JPWO2016052619A1 - 核酸の増幅方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 鋳型RNA、プライマー、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、RNase Hマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含み、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素が、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のDNA鎖を切断する活性を有する酵素である、核酸の増幅方法。
(2) RNase Hマイナス型逆転写酵素のRNA依存性DNAポリメラーゼ活性により鋳型RNAの相補鎖DNA(cDNA)を合成し、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素によりRNAとcDNAとのハイブリッド鎖のうちのcDNA鎖を無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、RNase Hマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により3’側のcDNA鎖がRNAから剥がされ、RNase Hマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなcDNA鎖が合成される工程を含む、(1)に記載の核酸の増幅方法。
(3) 前記混合物がDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素として二本鎖特異的DNA分解酵素を含み、二本鎖特異的DNA分解酵素が、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のDNA鎖を切断する活性を有し、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のRNA鎖、一本鎖DNA及び一本鎖RNAを切断する活性を実質的に有さない酵素である、(1)又は(2)に記載の核酸の増幅方法。
(4) 前記混合物がDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素として非特異的DNA分解酵素を含み、非特異的DNA分解酵素が、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のDNA鎖を切断する活性を有し、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のRNA鎖、及び一本鎖RNAを切断する活性を実質的に有さない酵素である、(1)又は(2)に記載の核酸の増幅方法。
(5) DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素が、60℃未満でもDNA分解活性を有する酵素である、(1)から(4)の何れかに記載の核酸の増幅方法。
(6) 二本鎖特異的DNA分解酵素が、甲殻類由来の二本鎖特異的DNA分解酵素又はその改変体である、(3)に記載の核酸の増幅方法。
(7) 二本鎖特異的DNA分解酵素が、エビ由来の二本鎖特異的DNA分解酵素又はその改変体である、(6)に記載の核酸の増幅方法。
(8) 非特異的DNA分解酵素が、ほ乳類由来の非特異的DNA分解酵素又はその改変体である、(4)に記載の核酸の増幅方法。
(9) 非特異的DNA分解酵素が、ウシ由来の非特異的DNA分解酵素又はその改変体である、(8)に記載の核酸の増幅方法。
(10) プライマーが、ランダムプライマー、オリゴdTプライマー又は配列特異的プライマーの1種以上である、(1)から(9)の何れかに記載の核酸の増幅方法。
(11) プライマーが、カチオンユニットの修飾によってTm値が上昇しているプライマーである、(1)から(10)の何れかに記載の核酸の増幅方法。
(12) プライマーが、Zip Nucleic Acid (ZNA) プライマーである、(1)から(11)の何れかに記載の核酸の増幅方法。
(13) 混合物がさらに、一本鎖DNA結合タンパク質を含む、(1)から(12)の何れかに記載の核酸の増幅方法。
(14) 鋳型RNAが、1細胞から数百細胞相当の微量RNAである、(1)から(13)の何れかに記載の核酸の増幅方法。
(15) DNAシーケンスライブラリ作製に供するcDNAの増幅のために行う、(1)から(14)の何れかに記載の核酸の増幅方法。
(16) DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、およびRNase Hマイナス型逆転写酵素を少なくとも含む、(1)から(15)の何れかに記載の核酸の増幅方法を行うためのキット。
(17) さらに一本鎖DNA結合タンパク質を含む、(16)に記載のキット。
本発明による核酸の増幅方法は、鋳型RNA、プライマー、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、RNase Hマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートすることによって行う方法であり、Reverse Transcription with Ramdom Displacement Amplification (RT−RamDA)法とも称する。本発明の核酸の増幅方法は、鎖置換反応を利用したRNAを直接鋳型とする増幅逆転写法であり、インビトロで行うことができる。本発明の方法は、エンドヌクレアーゼである二本鎖特異的DNA分解酵素(double-strand specific DNase:dsDNase) 、又は非特異的DNA分解酵素(DNase I)などのDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素のヌクレアーゼ活性を利用してRNA:cDNAハイブリッド鎖のcDNA側を切断し、無作為に鎖置換反応を起こすことによって、逆転写反応中にcDNAを増幅させる技術である。
1.RNase Hマイナス型逆転写酵素のRNA依存性DNAポリメラーゼ活性により鋳型RNAの相補鎖DNA(cDNA)を合成する。
2.二本鎖特異的DNA分解酵素(dsDNase)又は非特異的DNA分解酵素(DNase I)などのDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素のヌクレアーゼ活性によりRNAとcDNAとのハイブリッド鎖のうちのcDNA鎖に無作為に切断点(ニック)が入れられる。
3.ニック部位が起点となり、RNase Hマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により3’側のcDNA鎖が剥がされる。剥がされた部分には逆転写酵素により新たなcDNAが合成される。剥がされたcDNAは一本鎖DNA結合タンパク質であるT4ジーン32プロテイン(T4GP32)によって、ヌクレアーゼ活性から保護される。これが連続的に起きることで、cDNAの収量を10倍以上に増やすことが可能となる。
また、本発明で使用するRNase Hマイナス型逆転写酵素は、鎖置換活性を有する。RNase Hマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により3'側のcDNA鎖がRNAから剥がされ、剥がされた部分に新たなcDNA鎖が合成される。
(1)Solenocera melantho(ナミクダヒゲエビ)DNase
(2)Penaeus japonicus(クルマエビ)DNase
(3)Paralithodes camtschaticus(タラバガニ)DSN
(4)Pandalus borealis(ホッコクアカエビ)dsDNase
(5)Chionoecetes opilio(ズワイガニ)DSN
(6)その他のDSNホモログ
上記の中でも、タラバガニDSNとズワイガニDSNは至適活性温度が60℃前後で耐熱性があるのに対して、ホッコクアカエビdsDNaseは至適温度が37℃の易熱性酵素である。
本発明においては、エビ由来の二本鎖特異的DNA分解酵素又はその改変体であることがさらに好ましい。
本発明による核酸の増幅方法は、微量のRNA(例えば、1細胞から数百細胞相当の微量RNA)を用いたRNAシーケンス法に利用することができる。
本発明による核酸の増幅方法を利用することによって、大量細胞中の1細胞を検出することが可能である。具体的には、大量細胞中の標的細胞でのみ発現する遺伝子を特異的に増幅することで、大量のRNA中に含まれるわずかな標的細胞遺伝子の検出が可能となり、標的細胞の含有の有無を判定できる。
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
RamDA−Aは、二本鎖特異的DNA分解酵素とT4ジーン32プロテインを用いてRT−RamDA法を行う態様である。
RamDA−Bは、T4ジーン32プロテインなしで二本鎖特異的DNA分解酵素を用いたRT−RamDA法を行う態様である。
RamDA−Cは、RT−RamDA熱サイクル法であり、RamDA−Bと同様の反応溶液組成で、反応温度条件を改変し、アニール行程と伸長反応行程を小刻みに繰り返して反応を行った態様である。
RamDA−Dは、非特異的DNA分解酵素とT4ジーン32プロテインを用いてRT−RamDA法を行う態様である。
細胞培養
Total RNAの抽出用に、5G6GRマウスES細胞を用いた。この細胞株は、直鎖化したGata6−GR−IRES−Puroベクターを EB5 ES細胞にランダムに組み込んで作成したものである(非特許文献20)。細胞は、Feeder−freeなゼラチン被覆ディッシュ上で、10%ウシ胎児血清入りGlasgow minimal essential medium (GMEM; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)、 1000U/mlleukemia inhibitory factor (ESGRO; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)、 100μmol/l 2−メルカプトエタノール(Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan)、 1×non-essential amino acids (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)、 1mmol/l ピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)、 2mmol/l L−グルタミン(Nacalai Tesque)、 0.5×ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)、 及び10μg/mlブラスチシジン (Life Technologies)の条件で培養を行った。
Total RNAは、RNeasy Mini Kit(Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)を用いて精製した。RNAの定量と品質チェックは、Quantus Fluorometer (Promega Corp., Madison, WI, USA)とRNA 6000 Nano Kit (Agilent Biotechnology, Santa Clara, CA, USA)を用いて行った。人工合成RNAは、pGIBS−DAP、pGIBS−THR プラスミド(American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA)からMEGAscript T3 kit (Life Technologies)を用いて合成した。
培養細胞は、TrypLE Express (Life Technologies)を用いて37℃で3分間反応させ、1細胞へ解離した。解離後は、直ちにPBS(−)へ置換し反応を止めた。セルソーターを使用して細胞だけを的確に分取するため、解離細胞の生細胞核を、Vybrant Dye Cycle(Life Technologies)を用いて染色標識した。染色条件は、試薬添付の方法を踏襲した。SH800セルソーター(Sony Corp., Tokyo, Japan)を用いてVybrant Dye Cycle(検出フィルター:BP450/50)陽性、死細胞蛍光マーカー色素のPI (検出フィルター:BP585/40)陰性を生細胞分画とし、この分画から50細胞を1μlのLysis buffer (1U RNasein plus (Promega)、 0.3% NP40 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA), RNase free water(TaKaRa Bio Inc., Otsu, Japan))に分取した。分取後は、直ちにスピンダウンと振とう攪拌を行い、−80℃で保存した。逆転写反応に使用する際は、融解後に49μlのLysis bufferを加え50倍希釈した細胞溶解液1μlを1細胞溶解液として用いた。
FRET解析は、Inge W. Nilsen et al (非特許文献12)の方法を改変して行った。0.6μlの oligonucleotide probe mix (6pmolオリゴDNA 又はRNA(Sigma-Aldrich)、 1xFirst-Strand buffer (Life Technologies)、 RNase free water (TaKaRa))を調整し、70℃5分で変性した後、ゆっくりと室温に戻した。解析に用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせは、以下の通りである(配列番号1から10)。
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
HEX-rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1
HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1
HEX-rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
GAACCTCCGATGGCG
CGCCATCGGAGGTTC
HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
GAACCTCCGATGGCG-BHQ1
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1
FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1
FAM-rCrGrCrCrArTrCrGrGrArGrGrTrTrC-BHQ1
RT−RamDA法(RamDA−A):
鋳型RNAは、1μl Lysis buffer (1U RNasein plus (Promega)、 10% Roche lysis buffer (Roche)、 0.3% NP40 (Thermo Fisher), RNase free water) に希釈し、65℃で2分間の変性処理を行い、使用まで氷上で保管した。逆転写酵素反応液は、ReverTra Ace qPCR RT KIT (TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan)を改変して用いた。1μlの変性済み希釈鋳型RNAに2μl RT mix (1.5 x ReverTra Ace RT buffer(TOYOBO)、0.6pmol オリゴ(dT)18プライマー(Thermo Fisher)、 7.8pmol ランダムヘキサマープライマー(TaKaRa)、 1.5 x ReverTra Ace enzyme mix(TOYOBO)、 RNase free water)、または、2μl RamDA−A mix (1.5 x ReverTra Ace RT buffer、0.6pmol オリゴ(dT)18プライマー、 7.8pmol ZNA−ランダムヘキサマープライマー ([Z][Z]NNNNNN; Sigma-Aldrich)、 0.4U dsDNase (ArcticZymes)、 100ng T4ジーン32プロテイン、1.5 x ReverTra Ace enzyme mix、RNase free water)をそれぞれ加え、MixMate(Eppendorf, Westbury, NY, USA)で 2,000rpm、30秒の撹拌後、サーマルサイクラーC1000(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA))を用いて25℃10分、30℃10分、37℃30分、50℃5分、85℃5分で反応を行った。
鋳型RNAを1μl lysis buffer (1U RNasein plus、 0.3% NP40、 RNase free water)に希釈し、70℃で90秒の変性処理を行った。氷上で冷却後、2μl RT mix (1.5xReverTra Ace RT buffer、0.6pmol オリゴ(dT)18プライマー、7.8pmol ランダムヘキサマープライマー、1.5 x ReverTra Ace enzyme mix、RNase free water)、または、2 μl RamDA-B mix (1.5 x ReverTra Ace RT buffer、0.6pmol オリゴ(dT)18プライマー、 7.8pmol ZNA-ランダムヘキサマープライマー([Z][Z]NNNNNN; Sigma-Aldrich)、0.1U dsDNase)をそれぞれ加え、RamDA−Aと同様の操作を行った。
RamDA−Bと同様の反応溶液組成で、温度条件を変えて逆転写反応を行った。反応条件は以下の通りである。25℃10分、30℃10分、37℃2分の後、25℃2分、37℃2分を29サイクル行った。その後50℃5分、85℃5分で処理した。
鋳型RNAは、1μl Lysis buffer (1U RNasein plus、 10% Roche lysis buffer、 0.3% NP40, RNase free water) に希釈し、70℃で90秒間の変性処理を行い、使用まで氷上で保管した。逆転写酵素反応液は、PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time) (TaKaRa)を改変して用いた。1μlの変性済み鋳型RNAに2μl RT mix (1.5 x PrimeScript Buffer (for Real Time)、0.6pmol オリゴ(dT)18プライマー、 8pmolランダムヘキサマープライマー、 1.5 x PrimeScript RT Enzyme Mix I、 RNase free water)、または、2μl RamDA-D mix (1.5 x PrimeScript Buffer (for Real Time)、0.6pmol オリゴ(dT)18プライマー、8pmolランダムヘキサマープライマー、 0.2U DNase I, Amplification Grade、 100ng T4ジーン32プロテイン、1.5 x PrimeScript RT Enzyme Mix I、 RNase free water)をそれぞれ加え、25℃10分、30℃10分、37℃60分、50℃5分、85℃5分で反応を行った。
Tris−HCl, KCl, NaCl, MgCl2の濃度を変更した自家調整逆転写反応液または、First-Strand Bufferを用いる際は、これらをRamDA-D mix 中のPrimeScript Buffer (for Real Time)と置き換え、さらに dNTP Mix (Life Technologies) を終濃度で0.5 mM加えて反応を行った。各bufferの組成は、表1に記載する。
RamDA-D mix中の逆転写プライマーを、0.6pmolのオリゴ(dT)18プライマーのみとし、条件に応じてRamDA-D mixの組成を変更した。また逆転写反応の温度条件は、RamDA−Aと同様とした。
SuperScript II、SuperScript III、SuperScript IV条件は、RamDA-D mix中の逆転写酵素をPrimeScript RT Enzyme Mix Iの代わりに、30U SuperScript II(Life Technologies), 30U SuperScript III(Life Technologies), 30U SuperScript IV(Life Technologies)と6UのRNasein plusを加えた。逆転写反応液はPrimeScript Buffer (for Real Time)を共通で使用した。
RamDA−Aの反応液条件で、ヌクレアーゼを0.2U 43kDadsDNase(ArcticZymes)、 0.2U 47kDa dsDNase(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)、 0.2U duplex specific nuclease (DSN; Evrogen JSC, Moscow, Russia)にそれぞれ置き換えて比較した。反応温度条件は、RamDA−Aに準じて行い、qPCRでcDNAの増幅率を定量した。
10種類のqPCR用RTキット、Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)、 ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)、 PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)、AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit(Agilent Biotechnology)、QuantiTect Rev. Transcription Kit(Qiagen)、GoScript Reverse Transcription System(Promega)、iScript Select cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)、ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit(New England Biolabs, MA, UK)、SuperScript III(Life Technologies)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)を用いて比較した。
人工合成RNA(DAP,THR)の系では、逆転写反応液をnuclease free water (Qiagen)で希釈し、1/50量をqPCR反応液に用いた。マウスES細胞由来の10pg total RNAの系は、nuclease free waterで希釈し、1/6量、1/8量、または1/10量をqPCR反応液に用いた。qPCRはLightCyclar 480 (Roche)、または、ABI 7900HT (Life Technologies)を用いて、以下の条件で行った。qPCR反応液 10μl(1 x Quantitect SybrGreen master mix (Qiagen)、5pmol フォワードプライマー、 5pmol リバースプライマー、 3μl 希釈cDNA、 nuclease free water)を95℃ 15分で酵素を活性化したのち、95℃15秒の変性、60℃1分の伸長反応を40サイクル行った。融解曲線分析は、95℃15秒、60℃15秒、95℃15秒で行った。絶対定量用の検量線作成には、standard DNAとして、人工合成RNA用にDAP及びTHRのdsDNA混合溶液の5倍希釈シリーズ(31250、6250、1250、250、50、10、0コピー)、total RNA用にmouse genomic DNA (clonetech)の5倍希釈シリーズ(31250、6250、1250、250、50、10、0コピー)をそれぞれ用いた。cDNAはssDNAであるため、定量値の算出には検出値(dsDNAコピー)x 2で算出した。各プライマー配列は、表2に記載する。データ解析は、LightCycler 480 Software, Version 1.5(Roche)、またはSDS Software 2.1(Life Technologies)を用いて行った。
逆転写反応液をそれぞれRNase-free TE 緩衝液(Life Technologies)で20μlに希釈し、70℃10分間の変性処理後直ちに氷上で冷却した。DNAラダーマーカーには、1μlのE-Gel 1 Kb Plus DNA Ladder(Life Technologies)をRNase-free TE 緩衝液で20μlに希釈し、熱変性したものをssDNAラダー、熱変性していないものをdsDNAラダーとして用いた。ただし、Millennium RNA Markersを用いた系では、希釈後の熱変性処理を除いた。逆転写反応液とラダーマーカーは、E-Gel EX Agarose Gels、 2%(Life Technologies)に充填後、E-Gel iBase Power System(Life Technologies)で10分間泳動した。泳動像は、FAS-Digi(NIPPON Genetics Co.Ltd, Tokyo, Japan)で撮影した。
dsDNase、及びDNase Iは、RNA:DNAハイブリッド鎖中のDNAを選択的に切断する
最初にdsDNaseやDNase Iが、標準的な逆転写バッファー条件下でRNA:DNAハイブリッド鎖のDNAを選択的に切断する活性をもっているのか確かめた。
カニ由来の二本鎖特異的ヌクレアーゼは、RNA:DNAハイブリッド鎖のDNAを切断する活性があることが知られている(非特許文献11)。しかしながら、この酵素は逆転写中の温度では活性をほとんど持たない(非特許文献11)。そこで、熱不安定性で知られているエビ由来のdsDNaseに着目した(非特許文献12)。この酵素は、37℃付近で活性を有しており、二本鎖DNAを特異的に切断するため、プライマーやcDNAを消化することなく混入したDNAやゲノムDNAなどを除去する作用がある(非特許文献12及び13)。しかしながら、鎖置換反応を行うために必須なRNA:DNAハイブリッド鎖のDNAを切断する活性についての報告はまだない。そこで、Fluorescence resonance energy transfer (FRET)を用いた解析を行った。すると、二本鎖DNAに対する活性の半分程度であるが、dsDNaseには、RNA:DNAハイブリッド鎖のDNA側を選択的に切断する活性があることがわかった(図2A〜C)。また、RNA:DNA ハイブリッド鎖中のRNA鎖、一本鎖DNA、一本鎖RNAに対しては、ほぼ活性を有していないことも確認した(図2D〜F)。dsDNaseをさらに熱不安定性にしたHeat-labile double-strand specific DNase (HL−dsDNase)でも同様の結果を得たが、ヌクレアーゼ活性は、dsDNaseよりも低いことがわかった(図2A〜C)。一方で、非特異的DNA分解酵素であるDNase Iを用いた場合、dsDNaseと同様にRNA:DNAハイブリッド鎖中のDNAを選択的に切断する活性を示したが、一本鎖DNAに対する活性も低いながら示した(図2B,E)。このため、まずは一本鎖DNAに対して分解活性を示さないdsDNaseを用いたRT−RamDA法の検証を行うことにした。
dsDNaseが、実際に逆転写反応で合成されたcDNAに作用し断片化されているのか、また、それにより鎖置換反応が起こりcDNAが増幅されているのか、これらを確かめるために、poly−A付加された約2kbの人工合成RNAを鋳型に用いて逆転写し、ゲル電気泳動によるcDNAの断片化の有無と、RT−qPCRを用いてcDNA量の収量を測定した。その結果、標準の逆転写法(RamDA(−))では、オリゴdTプライマー、 ランダムヘキサマープライマーいずれも、断片化はほとんど起きていないことが分かった。一方で、RamDA(+)では、cDNAが断片化し、スメアーな電気泳動像が得られた(図3A)。これは、dsDNaseによるRNA:cDNAハイブリッド鎖中のcDNA側の切断作用によるもであることが示唆された。次に、鎖置換反応による増幅を定量的に検出するため、qPCRによるcDNAの絶対定量を行った。鋳型RNAには、人工合成RNAのDap(1,910b)とThr(2,052b)をそれぞれ 100fg(Dap: 96,725コピー、Thr:89,991コピー)ずつマウスES細胞由来の10pg total RNA(1細胞相当量)に混ぜて逆転写を行った。qPCRによる定量は、それぞれの人工合成RNAに対して、3’末端から5’末端にかけて12カ所の領域でqPCR プライマーを設計し、各領域における検出量を測定した。その結果、Dap、Thrともに、RamDA(−)コントロール条件では、オリゴdTプライマー及び、ランダムヘキサマープライマー、どちらの条件においても全領域でほぼ一定の検出量を示した(図3B)。一方でRamDA(+)においては、ランダムヘキサマープライマーだけでなく、オリゴdTプライマーを用いた条件であっても、3’側から500nt以上の領域でcDNAの検出量がRamDA(−)コントロールと比べて、安定して10倍近く増加していることが分かった(図3B)。また、増加量は、3’末端付近で相対的に少ないことが分かった(図3B)。これらのことから、RamDA(+)におけるcDNA検出量の増加は、鎖置換反応による増幅であること、さらに、dsDNaseによって形成されたcDNA側のニックが鎖置換反応の起点となっていることが示唆された。
RT−RamDA法に利用できるdsDNase酵素と逆転写酵素を調べるため、他のdsDNaseや種々の逆転写酵素を用いた条件でも増幅効果が得られるかどうかを確かめた。まず、dsDNaseについては、ArcticZymes社が販売するdsDNase(43kDa)とaffymetrix社のdsDNase(47kDa)、 Evrogen社のduplex spesific nuclease (DSN)の3つの酵素で比較を行った。1細胞相当のtotal RNA量であるマウスES細胞由来の10pg total RNAを用いて逆転写を行ったところ、両dsDNase添加サンプルでcDNAの検出量に大きな増加が見られた(図4A)。活性温度の違いによりDSNの増幅率は僅かであったが、二本鎖特異的DNaseであれば、特定の酵素に限定されないことがわかった。
本発明者らは、増幅率の向上に着目した派生法、T4ジーン32プロテインなしのRT−RamDA法(RamDA−B)とRT−RamDA熱サイクル法(RamDA−C)を開発した。鎖置換反応において、鋳型の二次構造形成は、増幅の障害となる。本発明者らは、この二次構造を緩める役割としてRT−RamDA法(RamDA−A)にT4ジーン32プロテインを導入した。しかしながら、同時にDNA:RNAハイブリッド鎖の不安定化をもたらし、dsDNaseの活性を抑制していることが推測された。そこで、T4ジーン32プロテインなしのRamDA−Bを試みることにした。マウスES細胞由来の10pg total RNAを鋳型にcDNA合成を行ったところ、RamDA−Bの条件でGnb2l1、Oct3/4の検出量が標準逆転写法(RamDA(−))と比べて40倍以上になることが分かった(図5A)。一方で、Nanog、Sox2、Eef1b2などでは、RamDA−Aと大きな差が見られなかった(図5A)。
RT−RamDA法において、dsDNaseを用いる最大の理由は、dsDNaseが、一本鎖DNAである増幅cDNA,逆転写プライマーに対してヌクレアーゼ活性を持たないためである。しかしながら、非特異的DNA分解酵素であるDNase I自体も、そもそも二本鎖DNAと比べて一本鎖DNAに対するヌクレアーゼ活性が低く(非特許文献12)、さらに、K+、Na+など一価の陽イオン依存的にヌクレアーゼ活性が下がることが知られている(非特許文献23、24)。一方で、逆転写に使用される一般的な反応液組成((First-Strand buffer (Life Technologies)、PrimeScript Buffer (for cDNA synthesis ) (TaKaRa)、Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis RT-Buffer (Thermo Fisher)、 M-MuLV Reverse Transcriptase Reaction Buffer (New England Biolabs), AffinityScript RT Buffer (Agilent Biotechnology)など)は、50 mM Tris-HCl、75 mM KCl、3 mM MgCl2とTris−HClとKClの濃度が高い。つまり、逆転写反応液条件下では、DNase Iの一本鎖DNAに対するヌクレアーゼ活性が低くRT−RamDA法が機能するのではないかと予測された。実際にFRET解析を用いて、DNase I reaction Buffer(Life Technologies)の組成である20 mM Tris-HCl、50 mM KCl、2 mM MgClを基準にTris−HCl、KClの濃度を上げてヌクレアーゼ活性を測定してみたところ、Tris−HCl、KClともに高濃度条件下では、二本鎖DNAだけでなく、一本鎖DNA、RNA:DNAハイブリッド鎖中DNAに対するDNase Iのヌクレアーゼ活性が大きく阻害されることが分かった(図6)。逆転写反応液と同等のTris−HCl,KCl濃度では、DNase I reaction Bufferの条件と比べて、それぞれ、43%、16%、14%と活性が抑制されていた(図6、##)。
T4ジーン32プロテインは、一本鎖DNAに結合することで、ヌクレアーゼから一本鎖DNAを保護する作用が報告されている(非特許文献25)。そこで、poly−A付加された人工合成RNAを鋳型に、オリゴdTプライマーのみを用いたRT−RamDA法によるcDNAの断片化状態をT4ジーン32プロテインありなしで検証した(図8)。その結果、DNase I、dsDNase共に、T4ジーン32プロテインと組み合わせることで、その泳動パターンから、DNase単独の条件よりもcDNAの断片化が抑制されることが分かった(図8、A)。BioAnalyzerの分析においては、同様の結果を得ただけでなく、DNaseを作用させることで、cDNAの収量が10倍近く増えることが分かった(図8、B)。これは、鎖置換反応によりcDNAがグローバルに増幅されていることを示唆するものと考えられる。次に、qPCRを用いて、鋳型RNAにおける3’末端から5’末端への増幅率を検証した(図9)。その結果、DNase Iを単独で用いた場合、ほとんど増幅は見られなかったが、T4ジーン32プロテインと組み合わた場合、10倍近い増幅が観察された(図9,A、B)。さらに、3’末端側での増幅率が、dsDNaseと比較して改善されていることが分かった(図9,A)。一方、dsDNaseの場合、一本鎖DNAに対する分解活性が元々ないため、単独で作用させるだけでも高い増幅率を示した。しかしながら、同一RNA上での増幅率の変動が大きいという結果となった(図9,A、C)。この条件は、RamDA−Bとほぼ同等の条件であることから、T4ジーン32プロテインがないと、遺伝子間だけでなく、同一遺伝子内での増幅の変動が大きくなることが示唆された。これらのことから、DNase Iを用いたRamDA−Dにおいて、T4ジーン32プロテインは、cDNAの分解を抑制し、遺伝子間、遺伝子内での増幅率の安定化に寄与する2つの役割をもつことが示唆された。
DNase Iを用いたRT−RamDA法が機能するには、増幅cDNAの分解量が、RNA:cDNA鎖へのニック形成による鎖置換増幅量よりも小さいこと、つまり、一本鎖DNAに対するヌクレアーゼ活性が、RNA:DNAハイブリッド鎖中のDNAに対する活性よりも十分に小さいことが重要と言える。cDNAの断片化と増幅率の実験(図8,9)から、T4ジーン32プロテインがこれに寄与していることが推測された。そこで、FRET解析を用いて逆転写反応液中のT4ジーン32プロテインのヌクレアーゼ活性への作用を検証した(図10)。その結果、逆転写反応液中にT4ジーン32プロテインを加えることで、一本鎖DNAに対する活性が、25%に減少することが分かった。一方、二本鎖DNAに対してはほぼ変動がなく、RNA:DNAハイブリッド鎖中のDNAに対する活性は、60%ぼどであった(図10、A)。次にRNA:DNAハイブリッド鎖中のDNAへのヌクレアーゼ活性に対する一本鎖DNAへの活性の比を検証した。すると、T4ジーン32プロテインを加えることで、40%から14%へと活性比が改善することが分かった(図10、B)。この比の改善が、RT−RamDA法を有効にするためのキーファクターであると推測される。一方でdsDNaseの場合は、T4ジーン32プロテインの非存在下においても活性比は7%程度しかなく、このため、T4ジーン32プロテインなしのRamDA−B,−Cが十分に機能するものと考えられる(図10、B)。
反応時間依存的に増幅率の改善が見込まれるのか、マウスES細胞の1細胞溶解液を鋳型に用いて検証した(図11)。qPCRを用いてcDNAの収量の相対値をみたところ、37℃における反応時間を30、60,120分と増やすことで、収量も約10、20、30倍と増えることが分かった(図11)。この様な現象は、dsDNaseを用いたRamDA−Aでは見られなかった(データ非掲載)。dsDNaseは、逆転写反応液中、特にT4ジーン32プロテイン存在下で、著しくヌクレアーゼ活性が阻害されており、RNA:DNAハイブリッド鎖中のDNAへのヌクレアーゼ活性は、DNase Iと比べて6%程度しかなかった(図10、A)。このことが、DNase I とdsDNaseを用いた際の増幅率の違いとなっているのかもしれない。一方で、RamDA−Dは、細胞溶解液の様な不純物を含むクルードサンプルにおいても問題無く機能することが確認された。さらに逆転写反応中での二本鎖DNAに対するヌクレアーゼ活性についてもdsDNaseと比べてDNase Iを用いた方が高いことから、増幅率だけでなく、コンタミネーション除去能力についてもRamDA−Dが有効であることが示唆された(図10、A)。
RamDA−Dが、特定のRNase Hマイナス型逆転写酵素に限定されるのかどうかを確かめるため、PrimeScript RT Enzyme Mix I 以外にSuperScriptシリーズ(Life Technologies)の逆転写酵素を用いて検証を行った(図12)。その結果、SuperScript II, IIIでcDNAの増幅が確認できた。なかでもSuperScript IIは、PrimeScript RT Enzyme Mix Iに匹敵する増幅率を示した(図12、SSII)。さらにMaxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)や ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)を用いた場合でもRamDA−Dが機能することを確認した(データ非掲載)。これらのことから、RamDA−Dは、特定のRNase Hマイナス型逆転写酵素に限定されないことがわかった。さらに、200pg, 1ngと、1細胞相当量である10pg total RNAよりも多いRNA量からでも問題なくRamDA−Dが機能することが分かった(図12、200 pg, 1ng)。このことから、少なくとも100細胞相当量の鋳型RNA量を用いても十分に増幅性能が担保されていることが示唆された。
Claims (17)
- 鋳型RNA、プライマー、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、RNase Hマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含み、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素が、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のDNA鎖を切断する活性を有する酵素である、核酸の増幅方法。
- RNase Hマイナス型逆転写酵素のRNA依存性DNAポリメラーゼ活性により鋳型RNAの相補鎖DNA(cDNA)を合成し、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素によりRNAとcDNAとのハイブリッド鎖のうちのcDNA鎖を無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、RNase Hマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により3’側のcDNA鎖がRNAから剥がされ、RNase Hマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなcDNA鎖が合成される工程を含む、請求項1に記載の核酸の増幅方法。
- 前記混合物がDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素として二本鎖特異的DNA分解酵素を含み、二本鎖特異的DNA分解酵素が、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のDNA鎖を切断する活性を有し、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のRNA鎖、一本鎖DNA及び一本鎖RNAを切断する活性を実質的に有さない酵素である、請求項1又は2に記載の核酸の増幅方法。
- 前記混合物がDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素として非特異的DNA分解酵素を含み、非特異的DNA分解酵素が、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のDNA鎖を切断する活性を有し、RNAとDNAとのハイブリッド鎖のRNA鎖、及び一本鎖RNAを切断する活性を実質的に有さない酵素である、請求項1又は2に記載の核酸の増幅方法。
- DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素が、60℃未満でもDNA分解活性を有する酵素である、請求項1から4の何れか1項に記載の核酸の増幅方法。
- 二本鎖特異的DNA分解酵素が、甲殻類由来の二本鎖特異的DNA分解酵素又はその改変体である、請求項3に記載の核酸の増幅方法。
- 二本鎖特異的DNA分解酵素が、エビ由来の二本鎖特異的DNA分解酵素又はその改変体である、請求項6に記載の核酸の増幅方法。
- 非特異的DNA分解酵素が、ほ乳類由来の非特異的DNA分解酵素又はその改変体である、請求項4に記載の核酸の増幅方法。
- 非特異的DNA分解酵素が、ウシ由来の非特異的DNA分解酵素又はその改変体である、請求項8に記載の核酸の増幅方法。
- プライマーが、ランダムプライマー、オリゴdTプライマー又は配列特異的プライマーの1種以上である、請求項1から9の何れか1項に記載の核酸の増幅方法。
- プライマーが、カチオンユニットの修飾によってTm値が上昇しているプライマーである、請求項1から10の何れか1項に記載の核酸の増幅方法。
- プライマーが、Zip Nucleic Acid (ZNA) プライマーである、請求項1から11の何れか1項に記載の核酸の増幅方法。
- 混合物がさらに、一本鎖DNA結合タンパク質を含む、請求項1から12の何れか1項に記載の核酸の増幅方法。
- 鋳型RNAが、1細胞から数百細胞相当の微量RNAである、請求項1から13の何れか1項に記載の核酸の増幅方法。
- DNAシーケンスライブラリ作製に供するcDNAの増幅のために行う、請求項1から14の何れか1項に記載の核酸の増幅方法。
- DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、およびRNase Hマイナス型逆転写酵素を少なくとも含む、請求項1から15の何れか1項に記載の核酸の増幅方法を行うためのキット。
- さらに一本鎖DNA結合タンパク質を含む、請求項16に記載のキット。
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