CN101397569A - 一种提高烟草病毒抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高烟草病毒抗性的方法。提高烟草病毒抗性的方法包括：人工合成由编码烟草病程蛋白－1a信号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽(PAP)的DNA序列组成的PAP融合基因，用这种融合基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导将PAP融合基因导入烟草细胞，在筛选培养基上筛选抗性愈伤组织和诱导再生植株，利用分子生物学方法鉴定转基因植株，通过病毒攻毒试验，可筛选病毒抗性强、生长发育正常的转基因植株。本发明能克服利用野生型美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化烟草后，转基因烟草出现PAP细胞毒性与病毒抗性提高不大的缺陷，有助于培育广谱抗病毒的烟草品种。

Description

一种提高烟草病毒抗性的方法

技术领域

本发明属于植物抗病毒育种领域，具体而言，本发明涉及一种提高烟草病毒抗性的方法。

背景技术

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein，PAP)属于类型I单链核糖体灭活蛋白(ribosome-inactiviting protein，RIP)，RIP蛋白是位点特异的RNA N-糖苷酶，裂解真核生物核糖体28S rRNA和原核生物核糖体23S rRNA Sarcin/ricin区域特殊腺嘌呤的N-糖苷键，使核糖体不能与eEF-2-GTP复合体结合，导致mRNA不能翻译成蛋白质，抑制病毒在细胞内的繁殖。Irvin(1975，1980)首先从美洲商陆(Phytolacca americana)叶片中提取得到PAP，并研究报道了该蛋白广谱抗病毒特性，Lin等(1991)、Poyet等(1994)、Poyet等(1997)和Park等(2002)分别从美洲商陆春叶、夏叶、种子和根中克隆了PAP、PAP II、PAP-S和PAP-H四种cDNA。PAP原蛋白由的N端结构域(22个氨基酸)、中心结构域(262个氨基酸)和C端结构域(29个氨基酸)组成，其他类型的PAP结构类似，但各结构域氨基酸数目和种类有较大差异。N端结构域主要起信号肽作用，将PAP定位在细胞壁基质中；中心结构域含有4个在RIP中高度保守的活性催化残基，是PAP活性的关键区域，而C端结构域，起着辅助N端信号肽细胞定位的作用，Ready等(1986)研究指出，PAP抗病毒作用机理属于“局部***”模型，即PAP与PAP II定位于美洲商陆细胞壁基质中，病毒感染时，PAP随病原体进入细胞，将宿主细胞的核糖体灭活，导致感病细胞死亡，从而抑制病毒繁殖，使相邻细胞不受感染。这个模型得到Bonness等(1994)研究的支持，并且Park等(2002)也证实PAP H定位在根尖细胞壁基质。研究表明：PAP具有与RIP相似的抗病毒功能，能抑制动植物病毒和噬菌体活性，是广谱的抗病毒蛋白(Peumans等，2001)。例如，PAP抑制脊髓灰白质炎病毒(Polio virus)、流感病毒(Influenza virus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus typeI)、人类免役缺陷病毒(HIV-1)和噬菌体MS2活性，以及多种植物RNA病毒和DNA病毒诸如黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaic virus，CaMV)、非洲木薯花叶病毒(African cassavamosaic virus，ACMV)、苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AIMV)、烟草坏死病毒(Tobacconecrosis virus，TNV)、南方菜豆花叶病毒(Southernbean mosaic virus，SBMV)和芫箐花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)等。因此，PAP在医药领域、植物抗病毒基因工程中具有很大的应用前景。

迄今为止，已经获得烟草、马铃薯、匍茎翦股颖(Agrostis stolonifera)、水稻和百合转PAP基因的植株(Lodge等，1993；Tumer等，1997；Wang等，1998；张海燕等，1998；Dai等，2003；Tabares等，2004；王燕萍等，2006；万多荣等，2007)。但是，转基因植株程度不同地出现PAP细胞毒性症状和病毒抗性不理想的结果，例如Lodge等(1993)和Tumer等(1997)报道，PAP转化频率很低(0.7％)或不能得到转基因植株；即使得到转PAP基因的植株，该植株则表现出不育、矮化和枯斑等PAP产生的细胞毒性症状；接种病毒10天，转基因烟草对烟草花叶病毒的感染率从33％～100％不等，转基因马铃薯对马铃薯Y病毒的感染率从14％～86％，但接种后随着生长时期延长，感染率增加。针对降低PAP细胞毒性和提高转基因植株病毒抗性，在植物抗病毒研究中利用PAP基因的技术特点为：

(1)选择弱毒性的美洲商陆抗病毒蛋白基因如PAPII。Wang等(1998)用PAPII基因转化普通烟草，其转化率为5％，转基因植株表达PAP II蛋白量至少比PAP蛋白高10倍，而且细胞毒性减弱。PAP II蛋白含量达到150ng/mg蛋白才使转基因烟草叶片出现失绿中毒症状，含量低于100ng/mg蛋白以下转基因烟草生长正常。但是，Dai等(2003)报道，在田间种植条件下，表达PAPII的转基因匍茎翦股颖(Agrostis stolonifera)植株死亡率很高，18株转基因植株死亡11株，发生较强的PAP II细胞毒性。

(2)诱导PAP序列突变。Tumer等(1997)诱导编码PAP成熟蛋白N端、C端和活性中心的DNA序列碱基突变，结果表明：C末端W237无义突变的PAP序列导入烟草细胞，转化率提高到11％，转基因植株生长正常，具有一定的抗PVX病毒能力，但随着感染后时间增加，抗病程度降低；N端突变仍然表现中毒症状，虽然活性中心碱基突变的序列导入烟草细胞，转基因植株不表现PAP细胞毒性，但其病毒抗性丧失。万多荣等(2007)诱导PAP信号肽氨基酸突变，将信号肽修饰的PAP导入烟草细胞，虽然转基因植株抗病毒能力有所提高，但仍然表现PAP细胞毒性症状。

(3)利用损伤诱导型启动子，使转基因植株在受到机械或昆虫损伤时表达PAP活性，避免正常生长条件下发生PAP细胞毒性。张海燕等(1998)将蛋白酶抑制子II启动子驱动的PAP cDNA导入甘蓝型油菜，转基因植株接种TuMV病毒后表现出不同程度的抗性，但有的转基因植株发生叶片枯斑等PAP细胞毒性症状。

由此可见，现有利用PAP基因的技术并没有达到既消除PAP细胞毒性又提高转基因植株病毒抗性的目的，限制了PAP基因在植物抗病毒基因工程中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有利用美洲商陆抗病毒蛋白基因技术中的不足，而提出一种利用PAP融合基因提高转基因烟草病毒抗性的方法，即利用烟草病程蛋白-1a信号肽将PAP成熟蛋白定位到细胞壁基质中的功能，将编码烟草病程蛋白-1a信号肽的DNA序列与编码PAP成熟蛋白的DNA序列融合，人工合成PAP融合基因。将这种融合基因导入烟草细胞并获得转基因植株，从转基因植株中筛选出病毒抗性强、很少或不表现PAP细胞毒性的烟草植株。本发明有利于培育广谱抗病毒的烟草品种。

本发明提供的技术方案是：

利用编码烟草病程相关蛋白-1a信号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽的DNA序列人工合成PAP融合基因，该融合基因的序列特征表示在序列表所示的DNA序列中。其中，1～90bp为PR-1a信号肽的DNA序列(GenBank登录号：D90196)，91～876bp为PAP成熟蛋白的DNA序列(GenBank登录号：X55383)；

一种提高烟草病毒抗性的方法，包括以下步骤：

(1)通过反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增方法，克隆编码烟草病程蛋白1a基因(PR-1a)和编码美洲商陆抗病毒蛋白基因(PAP)的cDNA序列；

(2)利用重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlapextension)，用聚合酶链式反应(PCR)扩增的编码烟草病程蛋白1a信号肽的DNA序列和编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽的DNA序列，合成PAP融合基因，并克隆PAP融合基因；

(3)将PAP融合基因的DNA片段连接到双元载体质粒pBI121，构建携带PAP融合基因的植物表达载体；

(4)利用农杆菌介导的方法，将PAP融合基因导入烟草细胞，通过抗生素筛选培养，诱导再生植株，遗传鉴定转基因植株；

(5)机械法将烟草花叶病毒(TMV)等病毒接种转基因植株叶片，选择病毒抗性强、不表现细胞毒性的转基因植株。

具体实施方式

实施例一

1.高保真PCR扩增PAP和PR-1a的cDNA序列

(1)合成第一链cDNA

用TMV感染10～15cm高的盆栽烟草品种K326叶片，4～6周后感病植物叶片表现明显症状，取感病幼叶提取mRNA；用美洲商陆完全伸展的夏季幼叶提取mRNA。具体做法是，各取幼叶0.1克，在液氮中研磨成粉，使用Pharmacia公司Quick Prep Micro mRNA Purification Kit，按照试剂盒使用指南，提取和纯化mRNA。然后，用第一链cDNA合成试剂盒(上海申能***公司)，按照试剂盒使用指南，合成第一链cDNA。

(2)PCR扩增PAP基因片段

根据Lin等(1991)报道的PAP基因序列(GenBank登录号：X55383.1)设计扩增PAP cDNA编码区序列且携带BamH I和Xam I酶切位点的正义引物和反义引物，即5’-GGATCCATGAAGTCGATGCTTGTGGT-3’和5’-CCCGGGTCAGAATCCTTCAAATAGAT-3’。高保真PCR扩增在50μl体系中进行，其中含pfu聚合酶2U，美洲商陆第一链cDNA约20ng，dNTP 200μmol/L，引物浓度各为20pmol/L和10×pfu扩增缓冲液5μl。扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30次循环，最后在72℃下保温10分钟。

(3)PCR扩增PR-1a基因片段

根据Cornelissen(1986)报道的PR-1a基因序列(GenBank登录号：D90196)设计扩增PR-1a cDNA编码区序列且携带BamH I和Xam I酶切位点的正义引物和反义引物，即5’-GGATCCATGGGATTTGTTCTCTTT-3’和5’-CCCGGGTTAGTATGGACTTTCGCCTC-3’。以烟草第一链cDNA为模板，PCR扩增PR-1a基因片段，扩增反应体系和条件同本实例步骤1(2)。

2.PAP基因和PR-1a基因的克隆

扩增产物在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶板中电泳，TAE电泳缓冲液，电压4V/cm。电泳后，在长波紫外光照下，快速切取只含DNA片段的凝胶。用3S核酸纯化试剂盒(申能***公司)纯化PCR扩增片段。使用pGEM-T Easy试剂盒(Promega公司)，按照试剂盒使用指南，将扩增的DNA片段连接到pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌菌株JM109，在含有X-gal 80mg/L、IPTG 100mg/L和氨苄青霉素100mg/L的LB培养基上培养。挑选白色菌落，以碱裂解法(金冬雁，黎孟枫等译：分子克隆实验指南，科学出版社，1992，P26)提取质粒。在20μl反应体系中，加入质粒DNA0.1μg，10×EcoR I酶缓冲液2μl与EcoRI 10U，37℃恒温水浴中酶切反应4小时。电泳酶切产物，鉴定携带含有***目的DNA片段的pGEM-T载体的JM109细胞克隆。将克隆的基因进行DNA序列测序(上海生工生物技术有限公司)后，分别与NCBI基因库中PAP基因和PR-1a基因的序列比对，选择携带含有目的基因碱基序列正确的pGEM-T质粒的JM109细胞克隆。

实施例二

利用重叠区扩增基因拼接法合成编码PR-1a信号肽的DNA序列与编码PAP成熟肽的DNA序列合成融合基因。

(1)PCR扩增编码PR-1a信号肽的DNA片段

正义引物和反义引物分别为：5’-GGATCCATGGGATTTGTTCTCTTT-3’和5’-CCCGGGAACATTGTAGATGATTGTGGCACGGCAAGAGTGG-3’，以携带PR-1a的质粒为摸板，在50μl体系中进行高保真PCR扩增。其中，含10×pfu扩增缓冲液5μl，质粒DNA 20ng，dNTP 200μmol/L，引物20pmol/L和pfu聚合酶2U。扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共进行30次循环，最后在72℃下保温10分钟。PCR扩增产物的电泳与纯化同实例一步骤2。

(2)PCR扩增编码PAP成熟蛋白的DNA序列

正义引物和反义引物分别为：

5’-TCCCACTCTTGCCGTGCCACAATCATCTACAATGTT-3’和5’-CCCGGGTCAAGTTGTCTGACAGCTCCC，以携带PAP的质粒为摸板，在50μl体系中进行高保真PCR扩增。其他步骤同本实例步骤(1)。

(3)PCR扩增PAP融合基因

正义引物和反义引物分别为：5’-GGATCCATGGGATTTGTTCTCTTT-3’和5’-CCCGGGTCAAGTTGTCTGACAGCTCCC，以纯化的编码PR-1a信号肽的DNA片段和编码PAP成熟蛋白的DNA片段为摸板，在50μl体系中进行高保真PCR扩增。其他步骤同本实例步骤(1)。

(4)PAP融合基因克隆

PAP融合基因克隆与酶切鉴定方法与实例一步骤2相同。将测序后的PAP融合基因序列，与NCBI基因库中PR-1a信号肽相应序列和PAP成熟肽相应序列比对，选择携带含有目的基因片段碱基序列正确的pGEM-T质粒的JM109细胞克隆。

实施例三

1.构建PAP融合基因的植物表达载体

(1)PAP融合基因DNA片段和线型双元载体质粒pBI121片段的纯化

用BamH I和Xam I酶分别双酶切含有PAP融合基因的pGEM-T载体质粒和双元载体质粒pBI121。做法是，在20μl反应体系中加入质粒DNA0.5μg，10×BamH I反应缓冲液2μl与BamH I 10U，37℃恒温水浴中酶切反应4小时。然后，在反应液中加入无水乙醇40μl，混匀，-20℃下放置30分钟，每分钟12000转离心10分钟，弃溶液，17μl无菌水溶解DNA沉淀。在该DNA溶液中，加入10×Xam I反应缓冲液2μl与Xam I 10U(10U/μl)，37℃水浴中酶切反应4小时。电泳酶切产物，用手术刀切取琼脂糖凝胶中的PAP融合基因条带和线型双元载体质粒pBI121条带，用3S核酸纯化试剂盒(申能***公司)分别纯化这两种DNA条带。

(2)PAP融合基因与双元载体pBI121质粒连接与克隆

在10μl连接反应体系中，加入2×T₄ DNA连接酶缓冲液5μl，PAP融合基因片段3μl，质粒pBI121 1μl和T₄ DNA连接酶1μl，4℃下连接过夜。用连接转化产物3μl与大肠杆菌菌株JM109感受态细胞50μl混合，将转化处理的大肠杆菌菌株JM109细胞涂布在含有卡那霉素100mg/L的LB培养基上，培养过夜。选取单菌落，碱裂解法提取质粒，按照本实例步骤1(1)方法，用BamHI和Xam I酶双酶切，然后进行电泳，观察电泳后琼脂糖凝胶中双酶切产物出现的PAP融合基因的DNA片段，以此确定携带含有PAP融合基因的pBI121质粒的JM109细胞克隆。

(3)农杆菌LBA4404的遗传转化

用携带PAP融合基因的pBI121质粒0.1μg与农杆菌LBA4404感受态细胞混合，冻融法转化农杆菌。转化处理后的农杆菌在含有利福平80mg/L与卡那霉素100mg/L的YEB培养基上培养24～48小时，选取单菌落，碱裂解法微量提取质粒，用BamH I和Xam I酶双酶切(方法同本实例步骤1(1))，电泳酶切产物，观察琼脂糖凝胶中酶切产物的PAP融合基因片段，鉴定携带含有PAP融合基因的pBI121质粒的农杆菌菌落。

2.烟草叶片的遗传转化

(1)农杆菌的培养

YEB培养基中过夜培养农杆菌，取菌液2ml，加入到20ml同一培养基中，在28℃、每分钟180转的条件下震荡培养6小时左右，用分光光度计检测菌液浓度为OD₆₀₀＝0.2～0.5时，用于烟草叶片细胞的遗传转化。(2)烟草叶片外植体表面消毒

取烟草K326品种3月龄植株上完全伸展的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台上，将叶片放入无菌烧杯中，用70％酒精浸泡叶片30秒，然后用0.1％氯化汞对叶片表面消毒6分钟，无菌水清洗5次，每次在无菌水中停留5分钟。在表面消毒与清洗过程中，需要间歇地摇动烧杯，使叶片表面消毒与清洗彻底。然后，将无菌叶片剪切成0.5～1.0cm²大小，用于感染农杆菌。

(3)农杆菌感染烟草叶片外植体

将烟草叶外植体放入OD₆₀₀＝0.2～0.5的菌液中，在每分钟80转的摇床上震荡感染10分钟。然后，在超净工作台内，用无菌滤纸上吸除叶外植体上多余的菌液后，将叶片接种在MS共培养基(MS基本培养基+萘乙酸0.02mg/L+6-苄氨基腺嘌啉0.2mg/L+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8)上，在26±1℃、黑暗条件下共培养3天。

(4)筛选抗性愈伤组织与诱导植株再生

将共培养后的叶片转移到MS筛选培养基(MS基本培养基+萘乙酸0.02mg/L+6-苄氨基腺嘌啉0.2mg/L+羧苄青霉素100mg/L+卡那霉素80mg/L+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8)上。每隔3～4天将培养叶外植体转移到同一新配制的培养基上。培养条件为，光照2000lx，温度25℃。经过3～4周的培养后，从叶外植体边缘个别部位形成小愈伤组织，再经过1～2周培养，从愈伤组织上分化出不定芽。卡那霉素抗性的无菌苗生长到2cm左右长时，将无菌苗从茎基部切离，转移到MS生根培养基(1/2大量元素浓度的MS基本培养基+萘乙酸0.01mg/L+羧苄青霉素100mg/L+卡那霉素80mg/L+1％蔗糖+0.6％琼脂，pH＝5.8)中诱导生根，培养条件同上。10天后，从无菌苗茎基部产生多条幼根。根长达到1～2cm长后，取出生根苗，小心清除抗性苗根系的琼脂，移栽到土壤中。移栽初期，用塑料薄膜遮盖，保持相对湿度90％以上，温度20～25℃。移栽苗恢复生长后，逐步降低相对湿度，直到与自然环境的相对湿度一致。

3.转基因植株的鉴定与PAP融合基因的表达分析

(1)PCR扩增鉴定转基因植株。

取抗生素抗性的植株幼叶0.1g，在液氮中快速研磨成粉，迅速转入预冷的1.5ml离心管中，立即加入65℃预热的2×十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)提取缓冲液0.5ml，在65℃水浴中提取30分钟。然后，加入等量的氯仿/异戊醇(24:1)，来回颠倒抽提。每分钟12000转离心10分钟。取上清液0.4ml，加入-20℃预冷的异丙醇0.8ml，来回颠倒混匀，溶液中出现丝状DNA物质。挑出丝状DNA物质，用76％乙醇(含10mmol/L乙酸铵)漂洗20分钟后，稍微干燥，用0.5ml TE缓冲液溶解。进一步纯化DNA的步骤与Williams等(1990)描述的相同(Nucleic Acids Res.18：6531-6535，1990)。

用两种DNA序列的PCR扩增片段鉴定转基因植株，一种是npt II基因的DNA片段，其正义和反义引物分别是：5’-CCGACCTGTCCGGTGCCC-3’和5’-CCGCCACACCCAGCCGGCC-3’，扩增产物大小为495bp；另一种是35S启动子片段，其正义和反义引物分别是：5’-CACAGATGGTTAGAGAGGCT-3’和5’-TTACGGCGAGTTCTGTTAGG-3’，扩增产物大小为315bp。在50μl PCR扩增体系中，各加入叶片总DNA 100ng，Tag DNA聚合酶3U，dNTP 200μmol/L，正义和反义引物浓度各为20ρmol/L，10×Tag DNA酶缓冲液5μl，超纯水补足到50μl。扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共进行35个循环，最后72℃保温10分钟。同时，用携带PAP融合基因的植物表达载体质粒和非转基因植株叶片总DNA为模板，分别作为阳性和阴性对照，在同样条件下进行PCR扩增。扩增产物在含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中电泳，TAE电泳缓冲液，电压4V/cm。通过凝胶成像仪观察电泳结果，阳性对照和转基因植株的PCR产物出现495bp和315bp大小的DNA条带，而阴性对照无这些DNA条带。

(2)RT-PCR半定量分析PAP融合基因的表达

取转基因植株上完全展开的幼叶0.1g，于液氮中充分研磨成粉，使用植物RNA提取试剂盒(普利莱公司，按说明书进行实验操作)提取转基因植株叶肉细胞总RNA。在含有总RNA的100μl体系中加入DNase 2U，37℃温浴10分钟，消除RNA中的微量DNA。利用第一链cDNA合成试剂盒(上海申能***生物技术公司，按试剂盒说明书操作)合成第一链cDNA。

以烟草延长因子-1α(EF-1α)(GenBank登录号：D63396)转录产物为内参，其PCR扩增的正义和反义引物分别是5’-TCACATCAACATTGTGGTCATTGGC-3’和5’-TTGATCTGGTCAAGAGCCTCAAG-3’。从第一链cDNA得到的PCR扩增产物大小为654bp。PCR扩增PAP融合基因编码成熟蛋白序列，所设计的正义引物和反义引物分别是5’-GGTTATTCTGATCCCTTTGA-3’和5’-TCTTACCCCATGTCTCTTGC-3’，从第一链cDNA得到的PCR扩增产物大小为409bp。在50μl PCR扩增体系中，加入模板cDNA 100ng，Tag DNA聚合酶3U，dNTP 200μmol/L，正义和反义引物浓度各为20ρmol/L，10×Tag DNA酶缓冲液5μl，超纯水补足到50μl。扩增条件是，94℃预变性4分钟，然后94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸45秒，共30个循环；最后在72℃延伸7分钟。在各样品EF-1α的PCR扩增产物水平基本一致的条件下，根据不同样品中PCR扩增PAP融合基因片段的电泳观察结果，确定转基因植株的PAP融合基因是否表达，以及PAP融合基因表达的强弱。将PAP融合基因表达的转基因植株按本实例步骤4的方法检测病毒抗性。

4.转基因植株的病毒抗性

取4℃下干燥保存、携带TMV的烟草叶片20mg，置于玻璃研钵中，加入0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)2ml，研磨成匀浆，制备TMV病毒溶液。加入少许400目的石英砂与病毒液混匀。以盆栽中新生长5～7叶的烟草转基因和非转基因植株为材料，用玻璃棒蘸取病毒液，轻轻摩擦叶片表面，接种病毒。同时接种其他病毒的方法同上。接种病毒后20天，定期观察记录植株***感病症状，选择没有或轻度表现TMV等病毒***感染症状，且生长发育正常，没有PAP细胞毒性表现的转基因植株，将其作为病毒抗性的育种材料，用于培育广谱抗病毒的烟草。

实施例中使用的培养基与缓冲液

(1)TAE电极缓冲液(100ml的50倍贮存液)：

Tris，24.2g；冰乙酸，5.7ml；EDTA，10ml 0.5mol/L(pH8.0)；

(2)LB培养基：

胰蛋白，5g/L；酵母提取物，10g/L；NaCl，10g/L；pH，7.0；

(3)YEB液体培养基：

蛋白胨，5g/L；酵母提取物，10g/L；牛肉膏，5g/L；蔗糖，5g/L；MgSO4，0.495g/L；pH，7.0；

(4)MS基本培养基：

大量元素成分：

KNO₃，1900mg/L；NH₄NO₃，1650mg/L；CaCl₂·2H₂O，440mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，170mg/L；

微量元素成分：

FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：

肌醇，100mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2.0mg/L；

(5)2×十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)提取缓冲液：

Tris-HCl，100mmol/L(pH8.0)；CTAB，2％(w/v)；NaCl，1.4mol/L；β-巯基乙醇，40mmol/L；EDTA，20mmol/L；

(6)TE缓冲液：

Tris-HCl，10mmol/L(pH，7.4)；EDTA，1mmol/L；

序列表

<110>北京师范大学

<120>一种提高烟草病毒抗性的方法

<130>1234

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>876

<212>DNA

<213>美洲商陆(Phytolacca americana)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(876)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(90)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(91)..(876)

<400>1

<210>2

<211>292

<212>PRT

<213>美洲商陆(Phytolacca americana)

<400>2

Claims (6)

1、一种由编码烟草病程蛋白-1a信号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽的DNA序列组成的PAP融合基因，它编码序列表SEQ NO：2所示的氨基酸序列。

2、根据权利要求1所述的融合基因编码的多肽，它是由序列表SEQ NO：1所示的DNA序列编码的。

3、含有权利要求2所述的融合基因的植物表达载体。

4、根据权利要求3所述的植物表达载体，它含有编码烟草病程蛋白-1a信号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽的DNA序列组成的融合基因。

5、含有权利要求2所述的融合基因的转基因植物。

6、根据权利要求5所述的植物是普通烟草(Nicotiana tabacum)。