장관을 형성시키는 공정을 포함한다.
생체내에의 이식은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 장관 오르가노이드의 분산액을 원심 분리하여 얻은 세포 펠릿을 적당한 족장 재료 (스캐폴드) 에 접착시키고, 장관막 지방 상에 유치 (留置) 함으로써 실시할 수 있다. 족장 재료에는, 각종 시판되는 것을 이용할 수 있고, 예를 들어 네오베일 시트 (군제) 나 poly-L-lactide (DURECT) 를 사용할 수 있다.
이식처의 동물로는, 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지, 소, 말 및 원숭이 등의 비인간 포유 동물 혹은 인간 동물이어도 되고, 바람직하게는 비인간 포유 동물이 선택된다. 또, 면역 부전인 동물이 바람직하게 이용될 수 있다.
이식 후의 장관 오르가노이드는, 생체내에서 분화하고, 성숙하여, 인공 장관을 형성한다. 분화 및 성숙을 위해서 필요한 기간은, 이식하는 세포수나 사용하는 족장 재료, 이식처의 동물 및 부위에 따라 상이할 수 있지만, 예를 들어 5 주 이상, 바람직하게는 10 주 이상, 보다 바람직하게는 약 13-20 주이다.
얻어지는 인공 장관은, ENP 에서 유래하는 신경세포 및 글리아세포를 포함하고, 전기 자극에 응답하여 수축 이완 반응을 나타낼 수 있다.
또, 당해 신경세포는, 인공 장관 내에서 아세틸콜린 및 아드레날린을 산생하여 근육을 수축시키고, 또 일산화질소를 산생하여 근육을 이완시키거나, 전기 자극에 응답하여 근육을 이완시키거나 하는 기능을 가지고 있다.
실시예
[시험예 1 : 인간 iPSC 의 유지 배양]
인간 iPSC 에는, 1231A3 주 (Scientific Reports, 2014, 4, 3594 참조) 를 사용했다.
iPSC 의 유지 배양은, iMatrix 511 Silk (주식회사 닙피) 를 코트한 플레이트를 사용하여, 피더세포를 사용하지 않고 실시했다. 배양은, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 실시했다. 유지 배양 시의 배지에는, StemFit AK03N (아지노모토 헬시 서플라이 주식회사) 의 A 액, B 액 및 C 액을 혼합한 것을 사용했다.
배지 교환은 매일 실시하고, 계대는 6 ∼ 7 일마다 실시했다. 계대는, 0.5 mM EDTA 를 첨가한 인산 완충액 (이하 「PBS」로 기재한다) 으로 2 배 희석한 TrypLE Select CTS (Life Technologies) 를 사용하여 iPSC 를 싱글 셀화하여 플레이트로부터 박리시킨 후, 박리시킨 iPSC 를 iMatrix 511 Silk 로 코트한 새로운 플레이트 상에 파종함으로써 실시했다. 파종 시의 배지에는, 10 μM 의 Y27632 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 첨가한 StemFit AK03N 의 A 액, B 액 및 C 액을 혼합한 것을 사용했다.
[시험예 2 : SOX10::tdTomato-PHOX2B::emGFP 리포터 인간 iPSC 주의 수립]
싱글 셀화한 상기 인간 iPSC 에, Neon Transfection system (Life Technologies) 을 사용하여 SpCas9 D10A 닉카아제 (nickase) 발현 플라스미드, SOX10 sgRNA 발현 플라스미드, SOX10-F2A-tdTomato 도너 플라스미드, 퓨로마이신 (puromycin) 내성 유전자 발현 플라스미드 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 공도입했다.
얻어진 세포를 퓨로마이신 처리에 의한 약제 선발 후에 콜로니 픽업하고, 확대 배양했다. 얻어진 콜로니 중, PCR 에 의해 목적 서열의 삽입이 확인된 것을 SOX10::tdTomato 주로 했다.
또한, 싱글 셀화한 인간 iPSC (SOX10::tdTomato 주) 에, Neon Transfection system (Life Technologies 사) 을 사용하여 SpCas9 D10A 닉카아제 단백, PHOX2B gRNA (IDT), PHOX2B-F2A-emGFP 도너 플라스미드, 퓨로마이신 내성 유전자 발현 플라스미드 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 공도입했다.
얻어진 세포는 퓨로마이신 처리에 의한 약제 선발 후에 콜로니 픽업하고, 확대 배양했다. 얻어진 콜로니 중, PCR 에 의해 목적 서열의 삽입이 확인된 것을 SOX10::tdTomato-PHOX2B::emGFP 주로 했다.
[시험예 3 : 인간 iPSC 로부터 미주 신경제세포로의 분화]
(1) iPSC 의 전배양
시험예 1 에 기재된 방법으로 유지 배양한 인간 iPSC (SOX10::tdTomato-PHOX2B::emGFP 주) 를, iMatrix 511 Silk 를 코트한 6 웰 플레이트 혹은 10 cm 디시에 각각 2 ∼ 4 × 104 혹은 2.4 ∼ 4.9 × 105 개/웰 또는 디시의 밀도로 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 3 ∼ 4 일간 배양 (전배양) 했다. 파종 시의 배양액에는, 10 μM 의 Y27632 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 첨가한 StemFit AK03N 의 A 액, B 액 및 C 액을 혼합한 것을 사용했다.
(2) iPSC 로부터 미주 신경제세포로의 분화
전배양 후, 배지를, 10 μM SB431542 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 및 1 μM CHIR99021 (Axon MedChem) 을 포함하는 배지로 교환하고 (배양 0 일째), 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양했다. 그 후, 추가로 1 μM 레티노산 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 을 포함하는 배지로 교환하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 5 일간 배양했다 (합계 11 일간). 여기서, 상기 배지로는, StemFit AK03N 의 A 액 및 B 액을 혼합한 것을 사용했다. 또한, 이들의 배양 기간 중, 배지 교환은 매일 실시했다.
배양 11 일째에 있어서, 미주 신경제세포를 얻었다.
또, 레티노산을 첨가하지 않은 것 이외에는 동일 조건으로 iPSC 의 배양을 실시하여, 두부 신경제세포를 유도했다.
미주 신경제세포의 분화 마커의 발현을 조사하기 위해, 배양 11 일째의 세포를 회수하고, RNeasy (Qiagen) 를 사용하여 전체 RNA 획분을 정제했다. Prime Script RT reagent kit (다카라 바이오) 를 사용하여 cDNA 를 합성한 후, 정량 RT-PCR 을 실시하여, 미주 신경제세포 마커인 SOX10 및 엔도텔린 수용체 유형 B (endothelin receptor type B) (EDNRB) 그리고 전후축의 위치 정보를 규정하는 HOX 유전자군 중, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB7 및 HOXB9 유전자 발현량을 측정했다. 유전자 발현량은, 내재성 컨트롤의 GAPDH 의 발현량에 대한 비로서 구했다.
각 유전자의 발현량을 도 2 에 나타낸다. 도면 중, 세로축은, Fold change (두부 신경제세포에 있어서의 발현량을 1 로 한 비를 log2 로 나타낸 값) 를 나타낸다. SOX10, EDNRB, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5 및 HOXB7 을 발현하고 있고, HOXB9 를 발현하고 있지 않은 점에서, 미주 신경제세포로의 분화를 확인할 수 있었다.
[시험예 4 : 미주 신경제세포로부터 장관 신경전구세포로의 분화 및 확대 배양]
시험예 3 의 방법으로 얻어진, 배양 11 일째의 세포 (미주 신경제세포) 를 효소적 처리에 의해 분산시켜 회수했다. 효소적 처리는 이하와 같이 하여 실시했다.
배지를 흡인 제거하여 PBS 로 치환 후, 세포를 셀 스크레이퍼로 박리했다. 박리한 세포 덩어리는 Accutase (Innovative Cell Technologies) 중에서 피펫팅에 의해 분산시켰다. 그 후, MACS Buffer (밀테니 바이오텍) 를 첨가하고, 40 μm 의 셀 스트레이너를 통과시켜 싱글 셀화했다. 얻어진 세포 현탁액은 300×g, 3 분간 원심 후에 상청을 제거하고, 장관 신경전구세포 배지에 현탁했다. 장관 신경전구세포 배지에는, StemFit AK03N 의 A 액 및 B 액을 혼합한 것에, 10 μM SB431542 (후지 필름 와코 순약 주식회사), 1 μM CHIR99021 (Axon MedChem), 1 μM 레티노산 (후지 필름 와코 순약 주식회사), 100 ng/mL Neuregulin1 (NRG1) (Pepro Tech) 및 50 mg/mL Glial Cell-derived Neurotrophic Factor (GDNF) (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 포함하는 것을 사용했다. 접착 배양을 하는 경우에는, 세포 현탁액에 2 ％ 가 되도록 마트리겔 (Corning) 을 첨가하고, 멀티 웰 플레이트 (Corning) 에서 배양했다. 부유 배양을 하는 경우에는 세포 저접착 처리를 실시한 멀티 웰 플레이트 (Corning) 를 사용했다. 배양은 모두 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 실시했다.
접착 배양 시의 계대 방법을 이하에 나타낸다.
배지를 흡인 제거하여 PBS 로 치환 후, PBS 를 흡인 제거하고, TrypLE Select CTS (Life Technologies) 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 10 분간 정치했다. 그 후, TrypLE Select CTS 를 흡인 제거하고, 장관 신경전구세포 배지를 첨가하고, 피펫팅에 의해 세포를 분산시켰다.
분산 후의 세포를 2 ∼ 10 × 104 개/㎠ 의 밀도로 파종했다. 세포 파종 후, 2 ％(w/v) 가 되도록 마트리겔을 첨가했다.
얻어진 세포는 1 ∼ 2 주 동안에 1 회 계대를 실시했다. 계대마다 자동 셀 카운터로 총 세포수, 생세포수 및 사세포수를 카운트했다. 계대 시에 파종한 생세포수 및 차회 계대 시에 얻어진 생세포수로부터 총 세포수 (accumulated cell number) 를 산출했다.
총 세포수 (accumulated cell number) 의 시간 경과에 따른 변화를 도 3 에 나타낸다. 세포는 적어도 7 회 계대 가능하고, 선형의 세포 증식을 나타냈다.
[시험예 5 : 장관 신경전구세포의 플로 사이토메트리 해석]
시험예 4 에서 배양한 세포에 있어서의 SOX10-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 의 발현을, 플로 사이토메트리를 사용하여, 계대 시마다 해석했다.
계대 시에 얻어진 세포 분산액을 300×g, 3 분간 원심하고, 상청 제거 후, DAPI 및 1 ％ 의 소 혈청 알부민을 포함하는 HBSS 에 세포를 현탁하고, FACS Aria Fusion (닛폰 벡톤·디킨슨) 에 의한 해석에 제공했다.
SOX10-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 의 발현 해석 결과를 도 4 에 나타낸다. 도면 중, P1 ∼ P6 은 계대 횟수 (1 ∼ 6 회) 를 의미한다. 계대를 거칠 때마다, SOX1-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 를 공발현하는 장관 신경전구세포가 차지하는 비율이 상승했다. 5 회 계대 이후에는 장관 신경전구세포가 차지하는 비율은 80 ％ 이상이 되었다.
[시험예 6 : 장관 신경전구세포 배지의 조성에 관한 검토]
장관 신경전구세포 배지에 NRG1 및/또는 GDNF 를 첨가하지 않은 것 이외에는 시험예 4 와 동일 조건으로 장관 신경전구세포 배지 미주 신경제세포를 배양하고, 형광 현미경 (BZ-X700, 키엔스) 으로 관찰했다. 또, 시험예 5 와 동일한 방법으로 플로 사이토메트리 해석을 실시했다.
세포의 형광상과 SOX10-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 의 발현 해석 결과를 도 5 에 나타낸다. NRG1 을 포함하지 않는 조건에서는, 세포 증식이 매우 느려, 플로 사이토메트리를 실시하기 위해서 필요한 세포수가 얻어지지 않았다. GDNF 를 포함하지 않는 조건에서는, SOX10-tdTomato 및 PHOX2B-emGFP 를 공발현하는 장관 신경전구세포가 얻어지지만, GDNF 를 포함하는 조건에 비해 세포의 증식이 느렸다.
[시험예 7 : 장관 신경전구세포의 유전자 발현 해석]
시험예 4 에 있어서 계대 시에 얻어진 세포로부터 전체 RNA 를 추출하여, 장관 신경전구세포의 마커인 SOX10, PHOX2B, HOXB5, EDNRB 및 ret proto-oncogene (RET) 의 유전자 발현을 확인했다. 유전자 발현 해석은 전술한 방법과 동일하게 실시했다.
결과를 도 6 에 나타낸다. 도면 중, 세로축은, Expression level (내재성 컨트롤의 GAPDH 의 발현량에 대한 비) 혹은 Fold change (iPSC 에 있어서의 발현량을 1 로 한 비를 log2 로 나타낸 값) 를 나타낸다. 장관 신경전구세포 배지에서 배양한 세포는, 계대를 거쳐도 SOX10, PHOX2B, HOXB5, EDNRB 및 RET 를 발현하고 있었다.
[시험예 8 : 장관 신경전구세포의 장관 신경계로의 분화]
시험예 4 와 동일하게 하여 얻은 장관 신경전구세포를 장관 신경 분화용 배지에서 배양하여 장관 신경으로의 분화를 실시했다. 장관 신경 분화용 배지에는, Neurobasal Medium (Life Technologies) 에 B27 (Life Technologies), N2 서플리먼트 (후지 필름 와코 순약 주식회사), L-글루타민 (후지 필름 와코 순약 주식회사), 페니실린/스트렙토마이신 (Life Technologies), 100 μM 아스코르브산 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 및 25 ng/mL GDNF 를 첨가한 것을 사용했다.
배양 40 일째에 4 ％ PFA 를 첨가하여 실온에서 고정을 실시하고, 여러 가지 장관 신경 서브타입으로의 분화능을 평가하기 위해서 형광 면역 염색에 제공했다. 1 차 항체로서 항 콜린 아세틸트랜스페라제 (choline acetyltransferase) (ChAT) 항체 (ab224267, Abcam), 항 뉴런 산화질소 신타아제 (neuronal nitric oxide synthases) (nNOS) 항체 (ab76067, Abcam), 항 감마-아미노부티르산 (GABA) 항체 (A2052, 시그마) 또는 항 5-히드록시트립타민 (5-HT) 항체 (S5545, 시그마) 와 반응시키고, 또한 2 차 항체로서 1 차 항체의 면역 동물에 맞춘 Alexa647 표지 2 차 항체와 순차 반응시킨 후, 형광 현미경으로 관찰했다.
형광 면역 염색상을 도 7 에 나타낸다. ChAT, nNOS, GABA 및 5-HT 양성의 신경이 확인되고, 각각 콜린발생성 뉴런 (cholinergic neuron), 억제성 뉴런 (inhibitory neuron), GABA발생성 뉴런 (GABAergic neuron) 및 세로토닌성 뉴런 (serotonergic neuron) 인 것이 나타났다. 따라서, 본 배양 방법으로 얻어진 장관 신경전구세포는 여러 가지 장관 신경 서브타입으로의 분화능을 유지하고 있는 것이 나타났다.
[시험예 9 : 인간 iPSC 의 유지 배양]
인간 iPSC 에는, 253G1 주 (Nature Biotechnology, 2008, 26, (1) : 101-106 참조) 를 사용했다.
iPSC 의 유지 배양은, 비트로넥션 (Vitronection) (TN-N) 제조합 인간 단백질, 절단됨 (Recombinant Human Protein, Truncated) (서모피셔사 제조) 를 코트한 플레이트를 사용하여, 피더세포를 사용하지 않고 실시했다. 배양은, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 실시했다.
유지 배양 시의 배지에는, Essential 8 Flex Medium Kit (서모피셔) 의 Basal Medium 및 Supplement 를 혼합한 것을 사용했다. 배지 교환은 매일 실시하고, 계대는 6 ∼ 7 일마다 실시했다.
계대는, 0.5 mM EDTA 를 첨가한 PBS 를 사용하여 iPSC 를 싱글 셀화하여 플레이트로부터 박리시킨 후, 박리시킨 iPSC 를 비트로넥션 (Vitronection) (TN-N) 제조합 인간 단백질, 절단됨 (Recombinant Human Protein, Truncated) 를 코트한 새로운 플레이트 상에 파종함으로써 실시했다.
파종 시의 배지에는, Essential 8 Flex Medium kit 의 Basal Medium 및 Supplement 를 혼합한 것에 10 μM Y27632 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 첨가하여 사용했다.
[시험예 10 : LGR5::emGFP 리포터 인간 iPSC 주의 수립]
시험예 9 의 인간 iPSC 를 싱글 셀화한 후, NEPA21 (네파 진) 을 사용하여 SpCas9 발현 플라스미드, LGR5 sgRNA 발현 플라스미드, LGR5::emGFP 도너 플라스미드 (LGR5 의 N 말단에 「키메릭 인트론 ＋ emGFP ＋ SV40polyA」를 녹인 가능한 콘스트럭트) 를 공도입했다.
얻어진 세포를 퓨로마이신 처리에 의한 약제 선발 후에 콜로니 픽업하고, 확대 배양했다. 얻어진 콜로니 중, PCR 에 의해 목적 서열의 삽입이 편(片)알렐성으로 확인된 것을 LGR5::emGFP 주로 했다.
[시험예 11 : 인간 iPSC 로부터 장관 오르가노이드로의 분화]
(1) iPSC 의 전배양
시험예 10 의 LGR5::emGFP 주를, 마트리겔 (Corning) 을 코트한 12 웰 플레이트에 각각 4 × 105 개/웰의 밀도로 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 2 일간 배양 (전배양) 했다. 파종 시의 배양액에는, Essential 8 Flex Medium Kit 의 Basal Medium 및 Supplement 를 혼합한 것에 10 μM Y27632 를 첨가하여 사용했다.
(2) 인간 iPSC 로부터 배체내 배엽으로의 분화
전배양 후, 배지를 100 ng/mL Activin A (PeproTech), 10 ng/mL BMP4 (R & D Systems), 20 ng/mL bFGF (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 포함하는 배지로 교환하고 (배양 0 일째), 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 4 일간 배양했다. 상기 배지로는, RPMI 1640 (서모피셔) 에 B-27 Supplement, 마이너스 인슐린 (minus insulin) (서모피셔) 과 페니실린-스트렙토마이신 (Penicillin-Streptomycin) (서모피셔) 을 혼합한 것을 사용했다. 배양 기간 중, 배지 교환은 매일 실시했다.
배태내 배엽으로의 분화를 확인하기 위해서, 배양 4 일 후의 세포를 회수하고, 정량 RT-PCR 에 의해 배태 내 배엽 마커인 SOX17 및 FOXA2 가 발현하고 있는 것을 확인했다.
(3) 배체내 배엽으로부터 후장으로의 분화
배체내 배엽 분화 후, 배지를 100 ng/mL FGF4 (PeproTech) 및 6 μM CHIR99021 (Axon MedChem) 을 포함하는 배지로 교환하고 (배양 4 일째), 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 4 일간 배양했다 (합계 8 일간). 상기 배지에는, RPMI 1640 (서모피셔) 에 B-27 Supplement, 마이너스 비타민 A (minus vitamin A) (서모피셔) 와 페니실린-스트렙토마이신 (서모피셔) 을 혼합한 것을 사용했다. 배양 4 일째에는 배지의 전체량을 교환했다. 배양 5 일째부터 7 일째에는 배지의 절반량을 교환했다. 후장으로의 분화를 확인하기 위해서, 배양 8 일 후의 세포를 회수하고, 정량 RT-PCR 에 의해 후장 마커인 CDX2 가 발현하고 있는 것을 확인했다.
(4) 장관 오르가노이드의 분화 1
웰 내에서 형성된 후장세포 덩어리를 배양 상청과 함께 회수했다. 후장세포 덩어리를 포함하는 용액에, 시험예 4 에서 제조한 장관 신경전구세포를 포함하는 세포 현탁액을 첨가하고, 원심한 후에 배양 상청을 제거했다. 마트리겔 용액에 재현탁한 후장세포 덩어리 및 장관 신경전구세포를, 50 μL/웰로 24 웰 플레이트 상에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 30 분간 배양하여 마트리겔을 겔화시켰다. 겔화한 마트리겔 상에 1000 ng/mL R-Spondin-1 (후지 필름 와코 순약 주식회사), 100 ng/mL Noggin (PeproTech), 100 ng/mL Wnt3a (R & D Systems), 100 ng/mL EGF, 2.5 μM 프로스타글란딘-E2 를 포함하는 배지를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양했다. 상기 배지에는, Advanced DMEM/F-12 (서모피셔) 에 B-27 Supplement, 마이너스 비타민 A (minus vitamin A) (서모피셔), N-2 Supplement (서모피셔), 10 μM Y27632, 10 mM HEPES (서모피셔), 페니실린-스트렙토마이신 (서모피셔) 을 혼합한 것을 사용했다.
배양 약 2 주간 후에, 후장세포 덩어리와 장관 신경전구세포로부터 분화한 장관 오르가노이드를 포함하는 마트리겔에 4 ℃ 의 D-PBS(-) (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 첨가하여, 마트리겔을 용해시켰다. 원심하여 배양 상청을 제거했다. 마트리겔 용액에 재현탁한 장관 오르가노이드를, 50 μL/웰로 24 웰 플레이트 상에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 30 분간 배양하여 마트리겔을 겔화시켰다. 겔화한 마트리겔 상에 1000 ng/mL R-Spondin-1, 100 ng/mL Noggin, 100 ng/mL Wnt3a, 100 ng/mL EGF, 2.5 μM 프로스타글란딘-E2, Y27632 를 포함하는 배지를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양했다 (장관 오르가노이드 배양 기간 합계 24 ∼ 25 일간).
(5) 장관 오르가노이드의 분화 2
웰 내에서 형성된 후장세포 덩어리를 배양 상청과 함께 회수했다. 원심하여 배양 상청을 제거했다. 마트리겔 용액에 재현탁한 세포 덩어리를, 50 μL/웰로 24 웰 플레이트 상에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 30 분간 배양하여 마트리겔을 겔화시켰다. 겔화한 마트리겔 상에 1000 ng/mL R-Sponding-1, 100 ng/mL Noggin, 100 ng/mL Wnt3a, 100 ng/mL EGF, 2.5 μM 프로스타글란딘-E2 를 포함하는 배지를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양했다. 상기 배지에는, Advanced DMEM/F-12 (서모피셔) 에 B-27 Supplement, 마이너스 비타민 A (minus vitamin A) (서모피셔), N-2 Supplement (서모피셔), 10 μM Y27632, 10 mM HEPES (서모피셔), 페니실린-스트렙토마이신 (서모피셔) 을 혼합한 것을 사용했다.
배양 약 2 주간 후에, 후장세포 덩어리로부터 분화한 장관 오르가노이드를 포함하는 마트리겔에 4 ℃ 의 D-PBS(-) 를 첨가하여, 마트리겔을 용해시켰다. 장관 오르가노이드를 포함하는 용액에, 시험예 4 에서 제작한 장관 신경전구세포를 포함하는 세포 현탁액을 첨가하고, 원심하여 배양 상청을 제거했다. 상청 제거 후의 세포 펠릿에 1000 ng/mL R-Spondin-1, 100 ng/mL Noggin, 100 ng/mL Wnt3a, 100 ng/mL EGF, 2.5 μM 프로스타글란딘-E2, 10 μM Y27632 를 포함하는 배지를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 2 일간 배양했다. 배양 후에 마트리겔 용액에 재현탁한 장관 오르가노이드를, 50 μL/웰로 24 웰 플레이트 상에 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 30 분간 배양하여 마트리겔을 겔화시켰다. 겔화한 마트리겔 상에 1000 ng/mL R-Spondin-1, 100 ng/mL Noggin, 100 ng/mL Wnt3a, 100 ng/mL EGF, 2.5 μM 프로스타글란딘-E2, Y27632 를 포함하는 배지를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 배양했다 (장관 오르가노이드 배양 기간 합계 24 ∼ 25 일간).
[시험예 12 : 장관 오르가노이드로부터의 인공 장관의 in vivo 형성]
(1) 장관 오르가노이드의 마우스에의 이식
시험예 11 에서 얻어진, 장관 오르가노이드를 포함하는 마트리겔을, 4 ℃ 의 D-PBS(-) 를 첨가하여 용해시켰다. 장관 오르가노이드를 포함하는 용액을 원심하여 배양 상청을 제거했다. 상청 제거 후의 세포 펠릿에 Collagen I (Corning) 을 첨가했다. 네오베일 시트 (군제) 와 폴리-L-락타이드 (poly-L-lactide) (DURECT) 를 사용하여 제작한 스캐폴드에 세포 펠릿과 Collagen I 을 포함하는 용액을 첨가하여, 세포 펠릿을 스캐폴드에 접착시켰다.
6 주령의 면역 부전 마우스 (웅성 NOG 마우스, 실험동물 중앙 연구소) 를 이소플루란에 의한 마취하에서 개복했다. 세포 펠릿을 접착시킨 스캐폴드를 장관막 지방 상에 유치하고, 봉합했다. 이식 후 13 주간 마우스를 사육했다.
(2) 이식한 장관 오르가노이드의 채취
마우스를 이소플루란에 의한 마취하에서 개복했다. 장관막 지방 상에서 형성된 인공 장관을 장관막 지방으로부터 분리하여 채취했다.
(3) 인공 장관의 조직학적 해석
채취한 인공 장관을 4 ％ 파라포름알데하이드·인산 완충액 (후지 필름 와코 순약 주식회사) 에 의해 고정하고, 형광 면역 염색에 제공했다. 1 차 항체로서 항 TUBB3 항체 (Abcam), 항 S100β 항체 (Abcam), 항 GFAP 항체 (Abcam) 와 반응시키고, 또한 2 차 항체로서 1 차 항체의 면역 동물에 맞춘 형광 표지 2 차 항체와 순차 반응시킨 후, 형광 현미경으로 관찰했다.
형광 면역 염색상을 도 8, 9 에 나타낸다. 도 8 과 같이, PHOX2B-emGFP 및 SOX10-tdTomato 가 양성인 장관 신경전구세포에서 유래하는 세포 (신경세포 및 글리아세포) 가 존재하고 있었다. 또, 도 9 와 같이, PHOX2B-emGFP 또는 SOX10-tdTomato 양성상에 일치하여 혹은 근접하여 S100β(A), GFAP(B) 또는 TUBB3(C) 의 양성상이 보여, 장관 신경전구세포에서 유래하는 세포가 신경세포 및 글리아세포로 분화하고 있는 것이 확인되었다. 실시예 4 에서 얻어진 장관 신경전구세포가, 장관 신경세포로 분화하여 인공 장관을 구성하는 능력을 가지고 있는 것이 나타났다.
(4) 인공 장관의 운동 기능 해석
채취한 인공 장관을 단책상 (短冊狀) 의 조직편으로 자르고, 오간 배스 어세이 장치 (Panlab) 의 챔버 내에 그 일단을 매달았다. 다른 일단을 압력 트랜스듀서 (바이오 리서치 센터사 제조) 에 접속하고, 조직편의 수축 이완 반응을 정량적으로 모니터할 수 있도록 했다. 챔버 내에 크레브스 용액 (NaCl : 120.7 mM, KCl : 5.9 mM, NaHCO3 : 15.5 mM, NaH2PO4 : 1.2 mM, MgCl2 : 1.2 mM, CaCl2 : 2.5 mM, Glucose : 11.5 mM) 을 충전하고, 용액 중에 95 ％ O2 를 폭로시켰다. 챔버 내의 조직편을 전기 자극하여, 수축 이완 반응을 계측했다.
결과를 도 10 ∼ 12 에 나타낸다. 전기 자극에 응답하여, 수축 이완 반응이 확인되었다 (도 10 참조). 무스카린성 아세틸콜린 수용체 저해제인 아트로핀 설페이트 모노히드레이트 (Atropine Sulfate Monohydrate) (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 1 μM, α 아드레날린 작동성 효과 차단약인 페녹시벤자민 히드로클로라이드 (Phenoxybenzamine Hydrochloride) (토쿄 화성 공업 주식회사) 를 10 μM, 또는 β 아드레날린 수용체 효과 차단약인 프로프라놀롤 히드로클로라이드 (Propranolol Hydrochloride) (후지 필름 와코 순약 주식회사) 를 10 μM 첨가함으로써, 수축 응답은 부분적으로 해제되었다 (도 11 참조). 이 점에서, 실시예 4 에서 얻어진 장관 신경전구세포가, 인공 장관 내에서 아세틸콜린 및 아드레날린을 산생하여 근육을 수축시키는 신경을 형성하고 있는 것이 시사되었다.
한편, 전기 자극에 의존한 이완 반응은 잔존했다. 일산화질소 합성 효소의 저해제인 NG-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드의 첨가에 의해, 이완 응답은 소실했다 (도 11 참조). 이 점에서, 실시예 4 에서 얻어진 장관 신경전구세포가, 인공 장관 내에서 일산화질소를 산생하여 근육을 이완시키는 신경을 형성하는 것이 시사되었다.
또한, 1 μM 아트로핀 설페이트 모노히드레이트, 10 μM 페녹시벤자민 히드로클로라이드 또는 10 μM 프로프라놀롤 히드로클로라이드의 첨가에 의한 수축 응답의 해제는, 3 μM 테트로도톡신 (Tetrodotoxin) (후지 필름 와코 순약 주식회사) 첨가에 의해 소실했다. 이 점에서도, 장관 신경전구세포가 분화한 신경세포는, 전기 자극에 응답하여 근육을 이완시키는 기능을 갖는 것이 시사되었다.
[시험예 13 : 확대 배양한 장관 신경전구세포의 동결 스톡 제조, 및 당해 동결 스톡 융해 후의 특성 평가]
시험예 4 와 동일하게 하여 얻은 장관 신경전구세포를 사용하여 동결 스톡을 제조했다. 또, 동결 스톡 융해 후의 장관 신경전구세포의 증식능 및 분화능의 확인을 실시했다.
분화 76 일째의 장관 신경전구세포의 세포 분산액을 300×g, 3 분간 원심하고, 상청 제거 후, Stemcell Banker GMP Grade (닛폰 전약 공업 주식회사) 에 20 만개/200 μL 의 농도로 세포를 현탁하고, -80 ℃ 에서 동결 보존했다.
동결 스톡을 37 ℃ 에서 융해했다. 장관 신경전구세포 배지에 세포를 현탁 후, 300×g, 3 분간 원심하고, 상청 제거 후, 장관 신경전구세포 배지에 재현탁했다. 시험예 4 에 기재된 방법으로 배양을 실시했다. 또, 시험예 4 및 5 에 기재된 방법으로 계대 및 플로 사이토메트리 해석을 실시했다. 또한, 시험예 8 및 14 에 기재된 방법에 따라 장관 신경세포 및 글리아세포로의 분화능을 확인했다.
결과를 도 13 에 나타낸다. (A) 는, 확대 배양 시의 세포수의 시간 경과에 따른 변화와, 확대 배양 시의 전체 세포에서 차지하는 장관 신경전구세포의 비율의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. (B) 는, 장관 신경전구세포 (ENP) 와 이것으로부터 분화시킨 장관 신경세포 (ENS) 에 있어서의 PHOX2B 및 SOX10 의 발현을 플로 사이토메트리에 의해 해석한 결과를 나타낸다. (C) 는, 장관 신경전구세포로부터 분화시킨 장관 신경세포 및 글리아세포의 형광 면역 염색상을 나타낸다. 동결 융해 후의 장관 신경전구세포는 우수한 증식능을 유지하고 있는 것이 확인되었다. 또, 동결 융해 후의 장관 신경전구세포가, 장관 신경세포 (PHOX2B 및 Peripherin 양성이고 SOX10 음성) 및 글리아세포 (GFAP 양성) 로의 분화능을 유지하고 있는 것이 확인되었다. 장관 신경세포에는, nNOS (neuronal nitric oxide synthase; 뉴런 산화질소 신타아제), TH (tyrosine hydroxylase; 티로신 히드록시아제), ChAT (choline acetyltransferase; 콜린 아세틸트랜스페라제), GABA (gamma amino butyric acid; 감마 아미노 부티르산) 혹은 SST (somatostatin; 소마토스타틴) 를 발현하는 여러 가지 서브타입이 포함되어 있었다.
[시험예 14 : 장관 신경전구세포의 글리아세포로의 분화]
시험예 4 와 동일하게 하여 얻은 장관 신경전구세포를 사용하여, 글리아세포로의 분화를 실시했다.
글리아세포 분화용 배지에는, 별아교세포 성숙 키트 (Astrocyte maturation kit) (Stem Cell Technologies) 에, 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies) 을 첨가한 것을 사용했다.
배양 46 일째의 세포를 파라포름알데하이드·인산 완충액에 의해 고정하고, 형광 면역 염색에 제공했다. 1 차 항체로서 항 GFAP 항체 (CST#3670, Cell Signaling) 와 반응시키고, 또한 2 차 항체로서 1 차 항체의 면역 동물에 맞춘 형광 표지 2 차 항체와 순차 반응시킨 후, 형광 현미경으로 관찰했다.
형광 면역 염색상을 도 14 에 나타낸다. GFAP 양성 글리아세포가 확인되었다. 따라서, 본 배양 방법으로 얻어진 장관 신경전구세포는 글리아세포로의 분화능을 유지하고 있는 것이 나타났다.
[시험예 15 : 장관 신경전구세포의 면역 부전 마우스 장관에 있어서의 생착성 확인]
시험예 4 와 동일하게 하여 얻은 장관 신경전구세포를 사용하여, 면역 부전 마우스 장관에 있어서의 생착성 확인을 실시했다.
(1) 이식용 장관 신경전구세포의 세포 덩어리의 조제
장관 신경전구세포를 장관 신경전구세포 배지에 현탁하고, 스피어 컬쳐 플레이트 (sphere culture plate) (RB500 400 NA 24, 쿠라레) 에 320,000 개/웰로 파종하고, 3 일간 배양하여 세포 덩어리 (sphere) 를 구축했다.
(2) 장관 신경전구세포의 마우스에의 이식
얻어진 세포 덩어리 (sphere) 를 회수하고, 마취하에서 개복한 면역 부전 마우스 (NOD. CB17-Prkdc <scid>/J, 수컷, 6 주령, 닛폰 찰스·리버 주식회사) 의 맹장벽에 시린지 니들 (30 게이지) 을 사용하여 580 sphere/site/마리로 이식했다. 이식 시의 매체는 마트리겔과 장관 신경전구세포 배지를 1 : 1 (v/v) 로 혼합한 것을 사용했다. 1 주간 후, 동물을 안락사시키고, 이식 부위 주위를 채취하여 4 ％ 파라포름알데하이드·인산 완충액으로 고정했다.
(3) 이식 후 샘플의 조직학적 해석
고정한 샘플을 형광 면역 염색에 제공했다. 1 차 항체로서 항 TUBB3 항체 (Abcam) 와 반응시키고, 또한 2 차 항체로서 1 차 항체의 면역 동물에 맞춘 형광 표지 2 차 항체와 순차 반응시킨 후, 형광 현미경으로 관찰했다.
형광 면역 염색상을 도 15 에 나타낸다. 마우스 장관의 점막 하층부터 근층에 상당하는 부위에 PHOX2B-emGFP 및 SOX10-tdTomato 가 양성인 장관 신경전구세포에서 유래하는 세포 (신경세포 및 글리아세포로 분화하고 있다고 생각되는 세포) 가 존재하고 있어 (a 및 b), 장관 신경전구세포의 마우스 장관에의 생착이 확인되었다. 또, PHOX2B-emGFP 또는 SOX10-tdTomato 양성상에 일치하여 혹은 근접하여 TUBB3 양성상이 보여 (c), 장관 신경전구세포에서 유래하는 세포가 신경세포로 분화하고 있는 것이 확인되었다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : 인간 NRG1 의 전장 아미노산 서열
<110> KYOTO UNIVERSITY TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED <120> METHOD FOR PRODUCING ENTERIC NEURAL PRECURSOR <130> PT38-9033 <150> JP2018-155395 <151> 2018-08-22 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 645 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Glu Arg Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Arg Gly Ser Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Pro Ala Leu Pro Pro Arg Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala 35 40 45 Ala Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser 50 55 60 Ser Leu Arg Phe Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys 65 70 75 80 Asn Lys Pro Gln Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu 85 90 95 Leu Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys 100 105 110 Lys Val Ile Ser Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr 115 120 125 Ile Val Glu Ser Asn Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu 130 135 140 Gly Ala Tyr Val Ser Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr 145 150 155 160 Glu Gly Ala Asn Thr Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr 165 170 175 Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn 180 185 190 Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr 210 215 220 Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys His Leu Gly Ile Glu Phe Met Glu Ala 225 230 235 240 Glu Glu Leu Tyr Gln Lys Arg Val Leu Thr Ile Thr Gly Ile Cys Ile 245 250 255 Ala Leu Leu Val Val Gly Ile Met Cys Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr 260 265 270 Lys Lys Gln Arg Lys Lys Leu His Asp Arg Leu Arg Gln Ser Leu Arg 275 280 285 Ser Glu Arg Asn Asn Met Met Asn Ile Ala Asn Gly Pro His His Pro 290 295 300 Asn Pro Pro Pro Glu Asn Val Gln Leu Val Asn Gln Tyr Val Ser Lys 305 310 315 320 Asn Val Ile Ser Ser Glu His Ile Val Glu Arg Glu Ala Glu Thr Ser 325 330 335 Phe Ser Thr Ser His Tyr Thr Ser Thr Ala His His Ser Thr Thr Val 340 345 350 Thr Gln Thr Pro Ser His Ser Trp Ser Asn Gly His Thr Glu Ser Ile 355 360 365 Leu Ser Glu Ser His Ser Val Ile Val Met Ser Ser Val Glu Asn Ser 370 375 380 Arg His Ser Ser Pro Thr Gly Gly Pro Arg Gly Arg Leu Asn Gly Thr 385 390 395 400 Gly Gly Pro Arg Glu Cys Asn Ser Phe Leu Arg His Ala Arg Glu Thr 405 410 415 Pro Asp Ser Tyr Arg Asp Ser Pro His Ser Glu Arg Tyr Val Ser Ala 420 425 430 Met Thr Thr Pro Ala Arg Met Ser Pro Val Asp Phe His Thr Pro Ser 435 440 445 Ser Pro Lys Ser Pro Pro Ser Glu Met Ser Pro Pro Val Ser Ser Met 450 455 460 Thr Val Ser Met Pro Ser Met Ala Val Ser Pro Phe Met Glu Glu Glu 465 470 475 480 Arg Pro Leu Leu Leu Val Thr Pro Pro Arg Leu Arg Glu Lys Lys Phe 485 490 495 Asp His His Pro Gln Gln Phe Ser Ser Phe His His Asn Pro Ala His 500 505 510 Asp Ser Asn Ser Leu Pro Ala Ser Pro Leu Arg Ile Val Glu Asp Glu 515 520 525 Glu Tyr Glu Thr Thr Gln Glu Tyr Glu Pro Ala Gln Glu Pro Val Lys 530 535 540 Lys Leu Ala Asn Ser Arg Arg Ala Lys Arg Thr Lys Pro Asn Gly His 545 550 555 560 Ile Ala Asn Arg Leu Glu Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gln Ser Ser 565 570 575 Asn Ser Glu Ser Glu Thr Glu Asp Glu Arg Val Gly Glu Asp Thr Pro 580 585 590 Phe Leu Gly Ile Gln Asn Pro Leu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Thr Pro 595 600 605 Ala Phe Arg Leu Ala Asp Ser Arg Thr Asn Pro Ala Gly Arg Phe Ser 610 615 620 Thr Gln Glu Glu Ile Gln Ala Arg Leu Ser Ser Val Ile Ala Asn Gln 625 630 635 640 Asp Pro Ile Ala Val 645

Claims (22)

  1. 이하의 공정을 포함하는, 장관 신경전구세포의 제조 방법 :
    (A1) 장관 신경전구세포를 제공하는 공정, 그리고
    (A2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 장관 신경전구세포를 배양하는 공정.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지가, 추가로 TGFβ 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함하는, 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 배지가, 추가로 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는, 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지가, 추가로 GDNF 를 포함하는, 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지가, 추가로 마트리겔을 포함하는, 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트가, NRG1 인, 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 장관 신경전구세포.
  8. 제 7 항에 기재된 장관 신경전구세포를 포함하는 동결 스톡.
  9. 제 7 항에 기재된 장관 신경전구세포를 포함하는 세포 의약.
  10. 이하의 공정을 포함하는, 장관 신경전구세포의 제조 방법 :
    (B1) 신경제세포를 제공하는 공정, 그리고
    (B2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트, 그리고 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는 배지 중에서 신경제세포를 배양하는 공정.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 신경제세포가, 미주 신경제세포인, 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 미주 신경제세포가, SOX10 양성, HOXB5 양성, HOXB9 음성 또한 PHOX2B 음성이고,
    상기 장관 신경전구세포가, SOX10 양성 또한 PHOX2B 양성인, 제조 방법.
  13. ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는, 장관 신경전구세포 배지.
  14. 제 13 항에 있어서,
    추가로 TGFβ 저해제 및/또는 GSK3β 저해제를 포함하는, 배지.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    추가로 레티노산 및/또는 그 유도체를 포함하는, 배지.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 GDNF 를 포함하는, 배지.
  17. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 마트리겔을 포함하는, 배지.
  18. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트가, NRG1 인, 배지.
  19. 이하의 공정을 포함하는, 장관 신경전구세포의 확대 배양 방법 :
    (C1) 장관 신경전구세포를 제공하는 공정, 그리고
    (C2) ERBB3 아고니스트 및/또는 ERBB4 아고니스트를 포함하는 배지 중에서 장관 신경전구세포를 배양하는 공정.
  20. 장관 신경전구세포와 후장세포를 공배양하는 공정을 포함하는, 장관 오르가노이드의 제조 방법.
  21. 장관 신경전구세포와 후장세포를 공배양함으로써 장관 오르가노이드를 얻는 공정과,
    상기 장관 오르가노이드를 생체내에 이식하여 인공 장관을 형성시키는 공정을 포함하는 인공 장관의 제조 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 장관 신경전구세포가, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 장관 신경전구세포인, 제조 방법.
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