JP7210806B2 - 低アルカロイド含量のタバコ属植物体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の一実施形態は、(a)配列番号2または配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体を提供する。
ポリヌクレオチド1:配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド2a:配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド2b:配列番号6に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド3:配列番号62に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド4a:配列番号63に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド4b:配列番号64に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
上記(III)は、例えば、配列番号35における3135位、3477位、3842位、3933位、4177位、4266位、4324位、4408位、4490位、4778位、4841および5069位;
配列番号36における3135位、3478位、3843位、3934位、4178位、4267位、4325位、4409位、4491位、4779位、4842位および5071位;ならびに
配列番号37における3135位、3278位、3643位、3733位、3977位、4078位、4136位、4236位、4318位、4747位、4810および5032位
のうちいずれか1つ(いずれも上述のイントロンの保存配列である)にG→A置換を生じているAO2遺伝子において、生じる。
上記(IV)は、例えば、(IVa)~(IVf)に示されている1つ以上の位置に生じているC→T置換またはG→A置換を生じているAO2遺伝子において、生じる。配列番号35~37においてインフレームに存在するCAA、CAG、CGAおよびTGGのみが、EMS処理によってストップコドン(TAA、TAGおよびTGA)に変化し得るからである。以下の例示において、「C」は、置換される前のヌクレオチド(つまりC→T置換)を表し、「G」は、置換される前のヌクレオチド(つまりG→A置換)を表す。
・配列番号35における(IVa)および(IVb):
(IVa)3031位のC、3118位のC、3124位のC、3134位のG、3478位のG、3486位のG、3487位のG、3503位のC、3527位のC、3533位のC、3552位のG、3553位のG、3563位のC、3584位のC、3587位のC、3653位のC、3737位のC、3791位のC、4051位のC、4141位のC、4174位のC、4812位のC、4818位のC、5077位のC、5275位のC、5398位のC、5401位のC、5479位のC、5533位のC、5575位のC、5587位のC、5642位のG、5643位のG、5645位のG、5646位のG、5731位のC、5744位のG、5745位のG、5822位のG、5823位のG、5839位のC、5849位のG、5850位のG、5935位のC、および5938位のC、
(IVb)6022位のC、6025位のC、6038位のG、6039位のG、6049位のC、および6061位のC;
・配列番号36における(IVc)および(IVd):
(IVc)3031位のC、3118位のC、3124位のC、3134位のG、3479位のG、3487位のG、3488位のG、3504位のC、3528位のC、3534位のC、3553位のG、3554位のG、3564位のC、3585位のC、3588位のC、3654位のC、3738位のC、3792位のC、4052位のC、4142位のC、4175位のC、4813位のC、4819位のC、5079位のC、5277位のC、5400位のC、5403位のC、5481位のC、5535位のC、5577位のC、5589位のC、5644位のG、5645位のG、5647位のG、5648位のG、5733位のC、5746位のG、5747位のG、5824位のG、5825位のG、5841位のC、5851位のG、5852位のG、5937位のC、および5940位のC、
(IVd)、6024位のC、6027位のC、6040位のG、6041位のG、6051位のC、および(51)6063位のC;ならびに
・配列番号37における(IVe)および(IVf):
(IVe)3031位のC、3118位のC、3124位のC、3134位のG、3279位のG、3287位のG、3288位のG、3304位のC、3334位のC、3353位のG、3354位のG、3364位のC、3385位のC、3388位のC、3454位のC、3538位のC、3592位のC、3851位のC、3941位のC、3974位のC、4781位のC、4787位のC、5040位のC、5238位のC、5361位のC、5364位のC、5442位のC、5496位のC、5538位のC、5550位のC、5605位のG、5606位のG、5608位のG、5609位のG、5694位のC、5707位のG、5708位のG、5785位のG、5786位のG、5802位のC、5812位のG、5813位のG、および5898位のC、
(IVf)5985位のC、5988位のC、6001位のG、6002位のG、6012位のC、および6024位のC。
好ましい実施形態において、上記(IV)が生じている上記位置は、(IVa)、(IVc)および(IVe)に示されている1つ以上の位置である。
特定の実施形態において、上記(IV)が生じている上記位置は、(IVa)および(IVb)に示されている1つ以上の位置である。特定の実施形態において、上記(IV)が生じている上記位置は、(IVa)に示されている1つ以上の位置であることが好ましい。
他の特定の実施形態において、上記(IV)が生じている上記位置は、(IVc)および(IVd)に示されている1つ以上の位置である。当該他の特定の実施形態において、上記(IV)が生じている上記位置は、(IVc)に示されている1つ以上の位置であることが好ましい。
さらなる他の特定の実施形態において、上記(IV)が生じている上記位置は、(IVe)および(IVf)に示されている1つ以上の位置である。当該さらなる他の特定の実施形態において、上記(IV)が生じている上記位置は、(IVe)に示されている1つ以上の位置であることが好ましい。
(1)コドンCAAにおけるC→T置換、(2)コドンCAGにおけるC→T置換、(3)コドンCGAにおけるC→Tに置換、(4)コドンTGGにおける1つまたは2つのG→A置換、(5)翻訳開始コドンATGにおけるG→A置換。
上記コード領域は、配列番号2、配列番号5もしくは配列番号6に示すアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するAO2タンパク質をコードする領域である。上記AO2タンパク質は、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有している。
本発明の一実施形態は、上記(a)および(b)の内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノム中の当該内在性遺伝子に導入する工程を含む、タバコ属植物体の製造方法を提供する。タバコ属植物体に導入される変異の詳細は、項目〔1.タバコ属植物体〕に記載されている。
・上記パネルに含まれている系統からゲノムDNAを抽出する工程、
・ゲノムDNAにおけるAO2遺伝子の塩基配列を決定する工程、
・ホモ接合型の変異の入った系統を、上記パネルから選抜する工程、および
・上記系統におけるアルカロイド含量を確認する工程。
本発明の一実施形態は、低アルカロイド含量のタバコ属植物体の決定方法を提供する。当該決定方法は以下の工程を包含する:
タバコ属植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程;
当該サンプルに含まれているゲノム上にある上記内在性遺伝子の機能抑制を特異的に引き起こす変異を検出する工程;および
上記変異が検出されたタバコ属植物体を、低アルカロイド含量のタバコ属植物体として決定する工程。
以上の各実施形態をまとめると、本発明は、以下のように要約され得る。
(1)配列番号2または配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノムに導入されている、タバコ属植物体。
配列番号2または配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノムに導入する工程を含む、タバコ属植物体の製造方法。
(a)配列番号2または配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの存在量の減少である、(1)に記載のタバコ属植物体。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの分解の促進である、(2)に記載のタバコ属植物体。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのmRNAの転写量の減少である、(2)に記載のタバコ属植物体。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、(1)~(4)のいずれかに記載のタバコ属植物体。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、(5)に記載のタバコ属植物体。
上記変異は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、(1)~(6)のいずれかに記載のタバコ属植物体。
ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ルスチカに属する、(1)~(7)のいずれかに記載のタバコ属植物体。
(c)配列番号62または配列番号63に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(d)配列番号64に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されていない、(1)~(8)のいずれかに記載のタバコ属植物体。
タバコ属植物体の製造方法であって、
(a)配列番号2または配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノムに導入する工程を含み、
上記導入する工程が、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、タバコ属植物体の製造方法。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの存在量の減少である、(10)に記載の製造方法。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの分解の促進である、(11)に記載の製造方法。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのmRNAの転写量の減少である、(11)に記載の製造方法。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、(10)~(13)のいずれか1項に記載の製造方法。
上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、(14)に記載の製造方法。
上記導入する工程が、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、(10)~(15)のいずれかに記載の製造方法。
(c)配列番号62または配列番号63に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(d)配列番号64に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されないことを、さらに含んでいる、(10)~(16)のいずれかに記載の製造方法。
(1)~(9)のいずれかに記載のタバコ属植物体、または(10)~(17)のいずれかに記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代。
(a)配列番号2または配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および/または
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこと比べて、低いアルカロイド含量を示す、葉たばこ。
(a)配列番号2または配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および/または
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する95%以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこから生成された乾燥葉と比べて、低いアルカロイド含量を示す、乾燥葉。
(20)に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
栽培タバコ、ニコチアナ・タバカム(染色体数:2n=4x=48)は二倍体のタバコ野生種ニコチアナ・シルベストリス(染色体数:2n=2x=24)およびこれもまた二倍体のタバコ野生種ニコチアナ・トメントシフォルミス(染色体数:2n=2x=24)の交雑に由来する複二倍体であり、それぞれの親に由来する2つのサブゲノム(ニコチアナ・シルベストリス由来のサブゲノムおよびニコチアナ・トメントシフォルミス由来のサブゲノムをそれぞれ「S」または「Sゲノム」および「T」または「Tゲノム」と称する)を有する。そのため、ニコチアナ・タバカムにおいて、対立遺伝子の存在も考慮すれば、多くの遺伝子について同じ機能を有する遺伝子が各々2ペア(S型ゲノムに1ペア=2対立遺伝子およびT型ゲノムに1ペア=2対立遺伝子)存在する。したがって、ニコチアナ・タバカムでは、標的とする遺伝子の機能喪失変異を表現型として観察するためには、機能の重複する4つすべての対立遺伝子の両方を変異させる必要がある。
実施例1で得られた8個のうち6個のSNIC系統および対照のニコチアナ・シルベストリスを圃場で栽培した。各系統について12個体を試験に供した。開花期に心止めし、約6週間後に上から2枚目の葉を各系統について3個体からサンプリングした。空気乾燥(24時間の1サイクル(30℃、湿度75%、16時間→22℃、湿度85%、8時間)を30日間(30サイクル)繰り返し)を実施した。次いで、中骨を除いて凍結乾燥後、マイナーアルカロイド分析に供した。その結果、すべてのSNIC系統のニコチン含量とノルニコチン含量との合計は0.04%(0.4mg/g乾葉)以下であった。これは、対照であるニコチアナ・シルベストリスにおける含量(100%)に対して2.6%以下であった(表4)。また、SNIC系統のニコチン含量、ノルニコチン含量、アナタビン含量、アナバシン含量を合計した総アルカロイドは0.1%(1mg/g乾葉)程度以下であった。
「MutMap法」は、バルク分離分析(bulked segregant analysis、BSA)と全ゲノムシーケンシング(whole genome sequencing、WGS)とを組み合わせて、変異体の原因遺伝子領域を同定する手法である(Abe, A. et al., Nat. Biotechnol., 30(2): 174-178 (2012))。この方法は、従来、行われているマップベースクローニング(map-based cloning)に比較して、マーカー作出の必要がなく、また、大量の個体を用いる必要もないことから、労力および時間が大幅に削減でき、より迅速な遺伝子同定が可能となる。
ニコチアナ・シルベストリスのエチオレート(Ethiolate)処理した葉からCTAB法に従ってゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを、次世代シーケンサーを用いたヌクレオチド配列解析に供して、ゲノム配列を構築し、これをリファレンスゲノムとして使用した。構築したリファレンスゲノムは、3,518本のスカフォールド(scaffold)から構成され、N50は48.7Mbであった。
SNIC4およびSNIC7由来のF2個体のうち、低アルカロイド性を示したそれぞれ25個体および18個体のゲノムDNAを、系統毎に等量混合し、異なる系統に由来する2種類のバルクDNAを調製した。バルクDNAを、Hiseq X ten(イルミナ社)を用いたペアエンドシーケンスに供し、それぞれ131Gbおよび132Gbのシーケンスデータを得た。得られたシーケンスデータを用いてMutMap解析を実施した。
・SNIC1:第2エキソンにおける、中性アミノ酸から酸性アミノ酸への非保存的なアミノ酸置換(Val→Glu)を起こす置換(配列番号35の3756位におけるT→A);
・SNIC2:第7エキソンにおけるナンセンス変異(配列番号35の5533位におけるC→T);
・SNIC5:第4エキソンの開始点におけるスプライス変異(配列番号35の4266位におけるG→A);
・SNIC6:第3エキソンにおける、中性アミノ酸から塩基性アミノ酸への非保存的なアミノ酸置換(Gly→Arg)を起こす置換(配列番号35の4033位におけるG→A)
が見いだされた。以上から、AO遺伝子における変異が低アルカロイド性の原因であると考えられた。
タバコ属には2つのAO遺伝子、AO1およびAO2が存在することが知られている。Kajikawaらの文献(2017, Plant physiology, 174:999-1011)では、ニコチアナ・タバカムSゲノム上のAO2遺伝子を「AO2.1」(Sol Genomicsのgene no. 19078)とし、ニコチアナ・タバカムTゲノム上のAO2遺伝子を「AO2.2」(Sol Genomicsのgene no. 71591)としている。また、AO1遺伝子は「AO1」(Sol Genomicsのgene no. 57190)としている。
(5-1)植物体の組換え操作
ニコチアナ・シルベストリスの幼苗の根からRNeasy Plant Mini Kit(キアゲン社)を用いてRNAを抽出し、PrimeScript(商標)RT reagent Kit(タカラバイオ社)を用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型にして、表11に示すプライマーを使用して、2種類のNsAO2の遺伝子断片(RNAiのtrigger配列)を増幅した。この遺伝子断片は、ニコチアナ・シルベストリスではNsAO2を、ニコチアナ・タバカムではNtAO2-SとNtAO2-Tの双方を特異的に標的とするように設計したRNAi用のトリガー配列である。PCRにはPrimeSTAR(登録商標)Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)を用いた。プライマーの5’末端には後述のクローニングに使用するためのCACC配列が付加されている。
次に、移植された個体のうち、RNAiによってNsAO2が機能抑制されている個体を決定した。決定のために、サンプリングした葉および根におけるNsAO2 mRNAを、以下のように、リアルタイムPCRによって定量した。
・根:対照と比べて非常に少ない量の、AO(AO1およびAO2の両方)およびAO2転写物
・葉:対照と同等の量の、AOおよびAO1転写物
上記6個体を、AO2転写物のみが減少しており、AO1転写物が減少していない個体として、選抜した。上記6個体におけるAO1およびAO2の転写プロファイルを、このように決定した理由を、以下に述べる。これ以降、特に断りがなければ、「AO」は「AO1およびAO2の両方」、「AO1」は「AO1のみ」、「AO2」は「AO2のみ」を表す。
AO1の発現:各組織において恒常的な、比較的に低レベルの発現。
AO2の発現:根において特異的な、高レベルの発現、および他の組織において極めて低レベルの発現。
つまり、タバコ属植物体の根における転写物(AOおよびAO2)を定量すれば、タバコ属植物体におけるAO2転写物量の減少を判定できる。
得られた6個体のNtAO2-RNAi系統および3個体のEmpty系統を、3号鉢に鉢上げ後、およそ1カ月間、人工気象室(28℃で16h明期、22℃で8h暗期)で育成した。その後、人工気象室を低温短日条件(18℃、8h日長)に切り替え、育成した。低温短日条件で育成後、2~4枚の中位葉を、開花期に採取し、70℃で16時間乾燥し、粉砕し、マイナーアルカロイド分析試験に供した。試験の結果を、表14に示す。
AO2-SまたはAO2-Tに変異を有するタバコ変異体を取得した。
NtAO2-F2-1では、葉における斑の発生または早期の老化は認められなかった。NtAO2-F2-2では、ssttおよびSSTTの両方に(AO2遺伝子の変異と無関係に)、外観の類似する斑の発生が葉に認められた。したがって、斑の発生は、系統NtAO2-F2-2に共通する、AO2遺伝子以外の変異に起因すると考えられる。また、上記斑の外観は、後述する比較例の変異体(AO1の機能が抑制されている)に認められる斑の外観と、明らかに異なっていた。
AO1-SまたはAO1-Tに変異を有するタバコ変異体を、以下のように作出した。
(2)NtAO1-S遺伝子に変異を有さず、NtAO1-T遺伝子に変異をホモ接合型に有する個体(NtAO1-SStt)、
(3)NtAO1-S遺伝子に変異をヘテロ接合型に有し、NtAO1-T遺伝子に変異をホモ接合型に有する個体(NtAO1-Sstt)、
(4)NtAO1-S遺伝子に変異を有さず、NtAO1-T遺伝子に変異をヘテロ接合型に有する個体(NtAO1-SStT)、ならびに
(5)NtAO1-S遺伝子およびNtAO1-T遺伝子に変異を有さない個体(NtAO1-SSTT)。
Claims (19)
- (a-1)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(a-2)配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、
(c-1)配列番号62に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(c-2)配列番号63に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(d)配列番号64に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されていない、タバコ属植物体。 - 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの存在量の減少である、請求項1に記載のタバコ属植物体。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの分解の促進である、請求項2に記載のタバコ属植物体。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのmRNAの転写量の減少である、請求項2に記載のタバコ属植物体。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項1~4のいずれか1項に記載のタバコ属植物体。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項5に記載のタバコ属植物体。
- 上記変異は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、請求項1~6のいずれか1項に記載のタバコ属植物体。
- ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ルスチカに属する、請求項1~7のいずれか1項に記載のタバコ属植物体。
- タバコ属植物体の製造方法であって、
(a-1)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(a-2)配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノムに導入する工程を含み、
上記導入する工程が、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含み、
(c-1)配列番号62に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(c-2)配列番号63に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(d)配列番号64に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されていないことを、さらに含んでいる、タバコ属植物体の製造方法。 - 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの存在量の減少である、請求項9に記載の製造方法。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたmRNAの分解の促進である、請求項10に記載の製造方法。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのmRNAの転写量の減少である、請求項10に記載の製造方法。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項9~12のいずれか1項に記載の製造方法。
- 上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項13に記載の製造方法。
- 上記導入する工程が、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、請求項9~14のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載のタバコ属植物体、または請求項9~15のいずれか1項に記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代。
- (a-1)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(a-2)配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および/または
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこと比べて、低いアルカロイド含量を示し、
(c-1)配列番号62に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(c-2)配列番号63に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(d)配列番号64に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されていない、葉たばこ。 - (a-1)配列番号2に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(a-2)配列番号5に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および/または
(b)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこから生成された乾燥葉と比べて、低いアルカロイド含量を示し、
(c-1)配列番号62に示されるアミノ酸配列に対する97%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、または、
(c-2)配列番号63に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
(d)配列番号64に示されるアミノ酸配列に対する96%以上の配列同一性を有しているポリペプチドであって、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されていない、乾燥葉。 - 請求項18に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
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