JP2021509587A - シトシン修飾の、亜硫酸水素塩非含有、塩基分解能特定 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年1月8日に出願された米国仮特許出願第62/614,798号、2018年4月20日出願の62/660,523号、2018年11月26日に出願された62/771,409号(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)の利益を主張する。
a. 標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 核酸を修飾する工程であって、
i. 核酸試料中の5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)にブロッキング基を添加する工程と、
ii. 核酸試料中の5mCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5−ホルミルシトシン(5fC)に変換する工程と、
iii. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
c. 修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的核酸中の5mCの位置を提供する、検出する工程を含む。
a. 標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 核酸を修飾する工程であって、
i. 核酸試料中の5mCおよび5hmCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5fCに変換する工程と、
ii. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、5caCおよび/または5fCをDHUに変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
c. 修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的核酸中の5mCまたは5hmCのいずれかの位置を提供する、検出する工程を含む。
a. 標的核酸中の5mCを特定する工程であって、この特定する工程が、
i. 標的核酸を含む第一核酸試料を提供する工程、
ii. 第一試料中の核酸を修飾する工程であって、
1. 第一核酸試料内の、5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)にブロッキング基を添加することと、
2. 第一核酸試料中の5mCを、5caCおよび/または5fCに変換することと、
3. 修飾標的核酸を含む修飾第一DNA試料を提供するために、5caCおよび/または5fCをDHUに変換することと、を含む、修飾する工程、
iii. 修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
iv. 修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的核酸中の5mCの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、
b. 標的核酸中の5mCまたは5hmCを特定する工程であって、この特定する工程が、
i. 標的核酸を含む第二核酸試料を提供する工程、
ii. 第二核酸試料中の核酸を修飾する工程であって、
1. 第二核酸試料中の5mCおよび5hmCを、5caCおよび/または5fCに変換することと、
2. 修飾標的核酸を含む修飾第二核酸試料を提供するために、5caCおよび/または5fCをDHUに変換することと、を含む、修飾する工程、
iii. 修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、
iv. 第二試料から修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較して修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的核酸中の5mCまたは5hmCのいずれかの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、ならびに、
c. 工程(a)および(b)の結果を比較する工程であって、工程(b)で存在するが工程(a)では存在しないCからTへの移行が、標的核酸中の5hmCの位置を提供する、比較する工程、を含む。
a. 標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、5caCおよび5fCをDHUに変換する工程、
c. 修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
d. 修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的核酸中の5caCまたは5fCのいずれかの位置を提供する、検出する工程を含む。
a. 標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 核酸試料中の5fCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、5caCをDHUに変換する工程、
d. 修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
e. 修飾標的核酸の配列を決定する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的核酸中の5caCの位置を提供する、決定する工程、を含む。
a. 標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 核酸試料中の5caCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、5fCをDHUに変換する工程、
d. 修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、
e. 修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的核酸中の5fCの位置を提供する、検出する工程、を含む。
表1。5mCおよび5hmC配列決定用のBSおよび関連する方法と、TAPS、TAPSβおよびCAPSとの比較。
a. 標的DNAを含むDNA試料を提供する工程、
b. DNAを修飾する工程であって、
i. DNA試料中の5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)にブロッキング基を添加する工程と、
ii. DNA試料中の5mCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5−ホルミルシトシン(5fC)に変換する工程と、
iii. 修飾標的DNAを含む修飾DNA試料を提供するために、5caCおよび/または5fCをDHUに変換する工程と、を含む、修飾する工程、
c. 修飾標的DNAの配列を検出する工程であって、修飾標的DNAの配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が比較した、検出する工程を含む。
a. 標的DNAを含むDNA試料を提供する工程、
b. DNAを修飾する工程であって、
i. DNA試料中の5mCおよび5hmCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5fCに変換する工程と、
ii. 修飾標的DNAを含む修飾DNA試料を提供するために、5caCおよび/または5fCをDHUに変換する工程と、を含む、修飾する工程、
c. 修飾標的DNAの配列を検出する工程であって、標的DNAと比較した修飾標的DNAの配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的DNA中の5mCまたは5hmCのいずれかの位置を提供する、検出する工程を含む。
a. 標的DNAを含むDNA試料を提供する工程、
b. DNAを修飾する工程であって、
i. DNA試料中の5hmCを5fCに変換する工程と、
ii. 修飾標的DNAを含む修飾DNA試料を提供するために、5fCをDHUに変換する工程と、を含む、修飾する工程、
c. 修飾標的DNAの配列を検出する工程であって、標的DNAと比較した修飾標的DNAの配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的DNA中の5hmCの位置を提供する、検出する工程を含む。
a. 標的DNAを含むDNA試料を提供する工程、
b. 修飾標的DNAを含む修飾DNA試料を提供するために、5caCおよび/または5fCをDHUに変換する工程、
c. 修飾標的DNAのコピー数を随意に増幅する工程、
d. 修飾標的DNAの配列を検出する工程であって、標的DNAと比較した修飾標的DNAの配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的DNA中の5caCまたは5fCの位置を提供する、検出する工程を含む。
a. 標的DNAを含むDNA試料を提供する工程、
b. DNA試料中の5fCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的DNAを含む修飾DNA試料を提供するために、5caCをDHUに変換する工程、
d. 修飾標的DNAのコピー数を随意に増幅する工程、
e. 修飾標的DNAの配列を決定する工程であって、標的DNAと比較した修飾標的DNAの配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的DNA中の5caCの位置を提供する、決定する工程を含む。
a. 標的DNAを含むDNA試料を提供する工程、
b. DNA試料中の5caCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的DNAを含む修飾DNA試料を提供するために、5fCをDHUに変換する工程、
d. 修飾標的DNAのコピー数を随意に増幅する工程、
e. 修飾標的DNAの配列を検出する工程であって、標的DNAと比較した修飾標的DNAの配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、標的DNA中の5fCの位置を提供する、検出する工程を含む。
表2。スパイクイン用のPCRプライマーの配列。
表3。120mer対照スパイクインの調製に使用されるDNAオリゴおよびプライマーの配列。
表5。ヌクレオシド定量化に使用される化合物依存性HPLC−MS/MSパラメータ。RT:保持時間、CE:衝突エネルギー、CAE:細胞促進電圧(cell accelerator voltage)。すべてのヌクレオシドが陽性モードで分析された。
表6。BSおよび関連する方法と、5fCおよび5caC配列決定のためのPSとの比較。
表7。WGBSおよびTAPSの、マッピングおよび配列決定の品質統計。
表8。TAPS、WGBS、およびWGBSとほぼ同じ平均カバレッジを持つようにダウンサンプリングされたTAPSのカバレッジ統計。ここでは、ゲノム内のすべての位置における両方の鎖に対してカバレッジが計算された。
表9。TAPS、WGBS、およびHpaII−qPCRアッセイにより定量化されたmESC gDNAにおけるCmCGGメチル化レベルの比較。TAPS、およびWGBSによる、カバレッジおよびメチル化レベル(mC%)を鎖当たりに対して計算した。HpaII−qPCRアッセイにおける、HpaII消化試料のCt値(CtHpaII)、または対照試料(CtCtrl)は、3組の平均であった。mC%は以下の等式を用いて計算される:mC%=2^(CtCtrl−CtHpaII)*100%。
例えば、以下の項目が提供される。
(項目1)
標的核酸中の5−メチルシトシン(5mC)を特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
i. DNA試料中の5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)にブロッキング基を添加する工程と、
ii. 前記核酸試料中の前記5mCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5−ホルミルシトシン(5fC)に変換する工程と、
iii. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
c. 前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCの位置を提供する、方法。
(項目2)
各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での5mCの定量レベルを提供する、項目1に記載の方法。
(項目3)
標的核酸中の5mCまたは5hmCを特定する方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
i. 前記核酸試料中の前記5mCおよび5hmCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5fCに変換する工程と、
ii. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
c. 前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCまたは5hmCのいずれかの位置を提供する、方法。
(項目4)
各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での5mCまたは5hmCの定量レベルを提供する、項目3に記載の方法。
(項目5)
標的核酸中の5mCを特定するための、および5hmCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸中の5−メチルシトシン(5mC)を特定する工程であって、前記特定する工程が、
i. 前記標的核酸を含む第一核酸試料を提供する工程、
ii. 前記第一試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
1. 前記第一核酸試料中の、5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)にブロッキング基を添加することと、
2. 前記第一核酸試料中の前記5mCを、5caCおよび/または5fCに変換することと、
3. 修飾標的核酸を含む修飾第一核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換することと、を含む、修飾する工程、
iii. 前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
iv. 前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、
b. 前記標的核酸中の5mCまたは5hmCを特定する工程であって、前記特定する工程が、
i. 前記標的核酸を含む第二核酸試料を提供する工程、
ii. 前記第二試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
1. 前記第二核酸試料中の5mCおよび5hmCを、5caCおよび/または5fCに変換することと、
2. 修飾標的核酸を含む修飾第二核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロラシル(DHU)に変換することと、を含む、修飾する工程、
iii. 前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
iv. 前記第二試料から前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCまたは5hmCのいずれかの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、ならびに、
c. 工程(a)および(b)の結果を比較する工程であって、工程(b)で存在するが工程(a)では存在しないCからTへの移行が、前記標的核酸中の5hmCの位置を提供する、比較する工程、を含む、方法。
(項目6)
工程(a)において、各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で5mCの定量レベルを提供し、工程(b)において、各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で5mC、または5hmCの定量レベルを提供し、および工程(c)において、工程(b)で、工程(a)ではなく、特定されたCからTへの移行についてのパーセンテージの差異が、前記標的核酸中の各位置で5hmCの定量レベルを提供する、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記5hmCに添加される前記ブロッキング基が糖である、項目1〜2または項目5〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記糖がグルコースまたは修飾グルコースである、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記ブロッキング基が、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の存在下で、糖に連結されたUDPに前記核酸試料を接触させることにより、前記5hmCに添加される、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、T4バクテリオファージβ−グルコシルトランスフェラーゼ(βGT)、T4バクテリオファージα−グルコシルトランスフェラーゼ(αGT)、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記核酸試料中の前記5mCを、5caC及び/または5fCに変換する工程、ならびに前記核酸試料中の前記5mC及び5hmCを、5caC及び/または5fCに変換する工程は、テンイレブントランスロケーション(TET)酵素と前記核酸試料を接触させることを含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記TET酵素が、ヒトTET1、TET2、及びTET3、マウスTet1、Tet2、及びTet3、ネグレリアTET(NgTET)、ウシグソヒトヨタケ(CcTET)、ならびにその誘導体または類似体からなる群から選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記TET酵素がNgTETまたはマウスTETである、項目12に記載の方法。
(項目14)
標的核酸中の5caC、または5fCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCおよび5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程、
c. 前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する工程、および
d. 前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5caC、または5fCのいずれかの位置を提供する、方法。
(項目15)
各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で、5caC、または5fCの定量レベルを提供する、項目14に記載の方法。
(項目16)
標的核酸中の5caCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸試料中の5fCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程、
d. 前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
e. 前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5caCの位置を提供する、方法。
(項目17)
各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸の各位置で5caCの定量レベルを提供する、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記5fCにブロッキング基を添加する工程が、ヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体、およびヒドラジド誘導体から選択されるアルデヒド反応性化合物と、前記核酸試料を接触させることを含む、項目16に記載の方法。
(項目19)
前記ヒドロキシルアミン誘導体が、O−エチルヒドロキシルアミンである、項目18に記載の方法。
(項目20)
標的核酸中の5fCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸試料中の5caCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程、
d. 前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
e. 前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5fCの位置を提供する、方法。
(項目21)
各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で5fCの定量レベルを提供する、項目20に記載の方法。
(項目22)
5caCにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料をカルボン酸誘導体化試薬、及びアミン、ヒドラジン又はヒドロキシルアミン化合物と接触させることを含む、項目20に記載の方法。
(項目23)
5caCにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料を1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)と接触させることと、エチルアミンと接触させることと、を含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記方法が、前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程をさらに含む、項目1〜6、および14〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはプライマー伸長を行うことを含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記5caCおよび/または5fCをDHUへ変換する前記工程が、前記核酸試料を還元剤に接触させることを含む、項目1〜6、および14〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記還元剤が、ピリジンボラン、2−ピコリンボラン(pic−BH3)、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリドからなる群から選択される、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記還元剤が、ピリジンボラン、または2−ピコリンボランである、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記修飾標的核酸の配列を特定する前記工程が、鎖終結配列決定、マイクロアレイ、高処理量配列決定、および制限酵素分析のうちの一つ以上を含む、項目1〜6、および14〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記核酸がDNAである、項目1〜29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記核酸がRNAである、項目1〜29のいずれか一項に記載の方法。
Claims (35)
- 標的核酸中の5−メチルシトシン(5mC)を特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
i. 核酸試料中の5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)にブロッキング基を添加する工程と、
ii. 前記核酸試料中の前記5mCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5−ホルミルシトシン(5fC)に変換する工程と、
iii. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
c. 前記配列におけるDHUの存在を検出すること、または前記DHUをチミン(T)に変換して前記配列における前記チミン(T)の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修標的核酸の配列におけるシトシン(C)のDHUへの移行またはシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCの位置を提供する、方法。 - 各移行位置でのDHUまたはTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での5mCの定量レベルを提供する、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸中の5mCまたは5hmCを特定する方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
i. 前記核酸試料中の前記5mCおよび5hmCを5−カルボキシルシトシン(5caC)および/または5fCに変換する工程と、
ii. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
c. 前記配列におけるDHUの存在を検出すること、または前記DHUをチミン(T)に変換して前記配列における前記チミン(T)の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のDHUへの移行またはシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCまたは5hmCのいずれかの位置を提供する、方法。 - 各移行位置でのDHUまたはTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での5mCまたは5hmCの定量レベルを提供する、請求項3に記載の方法。
- 標的核酸中の5mCを特定するための、および5hmCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸中の5−メチルシトシン(5mC)を特定する工程であって、前記特定する工程が、
i. 前記標的核酸を含む第一核酸試料を提供する工程、
ii. 前記第一試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
(1). 前記第一核酸試料中の、5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)にブロッキング基を添加することと、
(2). 前記第一核酸試料中の前記5mCを、5caCおよび/または5fCに変換することと、
(3). 修飾標的核酸を含む修飾第一核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換することと、を含む、修飾する工程、
iii. 前記配列におけるDHUの存在を検出すること、または前記DHUをチミン(T)に変換して前記配列における前記チミン(T)の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のDHUへの移行またはシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、
b. 前記標的核酸中の5mCまたは5hmCを特定する工程であって、前記特定する工程が、
i. 前記標的核酸を含む第二核酸試料を提供する工程、
ii. 前記第二試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
(1). 前記第二核酸試料中の5mCおよび5hmCを、5caCおよび/または5fCに変換することと、
(2). 修飾標的核酸を含む修飾第二核酸試料を提供するために、前記5caCおよび/または5fCをジヒドロラシル(DHU)に変換することと、を含む、修飾する工程、および
iii. 前記配列におけるDHUの存在を検出すること、または前記DHUをチミン(T)に変換して前記配列における前記チミン(T)の存在を検出することを含む、前記第二試料から前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のDHUへの移行またはシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5mCまたは5hmCのいずれかの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、ならびに、
c. 工程(a)および(b)の結果を比較する工程であって、工程(b)で存在するが工程(a)では存在しないCからDHUまたはCからTへの移行が、前記標的核酸中の5hmCの位置を提供する、比較する工程、を含む、方法。 - 工程(a)において、各移行位置でのDHUまたはTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で5mCの定量レベルを提供し、工程(b)において、各移行位置でのDHUまたはTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で5mC、または5hmCの定量レベルを提供し、および工程(c)において、工程(b)で、工程(a)ではなく、特定されたCからDHUまたはTへの移行についてのパーセンテージの差異が、前記標的核酸中の各位置で5hmCの定量レベルを提供する、請求項5に記載の方法。
- 前記5hmCに添加される前記ブロッキング基が糖である、請求項1〜2または請求項5〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖がグルコースまたは修飾グルコースである、請求項7に記載の方法。
- 前記ブロッキング基が、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の存在下で、糖に連結されたウリジン二リン酸(UDP)に前記核酸試料を接触させることにより、前記5hmCに添加される、請求項7に記載の方法。
- 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、T4バクテリオファージβ−グルコシルトランスフェラーゼ(βGT)、T4バクテリオファージα−グルコシルトランスフェラーゼ(αGT)、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸試料中の前記5mCを、5caC及び/または5fCに変換する工程、ならびに前記核酸試料中の前記5mC及び5hmCを、5caC及び/または5fCに変換する工程は、テンイレブントランスロケーション(TET)酵素と前記核酸試料を接触させることを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TET酵素が、ヒトTET1、TET2、及びTET3、マウスTet1、Tet2、及びTet3、ネグレリアTET(NgTET)、ウシグソヒトヨタケ(CcTET)、ならびにその誘導体または類似体からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記TET酵素がNgTETまたはマウスTETである、請求項12に記載の方法。
- 標的核酸中の5caC、または5fCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCおよび5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程、
c. 前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する工程、および
d. 前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5caC、または5fCのいずれかの位置を提供する、方法。 - 各移行位置でのTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で、5caC、または5fCの定量レベルを提供する、請求項14に記載の方法。
- 標的核酸中の5caCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸試料中の5fCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5caCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程、および
d. 前記配列におけるDHUの存在を検出すること、または前記DHUをチミン(T)に変換して前記配列における前記チミン(T)の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のDHUへの移行またはシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5caCの位置を提供する、方法。 - 各移行位置でのDHUまたはTのパーセンテージが、前記標的核酸の各位置で5caCの定量レベルを提供する、請求項16に記載の方法。
- 前記5fCにブロッキング基を添加する工程が、ヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体、およびヒドラジド誘導体から選択されるアルデヒド反応性化合物と、前記核酸試料を接触させることを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記ヒドロキシルアミン誘導体が、O−エチルヒドロキシルアミンである、請求項18に記載の方法。
- 標的核酸中の5fCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記核酸試料中の5caCにブロッキング基を添加する工程、
c. 修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換する工程、および
d. 前記配列におけるDHUの存在を検出すること、または前記DHUをチミン(T)に変換して前記配列における前記チミン(T)の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のDHUへの移行またはシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5fCの位置を提供する、方法。 - 各移行位置でのDHUまたはTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で5fCの定量レベルを提供する、請求項20に記載の方法。
- 5caCにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料をカルボン酸誘導体化試薬、及びアミン、ヒドラジン又はヒドロキシルアミン化合物と接触させることを含む、請求項20に記載の方法。
- 5caCにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料を1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)と接触させることと、エチルアミンと接触させることと、を含む、請求項22に記載の方法。
- 標的核酸中の5hmCを特定するための方法であって、前記方法が、
a. 前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
b. 前記試料中の前記核酸を修飾する工程であって、
i 前記核酸試料中の前記5hmCを5caCおよび/または5fCに変換する工程と
ii 前記5caCおよび/または5fCをジヒドロウラシル(DHU)に変換して修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供する工程と、を含む、修飾する工程、および
c. 前記配列におけるDHUの存在を検出すること、または前記DHUをチミン(T)に変換して前記配列におけるチミン(T)の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン(C)のDHUへの移行またはシトシン(C)のチミン(T)への移行が、前記標的核酸中の5hmCの位置を提供する、検出する工程、を含む、方法。 - 各移行位置でのDHUまたはTのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で5hmCの定量レベルを提供する、請求項24に記載の方法。
- 前記5hmCを5caCおよび/または5fCに変換する工程が、前記核酸試料を酸化剤と接触させることを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記酸化剤が、過ルテニウム酸カリウムまたはCu(II)/TEMPOである、請求項26に記載の方法。
- 前記方法が、前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程をさらに含む、請求項1〜6、および14〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはプライマー伸長を行うことを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記5caCおよび/または5fCをDHUへ変換する前記工程が、前記核酸試料を還元剤に接触させることを含む、請求項1〜6、および14〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記還元剤が、ピリジンボラン、2−ピコリンボラン(pic−BH3)、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリドからなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記還元剤が、ピリジンボラン、または2−ピコリンボランである、請求項31に記載の方法。
- 前記修飾標的核酸の配列を特定する前記工程が、鎖終結配列決定、マイクロアレイ、高処理量配列決定、および制限酵素分析のうちの一つ以上を含む、請求項1〜6、および14〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸がDNAである、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸がRNAである、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
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