JP2015021889A - 表面プラズモン増強蛍光測定方法および表面プラズモン増強蛍光測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】被検出物質を高感度に検出することができる、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供すること。【解決手段】回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する。前記回折格子において表面プラズモンの定在波が発生するように、前記回折格子に励起光を照射する。前記蛍光物質から放出された蛍光を検出して蛍光シグナルを得る。【選択図】図１

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して検体に含まれる被検出物質の検出を行う表面プラズモン増強蛍光測定方法および表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。

臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。

被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で金属膜に光を照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された２次抗体を反応場に提供すると、反応場に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。

ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを利用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ−ＳＰＦＳは、現在主流となっている方法であるが、プリズムを使用すること、および金属膜に対する励起光の入射角が大きいことから、ＰＣ−ＳＰＦＳは、測定装置の小型化の点で課題を有している。

これに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（非特許文献１参照）。ＧＣ−ＳＰＦＳは、プリズムを使用せず、かつ回折格子に対する励起光の入射角が小さいため、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化することができる。

Keiko Tawa, Hironobu Hori, Kenji Kintaka, Kazuyuki Kiyosue, Yoshiro Tatsu, and Junji Nishii, "Optical microscopic observation of fluorescence enhanced by grating-coupled surface plasmon resonance", Optics Express, Vol. 16, pp. 9781-9790.

上記のように、ＧＣ−ＳＰＦＳは、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化できるという利点を有するが、ＧＣ−ＳＰＦＳについての研究は、ＰＣ−ＳＰＦＳについての研究に比べて進んでいない。したがって、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置には、検出感度に改善の余地がある。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置であって、被検出物質をより高感度に検出することができる測定方法および測定装置を提供することを目的とする。

本発明者らは、回折格子において表面プラズモンの定在波を発生させることで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。

［１］被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する工程と、前記回折格子において表面プラズモンの定在波が発生するように、前記回折格子に励起光を照射する工程と、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出して蛍光シグナルを得る工程と、を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
［２］前記回折格子のピッチΛ（ｎｍ）および真空中の前記励起光の波長λ_０（ｎｍ）は、以下の式（１）を満たし、前記回折格子のフィルファクターｆは、以下の式（２）を満たし、前記回折格子に対する前記励起光の入射角θ（°）は、以下の式（３）〜式（５）を満たすか、または前記蛍光物質からの蛍光の強度が以下の式（３）〜式（５）を満たすときの前記蛍光物質からの蛍光の強度に対して５０％以上となる範囲内である、［１］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。

［上記式（１）〜（３）において、ε_１は前記回折格子上の媒体の誘電率であり、ε_２は前記回折格子を構成する金属の誘電率であり、ｎは前記媒体の屈折率であり、ＭおよびＮは整数であり、ｌおよびｍは１〜５の範囲内の整数である。］
［３］前記回折格子に励起光を照射する工程では、前記捕捉体に結合した前記被検出物質に所定の周波数で前記金属膜の面方向を含む方向の振動を加え、前記蛍光シグナルを周波数解析することにより被検出物質の存在またはその量を分析する工程をさらに含む、［１］または［２］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
［４］前記被検出物質に加えられる前記振動の周波数は、前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数未満であるか、または前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数である、［３］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。

また、本発明は、以下の表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。

［５］回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記励起光を前記回折格子に照射する光源と、前記蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、を有し、前記光源は、前記回折格子において表面プラズモンの定在波が発生するように、前記励起光を前記回折格子に照射する、表面プラズモン増強蛍光測定装置。
［６］前記回折格子のピッチΛ（ｎｍ）および真空中の前記励起光の波長λ_０（ｎｍ）は、以下の式（１）を満たし、前記回折格子のフィルファクターｆは、以下の式（２）を満たし、前記回折格子に対する前記励起光の入射角θ（°）は、以下の式（３）〜式（５）を満たすか、または前記蛍光物質からの蛍光の強度が以下の式（３）〜式（５）を満たすときの前記蛍光物質からの蛍光の強度に対して５０％以上となる範囲内である、［５］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。

［上記式（１）〜（３）において、ε_１は前記回折格子上の媒体の誘電率であり、ε_２は前記回折格子を構成する金属の誘電率であり、ｎは前記媒体の屈折率であり、ＭおよびＮは整数であり、ｌおよびｍは１〜５の範囲内の整数である。］
［７］前記捕捉体に結合した前記被検出物質に、所定の周波数で前記金属膜の面方向を含む方向の振動を加える振動付与部をさらに有し、前記振動付与部により前記被検出物質に振動を加えた状態で、前記光検出部により前記蛍光物質からの蛍光を検出し、前記光検出部からの出力信号を周波数解析することにより被検出物質の存在またはその量を分析する、［５］または［６］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
［８］前記振動付与部が加える前記振動の周波数は、前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数未満であるか、または前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数である、［７］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
［９］前記振動付与部は、交番電界を印加することで前記被検出物質に振動を加える、［７］または［８］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
［１０］前記振動付与部は、前記金属膜を１つの壁面とする流路の他の壁面を振動させることで前記被検出物質に振動を加える、［７］または［８］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
［１１］前記振動付与部は、前記金属膜を１つの壁面とする流路内において液体を往復させることで前記被検出物質に振動を加える、［７］または［８］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
［１２］前記振動付与部は、周波数１×１０^５〜１×１０^１３Ｈｚの電磁波を照射することで前記被検出物質に振動を加える、［７］または［８］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。

本発明によれば、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置において、被検出物質をより高感度に検出することができる。

実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の構成を示す模式図である。 図２Ａ，Ｂは、回折格子の斜視図である。 実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の動作を示すフローチャートである。 図４Ａ，Ｂは、表面プラズモンの定在波の電荷分布を示す回折格子の部分拡大断面である。 実施の形態２に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の構成を示す模式図である。 図６Ａ〜Ｃは、反応場に結合した被検出物質の振動を説明するための模式図である。 倒立振り子モデルを説明するための図である。 回折格子上の電場強度の分布の例を示すグラフである。 特異的結合（ＳＰ）により結合した複合体および非特異的結合（ＵＳ）により結合した複合体の蛍光強度の変化を示すグラフである。 実施の形態２に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の動作を示すフローチャートである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下「ＳＰＦＳ装置」という）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、光源１１０、コリメートレンズ１２０、励起光フィルター１３０、第１集光レンズ１４０、蛍光フィルター１５０、第２集光レンズ１６０、光検出部１７０および制御部１８０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー（不図示）にチップ２００を装着した状態で使用される。そこで、チップ２００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。

チップ２００は、基板２１０と、基板２１０の上に形成された金属膜２２０とを有する。金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。回折格子２３０には捕捉体（例えば１次抗体）が固定化されており、回折格子２３０の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図１では、捕捉体および被検出物質を省略している。なお、チップ２００は、好ましくは、各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

基板２１０は、金属膜２２０の支持部材である。基板２１０の材料は、金属膜２２０を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板２１０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。

金属膜２２０は、基板２１０上に配置されている。前述のとおり、金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。金属膜２２０に光を照射すると、金属膜２２０中に生じる表面プラズモンと、回折格子２３０により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴が生じる。金属膜２２０の材料は、表面プラズモンを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜２２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜２２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜２２０の厚みは、特に限定されない。たとえば、金属膜２２０の厚みは、３０〜７０ｎｍ程度である。

回折格子２３０は、金属膜２２０に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子２３０の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２３０は、図２Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図２Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図２Ａに示される１次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図２Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２３０の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。なお、本明細書において、「回折格子のピッチ」とは、図２Ａ，Ｂに示されるように、凸部の配列方向（ｘ軸方向）における凸部の中心間距離Λをいう。また、「回折格子のフィルファクター」とは、凸部の中心間距離Λに対する凸部の同一方向の幅の割合（０〜１の範囲内の数）をいう。図２Ａ，Ｂに示される例では、後述する励起光αの光軸は、ｘｚ平面に平行である。

回折格子２３０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板２１０の上に金属膜２２０を形成した後、金属膜２２０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板２１０の上に、金属膜２２０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２３０を含む金属膜２２０を形成することができる。

回折格子２３０（反応場）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている（図６における１次抗体４１０を参照）。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。本実施の形態では、回折格子２３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。

捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子２３０の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ膜」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭ膜の例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子２３０に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。

図１に示されるように、励起光αは、所定の入射角θで金属膜２２０（回折格子２３０）に照射される。照射領域では、金属膜２２０で生じた表面プラズモンと、回折格子２３０により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。

光源１１０、コリメートレンズ１２０および励起光フィルター１３０は、励起光照射ユニットを構成する。励起光照射ユニットは、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、チップ２００の金属膜２２０表面（回折格子２３０）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。また、励起光照射ユニットは、金属膜２２０中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子２３０で生じるように、金属膜２２０に対するＰ波のみを回折格子２３０に向けて出射する。励起光照射ユニットは、励起光αの光軸が、回折格子２３０における周期的構造の配列方向（図２Ａ，Ｂにおけるｘ軸方向）に沿うように、励起光αを回折格子２３０に照射する。したがって、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に平行な軸をｙ軸とし、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に垂直な軸をｚ軸とした場合、励起光αの光軸はｘｚ平面に平行である（図１参照）。

本実施の形態では、光源１１０は、レーザーダイオードである。光源１１０は、チップ２００の回折格子２３０に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。なお、光源１１０の種類は、特に限定されず、レーザーダイオードでなくてもよい。光源１１０の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。

コリメートレンズ１２０は、光源１１０から出射された励起光αをコリメートする。レーザーダイオード（光源１１０）から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように、レーザーダイオードは所定の姿勢で保持される。

励起光フィルター１３０は、例えば、バンドパスフィルターおよび直線偏光フィルターを含み、光源１１０から出射された励起光αを整波する。レーザーダイオード（光源１１０）からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、レーザーダイオード（光源１１０）からの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、直線偏光フィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを完全な直線偏光の光にする。励起光フィルター１３０は、金属膜２２０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。

金属膜２２０に対する励起光αの入射角θ（図１参照）は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。この後説明するように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００では、回折格子２３０において表面プラズモンの定在波を発生させることで、回折格子２３０の近傍に形成される増強電場の強度をより強くする。したがって、励起光αの入射角θは、表面プラズモンの定在波を発生させるために、回折格子２３０のピッチや励起光αの波長、金属膜２２０を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。励起光αの最適な入射角θは、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで入射角θを調整する第１角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、励起光照射ユニットまたはチップ２００を回転させればよい。

第１集光レンズ１４０、蛍光フィルター１５０、第２集光レンズ１６０および光検出部１７０は、蛍光検出ユニットを構成する。蛍光検出ユニットは、励起光照射ユニットに対して、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０に対して垂直な直線を挟むように配置されている。蛍光検出ユニットは、回折格子２３０（反応場）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する。

第１集光レンズ１４０および第２集光レンズ１６０は、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。第１集光レンズ１４０と第２集光レンズ１６０との間を進行する光は、略平行光となる。第１集光レンズ１４０および第２集光レンズ１６０は、金属膜２２０上の蛍光像を光検出部１７０の受光面上に結像させる。

蛍光フィルター１５０は、第１集光レンズ１４０と第２集光レンズ１６０との間に配置されている。蛍光フィルター１５０は、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、光検出部１７０に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、光検出部１７０に到達する光の光量を調整したりする。

光検出部１７０は、金属膜２２０上の蛍光像を検出する。たとえば、光検出部１７０は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。光検出部１７０は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサなどであってもよい。

金属膜２２０の垂線に対する蛍光検出ユニットの光軸の角度は、回折格子２３０（反応場）から放出される蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。したがって、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出ユニットの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニットの光軸の角度を調整する第２角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２角度調整部は、蛍光検出ユニットの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、蛍光検出ユニットまたはチップ２００を回転させればよい。

制御部１８０は、励起光照射ユニット（光源１１０）、蛍光検出ユニット（光検出部１７０）、励起光照射ユニットおよび蛍光検出ユニットの角度調整部（第１角度調整部および第２角度調整部）の動作を制御する。また、制御部１８０は、光検出部１７０からの出力信号（蛍光シグナル）を解析することにより、被検出物質の存在またはその量を分析する。制御部１８０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０上に固定化されている。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置にチップ２００を設置する。また、チップ２００の金属膜２２０上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜２２０上を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。具体的には、金属膜２２０上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、***などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。

次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜２２０上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される（図５Ａ参照）。この後、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去する。なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜２２０上に提供してもよい。また、金属膜２２０上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。

次いで、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βの強度を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１８０は、光源１１０に励起光αを出射させる。同時に、制御部１８０は、光検出部１７０に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。光検出部１７０は、測定結果を制御部１８０に出力する。

最後に、制御部１８０は、光検出部１７０からの出力信号（蛍光シグナル）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ５０）。

以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。

本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、表面プラズモンの定在波を利用して蛍光物質を効率的に励起することを特徴とする。したがって、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００では、励起光αを回折格子２３０に照射したときに回折格子２３０において表面プラズモンの定在波が発生するように、回折格子２３０のピッチΛ（ｎｍ）、回折格子２３０のフィルファクターｆ、真空中の励起光αの波長λ_０（ｎｍ）、および回折格子２３０に対する励起光αの入射角θ（°）が設定される。そこで、これらのパラメータの決定方法について、次に説明する。

回折格子２３０に励起光αを照射してＳＰＲが発生した場合、表面プラズモンの波数ｋ_ｓｐは、以下の式（６）のように定義される。

ｋ_ｓｐ：表面プラズモンの波数
λ_０：真空中の励起光αの波長（ｎｍ）
ｎ：回折格子２３０上の媒体（誘電体）の屈折率
ε_１：回折格子２３０上の媒体（誘電体）の誘電率＝ｎ^２
ε_２：回折格子２３０を構成する金属の誘電率

また、回折格子２３０において表面プラズモンの定在波が発生する場合は、以下の式（７）の条件が満たされる。式（７）の条件が満たされる場合、表面プラズモンは、回折格子２３０によりブラッグ反射されて反対方向に伝播する。これにより、定在波が発生する。

ｋ_ｓｐ：表面プラズモンの波数
ｋ_０：励起光αの波数＝２π／（λ_０／ｎ）
λ_０：真空中の励起光αの波長（ｎｍ）
ｎ：回折格子２３０上の媒体（誘電体）の屈折率
θ：励起光αの格子面に対する入射角（°）
Ｍ，Ｎ：整数
Ｋ：格子ベクトル＝２π／Λ
Λ：回折格子２３０のピッチ（ｎｍ）

上記式（７）において、Ｍは、表面プラズモンの回折次数を意味し、Ｎは、回折格子２３０における電磁波の次数を意味する。ＭおよびＮは、θが以下の式（８）および式（９）を満たす範囲内で任意に選択されうる。

励起光αを回折格子２３０に照射してＳＰＲが発生し、かつ回折格子２３０において表面プラズモンの定在波が発生する場合は、上記式（６）および式（７）より、以下の式（１０）が成立する。

上記式（１０）は、以下の式（１１）のように書き換えられる。

したがって、回折格子２３０上の媒体（誘電体）の誘電率ε_１および回折格子２３０（金属）の誘電率ε_２が決まっている場合は、表面プラズモンの定在波を発生させるための回折格子２３０のピッチΛは、上記式（１１）により励起光αの波長λ_０に応じて決定されうる。逆に言えば、表面プラズモンの定在波を発生させるための励起光αの波長λ_０は、上記式（１１）により回折格子２３０のピッチΛに応じて決定されうる。

また、上記式（７）は、以下の式（１２）のように書き換えられる。

したがって、表面プラズモンの定在波を発生させるための励起光αの入射角θは、上記式（１１）により決定される励起光αの波長λ_０および回折格子２３０のピッチΛに応じて決定されうる。励起光αの入射角θは、上記式（１２）を満たすことが最も好ましいが、上記式（１２）を満たす角度の前後の角度であってもよい。具体的には、励起光αの入射角θは、蛍光物質からの蛍光の強度が上記式（１２）を満たすときの蛍光物質からの蛍光の強度（ピーク強度）に対して５０％以上となる範囲内であればよい。

たとえば、回折格子２３０上の媒体が水（屈折率ｎ＝１.３３、誘電率ε_１≒１.７７）であり、回折格子２３０が金（誘電率ε_２≒−１２）からなり、励起光αの波長λ_０が６４０ｎｍであると仮定する。Ｍ，Ｎは、それぞれ−１，３と設定する。なお、回折格子２３０の誘電率ε_２は複素数であるが、実数部に比べて虚数部が小さいため、虚数部を無視している。また、励起光αの波長は真空中と空気中とで異なるが、その違いは非常に小さいため、ここではその違いを無視している。

この条件において、各数値を上記式（１１）に代入すると、以下の式（１３）のように、表面プラズモンの定在波を発生させるための回折格子２３０のピッチΛ（ｎｍ）が約６６６ｎｍであることが求められる。

さらに、各数値を上記式（１２）に代入すると、以下の式（１４）のようになる。したがって、表面プラズモンの定在波を発生させるための励起光αの最も好ましい入射角θ（°）が約２１°であることが求められる。

なお、上記式（１１）および式（１２）を満たしていても、回折格子２３０のフィルファクターｆ（Λに対する凸部の幅の割合）が以下の式（１５）を満たしていない場合は、ｍ次の高調波の振幅ｈｍが０となり、表面プラズモンの定在波を発生させることができない。したがって、回折格子２３０のフィルファクターｆは、以下の式（１５）を満たすことが好ましい。

ｌ，ｍ：１〜５の範囲内の整数

上記式（１５）は、次のように導かれる。まず、表面プラズモンのｍ次の高調波の振幅ｈｍは、以下の式（１６）で求められる。

ｄ：回折格子２３０の凹部の深さ（凸部の高さ）（ｎｍ）
ｆ：回折格子２３０のフィルファクター
Λ：回折格子２３０のピッチ（ｎｍ）
ｍ：表面プラズモンの高調波の次数（整数）

表面プラズモンの定在波を発生させるためには、以下の式（１７）を満たすことが必要である。したがって、式（１６）および式（１７）より、以下の式（１８）が導かれる。式（１８）を解くと、以下の式（１９）となる。式（１９）は、上記式（１５）のように書き換えられる。

ｌ：整数

なお、実用上は、１〜５次の高調波の振幅を考慮すればよいと考えられる。また、回折格子２３０のフィルファクターｆは、０〜１の範囲内の数値である。よって、ｌおよびｍは、１〜５の範囲内の整数である。

このように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００では、回折格子２３０のピッチΛ（ｎｍ）、回折格子２３０のフィルファクターｆ、真空中の励起光αの波長λ_０（ｎｍ）、および回折格子２３０に対する励起光αの入射角θ（°）が、上記式（１１）、式（１２）および式（１５）を満たすように設定される。したがって、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、励起光αを回折格子２３０に照射することで、回折格子２３０において表面プラズモンの定在波を発生させることができ、その結果として、回折格子２３０上の蛍光物質を励起するための光子数を顕著に増大させることができる。たとえば、回折格子のピッチΛは、０.１〜１０μｍの範囲内から選択され、回折格子２３０におけるフィルファクターｆは、０.１〜０.９の範囲内から上記式（１５）を満たすものが選択され、励起光αの波長λ_０は、３００〜８００ｎｍの範囲内から選択され、励起光αの入射角θは５〜７０°の範囲内から選択される。

図４は、表面プラズモンの定在波の電荷分布の例を示す図である。図４Ａは、長距離伝播状態を示す図であり、図４Ｂは、短距離伝播状態を示す図である。図４Ａは、表面プラズモンの分散曲線におけるバンドギャップの高エネルギー側のバンドギャップ端（ω_＋モード）における表面プラズモンの定在波の電荷分布を示している。一方、図４Ｂは、バンドギャップの低エネルギー側のバンドギャップ端（ω₋モード）における表面プラズモンの定在波の電荷分布を示している。

図４Ａに示されるように、ω_＋モードでは、回折格子２３０の凹部で電場が大きくなり、媒体（誘電体）側への電場の侵入長さが大きくなる。一方、図４Ｂに示されるように、ω₋モードでは、回折格子２３０の凸部で電場が大きくなり、媒体（誘電体）側への電場の侵入長さが小さくなる。回折格子２３０から離れて位置する蛍光物質を励起する観点からは、ω_＋モードがより好ましいが、ω₋モードでも回折格子２３０上の光子数を顕著に増大させることができる。なお、図４Ａ，Ｂに示される電荷分布は一例であり、回折格子２３０の形状により電荷分布はこれ以外の態様となりうる。

以上のように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、表面プラズモンの定在波を利用して蛍光物質を効率的に励起することができるため、従来のＳＰＦＳ装置に比べてより高感度に被検出物質を検出することができる。

なお、上記実施の形態では、金属膜２２０側から励起光αをチップ２００に照射する例について説明したが、基板２１０側から励起光αをチップ２００に照射してもよい。

［実施の形態２］
図５は、本発明の実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置３００の構成を示す模式図である。図５に示されるように、ＳＰＦＳ装置３００は、光源１１０、コリメートレンズ１２０、励起光フィルター１３０、第１集光レンズ１４０、蛍光フィルター１５０、第２集光レンズ１６０、光検出部１７０、振動付与部３１０および制御部１８０を有する。実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置３００は、振動付与部３１０をさらに有する点において実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同じ構成要素については同一の符号を付し、説明を省略する。

振動付与部３１０は、回折格子２３０上の反応場（捕捉体）に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質に、所定の振動数で面方向を含む方向に振動を加える。ここで「面方向を含む方向の振動」とは、振動方向が面方向（水平方向）の成分を含むことを意味する。本実施の形態では、振動付与部３１０は、高圧電源３１２と、高圧電源３１２に接続された一対の電極３１４とを含む。一対の電極３１４は、回折格子２３０（反応場）を挟むように配置されている。高圧電源３１２は、交流電圧または極性を交互に入れ替えたパルス状の電圧を電極３１４間に印加することが可能である。したがって、振動付与部３１０は、回折格子２３０上の反応場に対して極性を所定の周波数で変化する交番電界を加えることができる。反応場に結合した被検出物質が正または負の電荷を帯びている場合は、被検出物質は交番電界により振動させられる。電圧は、例えば数百Ｖ以下であり、好ましくは数十Ｖ以下である。振動付与部３１０が加える振動の周波数は、反応場（捕捉体）に結合した被検出物質が共振する周波数、またはそれ未満の周波数であることが好ましい。たとえば、周波数は、数Ｈｚ〜数十Ｈｚ程度である。

図６は、反応場に結合した被検出物質の振動を説明するための模式図である。この図では、回折格子２３０の表面（例えば、凹条の底面）を拡大して示している。また、一対の電極３１４に印加されている電圧の極性も示している。図６Ａに示される例では、金属膜２２０（回折格子２３０）に固定化された１次抗体４１０（捕捉体）に、被検出物質４２０が結合している。また、被検出物質４２０に、蛍光物質４４０で標識された２次抗体４３０が結合している。被検出物質４２０、２次抗体４３０および蛍光物質４４０からなる複合体は、負の電荷を有しているものとする。このような特異的結合ＳＰにより金属膜２２０に結合した複合体に加え、非特異的結合ＵＳにより金属膜２２０に結合した複合体も存在する。非特異的結合ＵＳの例には、金属膜２２０への被検出物質４２０または他の物質４５０の直接的結合、金属膜２２０への２次抗体４３０の直接的結合などが含まれる。

図６Ｂおよび図６Ｃに示されるように、反応場に交番電界を印加すると、反応場に特異的または非特異的に結合した物質のうち、正または負の電荷を有する物質は、金属膜２２０の面方向を含む方向に振動させられる。このとき、特異的結合ＳＰにより結合している複合体と、非特異的結合ＵＳにより結合している複合体（物質）とでは、その長さおよび質量が異なる。したがって、各成分の振動のしかたはそれぞれ異なるものとなる。たとえば、金属膜２２０に２次抗体４３０が直接結合している場合は、反応場に交番電界を印加しても、この２次抗体４３０はほとんど振動しない。また、金属膜２２０に被検出物質４２０が直接結合しており、かつこの被検出物質４２０に２次抗体４３０が結合している場合は、この非特異的結合ＵＳにより結合している複合体の共振周波数は、特異的結合ＳＰにより結合している複合体の共振周波数よりも大きい。したがって、これらの振動の違いを検出することができれば、特異的結合ＳＰにより結合した複合体と、非特異的結合ＵＳにより結合した複合体とを区別することができる。

ここで、特異的結合ＳＰにより結合している複合体の共振周波数について説明する。複合体の共振周波数を算出するために、図７に示される倒立振り子モデルを用いてタンパク質の運動方程式について検討する。

図７に示されるように、タンパク質の質量をｍ、タンパク質の長さをｌ、ばね定数をｋ、タンパク質の基点からばねの作用点までの長さをｈ、溶媒による粘性減衰係数をＣとしたとき、慣性モーメント、転倒モーメント、ばねの復元力および復元モーメントは、以下のようになる。
慣性モーメント： Ｊ＝ｍｌ^２
転倒モーメント： ｍｇ・ｌ・ｓｉｎθ≒ｍｇｌ・θ
ばねの復元力 ： −ｋ・ｈθ
復元モーメント： −ｋ・ｈθ・ｈ＝−ｋ・ｈ^２・θ

この場合、運動方程式は、以下の式（２０）のように表される。

上記式（２０）は、以下の式（２１）のように書き換えられる。

ここで、重力およびばね復元力による共振角周波数をωｎとすると、以下の式（２２）および式（２３）が成立する。式（２２）において、ξは減衰比である。

上記式（２２）および式（２３）を利用すると、上記式（２１）は、以下の式（２４）のように表される

溶媒の粘性減衰を含めた全体での共振周期Ｔは、以下の式（２５）のとおりとなる。

ここで、タンパク質の基点からばねの作用点までの長さｈ、タンパク質の長さｌ、タンパク質の質量ｍ、重力加速度ｇ、ばね定数ｋを以下のように仮定する。
ｈ＝ｌ＝１.８×１０^−９（ｍ）
ｍ＝６.１７×１０^−２２（ｋｇ）
ｇ＝９.８（ｍ／ｔ^２）
ｋ＝２.５（Ｎ／ｍ）＝２.５（ｋｇ／ｔ_２）

そうすると、ｋｔ、慣性モーメントＪおよび共振角周波数ωｎは、以下のとおりとなる。
ｋｔ＝ｋｈ^２−ｍｇｌ≒０.８１×１０^−１５（ｋｇｍ^２／ｔ^２）
Ｊ＝ｍ×ｌ^２＝６.１７×１０^−２２×（１８×１０^−９）^２＝１.９９９０８×１０^−３７（ｋｇｍ^２）
ωｎ＝√（ｋｔ／Ｊ）≒０.６３６×１０^１１（Ｈｚ）

溶媒（水）の粘度ηおよびタンパク質の大きさ（半径）ｒを以下のように仮定する。
η＝０.８９（ｃＰ）＝０.８９×１０^−３（ｋｇ／（ｍｔ））
ｒ＝５（ｎｍ）

そうすると、タンパク質の体積Ｖ、粘性減衰係数Ｃ、減衰比ξ、共振周期Ｔおよび共振周波数ｆは、以下のとおりとなる。
Ｖ＝４／３πｒ^３＝５.２３６×１０^−２５（ｍ^３）
Ｃ＝η×Ｖ＝０.８９×１０^−３×５.２３６×１０^−２５≒４.６６００４×１０^−２８（ｋｇｍ^２／ｔ）
ξ＝Ｃ／（２ωｎ×Ｊ）＝４.６６００４×１０^−２８／（２×０.６３６×１０^１１×１.９９９０８×１０^−３７）
Ｔ＝２π／（ωｎ×√（１−ξ^２））≒９.８８×１０^−１１（ｔ）
ｆ＝１／Ｔ≒１０（ＧＨｚ）

より粘度の高い溶媒を選択することで、特異的結合ＳＰにより結合している複合体の共振周波数ｆを任意の値に設定することができる。共振周波数ｆは、数Ｈｚ程度が好ましい。

図８は、回折格子２３０上の電場強度の分布の例を示すグラフである。図８に示されるように、電場強度は、回折格子２３０の形状に対応して周期的に変化する。このような状況において、反応場に交番電界を印加して、反応場に特異的または非特異的に結合した複合体を金属膜２２０の面方向を含む方向に振動させると、これらの複合体の周囲の電場強度が周期的に変化する。したがって、これらの複合体に含まれる蛍光物質からの蛍光強度も周期的に変化する。

前述のとおり、特異的結合ＳＰにより結合している複合体と、非特異的結合ＵＳにより結合している複合体（物質）とでは、その長さおよび質量が異なる。非特異的結合ＵＳにより結合している複合体の共振周波数は、特異的結合ＳＰにより結合している複合体の共振周波数よりも大きい。したがって、図９に示されるように、非特異的結合ＵＳにより結合している複合体からの蛍光シグナルの周波数は、特異的結合ＳＰにより結合している複合体からの蛍光シグナルの周波数よりも大きくなる。

ＳＰＦＳ装置３００の説明に戻る。制御部１８０は、励起光照射ユニット（光源１１０）、蛍光検出ユニット（光検出部１７０）、励起光照射ユニットおよび蛍光検出ユニットの角度調整部、ならびに振動付与部３１０の動作を制御する。また、制御部１８０は、光検出部１７０からの出力信号（蛍光シグナル）を周波数解析することにより、特異的結合ＳＰにより結合している複合体からの蛍光シグナルを他の蛍光シグナル（ノイズ）から分離して、被検出物質の存在またはその量を分析する。制御部１８０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

たとえば、制御部１８０は、光検出部１７０からの出力信号（蛍光シグナル）をバンドパスフィルターまたはローパスフィルターを通すことで、特異的結合ＳＰにより結合している複合体からの蛍光シグナルを他の蛍光シグナル（ノイズ）から分離することができる。また、制御部１８０は、光検出部１７０からの出力信号（蛍光シグナル）に対して周波数変換処理（例えば高速フーリエ変換）を行い、特異的結合ＳＰにより結合している複合体の振動周波数における蛍光強度を算出することで、被検出物質の存在またはその量を分析することもできる。さらに、制御部１８０は、光検出部１７０からの出力信号（蛍光シグナル）に対して周波数変換処理（例えば高速フーリエ変換）を行い、得られた信号を所定の振動周波数を通すフィルターに通し、フィルターを通過した信号に対して周波数逆変換処理（例えば高速フーリエ逆変換）を行うことで、特異的結合ＳＰにより結合している複合体からの蛍光シグナルを他の蛍光シグナル（ノイズ）から分離することもできる。

次に、ＳＰＦＳ装置３００の検出動作について説明する。図１０は、ＳＰＦＳ装置３００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体４１０が金属膜２２０上に固定化されている。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置３００の所定の位置にチップ２００を設置する。次いで、検体中の被検出物質４２０と１次抗体４１０とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。次いで、１次抗体４１０に結合した被検出物質４２０を蛍光物質４４０で標識する（２次反応、工程Ｓ３０）。これらの各工程は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の各工程と同じである。

次いで、１次抗体４１０に結合した、蛍光物質４４０で標識されている被検出物質４２０に所定の周波数の振動を加える（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１８０は、振動付与部３１０に交番電界を印加させて、被検出物質４２０に所定の周波数の振動を加えさせる（図６Ｂおよび図６Ｃ参照）。

次いで、被検出物質４２０に所定の周波数の振動を加えた状態で、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質４４０から放出される蛍光βの強度を測定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１８０は、光源１１０に励起光αを出射させる。同時に、制御部１８０は、光検出部１７０に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。光検出部１７０は、測定結果を制御部１８０に出力する。

最後に、制御部１８０は、光検出部１７０からの出力信号（蛍光シグナル）に対して周波数解析を行い、特異的結合ＳＰに由来する蛍光シグナルを分離して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ６０）。

以上の手順により、特異的結合ＳＰに由来する蛍光シグナルを分離して、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を高精度に検出することができる。

前述のとおり、本実施の形態では、回折格子２３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。したがって、回折格子２３０の凹部の底面に位置する被検出物質４２０からの蛍光強度の変化と、凸部の頂面に位置する被検出物質４２０からの蛍光強度の変化とが、互いに打ち消しあうことも考えられる。しかしながら、回折格子２３０の凹部の底面と凸部の頂面とでは、電場強度に大きな差があるため、凸部の頂面における蛍光強度の変化は、凹部の底面における蛍光強度の変化に比べて非常に小さい。このため、このようなことはほとんど問題とならない。また、蛍光検出ユニット内にマスクを配置して特定の領域（例えば、電場強度が小さい領域）からの蛍光を遮蔽したり、光検出部１７０で検出した蛍光像における特定の領域（例えば、電場強度が大きい領域）についてのみ周波数解析を行ったりすることで、このような問題をより確実に回避してもよい。

以上のように、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置３００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の効果に加え、特異的結合ＳＰに由来する蛍光シグナルを分離することができるため、非特異的吸着が生じている場合でも被検出物質を高精度に検出することができるという効果を有する。

なお、本実施の形態では、振動付与部３１０が交番電界を印加して被検出物質に振動を加える例について説明したが、被検出物質に振動を加える手段はこれに限定されない。たとえば、この場合、振動付与部３１０は、金属膜２２０を１つの壁面とする流路の他の壁面を振動させることで被検出物質に振動を加えてもよい。また、振動付与部３１０は、金属膜２２０を１つの壁面とする流路内において液体を往復させることで被検出物質に振動を加えてもよい。さらに、振動付与部３１０は、周波数１×１０^５〜１×１０^１３Ｈｚの電磁波を照射して分子を振動させることで被検出物質に振動を加えてもよい。

また、本実施の形態では、振動付与部３１０が被検出物質を主として金属膜２２０の面方向に振動させる例について説明したが、振動付与部３１０は被検出物質を金属膜２２０の厚み方向に振動させてもよい（本願発明者らによる特開２０１１−８０９３５号公報参照）。ＳＰＲにより形成される増強電場は金属膜２２０のごく近傍にのみ存在するため、被検出物質を金属膜２２０の厚み方向に振動させても、振動に応じて蛍光物質から放出される蛍光の強度が変化する。また、被検出物質を金属膜２２０の厚み方向に振動させる場合も、特異的結合ＳＰにより結合した複合体と、非特異的結合ＵＳにより結合した複合体とでは、蛍光シグナルの周波数が異なる。したがって、被検出物質を金属膜２２０の厚み方向に振動させる場合も、上記実施の形態と同様に、特異的結合ＳＰに由来する蛍光シグナルを分離して、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を高精度に検出することができる。振動付与部３１０は、被検出物質を金属膜２２０の面方向に振動させてもよいし、厚み方向に振動させてもよいし、面方向および厚み方向に振動させてもよい。

本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法および表面プラズモン増強蛍光測定装置は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

１００，３００ 表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０ 光源
１２０ コリメートレンズ
１３０ 励起光フィルター
１４０ 第１集光レンズ
１５０ 蛍光フィルター
１６０ 第２集光レンズ
１７０ 光検出部
１８０ 制御部
２００ チップ
２１０ 基板
２２０ 金属膜
２３０ 回折格子
３１０ 振動付与部
３１２ 高圧電源
３１４ 電極
４１０ １次抗体
４２０ 被検出物質
４３０ ２次抗体
４４０ 蛍光物質
α 励起光
β 蛍光

Claims (12)

1. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
   回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する工程と、
   前記回折格子において表面プラズモンの定在波が発生するように、前記回折格子に励起光を照射する工程と、
   前記蛍光物質から放出された蛍光を検出して蛍光シグナルを得る工程と、
   を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
2. 前記回折格子のピッチΛ（ｎｍ）および真空中の前記励起光の波長λ_０（ｎｍ）は、以下の式（１）を満たし、
   前記回折格子のフィルファクターｆは、以下の式（２）を満たし、
   前記回折格子に対する前記励起光の入射角θ（°）は、以下の式（３）〜式（５）を満たすか、または前記蛍光物質からの蛍光の強度が以下の式（３）〜式（５）を満たすときの前記蛍光物質からの蛍光の強度に対して５０％以上となる範囲内である、
   請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
   

   

   

   

   

   

   ［上記式（１）〜（３）において、ε_１は前記回折格子上の媒体の誘電率であり、ε_２は前記回折格子を構成する金属の誘電率であり、ｎは前記媒体の屈折率であり、ＭおよびＮは整数であり、ｌおよびｍは１〜５の範囲内の整数である。］
3. 前記回折格子に励起光を照射する工程では、前記捕捉体に結合した前記被検出物質に所定の周波数で前記金属膜の面方向を含む方向の振動を加え、
   前記蛍光シグナルを周波数解析することにより被検出物質の存在またはその量を分析する工程をさらに含む、
   請求項１または請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
4. 前記被検出物質に加えられる前記振動の周波数は、前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数未満であるか、または前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数である、請求項３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
5. 回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
   増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記励起光を前記回折格子に照射する光源と、
   前記蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、を有し、
   前記光源は、前記回折格子において表面プラズモンの定在波が発生するように、前記励起光を前記回折格子に照射する、
   表面プラズモン増強蛍光測定装置。
6. 前記回折格子のピッチΛ（ｎｍ）および真空中の前記励起光の波長λ_０（ｎｍ）は、以下の式（１）を満たし、
   前記回折格子のフィルファクターｆは、以下の式（２）を満たし、
   前記回折格子に対する前記励起光の入射角θ（°）は、以下の式（３）〜式（５）を満たすか、または前記蛍光物質からの蛍光の強度が以下の式（３）〜式（５）を満たすときの前記蛍光物質からの蛍光の強度に対して５０％以上となる範囲内である、
   請求項５に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
   

   

   

   

   

   

   ［上記式（１）〜（３）において、ε_１は前記回折格子上の媒体の誘電率であり、ε_２は前記回折格子を構成する金属の誘電率であり、ｎは前記媒体の屈折率であり、ＭおよびＮは整数であり、ｌおよびｍは１〜５の範囲内の整数である。］
7. 前記捕捉体に結合した前記被検出物質に、所定の周波数で前記金属膜の面方向を含む方向の振動を加える振動付与部をさらに有し、
   前記振動付与部により前記被検出物質に振動を加えた状態で、前記光検出部により前記蛍光物質からの蛍光を検出し、前記光検出部からの出力信号を周波数解析することにより被検出物質の存在またはその量を分析する、
   請求項５または請求項６に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
8. 前記振動付与部が加える前記振動の周波数は、前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数未満であるか、または前記捕捉体に結合した前記被検出物質が共振する周波数である、請求項７に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
9. 前記振動付与部は、交番電界を印加することで前記被検出物質に振動を加える、請求項７または請求項８に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
10. 前記振動付与部は、前記金属膜を１つの壁面とする流路の他の壁面を振動させることで前記被検出物質に振動を加える、請求項７または請求項８に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
11. 前記振動付与部は、前記金属膜を１つの壁面とする流路内において液体を往復させることで前記被検出物質に振動を加える、請求項７または請求項８に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
12. 前記振動付与部は、周波数１×１０^５〜１×１０^１３Ｈｚの電磁波を照射することで前記被検出物質に振動を加える、請求項７または請求項８に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。

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