JPWO2019087853A1 - 生体物質定量方法、画像処理装置及びプログラム - Google Patents
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Abstract
Description
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す第1の蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第1の蛍光画像を実空間から周波数空間に変換する第1の変換工程と、
前記周波数空間の画像から、所定の周波数よりも高い周波数成分のみの画像を抽出する抽出工程と、
前記抽出工程によって抽出された周波数成分の画像を実空間に変換して第2の蛍光画像を生成する第2の変換工程と、
前記第2の蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて、前記生体物質を定量する定量工程と、を含む
ことを特徴とする。
前記第1の蛍光画像は、前記組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた複数枚の蛍光画像であり、
前記第2の蛍光画像は、複数枚の前記第1の蛍光画像の各々について生成された複数枚の蛍光画像であり、
複数枚の前記第2の蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出工程と、
複数枚の前記第2の蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第1閾値よりも小さいか否かを判定する判定工程と、
前記定量工程においては、前記判定工程において前記輝度積算値の差が所定の第1閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
ことを特徴とする。
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を、当該組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数枚の蛍光画像を入力する入力工程と、
複数枚の前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出工程と、
複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいか否かを判定する判定工程と、
前記蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量工程と、を含み、
前記定量工程においては、前記判定工程において前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
ことを特徴とする。
前記判定工程は、複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値のピーク値に該当する座標の変化が、所定の第3閾値よりも小さいか否かを判定することを特徴とする。
前記判定工程は、複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の形状の変化が、所定の第4閾値よりも小さいか否かを判定することを特徴とする。
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す第1の蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第1の蛍光画像を実空間から周波数空間に変換する第1の変換手段と、
前記周波数空間の画像から、所定の周波数よりも高い周波数成分のみの画像を抽出する抽出手段と、
前記抽出手段によって抽出された周波数成分の画像を実空間に変換して第2の蛍光画像を生成する第2の変換手段と、
前記第2の蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて、前記生体物質を定量する定量手段と、を備える
ことを特徴とする。
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を、当該組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数枚の蛍光画像を入力する入力手段と、
複数枚の前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出手段と、
複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいか否かを判定する判定手段と、
前記蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量手段と、を備え、
前記定量手段は、前記判定手段によって前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
ことを特徴とする。
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本における、前記生体物質を定量するコンピューターを、
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す第1の蛍光画像を入力する入力手段、
前記第1の蛍光画像を実空間から周波数空間に変換する第1の変換手段、
前記周波数空間の画像から、所定の周波数よりも高い周波数成分のみの画像を抽出する抽出手段、
前記抽出手段によって抽出された周波数成分の画像を実空間に変換して第2の蛍光画像を生成する第2の変換手段、
前記第2の蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量手段として機能させる。
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本における、前記生体物質を定量するコンピューターを、
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を、当該組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数枚の蛍光画像を入力する入力手段、
複数枚の前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出手段、
複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいか否かを判定する判定手段、
前記蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量手段、として機能させるためのプログラムであって、
前記定量手段は、前記判定手段によって前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
ことを特徴とする。
<蛍光画像の生体物質定量システム100の構成>
図1に、生体物質定量システム100の全体構成例を示す。
図1に示すように、生体物質定量システム100は、顕微鏡画像取得装置1Aと、画像処理装置2Aと、がケーブル3Aなどのインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。
顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2Aとの接続方式は特に限定されない。たとえば、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2AはLAN(Local Area Network)により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
顕微鏡画像取得装置1Aは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信I/Fなどを備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルタなどにより構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズなどにより構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサーなどを備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信I/Fは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置2Aに送信する。
顕微鏡画像取得装置1Aでは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野/蛍光を切り替えることが可能である。
なお、公知の任意の顕微鏡(たとえば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡等)にカメラを設置したものを顕微鏡画像取得装置1Aとして用いることができる。
図2に、画像処理装置2Aの機能構成例を示す。
図2に示すように、画像処理装置2Aは、制御部21、操作部22、表示部23、通信I/F24、記憶部25などを備えて構成され、各部はバス26を介して接続されている。
たとえば、制御部21は、記憶部25に記憶されている画像処理プログラムとの協働により画像解析処理を実行し、第1の変換手段、抽出手段、第2の変換手段、定量手段、算出手段、判定手段としての機能を実現する。
その他、画像処理装置2Aは、LANアダプターやルーターなどを備え、LANなどの通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
続いて、組織標本について説明する。
組織標本は目的生体物質を含む組織切片であって免疫染色剤で染色され、染色後の組織標本が顕微鏡画像取得装置1Aのステージに設置される。
目的生体物質とは、主に病理診断の観点からの検出または定量のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものをいい、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質(抗原)である。
典型的な目的生体物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカとして利用することができる生体物質が挙げられる。
免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“〜”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
一次抗体には、目的生体物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体(IgG)を用いることができる。たとえば、HER2を目的生体物質とする場合は抗HER2抗体を、HER3を目的生体物質とする場合は抗HER3抗体を、それぞれ用いることができる。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体(IgG)を用いることができる。
一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物(免疫動物)の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
蛍光ナノ粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、目的生体物質を1分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット(半導体ナノ粒子)、蛍光物質集積ナノ粒子が使用される。蛍光ナノ粒子の輝度は、自家蛍光の輝度の5倍以上であることが望ましい。
量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物またはIV族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geなどが挙げられる。
蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質(たとえば、上記量子ドット、蛍光色素など)がその中に内包されている及び/又はその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、母体と蛍光物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、量子ドット集積ナノ粒子、蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。
蛍光物質集積粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは発する蛍光がバックグラウンドノイズ(カメラのノイズや細胞の自家蛍光)に埋もれてしまうことから、20〜200nm程度のものが好適である。
また、粒径の変動係数が15%以下であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、1粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、1000個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1000個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂;スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、AS樹脂(アクリロニトリル−スチレン共重合体)、ASA樹脂(アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体)など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂;ポリ乳酸等のその他の樹脂;多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
量子ドット集積ナノ粒子とは、上記量子ドットが、上記母体の中に内包されている、及び/又はその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記母体の中に内包されている、及び/又はその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Alexa Fluor(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、Cy(登録商標、GEヘルスケア社製)系色素分子、HiLyte(登録商標、アナスペック社製)系色素分子、DyLight(登録商標、サーモサイエンティフィック社製)系色素分子、ATTO(登録商標、ATTO−TEC社製)系色素分子、MFP(登録商標、Mobitec社製)系色素分子、CF(登録商標、Biotium社製)系色素分子、DY(登録商標、DYOMICS社製)系色素分子、CAL(登録商標、BioSearch Technologies社製)系色素分子などを用いることができる。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
染色方法の一例について説明する。
この染色方法が適用できる組織切片(単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。)の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
(5.1.1)脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mのクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMのEDTA溶液(pH8.0)、5%尿素、0.1Mのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
pH条件は用いる組織切片に応じてpH2.0〜13.0の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はpH6.0〜8.0で行うが、特殊な組織切片ではたとえばpH3.0でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50〜130℃、時間は5〜30分で行うことができる。
免疫染色工程では、目的生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に乗せ、目的生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、BSA含有PBSなど公知のブロッキング剤やTween20などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行ってもよい。
形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている(これら2つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)として知られている)。
形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
染色した組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置1Aを用いて顕微鏡画像(第1の蛍光画像)を取得する。第1の蛍光画像の取得に際して、フォーカシングは蛍光ナノ粒子に対して行い、蛍光ナノ粒子に合焦した面(合焦面)を第1の蛍光画像として取得する。
制御部21は、顕微鏡画像取得装置1Aのステージを制御して、焦点位置を切り替えさせながら合焦面を特定し、組織標本の蛍光画像を撮像する。
蛍光画像を撮像する場合、制御部21は、照射手段により励起光を組織標本に照射する。すると、組織標本の蛍光ナノ粒子が蛍光発光し、蛍光輝点が出現する。制御部21はその蛍光像を撮像手段に撮像させる。
続いて、蛍光画像の生体物質定量方法について説明する。
かかる方法は、蛍光画像の生体物質定量システム100を用いて、免疫染色後の組織標本から自家蛍光を除去し、組織標本における生体物質の発現量を定量的に評価する際に行われる方法である。
図4に、ステップS12における自家蛍光検出処理1のフローチャートを示す。図4に示す自家蛍光検出処理1は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図5に、ステップS13における処理の詳細フローを示す。ステップS13の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
以下、第2の実施形態について図面を用いて説明する。第2の実施形態に係る生体物質定量システム100は、第1の実施形態とは異なり、組織標本の高さ方向に複数枚の撮像された蛍光画像を用いて、自家蛍光と蛍光ナノ粒子の蛍光輝点とを判別して、自家蛍光を解析対象から除外する。
なお、第1の実施形態と同様の構成については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
ステップS21においては、これらの蛍光画像の全てが画像処理装置2Aに入力され、ステップS22においては、全ての蛍光画像について輝点領域の抽出が実行される。なお、ステップS22における処理は、第1の実施形態に係るステップS13の処理と同様であるため、詳細な説明を省略する。
図7に、ステップS23における自家蛍光検出処理2のフローチャートを示す。図7に示す自家蛍光検出処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
蛍光ナノ粒子の蛍光輝点はZ座標が異なると輝度積算値が大きく変化するが、自家蛍光の場合は蛍光ナノ粒子の輝点に比べて輝度積算値の変化が小さい。即ち、Z座標が一定の距離だけ離れた画像間で、輝度積算値の差異がほとんどない輝点を自家蛍光とみなすことができる。制御部21は、合焦面上の蛍光輝点と、合焦面からZ方向に所定の距離だけ離れた他の輝点領域画像上の同一座標に存在する蛍光輝点の、輝度積算値の差を算出する。
以下、第3の実施形態について図面を用いて説明する。第3の実施形態に係る生体物質定量システム100は、自家蛍光検出処理として、周波数解析による自家蛍光の除去(自家蛍光除去処理)と輝度積算値を用いた自家蛍光の特定(自家蛍光特定処理)とを含む。
なお、第1の実施形態と同様の構成については、同一の符号を付して詳細な説明は省略する。
その他、生体物質定量システム100を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
2A 画像処理装置
3A ケーブル
21 制御部(第1の変換手段、抽出手段、第2の変換手段、定量手段、算出手段、判定手段)
22 操作部
23 表示部
24 通信I/F(入力手段)
25 記憶部
26 バス
100 生体物質定量システム
Claims (9)
- 単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す第1の蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第1の蛍光画像を実空間から周波数空間に変換する第1の変換工程と、
前記周波数空間の画像から、所定の周波数よりも高い周波数成分のみの画像を抽出する抽出工程と、
前記抽出工程によって抽出された周波数成分の画像を実空間に変換して第2の蛍光画像を生成する第2の変換工程と、
前記第2の蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて、前記生体物質を定量する定量工程と、を含む
生体物質定量方法。 - 前記第1の蛍光画像は、前記組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた複数枚の蛍光画像であり、
前記第2の蛍光画像は、複数枚の前記第1の蛍光画像の各々について生成された複数枚の蛍光画像であり、
複数枚の前記第2の蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出工程と、
複数枚の前記第2の蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第1閾値よりも小さいか否かを判定する判定工程と、
前記定量工程においては、前記判定工程において前記輝度積算値の差が所定の第1閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
請求項1に記載の生体物質定量方法。 - 単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を、当該組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数枚の蛍光画像を入力する入力工程と、
複数枚の前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出工程と、
複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいか否かを判定する判定工程と、
前記蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量工程と、を含み、
前記定量工程においては、前記判定工程において前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
生体物質定量方法。 - 前記判定工程は、複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値のピーク値に該当する座標の変化が、所定の第3閾値よりも小さいか否かを判定する請求項3に記載の生体物質定量方法。
- 前記判定工程は、複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の形状の変化が、所定の第4閾値よりも小さいか否かを判定する請求項3又は4に記載の生体物質定量方法。
- 単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す第1の蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第1の蛍光画像を実空間から周波数空間に変換する第1の変換手段と、
前記周波数空間の画像から、所定の周波数よりも高い周波数成分のみの画像を抽出する抽出手段と、
前記抽出手段によって抽出された周波数成分の画像を実空間に変換して第2の蛍光画像を生成する第2の変換手段と、
前記第2の蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて、前記生体物質を定量する定量手段と、を備える
画像処理装置。 - 単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を、当該組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数枚の蛍光画像を入力する入力手段と、
複数枚の前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出手段と、
複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいか否かを判定する判定手段と、
前記蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量手段と、を備え、
前記定量手段は、前記判定手段によって前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
画像処理装置。 - 単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本における、前記生体物質を定量するコンピューターを、
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す第1の蛍光画像を入力する入力手段、
前記第1の蛍光画像を実空間から周波数空間に変換する第1の変換手段、
前記周波数空間の画像から、所定の周波数よりも高い周波数成分のみの画像を抽出する抽出手段、
前記抽出手段によって抽出された周波数成分の画像を実空間に変換して第2の蛍光画像を生成する第2の変換手段、
前記第2の蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量手段
として機能させるためのプログラム。 - 単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本における、前記生体物質を定量するコンピューターを、
単一又は複数種類の生体物質が染色された組織標本を、当該組織標本の高さ方向に所定の間隔毎に撮像して得られた、前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数枚の蛍光画像を入力する入力手段、
複数枚の前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出し、当該蛍光輝点領域の輝度値の積算値である輝度積算値を算出する算出手段、
複数枚の前記蛍光画像の間で、同一の蛍光輝点領域の前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいか否かを判定する判定手段、
前記蛍光画像における蛍光輝点領域に基づいて前記生体物質を定量する定量手段、として機能させるためのプログラムであって、
前記定量手段は、前記判定手段によって前記輝度積算値の差が所定の第2閾値よりも小さいと判定された蛍光輝点領域を定量の対象から除外する
プログラム。
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