KR20130062296A

KR20130062296A - cDNA 의 합성 방법

Info

Publication number: KR20130062296A
Application number: KR1020127032358A
Authority: KR
Inventors: 유코 나카바야시; 다카시 우에모리; 히로유키 무카이; 기요조 아사다
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2013-06-12
Also published as: JP5940447B2; CN102884186A; JPWO2011142310A1; WO2011142310A1; EP2570480A1; EP2570480B1; US20130065281A1; CN102884186B; US9169482B2; KR101697811B1; EP2570480A4

Abstract

RNA 및 DNA 를 포함하는 시료 중의 DNA 를 엔도데옥시리보뉴클레아제에 의해 분해하여 처리 시료로 한 후, 엔도데옥시리보뉴클레아제의 열 실활 또는 엔도데옥시리보뉴클레아제의 제거를 실시하지 않고서, 당해 처리 시료 및 역전사 효소를 함유하고, 또한 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액을 조제하여 역전사 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 cDNA 의 합성 방법.
본 발명의 cDNA 합성 방법 및 키트는 유전자 공학의 분야에서 널리 유용하다.

Description

cDNA 의 합성 방법{METHOD FOR SYNTHESIZING CDNA}

본 발명은 cDNA 의 합성에 유용한 방법 및 cDNA 의 합성에 유용한 키트에 관한 것이다.

생명 현상을 해명하기 위해서는, 다양한 유전자의 mRNA 분자의 해석이 매우 중요하다. RNA 의존성 DNA 폴리머라아제, 즉 역전사 효소의 발견에 의해 RNA 를 주형으로 cDNA 를 합성하는 역전사 반응이 가능하게 되고, mRNA 분자의 해석법은 장족의 발전을 이루어, 역전사 효소를 사용한 mRNA 분자의 해석법은 현재 유전자에 관한 연구에 있어서 필수적인 실험법이 되었다. 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 를 주형으로 하여 DNA 단편을 증폭하는 PCR 법은 RT-PCR 법이라 불리고 있다. RT-PCR 법은 mRNA 유래의 cDNA 의 클로닝이나 cDNA 라이브러리의 제작에 이용되는 외에 특정한 RNA 의 발현 상태를 조사하는 방법으로도 유용하다.

그러나, cDNA 합성에 사용되는 시료 중에 DNA 가 혼재하는 경우에는, RNA 를 코드하고 있는 DNA 상의 영역이나 가짜 유전자가 증폭되는 경우가 있으므로, RNA 를 주형으로 하여 합성된 DNA 만을 선택적으로 취득하는 것이 어려워진다. 시료 중에 혼재된 DNA 유래의 증폭 산물의 생성을 방지하기 위해, 역전사 반응시에 뉴클레오티드 아날로그와 Tm 값을 저하시키는 화합물을 사용하는 방법 (특허문헌 1) 이나, 시료 중의 DNA 를 데옥시리보뉴클레아제 I (이하, DNaseI 이라고 하는 경우가 있다) 등의 엔도데옥시리보뉴클레아제 (이하, 엔도 DNase 라고 하는 경우가 있다) 에 의해 분해한 후에 역전사 반응을 실시하는 방법 등이 채용되고 있다.

시료 중의 DNA 를 DNaseI 에 의해 분해한 후에 역전사 반응을 실시하는 경우, cDNA 의 분해를 방지하기 위해, 열처리나 페놀/클로로포름 추출 등에 의해 DNaseI 을 역전사 반응 전에 불활성화 또는 제거하는 것이 일반적이다. 그러나, 페놀/클로로포름 추출은 번잡하고, 또한, DNaseI 의 반응에 필수적인 2 가의 금속 이온은 그 존재 하에서의 열처리에 의해 RNA 의 가수 분해를 일으키는 것이 알려져 있다. DNaseI 과 역전사 효소를 동시에 작용시키는 방법도 제안되어 있으나 (특허문헌 2, 3), DNaseI 은 DNA/RNA 하이브리드 중의 DNA 도 분해하므로, 이 방법으로 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 는 DNaseI 에 의해 분해를 당한다.

국제 공개 제 99/09213호 팜플렛 일본 공개특허공보 2005-304396호 국제 공개 제 2006/103039호 팜플렛

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 시료 중에 혼재하는 DNA 유래의 증폭 산물의 생성을 간편하게 방지할 수 있는 cDNA 합성 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 엔도 DNase 가 활성을 나타내지 않고, 또한 역전사 효소가 활성을 나타내는 반응액 조성을 조제할 수 있는 것을 알아내고, 나아가 이 지견에 기초하여 상기 과제를 해결할 수 있는 cDNA 의 합성 방법 및 cDNA 합성용 키트에 관한 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은,

[1] RNA 및 DNA 를 포함하는 시료 중의 DNA 를 엔도데옥시리보뉴클레아제에 의해 분해하여 처리 시료로 한 후, 엔도데옥시리보뉴클레아제의 열 실활 또는 엔도데옥시리보뉴클레아제의 제거를 실시하지 않고서, 당해 처리 시료 및 역전사 효소를 함유하고, 또한 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액을 조제하여 역전사 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 cDNA 의 합성 방법,

[2] (a) RNA 및 DNA 를 포함하는 시료 및 엔도데옥시리보뉴클레아제를 포함하는 조성물을 얻는 공정, (b) 엔도데옥시리보뉴클레아제가 시료 중의 DNA 를 분해하는데 충분한 조건으로, 공정 (a) 에서 얻어진 조성물을 처리하는 공정, 및 (c) 공정 (b) 에서 처리된 조성물에 첨가제와 역전사 효소를 첨가하여 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액을 조제하여, 역전사 효소에 의한 역전사 반응을 실시하는 공정을 포함하는 [1] 에 기재된 방법,

[3] 엔도데옥시리보뉴클레아제가 데옥시리보뉴클레아제 I 인 [1] 에 기재된 방법,

[4] 역전사 효소가 모로니 마우스 백혈병 바이러스 유래 역전사 효소인 [1] 에 기재된 방법,

[5] 첨가제가 환원제, 1 가 카티온 및 그 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1 종인 [2] 에 기재된 방법,

[6] 1 가 카티온이 암모늄 이온인 [5] 에 기재된 방법,

[7] cDNA 의 증폭 방법으로서, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 합성된 cDNA 를 주형으로 하여 유전자 증폭 반응을 실시하는 공정을 포함하는 방법, 및

[8] (A) 엔도데옥시리보뉴클레아제, (B) 완충제, (C) 역전사 효소, 및 (D) 역전사 효소가 활성을 나타내고, 또한 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 역전사 반응용의 조성물을 조제하기 위한 첨가제를 포함하는, [1] ∼ [7] 중 어느 하나에 기재된 방법을 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 시료 중에 혼재하는 DNA 유래의 증폭 산물의 생성을 방지하는 것이 가능하고, 또한 조작성이나 정량성 등이 우수한 cDNA 의 합성이 가능해진다.

도 1 은 실시예 2 에 있어서의 아가로오스 겔 전기 영동의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는 실시예 8 에 있어서의 리얼타임 PCR 의 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명의 cDNA 합성 방법은, RNA 및 DNA 를 포함하는 시료 중의 DNA 를 엔도데옥시리보뉴클레아제에 의해 분해하여 처리 시료로 한 후, 엔도데옥시리보뉴클레아제의 열 실활 또는 엔도데옥시리보뉴클레아제의 제거를 실시하지 않고서, 당해 처리 시료 및 역전사 효소를 함유하고, 또한 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액을 조제하여 역전사 반응을 실시하는 것을 특징으로 한다.

종래, 시료 중의 DNA 를 엔도 DNase 에 의해 분해한 후에 역전사 반응을 실시하는 방법에서는, 역전사 반응 전에 엔도 DNase 를 열 실활하거나 엔도 DNase 를 제거할 필요가 있었으나, 본 발명의 방법에서는 이러한 조작이 필요없다. 즉, 본 발명에 의하면 엔도 DNase 에 의한 시료 중의 DNA 의 분해와 역전사 반응 사이에 60 ℃ 이상의 열처리 또는 특정 성분의 분리 조작을 실시할 필요는 없다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「엔도데옥시리보뉴클레아제 (엔도 DNase) 의 열 실활」 이란 엔도 DNase 를 포함하는 시료를 60 ℃ 이상에서 열처리하는 것을, 「엔도데옥시리보뉴클레아제 (엔도 DNase) 의 제거」 란 엔도 DNase 를 포함하는 시료로부터 엔도 DNase 를 분리하는 것을 나타내고, 「엔도데옥시리보뉴클레아제의 열 실활 또는 엔도데옥시리보뉴클레아제의 제거를 실시하지 않고서」 란 상기와 같은 조작을 실시하지 않는 것이다.

본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 사용하는 시료로는, RNA 를 포함하는 시료이면 되고, 예를 들어, RNA 및 DNA 를 포함하는 시료를 들 수 있다. 구체적으로는, 세포, 조직, 혈액과 같은 생체 유래 시료, 이것을 공지된 방법으로 처리함으로써 얻어지는 핵산 함유 시료, 식품, 토양, 배수와 같은 생물을 함유할 가능성이 있는 시료가 예시된다. 생체 유래 시료를 공지된 방법으로 처리함으로써 얻어지는 핵산 함유 시료의 예로는, 예를 들어 세포 파쇄물이나 그를 분획하여 얻어지는 시료, 그 시료 중의 전체 RNA, 혹은 특정한 RNA 분자군, 예를 들어, mRNA 를 부화 (富化) 한 시료 등을 들 수 있고, 그들 안에 DNA 가 혼재하는 시료이어도 된다.

본 명세서에 있어서 엔도데옥시리보뉴클레아제 (엔도 DNase) 란, DNA 사슬을 엔도형으로 절단하는 효소를 말한다. 본 발명에 사용되는 엔도 DNase 로는 2 개 사슬 DNA 특이적 엔도 DNase 가 바람직하게 예시되고, 예를 들어 DNaseI 이나 Shrimp DNase 등의 배열 비특이적 엔도뉴클레아제나 제한 효소 등의 배열 특이적 엔도뉴클레아제가 보다 바람직하게 예시된다.

시료 중의 DNA 를 엔도 DNase 에 의해 분해한 처리 시료로는, 시료 중의 DNA 가 엔도 DNase 에 의해 분해되는 조건 하에 유지된 시료이면 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 사용하는 엔도 DNase 나 시료에 따라 적절히 조제할 수 있다. 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 엔도 DNase 로서 DNaseI 을 사용하는 경우 유지하는 조건으로 바람직하게는 20 ℃ ∼ 45 ℃ 에서 10 초 ∼ 12 시간, 보다 바람직하게는 25 ℃ ∼ 44 ℃ 에서 30 초 ∼ 1 시간, 더욱 바람직하게는 30 ℃ ∼ 43 ℃ 에서 1 분 ∼ 30 분의 조건이 예시된다.

본 발명에 사용되는 역전사 효소는 역전사 활성, 즉 RNA 를 주형으로 하여 여기에 상보적인 DNA 를 합성하는 활성을 갖는 효소이면 되고, 예를 들어 모로니 마우스 백혈병 바이러스 유래 역전사 효소 (MMLV 유래 역전사 효소) 나 트리 골수 아구증 바이러스 유래 역전사 효소 (AMV 유래 역전사 효소) 등의 바이러스 유래의 역전사 효소, 호열성 바실루스 (Bacillus) 속 세균 유래 DNA 폴리머라아제 (Bca DNA 폴리머라아제 등) 등의 진정 세균 유래의 역전사 효소, 테르무스 (Thermus) 속 세균 유래의 역전사 활성과 DNA 의존성 DNA 폴리머라아제 활성을 겸비하는 DNA 폴리머라아제 (Tth DNA 폴리머라아제 등) 가 예시된다. 본 발명에는, 바이러스 유래의 역전사 효소가 바람직하게 사용되고, MMLV 유래 역전사 효소가 보다 바람직하게 사용된다. 또한, 역전사 효소는 천연 유래 효소 또는 재조합체 효소 모두 본 발명에 사용할 수 있고, 역전사 활성을 갖는 범위에서 천연 유래의 아미노산 배열에 개변이 실시된 역전사 효소도 본 발명에 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액」 이란, 「엔도데옥시리보뉴클레아제가 DNA 분해 활성을 나타내지 않는 반응액」 으로, 예를 들어, 당해 반응액에 40 ㎍/㎖ 의 송아지 흉선 DNA 를 함유시키고, 이것을 제품에 표시된 역가로 8 U/㎖ 의 DNaseI (다카라 바이오사) 의 존재 하에서 25 ℃, 10 분간 유지하여도 260 ㎚ 의 흡광도가 실질적으로 변화하지 않는 반응액을 말한다.

당해 처리 시료 및 역전사 효소를 함유하고, 또한 엔도 DNase 가 활성을 나타내지 않는 반응액은, 예를 들어, 엔도 DNase 에 의한 시료 중의 DNA 의 분해를 실시한 후의 반응액에 엔도 DNase 가 DNA 분해 활성을 나타내지 않는 조성이 되도록 첨가제, 역전사 효소, 기타 성분을 첨가함으로써 조제할 수 있다. 즉, (a) 시료 및 엔도데옥시리보뉴클레아제를 포함하는 조성물을 얻는 공정, (b) 엔도데옥시리보뉴클레아제가 시료 중의 DNA 를 분해하는데 충분한 조건으로 공정 (a) 에 의해 얻어진 조성물을 처리하는 공정, 그리고 (c) 공정 (b) 에서 처리된 조성물에 첨가제와 역전사 효소를 첨가해 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액을 조제하여 역전사 반응을 실시하는 공정을 포함하는 방법은 본 발명의 방법의 바람직한 양태의 하나이다.

상기의 공정 (a) 에 있어서의 시료 및 엔도데옥시리보뉴클레아제를 포함하는 조성물에는, 추가로 Tris-HCl 등의 완충제, 마그네슘 이온이나 망간 이온 등의 2 가의 금속 이온, 및 디티오트레이톨 (Dithiothreitol, 이하, DTT 라고 하는 경우가 있다) 등의 환원제가 포함되는 것이 바람직하다. 완충제, 2 가의 금속 이온, 및 환원제의 종류나 농도는, 다음의 공정 (b) 에 있어서 엔도 DNase 가 시료 중의 DNA 를 분해하는 활성을 나타내는 범위 내에서, 엔도 DNase 의 반응 특성이나 안정성 등의 효소 학문적 성질, 혹은 실험에 기초하여 적절히 선택 가능하며, 엔도 DNase 가 높은 활성을 나타내고, 또한 높은 안정성을 나타내도록 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 완충제의 종류나 농도는 그 첨가에 의해 엔도 DNase 의 지적 (至適) pH 부근으로 설정하면 되어, 예를 들어, 엔도 DNase 로서 DNaseI 을 사용하는 경우, pH 5 ∼ 10 로 반응액의 pH 를 조정하는 것이 가능한 것이 바람직하다. 또한, 환원제의 종류나 농도는, 엔도 DNase 가 높은 안정성을 나타내도록 설정하면 되고, 예를 들어, 엔도 DNase 로서 DNaseI 을 사용하는 경우, 1 mM 이상 5 mM 미만의 DTT 를 조성물 중에 함유시키는 것이 바람직하다.

상기의 공정 (b) 에 있어서의 엔도데옥시리보뉴클레아제가 시료 중의 DNA 를 분해하기에 충분한 조건은, 후의 역전사 반응이나 그 후의 핵산 증폭 반응에 있어서, 시료 중의 DNA 유래의 산물을 실질적으로 확인할 수 없게 되도록 DNA 의 분해가 실시되는 온도나 시간의 조건이면 특별히 한정은 없고, 당업자라면 사용하는 엔도 DNase 나 시료에 따라 적절히 설정할 수 있다. 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 엔도 DNase 로서 DNaseI 을 사용하는 경우, 20 ℃ ∼ 45 ℃ 에서 10 초 ∼ 12 시간의 조건이 바람직하게 예시되고, 25 ℃ ∼ 44 ℃ 에서 30 초 ∼ 1 시간의 조건이 보다 바람직하게 예시되고, 30 ℃ ∼ 43 ℃ 에서 1 분 ∼ 30 분의 조건이 보다 바람직하게 예시된다.

상기의 공정 (c) 에 있어서의 첨가제로는, 환원제, 1 가 카티온 및 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이 예시된다. 첨가제는, 예를 들어, 당해 첨가제를 포함하는 수용액, 바람직하게는 당해 첨가제를 포함하는 완충액의 형상으로서 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 완충액에 사용하는 완충제의 종류나 농도는 반응액을 원하는 pH 로 할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없지만, 그 첨가에 의해 역전사 반응에 사용하는 역전사 효소의 지적 pH 부근으로 반응액의 pH 를 변화시키는 것이 가능한 것이 바람직하다. 상기의 완충제로는, 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만 Tris-HCl 등의 굿 버퍼가 예시된다. 상기의 환원제로는, 예를 들어 DTT 등의 티올 환원제나 2-메르캅토에탄올이 예시된다. 또한, 상기의 1 가 카티온으로는, 암모늄 이온, 그리고 칼륨 이온, 리튬 이온, 및 나트륨 이온 등의 알칼리 금속 이온 등이 예시되고, 이들의 염, 예를 들어 황산암모늄이나 염화칼륨을 사용해도 된다. 환원제나 1 가 카티온 또는 그 염의 종류나 사용량은, 첨가제를 첨가한 조성물에 있어서 엔도 DNase 가 활성을 나타내지 않고, 또한 역전사 효소가 유효하게 기능하는 조성이 되는 것이면 특별히 한정은 없고, 당업자라면 본 명세서의 개시에 기초하여 적절히 결정할 수가 있다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 엔도 DNase 가 활성을 나타내지 않고, 또한 역전사 효소가 유효하게 기능하는 조성물에 포함되는 성분으로는, 예를 들어 엔도 DNase 가 DNaseI 인 경우, 황산암모늄, DTT 및 염화칼륨이 예시된다. 황산암모늄의 조성물 중의 농도로는 5 mM 이상이 바람직하게 예시되고, 10 mM ∼ 30 mM 가 보다 바람직하게 예시되고, 14 mM ∼ 28 mM 가 더욱 바람직하게 예시된다. 또한 DTT 의 농도로는, 5 mM 이상이 바람직하게 예시되고, 11 mM ∼ 30 mM 가 보다 바람직하게 예시되고, 12 mM ∼ 20 mM 가 더욱 바람직하게 예시된다. 또한, 염화칼륨의 농도로는, 1 mM 이상이 바람직하게 예시되고, 3 mM ∼ 30 mM 가 보다 바람직하게 예시되고, 5 mM ∼ 20 mM 가 더욱 바람직하게 예시된다. 구체적으로는, 조성물 중의 최종농도로, 바람직하게는 5 mM 이상의 황산암모늄, 5 mM 이상의 DTT, 및 1 mM 이상의 염화칼륨을 포함하도록, 보다 바람직하게는 10 mM ∼ 30 mM 의 황산암모늄, 11 mM ∼ 30 mM 의 DTT, 및 3 mM ∼ 30 mM 의 염화칼륨을 포함하도록, 더욱 바람직하게는 14 mM ∼ 28 mM 의 황산암모늄, 11 mM ∼ 30 mM 의 DTT, 및 5 mM ∼ 20 mM 의 염화칼륨을 포함하도록, 더욱 바람직하게는 14 mM ∼ 28 mM 의 황산암모늄, 12 mM ∼ 20 mM 의 DTT, 및 5 mM ∼ 20 mM 의 염화칼륨을 포함하도록 상기 첨가제를 배합한다.

또한, 상기 첨가제는 역전사 효소, 완충제, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 dNTP 등의 역전사 반응에 필요한 성분과 혼합한 역전사 반응액 조제용의 완충액으로서 본 발명에 사용할 수 있다. 조작성과 역전사 효소의 안정성을 고려하면, 역전사 효소 이외의 역전사 반응에 필요한 성분은 이 완충액에 함유시켜, 역전사 효소만을 별도 첨가하는 양태가 바람직하다.

역전사 반응의 조건은 주형 RNA 에 상보적인 프라이머 신장 사슬을 합성하기에 충분한 조건이면 특별히 한정은 없다. 주형 RNA 에 상보적인 프라이머 신장 사슬을 합성하기에 충분한 조건이란, 특별히 한정하는 것은 아니지만, 온도 조건으로는 25 ∼ 60 ℃ 가 바람직하고, 30 ∼ 50 ℃ 가 보다 바람직하다. 또한, 반응 시간으로는 5 ∼ 120 분이 바람직하고, 15 ∼ 60 분이 보다 바람직하다. 또한, 역전사 반응 후에 역전사 효소가 불활성화되는 조건으로 반응액을 인큐베이트해도 된다. 역전사 효소를 불활성화하는 조건으로는, 예를 들어 85 ℃ 에서 5 초간의 조건이 예시된다.

본 발명의 cDNA 의 증폭 방법은 본 발명의 cDNA 의 합성 방법에 의해 합성된 cDNA 를 주형으로 하여 유전자 증폭 반응을 실시하는 공정을 포함한다. cDNA 를 주형으로 한 핵산의 증폭에는 PCR 법, ICAN 법, LAMP 법, SDA 법 등의 이 분야에서 주지된 유전자 증폭법을 이용할 수 있다. 예를 들어 핵산의 증폭에 PCR 법을 사용하는 경우, 일반적인 PCR 의 조건을 적용할 수 있고, 예를 들어, 2 개 사슬 주형 DNA 의 한 개 사슬로의 해리 (변성), 한 개 사슬 주형 DNA 로의 프라이머의 어닐링, 프라이머로부터의 상보 사슬 합성 (신장) 의 3 개의 단계로 이루어지는 반응에 의해, 또는 「셔틀 PCR」[「PCR 법 최전선」, 「단백질 핵산 효소」 별책, 제 41 권, 제 5 호, 425 페이지 ∼ 428 페이지 (1996)] 로 불리는, 상기 서술한 3 단계 반응 중 프라이머의 어닐링 및 신장의 단계를 동일 온도에서 실시하는 2 단계 반응에 의해 실시된다. PCR 법으로는, 인터컬레이팅 색소나 FRET 표지 프로브 등을 이용하여 핵산의 증폭을 모니터링할 수 있는 리얼타임 PCR 도 이용할 수 있다.

본 발명의 키트는 본 발명의 cDNA 의 합성 방법 또는 본 발명의 cDNA 의 증폭 방법에 사용하기 위한 키트로, (A) 엔도데옥시리보뉴클레아제, (B) 완충제, (C) 역전사 효소, 및 (D) 역전사 효소가 활성을 나타내고, 또한 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 역전사 반응용의 조성물을 조제하기 위한 첨가제를 포함한다. 상기 (B) 의 완충제에는, 엔도 DNase 의 반응에 필요한 2 가의 금속 이온 등이 포함되어 있어도 된다. 또한, (D) 의 첨가제에는, 역전사 효소에 의한 역전사 반응에 필요한 올리고뉴클레오티드 프라이머나 dNTP 가 포함되어 있어도 된다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 엔도 DNase 활성을 억제하는 반응 조성의 탐색 - 1

5 U 의 DNaseI [Recombinant DNase I (RNase-free), 다카라 바이오사], 200 ng 의 마우스 게놈 DNA, 및 표 1 에 기재된 성분을 함유하는 20 ㎕ 의 반응액을 5 종류 (반응액 1 ∼ 5) 조제하였다. 또한, DNaseI 을 포함하지 않는 것 이외에는 상기와 동일한 조성의 반응액 20 ㎕ 를 5 종류 조제하였다. 또한, 반응액 1 은, 각 성분이 DNaseI 의 표준적인 반응액 조성의 절반의 농도가 되도록 설정되어 있고, 반응액 2 는 역전사 효소의 지적 pH 부근의 pH 가 되고 또한 역전사 효소의 기질이 되는 dNTP 를 포함하도록 설정되어 있다. 이들 반응액을 37 ℃ 에서 15 분간 인큐베이트한 후, 85 ℃ 에서 5 초간 인큐베이트하였다. 다음으로, Rsp18 유전자 영역을 표적 배열로 한 리얼타임 PCR 에 의해 각 반응액 중에 잔존하는 게놈 DNA 의 양을 정량하였다. 또한, 리얼타임 PCR 에는 SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, 다카라 바이오사) 를 이용하고, 프라이머쌍으로는 배열표의 배열 번호 1 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머 및 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머를 사용하였다.

리얼타임 PCR 에 의한 게놈 DNA 의 정량 결과 및 각 반응액 조성에 있어서의 게놈 DNA 의 분해의 억제율을 표 2 에 나타낸다. 표 2 에 나타내는 바와 같이 반응액 중의 게놈 DNA 가 완전하게 분해되는 반응액 1 에 대해, KCl 이나 (NH₄)₂SO₄ 를 첨가한 반응액이나 DTT 의 농도를 높인 반응액 3 ∼ 5 에서는 DNA 분해의 억제 효과가 인정되었다. 특히, (NH₄)₂SO₄ 를 첨가한 반응액 4 나 DTT 의 농도를 높인 반응액 5 에서는 높은 DNA 분해의 억제 효과가 인정되었다. 또한, 분해의 억제율은 이하의 식에 의해 산출하였다.

억제율 (%) = DNaseI 을 포함하는 반응액의 DNA 량 / DNaseI 을 포함하지 않는 반응액의 DNA 량 × 100

실시예 2 엔도 DNase 활성을 억제하는 반응 조성의 탐색 - 2

엔도 DNase 활성을 완전하게 억제하는 반응 조성을 구축하기 위해서, 5 U 의 DNaseI (다카라 바이오사), 200 ng 의 마우스 게놈 DNA 및 표 3 에 나타낸 성분을 함유하는 반응액 20 ㎕ 를 6 종류 (반응액 1 ∼ 6) 조제하였다. 또한, DNaseI 을 포함하지 않는 것 이외에는 동일한 조성의 반응액 20 ㎕ 를 6 종류 조제하였다. 이들 반응액을 37 ℃ 에서 15 분간 인큐베이트한 후, 85 ℃ 에서 5 초간 인큐베이트하였다. 다음으로, 각 반응액을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공함으로써, 마우스 게놈 DNA 의 DNaseI 에 의한 분해를 확인하였다.

전기 영동 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 에 나타내는 바와 같이, 반응액 1 및 2 의 조성에 있어서는 DNaseI 의 작용에 의해 게놈 DNA 의 밴드는 완전히 소실되었다. 한편, 반응액 3 및 4 의 조성에 있어서는, DNaseI 존재 하에서도 게놈 DNA 의 밴드는 완전하게는 소실되지 않고 스미어상(狀)의 영동 이미지를 확인할 수 있었다. 이러한 점에서, 반응액 3 및 4 에서는 DNaseI 활성이 억제되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 그 억제의 정도는 반응액 4 가 크다는 점에서, (NH₄)₂SO₄ 는 농도 의존적으로 DNaseI 의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 나아가 반응액 5 및 6 의 조성에 있어서는, 게놈 DNA 의 밴드는 DNaseI 존재 하에서도 전혀 변화하지 않는 점에서, 이들 반응액에서는 완전하게 DNaseI 활성이 억제되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 점에서, KCl, (NH₄)₂SO₄ 의 첨가나 DTT 농도를 높이는 것 외에, Mg 농도를 조정함으로써 DNaseI 활성을 더욱 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터, 예를 들어, 반응액 1 의 조성으로 DNaseI 에 의한 DNA 의 분해를 실시한 후, 최종농도가 반응액 5 혹은 6 의 조성이 되도록 별도 조제한 첨가제를 첨가함으로써 DNaseI 이 작용하지 않는 다른 효소 반응이 가능해진다는 것이 시사되었다.

실시예 3 DNase 활성의 확인

DNaseI 에 의한 게놈 DNA 의 분해가 확인된 실시예 2 의 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분을 갖는 반응액과 게놈 DNA 의 분해가 확인되지 않은 실시예 2 의 표 3 의 반응액 5 에 기재된 조성을 갖는 반응액에 대해, 이들 반응액 중에서의 DNaseI 의 DNase 활성을 측정하였다. 또한, 이하에 나타내는 DNase 의 활성 단위는 송아지 흉선 DNA 를 기질로 하여 반응액의 OD260 의 흡광도를 1 분간 0.001 증가시키는 효소량을 1 U 로 하였다.

먼저, 표 3 의 반응액 2 또는 5 에 기재된 성분, DNaseI (다카라 바이오사, 제품에 표시된 역가 = 5 U/㎕) 의 60 배 희석 용액을 100 ㎕, 및 40 ㎍ 의 송아지 흉선 DNA 를 함유하는 합계 1 ㎖ 의 용액을 조제하여, 이것을 25 ℃ 에서 10 분간 유지하면서 1 분마다 흡광도 (OD260) 를 측정하였다. 그 결과, 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분을 갖는 반응액에서는, 희석 전의 DNaseI (제품에 표시된 역가 = 5 U/㎕) 1 ㎕ 당 39 U 의 활성이 인정된 것에 반해, 표 3 의 반응액 5 에 기재된 조성에 있어서는 흡광도의 변화는 인정되지 않았다.

다음으로, 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분, DNaseI (5 U/㎕) 을 50 ㎕, 및 40 ㎍ 의 송아지 흉선 DNA 를 함유하는 1 ㎖ 의 용액을 25 ℃ 에서 10 분간 유지하면서 1 분마다 흡광도 (OD260) 를 측정하였다. 그 결과, 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분을 갖는 반응액에 있어서는 흡광도의 변화는 인정되지 않았다.

이상과 같이, 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분을 갖는 반응액에 있어서는 제품의 표시 역가 대비 약 8 배의 활성을 나타내는 데 반해, 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분을 갖는 반응액에 있어서는, 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분을 갖는 반응액에 있어서의 활성 측정시의 30 배의 DNaseI 을 사용하여도 활성은 검출 한계 이하였다. 이러한 점에서, 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분을 갖는 반응액에서는, DNaseI 의 활성이 완전하게 억제되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4 DNaseI 이 작용하지 않는 반응 조성에 있어서의 DNaseI 존재 하의 역전사 반응 - 1

실시예 2 의 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분을 갖는 반응액 및 실시예 2 의 표 3 의 반응액 6 에 기재된 성분을 갖는 반응액에 있어서, 역전사 효소에 의한 역전사 반응을 실시했을 경우에 반응액 중의 DNaseI 이 cDNA 합성에 미치는 영향에 대해 이하의 방법으로 검증하였다.

2 ㎍/㎕ 에서 20 pg/㎕ 로 단계 희석한 마우스 간장 전체 RNA 용액 1 ㎕, 10 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분, 및 5 U 의 DNaseI 을 함유하는 합계 10 ㎕ 의 혼합액을 조제하였다. 또한, DNaseI 을 포함하지 않는 것 이외에는 상기와 동일한 조성의 혼합액 10 ㎕ 도 조제하였다. 이들 혼합액을 42 ℃ 에서 2 분간 인큐베이트한 후, 200 U 의 PrimeScript (등록 상표) RTase (다카라 바이오사), 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer 와 100 p㏖ 의 Random 6mers 를 함유하는 100 mM 의 Tris-HCl (pH 9.2), 20 mM 의 KCl, 20 mM 의 DTT, 1 mM 의 dNTP, 28 mM 또는 56 mM 의 (NH₄)₂SO₄ 를 포함하는 용액을 각각 10 ㎕ 씩 첨가 혼합하였다. 즉, DNase 처리 후의 혼합액에 역전사 효소를 포함하는 상기 용액을 첨가하여, 역전사 효소, DNaseI, RNase 저해제 및 프라이머 이외의 최종농도를 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분 또는 표 3 의 반응액 6 에 기재된 성분으로 하였다. 다음으로, 37 ℃ 에서 15 분간의 조건으로 역전사 반응을 실시한 후, 85 ℃ 에서 5 초간의 조건으로 역전사 효소를 실활시켰다. 역전사 반응 후의 cDNA 합성량은 Rsp18 유전자 영역을 표적 배열로 한 리얼타임 PCR 에 의해 평가하였다. 또한, 리얼타임 PCR 에는 SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, 다카라 바이오사) 를 이용하고, 프라이머쌍으로는 배열표의 배열 번호 1 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머 및 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머를 사용하였다.

리얼타임 PCR 의 결과를 표 4 에 나타낸다. 표 4 에 나타낸 바와 같이, DNaseI 의 유무에서는 Ct 값에 차이가 없었다. 이 결과로부터, 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분을 갖는 반응액 및 표 3 의 반응액 6 에 기재된 성분을 갖는 반응액에 있어서, 역전사 효소에 의한 cDNA 합성에 DNaseI 이 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5 DNaseI 이 작용하지 않는 반응 조성에 있어서의 DNaseI 존재 하의 역전사 반응 - 2

DNaseI 이 작용하지 않는 반응 조성에 있어서의 DNaseI 존재 하의 역전사 효소에 의한 cDNA 합성량을, DNaseI 을 함유하지 않는 표준적인 역전사 반응 조성에 의한 cDNA 합성량과 비교하였다.

2 ㎍/㎕ 내지 20 pg/㎕ 의 단계 희석한 마우스 간장 전체 RNA 용액 1 ㎕, 실시예 2 의 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분, 및 5 U 의 DNaseI 을 함유하는 합계 10 ㎕ 의 혼합액을 조제하였다. 이 혼합액을 42 ℃ 에서 2 분간 인큐베이트한 후, 200 U 의 PrimeScript (등록 상표) RTase (다카라 바이오사), 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer 와 100 p㏖ 의 Random 6mers 를 함유하는 100 mM 의 Tris-HCl (pH 9.2), 20 mM 의 KCl, 20 mM 의 DTT, 1 mM 의 dNTP, 28 mM 의 (NH₄)₂SO₄ 를 포함하는 용액을 10 ㎕ 첨가 혼합하였다. 즉, DNase 처리 후의 혼합액에 역전사 효소를 포함하는 상기 용액을 첨가하여, 역전사 효소, DNaseI, RNase 저해제 및 프라이머 이외의 최종농도를 실시예 2 의 표 3 의 반응액 5 에 기재된 것으로 하였다. 다음으로, 37 ℃ 에서 15 분간의 조건으로 역전사 반응을 실시한 후, 85 ℃ 에서 5 초간의 조건으로 역전사 효소를 실활시켰다.

한편, DNaseI 을 함유하지 않는 표준적인 역전사 반응 조성은, 2 ㎍/㎕ 내지 20 pg/㎕ 의 단계 희석한 마우스 간장 전체 RNA 용액 1 ㎕, 200 U 의 PrimeScript (등록 상표) RTase (다카라 바이오사), 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer, 및 100 p㏖ 의 Random 6mers, 50 mM 의 Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM 의 KCl, 및 3 mM 의 MgCl₂ 를 포함하는 합계 10㎕ 의 반응액으로 하였다. 이 반응액을 이용하여 37 ℃ 에서 15 분간의 조건으로 역전사 반응을 실시한 후, 85 ℃ 에서 5 초간의 조건으로 역전사 효소를 실활시켰다.

역전사 반응 후의 cDNA 합성량은 Rsp18 유전자 영역을 표적 배열로 한 리얼타임 PCR 에 의해 평가하였다. 또한, 리얼타임 PCR 에는 SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, 다카라 바이오사) 를 이용하고, 프라이머쌍으로는 배열표의 배열 번호 1 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머 및 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머를 사용하였다.

리얼타임 PCR 의 결과를 표 5 에 나타낸다. 표 5 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 리얼타임 RT-PCR 에 의해 얻어진 Ct 값과 종래의 표준적인 리얼타임 RT-PCR 에 의해 얻어진 Ct 값이 거의 일치하였다. 이로써 본 발명의 방법은 DNaseI 에 의한 cDNA 합성 산물의 분해를 완전하게 억제하면서, 효율적으로 역전사 반응을 실시하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다.

실시예 6 DNaseI 이 작용하지 않는 반응 조성에 있어서의 DNaseI 존재 하의 역전사 반응 - 3

본 발명의 cDNA 합성 방법에 의해 얻어지는 cDNA 합성량을 시료 중의 DNA 의 DNaseI 에 의한 분해 후에 DNaseI 을 열 실활시키는 종래의 cDNA 합성 방법에 의해 얻어지는 cDNA 합성량과 비교하였다.

2 ㎍/㎕ 내지 20 pg/㎕ 의 단계 희석한 마우스 간장 전체 RNA 용액 1 ㎕, 실시예 2 의 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분, 및 5 U 의 DNaseI 을 함유하는 합계 10 ㎕ 의 혼합액을 조제하였다. 이 혼합액을 42 ℃ 에서 2 분간 인큐베이트한 후, 200 U 의 PrimeScript (등록 상표) RTase (다카라 바이오사), 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer 와 100 p㏖ 의 Random 6mers 를 함유하는 100 mM 의 Tris-HCl (pH 9.2), 20 mM 의 KCl, 20 mM 의 DTT, 1 mM 의 dNTP, 28 mM 의 (NH₄)₂SO₄ 를 포함하는 용액을 10 ㎕ 첨가 혼합하였다. 즉, DNase 처리 후의 혼합액에 역전사 효소를 포함하는 상기 용액을 첨가하고, 역전사 효소, DNaseI, RNase 저해제 및 프라이머 이외의 최종농도를 실시예 2 의 표 3 의 반응액 5 에 기재된 것으로 하였다. 다음으로, 37 ℃ 에서 15 분간의 조건으로 역전사 반응을 실시한 후, 85 ℃ 에서 5 초간의 조건으로 역전사 효소를 실활시켰다.

한편, DNaseI 을 열 실활시키는 종래의 cDNA 합성 방법에서는, 2 ㎍/㎕ 내지 20 pg/㎕ 의 단계 희석한 마우스 간장 전체 RNA 용액 1 ㎕, 실시예 2 의 표 3 의 반응액 1 에 기재된 성분, 및 5 U 의 DNaseI 을 함유하는 합계 10 ㎕ 의 혼합액을 조제하고, 이를 42 ℃ 에서 2 분간 인큐베이트한 후에 95 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하여 DNaseI 을 열 실활시켰다. 여기에, 200 U 의 PrimeScript (등록 상표) RTase (다카라 바이오사), 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer, 100 p㏖ 의 Random 6mers, 100 mM 의 Tris-HCl (pH 8.3), 300 mM 의 KCl, 12 mM 의 MgCl₂, 및 1 mM 의 dNTP 를 포함하는 용액을 10 ㎕ 첨가 혼합하였다. 즉, DNase 처리, DNase 열 실활 처리 후의 혼합액에 역전사 효소를 포함하는 상기 용액을 첨가하여 표준적인 역전사 반응액 조성을 갖는 조성물로 하였다. 다음으로, 37 ℃ 에서 15 분간의 조건으로 역전사 반응을 실시한 후, 85 ℃ 에서 5 초간의 조건으로 역전사 효소를 실활시켰다.

리얼타임 PCR 의 결과를 표 6 에 나타낸다. 표 6 에 나타낸 바와 같이, 시료 중의 DNA 분해 후에 DNaseI 을 열 실활시키는 종래의 cDNA 합성 방법으로 얻어진 cDNA 를 주형으로 했을 경우의 Ct 값은, 본 발명의 방법에 의한 리얼타임 RT-PCR 에 의해 얻어진 Ct 값과 비교해 2 사이클 정도의 지연이 인정된다. 이는, DNaseI 의 열 실활 시에 cDNA 합성의 주형이 되는 RNA 가 분해된 것이 원인으로 생각된다. 본 실시예에 의해, DNaseI 의 열 실활의 필요가 없는 본 발명의 cDNA 합성 방법의 유용성이 나타난다.

실시예 7 본 발명 방법에 있어서의 게놈 DNA 의 분해

본 발명의 cDNA 의 합성 방법을 실시하는 것에 의한 시료 중의 DNA 의 분해를 하기 방법에 의해 확인하였다.

먼저, 200 ng/㎕ 의 마우스 게놈 DNA 용액 1 ㎕, 10 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분, 및 5 U 의 DNaseI 을 함유하는 합계 10 ㎕ 의 혼합액을 조제하였다. 또한, DNaseI 을 포함하지 않는 것 이외에는 상기와 동일한 조성의 혼합액 10 ㎕ 도 조제하였다. 이들 혼합액을 42 ℃ 에서 2 분간 인큐베이트한 후, 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer 와 100 p㏖ 의 Random 6mers 를 함유하는 100 mM 의 Tris-HCl (pH 9.2), 20 mM 의 KCl, 20 mM 의 DTT, 1 mM 의 dNTP, 28 mM 의 (NH₄)₂SO₄ 를 포함하는 용액을 각각 10 ㎕ 씩 첨가 혼합하였다. 즉, DNase 처리 후의 혼합액에 상기 용액을 첨가하여, DNaseI, RNase 저해제 및 프라이머 이외의 최종농도를 표 3 의 반응액 5 에 기재된 성분으로 하였다. 다음으로, 37 ℃ 에서 15 분간, 85 ℃ 에서 5 초간의 반응을 실시하였다. 반응 후의 마우스 게놈 DNA 의 잔존량은 Rsp18 유전자 영역을 표적 배열로 한 40 cycles 의 리얼타임 PCR 에 의해 평가하였다. 또한, 리얼타임 PCR 에는 SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, 다카라 바이오사) 를 이용하고, 프라이머쌍으로는 배열표의 배열 번호 1 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머 및 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머를 사용하였다.

리얼타임 PCR 의 결과, DNaseI 을 포함하지 않는 혼합액을 사용한 경우의 Ct 값이 22.68 인 데 반해, DNaseI 을 포함하는 혼합액을 사용한 경우에는 증폭 산물을 전혀 확인할 수 없었다. 이 결과로부터, 본 발명의 cDNA 의 합성 방법에서는, 시료 중에 혼재하는 DNA 에서 유래하는 증폭 산물의 생성을 피할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 8 본 발명 방법에 의한 cDNA 합성의 효율

본 발명 방법에 의한 cDNA 합성의 효율을 DNaseI 과 역전사 효소를 동시에 작용시키는 방법에 의한 cDNA 합성의 효율과 비교하였다.

(1) 주형 RNA

주형으로는, total RNA 추출 키트 NucleoSpin (등록 상표) RNA II (맛하라이·나겔 사) 의 표준 프로토콜에 따라 게놈 DNA 가 제거되고, 정제된 마우스 간장 전체 RNA 용액을 2 ㎍/㎕ 내지 20 pg/㎕ 의 단계 희석한 것을 사용하였다.

(2) DNaseI 과 역전사 효소를 동시에 작용시키는 방법에 의한 cDNA 합성

상기 주형 RNA 용액을 1 ㎕, 실시예 2 의 표 3 의 반응액 1 에 기재된 성분, 0.5 mM 의 dNTP, 200 U 의 PrimeScript (등록 상표) RTase (다카라 바이오사), 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer, 100 p㏖ 의 Random 6mers, 및 5 U 의 DNaseI 을 포함하는 합계 20 ㎕ 의 혼합액을 주형 RNA 의 농도가 각각 상이한 합계 6 종류에 대해 조제하였다. 또한, 주형 RNA 용액 대신에 멸균 증류수 1 ㎕ 를 첨가한 혼합액도 조제하였다. 대조로서 DNaseI 을 포함하지 않는 것 이외에는 상기와 동일한 조성의 혼합액 20 ㎕ 도 조제하였다. 이렇게 하여 조제한 각 혼합액에 대해 37 ℃, 15 분간의 조건으로 역전사 반응을 실시한 후, 85 ℃, 5 초간의 조건으로 역전사 효소를 실활시켰다.

(3) 본 발명 방법에 의한 cDNA 합성

상기 (1) 에 기재된 주형 RNA 용액을 1 ㎕, 실시예 2 의 표 3 의 반응액 2 에 기재된 성분, 및 5 U 의 DNaseI 을 함유하는 합계 10 ㎕ 의 혼합액을 주형 RNA 의 농도가 각각 상이한 합계 6 종류에 대해 조제하였다. 또한, 주형 RNA 용액 대신에 멸균 증류수 1 ㎕ 를 첨가한 혼합액도 조제하였다. 대조로서 DNaseI 을 포함하지 않는 것 이외에는 상기와 동일한 조성의 혼합액 10 ㎕ 도 조제하였다. 이렇게 하여 조제한 혼합액을 42 ℃ 에서 2 분간 인큐베이트한 후, 200 U 의 PrimeScript (등록 상표) RTase (다카라 바이오사), 20 U 의 RNase Inhibitor (다카라 바이오사), 50 p㏖ 의 Oligo dT primer 와 100 p㏖ 의 Random 6mers 를 함유하는 100 mM 의 Tris-HCl (pH 9.2), 20 mM 의 KCl, 20 mM 의 DTT, 1 mM 의 dNTP, 28 mM 의 (NH₄)₂SO₄ 를 포함하는 용액을 10 ㎕ 첨가 혼합하였다. 즉, DNase 처리 후의 혼합액에 역전사 효소를 포함하는 상기 용액을 첨가하고, 역전사 효소, DNaseI, RNase 저해제 및 프라이머 이외의 최종농도를 실시예 2 의 표 3 의 반응액 5 에 기재된 것으로 하였다 (반응액 최종 용량 20 ㎕). 다음으로, 37 ℃ 에서 15 분간의 조건으로 역전사 반응을 실시한 후, 85 ℃ 에서 5 초간의 조건으로 역전사 효소를 실활시켰다.

(4) 리얼타임 PCR 에 의한 cDNA 합성량의 평가

상기 (2), (3) 에 의해 얻어진 cDNA 의 합성량을, Rsp18 유전자 영역을 표적 배열로 한 리얼타임 PCR 에 의해 평가하였다. 또한, 리얼타임 PCR 에는 SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, 다카라 바이오사) 를 이용하고, 프라이머쌍으로는 배열표의 배열 번호 1 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머 및 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 핵산 배열로 이루어지는 프라이머를 사용하였다. 리얼타임 PCR 의 결과를 표 7 및 도 2 에 나타낸다. 표 7 및 도 2 중 「(3)」 는 상기 (3) 에 의해 얻어진 cDNA 의 합성량을 리얼타임 PCR 에 의해 평가한 결과를, 「(2)」 는 상기 (2) 에 의해 얻어진 cDNA 의 합성량을 리얼타임 PCR 에 의해 평가한 결과를 나타낸다.

표 7 및 도 2 에 나타내는 바와 같이, DNaseI 과 역전사 효소를 동시에 작용시키는 방법, 즉, (2) 방법의 DNase(+) 에서는, DNase 에 의해 cDNA 합성량이 저하되고, Ct 값이 커졌다. 그 원인으로는, 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 의 DNase 에 의한 분해를 들 수 있다. 한편, 본 발명 방법에서는, DNase 에 의한 cDNA 합성에의 영향은 인정되지 않았다.

본 발명의 cDNA 합성 방법 및 키트는 유전자 공학의 분야에서 널리 유용하다.

<배열표 프리텍스트>

SEQ ID NO : 1 ; Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.

SEQ ID NO : 2 ; Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.

<110> TAKARA BIO INC. <120> METHOD FOR SYNTHESIZING cDNA <130> 11-013-PCTJP <150> JP 2010-111595 <151> 2010-05-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene. <400> 1 ttctggccaa cggtctagac aac 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene. <400> 2 ccagtggtct tggtgtgctg a 21

Claims

RNA 및 DNA 를 포함하는 시료 중의 DNA 를 엔도데옥시리보뉴클레아제에 의해 분해하여 처리 시료로 한 후, 엔도데옥시리보뉴클레아제의 열 실활 또는 엔도데옥시리보뉴클레아제의 제거를 실시하지 않고서, 당해 처리 시료 및 역전사 효소를 함유하고, 또한 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액을 조제하여 역전사 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 cDNA 의 합성 방법.
제 1 항에 있어서,
하기 공정 (a) ∼ (c) :
(a) RNA 및 DNA 를 포함하는 시료 및 엔도데옥시리보뉴클레아제를 포함하는 조성물을 얻는 공정 ;
(b) 엔도데옥시리보뉴클레아제가 시료 중의 DNA 를 분해하는데 충분한 조건으로 공정 (a) 에서 얻어진 조성물을 처리하는 공정 ; 및
(c) 공정 (b) 에서 처리된 조성물에 첨가제와 역전사 효소를 첨가하여 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 반응액을 조제하고, 역전사 효소에 의한 역전사 반응을 실시하는 공정을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
엔도데옥시리보뉴클레아제가 데옥시리보뉴클레아제 I 인 방법.
제 1 항에 있어서,
역전사 효소가 모로니 마우스 백혈병 바이러스 유래 역전사 효소인 방법.
제 2 항에 있어서,
첨가제가 환원제, 1 가 카티온 및 그 염으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1 종인 방법.
제 5 항에 있어서,
1 가 카티온이 암모늄 이온인 방법.
cDNA 의 증폭 방법으로서, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 합성된 cDNA 를 주형으로 하여 유전자 증폭 반응을 실시하는 공정을 포함하는 방법.
하기 (A) ∼ (D) :
(A) 엔도데옥시리보뉴클레아제,
(B) 완충제,
(C) 역전사 효소, 및
(D) 역전사 효소가 활성을 나타내고, 또한 엔도데옥시리보뉴클레아제가 활성을 나타내지 않는 역전사 반응용의 조성물을 조제하기 위한 첨가제를 포함하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 키트.