JPWO2015199242A1 - ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコ(ウイルス抵抗性タバコ)に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現量(例えば、転写物の量)が減少した、ウイルス抵抗性タバコに関する。また、本発明の別の一態様は、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出する方法(ウイルス抵抗性タバコ作出方法)に関し、より具体的には、細胞内における、ウイルスに対して機能的なeIF(iso)4E遺伝子の発現量(例えば、転写物の量)を減少させることによって、ウイルス抵抗性タバコを作出する方法に関する。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、eIF(iso)4E遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されているウイルス抵抗性タバコである。
(1)市販のシーケンサー等を利用し、各ポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
(2)SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism:一本鎖高次構造多型)法を用いて変異の有無を検出する方法。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの別の一態様は、eIF(iso)4E遺伝子の発現量が野生型と比較して20%以下であるウイルス抵抗性タバコである。発現が抑制されたタバコのeIF(iso)4E遺伝子の発現量は、野生型の発現量を100%とした場合、好ましくは15%以下、より好ましくは10%以下である。ここで、「野生型」とは、eIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制させる因子が導入されておらず、かつ、eIF(iso)4E遺伝子に変異を有していないタバコを指す。
本発明はまた、タバコにウイルス抵抗性を付与する方法を提供する。
本発明では、タバコeIF(iso)4E遺伝子上に生じた変異を利用してDNAマーカーを開発することができ、それをマーカー育種に活用することができる。「DNAマーカー」とは、品種間または個体間におけるDNAの塩基配列の違い(変異または多型)、またはその違いを検出するためのツールであり、品種または個体を識別するための目印となる塩基配列の違い(変異または多型)、またはその違いを検出するためのツールのことを指す。eIF(iso)4E遺伝子における変異が確定し、その変異によってウイルスに抵抗性となることが確認された場合、その変異が生じたタバコ変異体を、当該ウイルス抵抗性の育種母本として利用することができる。その際、既に抵抗性に係る原因変異が分っているため、原因変異の識別に利用可能なマーカーをeIF(iso)4E遺伝子上に設計することができる。当該変異とウイルス抵抗性との関係が遺伝的分離によって切れることがないため、精密なマーカー育種が可能となる。この変異の有無を検出すれば、交配等を繰り返した際に、一回一回ウイルス抵抗性を確認する必要がない。
(1)市販のシーケンサー等を利用し、増幅したポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
(2)SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)法を用いて、増幅したポリヌクレオチド上の変異の有無を検出する方法。
(3)増幅したポリヌクレオチドに対して、変異箇所の配列(変異前の配列または変異後の配列)を特異的に認識する制限酵素による処理後に、切断の有無により判定する方法(CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)法)。その他、意図的に設計したミスマッチプライマーを含むプライマーセットによって制限酵素認識部位を作製するdCAPS(derived CAPS)法を用いてもよい。そのようなプライマーセットとしては、例えば、配列番号7に示すS型のeIF(iso)4E遺伝子の塩基配列の330番目の塩基のC→T変異を検出するためのプライマーとして、配列番号45に示す塩基配列からなる核酸および配列番号46に示す塩基配列からなる核酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。また、配列番号46に示す塩基配列のように、ミスマッチプライマーを使用した場合、増幅効率が良くない場合があるが、そのような場合、標的配列の外側の部位にミスマッチのないプライマーを設計し(上記の場合、例えば配列番号25および26に示す塩基配列からなる核酸プライマーのセット)、予めPCRを一度行い、そのPCR産物の一部を鋳型に、ミスマッチプライマーで再増幅し、得られたPCR産物を制限酵素で処理することで変異を検出してもよい。
(4)変異部分に特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、ハイブリダイズさせることで変異の有無を確認する方法。
(5)変異箇所の配列(変異前の配列および/または変異後の配列)を一部に含ませてプライマー配列を設計し、PCR法等によって増幅させることにより、増幅の有無によって変異の有無を検出する方法(アリル特異的PCR法)。そのようなプライマーとしては、例えば、配列番号7に示すS型のeIF(iso)4E遺伝子の塩基配列の330番目の塩基のC→T変異を検出するためのプライマーとして、配列番号37に示す塩基配列からなる核酸および配列番号39示す塩基配列からなる核酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。この場合、コントロールとして、例えば変異前の塩基配列に特異的な配列番号38に示す塩基配列からなる核酸プライマーを用いることができる。
本発明のウイルス抵抗性タバコを栽培して生産される葉たばこは、当該ウイルス(例えば、Virgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統またはTBTV)が引き起こす病気に罹患しない。そのため、特に当該病気が発生する環境下で栽培された場合において、ウイルス抵抗性でないタバコを栽培して生産される葉たばこと比較して、品質低下が軽減され高品質である。その結果、より高品質のたばこ製品を生産することができる。
このように、課題を解決するために、本願発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、タバコにおいてeIF(iso)4Eの機能を抑制することにより、そのタバコがPVY-breaking系統およびTBTVに抵抗性となることを初めて見出した。さらに、タバコゲノムに存在する2組のeIF(iso)4E遺伝子の片方が、PVY-breaking系統に対する抵抗性に関係し、もう片方がTBTVに対する抵抗性に関係することを解明し、それら片側の遺伝子の機能を抑制することで、それぞれのウイルスに対する抵抗性を付与できることを見出した。また、eIF(iso)4E機能抑制タバコには生育阻害が起きないことを確認し本発明を完成した。
(遺伝子の取得)
公知データベースの検索を行い、タバコ(Nicotiana tabacum)の翻訳開始因子eIF4E1(GenBankアクセッション番号:AY702653)のcDNA塩基配列(配列番号10)、およびeIF(iso)4E(GenBankアクセッション番号:AY699609)のcDNA塩基配列(配列番号1)を取得した。
eIF4E1発現抑制タバコ、およびeIF(iso)4E発現抑制タバコを作出するため、これら遺伝子の内部配列をトリガーとするRNAiコンストラクトを構築した。
タバコの形質転換は常法(リーフディスク法)で行った。タバコ品種はPetit Havana SR1を用いた。
組換えタバコについて、eIF4E1またはeIF(iso)4E遺伝子の発現を調査するため、各遺伝子の塩基配列に基づき、リアルタイムPCR用のプライマー/プローブを設計した(表2)。また各組換えタバコの葉よりRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社)を用いてTotal RNAを抽出した。得られたRNAからPrime Script reagent Kit(タカラバイオ株式会社)を用いてcDNAを合成し、リアルタイムPCRの鋳型とした。リアルタイムPCRではTaqMan Fast Advanced Master mix(Life technologies社)を用いて増幅反応を行った。反応条件は50℃ 2分間、95℃ 20秒間の後、95℃ 1秒、60℃20秒のサイクルを40回とした。発現解析はStepOne Software v2.2(Life technologies社)を用いた。PCRの内部標準としてelongation factor1-alpha(EF1−α)遺伝子を使用し、この遺伝子の発現量との比較で、標的遺伝子の相対的な遺伝子発現量を算出した。対照として非組換えタバコ(SR1)を用いた。
形質転換当代で転写抑制度合が高かったeIF4E1の5系統、およびeIF(iso)4Eの3系統の種子を、LS固形培地(3%ショ糖、0.8%寒天を含む)上に無菌的に播種した。発芽、生育した幼植物体のGFP蛍光をFluor Imager 595(Molecular Dynamics社)を用いて測定した。上述の通り、コンストラクト導入に用いているpSP231はT−DNA領域上のRNAi発現カセットの隣に、35Sプロモーター−GFP発現カセットが配置されている。幼植物体において、強いGFP蛍光を発するものをRNAiコンストラクトについてホモ接合系統、全く蛍光がないものをRNAiコンストラクトについてヌル分離系統(RNAiコンストラクトが存在しない)、弱い蛍光を発するものをRNAiコンストラクトについてヘミ接合系統と判断した。播種後3週の植物を温室に移し、培土に植え替え、育成した。
各組換えタバコ系統の次世代におけるeIF(iso)4E遺伝子の発現を調査するため、上述のようにして組換えタバコの葉よりRNAを抽出してcDNAを合成し、リアルタイムPCRの鋳型とした。リアルタイムPCRも上述の通り行い、内部標準としてEF1−α遺伝子を用い、対照植物として非組換えタバコ(SR1)を用いた。
培土への移植後10日の個体に、PVY(PVY−N)、PVY−B、またはTBTV(Tobacco bushy top virus)を接種した。PVY−Bは日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所で分離されたウイルス系統で、PVY抵抗性であるタバコ既存品種Virgin A mutantに壊疽症状を発生させるVAM breaking系統である。TBTVは、Umbravirus属のウイルスで、タバコの葉にモットリング症状を引き起こす。接種源には、各ウイルスが感染し発病した黄色種つくば1号の罹病葉を使用した。品種つくば1号は、PVY、PVY−B、およびTBTVに罹病性の品種であり、接種により明瞭な病徴を示す。採種した罹病葉を乳鉢中で0.01Nリン酸緩衝液とともに磨砕した。その磨砕液を移植1週間後のタバコ苗の最大葉(下から4枚目または5枚目)の半葉にカーボランダムを用いて塗抹接種した。その後、温室内で栽培し、適時病徴を観察した。
(eIF(iso)4Eタバコ変異体の選抜)
S型のeIF(iso)4E(AY699609)とT型のeIF(iso)4E(EB683576)のmRNA配列を用いて、GenBankデータベースのNicotiana tabacumのWhole Genome Shotgun Contigsを検索した結果、イントロン領域以外のタンパクコード領域において100%の配列同一性を示すゲノム配列が取得された(S型のアクセッション番号はAWOJ01412288、T型のアクセッション番号はAWOJ01054542)。これらの配列のうち、eIF(iso)4E遺伝子部分の配列を、配列番号7(S型のeIF(iso)4E遺伝子のゲノム配列)および配列番号8(T型のeIF(iso)4E遺伝子のゲノム配列)に示した。両配列はタバコ品種K326由来のゲノム配列である。
上記DNAサンプル(1974系統分のDNAサンプル)を鋳型に、表4のプライマーのうち、S型eIF(iso)4E−Exon 1 組合せ1(配列番号25および26)、およびS型eIF(iso)4E−Exon 2&3 組合せ1(配列番号28および29)を使ってPCRを行った。得られたPCR産物の塩基配列を決定したところ、Exon 1では58サンプル(50か所)、Exon 2とExon 3では計58サンプル(45か所)で変異が検出された。変異はいずれもヘテロ接合であった。ナンセンス変異(ストップコドンが生じた変異)が検出されたサンプルは、Exon 1で4サンプル(配列番号7の295、394または395番目のGがAに変異、330番目のCがTに変異)、Exon 2とExon 3で1サンプル(配列番号7の1814番目のGがAに変異)であった。これらのうち、330番目のCがTに変異した系統(M2)を播種し、24個体からDNAを抽出し、塩基配列を決定した結果、目的の変異をホモ接合で有する個体(eIF(iso)4E_S型変異ホモ個体)が11個体得られた。
上記DNAサンプル(1974系統分のDNAサンプル)を鋳型に、表4のプライマーのうち、T型eIF(iso)4E−Exon 1 組合せ1(配列番号31および32)、およびT型eIF(iso)4E−Exon 2&3 組合せ2(配列番号34および36)を使ってPCRを行った。上記と同様に、得られたPCR産物の塩基配列を決定したところ、Exon 1では43サンプル(38か所)、Exon 2とExon 3では計66サンプル(55か所)で変異が検出された。変異はいずれもヘテロ接合であった。ナンセンス変異が検出されたサンプルは、Exon 1で5サンプル(配列番号8の289、299、328、329または380番目のGがAに変異)、Exon 2とExon3で4サンプル(配列番号8の1704番目のGがAに変異したものが3つ、1737番目のGがAに変異したものが1つ)であった。これらのうち、299番目のGがAに変異した系統(M2)について24個体からDNAを抽出し、塩基配列を決定した結果、目的の変異をホモ接合で有する個体(eIF(iso)4E_T型変異ホモ個体)が8個体得られた。
上記eIF(iso)4E_S型変異ホモ個体とeIF(iso)4E_T型変異ホモ個体とを交配した。この交配によって、eIF(iso)4EのS側の遺伝子座およびT側の遺伝子座の両方において、野生型(変異がない)と変異型とをヘテロ接合で保有するF1系統を作出した。F1系統を自家受粉(自殖)させ、F2系統を得た。このF2系統においては、S型とT型の両方について変異をホモに持つ個体の割合の理論値は1/16である。F2系統を播種し、700個体からDNAを抽出した。
上述のeIF(iso)4E_S型変異体(S型のeIF(iso)4E遺伝子にホモ型の変異を有する。遺伝子型はssTT)、またはeIF(iso)4E_T型変異体(T型のeIF(iso)4E遺伝子にホモ型の変異を有する。遺伝子型はSStt)を育成し、自殖後代を得ることで種子の増殖を行った。得られた後代種子については一部を育成し、上記のようにDNAを抽出して、DNAマーカーを用いた多型解析を実施し、S側またはT側の変異をそれぞれホモで有することを確認した。
eIF(iso)4E遺伝子の多型を検出するための、より検出の確度が高いDNAマーカーとして、dCAPSマーカーを開発した。制限酵素の認識配列に多型が存在する場合には、制限酵素処理後の断片長の違いを検出することによって多型を判別することができるが、これをCAPSマーカー、PCR−RFLPマーカーと呼ぶ。eIF(iso)4E遺伝子に生じた今回の変異(S型では配列番号7の330番目のCがTに変異、T型では配列番号8の299番目のGがAに変異)の場合、SNP周辺の配列が制限酵素の認識配列を含まなかった。そのため、PCRで用いるプライマーを設計する際に、SNP(一塩基多型)近傍に人工的に制限酵素サイトを導入した。今回利用した変異においては、変異型遺伝子では制限サイト(S型ではNla III:CATG、T型ではMbo I:GATC)となるには二塩基の変異が必要であった一方で、野生型遺伝子では制限サイトとなるには一塩基の変異で足りた。したがって、本実施例では、一塩基変異導入することで、野生型では制限酵素で切れて、変異型では切れないような、dCAPSマーカーを作製した。なおこの場合、断片長の差はプライマーの長さ分の差として検出される。作製したプライマーは表6の通りである。
各種eIF(iso)4Eタバコ変異体について、eIF(iso)4E遺伝子の転写解析を行った。DNAマーカーで選抜された、eIF(iso)4E_S型変異体(ssTT)、eIF(iso)4E_T型変異体(SStt)、eIF(iso)4E_ST両ホモ変異体(sstt)、およびeIF(iso)4E_野生型系統(SSTT)から、上述と同様にRNAを抽出し、cDNAを合成して、定量PCRを行った。プライマー/プローブセットは、S型のeIF(iso)4E遺伝子用には、表2に示した配列番号19、20および21を用いた。また、T型eIF(iso)4E遺伝子用には、表6に示した配列番号49、50および51を新たに設計し、実験に供試した。
培土への移植後2週間の個体に、PVY−B(Potato virus Y のVAM breaking系統)、またはTBTV(Tobacco bushy top virus)を接種した。ウイルス接種源の作製およびタバコへの接種方法は、実施例1と同様の方法で実施した。接種後、温室内で栽培し、適宜病徴を観察した。eIF(iso)4E機能欠損変異体タバコのウイルス接種試験結果を表8および表9に示す。
なお、eIF(iso)4E機能抑制タバコに、生育阻害は一切見られなかった。
FERM BP-22285
Claims (34)
- 翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ。
- 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項1に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記変異は、(a)配列番号3もしくは配列番号4に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、(b)配列番号3もしくは配列番号4に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、(c)配列番号5もしくは配列番号6に示す塩基配列からなるmRNAが生成される野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、または(d)配列番号5もしくは配列番号6に示す塩基配列と92%以上の配列同一性を有するmRNAが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソンにおける、下記(1)〜(4)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項1または2に記載のウイルス抵抗性タバコ;
(1)コドンCAAのCがTに置換、(2)コドンCGAのCがTに置換、(3)コドンCAGのCがTに置換、(4)コドンTGGのG(2つのGのうちの何れか一方または両方)がAに置換。 - 上記変異は、ゲノムDNAにおける、配列番号7に示す塩基配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の下記(1)〜(27)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項1〜3の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ;
(1)270番目のCがTに置換、(2)295番目のGがAに置換、(3)296番目のGがAに置換、(4)304番目のGがAに置換、(5)305番目のGがAに置換、(6)315番目のCがTに置換、(7)330番目のCがTに置換、(8)343番目のGがAに置換、(9)344番目のGがAに置換、(10)357番目のCがTに置換、(11)394番目のGがAに置換、(12)395番目のGがAに置換、(13)1740番目のCがTに置換、(14)1813番目のGがAに置換、(15)1814番目のGがAに置換、(16)1846番目のGがAに置換、(17)1847番目のGがAに置換、(18)1888番目のGがAに置換、(19)1889番目のGがAに置換、(20)2050番目のCがTに置換、(21)2104番目のCがTに置換、(22)2123番目のGがAに置換、(23)2124番目のGがAに置換、(24)2152番目のCがTに置換、(25)4742番目のGがAに置換、(26)4743番目のGがAに置換、(27)4926番目のCがTに置換。 - 上記変異は、ゲノムDNAにおける、配列番号8に示す塩基配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の下記(1)〜(26)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項1〜3の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ;
(1)264番目のCがTに置換、(2)289番目のGがAに置換、(3)290番目のGがAに置換、(4)298番目のGがAに置換、(5)299番目のGがAに置換、(6)315番目のCがTに置換、(7)328番目のGがAに置換、(8)329番目のGがAに置換、(9)342番目のCがTに置換、(10)379番目のGがAに置換、(11)380番目のGがAに置換、(12)1630番目のCがTに置換、(13)1703番目のGがAに置換、(14)1704番目のGがAに置換、(15)1736番目のGがAに置換、(16)1737番目のGがAに置換、(17)1778番目のGがAに置換、(18)1779番目のGがAに置換、(19)1940番目のCがTに置換、(20)1994番目のCがTに置換、(21)2013番目のGがAに置換、(22)2014番目のGがAに置換、(23)2042番目のCがTに置換、(24)3224番目のGがAに置換、(25)3225番目のGがAに置換、(26)3406番目のCがTに置換。 - 上記変異は、(a)配列番号3に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子、(b)配列番号3に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子、(c)配列番号5に示す塩基配列からなるmRNAが生成される野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子、または(d)配列番号5に示す塩基配列と92%以上の配列同一性を有するmRNAが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における1つ以上の変異であり、
上記ウイルスは、Umbravirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項1〜4の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ。 - 上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることを特徴とする、請求項6に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記変異は、(a)配列番号4に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子、(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子、(c)配列番号6に示す塩基配列からなるmRNAが生成される野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子、または(d)配列番号6に示す塩基配列と92%以上の配列同一性を有するmRNAが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における1つ以上の変異であり、
上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項1〜3および5の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ。 - 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることを特徴とする、請求項8に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現量が野生型と比較して20%以下であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ。
- 上記発現量は野生型と比較して10%以下であることを特徴とする、請求項10に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制するためのRNAiコンストラクトを保持することを特徴とする、請求項10または11に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異を翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項13に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせることを特徴とする、請求項13または14に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記変異は、(a)配列番号3もしくは配列番号4に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、(b)配列番号3もしくは配列番号4に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、(c)配列番号5もしくは配列番号6に示す塩基配列からなるmRNAが生成される野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、または(d)配列番号5もしくは配列番号6に示す塩基配列と92%以上の配列同一性を有するmRNAが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソンにおける、下記(1)〜(4)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項13〜15の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法;
(1)コドンCAAのCがTに置換、(2)コドンCGAのCがTに置換、(3)コドンCAGのCがTに置換、(4)コドンTGGのG(2つのGのうちの何れか一方または両方)がAに置換。 - 上記変異は、ゲノムDNAにおける、配列番号7に示す塩基配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の下記(1)〜(27)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項13〜16の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法;
(1)270番目のCがTに置換、(2)295番目のGがAに置換、(3)296番目のGがAに置換、(4)304番目のGがAに置換、(5)305番目のGがAに置換、(6)315番目のCがTに置換、(7)330番目のCがTに置換、(8)343番目のGがAに置換、(9)344番目のGがAに置換、(10)357番目のCがTに置換、(11)394番目のGがAに置換、(12)395番目のGがAに置換、(13)1740番目のCがTに置換、(14)1813番目のGがAに置換、(15)1814番目のGがAに置換、(16)1846番目のGがAに置換、(17)1847番目のGがAに置換、(18)1888番目のGがAに置換、(19)1889番目のGがAに置換、(20)2050番目のCがTに置換、(21)2104番目のCがTに置換、(22)2123番目のGがAに置換、(23)2124番目のGがAに置換、(24)2152番目のCがTに置換、(25)4742番目のGがAに置換、(26)4743番目のGがAに置換、(27)4926番目のCがTに置換。 - 上記変異は、ゲノムDNAにおける、配列番号8に示す塩基配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の下記(1)〜(26)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項13〜16の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法;
(1)264番目のCがTに置換、(2)289番目のGがAに置換、(3)290番目のGがAに置換、(4)298番目のGがAに置換、(5)299番目のGがAに置換、(6)315番目のCがTに置換、(7)328番目のGがAに置換、(8)329番目のGがAに置換、(9)342番目のCがTに置換、(10)379番目のGがAに置換、(11)380番目のGがAに置換、(12)1630番目のCがTに置換、(13)1703番目のGがAに置換、(14)1704番目のGがAに置換、(15)1736番目のGがAに置換、(16)1737番目のGがAに置換、(17)1778番目のGがAに置換、(18)1779番目のGがAに置換、(19)1940番目のCがTに置換、(20)1994番目のCがTに置換、(21)2013番目のGがAに置換、(22)2014番目のGがAに置換、(23)2042番目のCがTに置換、(24)3224番目のGがAに置換、(25)3225番目のGがAに置換、(26)3406番目のCがTに置換。 - 翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現量を野生型と比較して20%以下に抑制させる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記発現量を野生型と比較して10%以下に抑制させる因子をタバコに導入することを特徴とする、請求項19に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記因子はRNAiコンストラクトであることを特徴とする、請求項19または20に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項13〜21の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yであることを特徴とする、請求項22に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統であることを特徴とする、請求項22に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記ウイルスは、Umbravirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項13〜21の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることを特徴とする、請求項25に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- タバコの翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする、検出用ポリヌクレオチド。
- 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項27に記載の検出用ポリヌクレオチド。
- 上記変異は、(a)配列番号3もしくは配列番号4に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、(b)配列番号3もしくは配列番号4に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、(c)配列番号5もしくは配列番号6に示す塩基配列からなるmRNAが生成される野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソン、または(d)配列番号5もしくは配列番号6に示す塩基配列と92%以上の配列同一性を有するmRNAが生成されるものであり、かつ機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子のエキソンにおける、下記(1)〜(4)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項27または28に記載の検出用ポリヌクレオチド;
(1)コドンCAAのCがTに置換、(2)コドンCGAのCがTに置換、(3)コドンCAGのCがTに置換、(4)コドンTGGのG(2つのGのうちの何れか一方または両方)がAに置換。 - 上記変異は、ゲノムDNAにおける、配列番号7に示す塩基配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の下記(1)〜(27)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項27〜29の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド;
(1)270番目のCがTに置換、(2)295番目のGがAに置換、(3)296番目のGがAに置換、(4)304番目のGがAに置換、(5)305番目のGがAに置換、(6)315番目のCがTに置換、(7)330番目のCがTに置換、(8)343番目のGがAに置換、(9)344番目のGがAに置換、(10)357番目のCがTに置換、(11)394番目のGがAに置換、(12)395番目のGがAに置換、(13)1740番目のCがTに置換、(14)1813番目のGがAに置換、(15)1814番目のGがAに置換、(16)1846番目のGがAに置換、(17)1847番目のGがAに置換、(18)1888番目のGがAに置換、(19)1889番目のGがAに置換、(20)2050番目のCがTに置換、(21)2104番目のCがTに置換、(22)2123番目のGがAに置換、(23)2124番目のGがAに置換、(24)2152番目のCがTに置換、(25)4742番目のGがAに置換、(26)4743番目のGがAに置換、(27)4926番目のCがTに置換。 - 上記変異は、ゲノムDNAにおける、配列番号8に示す塩基配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の下記(1)〜(26)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項27〜29の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド;
(1)264番目のCがTに置換、(2)289番目のGがAに置換、(3)290番目のGがAに置換、(4)298番目のGがAに置換、(5)299番目のGがAに置換、(6)315番目のCがTに置換、(7)328番目のGがAに置換、(8)329番目のGがAに置換、(9)342番目のCがTに置換、(10)379番目のGがAに置換、(11)380番目のGがAに置換、(12)1630番目のCがTに置換、(13)1703番目のGがAに置換、(14)1704番目のGがAに置換、(15)1736番目のGがAに置換、(16)1737番目のGがAに置換、(17)1778番目のGがAに置換、(18)1779番目のGがAに置換、(19)1940番目のCがTに置換、(20)1994番目のCがTに置換、(21)2013番目のGがAに置換、(22)2014番目のGがAに置換、(23)2042番目のCがTに置換、(24)3224番目のGがAに置換、(25)3225番目のGがAに置換、(26)3406番目のCがTに置換。 - 上記変異を挟む核酸プライマーのセット、または、上記変異を含む連続した塩基配列もしくはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットであることを特徴とする、請求項27〜31の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチド。
- タバコにおいて、ゲノムDNAにおける上記変異の有無を、請求項27〜32の何れか一項に記載の検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、
上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法。 - 翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異であることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用DNAマーカー。
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