WO2022196203A1 - 画像形成方法 - Google Patents

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WO2022196203A1
WO2022196203A1 PCT/JP2022/005553 JP2022005553W WO2022196203A1 WO 2022196203 A1 WO2022196203 A1 WO 2022196203A1 JP 2022005553 W JP2022005553 W JP 2022005553W WO 2022196203 A1 WO2022196203 A1 WO 2022196203A1
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WO
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autofluorescence
tissue
image forming
forming method
fluorescence
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PCT/JP2022/005553
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賢司 西川
愛奈 安藤
健 瀬戸川
洋 根岸
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コニカミノルタ株式会社
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Publication date
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an image forming method, and more particularly to an image forming method that enables accurate measurement of fluorescence intensity derived from a target substance by reducing noise due to autofluorescence.
  • a specific target substance e.g., a substance overexpressed in a specific cell, a substance specifically expressed in a specific cell, etc.
  • PID particles fluorescent substance-integrated nanoparticles
  • PID particles fluorescent substance-integrated nanoparticles
  • the present invention has been made in view of the above problems and circumstances, and the problem to be solved is to provide an image forming method that enables accurate measurement of fluorescence intensity derived from a target substance by reducing noise due to autofluorescence. That is.
  • the present inventors used a combination of fluorescent substance-accumulating nanoparticles and an autofluorescence inhibitor to reduce noise due to autofluorescence.
  • the inventors have found that it is possible to provide an image forming method capable of accurately measuring the fluorescence intensity derived from a target substance, and have arrived at the present invention. That is, the above problems related to the present invention are solved by the following means.
  • An imaging method using a fluorescent material comprising: a step of adding an autofluorescence inhibitor to a biological tissue containing a target substance and labeling the target substance with fluorescent substance-accumulating nanoparticles to prepare a tissue specimen; and irradiating the tissue sample with excitation light to form a fluorescence image.
  • the autofluorescence suppressor comprises a fluorescence resonance energy transfer autofluorescence suppressor or an oxidative autofluorescence suppressor.
  • heteropolyacid or a salt thereof is a heteropolyacid represented by the following general formula (1) or a salt thereof.
  • General formula ( 1 ) HnAbDcOy.xH2O (Each symbol in the formula has the following meaning.
  • A represents phosphorus, boron, silicon, germanium, tin, arsenic, antimony, copper, nickel, cobalt, iron, cerium, thorium, chromium, or a composite element of two or more of these elements.
  • D represents molybdenum, tungsten, vanadium, or a composite element of two or more of these elements.
  • n represents the number of acidic hydrogens and is 1 or more.
  • b represents a number from 0.1 to 10;
  • c represents a number from 6 to 18;
  • x represents the number of moles of water of hydration.
  • y represents the number of oxygens in the heteropolyacid.
  • the present invention enables an image forming method that enables accurate measurement of fluorescence intensity derived from a target substance by reducing noise due to autofluorescence by using PID particles and an autofluorescence inhibitor in combination. is.
  • the image forming method of the present invention is an image forming method using a fluorescent substance, wherein an autofluorescence inhibitor is added to a biological tissue containing a target substance, and the target substance is labeled with fluorescent substance-accumulated nanoparticles. and forming a fluorescence image by irradiating the tissue sample with excitation light.
  • This feature is a technical feature common to or corresponding to each of the following embodiments.
  • the autofluorescence suppressing agent includes a fluorescence resonance energy transfer autofluorescence suppressing agent or an oxidized autofluorescence suppressing agent.
  • the autofluorescence suppressing agent may contain both the fluorescence resonance energy transfer autofluorescence suppressing agent and the oxidized autofluorescence suppressing agent. preferable.
  • the oxidized autofluorescence suppressing agent contains an oxidized autofluorescence suppressing compound, and the oxidized autofluorescence suppressing compound is an oxidizing autofluorescence suppressing compound.
  • a metal compound is preferred.
  • the oxidizable metal compound is preferably a heteropolyacid or a salt thereof, more preferably a heteropolyacid represented by the general formula (1) or a salt thereof.
  • the oxidized autofluorescence inhibitor further contains a reducing agent.
  • the reducing agent preferably contains a compound having a hydroxy group and a carbonyl group, or a compound having a carboxy group or a salt thereof, and is selected from ascorbic acid, tartaric acid, potassium antimonyl tartrate, and 2-furancarboxylic acid. It is more preferable to include at least one of
  • the biological tissue is preferably a fibrous tissue having interstitial cells, and the fibrous tissue is preferably lung tissue.
  • the image forming method of the present invention is an image forming method using a fluorescent material, and is characterized by comprising the following steps (1) and (2).
  • a step of adding an autofluorescence inhibitor to a biological tissue containing a target substance and labeling the target substance with fluorescent substance-accumulating nanoparticles to prepare a tissue sample (hereinafter referred to as “tissue sample preparation step”) Also called.)
  • tissue sample preparation step a tissue sample
  • fluorescence image forming step a step of irradiating the tissue sample with excitation light to form a fluorescence image
  • a fluorescence image obtained by the image forming method of the present invention is image-processed and used for analysis, etc., in an image processing apparatus, for example. Specifically, it is used to quantify a target substance in a biological tissue used as a specimen, to grasp the state of distribution, and the like.
  • the image forming method of the present invention may have steps other than the steps (1) and (2) depending on the purpose of use of the fluorescent image to be obtained. Each step of the image forming method of the present invention will be described below.
  • the tissue specimen preparing step according to the present invention is a step of preparing a biological tissue containing a target substance and preparing a tissue specimen by the following steps (1-1) and (1-2). is.
  • a tissue sample is, for example, a sample in which a target substance in a biological tissue prepared as a tissue section is stained with a fluorescent substance, and an autofluorescence inhibitor is added to the biological tissue (tissue section).
  • a step of adding an autofluorescence suppressor to a biological tissue containing a target substance (hereinafter also referred to as an "autofluorescence suppressor addition step”).
  • Step of labeling the target substance with fluorescent substance-accumulating nanoparticles (in this specification, labeling the target substance with PID particles and staining the target substance with PID particles are used interchangeably (1-2) is hereinafter also referred to as the “dyeing process”.)
  • steps (1-1) and (1-2) does not matter in the tissue preparation process.
  • various treatments described later in the dyeing process in (1-2) may reduce the ability of the autofluorescence inhibitor. Therefore, from the viewpoint of exhibiting the effect of the present invention, it is preferable to perform the step (1-1) after the step (1-2).
  • step (1-1) may be performed during step (1-2).
  • the step (1-1) may be performed after the morphological observation and staining step below. From the viewpoint of obtaining a more pronounced effect of the autofluorescence inhibitor, the step (1-1) is particularly preferably carried out after the morphological observation staining step and before the post-treatment step.
  • the tissue sample preparation step may have steps other than steps (1-1) and (1-2). For example, before the steps (1-1) and (1-2), a deparaffinization step and an activation treatment step may be provided in that order, and the steps (1-1) and (1-2) may be followed by a morphological observation staining step. Furthermore, a post-treatment step may be included as the final step in the tissue specimen preparation step.
  • the living tissue to which the image forming method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a living tissue.
  • the effects of the present invention are more pronounced when the biological tissue is a tissue containing a large amount of autofluorescent substances, for example, a fibrous tissue having stromal cells.
  • Such fibrous tissue includes lung tissue.
  • a biological tissue used in the present invention contains a target substance.
  • a target substance is a substance that is targeted for immunostaining using a fluorescent substance, mainly for detection or quantification from the viewpoint of pathological diagnosis.
  • the target substance is not particularly limited, but in pathological diagnosis, biomarkers such as antigens are generally selected according to the purpose.
  • biomarkers such as antigens are generally selected according to the purpose.
  • biological substances such as proteins (antigens) expressed in biological tissues can be used as target substances.
  • units smaller than proteins such as peptides and biomarkers such as RNA may be used as target substances.
  • the target substance does not have to be unique to the living body as long as it exists in living tissue.
  • the target substance may be a drug or the like introduced from outside the body into the body.
  • Typical target substances include biological substances that are expressed in the cell membranes of various cancer tissues and can be used as biomarkers.
  • an autofluorescence suppressor is added to a living tissue containing a target substance (hereinafter, also simply referred to as “living tissue”).
  • the biological tissue to which the autofluorescence inhibitor is added is prepared, for example, as a tissue section having a size to be used as a tissue specimen.
  • the tissue section is preferably, for example, one that has undergone a deparaffinization step and an activation treatment step, which will be described later, in that order.
  • the autofluorescence suppressing agent used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function of suppressing fluorescence emitted by a biologically derived fluorescent substance (hereinafter also referred to as "autofluorescence suppressing ability").
  • the ability to suppress autofluorescence is typically determined by the fact that a biologically derived fluorescent substance (coenzyme, amino acid, protein, intracellular pigment, etc., hereinafter also referred to as "autofluorescent substance”) originally present in a tissue specimen. This is the function of suppressing emitted fluorescence (so-called “autofluorescence”).
  • the autofluorescence inhibitor may also have a function of suppressing fluorescence emission not derived from the living body.
  • fluorescence includes, for example, fluorescence emitted from non-biologically-derived fluorescent substances contained in living tissue and instruments such as slide glasses.
  • the autofluorescence suppressing agent used in the present invention contains at least a compound having autofluorescence suppressing function (autofluorescence suppressing compound).
  • the autofluorescence suppressing agent may be an autofluorescence suppressing compound alone or a composition containing the compound.
  • the autofluorescence-suppressing agent is a composition
  • the composition contains at least one autofluorescence-suppressing compound, and as other components other than the autofluorescence-suppressing compound, a component that does not inhibit the autofluorescence-suppressing ability of the autofluorescence-suppressing compound. can be used as appropriate.
  • Other components include, for example, solvents, oxidizing agents, reducing agents, chelating agents, surfactants, and the like.
  • the autofluorescence inhibitor it is preferable to use a fluorescence resonance energy transfer type autofluorescence inhibitor or an oxidized autofluorescence inhibitor, and it is more preferable to use both of them.
  • a fluorescence resonance energy transfer (hereinafter also referred to as "FRET (Fluorescence resonance energy transfer) type”) autofluorescence inhibitor contains a FRET-type autofluorescence-suppressing compound.
  • a FRET-type autofluorescence-suppressing compound is a compound capable of receiving, through resonance, energy possessed by an autofluorescent substance excited by excitation light in a system coexisting with the autofluorescent substance. As a result, the autofluorescent substance in the excited state can return to the ground state without substantially emitting fluorescence.
  • the FRET-type autofluorescence-suppressing compound emits the received energy as, for example, light that does not generate heat or noise.
  • FRET-type autofluorescence-suppressing compounds include porphyrin.
  • Porphyrin is a general term for macrocyclic compounds and derivatives thereof in which four pyrrole rings are alternately bonded to four methine groups at the ⁇ -positions.
  • Porphyrins also include complexes with a metal element in the center of the ring.
  • One of the FRET-type autofluorescence-suppressing compounds may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • a FRET-type autofluorescence suppressing compound for example, porphyrin
  • the solvent used in the composition is a solvent capable of dissolving the compound without inhibiting the ability of FRET-type autofluorescence-suppressing compounds, such as porphyrin, to suppress autofluorescence.
  • Specific examples of the solvent include water and the like.
  • the content of the FRET-type autofluorescence-suppressing compound, such as porphyrin, in the composition can be in the range of, for example, 1 ng/mL to 1 mg/mL as a total content relative to the total amount of the composition.
  • the above composition may further contain a pH adjuster, HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid), PBS (phosphate buffered saline), Tris (Trishydroxymethylaminomethane) and the like may be contained.
  • the pH of the composition is preferably in the range of 6.0-8.0.
  • the oxidized autofluorescence suppressing agent contains an oxidized autofluorescence suppressing compound.
  • the oxidized autofluorescence-suppressing compound has a function of suppressing autofluorescence by binding to an autofluorescent substance. Specifically, the autofluorescence is suppressed by converting the wavelength of the fluorescence emission of the autofluorescent substance or by reducing the fluorescence emission amount itself.
  • One of the oxidized autofluorescence-suppressing compounds may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • oxidized autofluorescence-suppressing compounds include oxidizing metal compounds, and heteropolyacids or salts thereof are preferable as oxidizing metal compounds.
  • Heteropolyacids are polyacids of metal oxyacids containing heteroatoms.
  • the heteropolyacid is generally in the form of containing water of hydration. Molybdenum, tungsten, vanadium, etc. are mentioned as a metal atom which the metal oxyacid in a heteropolyacid has. One or more metal atoms may be used.
  • Heteroatoms in heteropolyacids include phosphorus, boron, silicon, germanium, tin, arsenic, antimony, copper, nickel, cobalt, iron, cerium, thorium, chromium, and the like. One or more heteroatoms may be used.
  • heteropolyacid salts include salts with monovalent metal cations such as sodium salts, potassium salts and lithium salts, salts with divalent metal cations such as nickel salts, cobalt salts, copper salts and zinc salts, and iron salts. salts with trivalent metal cations, salts with quaternary ammonium cations (NR 4+ (R is, for example, a hydrogen atom, a methyl group, a butyl group)), salts with quaternary phosphonium cations, and the like. be done.
  • monovalent metal cations such as sodium salts, potassium salts and lithium salts
  • salts with divalent metal cations such as nickel salts, cobalt salts, copper salts and zinc salts
  • iron salts salts with trivalent metal cations
  • salts with quaternary ammonium cations NR 4+ (R is, for example, a hydrogen atom, a methyl group, a butyl group)
  • Heteropolyacids or salts thereof bind to autofluorescent substances selected from aldehyde-fixed tissues, erythrocytes, collagen and elastin, and have the effect of inhibiting their autoluminescence.
  • heteropolyacids include heteropolyacids represented by the following general formula (1) (hereinafter also referred to as heteropolyacid (1)).
  • n represents the number of acidic hydrogens and is 1 or more. n is preferably in the range of 2-10.
  • b represents a number from 0.1 to 10; b is preferably in the range of 0.5 to 5, more preferably 0.5 to 2.5. As for b, 1 is especially preferable in a predetermined aspect.
  • c represents a number from 6 to 18; c is preferably in the range of 9-15, more preferably 10-12. c is particularly preferably 12 in certain embodiments.
  • x represents the number of moles of water of hydration. x is typically in the range 0-40. y represents the number of oxygens in the heteropolyacid. y is typically in the range 10-70.
  • Examples of salts of heteropolyacid (1) include compounds in which the acidic hydrogen in general formula (1) is replaced with the cations exemplified above. The number of n is appropriately adjusted according to the valence of the replaced cation.
  • Phosphomolybdic acid is particularly preferred as the heteropolyacid (1).
  • an oxidized autofluorescence-suppressing compound such as a heteropolyacid or a salt thereof may itself be used as an autofluorescence-suppressing agent. You may use it as an agent.
  • the solvent used in the composition is a solvent capable of dissolving the compound without inhibiting the autofluorescence-suppressing ability of the oxidized autofluorescence-suppressing compound, for example, a heteropolyacid or a salt thereof.
  • Specific examples of the solvent include water, ethanol, and the like.
  • the content of the oxidized autofluorescence-suppressing compound in the composition can be in the range of, for example, 0.1 to 10 mg/mL as a total content relative to the total amount of the composition.
  • the composition may further contain reducing agents, pH adjusters, HEPES, PBS, Tris, and the like, if necessary. pH adjusters, HEPES, PBS, Tris, etc. are used as buffers.
  • the pH of the composition is preferably in the range of 6.0-8.0.
  • the oxidized autofluorescence suppressing agent as a composition preferably contains a reducing agent in addition to the oxidized autofluorescence suppressing compound.
  • reducing agent known reducing agents can be used without any particular restrictions.
  • Specific examples of reducing agents include organic reducing agents such as compounds having a hydroxy group and a carbonyl group, compounds having a carboxy group or a salt thereof, and inorganic reduction agents such as metal compounds, metal complexes, metal nanoparticles, and inorganic acids. and organic reducing agents are preferred.
  • inorganic reducing agents examples include tin (II) chloride, sodium cyanoborohydride, sulfuric acid, sodium borohydride, and hydrazine.
  • compounds having a hydroxy group and a carbonyl group include ascorbic acid, erythorbic acid, and the like.
  • Compounds having a carboxyl group or a salt thereof include tartaric acid, potassium antimonyl tartrate, 2-furancarboxylic acid, formic acid, oxalic acid, 3,4,5-trihydroxybenzoic acid and the like.
  • the reducing agent contains at least one selected from ascorbic acid, tartaric acid, potassium antimonyl tartrate, and 2-furancarboxylic acid, and three kinds of ascorbic acid, potassium antimonyl tartrate, and 2-furancarboxylic acid. It is more preferable to include In that case, the mixing ratio of ascorbic acid, potassium antimonyl tartrate, and 2-furancarboxylic acid is, for example, 100 to 300 parts by weight of potassium antimonyl tartrate and 10 parts by weight of 2-furancarboxylic acid per 100 parts by weight of ascorbic acid. up to about 50 parts by mass.
  • the type of reducing agent is appropriately selected according to the type of oxidized autofluorescence-suppressing compound to be combined.
  • a heteropolyacid or a salt thereof is used as an oxidative autofluorescence inhibitor, and a compound having a hydroxy group and a carbonyl group, or a compound having a carboxy group or a salt thereof is used as a reducing agent.
  • the reducing agent more preferably contains at least one selected from ascorbic acid, tartaric acid, antimonyl potassium tartrate, and 2-furancarboxylic acid, and ascorbic acid, antimonyl potassium tartrate, and 2-furancarboxylic acid. It is more preferable to include the three types of, and as the mixing ratio of the three types, the same mixing ratio as described above can be mentioned.
  • the reducing agent moderately reduces an oxidized autofluorescence-suppressing compound, such as a heteropolyacid or a salt thereof, to obtain an oxidized autofluorescence-suppressing agent.
  • an oxidized autofluorescence-suppressing compound such as a heteropolyacid or a salt thereof.
  • a function of sufficiently suppressing autofluorescence can be imparted.
  • the effect on PID particles is small, and the S/N ratio in image evaluation is very high.
  • a commercially available composition containing an oxidized autofluorescence inhibitor such as a heteropolyacid or a salt thereof, may be used.
  • Commercially available products include, for example, a kit consisting of a plurality of components, and a solution (composition) containing the heteropolyacid (1) or a salt thereof by mixing the components at the time of use.
  • a kit for phosphomolybdic acid solution the phosphomolybdic acid concentration in the phosphomolybdic acid solution at the time of use is about 1.5 to 2.4 mg/mL).
  • TrueVIEW consists of a phosphomolybdic acid undiluted solution in which phosphomolybdic acid is dissolved in a solvent at a predetermined ratio, a reducing agent solution in which a reducing agent is dissolved in a solvent at a predetermined ratio, and a buffer solution.
  • a stock solution (A) of a heteropolyacid or a salt thereof in which a heteropolyacid or a salt thereof is dissolved in a solvent, and a reducing agent solution (B) in which a reducing agent is dissolved in a solvent at a predetermined ratio. and buffer solution (C) are prepared separately and mixed at the time of use to use as an autofluorescence inhibitor (composition).
  • the content of the heteropolyacid or its salt in the stock solution (A) of the heteropolyacid or its salt and the content of the reducing agent in the reducing agent solution (B) are, for example, the stock solution of the heteropolyacid or its salt (A), the reducing agent
  • the autofluorescence inhibitor is prepared by mixing the liquid (B) and the buffer solution (C) at a predetermined mixing ratio, for example, 1:1:1 (volume), each component in the resulting autofluorescence inhibitor
  • the content may be adjusted so as to be a suitable content for use.
  • the content of the heteropolyacid or its salt in the autofluorescence inhibitor is preferably in the above range, for example, 0.1 to 10 mg/mL, and the content of the reducing agent is, for example, in the range of 1.6 to 17 mg/mL. can do.
  • a stock solution (A) of a heteropolyacid or a salt thereof, a reducing agent solution (B), and a buffer solution (C) are mixed at, for example, 1:1:1 (by volume) to prepare an autofluorescence inhibitor.
  • the content of the heteropolyacid or its salt in the undiluted solution (A) of the heteropolyacid or its salt is preferably 0.3 to 30 mg/mL.
  • the content of the reducing agent in the reducing agent liquid (B) is preferably 5 to 50 mg/mL.
  • the buffer (C) for example, a buffer adjusted to pH 7.0 to 8.0 by adding a pH adjuster to an aqueous solution containing 10 to 30% by mass of a buffer such as HEPES or Tris. Liquid is preferred.
  • the mixing ratio of the stock solution (A) of the heteropolyacid or its salt, the reducing agent solution (B), and the buffer solution (C) is, for example, 1:0.5 to 2:0. It may be adjusted in the range of 5 to 2 (volume). In that case, according to the selected mixing ratio, the content of the heteropolyacid or its salt in the autofluorescence inhibitor and the content of the reducing agent are within the above ranges. The content of the acid or salt thereof and the content of the reducing agent in the reducing agent liquid (B) may be appropriately adjusted.
  • Addition of the autofluorescence suppressing agent to the biological tissue is performed, for example, to a biological tissue prepared as a tissue section having a size to be a tissue specimen.
  • the fluorescent image forming step that is performed after the tissue sample preparation step is typically performed using a microscope image acquisition device. Therefore, the tissue section to which the autofluorescence inhibitor is added is prepared in a form adapted to the microscope image acquisition device, specifically on a slide glass.
  • the tissue section (also simply referred to as "section”, including sections such as pathological sections) may be prepared by any method without particular limitation, and a section prepared by a known procedure and placed on a slide glass can be used. .
  • an autofluorescence inhibitor prepared in a liquid form is added to the section placed on the slide glass in this way.
  • the section is preferably subjected to the following deparaffinization step and activation treatment step in that order before the autofluorescence inhibitor is added.
  • the section placed on the slide glass is immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, it can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably within the range of 3 to 30 minutes.
  • xylene may be exchanged during the immersion, if necessary.
  • the sections are immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, it can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably within the range of 3 to 30 minutes. If necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
  • the sections are immersed in a container containing water to remove ethanol.
  • the temperature is not particularly limited, it can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably within the range of 3 to 30 minutes.
  • the water may be exchanged during the immersion.
  • activation treatment step Following a known method, the target substance is activated. Activation conditions are not particularly defined, but activating solutions include 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, and 0.1 M Tris-HCl buffer. A liquid or the like can be used.
  • pH conditions are such that a signal is generated at pH 2.0 to 13.0 at 25°C, and the roughness of the tissue is such that the signal can be evaluated.
  • pH is within the range of 6.0 to 8.0, but for special tissue sections, pH 3.0, for example, can also be used.
  • Autoclaves, microwaves, pressure cookers, water baths, etc. can be used as heating equipment.
  • the temperature can be in the range of 50 to 130° C., and the time can be in the range of 5 to 30 minutes.
  • the section after the activation treatment is immersed in a container containing PBS and washed.
  • the temperature is not particularly limited, it can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably within the range of 3 to 30 minutes. Also, the PBS may be replaced during the immersion, if necessary.
  • the autofluorescence-suppressing compound itself is liquid, it can be added to the slice as it is.
  • the autofluorescence-suppressing compound is solid, for example, a liquid composition (solution) containing the autofluorescence-suppressing compound in the above content is prepared and added to the slice.
  • the amount of the autofluorescence suppressor to be added should be enough to cover the section, and is preferably within the range of 20 ⁇ L to 150 ⁇ L per slide glass.
  • the temperature is not particularly limited, it can be performed at room temperature.
  • the standing time is preferably within the range of 3 to 5 minutes.
  • the section may be immersed in the autofluorescence inhibitor together with the slide glass.
  • the ratio of the two to the FRET-type autofluorescence-suppressing compound and the oxidized autofluorescence-suppressing compound is A mass ratio of 1:1000 to 1000:1 is preferred.
  • the order of adding the FRET-type autofluorescence inhibitor and the oxidized autofluorescence inhibitor is not particularly limited. In addition, part or all of the following dyeing process may be performed between the steps of adding the FRET-type autofluorescence suppressor and adding the autofluorescence suppressor.
  • the addition amount of each self-fluorescence suppressing agent, the temperature, and the standing time can be the same as those described above. Note that the FRET-type autofluorescence inhibitor and the oxidized autofluorescence inhibitor may be mixed and then added at the same time.
  • the staining step is a step of staining a target substance contained in a biological tissue, for example, a tissue section, with PID particles.
  • PID particles fluorescent substance-integrated nanoparticles
  • PID particles are nano-sized particles obtained by accumulating fluorescent substances. By staining the target substance using such PID particles, the detection sensitivity for labeling the target substance can be increased as described above.
  • PID particles have a structure in which a particle composed of an organic or inorganic substance is used as a matrix, and a fluorescent substance is included therein and/or adsorbed on its surface.
  • a fluorescent substance is excited by irradiation with excitation light such as X-rays, ultraviolet rays, visible rays, or infrared rays from the outside, and emits fluorescence in the process from the excited state to the ground state.
  • excitation light such as X-rays, ultraviolet rays, visible rays, or infrared rays from the outside.
  • Fluorescent substances used for PID particles include light with a wavelength in the range of 400 to 900 nm (visible It preferably exhibits luminescence in the range of light to near-infrared light.
  • the matrix and the fluorescent light-emitting substance have substituents or moieties having mutually opposite charges so that electrostatic interaction works.
  • Fluorescent substances are roughly classified into, for example, organic fluorescent substances (fluorescent dyes) and inorganic fluorescent substances (quantum dots).
  • fluorescent dyes include fluorescein-based dyes, rhodamine-based dyes, squarylium-based dyes, coumarin-based dyes, pyrene-based dyes, cyanine-based dyes, perylene-based dyes, oxazine-based dyes, aromatic ring-based dyes, carbopyronine-based dyes, pyromecenes-based dyes. Fluorescent dyes such as dyes can be exemplified.
  • Alexa Fluor registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • BODIPY registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • Cy registered trademark, manufactured by GE Healthcare
  • HiLyte registered trademark, manufactured by Anaspec
  • DyLight registered trademark, manufactured by Thermo Scientific
  • ATTO registered trademark, manufactured by ATTO-TEC
  • MFP registered trademark, manufactured by Mobitec
  • CF registered trademark, Biotium
  • DY registered trademark, manufactured by DYOMICS
  • CAL registered trademark, manufactured by BioSearch Technologies
  • NBD registered trademark
  • Texas Red registered trademark
  • Quantum dots Semiconductor nanoparticles containing II-VI compounds, III-V compounds or IV elements are used as quantum dots. Examples include CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, and Ge.
  • a quantum dot in which the above quantum dot is used as a core and a shell is provided thereon can also be used.
  • the core is CdSe and the shell is ZnS
  • quantum dots with shells for example, CdSe/ZnS, CdS/ZnS, InP/ZnS, InGaP/ZnS, Si/SiO 2 , Si/ZnS, Ge/GeO 2 , Ge/ZnS, etc. can be used. , but not limited to.
  • Quantum dots may be surface-treated with an organic polymer or the like, if necessary.
  • an organic polymer or the like for example, CdSe/ZnS (manufactured by Invitrogen) having surface carboxyl groups, CdSe/ZnS (manufactured by Invitrogen) having surface amino groups, and the like can be mentioned.
  • the method for producing PID particles is not particularly limited, and they can be produced by known methods. Specifically, a manufacturing method can be used in which a fluorescent substance is encapsulated in particles whose base material is an organic substance or an inorganic substance and/or the fluorescent substance is immobilized on the surface.
  • Organic substances that make up the matrix include resins generally classified as thermosetting resins such as melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin, furan resin; styrene resin, acrylic resin, acrylonitrile.
  • Resin, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer), ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer) resins generally classified as thermoplastic resins; other resins such as polylactic acid; polysaccharides can be exemplified.
  • Silica, glass, and the like can be exemplified as inorganic substances constituting the matrix.
  • the methods for producing PID particles will be described separately for the case where the fluorescent substance is a fluorescent dye and the case where the fluorescent substance is a quantum dot.
  • a method for producing PID particles using a fluorescent dye there is a method of forming resin particles having a diameter on the order of nanometers, in which the fluorescent dye is immobilized inside or on the surface of a matrix made of resin.
  • the method for preparing the PID particles is not particularly limited, but for example, (co)polymerizing a (co)monomer for synthesizing the resin (thermoplastic resin or thermosetting resin) forming the base of the PID particles
  • a method of adding a fluorescent dye and incorporating the fluorescent dye into the interior or surface of the resulting (co)polymer can be used.
  • Polystyrene nanoparticles encapsulating a fluorescent dye can be produced, for example, by a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group as described in US Pat. No. 4,326,008 (1982), or as described in US Pat. It can be produced using a method of impregnating a fluorescent dye into a polystyrene nanoparticle.
  • PID particles in which a fluorescent dye is immobilized inside or on the surface of a matrix made of silica.
  • Silica nanoparticles encapsulating a fluorescent dye can be synthesized, for example, with reference to the synthesis of FITC (fluorescein isothiocyanate) encapsulating silica particles described in Langmuir, Vol. 8, page 2921 (1992).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • a variety of silica-based PID particles can be synthesized by substituting the desired fluorescent dye for FITC.
  • the fluorescent dye when the fluorescent dye is encapsulated in the matrix, the fluorescent dye may or may not be chemically bonded to the matrix itself as long as it is dispersed inside the matrix.
  • PID particles using quantum dots can be produced by a known method.
  • silica nanoparticles encapsulating quantum dots can be synthesized with reference to Synthesis of CdTe-encapsulating silica nanoparticles described in New Journal of Chemistry, Vol. 33, page 561 (2009).
  • Silica nanoparticles encapsulating quantum dots are, for example, silica nanoparticles in which CdSe/ZnS capped with 5-amino-1-pentanol and APS described in Chemical Communication, page 2670 (2009) are accumulated on the surface. Synthesis can be used as a reference.
  • Polymer nanoparticles encapsulating quantum dots can be produced, for example, using the method of impregnating quantum dots into polystyrene nanoparticles described in Nature Biotechnology, Vol. 19, p. 631 (2001).
  • silica nanoparticles are treated with a silane coupling agent to aminate the ends, and quantum dots having a carboxyl group end are accumulated by bonding to the surface of silica beads through amide bonds, and PID particles There is also a method of
  • a reverse micelle method and a sol-gel using a mixture of an organic alkoxysilane and an alkoxide having an organic functional group with good adsorption to quantum dots at the end of the molecule as a glass precursor.
  • glass-like particles in which quantum dots are dispersed and fixed are formed to form PID particles.
  • Yet another method for preparing PID particles is to mix amino-terminated and carboxy-terminated quantum dots in the presence of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC). Then, there is an example of manufacturing PID particles by accumulating quantum dots by bonding quantum dots via amide bonds.
  • EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
  • the quantum dots when included in the matrix, the quantum dots need only be dispersed inside the matrix, and may or may not be chemically bonded to the matrix itself.
  • the average particle size of the PID particles is not particularly limited, those of about 20 to 200 nm are suitable. Those having an average particle size larger than the above upper limit tend to be difficult to access the target substance. When the average particle size is smaller than the above lower limit, the amount of the fluorescent light-emitting substance contained in the PID particles tends to be small and the luminance value tends to be low. Therefore, the emitted fluorescence is buried in background noise (camera noise and cell noise fluorescence), making quantitative evaluation difficult.
  • the average particle size of the PID particles is more preferably in the range of 40-150 nm.
  • the coefficient of variation of the particle size of the PID particles is 15% or less. Since the variation in particle size of the PID particles is small, the luminance value of the fluorescence per particle is substantially constant, so that the accuracy of quantification is enhanced.
  • the average particle diameter of the PID particles is the diameter of the circle when the cross-sectional area is measured for a sufficient number of particles by taking an electron micrograph using a scanning electron microscope (SEM), and each measured value is the area of the circle. was obtained as the particle size.
  • SEM scanning electron microscope
  • the arithmetic mean of the particle diameters of 1000 particles was taken as the average particle diameter.
  • the coefficient of variation was also a value calculated from the particle size distribution of 1000 particles.
  • the PID particles described above are used to stain the target substance.
  • An immunostaining method is preferable as a method for staining a target substance with PID particles.
  • a conjugate immunostaining agent
  • the obtained immunostaining agent binds to the target substance through an antigen-antibody reaction to stain the target substance. do.
  • immunostaining there are various methods for immunostaining, and there is no particular limitation as long as the protein as the target substance can be stained.
  • Representative techniques include the following techniques, and immunostaining agents are used according to each technique as follows.
  • a fluorescence-labeled primary antibody is prepared by linking the PID particles and the primary antibody. Staining is performed by directly fluorescently labeling the target substance with the obtained immunostaining agent (fluorescently labeled primary antibody).
  • a fluorescence-labeled secondary antibody is prepared by linking the PID particles and a secondary antibody (an antibody against the primary antibody). Staining is performed by reacting a target substance with a primary antibody and then reacting the primary antibody with an immunostaining agent (fluorescently labeled secondary antibody) to indirectly fluorescently label the target substance.
  • a biotin-modified primary antibody in which a primary antibody and biotin are linked, and avidin-modified PID particles in which PID particles and avidin or streptavidin are linked as an immunostaining agent are prepared. Staining involves reacting a target substance with a biotin-modified primary antibody and then reacting it with an immunostaining agent (avidin-modified PID particles) to indirectly fluorescently label the target substance using the avidin-biotin reaction. is done in
  • Biotin-biotin combined secondary antibody method Prepare primary antibody.
  • a biotin-modified secondary antibody in which a secondary antibody is linked to biotin and an avidin-modified PID particle in which PID particles are linked to avidin or streptavidin as an immunostaining agent are prepared.
  • the target substance is reacted with a primary antibody, then with a biotin-modified secondary antibody, and then with an immunostaining agent (avidin-modified PID particles) to detect the target substance using the avidin-biotin reaction. is indirectly fluorescently labeled.
  • hapten non-immunogenic but antigenic antibody
  • anti-hapten antibodies such as dickoxigenin and anti-dicoxigenin antibodies, FITC (fluorescein isothiocyanate) and anti-FITC antibodies, as well as other substance combinations with similar specific reactivity can also be used.
  • An antibody (IgG) that specifically recognizes and binds to a protein as a target substance as an antigen can be used as the primary antibody in the various immunostaining methods described above.
  • an anti-HER2 antibody can be used when HER2 is the target substance
  • an anti-HER3 antibody can be used when HER3 is the target substance.
  • An antibody (IgG) that specifically recognizes and binds to the primary antibody as an antigen can be used as the secondary antibody in the various immunostaining methods described above.
  • Both the primary antibody and the secondary antibody may be polyclonal antibodies, but from the viewpoint of stability of quantification, monoclonal antibodies are preferred.
  • the type of animal that produces antibodies is not particularly limited, and may be selected from mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, and the like, as in the past.
  • biotin-modified primary antibody or secondary antibody and the hapten-, dickoxigenin- or FITC-modified primary antibody or secondary antibody used in these modifications, are produced by conventionally known methods. can be done.
  • a linker molecule may optionally be introduced between the primary antibody or secondary antibody and biotin, hapten, dickoxigenin or FITC.
  • the immunostaining agent used is obtained by appropriately binding the primary antibody or secondary antibody and PID particles.
  • the binding between the primary antibody or secondary antibody and the PID particles includes, for example, covalent bond, ionic bond, hydrogen bond, coordinate bond, antigen-antibody bond, biotinavidin reaction, physical adsorption, chemical adsorption, etc.
  • a linker molecule may be interposed, if necessary.
  • the immunostaining agents used are avidin-modified PID particles in which PID particles and avidin or streptavidin are linked.
  • the immunostaining agents used are PID particles modified with anti-hapten antibodies, anti-dicoxigenin antibodies or anti-FITC antibodies. Modification of PID particles with avidin, anti-hapten antibody, anti-dicoxigenin antibody or anti-FITC antibody can be performed by known methods. For example, it can be produced by introducing functional groups capable of reacting with each other into both the avidin, anti-hapten antibody, anti-dicoxygenin antibody or anti-FITC antibody and the matrix of the PID particles and allowing them to react.
  • Immunostaining may be performed according to standard procedures and processing conditions for each of the various techniques described above.
  • a slide glass on which a tissue section containing a target substance is placed is coated with one or more reagents according to each immunostaining method in the order described above under appropriate temperature and time conditions. It should be immersed below.
  • the temperature is not particularly limited, it can be performed at room temperature.
  • the reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less for each reagent.
  • each immunostaining method treatment with a reagent containing an immunostaining agent is performed last.
  • the slide glass on which the immunostained tissue section is placed is preferably immersed in a washing solution such as PBS and washed.
  • a washing solution such as PBS
  • the temperature of the washing treatment with PBS after the treatment with the reagent containing the immunostaining agent is room temperature, and the time is 3 to 30 minutes. If necessary, the PBS may be replaced during the immersion.
  • a known blocking agent such as BSA-containing PBS or a surfactant such as Tween 20 before performing the above-described treatment.
  • the dyeing step is preferably performed before the autofluorescence inhibitor addition step.
  • the biological tissue for example, the tissue section
  • the deparaffinization step and the activation treatment step in that order.
  • the avidin-biotin combination secondary antibody method after the primary antibody is reacted with the target substance, and then with the biotin-modified secondary antibody, the avidin-modified PID particles are further reacted.
  • a step of adding an autofluorescence inhibitor may be provided after each step.
  • morphological observation staining may be performed separately from the staining step (1-2) so that the morphology of cells, tissues, organs, etc. can be observed in a bright field. .
  • the morphological observation staining step can be performed according to a conventional method.
  • eosin which stains cytoplasm, stroma, various fibers, red blood cells, and keratinocytes in red to dark red
  • hematoxylin which stains cell nuclei, calcareous tissue, cartilage tissue, bacteria, and mucus in blue to pale blue
  • a method of performing these two stainings simultaneously is known as hematoxylin-eosin staining (HE staining).
  • the morphological observation and staining process may be performed after the staining process (1-2) or before the staining process.
  • (1-1) autofluorescence inhibitor addition process may be performed after the morphological observation and staining process.
  • an autofluorescence inhibitor is added.
  • the autofluorescence inhibitor addition step is preferably performed after the morphological observation and staining step and before the post-treatment step.
  • the tissue specimen may be subjected to post-treatments such as fixation/dehydration, clearing, and encapsulation so as to make it suitable for observation in the next (2) fluorescence imaging step. preferable.
  • the fixation/dehydration treatment is performed by immersing the tissue specimen in a fixation treatment solution (cross-linking agents such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, and methanol).
  • the clearing treatment is performed by immersing the tissue specimen that has been fixed and dehydrated in a clearing solution (xylene or the like).
  • the encapsulation treatment is performed by immersing the tissue specimen that has undergone the clearing treatment in an encapsulating fluid.
  • the conditions for performing these treatments for example, the temperature and immersion time when immersing the tissue specimen in a prescribed treatment solution, can be adjusted as appropriate to obtain an appropriate signal according to conventional immunostaining methods. can.
  • a tissue specimen to be subjected to the fluorescent imaging step (2) is prepared. That is, in the image forming method of the present invention, the tissue sample prepared in (1) is then subjected to the fluorescent image forming step (2).
  • the tissue specimen prepared in (1) is irradiated with excitation light to form a fluorescence image.
  • the acquired fluorescence image is image-processed and used for analysis or the like in an image processing device, for example.
  • a fluorescence image can be formed by a conventionally known method.
  • a fluorescence image is formed using, for example, the following microscope image acquisition device.
  • the microscope image acquisition device is a device that irradiates the tissue specimen prepared in (1) with excitation light and acquires a fluorescence image based on the fluorescence emitted from the fluorescent substance in the PID particles that fluorescently labeled the target substance. be.
  • the acquired fluorescence image is subjected to, for example, image processing and analysis steps in an image processing device.
  • the microscope image acquisition device and image processing device are connected via an interface such as a cable so that data can be sent and received.
  • the connection method between the microscope image acquisition device and the image processing device is not particularly limited.
  • the microscope image acquisition device and the image processing device may be connected via a LAN (Local Area Network), or may be connected wirelessly.
  • the microscope image acquisition device is typically a known camera-equipped fluorescence microscope, and the tissue specimen prepared in (1) above (the tissue section on the slide glass of (1-1) and (1-2) A tissue sample subjected to the process) is placed on a slide fixing stage, a fluorescence microscope image thereof is obtained, and the image is transmitted to an image processing device.
  • a microscope image acquisition device is configured with, for example, irradiation means, imaging means, imaging means, communication I/F, and the like.
  • the irradiation means is composed of an excitation light source, an optical filter, and the like, and irradiates the tissue sample on the slide glass mounted on the slide fixing stage with excitation light.
  • the excitation light source examples include light sources capable of emitting light of the wavelengths described above, and the excitation light is preferably excitation light having a wavelength in the range of 575 to 600 nm, for example, by passing through an optical filter. Also, it is preferable to set the wavelength range of fluorescence to be observed within the wavelength range of 612 to 692 nm by passing it through an optical filter.
  • the imaging means is composed of an eyepiece lens, an objective lens, etc., and forms an image of transmitted light, reflected light, or fluorescence emitted from the tissue specimen on the slide by the irradiated light.
  • the imaging means is a microscope-equipped camera that includes a CCD (Charge Coupled Device) sensor or the like, and captures an image formed on an imaging plane by the imaging means to generate digital image data of a fluorescence image.
  • CCD Charge Coupled Device
  • the communication I/F transmits image data of the generated fluorescence image to the image processing device.
  • the microscope image acquisition device is equipped with a bright field unit combining illumination means and imaging means suitable for bright field observation, and a fluorescence unit combining illumination means and imaging means suitable for fluorescence observation. By doing so, it is possible to switch between bright field and fluorescence.
  • a known camera-equipped fluorescence microscope used as a microscope image acquisition device is not particularly limited, and any known microscope (e.g., phase contrast microscope, differential interference contrast microscope, electron microscope, etc.) with a camera installed.
  • a fluorescence microscope with an attached light can be used.
  • the microscope image acquisition device is not limited to a microscope with a camera.
  • a virtual microscope slide creation device that scans a slide on a slide fixing stage of a microscope and acquires an entire microscope image of a tissue specimen (tissue section).
  • a tissue specimen tissue section
  • the virtual microscope slide creation device it is possible to acquire an entire image of a tissue sample (tissue section) on the slide as image data that can be viewed at once on the display unit.
  • the image processing device identifies the focal position for each cell in the tissue section to be observed by analyzing the fluorescence image transmitted from the microscope image acquisition device.
  • Example 1 Preparation of tissue specimen (biological tissue containing target substance) A human lung cancer tissue array slide (manufactured by US Biomax, model number LC241m; target substance is ATPase) was used as a biological tissue containing the target substance.
  • Step Staining of the target substance was performed by a combined secondary antibody method of avidin and biotin.
  • a solution containing a primary antibody, a biotin-modified secondary antibody, and an immunostaining agent (avidin-modified PID particles) as reagents was prepared as follows.
  • linker reagent "(+)-Biotin-PEG6-NH-Mal" manufactured by PurePEG, product number 2461006-250
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • This reaction solution was subjected to a desalting column "ZebaDesaltSpinColumns" (manufactured by Thermo Scientific, Cat. #89882) for purification.
  • the absorption of the desalted reaction solution at a wavelength of 300 nm was measured with a spectrophotometer (Hitachi "F-7000") to calculate the amount of protein contained in the reaction solution.
  • the reaction solution was adjusted to 250 ⁇ g/mL with a 50 mM Tris solution and further diluted to 6 ⁇ g/mL with PBS containing 1% BSA. This solution was used as a biotin-modified secondary antibody solution.
  • PBS containing 2 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)
  • SM (PEG) 12 succinimidyl-[(N -maleimidopropionamido)-dodecaethylenegly
  • streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is subjected to a thiol group addition treatment, followed by filtration through a gel filtration column, and can be bound to maleimide-modified PID particles. , to obtain a streptavidin solution to which a thiol group was added.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • streptavidin-modified PID particle 1 solution The streptavidin-modified PID particles 1 obtained above were subjected to ultrasonic dispersion treatment, and then diluted with PBS containing 1% BSA to adjust to 0.02 nM.
  • tissue array slide subjected to the primary reaction was washed with PBS, and then reacted with the biotin-modified secondary antibody solution obtained above at room temperature for 30 minutes.
  • hematoxylin staining was performed. Hematoxylin staining was performed by staining the immunostained sections with Mayer's hematoxylin solution for 5 minutes. The tissue sections were then washed with running water at 45°C for 3 minutes.
  • the three components of TrueVIEW consist of phosphomolybdic acid undiluted solution (A1), reducing agent solution (B1), and buffer solution (C1).
  • the solvent in the phosphomolybdic acid stock solution (A1) is water, and the content of phosphomolybdic acid is 7 mg/mL.
  • the reducing agent in the reducing agent liquid (B1) is a mixture of ascorbic acid, antimonyl potassium tartrate and 2-furancarboxylic acid in a ratio of 17:27:5 (mass ratio), and the reducing agent liquid (B1) is a solvent. It is a solution in which the above mixture is dissolved in water at a ratio of 49 mg/mL.
  • the buffer solution (C1) is a buffer solution prepared by adding sodium hydroxide to an aqueous solution of HEPES (23.8% by mass) to adjust the pH to 7.6.
  • the mixing ratio of the three components was 1:1:1 (by volume).
  • the concentration of the reducing agent in the autofluorescence inhibitor is 16.3 mg/mL.
  • tissue sections are immersed in pure ethanol for 5 minutes four times, and then washed. ⁇ I dehydrated. Subsequently, an operation of immersion in xylene for 5 minutes was performed four times to carry out penetration. Finally, using a mounting medium ("Enteran New" manufactured by Merck), the tissue sections were mounted to form tissue array slides for observation samples.
  • the tissue sections that have undergone the fixation treatment step were irradiated with predetermined excitation light to emit fluorescence.
  • the tissue section in that state was observed and photographed with a fluorescence microscope ("BX-53" manufactured by Olympus) and a digital camera for microscope ("DP73" manufactured by Olympus).
  • the excitation light was set to 575-600 nm by passing it through an optical filter.
  • the wavelength (nm) range of fluorescence to be observed was also set to 612 to 692 nm by passing through an optical filter.
  • the excitation wavelength conditions during microscopic observation and image acquisition were such that the irradiation energy near the center of the field of view was 25 mW/cm 2 with excitation of 580 nm.
  • the excitation light irradiation time at the time of image acquisition was set to 0.5 seconds, and the image was captured.
  • Example 1 (Observation/measurement process) In Example 1, address C6 of the tissue array slide (LC241m) was observed. Image analysis was performed by ImageJ based on an image (300 ⁇ m ⁇ 200 ⁇ m) taken at 400 times.
  • Example 1 In Example 1 above, except for using AlexaFluor 647 (manufactured by Invitrogen) modified with streptavidin instead of streptavidin-modified PID particles 1 as an immunostaining agent, a human lung cancer tissue array slide ( A tissue sample was prepared from US Biomax, model number LC241m; target substance is ATPase), and a fluorescence image was formed in the same manner. The S/N ratio was calculated in the same manner as in Example 1 above based on the fluorescence image of address C6 of the tissue array slide (LC241m). Results are shown in Table I.
  • Example 2 to 9 (1) Preparation of Tissue Specimen A tissue array slide of a sample for observation was prepared in the same manner as in Example 1 above, except that the autofluorescence inhibitor was changed as follows.
  • the autofluorescence inhibitor consists of phosphomolybdic acid undiluted solution (A2), reducing agent solution (B2-B9), and buffer solution (C2).
  • phosphomolybdic acid stock solution (A2) phosphomolybdic acid is 12-molybdo (VI) phosphate n-hydrate (product name, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the solvent is water, and phosphomolybdic acid content is 7.2 mg/mL.
  • the reducing agent liquids (B2 to B9) are solutions obtained by dissolving each of the reducing agents shown in Table II in water as a solvent at a ratio of 49 mg/mL.
  • the buffer solution (C2) is a buffer solution prepared by adding sodium hydroxide to an aqueous solution of HEPES (23.8% by mass) to adjust the pH to 7.6.
  • the mixing ratio of ascorbic acid, potassium antimonyl tartrate, and 2-furancarboxylic acid in the reducing agent liquid (B6) was 4:6:1 in mass ratio.
  • the total content of the above three reducing agents was 49 mg/mL.
  • the mixing ratio of the phosphomolybdic acid undiluted solution (A2), the reducing agent solutions (B2 to B9), and the buffer solution (C2) is 1:1:1 (by volume). Further, the concentration of phosphomolybdic acid in the autofluorescence inhibitor is about 2.4 mg/mL, and the concentration of the reducing agent is 16.3 mg/mL.
  • Comparative Example 2 A tissue array slide of a sample for observation was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 except that the autofluorescence suppressor was changed to the same autofluorescence suppressor used in Example 2. Fluorescent images were formed as in 2-9. Based on the fluorescence image of address C6 of the tissue array slide (LC241m), the S/N ratio was calculated in the same manner as in Examples 2 to 9 above. Results are shown in Table II.
  • Example 11 A tissue specimen was prepared from a human lung cancer tissue array slide (manufactured by US Biomax, model number LC241m; target substance is ATPase) in the same manner as in Example 1 above, and a fluorescence image was formed in the same manner. Based on the obtained fluorescence images, in Example 11, address C6 (lung cancer cancer cells) of the tissue array slide (LC241m), and in Example 12, address C5 (lung cancer stroma) of the same tissue array slide, In Example 13, address B3 (blood vessel) of the same tissue array slide was observed in the same manner as in Example 1, and the S/N ratio was calculated. Results are shown in Table III.
  • Tissue specimens were prepared from human lung cancer tissue array slides (manufactured by US Biomax, model number LC241m; target substance is ATPase) in the same manner as in Examples 11 to 13, except that no autofluorescence inhibitor was added.
  • a fluorescence image was formed by Based on the obtained fluorescence images, in Comparative Example 11, address C6 (lung cancer cancer cells) of the tissue array slide (LC241m), and in Comparative Example 12, address C5 (lung cancer stroma) of the same tissue array slide, In Comparative Example 13, address B3 (blood vessel) of the same tissue array slide was observed in the same manner as in Example 1, and the S/N ratio was calculated. Results are shown in Table III.
  • the present invention it is possible to provide an image forming method that reduces noise due to autofluorescence and enables accurate measurement of fluorescence intensity derived from a target substance.

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Abstract

本発明の課題は、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度の正確な計測を可能にする画像形成方法を提供することである。本発明の画像形成方法は、蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、標的物質を含む生体組織に自家蛍光抑制剤を添加するとともに、前記標的物質を蛍光発光性物質集積ナノ粒子で標識して、組織標本を作製する工程と、前記組織標本に励起光を照射して蛍光画像を形成する工程とを有する。

Description

画像形成方法
　本発明は、画像形成方法に関し、特に、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度の正確な計測を可能にする画像形成方法に関する。
　病理診断において、生体組織中の特定の標的物質（例えば、特定の細胞に過剰に発現されている物質や、特定の細胞の特異的に発現されている物質等）の量を定量することは、予後の予測やその後の治療計画を決める上で非常に重要な情報となり得る。
　従来、標的物質を標識するための蛍光発光性物質（蛍光色素、量子ドット等）を集積させたナノサイズの粒子、すなわち、蛍光発光性物質集積ナノ粒子（Phosphor Integrated Dots、以下、「ＰＩＤ粒子」ともいう。）を用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。標的物質をＰＩＤ粒子で標識することで、組織標本を撮像した蛍光画像から標的物質の位置を輝度の高い輝点として観察することが可能となる。
　近年、ＰＩＤ粒子を用いた標的物質の量を定量解析する方法が開発されている。しかしながら、ＰＩＤ粒子を用いた場合であっても、生体組織の切片のように自家蛍光によるノイズを多く発する標本を用いた観察時には、Ｓ／Ｎ比（「Ｓ（シグナル）」は標的物質を標識する蛍光発光性物質由来の蛍光の輝度を示し、「Ｎ（ノイズ）」は上記標的物質を標識する蛍光発光性物質以外の物質由来のノイズとなる蛍光の輝度を示す。本明細書において、シグナル及びノイズはそれぞれ上記の意味で用いられる。）の低下を回避するのは困難である。Ｓ／Ｎ比が低下すれば、標的物質の定量的な解析が困難となる。
　一方、Ｓ／Ｎ比を高めるために、自家蛍光抑制剤を用いる技術が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。しかしながら、特許文献２に記載のヘテロポリ酸又はその塩を含む自家蛍光抑制剤を用いた場合、標的物質の種類によっては、蛍光輝度が低下する懸念がある。また、このような自家蛍光抑制剤を用いた場合でも、組織標本の種類によっては、ノイズの低減が十分でない場合がある。
国際公開第２０１２／０２９７５２号 国際公開第２０１８／２０４５８３号
　本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度の正確な計測を可能にする画像形成方法を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決すべく、上記問題の原因等について検討する過程において、蛍光発光性物質集積ナノ粒子と自家蛍光抑制剤を組み合わせて用いることにより、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度を正確に計測することができる画像形成方法を提供することができることを見いだし本発明に至った。すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、
　標的物質を含む生体組織に自家蛍光抑制剤を添加するとともに、前記標的物質を蛍光発光性物質集積ナノ粒子で標識して、組織標本を作製する工程と、
　前記組織標本に励起光を照射して蛍光画像を形成する工程と
　を有する画像形成方法。
　２．前記自家蛍光抑制剤が、蛍光共鳴エネルギー移動型の自家蛍光抑制剤又は酸化型の自家蛍光抑制剤を含むことを特徴とする第１項に記載の画像形成方法。
　３．前記自家蛍光抑制剤が、前記蛍光共鳴エネルギー移動型の自家蛍光抑制剤及び前記酸化型の自家蛍光抑制剤の両方を含む第２項に記載の画像形成方法。
　４．前記酸化型の自家蛍光抑制剤が酸化型の自家蛍光抑制化合物を含有し、前記酸化型の自家蛍光抑制化合物が、酸化性金属化合物である第２項又は第３項に記載の画像形成方法。
　５．前記酸化性金属化合物が、ヘテロポリ酸又はその塩である第４項に記載の画像形成方法。
　６．前記ヘテロポリ酸又はその塩が、下記一般式（１）で表されるヘテロポリ酸又はその塩である第５項に記載の画像形成方法。
　一般式（１）：ＨｎＡｂＤｃＯｙ・ｘＨ２Ｏ
（式中の各記号は、以下の意味を示す。
　Ａは、リン、ホウ素、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、ヒ素、アンチモン、銅、ニッケル、コバルト、鉄、セリウム、トリウム、クロミウム又はこれらの元素の２種以上の複合元素を表す。
　Ｄは、モリブデン、タングステン、バナジウム又はこれらの元素の２種以上の複合元素を表す。
　ｎは、酸性水素の数を表し、１以上である。
　ｂは、０．１～１０の数を表す。
　ｃは、６～１８の数を表す。
　ｘは、水和水のモル数を表す。
　ｙは、ヘテロポリ酸中の酸素の数を表す。）
　７．前記酸化型の自家蛍光抑制剤が、さらに還元剤を含有する第４項から第６項までのいずれか一項に記載の画像形成方法。
　８．前記還元剤が、ヒドロキシ基及びカルボニル基を有する化合物、又は、カルボキシ基若しくはその塩を有する化合物を含む第７項に記載の画像形成方法。
　９．前記還元剤が、アスコルビン酸、酒石酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸から選ばれる少なくとも１種を含む第７項又は第８項に記載の画像形成方法。
　１０．前記生体組織が、間質細胞を有する繊維質組織である第１項から第９項までのいずれか１項に記載の画像形成方法。
　１１．前記繊維質組織が肺組織である第１０項に記載の画像形成方法。
　本発明の上記手段により、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度の正確な計測を可能にする画像形成方法を提供することができる。
　上記のようにヘテロポリ酸のような酸化作用の強い自家蛍光抑制剤を用いた場合、標的物質由来の蛍光輝度の低下を招く場合がある。しかしながら、ＰＩＤ粒子により高められた標的物質由来の蛍光輝度は、このような自家蛍光抑制剤を用いた場合でも殆ど低下することがない。これまで、ＰＩＤ粒子を使用することで酸化作用の強い自家蛍光抑制剤による標的物質由来の蛍光輝度の低下を抑制できることは知られておらず、この効果は本発明者らが見出したものである。
　すなわち、本発明は、ＰＩＤ粒子と自家蛍光抑制剤を組み合わせて用いることで、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度の正確な計測を可能にする画像形成方法を可能としたものである。
　本発明の画像形成方法は、蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、標的物質を含む生体組織に自家蛍光抑制剤を添加するとともに、前記標的物質を蛍光発光性物質集積ナノ粒子で標識して、組織標本を作製する工程と、前記組織標本に励起光を照射して蛍光画像を形成する工程とを有することを特徴とする。この特徴は、下記各実施形態に共通又は対応する技術的特徴である。
　本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記自家蛍光抑制剤が、蛍光共鳴エネルギー移動型の自家蛍光抑制剤又は酸化型の自家蛍光抑制剤を含むことが好ましい。
　本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記自家蛍光抑制剤が、前記蛍光共鳴エネルギー移動型の自家蛍光抑制剤及び前記酸化型の自家蛍光抑制剤の両方を含むことが好ましい。
　本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記酸化型の自家蛍光抑制剤が、酸化型の自家蛍光抑制化合物を含有し、前記酸化型の自家蛍光抑制化合物が、酸化性金属化合物であることが好ましい。さらに、前記酸化性金属化合物が、ヘテロポリ酸又はその塩であることが好ましく、上記一般式（１）で表されるヘテロポリ酸又はその塩であることがより好ましい。
　本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記酸化型の自家蛍光抑制剤が、さらに還元剤を含有することが好ましい。さらに、前記還元剤が、ヒドロキシ基及びカルボニル基を有する化合物、又は、カルボキシ基若しくはその塩を有する化合物を含むことが好ましく、アスコルビン酸、酒石酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸から選ばれる少なくとも１種を含むことがより好ましい。
　本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記生体組織が、間質細胞を有する繊維質組織であることが好ましく、前記繊維質組織が肺組織であることが好ましい。
　以下、本発明とその構成要素及び本発明を実施するための形態・態様について説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
［本発明の画像形成方法］
　本発明の画像形成方法は、蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、以下の（１）及び（２）の工程を有することを特徴とする。
（１）標的物質を含む生体組織に自家蛍光抑制剤を添加するとともに、前記標的物質を蛍光発光性物質集積ナノ粒子で標識して、組織標本を作製する工程（以下、「組織標本作製工程」ともいう。）
（２）前記組織標本に励起光を照射して蛍光画像を形成する工程（以下、「蛍光画像形成工程」ともいう。）
　本発明の画像形成方法により取得した蛍光画像は、例えば、画像処理装置において、画像処理され分析等に用いられる。具体的には、検体として用いた生体組織における標的物質の定量、分布状態の把握等に用いられる。本発明の画像形成方法は、得られる蛍光画像の使用目的に応じて（１）及び（２）の工程以外の工程を有してもよい。以下、本発明の画像形成方法が有する各工程について説明する。
（１）組織標本作製工程
　本発明に係る組織標本作製工程は、標的物質を含む生体組織を準備し、以下の（１－１）の工程及び（１－２）工程により組織標本を作製する工程である。組織標本は、例えば、組織切片として準備される生体組織内の標的物質が蛍光発光性物質で染色され、かつ、生体組織（組織切片）に自家蛍光抑制剤が添加された標本である。
（１－１）標的物質を含む生体組織に自家蛍光抑制剤を添加する工程（以下、「自家蛍光抑制剤添加工程」ともいう。）
（１－２）標的物質を蛍光発光性物質集積ナノ粒子で標識する工程（本明細書において、標的物質をＰＩＤ粒子で標識することと、標的物質をＰＩＤ粒子で染色することは同じ意味に用いる。以下、（１－２）の工程を「染色工程」ともいう。）
　組織標本作製工程において（１－１）及び（１－２）の工程の順番は問わない。ただし、（１－１）において自家蛍光抑制剤を添加後、（１－２）において染色工程における各種処理（後述）を施すと、自家蛍光抑制剤の能力が低下することがある。したがって、本発明の効果発現の観点から、（１－２）の工程後、（１－１）の工程を行うことが好ましい。なお、後述するとおり（１－２）の工程の途中に（１－１）の工程を行ってもよい。さらに、必要に応じて、以下の形態観察染色工程の後に（１－１）の工程を行ってもよい。自家蛍光抑制剤の効果がより顕著に得られる観点から（１－１）の工程は形態観察染色工程の後、後処理工程の前に行うことが特に好ましい。
　組織標本作製工程は、（１－１）及び（１－２）の工程以外の工程を有していてもよい。例えば、（１－１）及び（１－２）の工程の前に、脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程をその順に有してもよく、（１－１）及び（１－２）の工程の後に形態観察染色工程を有してもよい。さらに、組織標本作製工程における最後の工程として、後処理工程を有してもよい。
（標的物質を含む生体組織）
　本発明の画像形成方法が適用される生体組織としては、生体組織であれば特に制限されない。生体組織が、自家蛍光物質を多く含有する組織、例えば、間質細胞を有する繊維質組織である場合に、本発明の効果がより顕著に発揮される。このような、繊維質組織としては、肺組織が挙げられる。本発明で用いる生体組織は、標的物質を含む。
　標的物質とは、主に病理診断の観点からの検出又は定量のために、蛍光発光性物質を用いた免疫染色の対象とするものをいう。
　標的物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原等のバイオマーカーが選択される。例えば、生体組織に発現しているタンパク質（抗原）等の生体物質を標的物質とすることができる。その他にも、ペプチド等のタンパク質より小さな単位や、ＲＮＡ等のバイオマーカーを標的物質としてもよい。また、標的物質は、生体組織中に存在するものであれば、生体固有のものでなくてもよい。例えば、標的物質は、体外から生体内に導入された薬剤等であってもよい。
　典型的な標的物質としては、各種の癌組織の細胞膜等で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
（１－１）自家蛍光抑制剤添加工程
　自家蛍光抑制剤添加工程において、標的物質を含む生体組織（以下、単に「生体組織」ともいう。）に自家蛍光抑制剤を添加する。自家蛍光抑制剤が添加される生体組織は、例えば、組織標本となるサイズに組織切片として準備される。組織切片は、例えば、後述する脱パラフィン処理工程及び賦活化処理工程をその順に経たものが好ましい。
＜自家蛍光抑制剤＞
　本発明に用いる自家蛍光抑制剤は、生体由来の蛍光発光性物質が発する蛍光を抑制する機能（以下、「自家蛍光抑制能」ともいう。）を有するものであれば特に制限されない。自家蛍光抑制能は、典型的には、組織標本において元から存在する生体由来の蛍光発光性物質（補酵素、アミノ酸、タンパク質、細胞内色素物質等、以下「自家蛍光物質」ともいう。）が発する蛍光（いわゆる「自家蛍光」）を抑制する機能である。
　なお、自家蛍光抑制剤は、併せて生体に由来しない蛍光発光を抑制する機能を有してもよい。このような蛍光発光としては、例えば、生体組織に含まれる生体に由来しない蛍光発光性物質やスライドガラス等の器具が発する蛍光が挙げられる。
　本発明に用いる自家蛍光抑制剤は、少なくとも自家蛍光抑制機能を有する化合物（自家蛍光抑制化合物）を含有する。自家蛍光抑制剤は自家蛍光抑制化合物単体であってもよく、当該化合物を含有する組成物であってもよい。自家蛍光抑制剤が組成物である場合、組成物は自家蛍光抑制化合物の少なくとも１種を含有し、自家蛍光抑制化合物以外のその他の成分として、自家蛍光抑制化合物の自家蛍光抑制能を阻害しない成分の適量が適宜使用可能である。その他の成分としては、例えば、溶媒、酸化剤、還元剤、キレート剤、界面活性剤等が挙げられる。
　本発明において、自家蛍光抑制剤としては、蛍光共鳴エネルギー移動型の自家蛍光抑制剤又は酸化型の自家蛍光抑制剤を用いることが好ましく、その両方を用いることがより好ましい。
　蛍光共鳴エネルギー移動型（以下、「ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）型」ともいう）の自家蛍光抑制剤は、ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物を含有する。ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物は、自家蛍光物質と共存する系において、励起光により励起状態となった自家蛍光物質が有するエネルギーを、共鳴を介して受け取ることが可能な化合物である。これにより、励起状態の自家蛍光物質は、概ね蛍光発光することなく基底状態に戻ることができる。また、ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物は、受け取ったエネルギーを、例えば、熱やノイズとならない光として放出する。
　ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物としては、例えば、ポルフィリンが挙げられる。ポルフィリンは、４個のピロール環がα位置で４個のメチン基と交互に結合した大環状化合物とその誘導体の総称である。ポルフィリンには、さらに、環の中心部に金属元素を有する錯体が含まれる。ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物は１種が単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ポルフィリンは、それ自体を自家蛍光抑制剤として用いてもよく、適宜、溶媒に溶解させた組成物（溶液）を自家蛍光抑制剤として用いてもよい。組成物に用いる溶媒は、ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ポルフィリンが有する自家蛍光抑制能を阻害せずに、当該化合物を溶解可能な溶媒が用いられる。溶媒として、具体的には、水等が挙げられる。組成物におけるＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ポルフィリンの含有量は、組成物全量に対する合計含有量として、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの範囲とすることができる。
　上記組成物は、さらに、必要に応じて、ｐＨ調整剤、ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）等を含有してもよい。組成物におけるｐＨは、６．０～８．０の範囲が好ましい。
　酸化型の自家蛍光抑制剤は、酸化型の自家蛍光抑制化合物を含有する。酸化型の自家蛍光抑制化合物は自家蛍光物質に結合することでその自家蛍光を抑制する機能を有する。具体的には、自家蛍光物質の蛍光発光の波長が変換される又は蛍光発光量自体が低減されることにより自家蛍光が抑制される。酸化型の自家蛍光抑制化合物は１種が単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　酸化型の自家蛍光抑制化合物としては、酸化性金属化合物が挙げられ、酸化性金属化合物としてはヘテロポリ酸又はその塩が好ましい。ヘテロポリ酸は、ヘテロ原子を含む金属酸素酸のポリ酸である。また、ヘテロポリ酸は一般的には水和水を含む態様である。ヘテロポリ酸における金属酸素酸が有する金属原子としては、モリブデン、タングステン、バナジウム等が挙げられる。金属原子は１種又は２種以上であってもよい。ヘテロポリ酸におけるヘテロ原子としては、リン、ホウ素、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、ヒ素、アンチモン、銅、ニッケル、コバルト、鉄、セリウム、トリウム、クロミウム等が挙げられる。ヘテロ原子は１種又は２種以上であってもよい。
　ヘテロポリ酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等の１価の金属カチオンとの塩、ニッケル塩、コバルト塩、銅塩、亜鉛塩等の２価の金属カチオンとの塩、鉄塩等の３価の金属カチオンとの塩、第４級アンモニウムカチオン（ＮＲ４＋（Ｒは、例えば、水素原子、メチル基、ブチル基））との塩、第４級ホスホニウムカチオンとの塩等が挙げられる。
　ヘテロポリ酸又はその塩は、特に、アルデヒド固定組織、赤血球、コラーゲン及びエラスチンから選ばれる自家蛍光物質に結合し、その自家発光を阻害する作用を有する。
　ヘテロポリ酸として、具体的には、下記一般式（１）で示されるヘテロポリ酸（以下、ヘテロポリ酸（１）ともいう。）が挙げられる。
　一般式（１）：ＨｎＡｂＤｃＯｙ・ｘＨ２Ｏ
　式中の各記号は、以下の意味を示す。
　Ａは、リン、ホウ素、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、ヒ素、アンチモン、銅、ニッケル、コバルト、鉄、セリウム、トリウム、クロミウム又はこれらの元素の２種以上の複合元素を表す。
　Ｄは、モリブデン、タングステン、バナジウム又はこれらの元素の２種以上の複合元素を表す。
　ｎは、酸性水素の数を表し、１以上である。ｎは、２～１０の範囲にあることが好ましい。
　ｂは、０．１～１０の数を表す。ｂは、０．５～５の範囲が好ましく、０．５～２．５がより好ましい。ｂは、所定の態様では、１が特に好ましい。
　ｃは、６～１８の数を表す。ｃは、９～１５の範囲が好ましく、１０～１２がより好ましい。ｃは、所定の態様では、１２が特に好ましい。
　ｘは、水和水のモル数を表す。ｘは、典型的には０～４０の範囲内である。
　ｙは、ヘテロポリ酸中の酸素の数を表す。ｙは、典型的には１０～７０の範囲内である。
　ヘテロポリ酸（１）の塩としては、一般式（１）中の酸性水素が、上に例示したカチオンに置き換わった化合物が挙げられる。ｎの数は、置き換わったカチオンの価数に応じて適宜調整される。
　ヘテロポリ酸（１）として、具体的には、リンモリブデン酸（Ｈ３［ＰＭｏ１２Ｏ４０］・ｘＨ２Ｏ（ｘ＝０～４０））、リンタングステン酸（Ｈ３［ＰＷ１２Ｏ４０］・ｘＨ２Ｏ（ｘ＝０～４０））、ケイモリブデン酸（Ｈ４［ＳｉＭｏ１２Ｏ４０］・ｘＨ２Ｏ（ｘ＝０～４０））、ケイタングステン酸（Ｈ４［ＳｉＷ１２Ｏ４０］・ｘＨ２Ｏ（ｘ＝０～４０））、リンタングストモリブデン酸（Ｈ３［ＰＷ１２－ＺＭｏＺＯ４０］・ｘＨ２Ｏ（０＜Ｚ＜１２，ｘ＝０～４０））、リンバナドモリブデン酸（Ｈ１５－Ｚ［ＰＶ１２－ＺＭｏＺＯ４０］・ｘＨ２Ｏ（６＜Ｚ＜１２，ｘ＝０～４０））等が挙げられる。ヘテロポリ酸（１）としては、リンモリブデン酸が特に好ましい。
　上記のとおり、酸化型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ヘテロポリ酸又はその塩は、それ自体を自家蛍光抑制剤として用いてもよく、適宜、溶媒に溶解させた組成物（溶液）を自家蛍光抑制剤として用いてもよい。組成物に用いる溶媒は、酸化型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ヘテロポリ酸又はその塩が有する自家蛍光抑制能を阻害せずに、当該化合物を溶解可能な溶媒が用いられる。溶媒として、具体的には、水、エタノール等が挙げられる。
　組成物における酸化型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ヘテロポリ酸又はその塩の含有量は、組成物全量に対する合計含有量として、例えば、０．１～１０ｍｇ／ｍＬの範囲とすることができる。組成物は、さらに、必要に応じて、還元剤、ｐＨ調整剤、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ等を含有してもよい。ｐＨ調整剤、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ等は緩衝剤として用いられる。組成物におけるｐＨは、６．０～８．０の範囲が好ましい。
　組成物としての酸化型の自家蛍光抑制剤は、酸化型の自家蛍光抑制化合物に加えて還元剤を含有することが好ましい。酸化型の自家蛍光抑制化合物と還元剤を組み合わせることによって、ＰＩＤ粒子への影響を抑えつつ、ノイズとなる自家蛍光を効率よく抑制することができる。また、還元剤として、最適な還元力を有する還元剤を選択することによってより高い効果が得られる。
　還元剤としては、公知の還元剤が特に制限なく使用できる。還元剤として、具体的には、ヒドロキシ基及びカルボニル基を有する化合物、カルボキシ基若しくはその塩を有する化合物等の有機還元剤、及び、金属化合物、金属錯体、金属ナノ粒子、無機酸等の無機還元剤が挙げられ、有機還元剤が好ましい。
　無機還元剤としては、塩化スズ（ＩＩ）、シアノ水素化ホウ酸ナトリウム、硫酸、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドラジン等が挙げられる。
　有機還元剤のうちヒドロキシ基及びカルボニル基を有する化合物としては、アルコルビン酸、エリソルビン酸等が挙げられる。カルボキシ基若しくはその塩を有する化合物としては、酒石酸、酒石酸アンチモニルカリウム、２－フランカルボン酸、ギ酸、シュウ酸、３，４，５－トリヒドロキシ安息香酸等が挙げられる。
　還元剤は、アスコルビン酸、酒石酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸から選ばれる少なくとも１種を含むことがより好ましく、アスコルビン酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸の３種を含むことがより好ましい。その場合のアスコルビン酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸の混合割合は、例えば、アスコルビン酸１００質量部に対して、酒石酸アンチモニルカリウム１００～３００質量部、及び２－フランカルボン酸１０～５０質量部程度が挙げられる。
　還元剤の種類は、組み合わせる酸化型の自家蛍光抑制化合物の種類に応じて適宜選択される。当該組合せとして、例えば、酸化型の自家蛍光抑制剤として、ヘテロポリ酸又はその塩を用い、還元剤として、ヒドロキシ基及びカルボニル基を有する化合物、又は、カルボキシ基若しくはその塩を有する化合物を用いる組合せが挙げられる。この場合、還元剤は、アスコルビン酸、酒石酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸から選ばれる少なくとも１種を含むことがより好ましく、アスコルビン酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸の３種を含むことがより好まく、当該３種の混合割合として、上記同様の混合割合が挙げられる。
　このように、還元剤を適宜選択することにより、還元剤が、酸化型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ヘテロポリ酸又はその塩を適度に還元することで、得られる酸化型の自家蛍光抑制剤に自家蛍光を十分に抑制する機能を付与することができる。またＰＩＤ粒子へ与える影響も小さく、画像評価した際のＳ／Ｎ比が非常に高い結果となる。
　酸化型の自家蛍光抑制剤は、酸化型の自家蛍光抑制化合物、例えば、ヘテロポリ酸又はその塩を含有する組成物として市販されているものを用いてもよい。市販品としては、例えば、複数のコンポーネントからなるキットであり、使用時にコンポーネントを混合してヘテロポリ酸（１）又はその塩を含む溶液（組成物）とするものとして、例えば、ＴｒｕｅＶＩＥＷ（Ｖｅｃｔｏｒ社製；リンモリブデン酸溶液用キット；使用時のリンモリブデン酸溶液中のリンモリブデン酸濃度は、約１．５～２．４ｍｇ／ｍＬ）等が挙げられる。
　なお、ＴｒｕｅＶＩＥＷは、リンモリブデン酸を所定の割合で溶媒に溶解させたリンモリブデン酸原液、還元剤を所定の割合で溶媒に溶解させた還元剤液及び緩衝液からなる。
　また、ＴｒｕｅＶＩＥＷと同様にして、例えば、ヘテロポリ酸又はその塩を溶媒に溶解させたヘテロポリ酸又はその塩の原液（Ａ）、還元剤を所定の割合で溶媒に溶解させた還元剤液（Ｂ）及び緩衝液（Ｃ）を別々に調製し、使用時にこれらを混合して、自家蛍光抑制剤（組成物）として用いることが好ましい。
　ヘテロポリ酸又はその塩の原液（Ａ）におけるヘテロポリ酸又はその塩の含有量、及び還元剤液（Ｂ）における還元剤の含有量は、例えば、ヘテロポリ酸又はその塩の原液（Ａ）、還元剤液（Ｂ）、緩衝液（Ｃ）を予め決められた混合割合、例えば、１：１：１（体積）として自家蛍光抑制剤を調製するとした場合に、得られる自家蛍光抑制剤における各成分の含有量が、使用に際して好適な含有量となるように調整すればよい。自家蛍光抑制剤におけるヘテロポリ酸又はその塩の含有量は、上記の範囲、例えば、０．１～１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、還元剤の含有量は、例えば、１．６～１７ｍｇ／ｍＬの範囲とすることができる。
　具体的には、ヘテロポリ酸又はその塩の原液（Ａ）、還元剤液（Ｂ）、緩衝液（Ｃ）を、例えば、１：１：１（体積）で混合して自家蛍光抑制剤を調製する場合には、ヘテロポリ酸又はその塩の原液（Ａ）におけるヘテロポリ酸又はその塩の含有量は、０．３～３０ｍｇ／ｍＬが好ましい。還元剤液（Ｂ）における還元剤の含有量は、５～５０ｍｇ／ｍＬが好ましい。緩衝液（Ｃ）としては、例えば、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ等の緩衝剤を１０～３０質量％含有する水溶液に、ｐＨ調整剤を添加して、ｐＨ７．０～８．０となるように調整した緩衝液が好ましい。
　なお、自家蛍光抑制剤の調製に際して、ヘテロポリ酸又はその塩の原液（Ａ）、還元剤液（Ｂ）、緩衝液（Ｃ）の混合割合は、例えば、１：０．５～２：０．５～２（体積）の範囲で調整してもよい。その場合、選択した混合割合に合わせて、自家蛍光抑制剤におけるヘテロポリ酸又はその塩の含有量及び還元剤の含有量が上記範囲となるように、ヘテロポリ酸又はその塩の原液（Ａ）におけるヘテロポリ酸又はその塩の含有量及び、還元剤液（Ｂ）における還元剤の含有量を適宜調整すればよい。
＜添加方法＞
　生体組織への自家蛍光抑制剤の添加は、例えば、組織標本となるサイズに組織切片として準備された生体組織に対して行う。本発明の画像形成方法において、組織標本作製工程後に行われる蛍光画像形成工程は、典型的には、顕微鏡画像取得装置を用いて行う。したがって、自家蛍光抑制剤の添加が行なわれる組織切片は、顕微鏡画像取得装置に適応した形態、具体的には、スライドガラス上に準備される。
　組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片等の切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製され、スライドガラス上に載置されたものを用いることができる。
　このようにスライドガラス上に載置された切片に対して、例えば、液状に準備された自家蛍光抑制剤を添加する。なお、切片は、自家蛍光抑制剤が添加される前に以下の脱パラフィン処理工程及び賦活化処理工程がその順に施されたものが好ましい。
（脱パラフィン処理工程）
　キシレンを入れた容器に、スライドガラス上に載置された切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いで、エタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　さらに、水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
（賦活化処理工程）
　公知の方法に倣い、標的物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。
　ｐＨ条件は用いる組織切片に応じて、２５℃においてｐＨ２．０～１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０～８．０の範囲内で行うが、特殊な組織切片では例えばｐＨ３．０でも行うことができる。
　加熱機器としては、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃の範囲内、時間は５～３０分の範囲内で行うことができる。
　次いで、ＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３～３０分の範囲内であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
（自家蛍光抑制剤の添加条件）
　自家蛍光抑制化合物自体が液状の場合はそのままの状態で切片に添加可能である。自家蛍光抑制化合物が固体である場合、例えば、上記含有量で自家蛍光抑制化合物を含有する液状の組成物（溶液）に調製され、切片に添加される。
　自家蛍光抑制剤の添加量としては、切片を覆うことができればよく、スライドガラス１枚に対して２０μＬ～１５０μＬの範囲内とすることが好ましい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。静置時間は、３～５分の範囲内であることが好ましい。なお、切片をスライドガラス毎、自家蛍光抑制剤に浸漬させてもよい。
　本発明においてＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制剤と酸化型の自家蛍光抑制剤の両方を用いる場合、両者の使用割合は、ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制化合物と酸化型の自家蛍光抑制化合物との割合として、質量比で、１：１０００～１０００：１の範囲が好ましい。
　ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制剤と酸化型の自家蛍光抑制剤を添加する順番は特に制限されない。また、ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制剤の添加と自家蛍光抑制剤の添加の工程の間に、以下の染色工程の一部又は全部が行なわれてもよい。各自家蛍光抑制剤の添加量及び、温度、静置時間は、それぞれ上記と同様とすることができる。なお、ＦＲＥＴ型の自家蛍光抑制剤と酸化型の自家蛍光抑制剤を混合後、同時に添加してもよい。
　また、自家蛍光抑制剤を添加した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）により切片を洗浄することが好ましい。
（１－２）染色工程
　染色工程は、生体組織、例えば、組織切片に含まれる標的物質をＰＩＤ粒子で染色する工程である。
（ＰＩＤ粒子（蛍光発光性物質集積ナノ粒子））
　ＰＩＤ粒子は、蛍光発光性物質を集積してナノサイズに粒子化したものである。このようなＰＩＤ粒子を用いて標的物質を染色することで、上記のとおり標的物質を標識する検出感度を高めることができる。
　ＰＩＤ粒子は、具体的には、有機物又は無機物で構成される粒子を母体とし、蛍光発光性物質がその中に内包されている及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
＜蛍光発光性物質＞
　本発明において、蛍光発光性物質とは、外部からのＸ線、紫外線、可視光線、又は赤外線等の励起光の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において蛍光を発光する物質をいう。ＰＩＤ粒子に用いられる蛍光発光性物質としては、２００～７００ｎｍの範囲内の波長の光（紫外光から近赤外光）により励起されたときに、４００～９００ｎｍの範囲内の波長の光（可視光から近赤外光）の発光を示すことが好ましい。また、母体と蛍光発光性物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基又は部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
　蛍光発光性物質は、例えば、有機蛍光発光性物質（蛍光色素）および無機蛍光発光性物質（量子ドット）に大別される。
〔蛍光色素〕
　蛍光色素の例としては、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、スクアリリウム系色素、クマリン系色素、ピレン系色素、シアニン系色素、ペリレン系色素、オキサジン系色素、芳香環系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素等の蛍光色素を例示することができる。また、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素、ＮＢＤ（登録商標）系色素、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）系色素等を用いることができる。
　具体的には、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，７，７’－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５１４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
〔量子ドット〕
　量子ドットとしては、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物又はＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅ等が挙げられる。
　上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。シェル付きの量子ドットとしては、例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ２、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
　量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
（ＰＩＤ粒子の製造）
　ＰＩＤ粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。具体的には、有機物又は無機物を母体とする粒子に蛍光発光性物質を内包する及び／又は表面に蛍光発光性物質を固定化する製造方法を用いることができる。
　母体を構成する有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂等、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）等、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。母体を構成する無機物としては、シリカ、ガラス等を例示することができる。
　以下、ＰＩＤ粒子の製造方法について、蛍光発光性物質が蛍光色素の場合と量子ドットの場合に分けて説明する。
〔蛍光色素の場合〕
　蛍光色素を用いたＰＩＤ粒子の製造方法として、蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定した、直径がナノメートルオーダーの樹脂粒子を形成させる方法を挙げることができる。このＰＩＤ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、ＰＩＤ粒子の母体をなす樹脂（熱可塑性樹脂又は熱硬化性樹脂）を合成するための（コ）モノマーを（共）重合させながら、蛍光色素を添加し、得られる（共）重合体の内部または表面に当該蛍光色素を取り込ませる方法を用いることができる。
　蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、例えば、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光色素の含浸法を用いて作製することができる。
　一方で、蛍光色素をシリカからなる母体の内部または表面に固定化したＰＩＤ粒子を製造することもできる。蛍光色素を内包したシリカナノ粒子は、例えば、ラングミュア８巻２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光色素を用いることでシリカを母体とする種々のＰＩＤ粒子を合成することができる。
　なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
〔量子ドットの場合〕
　量子ドットを用いたＰＩＤ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。例えば、量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー３３巻５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
　量子ドットを外包したシリカナノ粒子は、例えば、ケミカル・コミュニケーション２６７０ページ（２００９）に記載されているＣｄＳｅ／ＺｎＳを５－アミノ－１－ペンタノールとＡＰＳでキャッピングした粒子を表面に集積したシリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
　量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、例えば、ネイチャー　バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
　また、ＰＩＤ粒子の製造方法として、シリカナノ粒子をシランカップリング剤で処理して末端をアミノ化し、カルボキシ基末端を有する量子ドットをシリカビーズの表面にアミド結合により結合することで集積し、ＰＩＤ粒子とする方法も挙げられる。
　さらに別のＰＩＤ粒子の製造方法として、逆ミセル法と、ガラスの前駆体として分子の末端に量子ドットへの吸着性がよい有機官能基を有する有機アルコキシシランとアルコキシドの混合物を用いたゾル－ゲル法とを組み合わせることにより、量子ドットを内部に分散固定したガラス状の粒子を形成し、ＰＩＤ粒子とする例が挙げられる。
　さらに別のＰＩＤ粒子の製造方法として、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在化で、アミノ基末端の量子ドットと、カルボキシ基末端の量子ドットを混合し、量子ドット間を、アミド結合を介して結合することで量子ドットを集積し、ＰＩＤ粒子を製造する例が挙げられる。
　なお、量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
＜ＰＩＤ粒子の粒径＞
　ＰＩＤ粒子の平均粒径は特に限定されないが、２０～２００ｎｍ程度のものが好適である。平均粒径が上記の上限より大きいものは標的物質にアクセスしにくい傾向にある。平均粒径が上記の下限より小さい場合、ＰＩＤ粒子に含まれる蛍光発光性物質量が少なく、輝度値が低くなる傾向にある。そのため、発する蛍光がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞のノイズ蛍光）に埋もれてしまうことから、定量的評価しにくい。ＰＩＤ粒子の平均粒径はより好ましくは、４０～１５０ｎｍの範囲内である。
　また、ＰＩＤ粒子の粒径の変動係数が１５％以下であることが好ましい。ＰＩＤ粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、１粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
　ＰＩＤ粒子の平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
（染色方法）
　染色工程では、上に説明したＰＩＤ粒子を用いて標的物質を染色する。標的物質をＰＩＤ粒子で染色する方法としては、免疫染色法が好ましい。免疫染色法では、例えば、ＰＩＤ粒子を抗体に結合した結合体（免疫染色剤）を作製し、得られた免疫染色剤を、抗原抗体反応を介して標的物質に結合することで標的物質を染色する。
　免疫染色法には様々な手法があり、標的物質としてのタンパク質を染色することができれば、特に限定されるものではない。代表的な手法には次のような手法が挙げられ、各手法に応じた免疫染色剤が以下のとおり用いられる。
〔１次抗体法〕
　免疫染色剤として、ＰＩＤ粒子と１次抗体を連結した蛍光標識１次抗体を作製する。染色は、得られた免疫染色剤（蛍光標識１次抗体）で標的物質を直接的に蛍光標識することで行われる。
〔２次抗体法〕
　１次抗体を準備する。また、免疫染色剤として、ＰＩＤ粒子と２次抗体（１次抗体に対する抗体）を連結した蛍光標識２次抗体を作製する。染色は、標的物質に１次抗体を反応させた後、その１次抗体に免疫染色剤（蛍光標識２次抗体）を反応させることで、標的物質を間接的に蛍光標識することで行われる。
〔アビジン－ビオチン併用１次抗体法〕
　１次抗体とビオチンを連結したビオチン修飾１次抗体、及び免疫染色剤として、ＰＩＤ粒子とアビジン又はストレプトアビジンを連結したアビジン修飾ＰＩＤ粒子を作製する。染色は、標的物質にビオチン修飾１次抗体を反応させた後、さらに免疫染色剤（アビジン修飾ＰＩＤ粒子）を反応させて、アビジン－ビオチン反応を利用して標的物質を間接的に蛍光標識することで行われる。
〔アビジン－ビオチン併用２次抗体法〕
　１次抗体を準備する。また、２次抗体とビオチンを連結したビオチン修飾２次抗体、及び免疫染色剤として、ＰＩＤ粒子とアビジン又はストレプトアビジンを連結したアビジン修飾ＰＩＤ粒子を作製する。染色は、標的物質に１次抗体を反応させ、次いでビオチン修飾２次抗体を反応させた後、さらに免疫染色剤（アビジン修飾ＰＩＤ粒子）を反応させて、アビジン－ビオチン反応を利用して標的物質を間接的に蛍光標識することで行われる。
　なお、上記のアビジン－ビオチン併用１次抗体法又はアビジン－ビオチン併用２次抗体法において、ビオチン及びアビジン（又はストレプトアビジン）の代わりに、ハプテン（免疫原性を有さないが抗原性を示し抗体と反応しうる比較的分子量の低い物質）及び抗ハプテン抗体、例えばジコキシゲニン及び抗ジコキシゲニン抗体、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）及び抗ＦＩＴＣ抗体、さらには同様の特異的な反応性を有するその他の物質の組み合わせを利用することもできる。
〔試薬〕
　上記各種免疫染色法において染色に用いる各種抗体、修飾抗体、免疫染色剤は、以下のとおり準備又は作製される。免疫染色法には、このような抗体、修飾抗体又は免疫染色剤が、それぞれ適当な溶媒に溶解され、必要に応じてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ））等のブロッキング剤が添加された緩衝液等の溶液として使用される。以下、当該溶液を総称して「試薬」という。試薬は、公知の方法にしたがって作製することが可能であり、市販品として入手することもできる。
＜抗体及び修飾抗体＞
　上記各種免疫染色法における１次抗体には、標的物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。例えば、ＨＥＲ２を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
　上記各種免疫染色法における２次抗体には、１次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
　１次抗体及び２次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等から選択すればよい。
　上記において、ビオチン修飾された１次抗体又は２次抗体、また、これらの変形例において、用いるハプテン、ジコキシゲニン又はＦＩＴＣ修飾された１次抗体又は２次抗体の製造は、従来公知の方法で行うことができる。１次抗体又は２次抗体とビオチン、ハプテン、ジコキシゲニン又はＦＩＴＣとの間には必要に応じてリンカー分子が導入されてもよい。
＜免疫染色剤＞
　上記の１次抗体法又は２次抗体法において、用いる免疫染色剤は、１次抗体又は２次抗体とＰＩＤ粒子を適宜結合させて得られる。１次抗体又は２次抗体とＰＩＤ粒子との間の結合は、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着等が挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
　上記のアビジン－ビオチン併用１次抗体法又はアビジン－ビオチン併用２次抗体法において、用いる免疫染色剤は、ＰＩＤ粒子とアビジン又はストレプトアビジンを連結したアビジン修飾ＰＩＤ粒子である。また、これらの変形例において、用いる免疫染色剤は、抗ハプテン抗体、抗ジコキシゲニン抗体又は抗ＦＩＴＣ抗体修飾されたＰＩＤ粒子である。アビジン、抗ハプテン抗体、抗ジコキシゲニン抗体又は抗ＦＩＴＣ抗体によるＰＩＤ粒子の修飾は、公知の方法で行うことができる。例えば、アビジン、抗ハプテン抗体、抗ジコキシゲニン抗体又は抗ＦＩＴＣ抗体とＰＩＤ粒子の母体の両方に互いに反応可能な官能基を導入して反応させることで製造可能である。
〔免疫染色方法〕
　免疫染色法は、上述したような各種の手法のそれぞれにとって標準的な手順及び処理条件にしたがって行えばよい。
　一般的には、標的物質を含む組織切片を載置したスライドガラスを、それぞれの免疫染色法に応じた１種類又は２種類以上の試薬に、上に説明した順に、適切な温度及び時間条件の下、浸漬すればよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、試薬ごとに３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　各免疫染色法において、免疫染色剤を含む試薬を用いた処理は、最後に行われる。免疫染色剤を含む試薬を用いた処理の後、免疫染色された組織切片が載置されたスライドガラスを好ましくはＰＢＳ等の洗浄液に浸漬して洗浄する。通常、免疫染色剤を含む試薬での処理後に行われるＰＢＳを用いた洗浄処理の温度は室温であり、時間は３～３０分である。必要により、浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を滴下することが好ましい。
　なお、上記のとおり染色工程は、自家蛍光抑制剤添加工程の前に行うことが好ましい。染色工程を自家蛍光抑制剤添加工程の前に行う場合、生体組織、例えば、組織切片は、上記脱パラフィン処理工程及び賦活化処理工程がその順に施されたものが好ましい。また、自家蛍光抑制剤添加工程は、染色工程の途中に行ってもよい。例えば、上記アビジン－ビオチン併用２次抗体法の場合には、標的物質に１次抗体を反応させた後や、その後、ビオチン修飾２次抗体を反応させた後、さらに、アビジン修飾ＰＩＤ粒を反応させた後に、それぞれ自家蛍光抑制剤を添加する工程を設けてもよい。
（形態観察染色）
　組織標本作製工程においては、（１－２）の染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器等の形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行ってもよい。形態観察染色工程は、常法にしたがって行うことができる。
　組織標本の形態観察に関しては、細胞質、間質、各種線維、赤血球、角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオシンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核、石灰部、軟骨組織、細菌、粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている。なお、これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）として知られている。
　組織標本作製工程が形態観察染色工程を有する場合、形態観察染色工程は、（１－２）の染色工程の後に行ってもよく、染色工程の前に行ってもよい。また、組織標本作製工程が形態観察染色工程を有する場合、（１－１）の自家蛍光抑制剤添加工程は、形態観察染色工程の後に行ってもよい。具体的には、ヘマトキシリン染色を行った後や、エオシン染色も行う場合には、エオシン染色を行った後に、自家蛍光抑制剤を添加する。形態観察染色工程を行う場合、自家蛍光抑制剤添加工程は、形態観察染色工程の後、後処理工程の前に行うのが好ましい。
（後処理工程）
　組織標本作製工程の最後に、組織標本は、次の（２）の蛍光画像形成工程における観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入等の後処理を施されることが好ましい。
　固定化・脱水処理は、組織標本を固定化処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤）に浸漬することで行われる。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレン等）に浸漬することで行われる。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬することで行われる。
　これらの処理を行う上での条件、例えば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　以上の各工程を経て、（２）の蛍光画像形成工程に供される組織標本が作製される。すなわち、本発明の画像形成方法においては、（１）で作製された組織標本は、次いで、（２）の蛍光画像形成工程に供される。
（２）蛍光画像形成工程
　蛍光画像形成工程では、（１）で作製された組織標本に励起光を照射して蛍光画像を形成する工程である。取得した蛍光画像は、例えば、画像処理装置において、画像処理され分析等に用いられる。蛍光画像の形成は、従来公知の方法で行うことができる。蛍光画像の形成は、例えば、以下の顕微鏡画像取得装置を用いて行う。
（顕微鏡画像取得装置）
　顕微鏡画像取得装置は、（１）で作製された組織標本に励起光を照射して、標的物質を蛍光標識したＰＩＤ粒子中の蛍光発光性物質から発せられる蛍光に基づく蛍光画像を取得する装置である。取得した蛍光画像は、例えば、画像処理装置において、画像処理及び分析工程等が行われる。
　顕微鏡画像取得装置と画像処理装置は、ケーブル等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されている。顕微鏡画像取得装置と画像処理装置との接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置と画像処理装置はＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ　Ａｒｅａ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
　顕微鏡画像取得装置は、典型的には、公知のカメラ付き蛍光顕微鏡であり、上記（１）で作製された組織標本（スライドガラス上の組織切片に（１－１）及び（１－２）の工程を施した組織標本）をスライド固定ステージ上に載置し、その蛍光顕微鏡画像を取得し、画像処理装置に送信するものである。
　顕微鏡画像取得装置は、例えば、照射手段、結像手段、撮像手段及び通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、励起光源、光学フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライドガラス上の組織標本に励起光を照射する。
　励起光源としては、上記した波長の光を発することが可能な光源が挙げられ、励起光は、例えば光学フィルターを通すことで波長５７５～６００ｎｍの範囲内の励起光であることが好ましい。また、観察する蛍光の波長の範囲についても、光学フィルターを通すことで波長６１２～６９２ｎｍの範囲内に設定することが好ましい。
　結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ）センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して、蛍光画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。
　通信Ｉ／Ｆは、生成された蛍光画像の画像データを画像処理装置に送信する。顕微鏡画像取得装置では、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
　顕微鏡画像取得装置として使用される公知のカメラ付き蛍光顕微鏡は、特に限定されるものではなく、公知の任意の顕微鏡（例えば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡等）にカメラを設置したカメラ付き蛍光顕微鏡を用いることができる。例えば、蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ－５３」）及び顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）等を用いることが好ましい。
　なお、顕微鏡画像取得装置としては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織標本（組織切片）の全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２－５１４３１９号公報参照）等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織標本（組織切片）の全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データとして取得することができる。
　画像処理装置は、顕微鏡画像取得装置から送信された蛍光画像を解析することにより、観察対象の組織切片における細胞ごとの合焦位置を特定する。
　なお、画像処理装置による画像処理等については、例えば、国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレットや国際公開ＷＯ２０１３／１４７０８１号パンフレット等の記載事項及びその他の一般的な技術的事項に準じた適切なものとし、ここではその記載を省略する。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、特記しない限り、操作は室温（２５℃）で行われた。また、特記しない限り、「％」及び「部」は、それぞれ、「質量％」及び「質量部」を意味する。
［実施例１］
（１）組織標本の作製
（標的物質を含む生体組織）
　標的物質を含む生体組織として、ヒトの肺癌の組織アレイスライド（ＵＳ　Ｂｉｏｍａｘ社製、型番ＬＣ２４１ｍ；標的物質はＡＴＰａｓｅ）を用いた。
（脱パラフィン処理工程）
　組織アレイスライドを１５分間６０℃に加熱処理をした後に、キシレンに５分間浸漬させることを３回繰り返し、次に、脱水エタノールに５分間浸漬させることを３回繰り返すことで脱パラフィン処理した。
（賦活化処理工程）
　脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。
（１－２）染色（免疫染色）工程
　標的物質の染色は、アビジン－ビオチン併用２次抗体法で行った。試薬として、１次抗体、ビオチン修飾２次抗体、免疫染色剤（アビジン修飾ＰＩＤ粒子）をそれぞれ含有する溶液を以下のとおり調製した。
（１次抗体溶液の作製）
　ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、Ａｂｃａｍ社製「抗ＡＴＰａｓｅウサギモノクローナル抗体」を０．０５ｎＭに調整し、１次抗体溶液とした。
（ビオチン修飾２次抗体溶液の作製）
　５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。該溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが３０オングストロームであるリンカー試薬「（＋）－Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ６‐ＮＨ‐Ｍａｌ」（ＰｕｒｅＰＥＧ社製，製品番号２４６１００６－２５０）を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を用いて０．４ｍＭとなるように調整した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。
　この反応溶液を脱塩カラム「ＺｅｂａＤｅｓａｌｔＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ」（サーモサイエンティフィック社製，Ｃａｔ．＃８９８８２）に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ－７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、さらに１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで６μｇ／ｍＬに希釈した。該溶液をビオチン修飾２次抗体の溶液とした。
（アビジン修飾ＰＩＤ粒子溶液の作製）
＜ＰＩＤ粒子１の作製＞
　テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ；登録商標）系色素（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１；励起波長５９５ｎｍ、発光波長６１５ｎｍ；シグマアルドリッチ社）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂（ニカラックＭＸ－０３５；日本カーバイド工業株式会社）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間撹拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に含まれるＰＩＤ粒子１を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿したＰＩＤ粒子１をエタノールおよび水で洗浄した。得られたＰＩＤ粒子１の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒子径を測定したところ、平均粒子径は１３１ｎｍであった。
＜ストレプトアビジン修飾ＰＩＤ粒子１の作製＞
　ＰＩＤ粒子１の０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ－３１５０；信越化学工業株式会社）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。次いで、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて表面アミノ化処理を行なった粒子を３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ；サーモサイエンティフィック社）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾されたＰＩＤ粒子１（マレイミド修飾ＰＩＤ粒子１）を得た。
　一方、Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いて、ストレプトアビジン（和光純薬工業株式会社）をチオール基付加処理した後、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、マレイミド修飾ＰＩＤ粒子に結合可能である、チオール基が付加されたストレプトアビジン溶液を得た。
　マレイミド修飾ＰＩＤ粒子１とチオール基を付加したストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。その後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた混合液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応のストレプトアビジンなどを除去し、ストレプトアビジン修飾ＰＩＤ粒子１を得た。
＜ストレプトアビジン修飾ＰＩＤ粒子１溶液の作製＞
　上記で得られたストレプトアビジン修飾ＰＩＤ粒子１は、超音波分散処理をされた後に、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳにより希釈して０．０２ｎＭに調整された。
（１次反応）
　上記で得られた１次抗体溶液を、上記賦活化処理工程が施された後の組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。
（２次反応）
　１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、上記で得られたビオチン修飾２次抗体の溶液と室温で３０分間反応させた。
（蛍光標識処理）
　２次反応を行った組織アレイスライドに対して、上記で得られたストレプトアビジン修飾ＰＩＤ粒子１の溶液を、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９～７．４）、室温の条件下で３時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。
（形態観察染色工程）
　免疫染色後、ヘマトキシリン染色を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。
（１－１）自家蛍光抑制剤添加工程
　自家蛍光抑制剤として、ＴｒｕｅＶＩＥＷ（Ｖｅｃｔｏｒ社製；リンモリブデン酸溶液用キット）を用いた。ＴｒｕｅＶＩＥＷは３種のコンポーネントからなるキットであり、使用時にコンポーネントを混合して濃度約２．４ｍｇ／ｍＬのリンモリブデン酸溶液（以下、当該溶液を「ＴｒｕｅＶＩＥＷ試薬」という）として用いた。上記形態観察染色工程を終えた組織切片をＰＢＳで洗浄した後、ＴｒｕｅＶＩＥＷ試薬に浸漬し、室温で３分間反応させた。反応後、組織切片をＰＢＳで５分洗浄し、その後、純水で５分洗浄した。
　なお、ＴｒｕｅＶＩＥＷの３種のコンポーネントは、リンモリブデン酸原液（Ａ１）、還元剤液（Ｂ１）、緩衝液（Ｃ１）からなる。リンモリブデン酸原液（Ａ１）における、溶媒は水であり、リンモリブデン酸の含有量は７ｍｇ／ｍＬである。還元剤液（Ｂ１）における還元剤は、アスコルビン酸、酒石酸アンチモニルカリウム及び２－フランカルボン酸の１７：２７：５（質量比）の混合物であり、還元剤液（Ｂ１）は、溶媒である水に、４９ｍｇ／ｍＬの割合で上記混合物が溶解した溶液である。緩衝液（Ｃ１）は、ＨＥＰＥＳ（２３．８質量％）の水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを７．６に調整した緩衝液である。なお、３種のコンポーネントの混合割合は、１：１：１（体積）である。また、自家蛍光抑制剤における還元剤の濃度は１６．３ｍｇ／ｍＬである。
（固定化処理工程）
　上記脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、免疫染色工程、形態観察染色工程、及び自家蛍光抑制剤添加工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（メルク社製「エンテランニュー」）を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。
（２）蛍光画像形成工程
　固定化処理工程を終えた組織切片に対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ－５３」）、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）により観察及び撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで５７５～６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターを通すことで６１２～６９２ｎｍに設定した。
　顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが２５ｍＷ／ｃｍ２となるようにした。画像取得時の励起光照射時間は、０．５秒に設定して撮像した。
（観察・計測工程）
　実施例１では、組織アレイスライド（ＬＣ２４１ｍ）のＣ６番地を観察した。４００倍で撮像した画像（３００μｍ×２００μｍ）をもとにＩｍａｇｅＪにより画像解析を実施した。上記ＰＩＤ粒子１を用いて免疫染色された標的物質（ＡＴＰａｓｅ）のシグナルは、画像全体に対して、“蛍光プローブ蛍光強度＝（画面全体の信号値の積算値）－（自家蛍光の１ピクセル平均値×ピクセル数）”の計算により算出された。ノイズは、自家蛍光の蛍光強度と定義し、“自家蛍光＝（画面全体の信号値の積算値）－（ガラス部分信号値の平均値×ピクセル数）”により算出した。観察はランダムに選択した５画像で行い、シグナル、ノイズは５画像の平均とした。得られたシグナルとノイズからＳ／Ｎ比を算出した。結果を表Ｉに示す。
［比較例１］
　上記実施例１において、免疫染色剤としてストレプトアビジン修飾ＰＩＤ粒子１の代わりにストレプトアビジンで修飾したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（インビトロジェン社製）を用いた以外は同様に操作を行って、ヒトの肺癌の組織アレイスライド（ＵＳ　Ｂｉｏｍａｘ社製、型番ＬＣ２４１ｍ；標的物質はＡＴＰａｓｅ）から組織標本を作製し、同様にして蛍光画像を形成した。組織アレイスライド（ＬＣ２４１ｍ）のＣ６番地の蛍光画像をもとに、上記実施例１と同様にしてＳ／Ｎ比を算出した。結果を表Ｉに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２～９］
（１）組織標本の作製
　上記実施例１において、自家蛍光抑制剤を、以下のとおり変更した以外は、同様にして観察用のサンプルの組織アレイスライドを作製した。
　自家蛍光抑制剤は、リンモリブデン酸原液（Ａ２）、還元剤液（Ｂ２～Ｂ９）、緩衝液（Ｃ２）からなる。リンモリブデン酸原液（Ａ２）における、リンモリブデン酸は、１２モリブド（VI）りん酸ｎ水和物（製品名、富士フィルム和光純薬株式会社製）であり、溶媒は水であり、リンモリブデン酸の含有量は７．２ｍｇ／ｍＬである。還元剤液（Ｂ２～Ｂ９）は、表IIに示す還元剤のそれぞれを、溶媒である水に、４９ｍｇ／ｍＬの割合で溶解した溶液である。緩衝液（Ｃ２）は、ＨＥＰＥＳ（２３．８質量％）の水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを７．６に調整した緩衝液である。還元剤液（Ｂ６）におけるアスコルビン酸、酒石酸アンチモニルカリウム及び２－フランカルボン酸の混合割合は、質量比で４：６：１である。還元剤液（Ｂ６）では、上記３種の還元剤の合計の含有量が４９ｍｇ／ｍＬである。
　なお、リンモリブデン酸原液（Ａ２）、還元剤液（Ｂ２～Ｂ９）、緩衝液（Ｃ２）の混合割合は、１：１：１（体積）である。また、自家蛍光抑制剤におけるリンモリブデン酸の濃度は約２．４ｍｇ／ｍＬであり、還元剤の濃度は１６．３ｍｇ／ｍＬである。
（２）蛍光画像形成工程
　実施例２～９において、蛍光画像形成工程を実施例１と同様に行い、蛍光画像を形成した。
（観察・計測工程）
　実施例２～９において、組織アレイスライド（ＬＣ２４１ｍ）のＣ６番地を観察し、上記実施例１と同様にしてＳ／Ｎ比を算出した。結果を表IIに示す。
［比較例２］
　上記比較例１において、自家蛍光抑制剤を、実施例２で使用した自家蛍光抑制剤と同様のものに変更した以外は、同様にして観察用のサンプルの組織アレイスライドを作製し、上記実施例２～９と同様にして蛍光画像を形成した。組織アレイスライド（ＬＣ２４１ｍ）のＣ６番地の蛍光画像をもとに、上記実施例２～９と同様にしてＳ／Ｎ比を算出した。結果を表IIに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例１１～１３］
　上記実施例１と同様にして、ヒトの肺癌の組織アレイスライド（ＵＳ　Ｂｉｏｍａｘ社製、型番ＬＣ２４１ｍ；標的物質はＡＴＰａｓｅ）から組織標本を作製し、同様にして蛍光画像を形成した。得られた蛍光画像をもとに、実施例１１では組織アレイスライド（ＬＣ２４１ｍ）のＣ６番地（肺癌の癌細胞）を、実施例１２では同組織アレイスライドのＣ５番地（肺癌の間質）を、実施例１３では同組織アレイスライドのＢ３番地（血管）を実施例１と同様に観察し、Ｓ／Ｎ比を算出した。結果を表IIIに示す。
［比較例１１～１３］
　実施例１１～１３において、自家蛍光抑制剤を添加しない以外は同様にして、ヒトの肺癌の組織アレイスライド（ＵＳ　Ｂｉｏｍａｘ社製、型番ＬＣ２４１ｍ；標的物質はＡＴＰａｓｅ）から組織標本を作製し、同様にして蛍光画像を形成した。得られた蛍光画像をもとに、比較例１１では組織アレイスライド（ＬＣ２４１ｍ）のＣ６番地（肺癌の癌細胞）を、比較例１２では同組織アレイスライドのＣ５番地（肺癌の間質）を、比較例１３では同組織アレイスライドのＢ３番地（血管）を実施例１と同様に観察し、Ｓ／Ｎ比を算出した。結果を表IIIに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果から、本発明の画像形成方法によれば、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度の正確な計測が可能であることがわかる。特に、間質細胞の自家蛍光によるノイズを低減できることがわかる。
　本発明によれば、自家蛍光によるノイズを低減して標的物質由来の蛍光輝度の正確な計測を可能にする画像形成方法を提供することができる。

Claims (11)

  1. 　蛍光発光性物質を用いる画像形成方法であって、
    　標的物質を含む生体組織に自家蛍光抑制剤を添加するとともに、前記標的物質を蛍光発光性物質集積ナノ粒子で標識して、組織標本を作製する工程と、
    　前記組織標本に励起光を照射して蛍光画像を形成する工程と
    　を有する画像形成方法。
  2. 　前記自家蛍光抑制剤が、蛍光共鳴エネルギー移動型の自家蛍光抑制剤又は酸化型の自家蛍光抑制剤を含む請求項１に記載の画像形成方法。
  3. 　前記自家蛍光抑制剤が、前記蛍光共鳴エネルギー移動型の自家蛍光抑制剤及び前記酸化型の自家蛍光抑制剤の両方を含む請求項２に記載の画像形成方法。
  4. 　前記酸化型の自家蛍光抑制剤が酸化型の自家蛍光抑制化合物を含有し、前記酸化型の自家蛍光抑制化合物が、酸化性金属化合物である請求項２又は請求項３に記載の画像形成方法。
  5. 　前記酸化性金属化合物が、ヘテロポリ酸又はその塩である請求項４に記載の画像形成方法。
  6. 　前記ヘテロポリ酸又はその塩が、下記一般式（１）で表されるヘテロポリ酸又はその塩である請求項５に記載の画像形成方法。
    　一般式（１）：ＨｎＡｂＤｃＯｙ・ｘＨ２Ｏ
    （式中の各記号は、以下の意味を示す。
    　Ａは、リン、ホウ素、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、ヒ素、アンチモン、銅、ニッケル、コバルト、鉄、セリウム、トリウム、クロミウム又はこれらの元素の２種以上の複合元素を表す。
    　Ｄは、モリブデン、タングステン、バナジウム又はこれらの元素の２種以上の複合元素を表す。
    　ｎは、酸性水素の数を表し、１以上である。
    　ｂは、０．１～１０の数を表す。
    　ｃは、６～１８の数を表す。
    　ｘは、水和水のモル数を表す。
    　ｙは、ヘテロポリ酸中の酸素の数を表す。）
  7. 　前記酸化型の自家蛍光抑制剤が、さらに還元剤を含有する請求項４から請求項６までのいずれか一項に記載の画像形成方法。
  8. 　前記還元剤が、ヒドロキシ基及びカルボニル基を有する化合物、又は、カルボキシ基若しくはその塩を有する化合物を含む請求項７に記載の画像形成方法。
  9. 　前記還元剤が、アスコルビン酸、酒石酸、酒石酸アンチモニルカリウム、及び２－フランカルボン酸から選ばれる少なくとも１種を含む請求項７又は請求項８に記載の画像形成方法。
  10. 　前記生体組織が、間質細胞を有する繊維質組織である請求項１から請求項９までのいずれか１項に記載の画像形成方法。
  11. 　前記繊維質組織が肺組織である請求項１０に記載の画像形成方法。
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