BR112016030279B1 - Métodos para reproduzir e selecionar tabaco resistente a vírus, polinucleotídeo para uso em detecção e marcador de dna para avaliar tabaco - Google Patents
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Abstract
TABACO RESISTENTE A VÍRUS E MÉTODO PARA REPRODUZIR O MESMO. Este tabaco resistente a vírus contém uma mutação no gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de translação, desse modo provocando a produção de proteínas de eIF(iso)4E que são não funcionais em relação a um vírus ou a supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E., A quantidade de expressão do gene de eIF(iso)4E no tabaco resistente a vírus é 20% ou menos em relação à quantidade no tipo selvagem.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a tabaco resistente a vírus e a um método para produzir o tabaco resisteTnte a vírus.
[0002] O gênero Potyvirus, que é o maior grupo de vírus de plantas, possui uma ampla gama de hospedeiros. O vírus Y da batata (doravante denominado PVY), que é um vírus que pertence ao gênero Potyvirus, pode ser transmitido de forma não persistente através de afídeos e infectam uma variedade de plantas da espécie solanácea. Quando se trata do tabaco, o PVY causa sintomas tais como altura reduzida da planta e necrose das nervuras. Isto resulta em diminuição da qualidade e do rendimento do tabaco em folha e, por conseguinte, causa um grande prejuízo na produção de tabaco em todo o mundo. Como resultado do tabaco em folha infectado com PVY e de qualidade reduzida, são produzidos produtos de tabaco com qualidade significativamente reduzida.
[0003] Entretanto, o vírus do topo espesso ("bushy top") do Tabaco (doravante denominado TBTV), que é um vírus que pertence ao gênero Umbravirus, é conhecido como um vírus causador da doença do topo espesso do tabaco que ocorre na África e na Ásia. O TBTV é transmitido de forma persistente por afídeos em um ambiente natural e provoca atrofia do crescimento da planta e sintomas de mosqueado nas folhas de tabaco. Isto resulta em diminuição da qualidade e do rendimento de tabaco. Em particular, doença do topo espesso do tabaco passou a ser uma doença importante nos países africanos.
[0004] No tabaco (Nicotiana tabacum), o mutante Virgin A (doravante denominado VAM), que é um recurso genético que apresenta resistência ao PVY, é conhecido e é frequentemente utilizado em um programa de reprodução de tabaco. No entanto, a cepa VAM (cepa PVY-Breaking que também pode ser expressa como PVY-B), que é uma cepa nova de PVY para quebrar a resistência de VAM, foi recentemente relatada ao redor domundo. Atualmente, há uma forte demanda por tabaco resistente à cepa VAM-Breaking. Recentemente, foi relatado tabaco que adquire resistência à cepa VAM-Breaking por exposição à radiação (Literatura de Não Patente 1), mas um gene causador ainda não foi identificado. Além disso, algumas das espécies selvagens incluindo, por exemplo, Nicotiana africana, sabidamente apresentam resistência à cepa PVY-Breaking, mas ainda não foram utilizadas em um programa de reprodução.
[0005] Ademais, já foi relatado que foi conduzida uma busca por fontes de resistência para a doença do topo espesso do tabaco usando 43 tipos de variedades de tabaco e espécies selvagens pertencentes ao gênero Nicotiana, e nenhuma dessas variedades de tabaco apresentou resisência à doença do topo espesso do tabaco, embora diversas espécies selvagens não apresentassem sintomas de doenças virais (Literatura de Não Patente 2). Entretanto, o modo de herança de resistência de tais espécies selvagens não foi elucidado, e espera-se que a introdução do traço resistente nas variedades cultivadas de N. tabacum proveniente das espécies selvagens seja acompanhada pela introdução de um traço que afeta negativamente a qualidade e o rendimento. Por conseguinte, o uso prático das mesmas ainda está muito longe.
[0006] Cerca de metade de aproximadamente 200 tipos de genes de resistência a vírus de plantas conhecidos são recessivamente herdados (Literatura de Não Patente 3). Estes genes são considerados os fatores hospedeiros necessários para, por exemplo, replicação e movimento de célula para célula dos vírus. As pesquisas feitas durante a década passada reveleram alguns desses fatores. Por exemplo, fatores de iniciação de tradução tais como eIF4E e eIF4G, proteína DEAD-box RNA helicase-like (Literatura de Não Patente 4), proteína interativa VPg rica em cisteína (Literatura de Não Patente 5), fator de alongamento de tradução (Literatura de Não Patente 6), entre outros, foram identificados com fatores genéticos de resistência recessiva a vírus. Na verdade, nem todos esses fatores são genes de resistência a vírus. Além disso, inúmeros outros fatores são considerados como candidatos a genes de resistência a vírus (Literatura de Não Patente 3). Exemplos de tais candidatos incluem vários fatores de planta associados ao transporte de tubo de peneira de vírus de plantas (Literatura de Não Patente 7).
[0007] Os vírus utilizam sistemas de iniciação de tradução dos hospedeiros na síntese de proteínas de seus próprios genomas. Em 2002, foi mostrado que um fator genético de resistência recessiva contra o vírus do mosaico do nabo (TuMV) em Arabidopsis thaliana é uma mutação de um fator de iniciação de tradução eIF(iso)4E (Literatura de Não Patente 8). Desde então, a associação da família de genes de eIF4E com resistência recessiva vírus conhecidos pertencentes ao gênero Potyvirus vem sendo estudada em algumas plantas. De fato, já foi mostrado que resistência recessiva a vírus é adquirida por uma mutação artificial de eIF4E ou eIF(iso)4E.
[0008] Por exemplo, a Literatura de Patente 1 descreve um método para conferir resistência a vírus suprimindo a função do gene eIF4E (não incluindo eIF(iso)4E). Além disso, a Literatura de Patente 2 descreve uma planta mutante com eIF4E ou eIF(iso)4E não influenciada por um vírus, por mutação splicing do gene de eIF4E ou do gene de eIF(iso)4E. A mutação é a inserção, deleção, ou substituição de pelo menos uma base em uma região não codificadora do eIF4E ou eIF(iso)4E ou em um elemento de splicing (uma região contendo ±10 bases de um sítio de fronteira entre um éxon e um íntron) de eIF4E ou eIF(iso)4E, e a mutação deve ocorrer preferivelmente em um íntron, e mais preferivelmente em um primeiro íntron. Além disso, a Literatura de Patente 3 descreve um método que envolve a seleção de plantas resistentes à doença do mosqueado das nervuras do pimentão (vírus do mosqueado das nervuras do pimentão (PVMV)) por combinação de mutações tanto em eIF4E quanto em eIF(iso)4E, e descreve especificamente um método para selecionar uma planta na qual eIF4E e eIF(iso)4E não são expressos, onde eIF4E mutado é expresso.
[0009] Adicionalmente, já foi mostrado que, por exemplo, um gene causador de resistência recessiva ao PVY em pimentão é o eIF4E (Literatura de Não Patente 9). Além disso, já foi mostrado que o vírus das nervuras amarelo do trevo prolifera na Arabidopsis thaliana deficiente em eIF(iso)4E, mas não prolifera na Arabidopsis thaliana deficiente em eIF4E, e, ao contrário, TuMV prolifera na Arabidopsis thaliana deficiente em eIF4E, mas não prolifera na Arabidopsis thaliana deficiente em eIF(iso)4E (Literatura de Não Patente 10). Ademais, para adquirir resistência ao PVMV, tanto o eIF4E quanto o eIF(iso)4E devem perder suas funções simultaneamente (Literatura de Não Patente 11). Por exemplo, a Literatura de Não Patente 12, a Literatura de Não Patente 13, entre outras, revisaram fatores de iniciação de tradução recentes e a resistência viral das plantas.
[00010] Uma associação entre um número limitado de vírus que não os vírus pertencentes ao gênero Potyvirus e fatores de iniciação de tradução também já foi salienta. Por exemplo, o vírus do mosaico do pepino (CMV) é um vírus pertencente ao gênero Cucumovirus. A produção da proteína 3a que é associada ao movimento de célula para célula do CMV é inibida na Arabidopsis thaliana na qual eIF4E ou eIF4G é destruído. Além disso, o vírus do mosqueado amarelo do arroz (RYMV) é um vírus pertencente ao gênero Sobemovirus. O arroz no qual eIF(iso)4G tem uma mutação é resistente ao RYMV (Literatura de Não Patente 14 e Literatura de Não Patente 15).
[00011] Quanto ao tomate, que é uma planta solanácea como o tabaco, uma relação entre resistência ao Potyvirus e um fator de iniciação de tradução eIF4E foi estudada com base em uma análise exaustiva de um painel de mutantes de tomate. No estudo, foi demonstrado que a supressão da função de eIF4E1, que é um membro da família de genes de eIF4E, confere resistência ao PVY e ao vírus do mosqueado do pimentão (PepMoV), mas não confere resistência ao vírus da causticação de tabaco (TEV) (Literatura de Não Patente 16). Também foi demonstrado que a supressão da função de eIF4E2, eIF(iso)4E, eIF4G, ou eIF(iso)4G não conferem resistência aos vírus pertencentes ao gênero Potyvirus. Também foi mostrado que a supressão simultânea das funções de eIF4E1 e eIF4E2 usando RNAi (RNA interferência) confere resistência a sete tipos de vírus pertencentes ao gênero Potyvirus, incluindo PVY, PepMoV e TEV. Entretanto, curiosamente, foi demonstrado que a supressão da função de eIF(iso)4E por RNAi não confere resistência a nenhum desses vírus (Literatura de Não Patente 17). Também foi mostrado que o eIF(iso)4E de tomate não está associado à resistência a vírus que não os vírus pertencentes ao gênero Potyvirus (Literatura de Não Patente 17).
[00012] Assim sendo, até agora foi apontada uma associação entre resistência ao PVY e eIF4E em qualquer planta, mas uma associação entre resistência ao PVY e eIF(iso)4E nunca foi relatada. Embora o eIF(iso)4E esteja classificado na família de eIF4E, a identidade entre sequências de DNA entre eIF4E e eIF(iso)4E nas plantas geralmente é menor que 60%. Além disso, eIF(iso)4E forma um complexo de tradução diferente daquele formado por eIF4E. Especificamente, eIF(iso)4E, junto com eIF(iso)4G, forma um complexo de tradução eIF(iso)4F, ao passo que eIF4E, junto com eIF4G, forma um complexo de tradução eIF4F.
[00013] No tocante ao tabaco (Nicotiana tabacum), a redução do nível de expressão de eIF4E1 ou eIF(iso)4E já foi relatada (Literatura de Não Patente 18). Neste trabalho, a transcrição de eIF4E1 ou eIF(iso)4E de tabaco é suprimida pelo uso de tecnologia antisense. A Literatura de Não Patente 18 descreve que a produção de tabaco no qual a quantidade de transcritos de eIF4E1 é suprimida para 30% a 40% em relação a um controle e de tabaco no qual a quantidade de transcritos de eIF(iso)4E é suprimida para 60% em relação a um controle e que em uma progênie híbrida entre ambos os tabacos acima, a quantidade de transcritos de eIF4E1 é reduzida para 26% em relação a um controle, e a quantidade de transcritos de eIF(iso)4E é reduzida para 31% em relação a um controle. No entanto, a Literatura de Não Patente 18 não des-creve de forma alguma uma associação com resistência viral. Além disso, a possibilidade de a proteína HC-Pro do PVY interagir com o eIF(iso)4E de tabaco foi sugerida a partir de um sistema de ensaio usado Nicotiana benthamiana (Literatura de Não Patente 19). No entanto, a Literatura de Não Patente 19 não apontou uma associação com resistência.
[00014] Além disso, no tocante ao tabaco, foi constatado a partir de uma análise completa de transcritos de tabaco VAM resistente ao PVY e transcritos de tabaco sensíveis ao PVY que o nível de transcritos do gene de eIF4E é especificamente baixo no tabaco VAM, e, na verdade, foi mostrado que tabaco com uma mutação nesse gene fica resistente ao PVY (Literatura de Não Patente 20).
[00015] Ao contrário, já foi relatado que não há qualquer associação entre a resistência do tabaco ao Potyvirus e as mutações nos fatores de iniciação de tradução eIF4E e eIF(iso)4E (Literatura de Não Patente 21). Este trabalho investigou sequências de bases de genes de eIF4E e eIF(iso)4E em variedades resistentes ao PVY e ao PepMoV, que são vírus pertencentes ao gênero Potyvirus e podem infectar o tabaco, e em variedades sensíveis a esses vírus. Como resultado, foi mostrado que uma associação entre mutações que ocorrem em ambos os genes e resistência e sensibilidade aos vírus não foi observada. Por exemplo, embora nenhuma mutação tenha sido detectada no gene de eIF4E e no gene de eIF(iso)4E de uma certa variedade resistente ao PVY, foram observadas mutações naqueles de uma variedade sensível ao PVY. Em experiências similares conduzidas em outras plantas no passado, foram detectadas mutações nos genes de eIF4E e de eIF(iso)4E de uma variedade resistente ao PVY, e a resistência ao PVY foi atribuída a essas mutações. Dessa forma, a Literatura de Não Patente 21 conclui que, no tabaco, ao contrário de outras plantas solanáceas, não existe qualquer associação entre a resistência ao PVY e os fatores de iniciação de tradução eIF4E e eIF(iso)4E. Como discutido acima, no tocante ao tabaco, ao contrário de outras plantas, a questão de uma associação entre resistência ao Potyvirus e os fatores de iniciação de tradução ainda é um caos.
[00016] Além disso, uma associação entre os fatores de iniciação de tradução e resistência aos vírus pertencentes ao gênero Umbravirus ainda não é conhecida em espécie de planta alguma, inclusive o tabaco.
[00017] Tabaco (Nicotiana tabacum), que é um anfidiploide, possui um número maior de genes que uma planta diploide normal. No tabaco, basicamente um par de genes derivados de Nicotiana sylvestris e um par de genes derivados de Nicotiana tomentosiformis estão presentes. Isto é, no tabaco, pelo menos dois pares de genes homólogos estão presentes. Portanto, o modo de herança do tabaco é mais complicado que aquele das plantas diploides. Na Arabidopsis thaliana, supõe-se que estejam presentes três tipos de eIF4E e um tipo de eIF(iso)4E (Literatura de Não Patente 12). No tabaco, os fatores de iniciação de tradução, que são observados no tabaco, são todos considerados presentes em pares. Foi descoberto que uma família de eIF4E de tabaco tem pelo menos 12 membros incluindo até mesmo uma proteína ligadora cap ("cap-binding protein") funcionalmente similar ao eIF4E (Literatura de Não Patente 20). Os membros da família de genes de fatores de iniciação de tradução de tabaco são muito maiores em número quando se inclui ainda o eIF4G e o eIF(iso)4G.
[00018] Literatura de Patente 1
[00019] Especificação da Patente US N° 7772462
[00020] Especificação da Publicação de Pedido de Patente N° 2013/117879
[00021] Publicação Internacional N° WO 2005/118850
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[00043] Embora tabaco com resistência à cepa PVY-Breaking seja conhecido, ele representa apensas um caso, como discutido anteriormente. Ademais, a persistência da resistência de tal tabaco é desconhecida. Portanto, a fim de evitar uma potencial vulnerabilidade genética, o desenvolvimento de outro novo tabaco nobre com resistência a vírus incluindo a cepa PVY representa uma necessidade urgente. Além disso, um gene envolvido na resistência ainda não foi identificado. Isto tem sido uma pedra no caminho para a criacão de um marcador preciso.
[00044] Adicionalmente, no tocante ao TBTV, foi feita uma exploração em busca de variedades resistentes ao TBTV através dos cultiva-res. No entanto, não foram encontradas variedades apresentando resistência TBTV. Depois disso, não se procedeu ao desenvolvimento de variedades resistentes ao TBTV.
[00045] A presente invenção foi alcançada tendo em vista os problemas acima, e constitui um objetivo principal da presente invenção oferecer tabaco com resistência a um vírus e um método para produzir o tabaco.
[00046] Um aspecto de um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção inclui uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[00047] Um outro aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é tal que o nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução é 20% ou menos, em relação ao tipo selvagem.
[00048] Um aspecto de um método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção inclui a introdução de uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, para produzir tabaco com resistência a um vírus.
[00049] Um outro aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção inclui a introdução de um fator que suprime o nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução para 20% ou menos em relação a um tipo selvagem, para produzir tabaco com resistência a um vírus.
[00050] Um aspecto de um polinucleotídeo para uso em detecção de acordo com a presente invenção é um polinucleotídeo para detecção de uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução de tabaco, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[00051] Um aspecto de um marcador de DNA para avaliar tabaco quanto à resistência a um vírus de acordo com a presente invenção inclui: um polinucleotídeo consistindo em uma sequência de bases contínuas que contém uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução ou uma sequência complementar à sequência de bases contínuas, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[00052] A presente invenção permitir oferecer tabaco com resistência a um vírus.
[00053] A Fig. 1 é um gráfico mostrando o resultado da análise de expressão do gene de eIF(iso)4E por PCR em tempo real (valores relativos a um valor de WT que é não recombinante) no Exemplo da presente invenção, onde as barras de erro representam desvios padrão.
[00054] A Fig. 2 é um diagrama ilustrando a estrutura gênica de um eIF(iso)4E tipo S (derivado de Nicotiana sylvestris) de tabaco (Nicotiana tabacum).
[00055] A Fig. 3 é um diagrama ilustrando a estrutura gênica de um eIF(iso)4E tipo T (derivado de Nicotiana tomentosiformis) de tabaco (Ni- cotiana tabacum).
[00056] A Fig. 4 é um diagrama mostrando o resultado de detecção mutante realizada usando-se um marcador de ASP no Exemplo da presente invenção.
[00057] A Fig. 5 é um diagrama mostrando o resultado de detecção mutante realizada usando-se um marcador de dCAPS no Exemplo da presente invenção.
[00058] Fig. 6 é um gráfico mostrando o resultado da análise de expressão do gene de eIF(iso)4E por PCR quantitativa (níveis de expressão em relação a um valor médio da quantidade de transcritos da linhagem SSTT) no Exemplo da presente invenção, onde as barras de erro representam desvios padrão.
[00059] Um aspecto da presente invenção refere-se a um tabaco com resistência a um vírus (um tabaco resistente a vírus) e mais especificamente a um tabaco resistente a vírus de modo que o nível de expressão (por exemplo, a quantidade de transcritos) de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é funcional em relação a um vírus é reduzido em uma célula. Além disso, um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir um tabaco com resistência a um vírus (um método para produzir um tabaco resistente a vírus) e mais especificamente a um método para produzir um tabaco resistente a vírus reduzindo o nível de expressão (por exemplo, a quantidade de transcritos) de um gene de eIF(iso)4E que é funcional em relação a um vírus em uma célula.
[00060] Nicotiana tabacum, que é um anfidiploide, tem tanto um ge- noma tipo S quanto um genoma tipo T derivado de Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis, respectivamente, cada um deles sendo uma espécie ancestral do mesmo. Portanto, N. tabacum possui dois pares de genes de eIF(iso)4E (alelos) com sequências de bases diferentes. Tanto gene de eIF(iso)4E do tipo S o quanto o gene de eIF(iso)4E do tipo T de N. tabacum, como indicado nas Figs. 2 e 3, respectivamente, possuem cinco éxons e quatro íntrons. Observe que, nas Figs. 2 e 3, os números mostrados na parte inferior das Figs. 2 e 3 indicam os números das posições nas quais mutações sem sentido (nonsense) em potencial ocorrem, e as setas indicam as posições dos iniciadores nos Exemplos. Um exemplo de uma sequência de cDNA de um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem tipo S está representado pela SEQ ID N°: 1 (número de acesso GenBank: AY699609). Na SEQ ID N°: 1, uma fase de leitura aberta vai da 70a até a 672a bases. Um exemplo de uma sequência de cDNA de um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem tipo T está representado pela SEQ ID N°: 2 (número de acesso GenBank: EB683576). Na SEQ ID N°: 2, uma fase de leitura aberta vai da 37a até a 624a bases. Além disso, um exemplo de uma sequência de aminoáci- dos de uma proteína de eIF(iso)4E do tipo selvagem tipo S está representado pela SEQ ID N°: 3. Um exemplo de uma sequência de amino- ácidos de uma proteína de eIF(iso)4E do tipo selvagem T está representado pela SEQ ID N°: 4. Além disso, um exemplo de uma sequência de mRNA (que contém "u" no lugar de "t" em uma sequência de cDNA) de um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem tipo S está representado pela SEQ ID N°: 5. Um exemplo de uma sequência de mRNA (que contém "u" no lugar de "t" em uma sequência de cDNA) de um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem tipo T está representado pela SEQ ID N°: 6. Além disso, um exemplo de uma sequência de bases de um genoma de um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem tipo S está representado pela SEQ ID N°: 7. Um exemplo de uma sequência de bases de um genoma de um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem tipo T está repre-sentado pela SEQ ID N°: 8. Na SEQ ID N°: 7, os éxons vão da 132a até a 397a bases (primeiro éxon), 1730a até a 1898a bases (segundo éxon), 2029a até a 2154a bases (terceiro éxon), 4723a até a 4785a bases (quarto éxon), e 4893a até a 5096a bases (quinto éxon). Na SEQ ID N°: 8, os éxons vão da 164a até até a 382a bases (primeiro éxon), 1620a até a 1788a bases (segundo éxon), 1919a até a 2044a bases (terceiro éxon), 3205a até a 3267a bases (quarto éxon), e 3373a até a 3593a bases (quinto éxon).
[00061] Em uma planta, sequências de bases das regiões codificadoras de proteína de com a mesma função podem apresentar uma diferença da ordem de 1% a vários por cento entre cultivares, dependendo do gene, e podem apresentar uma diferença da ordem de de vários por cento a 10% entre um cultivar e um parente selvagem. Um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem antes de sofrer mutação, neste contexto, abrange um gene que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 e um gene que codifica uma proteína de eIF(iso)4E consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4. Além disso, o gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem antes de sofrer mutação, neste contexto, abrange um gene que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais, preferivelmente 95% ou mais, mais preferivelmente 97% ou mais, ainda mais preferivelmente 99% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional. Adicionalmente, o gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem neste contexto abrange um gene que codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais, preferivelmente 95% ou mais, mais preferivelmente 97% ou mais, ainda mais preferivelmente 99% ou mais com a sequência de ami- noácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4. Além disso, o gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem neste contexto abrange um gene que (i) provoca a produção de mRNA com uma sequência de bases na qual 1 a 50 bases, 1 a 40 bases, 1 a 30 bases, 1 a 20 bases, 1 a 15 bases, 1 a 12 bases, 1 a 10 bases, 1 a 8 bases, 1 a 5 bases, 1 a 3 bases, 1 a 2 bases, ou uma base são substituídas, deletadas, inseridas, e/ou adicionadas à sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 e (ii) codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional. Além disso, o gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem neste contexto abrange um gene que codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional com uma sequência de aminoácidos na qual 1 a 20 aminoácidos, 1 a 15 aminoá- cidos, 1 a 12 aminoácidos, 1 a 10 aminoácidos, 1 a 8 aminoácidos, 1 a 5 aminoácidos, 1 a 4 aminoácidos, 1 a 3 aminoácidos, 1 a 2 aminoáci- dos, ou um aminoácido são substituídos, deletados, inseridos, e/ou adicionados à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4. A menos que especificado em contrário, qualquer faixa numérica expressa por "A a B" neste relatório significa "não menos que A e não mais que B".
[00062] Por exemplo, um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem do tipo T antes de sofrer mutação, neste contexto, abrange um gene cuja sequência de cDNA é idêntica à sequência à qual fora atribuído o número de acesso GenBank FN666434. Esta sequência, que é derivada de um gene de eIF(iso)4E do tipo T derivado da variedade de tabaco Samsun NN, tem uma identidade de sequência de 97% com a sequência de cDNA de EB683576 (SEQ ID N°: 2) de um eIF(iso)4E tipo T derivado da variedade de tabaco K326. As proteínas codificadas por estes dois genes têm uma uma identidade de sequência de aminoácidos (identity) de 97% e similaridade de sequência de aminoácidos (similaridade) de 99%.
[00063] Conforme usado neste relatório, a "identidade de sequência de bases" refere-se à percentagem de alinhamentos de bases que coincidem exatamente entre uma pluralidade de sequências de bases. A "identidade de sequência de aminoácidos" e-se à percentagem de alinhamentos de aminoácidos que coincidem exatamente entre uma pluralidade de sequências de aminoácidos. A similaridade de sequência de aminoácidos" refere-se à percentagem de alinhamentos de aminoácidos que coincidem exatamente ou têm propriedades similares entre uma pluralidade de sequências de aminoácidos. Exemplos de aminoácidos tendo propriedades similares estão listados a seguir. Por exemplo, ami- noácidos tendo um resíduo com cargas positivas são lisina, arginina, e histidina, aminoácidos tendo um resíduo com cargas negativas são ácido aspártico e ácido glutâmico, aminoácidos tendo um resíduo não polar residue, isto é, um resíduo hidrófobo são alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano, fenilalanina, e prolina, e aminoácidos polares sem carga são glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, aspa- ragina, e glutamina. A "identidade de sequência de bases", "identidade de sequência de aminoácidos, "similaridade de sequência de aminoácidos" podem ser calculadas usando-se, por exemplo, BLAST (Literatura: Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215:403-410.), que é um programa de análise de sequências (busca por homologia) comumente usado pelos especialistas na técnica, ou sando-se um software de análise de ácidos nucleicos e amino- ácidos comercialmente disponível. A busca por meio do BLAST pode ser feita em um website de, por exemplo, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) ou DNA Data Bank of Japan (http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html). com isso, vários parâmetros de busca podem ser alterados, mas valores de default são normalmente usados.
[00064] Conforme usado neste relatório, o "tabaco" abrange não apenas Nicotiana tabacum, mas também outras espécies do mesmo gênero Nicotiana. Exemplos de outras espécies do gênero Nicotiana incluem N. paniculata, N. knightiana, N. solanifolia, N. benavidesii, N. cor- difolia, N. raimondii, N. cutleri, N. rustica, N. tomentosa, N. tomentosifor- mis, N. otophora, N. kawakamii, N. setchellii, N. undulata, N. arentsii, N. wigandioides, N. glutinosa, N. thyrsiflora, N. obtusifolia, N. palmeri, N. langsdorffii, N. alata, N. forgetiana, N. bonariensis, N. longiflora, N. plum- baginifolia, N. azambujae, N. mutabilis, N. sylvestris, N. repanda, N. stocktonii, N. nesophila, N. nudicaulis, N. noctiflora, N. petunioides, N. acaulis, N. ameghinoi, N. glauca, N. paa, N. acuminata, N. pauciflora, N. attenuata, N. longibracteata, N. miersii, N. corymbosa, N. linearis, N. spegazzinii, N. quadrivalvis, N. clevelandii, N. benthamiana, N. umbra- tica, N. cavicola, N. debneyi, N. gossei, N. amplexicaulis, N. maritima, N. velutina, N. hesperis, N. occidentalis, N. simulans, N. megalosiphon, N. rotundifolia, N. excelsior, N. suaveolens, N. ingulba, N. exigua, N. go- odspeedii, N. rosulata, N. fragrans, N. africana, N. burbidgeae, N. hete- rantha, N. stenocarpa, N. truncata, e N. wuttkei. Além disso, o "tabaco" abrange, por exemplo, uma planta de tabaco inteira, tecidos de planta de tabaco (por exemplo, uma folha, um talo, uma flor, uma raiz, um órgão reprodutor, um embrião, e uma parte do mesmo), uma plântula de tabaco, uma semente de tabaco, uma folha de tabaco seca, um talo de tabaco seco, uma flor de tabaco seca, uma raiz de tabaco seca, e uma semente de tabaco seca.
[00065] Considera-se que as sequências de cDNA dos genes de eIF(iso)4E dessas plantas do gênero Nicotiana têm uma identidade de sequência de 90% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 1. De fato, a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 1 mostra uma identidade de sequência de 100% com uma sequência de cDNA de um gene de eIF(iso)4E de N. sylvestris (exceto para íntrons). A sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 2 mostra uma identidade de sequência de 99% com uma sequência de cDNA de eIF(iso)4E de N. tomentosiformis (exceto para íntrons). A sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 1 e a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 2 mostram identidades de sequência de 98% e 99%, respectivamente, com uma sequência de cDNA de eIF(iso)4E de N. otophora (exceto para íntrons). Além disso, todos os genes de eIF(iso)4Es de N. sylvestris, N. tomentosiformis, e N. otophora possuem éxons (cinco éxons) e íntrons (quatro íntrons) que são numericamente iguais aos éxons e íntrons do gene de N. tabacum.
[00066] A sequência de bases do gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem pode ser obtida usando-se, por exemplo, o programa BLAST para fazer uma busca de homologia usando a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 1 através dos genomas (Whole genome shotgun contigs) de N. sylvestris, N. tomentosiformis, ou N. otophora, que estão registrados no GenBank. Alternativamente, uma sequência de bases of an gene de eIF(iso)4E de uma espécie de planta derivada de uma planta pertencente ao gênero Nicotiana pode ser obtida por amplificação do gene de eIF(iso)4E a partir de um DNA genômico da espécie de planta por um método de PCR usando, por exemplo, uma sequência de iniciador representada pelas SEQ ID N°: 25 a SEQ ID N°: 36, e então determinação de uma sequência de bases dos produtos de PCR. A busca por homologia pode ser feita usando-se o programa BLAST ou pode ser feita usando-se um software de análise de ácidos nucleicos e aminoáci- dos comercialmente disponível.
[00067] Além disso, a partir de uma biblioteca genômica ou de uma biblioteca de cDNA da espécie selvagem de tabaco, é possível obter uma sequência de bases de um gene de eIF(iso)4E da espécie selvagem de tabaco realizando-se uma experiência de hibridização em condições rigorosas com o uso da sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2 como sonda.
[00068] Um vírus ao qual um tabaco resistente a vírus apresenta resistência não se limita a um vírus específico. Exemplos do vírus incluem vírus com os quais os tabacos podem ser infectados, tais como vírus pertencentes ao gênero Alfamovirus (por exemplo, vírus do mosaico da alfafa), vírus pertencentes ao gênero Curtovirus (por exemplo, vírus do topo enrolado da beterraba), vírus pertencentes ao gênero Begomovirus (por exemplo, vírus do topo enrolado das folhas de tabaco), vírus pertencentes ao gênero Cucumovirus (por exemplo, vírus do mosaico do pepino e vírus do atrofiamento do amendoim), vírus pertencentes ao gênero Ilarvirus (por exemplo, vírus da risca do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Potyvirus (por exemplo, vírus Y da batata (PVY), vírus da causticação do tabaco, vírus do mosqueado das nervuras de tabaco, e vírus do mosaico das nervuras do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Tobamovirus (por exemplo, vírus do mosaico do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Tobravirus (por exemplo, vírus chocalho do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Necrovirus (por exemplo, vírus da necrose do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Varicosavirus (por exemplo, vírus do atrofiamento do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Nepovirus (por exemplo, vírus da mancha em anel do tabaco), vírus per-tencentes ao gênero Umbravirus (por exemplo, vírus do topo espesso do tabaco e vírus do mosqueado do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Polerovirus (por exemplo, vírus da deformação das nervuras do tabaco), vírus pertencentes ao gênero Mastrevirus (por exemplo, vírus anão amarelo do tabaco), e vírus pertencentes ao gênero Tospovirus (por exemplo, vírus da murchidão com manchas do tomate). Um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ter resistência a uma espécie de vírus ou pode ter resistência a duas ou mais espécies de vírus. Um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ter resistência significativa aos vírus pertencentes ao gênero Potyvirus. Um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ter resistência aos vírus na cepa PVY-O, na cepa PVY- C, na cepa PVY-Z, e na cepa PVY-N (incluindo NTN e NW) do vírus Y da batata (PVY) nos vírus pertencentes ao gênero Potyvirus e particu-larmente à cepa PVY que quebra a resistência ao vírus do mutante Virgin A de tabaco (a cepa VAM-Breaking). Além disso, um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ter resistência significativa aos vírus pertencentes ao gênero Umbravirus e particularmente ao vírus do topo espesso do tabaco (TBTV).
[00069] Conforme usado neste relatório, "resistência a vírus" refere- se ao retardamento ou não ocorrência de um sintoma que ocorre no tabaco com infecção viral, em relação a uma variedade de tabaco suscetível. Exemplos do sintoma que ocorre no tabaco incluem atrofia da planta, necrose das nervuras, necrose do caule, distorção das nervuras, e mosqueado. Alternativamente, a "resistência a vírus" refere-se à supressão de reprodução/replicação de um vírus ou supressão do movimento célula para células de um vírus, em relação a uma variedade de tabaco suscetível.
[00070] Um aspecto de um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é um tabaco resistente a vírus que inclui uma mutação em um gene de eIF(iso)4E, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[00071] Conforme usado neste relatório, a "mutação" refere-se à mutação pontual, deleção, inserção, duplicação, translocação, e inversão no DNA. A menos que especificado em contrário, a "mutação" refere-se a uma diferença em relação à sequência de bases do tipo selvagem.
[00072] Conforme usado neste relatório, o "gene de eIF(iso)4E" abrange, em um genoma, não apenas uma região codificadora que codifica uma proteína de eIF(iso)4E, como também uma região não codificadora necessária para expressão da proteína de eIF(iso)4E, incluindo íntrons, regiões reguladoras, e outras sequências não transladadas.
[00073] A "proteína de eIF(iso)4E que é não funcional em relação a um vírus" refere-se a uma proteína de eIF(iso)4E que não pode ser usada para auto-reprodução ou para o movimento de célula para célula de um vírus (o uso dessa proteína de eIF(iso)4E é inibido pelo menos parcialmente), e abrange tanto uma proteína de eIF(iso)4E que não contém a função de uma proteína de eIF(iso)4E normal (como um fator de iniciação de tradução) no tabaco quanto a uma proteína de eIF(iso)4E que não contém a função de uma proteína de eIF(iso)4E normal no tabaco, mas não pode ser usada por um vírus. Como demonstrado nos Exemplos discutidos mais adiante, os inventores da presente invenção descobriram que, no tabaco, uma proteína de eIF(iso)4E de um tipo selvagem (uma planta sem mutação introduzida na mesma) provavelmente é usada para auto-reprodução ou para movimento de célula para célula de um vírus.
[00074] O "nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E" pode ser a quantidade de transcrição para um mRNA de eIF(iso)4E (o nível de transcrição ou a quantidade de transcritos) e/ou a quantidade de tradução para uma proteína de eIF(iso)4E (nível translacional ou a quantidade de produtos de tradução). Assim sendo, a expressão que diz "a expressão de eIF(iso)4E é suprimida" abrange um caso em que a transcrição é suprimida em relação ao tipo selvagem, um caso em que a tradução é suprimida em relação ao tipo selvagem, e um caso em que a transcrição e a tradução são suprimidas em relação ao tipo selvagem. Observe que a expressão que diz "a transcrição é suprimida" abrange um caso em que os transcritos são degradados.
[00075] Como descrito acima, considera-se que o N. tabacum tem um par de genes de eIF(iso)4E tipo S e um par de genes de eIF(iso)4E tipo T, que dá um total de quatro genes de eIF(iso)4E (dois genes de eIF(iso)4E tipo S e dois genes de eIF (iso) 4E tipo T). Em um exemplo, é preferível que um tabaco resistente a vírus tenha uma mutação pelo menos nos genes de eIF(iso)4E tipo S. Neste caso, o tabaco resistente a vírus tem resistência pelo menos aos vírus pertencentes ao gênero Umbravirus (por exemplo, TBTV). Em um outro exemplo, é preferível que um tabaco resistente a vírus tenha uma mutação pelo menos nos genes de eIF(iso)4E tipo T. Neste caso, o tabaco resistente a vírus tem resistência pelo menos aos vírus pertencentes ao gênero Potyvirus (por exemplo, the PVY-B strain). Em ainda um outro exemplo, é mais preferível que um tabaco resistente a vírus tenha uma mutação tanto nos genes de eIF(iso)4E tipo S quanto nos genes de eIF(iso)4E tipo T. Neste caso, o tabaco resistente a vírus tem resistência pelo menos aos vírus pertencentes ao gênero Umbravirus (por exemplo, TBTV) e aos vírus pertencentes ao gênero Potyvirus (por exemplo, a cepa PVY-B). Além disso, uma mutação em um tipo de genes de eIF(iso)4E pode ser uma mutação homozigótica (por exemplo, ambos os genes de eIF(iso)4E tipo S possueem mutações) ou pode ser uma mutação heterozigótica, mas preferivelmente é uma mutação homozigótica.
[00076] Portanto, um exemplo de um tabaco resistente a vírus (i) possui uma ou mais mutações em (a) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3, (b) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3, (c) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5, ou (d) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional, e (ii) tem resistência aos vírus pertencentes ao gênero Umbravirus. Um outro exemplo de um tabaco resistente a vírus (i) possui uma ou mais mutações em (a) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 4, (b) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 4, (c) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 6, ou (d) um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 6 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E funcional, e (ii) tem resistência aos vírus pertencentes ao gênero Potyvirus.
[00077] Além disso, um gene de eIF(iso)4E pode ter uma pluralidade de mutações. Adicionalmente, as mutações em uma pluralidade de genes de eIF(iso)4E podem ser as mesmas mutações ou podem ser mutações diferentes.
[00078] Presumindo que um de dois pares de genes de eIF(iso)4E originalmente perderam funcionalidade (devido à mutação espontânea), o outro par ainda tendo funcionalidade pode ter mutações. Além disso, presumindo que embora os dois genes de eIF(iso)4E em um dos dois pares de genes de eIF(iso)4E tenham perdido completamente a funcionalidade, um gene de eIF(iso)4E no outro par perdera a funcionalidade, mas o outro gene de eIF(iso)4E no outro par ainda tem a funcionalidade, isto é, três dos quatro genes de eIF(iso)4E perderam a funcionalidade, é possível desenvolver resistência a vírus contanto que o nível de expressão de eIF(iso)4E seja suficientemente baixo. No caso da espécie selvagem de tabaco (o gênero Nicotiana) tendo originalmente apenas um par de genes de eIF(iso)4E, as mutações ocorrem naquele um par de genes de eIF (iso) 4E.
[00079] Nos casos em que um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção tem uma mutação em uma região codificadora, uma mutação ocorre em uma sequência de aminoácidos de uma proteína de eIF(iso)4E. A mutação é, por exemplo, substituição, dele- ção, e inserção. Nos casos em que a mutação é substituição de um aminoácido, o aminoácido a ser substituído e o aminoácido substituído não se limitam a aminoácidos específicos, contanto que uma proteína de eIF(iso)4E seja transformada em não funcional em relação a um vírus. Por exemplo, tal substituição é preferivelmente uma substituição não conservativa. A substituição não conservativa é exemplificada pela substituição de um aminoácido por um outro aminoácido tendo uma carga diferente ou uma hidrofobicidade diferente (por exemplo, substituição de um aminoácido básico por um aminoácido ácido ou substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar) e substituição de um certo aminoácido por um outro aminoácido tendo um tamanho diferente de uma cadeia lateral. Além disso, nos casos em que a mutação ocorre na região codificadora, a mutação pode ser uma mutação frameshift ou uma mutação sem sentido (nonsense). Nos casos em que a mutação é uma mutação sem sentido (nonsense) (uma mutação que provoca uma alteração em um códon de interrupção), decaimento de mRNA mediado por sem sentido (nonsense) (Literatura: Brogna e Wen 2009, Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113) pode ocorrer, podendo, portanto, ocorrer degradação de um transcrito. Em vista disto, a posição da mutação sem sentido (nonsense) fica preferivelmente no Éxon 1, Éxon 2, e/ou Éxon 3, mais preferivelmente no Éxon 1 e/ou Éxon 2. Nos casos em que a mutação é uma mutação frameshift ou uma mutação sem sentido (nonsense), é preferível que a mutação esteja localizada em uma posição aproximadamente entre metade do comprimento de um gene e uma extremidade 5' do gene. Especificamente, é preferível que a mutação ocorra no Éxon 1, Éxon 2, e/ou Éxon 3. Quanto mais perto da extremidade 5' a mutação fica localizada, menor é uma parte normal de uma proteína resultante. Dessa forma, é mais provável que proteína passe a ser não funcional em relação a um vírus. Nos casos em que ocorrem mutações nas regiões codificadoras de todos os genes de eIF(iso)4E de tabaco (por exemplo, todos os quatro genes de eIF(iso)4E de N. tabacum), toda proteína de eIF(iso)4E que seja funcional em relação a um vírus não será absolutamente produzida.
[00080] Nos casos em que um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção tem uma mutação em uma região não codificadora, tal mutação afeta uma sequência de aminoácidos que codifica uma proteína de eIF(iso)4E mas pode alterar uma estrutura secundária do DNA ou mRNA, pode alterar um sítio de ligação para sistema de transcrição ou tradução, ou pode diminuir a eficiência de ligação ao tRNA. Por conseguinte, podem ocorrer uma redução no nível de transcrição e uma redução no nível de tradução.
[00081] Entretanto, nos casos em que um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção tem uma mutação em uma região não codificadora em uma extremidade 5’, tal mutação pode levar ao aparecimento de ATG (códon de iniciação) em uma fase que não seja uma fase correta. Isto pode provocar o início de uma tradução a partir de tal fase incorreta. Neste caso, uma proteína de eIF(iso)4E normal não é produzida. Por exemplo, nos casos em que o mutágeno é etil metano sulfonato (EMS) (descrito mais adiante), ocorre uma mutação de G para A em GTG ou uma mutação de C para T em ACG. Isto faz com que surja um outro ATG. Nos casos em que uma frameshift ocorre em tal situação, a tradução para uma proteína de eIF(iso)4E normal não acontece.
[00082] Nos casos em que a transcrição de um gene de eIF(iso)4E é suprimida, a quantidade de transcritos do gene de eIF(iso)4E é preferivelmente 20% ou menos, mais preferivelmente 15% ou menos, and ainda mais preferivelmente 10% ou menos, em relação ao tipo selvagem. Além disso, nos casos em que a tradução de um gene de eIF(iso)4E é suprimida, a quantidade de produtos de tradução do gene de eIF(iso)4E é preferivelmente 20% ou menos, mais preferivelmente 15% ou menos, e ainda mais preferivelmente 10% ou menos, em relação ao tipo selvagem.
[00083] Além disso, uma mutação em um gene de eIF(iso)4E pode provocar uma emenda anormal do RNA. Por exemplo, nos casos em que as mutações ocorrem em qualquer uma das bases GT em uma extremidade 5' de um íntron e 10 bases a montante e a jusante das bases GT, preferivelmente em qualquer uma das bases GT em uma extremidade 5’ de um íntron e 5 bases a montante e a jusante das bases GT, mais preferivelmente em qualquer uma das bases GT em uma extremidade 5’ de um íntron and one base a montante e a jusante das bases GT ou ocorrem em qualquer uma das bases AG em uma extremidade 3’ de um íntron e 10 bases a montante e a jusante das bases AG, preferivelmente em qualquer uma das bases AG em uma extremidade 3’ de um íntron e 5 bases a montante e a jusante das bases AG, mais preferivelmente em qualquer uma das bases AG em uma extremidade 3’ de um íntron e uma base a montante e a jusante das bases AG, a emenda do íntron não é completada com sucesso, resultando consequentemente um mRNA anormal. Isto pode produzir uma proteína de eIF(iso)4E que é não funcional em relação a um vírus ou suprimir a tradução do gene de eIF(iso)4E.
[00084] Um método para induzir uma mutação em um gene de eIF(iso)4E não se limita a um método específico e pode ser um método conhecido.
[00085] O mutágeno pode ser qualquer agente químico que induza uma mutação em um DNA genômico do tabaco. Exemplos de tal agente químico incluem, porém sem limitação, etil metano sulfonato (EMS), azida sódica, brometo de etídio, e ácido nitroso. Alternativamente, o mu- tágeno pode ser qualquer radiação ou similar que induza uma mutação em um DNA genômico do tabaco. Exemplos de tal radiação ou similar incluem, porém sem limitação, raios gama, feixes de íons pesados, raios X, feixes de nêutrons, e UV. O mutágeno é preferivelmente EMS.
[00086] Qualquer tipo de tecido ou órgão do tabaco pode ser tratado com o mutágeno, contanto que o corpo de uma planta possa ser regenerado a partir do mesmo. Exemplos de tais tecidos ou órgãos incluem, porém sem limitação, uma semente, uma raiz, uma folha, e uma flor. Uma semente é preferivelmente tratada com o mutágeno. Em relação à população de mutagênese, uma dosagem de um agente químico muta- gênico ou de uma radiação é empiricamente determinada para cada tipo de tecido vegetal para obter uma frequência de mutação menor que um nível limítrofe que leva à letalidade ou esterilidade reprodutiva.
[00087] Alternativamente, o mutágeno pode ser um transposon (elemento genético móvel). Um transposon pode ser transferido para o ge- noma do tabaco para suprimir a função de um gene de eIF(iso)4E. Um exemplo preferido de tal transposon é representado pelo retrotranspo- son tnt1 de tabaco. Alternativamente, também pode ser usado um transposon de outra planta sendo introduzido em tabaco. Exemplos de tal transposon incluem, porém sem limitação, transposons Ac/Ds, Spm/dSpm, e Mu de milho, transposon nDart de arroz, e transposon tam de boca-de-leão.
[00088] Ainda alternativamente, T-DNA no plasmídio Ti de Agrobacterium pode ser inserido no tabaco ao acaso para suprimir a função de um gene de eIF (iso) 4E. Portanto, a partir de uma população mutante de tabaco preparada (painel) com T-DNA inserido, um indivíduo no qual a função de eIF (iso) 4E é suprimida pode ser rastreado com o uso de uma sequência de bases de eIF(iso)4E como índice.
[00089] Em um exemplo de um método para produzir um tabaco resistente a vírus com mutações em dois pares de genes de eIF(iso)4E (quatro genes de eIF(iso)4E), o tabaco é tratado com um mutágeno, como discutido acima, para preparar uma população (painel) de mutan- tes de tabaco com mutações no genoma inteiro do tabaco, e DNAs ge- nômicos são extraídos. Usando-se iniciadores gene-específicos, genes de eIF(iso)4E são amplificados a partir dos DNAs genômicos do painel ou a partir daqueles reunidos. Subsequentemente, as sequências de bases dos produtos resultantes são determinadas, e uma linhagem com uma mutação homozigótica é então rastreada. Primeiro, uma linhagem com uma mutação homozigótica em um genoma tipo S e uma linhagem com uma mutação homozigótica em um genoma tipo T são obtidas e então cruzadas para obter indivíduos F1. Subsequentemente, uma pro- gênie autofecundada (F2) é cultivada a partir dos indivíduos F1. A partir da progênie autofecundada (F2) obtém-se uma linhagem com mutações homozigóticas tanto em um genoma tipo S quanto em um genoma tipo T (tal linhagem é obtida a uma probabilidade de 1/16 desde que dois elementos sejam recessivos). A linhagem com mutações no gene de eIF(iso)4E tanto no genoma tipo S quanto no genoma tipo T obtida dessa maneira é submetida a um ensaio de vírus para verificação da resistência. Com isso, análise da expressão de genes de eIF(iso)4E pode ser feita por uma PCR quantitativa ou similar para confirmar a quantidade reduzida de transcritos.
[00090] Portanto, um aspecto de um método para produzir um tabaco resistente a vírus pode incluir pelo menos uma das seguintes etapas: preparar uma população (painel) de mutantes de tabaco com mutações no genoma inteiro do tabaco; extrair DNAs genômicos; determinar sequências de bases de genes de eIF(iso)4E; rastrear uma linhagem com uma mutação homozigótica; e realizar um ensaio de vírus para verificação da resistência.
[00091] Além disso, com a finalidade de remover mutações em posições outras que não os genes de eIF(iso) 4E no DNA, uma linhagem que passara por tratamento para mutação pode ser cruzada em qualquer tempo dado com uma linhagem que não passara por tratamento para mutação.
[00092] A extração de DNA genômico de um mutante de tabaco pode ser feita por qualquer método conhecido e pode ser feita usando-se um kit de extração comercialmente disponível. Além disso, o DNA genômico pode ser um DNA grosseiramente purificado ou pode ser um DNA purificado obtido através de várias etapas de purificação.
[00093] A amplificação de um polinucleotídeo pode ser feita, por exemplo, por um método de PCR, mas também pode ser feita por qualquer outro método de amplificação de genes conhecido incluindo, por exemplo, um método de reação em cadeia da ligase (LCR), um método de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP).
[00094] Uma sequência de iniciador sequence para amplificar cada polinucleotídeo pode ser desenhada com base em, por exemplo, uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 7 ou uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 8. Primeiro, uma região tipo S- específica e uma região tipo T-específica são determinadas a partir do resultado de uma análise da homologia entre a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 7 (gene de eIF(iso)4E do tipo S) e a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 8 (gene de eIF(iso)4E do tipo T). Com os iniciadores desenhados para aquelas regiões, o gene tipo S e o gene tipo T podem ser independentemente amplificados especificamente a partir de um genoma de tabaco no qual um genoma tipo S e um genoma tipo T estão misturados. Um sítio alvo no qual cada um dos iniciadores está desenhado pode ser selecionado dentre a região tipo S-específica ou a região tipo T-específica, mas é preferivelmente um íntron, uma região não transladada 5', ou uma região não transladada 3'. O comprimento de cada iniciador varia preferivelmente de 15 bases a 30 bases e em particular preferivelmente de 17 bases a 25 bases. A sequência de iniciador pode ser desenhada com base em uma sequência da região específica para a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 7, uma sequência da região específica para a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 8, ou uma sequência de uma região que ambas as sequências de bases têm em comum. Contanto que o iniciador possa funcionar como um iniciador para amplificar uma sequência de número predeterminado de bases incluindo um sítio de mutação, a sequência do iniciador pode incluir uma ou mais substituições, deleções, e/ou adições. Além disso, o iniciador pode ser marcado com, por exemplo, uma substância fluorescente ou uma substância radioativa, se necessário.
[00095] O comprimento de cada polinucleotídeo a ser amplificado pode ser qualquer comprimento que possa ser usado por vários métodos de detecção (descritos mais adiante) e varia, por exemplo, de 20 bases a 5000 bases, mais preferivelmente 50 bases a 2000 bases, ainda mais preferivelmente 100 bases a 700 bases, ainda mais preferivelmente 100 bases a 500 bases.
[00096] A seguir encontram-se exemplos típicos não limitativos de um método de detecção de mutações:
[00097] (1) Um método para detectar a presença ou ausência de mutações por leitura direta da sequência de bases de cada polinucleotídeo por meio de, por exemplo, um sequenciador comercialmente disponível; e
[00098] (2) Um método para detectar a presença ou ausência de mu tações usando um método de polimorfismo de conformação de cordão único (SSCP).
[00099] Identificando sequências de bases dos produtos (PCR) que são amplificadas por iniciadores específicos para os genes de eIF(iso)4E de um mutante de tabaco no qual uma mutação fora detectada por qualquer um dos métodos acima, é possível determinar se a mutação é uma mutação homozigótica ou uma mutação heterozigótica ou se a mutação é uma mutação que ocorre no genoma tipo S ou uma mutação que ocorre no genoma tipo T.
[000100] Nos casos em que é feito o tratamento com EMS, a maioria das mutações que ocorrem no DNA são mutações de C para T e mutações de G para A. Portanto, os códons que podem transformar-se em códons de interrupção quando mutados pelo tratamento com EMS (isto é, códons potencias para mutação sem sentido (nonsense)) são os quatro tipos códons a seguir: CAA (C que aparece no 1O sítio é substituído por T), CGA (C que aparece no 1O sítio é substituído por T), TGG (G que aparece no 2O ou 3O sítio é substituído por A), e CAG (C que aparece no 1O sítio é substituído por T).
[000101] Por exemplo, no caso da SEQ ID N°: 7, uma alteração em um códon de terminação (TAA, TAG, or TGA) ocorre quando ocorre (1) substituição de C por T na posição 270, (2) substituição de G por A na posição 295, (3) substituição de G por A na posição 296, (4) substituição de G por A na posição 304, (5) substituição de G por A na posição 305, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de C por T na posição 330, (8) substituição de G por A na posição 343, (9) substituição de G por A na posição 344, (10) substituição de C por T na posição 357, (11) substituição de G por A na posição 394, (12) substituição de G por A na posição 395, (13) substituição de C por T na posição 1740, (14) substituição de G por A na posição 1813, (15) substituição de G por A na posição 1814, (16) substituição de G por A na posição 1846, (17) substituição de G por A na posição 1847, (18) substituição de G por A na posição 1888, (19) substituição de G por A na posição 1889, (20) substituição de C por T na posição 2050, (21) substituição de C por T na posição 2104, (22) substituição de G por A na posição 2123, (23) substituição de G por A na posição 2124, (24) substituição de C por T na posição 2152, (25) substituição de G por A na posição 4742, (26) substituição de G por A na posição 4743, ou (27) substituição de C por T na posição 4926. Assim sendo, um exemplo preferido de um tabaco resistente a vírus tem uma ou mais das mutações (1) a (27) acima em um gene de eIF(iso)4E consistindo em uma sequência de bases repre-sentada pela SEQ ID N°: 7 no DNA genômico. Entre essas mutações, é preferível que ocorra qualquer uma das mutações (1) a (26), e é ainda mais preferível que ocorra qualquer uma das mutações (1) a (24).
[000102] Por exemplo, no caso da SEQ ID N°: 8, uma alteração no códon de terminação (TAA, TAG, or TGA) ocorre quando ocorre (1) substituição de C por T na posição 264, (2) substituição de G por A na posição 289, (3) substituição de G por A na posição 290, (4) substituição de G por A na posição 298, (5) substituição de G por A na posição 299, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de G por A na posição 328, (8) substituição de G por A na posição 329, (9) substituição de C por T na posição 342, (10) substituição de G por A na posição 379, (11) substituição de G por A na posição 380, (12) substituição de C por T na posição 1630, (13) substituição de G por A na posição 1703, (14) substituição de G por A na posição 1704, (15) substituição de G por A na posição 1736, (16) substituição de G por A na posição 1737, (17) substituição de G por A na posição 1778, (18) substituição de G por A na posição 1779, (19) substituição de C por T na posição 1940, (20) substituição de C por T na posição 1994, (21) substituição de G por A na posição 2013, (22) substituição de G por A na posição 2014, (23) substituição de C por T na posição 2042, (24) substituição de G por A na posição 3224, (25) substituição de G por A na posição 3225, ou (26) substituição de C por T na posição 3406. Assim sendo, um exemplo preferido de um tabaco resistente a vírus tem uma ou mais das mutações (1) a (26) acima em um gene de eIF(iso)4E consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 8 no DNA genômico. Entre essas mutações, é preferível que ocorra qualquer uma das mutações (1) a (25), e é mais preferível que ocorra qualquer uma das mutações (1) a (23).
[000103] Alternativamente, a mutação pode ser uma mais das seguintes mutações (1) a (4): (1) C do códon CAA é substituído por T; (2) C do códon CGA é substituído por T; (3) C do códon CAG é substituído por T; e (4) G (seja um ou ambos Gs) do códon TGG é substituído por A, em (a) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4 ou (b) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional.
[000104] Como um outro meio para provocar uma mutação no gene de eIF(iso)4E, uma técnica de edição genética pode ser usada. A técnica de edição genética é uma técnica de introdução de uma mutação em qualquer região do genoma. Exemplos de tal técnica incluem TALEN (efetor pseudo-ativador de transcrição), CRISPR (repetições palindrô- micas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas)/CAS, ODM (mutagênese oligonucleotídeo-direcionada), e ZFN (nuclease dedo-de- zinco).
[000105] As definições de ODM e ZFN estão descritas em Lusser et al. (2012) Nature Biotechnology 30: 231-239. Quanto à ODM, sua aplicação a uma planta está descrita, por exemplo, em Zhu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8768-8773 e em Oh e May (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:169-172. Quanto à ZFN, sua aplicação a uma planta está descrita em Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: 5978-5990. De acordo com qualquer um dos métodos descritos nestas literaturas, é possível introduzir uma mutação no gene de eIF(iso)4E.
[000106] TALEN será explicado abaixo. Uma proteína ligadora de DNA derivada de um patógeno de planta, efetor pseudo-ativador de transcrição (TAL), tem uma porção estrutural na qual 34 aminoácidos são repetidos. Tais estruturas repetitivas reconhecem as bases de um DNA uma por uma Quatro tipos de bases (A, T, G, e C) estão presentes no DNA, e a especificidade de ligação de uma sequência de DNA é determinada por dois aminoácidos (13o e 14o aminoácidos) na estrutura repetitiva do efetor TAL. Isto é, selecionando-se os13o e 14o aminoáci- dos em cada uma das estruturas repetitivas, é possível ligar artificialmente o efetor TAL a uma região desejada de um DNA. Uma fusão do efetor TAL com a enzima FokI, que apresenta atividade de clivagem de DNA quando ela é um dímero, é chamada de TAL efetor nuclease (TALEN). Quando dois TALENs são desenhados para se ligarem bem próximos um ao outro, FokI forma um dímero para clivar um DNA que está presente entre os dois TALENs. Depois que a clivagem ocorre, o DNA é reparado. Durante o reparo, deleção ou adição pode ocorrer em certa medida em um sítio de clivagem. Foi constatado que TALENs funcionam em plantas (Literatura: Zhang et al. (2013) Plant Physiology 161: 20-27).
[000107] Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos eIF(iso)4E-es- pecífica de preferivelmente 15 bases a 25 bases, mais preferivelmente 18 bases a 22 bases, é desenhada na SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2, preferivelmente em uma região codificadora de proteína. Em seguida, uma outra sequência de nucleotídeos é desenhada de maneira similar em um lugar preferivelmente 9 bases a 15 bases de distância da sequência de nucleotídeos desenhada anteriormente. Uma porção flanqueada por esses dois nucleotídeos será supostamente cortada mais tarde.
[000108] Para determinar se as sequências de nucleotídeos assim desenhadas são específicas para o gene de eIF(iso)4E, não apenas a própria sequência como também a presença ou ausência de uma região com alta homologia incluindo aquela sequência podem ser determinadas fazendo-se, por exemplo, uma busca por homologia da sequência de nucleotídeos desenhada através de um banco de dados de sequências de tabaco (Nicotiana tabacum) conhecido, alternativamente Nicoti- ana sylvestris ou Nicotiana tomentosiformis. Exemplos dos bancos de dados de sequências usados incluem GenBank, EMBL (The European Molecular Biology Loboratory), e DDBJ (DNA Data Bank of Japan). Como algoritmo de análise de sequências, por exemplo, BLAST pode ser usado. Exemplos de tipos de sequências em bancos de dados in-cluem, porém sem limitação, Coleções de Nucleotídeos (nr/nt), Etiquetas de Seqüências Expressas (EST), Levantamento de Sequências do Genoma (GSS), e Whole genome shotgun contigs (WGS).
[000109] Com base na sequência de nucleotídeos específica desenhada, é desenhada uma sequência de genes de um TALE. Por exemplo, o kit GoldenGateTALEN (Addgene), que é um exemplo não limitativo, pode ser usado para ligar uma pluralidade de estruturas repetitivas. Ao se fundir o TALE e a FokI, por exemplo, é possível dispor uma sequência ligadora adequada. Observe que a sequência da FokI está incluída em um banco de dados conhecido. Um promotor para expressar um gene de fusão TALE/FokI em tabaco é preferivelmente um promotor que alcança alto nível de expressão. Exemplos de tal promotor incluem, porém sem limitação, promotores de expressão constitutiva tal como um promotor de um gene de RNA do vírus do mosaico da couve-flor 35S, um promotor de um gene da actina, e um promotor de um gene da ubi- quitina; promotores específicos para o tecido verde tal como um promotor de um gene da subunidade pequena Rubisco e um promotor de um gene de PPDK; e promotores específicos para os órgãos e promotores específicos para os estágios. Para aumentar o nível de expressão, um íntron desejado pode ser disposto entre o promotor e o TALE/FokI. Para aumentar ainda mais o nível de expressão, códons de TALE/FokI podem ser otimizados para serem códons de planta (tabaco). Os códons de planta estão listados, por exemplo, em um banco de dados conhecido tal como Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/).
[000110] Um vetor para introduzir um cassete de expressão de TALEN em uma planta pode ter incorporado não apenas o cassete mencionado acima, mas também um cassete de expressão de um gene de resistência a drogas (marcador de seleção) para selecionar uma célula vegetal na qual o cassete de expressão de TALEN será introduzido. O gene de resistência a drogas é qualquer gene de resistência a drogas para uma droga capaz de selecionar células de tabaco, e exemplos do mesmo incluem, porém sem limitação, um gene de resistência à canamicina (neomicina fosfotransferase: NPT-II) e um gene de resistência à higro- micina (higromicina fosfotransferase: HPT). Além disso, o promotor não se limita a um promotor específico, contanto que ele permita expressão constitutiva.
[000111] Além disso, nos casos em que Agrobacterium é usada para a introdução estável do cassete de expressão de TALEN em uma planta, o cassete de expressão de TALEN e o cassete de expressão do marcador de seleção precisam estar presentes no T-DNA. Neste caso, uma sequência de margem direita (RB) e uma sequência de margem esquerda (LB), como sequências de fronteira do T-DNA, estão dispostas em ambas as extremidades do T-DNA.
[000112] Exemplos de um vetor para introdução do cassete de expressão TALEN em uma planta, o vetor permitindo que um gene seja introduzido em tabaco, incluem, porém sem limitação, um vetor pBI e um vetor pSB (Literatura: Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 1541.), um vetor pLC (Literatura: Relatório Descritivo da Patente US N° 8298819), e um vetor pGreen vector (Literatura: Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.).
[000113] Um método para introdução do cassete de expressão TALEN em uma planta não se limita a um método específico, e pode ser um método comumente empregado pelos especialistas na técnica, tal como o método mencionado acima que utiliza Agrobacterium, um método que utiliza uma pistola de partículas, um método de PEG, um método de eletroporação, e um método de agroinfiltração. O tecido ou órgão de tabaco a sofrer a introdução não se limita a um tipo específico de tecido ou órgão, contanto que a regeneração de um corpo da planta seja obtida. Exemplos de tal tecido ou órgão incluem uma semente, uma raiz, uma folha, e uma flor.
[000114] A seleção e o cultivo de uma planta transformada podem ser facilmente feitos pelos especialistas na técnica. Exemplos de uma droga usada para a seleção incluem, porém sem limitação, canamcina e hi- gromicina. A concentração da droga varia, por exemplo, de 20 mg/mL a 200 mg/mL, preferivelmente 50 mg/mL a 100 mg/mL. Um meio para o cultivo de uma cultura de planta pode ser um meio comumente usado. Exemplos de um tipo de sal inorgânico incluem MS e LS. Ao sal inorgânico adiciona-se, por exemplo, sacrose, ágar, ou hormônio de planta. A concentração de tal substância pode ser determinada de acordo com um protocolo comumente usado pelos especialistas na técnica.
[000115] Como um tecido ou órgão a sofrer introdução de genes, não apenas os tecidos ou órgãos listados acima, mas também um proto- plasto pode ser usado. O protoplasto pode ser preparado por um método usual usando uma enzima degradadora da parede celular. Além disso, como um método de introdução de genes, não apenas o método de transformação estável mencionado acima, como também um método transitório podem ser empregados. O ensaio transitório pode ser realizado usando-se um método de eletroporação, um método de PEG, ou outro método usual. Um outro método de ensaio transitório é exemplificado por, por exemplo, agroinfiltração e um vetor viral. Exemplos do vetor viral incluem, porém sem limitação, ALSV (vírus esférico latente da maçã) e TRV (vírus chocalho do tabaco).
[000116] Se o gene de eIF(iso)4E é mutado em um indivíduo, ou em um tecido ou órgão, que fora regenerado a partir de uma célula trans- gênica pode ser confirmado desenhando-se iniciadores que flanqueiam uma região alvo, extraíndo-se DNA de um tecido vegetal desejado, e amplificando-se aquela região por PCR ou método similar, e então examinando-se uma sequência de bases de um produto de PCR.
[000117] Um método de análise da expressão gênica não se limita a um método específico, e pode ser qualquer um dos métodos conhecidos incluindo, por exemplo, um método de hibridização do norte ("northern hybridization method") e um método de PCR quantitativa. A sonda usada na hibridização pode ser desenhada de forma a ter uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 1 ou uma parte dessa sequência de bases (por exemplo, SEQ ID N°: 9), de forma a ter uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 2 ou uma parte dessa sequência de bases, ou de forma a ter uma sequência de bases na qual uma ou mais bases são substituídas, deletadas, ou inseridas em qualquer uma dessas sequências de bases. O comprimento da sonda pode variar, por exemplo, de 20 bases até o comprimento total da sequência.
[000118] Extração de RNA para uso na análise de expressão é efetuada por um método conhecido incluindo, por exemplo, um método que usa cloridrato de guanidina e um método de SDS-fenol, e pode ser efetuada usando-se um kit comercialmente disponível. RNA total pode ser purificado para obtenção de mRNA (poliA + RNA).
[000119] A síntese de cDNA para uso na realização da PCR quantitativa pode ser feita por método conhecido usando transcriptase reversa e um iniciador de oligo dT ou um iniciador gene-específico, e pode ser feita por meio de um kit comercialmente disponível.
[000120] Além disso, um iniciador para PCR quantitativa pode ser desenhado com base na SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2. O comprimento do iniciador varia preferivelmente de 15 bases a 30 bases, particularmente preferivelmente 17 bases a 25 bases. O comprimento de uma sequência alvo a ser amplificada por um conjunto de iniciadores não se limita a um comprimento específico, e pode variar, por exemplo, de 40 bases até o comprimento total da sequência, preferivelmente 50 bases a 500 bases.
[000121] Para realização de PCR quantitativa usando um aparelho de PCR fluorescente, não apenas sequências dos iniciadores, como também uma sequência da sonda são dispostas em uma sequência alvo. O comprimento da sequência alvo varia preferivelmente de 40 bases a 200 bases, mais preferivelmente 50 bases a 150 bases. Um corante repórter para marcar os iniciadores e a sonda é exemplificado por FAM, HEX, TET, e cianina 5, e um corante extintor é exemplificado por, por exemplo, TAMRA e BHQ1. O corante repórter e o corante extintor não se limitam a esses corantes, e podem ser selecionados e combinados da maneira apropriada pelos especialistas na técnica. Um gene usado como padrão interno para PCR quantitativa pode ser um gene de expressão constitutiva. Um gene padrão interno preferível é exemplificado por, por exemplo, um gene do fator de alongamento e um gene da ac- tina.
[000122] CRISPR/CAS será explicado abaixo. O sistema CRISPR/CAS, que é um técnica de edição de genees usando (i) um RNA guia que reconhece uma sequência de DNA e (ii) CAS nuclease, sabidamente funciona em uma planta (Literatura: Belhaj et al. (2013) Plant Methods 9:39). Esta técnica, que é uma técnica para cortar um DNA tendo uma sequência desejada no genoma, depende, no que diz respeito à deleção, adição, e inserção em uma sequência genômica alvo, de erros cometidos por um sistema de reparo de DNA de um hospedeiro, como é o caso com TALEN.
[000123] Um promotor para expressar CAS9 em uma planta é preferivelmente um promotor que alcança um alto nível de expressão. Exemplos de tal promotor incluem, porém sem limitação, um promotor de um gene de RNA de 35S, um promotor de um gene da ubiquitina, e um promotor de um gene de PPDK, que foram listados mais acima. Para aumentar o nível de expressão, um íntron desejado pode ser disposto entre o promotor e CAS9. Observe que a sequência de bases de CAS9 é conhecida. Para aumentar ainda mais o nível de expressão, códons de CAS9 podem ser otimizados para serem códons de planta (tabaco). Além disso, um sinal de localização nuclear (NLS) pode ser adicionado ao CAS9.
[000124] Uma sequência genômica desejada e um RNA guia complementar são desenhados. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos eIF(iso)4E-específica de preferivelmente 19 bases a 22 bases é determinada na SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2, preferivelmente em uma região codificadora de proteína. Neste caso, em uma extremidade 3' daquela sequência, uma sequência NGG denominada motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) precisa estar presente. Além disso, nos casos em que o tipo do promotor descrito posteriormente é U6, o ponto de iniação de transcrição (extremidade 5’ de um RNA guia) precisa ser G. Nos casos em que o tipo do promotor é U3, o ponto de iniação de transcrição precisa ser A.
[000125] Para determinar se a sequência do RNA guia é específica para o gene de eIF(iso)4E, não apenas uma sequência mas também a presença ou ausência de uma região tendo alta homologia incluindo aquela sequência podem ser determinadas efetuando-se, por exemplo, uma busca por homologia da sequência desenhada através dos bancos de dados de sequências de tabaco (Nicotiana tabacum), alternativamente Nicotiana sylvestris ou Nicotiana tomentosiformis. Os bancos de dados de sequências e o algoritmo para análise de sequências são similares àqueles discutidos mais acima.
[000126] Depois que o RNA guia é desenhado, uma sequência de cadafalso de sgRNA é fundida a uma extremidade 3' do RNA guia para obter um sgRNA ((g)RNA guia + cadafalso de gRNA), e uma construção para expressão do sgRNA é então produzida. Nessa ocasião, um promotor incluindo, por exemplo, U6 e U3 da RNA polimerase III podem ser usados como promotor. A construção completada com o uso de um vetor adequado é introduzida no tabaco, um recombinante é selecionado, e a regeneração é então realizada. Para garantir ainda a ocorrência de uma mutação, uma pluralidade de RNAs guias podem ser desenhados no eIF(iso)4E, e as construções para expressão dos respectivos RNAs guias podem ser introduzidas no tabaco simultaneamente. Neste caso, uma pluralidade de cassestes de expressão de RNA guia e um cassete de expressão de CAS9 podem ser dispostos em um T-DNA simultaneamente.
[000127] Observe que o vetor para introdução, em uma planta, de um cassete que permite a expressão de um RNA guia e CAS9 e o método de transformação de tabaco são similares àqueles explicados mais acima para TALEN.
[000128] Como o tecido ou órgão a sofrer introdução de genes, não apenas os tecidos ou órgãos listados acima, mas também um proto- plasto pode ser usado. O protoplasto pode ser preparado por um método usual usando uma enzima degradadora da parede celular. Além disso, como um método de introdução de genes, não apenas o método de transformação estável mencionado acima, como também um método transitório podem ser empregados. O ensaio transitório é similar àquele explicado mais acima para TALEN.
[000129] Se o gene de eIF(iso)4E é mutado em um indivíduo, ou em um tecido ou órgão, que fora regenerado a partir de uma célula trans- gênica pode ser confirmado por um método similar àquele explicado mais acima para TALEN.
[000130] Exemplos de um método de ensaio de vírus incluem, porém sem limitação, um método de inoculação mecânica usando uma combinação de uma solução de vírus e um pó sólido tal como carborundum e um método de inoculação usando um afídeo infectado com um vírus. O vírus usado não se limita a um vírus específico, e pode ser qualquer um dos vírus listados acima como o vírus ao qual um tabaco resistente a vírus apresenta resistência.
[000131] Um outro aspecto de um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é um tabaco resistente a vírus no qual o nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E é 20% ou menos, em relação ao tipo selvagem. O nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E no tabaco em que a expressão de eIF(iso)4E é suprimida é preferivelmente 15% ou menos e mais preferivelmente 10% ou menos, em um caso em que o nível de expressão no tipo selvagem é 100%. Aqui, o "tipo selvagem" refere-se a um tabaco no qual um fator que suprime a expressão de um gene de eIF(iso)4E não foram introduzido e no qual o gene de eIF(iso)4E não é mutado.
[000132] Para a produção de tal um tabaco resistente a vírus, qualquer um dos métodos conhecidos na literatura pode ser empregado, incluindo, por exemplo, um método usando antisense, um método usando cossupressão, um método usando RNA interferência (RNAi), um método usando microRNA, um método usando VIGS, um método usando ribozimas, um método usando recombinação homóloga, e um método usando expressão de produtos gênicos negativos dominantes. Especificamente, é possível produzir o tabaco resistente a vírus pela introdução de um fator que suprime o nível de expressão do gene de eIF(iso)4E a 20% ou menos, preferivelmente 15% ou menos, mais preferivelmente 10% ou menos em comparação com o tipo selvagem.
[000133] Um método para suprimir a expressão de eIF(iso)4E é pre-ferivelmente RNAi. Especificamente, uma construção de RNAi é preparada usando-se, como gatilho, uma sequência de bases do gene de eIF(iso)4E (por exemplo, SEQ ID N°: 1) ou uma parte daquela sequência de bases (por exemplo, SEQ ID N°: 9) ou uma sequência de bases representada, por exemplo, pela SEQ ID N°: 2 ou uma parte daquela sequência de bases. A construção de RNAi preparada desta maneira é fundida com um que promotor provoca expressão em uma planta, e uma fusão obtida desta maneira é introduzida no tabaco usando-se um vetor. Por conseguinte, é obtido um tabaco resistente a vírus no qual a construção de RNAi é expressa para suprimir a expressão do gene de eIF(iso)4E. Por conseguinte, um tabaco resistente a vírus de acordo com um aspecto pode conservar a construção de RNAi para supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E.
[000134] O comprimento do gatilho pode variar, por exemplo, de 21 bases ao comprimento total da sequência, preferivelmente 50 bases ou mais, mais preferivelmente 100 bases ou mais. Uma sequência de gatilho pode ser tal que uma ou mais bases são substituídas, deletadas, ou inseridas.
[000135] No RNAi, é preparada uma construção de RNAi de modo que uma porção da sequência de gatilho se estendendo na direção sense e a outra porção da sequência de gatilho se estendendo na direção na antisense são funcionalmente ligadas para que a sequência de gati- lhoseja uma sequência de repetição invertida. Na preparação da construção de RNAi, uma sequência espaçadora é preferivelmente fornecida entre os dois gatilhos. Tal sequência espaçadora é preferivelmente uma sequência que não está contida no genoma do tabaco ou em uma região, tal como uma sequência de íntrons, que não está contida no mRNA maduro. Exemplos de tal sequência incluem, porém sem limitação, sequências de íntrons do gene da β-glucuronidase (GUS), gene da piruvato desydrogenase quinase (pdk), e gene da catalase (cat).
[000136] Exemplos de um promotor para causar transcrição da construção de RNAi em uma planta incluem, porém sem limitação, promotores de expressão constitutiva tal como um promotor de um gene de RNA do vírus do mosaico da couve-flor 35S, um promotor de um gene de actina, e um promotor de um gene de ubiquitina; promotores específicos para tecido verde tais como um promotor de um gene da pequena su- bunidade Rubisco e um promotor de um gene de PPDK; promotores específicos para órgão e promotores específicos para estágio. O promotor é preferivelmente um promotor que causa expressão em um tecido infectado com um vírus.
[000137] Um terminador pode ser qualquer terminador que funciona em uma planta. Exemplos do terminador incluem, porém sem limitação, um terminador de um gene de RNA do vírus do mosaico da couve-flor 35S, um terminador de um gene de RNA do vírus do mosaico da couve- flor 19S, e um terminador de um gene de nopalina sintetase.
[000138] Um vetor para introdução de um cassete de expressão de RNAi em uma planta pode ter incorporado não só o cassete mencionado acima, mas também um cassete de expressão de um gene de resistência a drogas para seleção de uma célula da planta na qual o cassete de expressão de RNAi será introduzido. O gene de resistência a drogas é qualquer gene de resistência a drogas para uma droga capaz de selecionar células de tabaco, e exemplos do mesmo incluem, porém sem limitação, um gene de resistência à canamicina (neomicina fosfotransfe- rase: NPT-II) e um gene de resistência à higromicina (higromicina fos- fotransferase: HPT). Além disso, o promotor não se limita a um promotor específico, contanto que ele permita expressão constitutiva.
[000139] Além disso, nos casos em que Agrobacterium é usado para introdução do cassete de expressão de RNAi em uma planta, o cassete de expressão de RNAi e o cassete de expressão de marcador de seleção precisam estar presentes no T-DNA. Neste caso, uma sequência de margem direita (RB) e uma sequência de margem (LB), como sequências de fronteira do T-DNA, encontram-se respectivamente dispostas em ambas as extremidades do T-DNA.
[000140] Além disso, para prever visualmente a expressão gênica, um cassete de expressão de uma proteína fluorescente pode ser disposto no T-DNA. Exemplos da proteína fluorescente incluem, porém sem limitação, proteína fluorescente verde (GFP) e proteína fluorescente amarela (YFP). A proteína fluorescente é preferivelmente GFP. A fluorescência pode ser obtservada por um analisador de imagem.
[000141] Exemplos de um vetor para introduzir o cassete de expressão de RNAi em uma planta, o vetor possibilitando que um gene seja introduzido no tabaco incluem, porém sem limitação, vetores pBI e vetores pSB (Literatura: Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 1541.), vetores pLC (Literatura: Relatório Descritivo da Patente US N° 8298819), um vetor pGreen (Literatura: Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.), um vetor pHellsgate (Literatura: Wesley et al. 2001 Plant J 27: 581-590.), e um vetor pSP231 (Literatura: Publicação internacional N° WO 2011/102394).
[000142] Um método para introduzir o cassete de expressão de RNAi em uma planta não se limita a um método específico, e pode ser um método comumente empregado pelos especialistas na técnica, tais como o método mencionado acima que usa Agrobacterium, um método que usa uma pistola de partículas, um método de PEG, um método de eletroporação, e um método de agroinfiltração. Um tecido ou órgão de tabaco a ser submetido à introdução não se limita a um tipo específico de tecido ou órgão, contanto que seja conseguida a regeneração de um corpo da planta. Exemplos de tal tecido ou órgão incluem uma semente, uma raiz, uma folha, e uma flor.
[000143] A seleção e o cultivo de uma planta transformada podem ser facilmente realizados pelos especialistas na técnica. Exemplos de uma droga usada para a seleção incluem, porém sem limitação, canamicina e higromicina. A concentração da droga varia, por exemplo, de 20 mg/mL a 200 mg/mL, preferivelmente 50 mg/mL a 100 mg/mL. Um meio para o cultivo de uma planta de cultura pode ser um meio comumente usado. Exemplos de um tipo de sal inorgânico incluem MS e LS. Ao sal inorgânico, por exemplo, sacarose, ágar, ou hormônio de planta é adicionado. A concentração de tal substância pode ser determinada de acordo com um protocolo comumente usado pelos especialistas na técnica.
[000144] Um método para analisar a expressão gênica e um método para ensaio de vírus estão discutidos mais acima.
[000145] A presente invenção também oferece um método para conferir resistência a vírus ao tabaco.
[000146] Um aspecto do método confere resistência a vírus ao tabaco pela introdução de uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional para um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução. Um método para introdução de tal mutação está discutido em [1. Tabaco resistente a vírus e método para produzir o tabaco resistente a vírus].
[000147] Um outro aspecto do método confere resistência a vírus ao tabaco pela introdução de um fator que suprime o nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução para 20% ou menos, preferivelmente 15% ou menos, mais preferivelmente 10% ou menos, em relação ao tipo selvagem. Um método introdução de tal fator está discutido em [1. Tabaco resistente a vírus e método para produzir o tabaco resistente a vírus].
[000148] De acordo com a presente invenção é possível desenvolver um narcador de DNA usando-se a mutação que ocorre em um gene de eIF (iso) 4E de tabaco, e o marcador de DNA pode ser utilizado para a criação do marcador. O "marcador de DNA" refere-se a uma diferença na sequência de bases do DNA (mutação ou polimorfismo) entre variedades ou indivíduos ou a uma ferramenta para detectar a diferença, e também se refere a uma diferença na na sequência de bases do DNA (mutação ou polimorfismo) que serve como um marcador para distinguir variedades ou indivíduos uns dos outros ou a uma ferramenta para detectar a diferença. Nos casos em que uma mutação em um gene de eIF(iso)4E é determinada, e é confirmado que a mutação deixa o tabaco resistente a um vírus, um mutante de tabaco com aquela mutação pode ser usado para criar uma planta matriz com aquela resistência a vírus. Além disso, uma vez que a mutação responsável pela resistência já tenha sido encontrada, é possível desenhar, em um gene de eIF(iso)4E, um marcador que possa ser usado para identificar a mutação responsável pela resistência. Como uma relação entre aquela mutação e a resistência a vírus nunca será rompida por segregação genética, é possível fazer uma criação precisa de marcadores. A detecção da presença ou ausência dessa mutação elimina a necessidade de confirmar a resistência a vírus depois de cada iteração de hibridização ou criação similar.
[000149] Extração de DNA genômica do tabaco pode ser feita por um método usual, e pode ser efetuada usando-se um kit de extração comercialmente disponível, que é um exemplo não limitativo. Além disso, o DNA genômica pode ser um DNA grosseiramente purificado ou pode ser um DNA purificado obtido através de várias etapas de purificação. A presença ou ausência de uma mutação pode ser detectada por qualquer técnica que permita a detecção da presença ou ausência de uma mutação. Exemplos de tal técnica incluem RFLP, um técnica em que se aplica hibridização de ácido nucleico (também chamado de "polinucleo- tídeo") usando um DNA de cordão simples como uma sonda, e uma técnica como PCR etc., envolvendo amplificação de um polinucleotídeo.
[000150] A amplificação de um polinucleotídeo pode ser feita, por exemplo, por um método de PCR, mas pode ser feita por qualquer um dos outros métodos de amplificação gênica conhecidos incluindo, por exemplo, um método de LCR, um método de amplificação por deslocamento de cordão (SDA), e um método de LAMP. O comprimento de cada polinucleotídeo pode ser amplificado para ter qualquer comprimento que possa ser usado por vários métodos de detecção (descritos mais adiante) e varia, por exemplo, preferivelmente de 40 bases a 5000 bases, mais preferivelmente 100 bases a 1000 bases, ainda mais preferivelmente 100 bases a 700 bases, mais preferivelmente ainda 100 bases a 500 bases.
[000151] Uma sequência de iniciador para amplificar cada polinucleo- tídeo é preferivelmente desenhada de forma a flanquer ou conter um sítio de mutação. No entanto, a posição na qual a sequência de iniciador é desenhada não se limita a uma posição específica. O comprimento de vada iniciador varia preferivelmente de 15 bases a 30 bases e em particular preferivelmente 17 bases a 25 bases. Contanto que o iniciador possa funcionar como um iniciador para amplificar uma sequência de um número predeterminado de bases incluindo um sítio de mutação, a sequência do iniciador pode incluir uma ou mais substituições, deleções, e/ou adições. Além disso, o iniciador pode ser marcado com, por exemplo, uma substância fluorescente ou uma substância radioativa, se necessário.
[000152] A mutação a ser detectada é uma mutação que provoca a produção de uma proteína de eIF(iso)4E que é não funcional em relação a um vírus ou uma mutação que suprime a expressão de um gene de eIF (iso) 4E. Exemplos específicos da mutação estão discutidos em [1. Tabaco resistente a vírus e método para produzir o tabaco resistente a vírus].
[000153] A seguir encontram-se exemplos típicos não limitativos de um método de detecção de mutações: (1) Um método para detectar a presença ou ausência de mutações por leitura direta da sequência de bases de um polinucleotídeo amplificado por meio de, por exemplo, um sequenciador comercialmente disponível; (2) Um método para detectar a presença ou ausência de mutações usando um método de polimorfismo de conformação de cordão único (SSCP); e (3) Um método para processamento de um polinucleotídeo amplificado com uma enzima de restrição que reconhece especificamente uma sequência de um sítio de mutação (uma sequência antes ou depois de ocorrer uma mutação), e em seguida determinar a presença ou ausência de clivagem (método da sequência polimórfica amplificada clivada (CAPS)). Como outro método, pode ser empregado um método de CAPS derivado (dCAPS) usando um conjunto de iniciadores contendo um iniciador de incompatibilidade desenhado propositalmente para produzir um sítio de reconhecimento de enzima de restrição. Exemplos de tal conjunto de iniciadores incluem, porém sem limitação, um conjunto dos seguintes ácidos nucleicos: como iniciadores para detectar uma mutação de C para T na 330a base da sequência de bases de um gene de eIF(iso)4E do tipo S representada pela SEQ ID N°: 7, um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 45; e um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 46. O uso de um iniciador de incompatibilidade, como a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 46, pode piorar a eficiência de amplificação. Nesse caso, a mutação pode ser detectada da seguinte maneira. Isto é, PCR é realizada uma vez com iniciadores sem incompatibilidades (no caso acima, por exemplo, um conjunto de iniciadores de ácido nucleico consistindo em sequências de bases representadas pelas SEQ ID N°: 25 e SEQ ID N°: 26, respectivamente) desenhadas nos sítios fora da sequência alvo. Subsequentemente, uma outra PCR é realizada para reamplificação, usando um iniciador de incompabilidade e uma parte dos produtos de PCR, que servem de modelo, e os produtos de PCR obtidos desta maneira são então processados com uma enzima de restrição.
[000154] Exemplos do conjunto de iniciadores contendo um iniciador de incompatibilidade incluem, porém sem limitação, um conjunto dos seguintes ácidos nucleicos: como iniciadores para detectar uma mutação de G para A na 299a base da sequência de bases de um gene de eIF(iso)4E do tipo T representada pela SEQ ID N°: 8, um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 47; e um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 48. O uso de um iniciador de incompatibilidade, como a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 48, pode piorar a eficiência de amplificação. Nesse caso, a mutação pode ser detectada da seguinte maneira. Isto é, PCR é realizada uma vez com iniciadores sem incompatibilidades (no caso acima, por exemplo, um conjunto de iniciadores de ácido nucleico consistindo em sequências de bases representadas pelas SEQ ID N°: 31 e SEQ ID N°: 32, respectivamente) desenhadas nos sítios fora da sequência alvo. Subsequente-mente, uma outra PCR é realizada para reamplificação, usando um iniciador de incompabilidade e uma parte dos produtos de PCR, que servem de modelo, e os produtos de PCR obtidos desta maneira são então processados com uma enzima de restrição.
[000155] Observe que nos casos em que é detectada uma mutação que não as mutações exemplificadas acima, os especialistas na técnica podem desenhar uma sequência de iniciador, realizar uma PCR, e detectar uma mutação pretendida, sem muito esforço. Por exemplo, a sequência de iniciador pode ser desenhada via uma teia ("web") (Literatura: Neff et al. (2002) Web-based initiator design for single nucleotide polymorphism analysis. TRENDS in Genetics 18: 613-615).
[000156] Observe que nos casos em que uma DNA polimerase com atividade corretora é usada para a realização de uma PCR com iniciadores contendo uma incompatibilidade perto de uma extremidade 3' de um dos iniciadores, a incompatibilidade é corrigida, e pode ocorrer uma falha na indução de clivagem com a enzima de restrição. Por conseguinte, nos casos em que um iniciador de incompatibilidade é usado no método de dCAPS, DNA polimerase sem atividade corretora é preferivelmente usada. Tal DNA polimerase é exemplificada, porém sem limitação, pela TaKaRa TaqTM (Takara-Bio Inc.). Além disso, nos casos em que um sítio de clivagem para a enzima de restrição é oferecido perto da extremidade 3' do iniciador, a presença ou ausência de clivagem é detectada como uma diferença no comprimento do iniciador. (4) Um método para confirmar a presença ou ausência de uma mutação efetuando-se uma hibridização com uma sonda desenhada para hibridizar especificamente com um sítio de mutação. Um processo de análise não se limita a um processo específico. Por exemplo, PCR realizada pelo método da sonda TaqMan (marca registrada), análise por MassARRAY (marca registrada) que é uma técnica de medição que utiliza TOF-MS, ou métodos similares podem ser usados. (5) Um método para detectar a presença ou ausência de uma mutação a partir da presença ou ausência de amplificação efetuando- se uma amplificação, por exemplo, por um método de PCR com o uso de uma sequência de iniciador desenhada de forma a conter uma parte de uma sequência de um sítio de mutação (sequência antes e/ou depois de ocorrer uma mutação) (método de PCR alelo-específica).
[000157] Exemplos de iniciadores usados em tal método incluem, porém sem limitação, um conjunto dos seguintes ácidos nucleicos: como iniciadores para detectar uma mutação de C para T na 330a base da sequência de bases de um gene de eIF(iso)4E do tipo S representada pela SEQ ID N°: 7, um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 37; e um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 39. Neste caso, por exemplo, um iniciador de ácido nucleico sendo específico para a sequência de bases antes de a mutação ocorrer e consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 38 pode ser usado como controle.
[000158] Além disso, exemplos de iniciadores para detectar uma mutação de G para A na 299a base da sequência de bases de um gene de eIF(iso)4E do tipo T representada pela SEQ ID N°: 8 incluem, porém sem limitação, um conjunto dos seguintes ácidos nucleicos: um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 40; e um ácido nucleico consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 42. Neste caso, por exemplo, um iniciador de ácido nucleico sendo específico para a sequência de bases antes de a mutação ocorrer e consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 41 pode ser usado como controle.
[000159] Nos casos em que uma base correspondente a uma mutação alvo é apresentada perto de uma extremidade 3' de um iniciador, aquela base é preferivelmente apresentada na extremidade perto do iniciador ou em qualquer uma das posições correspondentes a várias bases perto da extremidade do iniciador. Além disso, nos casos em que uma mutação alvo é apresentada perto da extremidade 3' do iniciador, não só uma sequência de um tipo mutante mas também uma sequência de um tipo selvagem sem mutação podem ser amplificadas. Neste caso, uma incompatibilidade que não uma incompatibilidade pode ser introduzida em um iniciador para detecção do tipo mutante e em um iniciador para detecção do tipo selvagem nas mesmas posições (bases representadas pelas letras minúsculas nas SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 41, e SEQ ID N°: 42), de modo que PCR é realizada para obtenção de uma amplificação tipo mutante-específica ou tipo selvagem-específica.
[000160] Além dos iniciadores para um gene alvo, iniciadores para um gene que serve de padrão interno de PCR (por exemplo, iniciadores consistindo em sequências de bases representadas pelas SEQ ID N°: 43 e SEQ ID N°: 44) podem ser acrescentados a uma solução para reação PCR, se necessário.
[000161] Observe que nos casos em que é detectada uma mutação que não as mutações exemplificadas acima, os especialistas na técnica podem desenhar uma sequência de iniciador, realizar uma PCR, e detectar uma mutação pretendida, sem muito esforço.
[000162] Observe que uma técnica de detecção de mutação gênica está detalhada na seguinte literatura: o website do Escritório de Patentes do Japão: http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/ka- kusan/0025.html. Além disso, métodos de detecção e análise de mutação gênica estão detalhados na seguinte literatura: o website do Escritório de Patentes do Japão: http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyou- jun_gijutsu/kakusan/0028.html. Alternativamente, é possível consultar a seguinte literatura: Agarwal et al. (2008): Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep. 27:617-631.; e Neff et al. (1998): dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14: 387-392.
[000163] Assim sendo, a presente invenção oferece um polinucleotí- deo para detecção de uma mutação em um gene de eIF(iso)4E. A mutação é uma mutação que provoca a produção de uma proteína de eIF(iso)4E que é não funcional em relação a um vírus ou uma mutação que suprime a expressão do gene de eIF(iso)4E. Exemplos específicos da mutação estão discutidos em [1. Tabaco resistente a vírus e método para produzir o tabaco resistente a vírus].
[000164] Além disso, um aspecto do polinucleotídeo para uso em detecção é um iniciador de ácido nucleico um conjunto de iniciadores de ácido nucleico. O conjunto de iniciadores de ácido nucleico pode ser um conjunto de iniciadores de ácido nucleico flanqueando a mutação ou um conjunto de iniciadores de ácido nucleico que contém um polinucleotí- deo consistindo em uma sequência de bases contínuas que contém a mutação ou uma sequência complementar à sequência de bases contínuas. Um outro aspecto do polinucleotídeo para uso em detecção é uma sonda de ácido nucleico que hibridiza com uma sequência de bases contínuas que contém a mutação ou uma sequência complementar à sequência de bases contínuas.
[000165] A presente invenção também oferece um método para avaliar tabaco quanto à resistência a um vírus, o método usando, como índice de resistência a vírus, a ocorrência da mutação em um gene de eIF(iso)4E no DNA genômico de tabaco.
[000166] A presente invenção também oferece um kit para avaliar tabaco quanto à resistência a um vírus, o kit incluindo um conjunto de iniciadores de ácido nucleico para detectar a mutação em um gene de eIF(iso)4E.
[000167] A presente invenção também oferece um kit para avaliar tabaco quanto à resistência a um vírus, o kit incluindo uma sonda que hibridiza com uma sequência de bases contínuas que contém a mutação em um gene de eIF(iso)4E ou uma sequência complementar à sequência de bases contínuas.
[000168] A presente invenção também oferece um método para criar um tabaco resistente a vírus, o método incluindo uma etapa de seleção para selecionar um tabaco com resistência a um vírus usando-se o método de avaliação acima.
[000169] A presente invenção também oferece um método para selecionar um tabaco resistente a vírus, o método incluindo: uma etapa de exame para examinar o tabaco quanto à presença ou ausência da mutação no DNA genômico usando o polinucleotídeo para uso em detecção mencionado acima; e uma etapa de seleção para selecionar, como um tabaco resistente a vírus, um tabaco no qual a mutação fora detectada na etapa de exame. Detalhes do método análise usando um poli- nucleotídeo para uso em detecção estão discutidos mais acima.
[000170] A presente invenção também oferece um marcador de DNA para avaliar tabaco quanto à resistência a um vírus, o marcador de DNA incluindo um polinucleotídeo consistindo em uma sequência de bases contínuas que contém a mutação em um gene de eIF(iso)4E ou uma sequência complementar à sequência de bases contínuas.
[000171] O tabaco em folha produzido por cultivo de um tabaco resistente a vírus da presente invenção não de qualquer doença causada pelo vírus (por exemplo, a cepa PVY que quebra a resistência a vírus do mutante Virgin A ou TBTV). Por conseguinte, tal tabaco em folha fica menos deteriorado e é de alta qualidade, em comparação com o tabaco em folha produzido a partir de um tabaco não resistente a vírus que fora cultivado particularmente em um ambiente no qual possa haver um surto da doença. Como resultado, é possível produzir um produto de tabaco de melhor qualidade.
[000172] O "tabaco em folha", que é obtido por secagem das folhas frescas colhidas de uma planta de tabaco, refere-se a um ingrediente para produção de um produto de tabaco. O "produto de tabaco" refere- se, por exemplo, a cigarro (com filtro e sem filtro), charuto, cigarrilha, "snus", rape, tabaco de mascar, e tabaco eletrônico.
[000173] Por conseguinte, a presente invenção oferece tabaco em folha que é produzido a partir do tabaco resistente a vírus.
[000174] A presente invenção também oferece um produto de tabaco contendo o tabaco em folha como um ingrediente.
[000175] Como descrito acima, os inventores da presente invenção estudaram com cuidado para resolver os problemas precedentes e constataram pela primeira vez que tabaco no qual o funcionalmente de eIF(iso)4E é suprimido tem resistência à cepa PVY-Breaking e TBTV. Os inventores também esclareceram que um de dois pares de genes de eIF(iso)4E presentes no genoma de tabaco está envolvido na resistência à cepa PVY-Breaking enquanto o outro par está envolvido na resistência ao TBTV, e constataram que a supressão da função de cada par de genes de eIF(iso)4E pode conferir resistência ao vírus correspondente. Além disso, os inventores verificaram que inibição do crescimento nunca ocorre no tabaco no qual a função de eIF(iso)4E é suprimida, e concluíram a presente invenção.
[000176] Um aspecto de um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é tal que o tabaco resistente a vírus includes uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[000177] O aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que a mutação é uma mutação sem sentido (nonsense).
[000178] O aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (4): (1) C do códon CAA é substituído por T; (2) C do códon CGA é substituído por T; (3) C do códon CAG é substituído por T; e (4) G (seja um ou ambos Gs) do códon TGG é substituído por A, em (a) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, (b) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, (c) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6, ou (d) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional.
[000179] O aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (27): (1) substituição de C por T na posição 270, (2) substituição de G por A na posição 295, (3) substituição de G por A na posição 296, (4) substituição de G por A na posição 304, (5) substituição de G por A na posição 305, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de C por T na posição 330, (8) substituição de G por A na posição 343, (9) substituição de G por A na posição 344, (10) substituição de C por T na posição 357, (11) substituição de G por A na posição 394, (12) substituição de G por A na posição 395, (13) substituição de C por T na posição 1740, (14) substituição de G por A na posição 1813, (15) substituição de G por A na posição 1814, (16) substituição de G por A na posição 1846, (17) substituição de G por A na posição 1847, (18) substituição de G por A na posição 1888, (19) substituição de G por A na posição 1889, (20) substituição de C por T na posição 2050, (21) substituição de C por T na posição 2104, (22) substituição de G por A na posição 2123, (23) substituição de G por A na posição 2124, (24) substituição de C por T na posição 2152, (25) substituição de G por A na posição 4742, (26) substituição de G por A na posição 4743, e (27) substituição de C por T na posição 4926, em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 7 no DNA genômico.
[000180] O aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (26): (1) substituição de C por T na posição 264, (2) substituição de G por A na posição 289, (3) substituição de G por A na posição 290, (4) substituição de G por A na posição 298, (5) substituição de G por A na posição 299, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de G por A na posição 328, (8) substituição de G por A na posição 329, (9) substituição de C por T na posição 342, (10) substituição de G por A na posição 379, (11) substituição de G por A na posição 380, (12) substituição de C por T na posição 1630, (13) substituição de G por A na posição 1703, (14) substituição de G por A na posição 1704, (15) substituição de G por A na posição 1736, (16) substituição de G por A na posição 1737, (17) substituição de G por A na posição 1778, (18) substituição de G por A na posição 1779, (19) substituição de C por T na posição 1940, (20) substituição de C por T na posição 1994, (21) substituição de G por A na posição 2013, (22) substituição de G por A na posição 2014, (23) substituição de C por T na posição 2042, (24) substituição de G por A na posição 3224, (25) substituição de G por A na posição 3225, e (26) substituição de C por T na posição 3406, em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 8 no DNA genômico.
[000181] O aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma ou mais mutações em (a) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3, (b) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3, (c) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5, ou (d) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional, e o vírus é um vírus pertencente ao gênero Umbravirus.
[000182] O aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que o vírus pertencente ao gênero Umbravirus é o vírus do topo espesso do tabaco.
[000183] O aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma ou mais mutações em (a) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 4, (b) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 4, (c) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 6, ou (d) um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 6 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional, e o vírus é um vírus pertencente ao gênero Potyvirus.
[000184] O vírus pertencente ao gênero Potyvirus is preferivelmente uma cepa do vírus Y da batata, a cepa que quebra a resistência viral do mutante Virgin A de tabaco.
[000185] Um outro aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é tal que o nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução é 20% ou menos, em relação ao tipo selvagem.
[000186] Um outro aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é mais preferivelmente tal que o nível de expressão é 10% ou menos em relação ao tipo selvagem.
[000187] Um outro aspecto do tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que o tabaco resistente a vírus conserva uma construção de RNAi para supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[000188] Um aspecto de um método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção inclui a introdução de uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, para produzir tabaco com resistência a um vírus.
[000189] O aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que a mutação é uma mutação sem sentido (nonsense).
[000190] O aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que a mutação é causada por etil metano sulfonato.
[000191] O aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (4): (1) C do códon CAA é substituído por T; (2) C do códon CGA é substituído por T; (3) C do códon CAG é substituído por T; e (4) G (seja um ou ambos Gs) do códon TGG é substituído por A, em (a) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma se-quência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, (b) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, (c) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6, ou (d) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional.
[000192] O aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (27): (1) substituição de C por T na posição 270, (2) substituição de G por A na posição 295, (3) substituição de G por A na posição 296, (4) substituição de G por A na posição 304, (5) substituição de G por A na posição 305, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de C por T na posição 330, (8) substituição de G por A na posição 343, (9) substituição de G por A na posição 344, (10) substituição de C por T na posição 357, (11) substituição de G por A na posição 394, (12) substituição de G por A na posição 395, (13) substituição de C por T na posição 1740, (14) substituição de G por A na posição 1813, (15) substituição de G por A na posição 1814, (16) substituição de G por A na posição 1846, (17) substituição de G por A na posição 1847, (18) substituição de G por A na posição 1888, (19) substituição de G por A na posição 1889, (20) substituição de C por T na posição 2050, (21) substituição de C por T na posição 2104, (22) substituição de G por A na posição 2123, (23) substituição de G por A na posição 2124, (24) substituição de C por T na posição 2152, (25) substituição de G por A na posição 4742, (26) substituição de G por A na posição 4743, e (27) substituição de C por T na posição 4926, em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 7 no DNA genômico.
[000193] O aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (26): (1) substituição de C por T na posição 264, (2) substituição de G por A na posição 289, (3) substituição de G por A na posição 290, (4) substituição de G por A na posição 298, (5) substituição de G por A na posição 299, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de G por A na posição 328, (8) substituição de G por A na posição 329, (9) substituição de C por T na posição 342, (10) substituição de G por A na posição 379, (11) substituição de G por A na posição 380, (12) substituição de C por T na posição 1630, (13) substituição de G por A na posição 1703, (14) substituição de G por A na posição 1704, (15) substituição de G por A na posição 1736, (16) substituição de G por A na posição 1737, (17) substituição de G por A na posição 1778, (18) substituição de G por A na posição 1779, (19) substituição de C por T na posição 1940, (20) substituição de C por T na posição 1994, (21) substituição de G por A na posição 2013, (22) substituição de G por A na posição 2014, (23) substituição de C por T na posição 2042, (24) substituição de G por A na posição 3224, (25) substituição de G por A na posição 3225, e (26) substituição de C por T na posição 3406, em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 8 no DNA genômico.
[000194] Um outro aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção inclui a introdução de um fator que suprime o nível de expressão de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução para 20% ou menos em relação a um tipo selvagem, para produzir tabaco com resistência a um vírus.
[000195] Um outro aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é mais preferivelmente tal que um fator que suprime o nível de expressão para 10% ou menos em relação ao tipo selvagem é introduzido no tabaco.
[000196] Um outro aspecto do método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que o fator é uma construção de RNAi.
[000197] Um método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que o vírus é um vírus pertencente ao gênero Potyvirus.
[000198] Um método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é mais preferivelmente tal que o vírus pertencente ao gênero Potyvirus é o vírus Y da batata.
[000199] Um método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é mais preferivelmente tal que o vírus pertencente ao gênero Potyvirus é uma cepa do vírus Y da batata, a cepa que quebra a resistência viral do mutante Virgin A de tabaco.
[000200] Um método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que o vírus é um vírus pertencente ao gênero Umbravirus.
[000201] Um método para produzir um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção é mais preferivelmente tal que o vírus pertencente ao gênero Umbravirus é o vírus do topo espesso do tabaco.
[000202] Um aspecto de um polinucleotídeo para uso em detecção de acordo com a presente invenção é um polinucleotídeo para detecção de uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução de tabaco, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[000203] O aspecto do polinucleotídeo para uso em detecção de acordo com a presente invenção é preferivelmente tal que a mutação é uma mutação sem sentido (nonsense).
[000204] O aspecto do polinucleotídeo para uso em detecção de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (4): (1) C do códon CAA é substituído por T; (2) C do códon CGA é substituído por T; (3) C do códon CAG é substituído por T; e (4) G (seja um ou ambos Gs) do códon TGG é substituído por A, em (a) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de ami- noácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, (b) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, (c) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6, ou (d) um éxon de um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA tendo uma identidade entre sequências de 92% ou mais com a sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 e codifica uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução funcional.
[000205] O aspecto do polinucleotídeo para uso em detecção de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (27): (1) substituição de C por T na posição 270, (2) substituição de G por A na posição 295, (3) substituição de G por A na posição 296, (4) substituição de G por A na posição 304, (5) substituição de G por A na posição 305, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de C por T na posição 330, (8) substituição de G por A na posição 343, (9) substituição de G por A na posição 344, (10) substituição de C por T na posição 357, (11) substituição de G por A na posição 394, (12) substituição de G por A na posição 395, (13) substituição de C por T na posição 1740, (14) substituição de G por A na posição 1813, (15) substituição de G por A na posição 1814, (16) substituição de G por A na posição 1846, (17) substituição de G por A na posição 1847, (18) substituição de G por A na posição 1888, (19) substituição de G por A na posição 1889, (20) substituição de C por T na posição 2050, (21) substituição de C por T na posição 2104, (22) substituição de G por A na posição 2123, (23) substituição de G por A na posição 2124, (24) substituição de C por T na posição 2152, (25) substituição de G por A na posição 4742, (26) substituição de G por A na posição 4743, e (27) substituição de C por T na posição 4926, em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 7 no DNA ge- nômico.
[000206] O aspecto do polinucleotídeo para uso em detecção de acordo com a presente invenção pode ser tal que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (26): (1) substituição de C por T na posição 264, (2) substituição de G por A na posição 289, (3) substituição de G por A na posição 290, (4) substituição de G por A na posição 298, (5) substituição de G por A na posição 299, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de G por A na posição 328, (8) substituição de G por A na posição 329, (9) substituição de C por T na posição 342, (10) substituição de G por A na posição 379, (11) substituição de G por A na posição 380, (12) substituição de C por T na posição 1630, (13) substituição de G por A na posição 1703, (14) substituição de G por A na posição 1704, (15) substituição de G por A na posição 1736, (16) substituição de G por A na posição 1737, (17) substituição de G por A na posição 1778, (18) substituição de G por A na posição 1779, (19) substituição de C por T na posição 1940, (20) substituição de C por T na posição 1994, (21) substituição de G por A na posição 2013, (22) substituição de G por A na posição 2014, (23) substituição de C por T na posição 2042, (24) substituição de G por A na posição 3224, (25) substituição de G por A na posição 3225, e (26) substituição de C por T na posição 3406, em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de bases representada pela SEQ ID N°: 8 no DNA genômico.
[000207] O aspecto do polinucleotídeo para uso em detecção de acordo com a presente invenção é um conjunto de iniciadores de ácido nucleico flanqueando a mutação ou um conjunto de iniciadores de ácido nucleico que contém um polinucleotídeo consistindo em uma sequência de bases contínuas que contém a mutação ou uma sequência complementar à sequência de bases contínuas.
[000208] Um aspecto de um método para selecionar um tabaco resistente a vírus de acordo com a presente invenção inclui: uma etapa de exame para examinar o tabaco quanto à presença ou ausência de uma mutação no DNA genômico usando o polinucleotídeo para uso em detecção citado em qualquer uma das reivindicações 27 a 32; and uma etapa de seleção para selecionar, como um tabaco resistente a vírus, tabaco no qual a mutação fora detectada na etapa de exame.
[000209] Um aspecto de um marcador de DNA para avaliar tabaco quanto à resistência a um vírus de acordo com a presente invenção inclui: um polinucleotídeo consistindo em uma sequência de bases contínuas que contém uma mutação em um gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução ou uma sequência complementar à sequência de bases contínuas, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução.
[000210] Em qualquer das plantas, o eIF4E só foi previamente discutido quanto a sua associação com a resistência ao PVY, e nenhuma informação acerca da associalção do eIF(iso)4E com a resistência ao PVY foi divulgada. Houve o relato de um tabaco no qual o nível de expressão de eIF(iso)4E é reduzido para um grau dado, mas não há menção de associação com resistência a vírus. Quanto ao tabaco, houve um relato de associação entre resistência ao PVY e eIF4E, porém nenhuma associação entre resistência ao Potyvirus e uma mutação de eIF4E ou eIF(iso)4E. Assim sendo, a situação continuou um caos. No tocante a um vírus pertencente ao gênero Umbravirus, não foi apontada qualquer associação entre resistência àquele vírus e um fator de iniciação de tradução. Ademais, a situação era tal que era impossível prever com facilidade um gene de tabaco responsável pela resistência à cepa PVY-Breaking ou TBTV pelos seguintes motivos. Um motivo é que um candidato a um fator hospedeiro necessário para reprodução do vírus não era apenas o fator de iniciação de tradução, mas também muitos candidatos incluindo, por exemplo, a proteína DEAD-box RNA helicase like, a proteína interativa VPg, e o fator de alongamento da tradução, como descrito mais acima. Um outro motivo é que como muitos genes estão presentes na família de eIF4E de tabaco, são necessários muito esforço e muito tempo para encontrar um gene efetivo entre aqueles genes.
[000211] A descrição a seguir discutirá detalhes da modalidade da presente invenção com referência aos Exemplos. A presente invenção naturalmente não está limitada aos exemplos abaixo e as particularidades podem ter vários aspectos. Além disso, a presente invenção não está limitada às modalidades, e pode ser alterada pelo especialista na técnica dentro do escopo das reivindicações. Uma modalidade derivada de uma combinação apropriada de meios técnicos divulgados nas respectivas diferentes modalidades também está abrangida pelo escopo técnica da presente invenção. Além disso, todas as literaturas descritas neste relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência. Exemplos
[000212] Foram feitas buscas em bancos de dados conhecidos para aquisição da sequência de cDNA (SEQ ID N°: 10) de um fator de iniciação de tradução eIF4E1 (número de acesso GenBank: AY702653) e da sequência de cDNA (SEQ ID N°: 1) de um fator de iniciação de tradução eIF(iso)4E (número de acesso GenBank :AY699609) de tabaco (Nicoti- ana tabacum).
[000213] Por análise BLAST usando os whole-genome shotgun contigs (WGS) do banco de dados GenBank, foi descoberto que o eIF(iso)4E ao qual foi atribuído o número de acesso AY699609 é derivado de Nicotiana sylvestris. Além disso, duas sequências às quais foi atribuído o número de acesso número de acesso GenBanks EB683576 (SEQ ID N°: 2) e FN666434 foram identifacadas como eIF(iso)4E de tabaco derivado de Nicotiana tomentosiformis (Nicotiana tabacum). Esses genes ou informações de sequências dos mesmos foram submetidos à seguinte experiência. FN666434, que é uma sequência derivada de um gene de eIF(iso)4E do tipo T derivado de tabaco variedade Samsun NN, tinha uma identidade de sequências de 97% com a sequência (EB683576) do eIF(iso)4E tipo T mencionado acima derivado de tabaco variedade K326. As proteínas codificadas por esses dois genes apresentaram uma identidade de sequências de aminoácidos (identidade) de 97% e uma similaridade de sequências de aminoácidos (similaridade) de 99%. Esta diferença de sequências entre elas foi atribuída a uma diferença na variedade de origem entre elas. Além disso, o eIF(iso)4E tipo S (AY699609) e o eIF(iso)4E tipo T (EB683576) apresentaram uma identidade de sequências de DNA de 91%. A sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: 3) do eIF(iso)4E tipo S e a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: 4) do eIF(iso)4E tipo T apresentaram uma identidade de 91% e uma similaridade de 96%. Para análises de uma identidades de sequências etc., foi usado o software de análise sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos GENETYX (marca registrada) (ver.12) (GENETYX CORPORATION).
[000214] Para produzir tabaco com expressão de eIF4E1 suprimida e tabaco com expressão de eIF(iso)4E suprimida, construtos de RNAi com as respectivas sequências internas daqueles genes como gatilhos foram construídas de forma independente.
[000215] Primeiro, foram produzidos iniciadores para amplificar espe-cificamente uma sequência de gatilho de eIF4E1 (SEQ ID N°: 11) e uma sequência de gatilho de eIF(iso)4E (SEQ ID N°: 9) (Tabela 1). Uma sequência CACC para uso em clonagem discutida mais adiante foi adicionada à extremidade 5 ' de um iniciador FW para cada gene.Tabela 1 Tabela 1: Iniciadores para clonagem da sequência do gatilho RNAi do fator de iniciação de tradução
[000216] Usando MagDEA (marca registrada) RNA100 (GC) (Precision System Science Co., Ltd.), RNA foi extraído de plântula de tabaco e purificado. Em seguida, o kit de reagente PrimeScriptTM RT (Takara- Bio Inc.) foi usado para sintetizar cDNA a partir do RNA purificado. Com o uso do cDNA como modelo e dos iniciadores gene-específicos mostrados na Tabela 1, fragmentos gênicos de eIF4E1 e eIF(iso)4E foram amplificados. Especificamente, 10 ng do DNA modelo e 5 pmoles de cada um dos iniciadores estavam contidos em uma solução reacional 20 μL, PrimeSTAR Max DNA Polimerase (Takara-Bio Inc.) foi usada como enzima, e uma reação foi realizada nas seguintes condições: 35 ciclos de 98°C por 10 segundos, 55°C por 15 segundos, e 72°C por 15 segundos. Os produtos de PCR (aproximadamente 320bp por eIF4E1; aproximadamente 310bp por eIF(iso)4E) foram purificados usando-se o kit de purificação para PCR MiniElute (Qiagen Inc.). Em seguida, os produtos de PCR purificados foram clonados em um vetor pENTRTM/D- TOPO (marca registrada) (Life Technologies Corporation). Depois de confirmada a sequência de bases da inserção, GateWay (marca registrada) LR Clonase (marca registrada) II Enzyme mix (Life Technologies Corporation) foi usada para clonar a inserção no vetor de vector pSP231 (vide a literatura: Publicação internacional WO2011/102394). O vetor pSP231, que é um vetor no qual um cassete de expressão de GFP (gene da proteína fluorescente verde) foi inserido em sítio SacI de pHellsgate 12 (vide a literatura: Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581590), é um vetor binário que aciona, com um promotor de gene 35SRNA do vírus do mosaico da couve-flor, uma sequência de RNAi formada com um íntron pdk/cat localizado entre sequências de repetição invertidas da sequência de gatilho. Depois da clonagem em pSP231, uma sequência de gatilho RNAi e sua orientação foram confirmadas. Como resultado, uma construção de RNAi final foi obtida.
[000217] O construto de RNAi preparado dessa maneira foi introduzido em Agrobacterium cepa LBA4404 pelo método de eletroporação. Transformação de tabaco
[000218] Transformação de tabaco foi realizada por um método usual (método de disco de folha). Como a variedade de tabaco, foi usada a Petit Havana SR1.
[000219] Cotilédone de tabaco foi cortado em seus quatro cantos, e os segmentos foliares obtidos desta maneira foram imersos em uma solução de Agrobacterium por 10 minutos. Os segmentos foliares foram secados e então colocados em um meio sólido LS (contendo 3% de sacarose e 0,8% de ágar). Os segmentos foliares foram cultivados no escuro a 25°C por 3 dias para que o tabaco fosse infectado com Agrobacterium recombinante para introduzir a construção de RNAi de cada fator de iniciação de tradução em SR1. Os segmentos foliares foram colocados por 4 dias em um meio sólido LS contendo 250 mg/L de cefotaxime, 2-isopentenil adenina (2iP) (10 mg/L), e IAA (0,3 mg/L), ambos sendo hormônios de planta, para erradicar a Agrobacterium. Seleção de um recombinante foi feita em um meio LS contendo cefotaxime e os hormônios de planta nas concentrações acima e contendo ainda 50 mg/L de canamicina. Um broto, que fora rediferenciado do recombi- nante selecionado, foi colocado em um meio de enraizamento (meio sólido LS contendo 1,5% de sacarose, 0,3% de goma gelana e contendo ainda cefotaxime e canamicina nas concentrações acima) para que fosse enraizado. O tabaco recombinante resultante foi cultivado em uma estufa.
[000220] Para examinar a expressão de eIF4E1 ou do gene de eIF(iso)4E no tabaco recombinante, um conjunto de iniciadores e uma sonda para PCR em tempo real foram desenhados com base na sequência de bases de cada gene (Tabela 2). Além disso, RNA total foi extraído de uma folha de cada tabaco recombinante usando-se o mini kit para plantas RNeasy (QIAGEN Inc.). Síntese do cDNA oriundo do RNA obtido foi realizada usando o kit de reagentes Prime Script (Takara- Bio Inc.), e o cDNA foi usado como um modelo para PCR em tempo real. Na PCR em tempo real, a mistura TaqMan Fast Advanced Master (Life Technologies Corporation) foi usada para realizar a reação de amplificação. A reação foi realizada nas seguintes condições: 50°C por 2 minutos e 95°C por 20 segundos, seguido por 40 ciclos de 95°C por 1 segundo e 60°C por 20 segundos. Análise da expressão foi feita usando-se o Software StepOne v2.2 (Life Technologies Corporation). Como um padrão interno para PCR, foi usado um gene do fator de alongamento 1-alfa (EF1-a). Para comparação com o nível de expressão do gene de EF1-a, um nível de expressão gênica relativa de um gene alvo foi calculado. Como controle, um tabaco não recombinante (SR1) foi usado.Tabela 2 Tabela 2: Iniciadores e uma sonda para PCR quantitative
[000221] Como resultado, a quantidade de transcritos de genes de eIF4E1 no tabaco em que a construção de RNAi do eIF4E1 fora introduzida e a quantidade de transcritos do gene de eIF(iso)4E em que a construção de RNAi do eIF(iso)4E foram introduzida foram muitos mais baixas que os níveis de expressão no controle. Como linhagens apresentando um grau elevado de inibição da transcrição de eIF4E1 no transformante na geração original, foram selecionadas as cinco linhagens a seguir: #1, #2, #3, #7, e #8 (suas quantidades de transcritos foram 1%, 1%, 1%, 36%, e 1% dos níveis de expressão na variedade de controle SR1). Como linhagens apresentando um grau elevado de supressão da transcrição de eIF(iso)4E no transformante na geração original, foram selecionadas as três linhagens a seguir: #1, #7, e #15 (suas quantidades de transcritos foram 4%, 6%, e 5% dos níveis de expressão na variedade de controle SR1).
[000222] Sementes das cinco linhagens apresentando um grau elevado de supressão da transcrição de eIF4E1 no transformante na geração original e sementes das três linhagens apresentando um grau elevado de supressão da transcrição de eIF(iso)4E no transformante na geração original foram assepticamente semeadas em um meio sólido LS (contendo 3% de sacarose e 0,8% de ágar). Fluorescências de GFP das plântulas que germinaram e se desenvolveram foram medidas usando-se o Fluor Imager 595 (Molecular Dynamics, Inc.). Como descrito anteriormente, o pSP231 usado para introdução de construção inclui um cassete de expressão de promotor 35S-GFP apresentado próximo ao cassete de expressão de RNAi na região do T-DNA. Foi determinado que as plântulas que emitiram fluorescência de GFP forte eram linhagens homozigóticas para a construção de RNAi, e foi determinado que as plântulas que não emitiram fluorescência eram linhagens segre- gadoras nulas para a construção de RNAi (onde nenhuma das constru- tos de RNAi estavam presentes) e as plântulas que emitiram fluorescência de GFP fraca eram linhagens homozigóticas para a construção de RNAi. Três semanas depois da semeadura, as plantas foram transferidas para uma estufa e então plantadas e cultivadas em um solo de cul-tivo.
[000223] Para examinar a expressão do gene de eIF(iso)4E na geração seguinte de cada linhagem do tabaco recombinante, RNA foi extraído de uma folha do tabaco recombinante, e cDNA foi sintetizado a partir do RNA e foi usado como modelo para PCR em tempo real, como discutido acima. A PCR em tempo real foi realizada da mesma maneira que discutido acima. Como um padrão interno para PCR, foi usado o gene de EF1-a. Como planta de controle, foi usado um tabaco não re- combinante (SR1).
[000224] Pelos resultados da análise da expressão gênica de eIF(iso)4E por PCR em tempo real (Fig. 1), foi confirmado que as linhagens homozigóticas das linhagens supressoras de expressão de eIF(iso)4E #1, #7, e #15 suprimiram a expressão para aproximadamente 8%, 6%, e 6% da expressão na linhagem não recombinante (SR1), respectivamente. Também foi confirmado que a supressão de expressão não ocorreu nas linhagens segregadoras nulas das três linhagens supressoras de expressão de eIF(iso)4E.
[000225] Plantas individuais 10 dias depois de serem transplantados em um solo de cultivo foram inoculados com PVY (PVY-N), PVY-B, ou TBTV (vírus do topo espesso do tabaco). PVY-B, que é uma cepa viral que foi isolado no Leaf Tobacco Research Center of Japan Tobacco Inc., é uma cepa de ruptura de VAM que causa um sintoma de necrose no mutante Virgin A da variedade de tabaco existente, que é resistente ao PVY. TBTV, que é um vírus pertencente ao gênero Umbravirus, causa um sintoma de mosqueado em uma folha de tabaco. Como inó- culo, foi usada uma folha de tabaco curada em fumeiro, Tsukuba 1, que fora infectada com cada vírus e desenvolverá um sintoma de doença. A variedade Tsukuba 1 é susceptível ao PVY, PVY-B, e TBTV, e apre-senta sintomas de doença nítidos. A folha infectada foi coletada e então triturada em uma solução de tampão de fosfato a 0,01N em um almofariz. O vírus foi inoculado por fricção de uma solução viral obtida pela trituração com o uso de um carborundum em uma metade da maior folha de uma plântula de tabaco uma semana após o transplante (quarta ou quinta folha a partir de baixo). Em seguida, os indivíduos foram cultivados em uma estufa, e seus sintomas de doença foram observados no momento apropriado.
[000226] Como resultado, a maioria dos indivíduos das linhagens de tabaco com a função eIF4E1 suprimida (eIF4E1#1, eIF4E1#2,eIF4E1#3, eIF4E1#7, eIF4E1#8) apresentaram os sintomas de doenças causadas pelo PVY, PVY-B, e TBTV. Eles eram suscetíveis a esses vírus. Neste ponto, praticamente não houve diferença da variedade de controle e das linhagens segregadoras nulas.
[000227] A Tabela 3 mostra os resultados de testes de inoculação de vírus do tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida.
[000228] Em uma avaliação de sintomas de doença no 7o dia depois da inoculação de PVY-B, o sintoma não foi observado nos indivíduos (um total de 9 indivíduos) nas três linhagens homozigóticas do tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida (eIF(iso)4E#1, eIF(iso)4E#7, eIF(iso)4E#15). Em todos os indivíduos nas linhagens segregadoras nulas não tendo construção de RNAi para eIF(iso)4E e na variedade de controle SR1, os sintomas de doença foram observados. Isto comprovou que o tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida tem resistência ao PVY-B. Foi considerado que a replicação ou o movimento de célula para célula do vírus foi inibido no tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida (tabaco com uma quantidade reduzida de transcritos de eIF(iso)4E). Por outro lado, os sintomas de uma doença causada por PVY foram obser-vados em 5 indivíduos dos 9 indivíduos das três linhagens homozigóti- cas de tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida, mas não foi observada em 4 indivíduos dos 9 indivíduos. Inibição do cresceimetno do tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida não foi observada.
[000229] Em uma avaliação de sintomas de doença no 9o dia depois da inoculação de TBTV, o sintoma de doença não foi observado nos indivíduos (um total de 9 indivíduos) nas três linhagens de tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida (eIF(iso)4E#1, eIF(iso)4E#7, eIF(iso)4E#15). Em contraste, o sintoma da doença foi observado em todos os indivíduos nas linhagens segregadoras nulas sem construção de RNAi para eIF(iso)4E e na variedade de controle SR1. Isto comprovou que o tabaco com a função eIF(iso)4E suprimida tem resistência ao TBTV.
[000230] Os resultados acima demonstram que a supressão da função do fator de iniciação de tradução eIF(iso)4E em tabaco permite conferir ao tabaco resistência ao PVY-B e TBTV. Tabela 3 Tabela 3: Resultados dos testes de inoculação de vírus em tabacos re- combinantes nos quais a transcrição do fator de iniciação de tradução é suprimida
[000231] Buscas dos Whole Genome Shotgun Contigs de Nicotiana tabacum no banco de dados GenBank foram feitas usando sequências de mRNA do eIF(iso)4E tipo S (AY699609) e eIF(iso)4E tipo T (EB683576). Como resultado, foram adquiridas sequências genômicas mostrando 100% de identidade entre sequências em uma região codificadora de proteína que não as regiões de íntron (o número de acesso para o eIF(iso)4E tipo S é AWOJ01412288, e o número de acesso para o eIF(iso)4E tipo T é AWOJ01054542). Nessas sequências contig inteiras, sequências de cada um dos genes de eIF(iso)4E estão representadas pela SEQ ID N°: 7 (sequência genômica do gene de eIF(iso)4E do tipo S) e SEQ ID N°: 8 (sequência genômica do gene de eIF(iso)4E do tipo T). Ambas as sequências são sequências genômicas derivadas da variedade de tabaco K326.
[000232] Além disso, foi descoberto que os genes de eIF(iso)4E consistem em cinco éxons e quatro íntrons. A Fig. 2 é um diagrama de uma estrutura do tipo éxon-íntron de um gene de eIF(iso)4E do tipo S. A Fig. 3 é um diagrama de uma estrutura do tipo éxon-íntron de um gene de eIF(iso)4E do tipo T. Nas Figs. 2 e 3, os números mostrados na parte inferior das Figs. 2 e 3 indicam os números das posições nas quais mutações sem sentido (nonsense) em potencial ocorrem quando o tratamento com EMS causes uma mutação de G para A ou uma mutação de C para T, e as setas indicam as posições dos iniciadores nos Exemplos. No caso do eIF(iso)4E tipo S, as bases que podem transformar-se em códons de interrupção quando o tratamento com EMS causa uma mutação de G para A ou uma mutação de C para T são 12 bases no primeiro éxon (na SEQ ID N°: 7, C na posição 270, G na posição 295, G na posição 296, G na posição 304, G na posição 305, C na posição 315, C na posição 330, G na posição 343, G na posição 344, C na posição 357, G na posição 394, e G na posição 395), 7 bases no segundo éxon (C na posição 1740, G na posição 1813, G na posição 1814, G na posição 1846, G na posição 1847, G na posição 1888, e G na posição 1889), 5 bases no terceiro éxon (C na posição 2050, C na posição 2104, G na posição 2123, G na posição 2124, e C na posição 2152), 2 bases no quarto éxon (G na posição 4742 e G na posição 4743), e uma base no quinto éxon (C na posição 4926).
[000233] No entanto, no caso do eIF(iso)4E tipo T, as bases que podem transformar-se em códons de interrupção quando o tratamento com EMS causa uma mutação de G para A ou uma mutação de C para T são 11 bases no primeiro éxon (na SEQ ID N°: 8, C na posição 264, G na posição 289, G na posição 290, G na posição 298, G na posição 299, C na posição 315, G na posição 328, G na posição 329, C na posição 342, G na posição 379, e G na posição 380), 7 bases no segundo éxon (C na posição 1630, G na posição 1703, G na posição 1704, G na posição 1736, G na posição 1737, G na posição 1778, e G na posição 1779), 5 bases no terceiro éxon (C na posição 1940, C na posição 1994, G na posição 2013, G na posição 2014, e C na posição 2042), 2 bases no quarto éxon (G na posição 3224 e G na posição 3225), e uma base no quinto éxon (C na posição 3406).
[000234] Para o primeiro éxon e uma combinação do segundo éxon e do terceiro éxon, foram criados iniciadores para amplificar uma região contendo o(s) éxon(s) e os sítios de fronteira entre um éxon e um íntron (Tabela 4). Na Tabela 4, "eIF(iso)4E tipo S" refere-se ao eIF(iso)4E derivado de Nicotiana sylvestris (sequência de Nicotiana tabacum), "eIF(iso)4E tipo T" refere-se ao eIF(iso)4E derivado de Nicotiana tomen-tosiformis (sequência de Nicotiana tabacum). Tabela 4 Tabela 4: Iniciadores para rastreamento de mutantes de tabaco
[000235] PCR foi realizada, e as sequências de bases dos produtos obtidos dessa maneira foram confirmadas. Usando 5 ng de genoma de tabaco (variedade: Tsukuba N° 1), PCR foi realizada em um sistema reacional de 20 μL. Como a enzima, foi usada a Tks GflexTM DNA Poli- merase (Takara-Bio Inc.). A reação foi realizada nas seguintes condições: 94°C por 2 minutos seguido por 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 90 segundos. Como resultado, todos osprodutos obtidos dessa maneira tinham o comprimento desejado, e suas sequências de bases foram confirmadas. Isto é, regiões do gene de eIF(iso)4E tipo S-específicas e tipo T-específicas foram amplificadas com sucesso a partir de um genoma de tabaco usando-se os iniciadores acima.
[000236] Com a extração de DNAs genômicos de indivíduos com uma mutação causada por um tratamento com EMS, realização de PCR com o uso de um dos iniciadores acima para amplicar regiões do gene de eIF(iso)4E tipo S-específicas e tipo T-específicas, e confirmação das sequências de bases dos produtos amplificados, mutantes de tabaco eIF(iso)4E com códons de interrupção ocorrendo no primeiro éxon, no segundo éxon, ou no terceiro éxon foram rastreados.
[000237] Especificamente, o rastreamento foi feito usando-se uma biblioteca de mutantes de tabaco preparado por Tajima et al. (Literatura: The 2011 Annual Meeting of the Phytopathological Society of Japan, P234, "Construction of mutant panel in Nicotiana tabacum L."). Este painel consiste em (i) um conjunto de sementes (sementes em massa M2) de progênie mutante autofecundada obtida de cada indivíduo (geração M1) reproduzido a partir de (vários milhares de) de sementes do tabaco variedade Tsukuba N° 1, sementes estas que foram submetidas ao tratamento com EMS como um tratamento com mutágeno, e (ii) um conjunto de DNA em massa extraído de plântulas de 8 indivíduos de cada linhagem cultivada a partir das sementes M2 semeadas.
[000238] Usando as amostras de DNA (amostras de DNA de 1974 linhagens) como modelos, PCR foi realizada com o uso dos iniciadores representados pela "eIF(iso)4E-Éxon tipo S 1 Combinação 1 (SEQ ID N°: 25 e SEQ ID N°: 26)" e dos iniciadores representados pela " eIF(iso)4E-Éxons tipo S 2&3 Combinação 1 (SEQ ID N°: 28 e SEQ ID N°: 29)" dos iniciadores mostrados na Tabela 4. Subsequentemente, foram determinadas as sequências de bases dos produtos de PCR obtidos dessa maneira. Como resultado, mutações no Éxon 1 foram detectadas em 58 amostras (50 posições), e mutações no Éxon 2 e Éxon 3 foram detectadas em um total de 58 amostras (45 posições). Todas as mutações eram mutações heterozigóticas. Amostras nas quais uma mu-tação sem sentido (nonsense) (uma mutação que causou códon de interrupção) foi detectada no Éxon 1 foram 4 amostras (na SEQ ID N°: 7, uma mutação de G para A na posição 295, 394, or 395 ou uma mutação de C para T na posição 330). Uma amostra na qual uma mutação sem sentido (nonsense) foi detectada nos Éxons 2 e 3 foi uma amostra (na SEQ ID N°: 7, uma mutação de G para A na posição 1814). Destas linhagens, sementes da linhagem (M2) com uma mutação de C para T na posição 330 foram semeadas, DNAs foram extraídos de 24 indivíduos daquela linhagem, e suas sequências de bases foram determinadas. Como resultado, foram obtidos 11 indivíduos, cada um com uma mutação alvo como mutação homozigótica (homozigotos mutantes tipo eIF(iso)4E_S).
[000239] Usando as amostras de DNA (amostras de DNA de 1974 linhagens) como modelos, PCR foi realizada com o uso dos iniciadores representados pela "eIF(iso)4E-Éxon tipo T 1 Combinação 1 (SEQ ID N°: 31 and SEQ ID N°: 32)" e dos iniciadores representados pela "eIF(iso)4E-Éxons tipo T 2&3 Combinação 2 (SEQ ID N°: 34 e SEQ ID N°: 36)" dos iniciadores mostrados na Tabela 4. Subsequentemente, sequências de bases dos produtos de PCR obtidos desta maneira foram determinadas da mesma maneira que no caso acima. Como resultado, mutações no Éxon 1 foram detectadas em 43 amostras (38 posições), e mutações no Éxon 2 and Éxon 3 foram detectadas em um total de 66 amostras (55 posições). Todas as mutações eram mutações heterozi- góticas. Amostras nas quais uma mutação sem sentido (nonsense) foi detectada no Éxon 1 foram 5 amostras (na SEQ ID N°: 8, uma mutação de G para A na posição 289, 299, 328, 329, or 380). Amostras nas quais uma mutação sem sentido (nonsense) foi detectada nos Éxons 2 e 3 foram 4 amostras (3 amostras tinham uma mutação de G para A na posição 1704 na SEQ ID N°: 8, e uma amostra tinha uma mutação de G para A na posição 1737 na SEQ ID N°: 8). DNAs foram extraídos de 24 indivíduos da linhagem (M2) com uma mutação de G para A na posição 299 das linhagens acima, e suas sequências de bases foram determinadas. Como resultado, foram obtidos 8 indivíduos com uma mutação alvo na forma de mutação homozigótica (homozigotos mutantes tipo eIF(iso)4E_T).
[000240] O homozigoto mutante tipo eIF(iso)4E_S e o homozigoto mutante tipo eIF(iso)4E_T foram cruzados entre si. O cruzamento produziu uma linhagem F1 na um gene do tipo selvagem (sem mutação) e um gene do tipo mutante foram mantidos de maneira heterozigótica em um loco de um eIF(iso)4E tipo S e em um loco de um eIF(iso)4E d tipo T. Os indivíduos na linhagem F1 foram autopolinizados (autofecundadas) para obter indivíduos em uma linhagem F2. Teoricamente, a probabilidade de os indivíduos na linhagem F2 com a mutação tipo S e com a mutação tipo T como mutações homozigóticos é 1/16. Sementes F2 foram semeadas, e DNAs foram extraídos de 700 indivíduos.
[000241] A extração de DNA foi feita da seguinte maneira. Uma amostra de folha de tabaco (1 cm x 1 cm) foi colocada em um tubo de 2 mL, 400 μL de solução de extração (composição: 200mM de Tris-HCl (pH7.5), 250mM de NaCl, 25mM de EDTA, 0,5% de SDS) e 200 μL de solução para precipitação de proteínas (produzida pela QIAGEN Inc.) foram acrescentados ao tubo. Em seguida, a amostra de folha de tabaco foi triturada na presença de cones de metal. Subsequentemente, o tubo foi centrifugado a 13000 rpm por 10 minutos. 300 μL de sobrenadante foram transferidos para um outro tubo de 1.5 mL, e 800 μL de etanol a 100% foram adicionados. A mistura em solução foi misturada por inversão. Depois de centrifugação a 15000 rpm por 10 minutos, o sobrena- dante foi completamente removido. Depois de confirmado que a pelota estava seca, 50 μL de TE (10mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM de EDTA) foram adicionados.
[000242] Como um marcador de DNA usando PCR, foram criados marcadores de iniciador alelo-específico (ASP). O marcador de ASP é um marcador que utiliza um aspecto tal que, com um iniciador desenhado para ter um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) localizado na extremidade 3' de sequência de iniciador, produtos de PCR são obtidos a partir de uma única amostra tendo um polimorfismo específico, e produtos de PCR não podem ser obtidos a partir de outras amostras devidos às incompatibilidades. Os iniciadores preparados estão mostrados na Tabela 5.Tabela 5 Tabela 5: Iniciadores para o marcador de ASP usado para seleção de mutantes de Tabaco*Uma letra minúscula indica uma base que causa incompatibilidade com o DNA modelo alvo.
[000243] Primeiro, foi preparada uma mistura de iniciadores para detectar um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem (WT) no qual não ocorrem mutações. A mistura de iniciadores era composta de 10 μM de cada um dos iniciadores F e R de eIF(iso)4E_S_WT, 10 μM de cada um dos iniciadores F e R de eIF(iso)4E_T_WT, e 1 μM de cada um dos iniciadores F e R do gene de Nia2 (controle, Literatura: Vincentz & Caboche (1991) Constitutive expression of nitrate reductase allows normal growth and development of Nicotiana plumbaginifolia plants. EMBO J. 10: 1027-1035.). Em seguida, foi preparada uma outra mistura de iniciadores para detectar um gene de eIF(iso)4E do tipo mutante (Mut). A mistura de iniciadores era composta de 10 μM de cada um dos iniciadores F e R de eIF(iso)4E_S_Mut, 10 μM de cada um dos iniciadores F e R de eIF(iso)4E_T_Mut, e 1 μM de cada um dos iniciadores F e R do gene de Nia2 (controle). Estas misturas de iniciadores foram oferecidas para PCR para detecção de um gene de eIF(iso)4E do tipo selvagem (WT) e para PCR para detecção de um gene de eIF(iso)4E do tipo mutante (Mut), respectivamente. As condições para a PCR foram as seguintes. Uma mistura de 1 μL de solução ajustada em 5 ng/μL, 1 μL de mistura de iniciadores para detecção de WT ou Mut, 3 μL de água estéril, de 5 μL da mistura "Multiplex PCR 2*Master Mix" (QIAGEN Inc.) foi usada na PCR como um 10 μL de sistema. A PCR foi realizada nas seguintes condições: 95°C por 15 minutos e 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 59°C por 90 segundos, e 72°C por 1 minuto, seguido por 72°C por 10 minutos. Os produtos de PCR foram tratados por eletroforese usando QIAxcel (Qiagen Inc.), e a detecção foi efetuada.
[000244] Alguns dos resultados estão mostrados na Fig. 4. Primeiro, a amploificação do gene de Nia2, que foi usado como um controle, foi confirmada (441bp da banda na parte superior da Fig. 4). Com a mistura de iniciadores para deteção do tipo selvagem (WT), tanto em um gene de eIF(iso)4E do tipo S como em um gene de eIF(iso)4E do tipo T, WT é detectado. Com a mistura de iniciadores para deteção do tipo mutante (Mut), tanto em um gene de eIF(iso)4E do tipo S como em um gene de eIF(iso)4E do tipo T, Mut é detectado. Por conseguinte, o tipo de mutação foi determinado com base nos resultados da detecção WT e da detecção Mut. Em um exemplo, em um caso em que produtos amplificados não foram encontrados pelos iniciadores para eIF(iso)4E_S_WT, produtos amplificados foram detectados pelos iniciadores para eIF(iso)4E_T_WT, produtos amplificados foram detectados pelos iniciadores para iniciadores para eIF(iso)4E_S_Mut, produtos amplificados não foram detectados pelos iniciadores para eIF(iso)4E_T_Mut, foi determinado que uma amostra de interesse era de um genótipo ssTT, no qual apenas genes de eIF(iso)4E tipo S são genes mutantes. Em um outro exemplo, em um caso em que produtos de PCR não foram detectados pelos dois pares de iniciadores para detecção WT, e produtos de PCR foram detectados pelos dois pares de iniciadores para detecção Mut, foi determinado que uma amostra de interesse era de um genótipo sstt, no qual tanto genes de eIF(iso)4E tipo S quanto genes de eIF(iso)4E tipo T são genes mutantes. Observe que uma banda fraca que aparece na faixa da extrema direita (para detecção Mut, SSTT) na Fig. 4 foi considerada como sendo um artefato.
[000245] Desta maneira, o mutante homozigótico duplo tipo eIF(iso)4E_ST (indivíduo com mutações homozigóticas tanto em genes de eIF(iso)4E tipo S quanto em genes de eIF(iso)4E tipo T; genótipo: sstt), e um indivíduo do tipo eIF(iso)4E_selvagem (indivíduo com genes de eIF(iso)4E tipo S do tipos selvagem e genes de eIF(iso)4E tipo T do tipos selvagem; genótipo: SSTT) como um controle foram adquiridos da linhagem F2 por análise de polimorfismo usando marcadores de DNA. Sequências de DNA dos produtos de PCR dos indivíduos selecionados foram decodificadas para confirmar as mutações. Como resultado, foi verificado que o resultado da seleção de marcador de DNA era preciso. Reprodução de mutante tipo eIF(iso)4E S e mutante tipo eIF(iso)4E T
[000246] O mutante tipo eIF(iso)4E_S mencionado acima (com genes de eIF(iso)4E tipo S mutados de forma homozigótica; genótipo: ssTT) e o mutante tipo eIF(iso)4E_T (com genes de eIF(iso)4E tipo T mutados de forma homozigótica; genótipo: SStt) foram cultivados para obtenção de progênies autofecundadas ("selfed progenies") para reprodução de sementes. Algumas das sementes obtidas das progênies foram semeadas e cultivadas. Da mesma maneira que no caso acima, DNAs foram extraídos para fazer a análise de polimorfismo usando um marcador de DNA. Como resultado, foi confirmado que as sementes tinham uma mutação homozigótica no gene de eIF(iso)4E tipo S ou no gene de eIF(iso)4E tipo T.
[000247] As sementes que tiveram as mutações confirmadas foram depositadas no National Institute of Technology and Evaluation International Patent Organism Depositary (#120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisa- razu-shi, Chiba 292-0818, Japão). As sementes do mutante tipo eIF(iso)4E_S foram depositadas como NtS1, enquanto que as sementes do mutante tipo eIF(iso)4E_T foram depositadas como NtT1. Seus respectivos números de acesso são FERM BP-22284 (data de acesso: 25 de fevereiro de 2015) e FERM BP-22285 (data de acesso: 25 de fevereiro de 2015).
[000248] Marcadores de dCAPS foram desenvolvidos como um marcador de DNA para detectar um polimorfismo de cada gene de eIF (iso) 4E com um grau de precisão mais elevado. Nos casos em que um polimorfismo está presente uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição, o polimorfismo pode ser identificado por detecção de diferenças no documento dos fragmentos entre fragmentos obtidos por tratamento com uma enzima de restrição. Este é denominado marcador de CAPS ou marcador de PCR-RFLP. No caso das mutações mencionadas acima que ocorreram no gene de eIF(iso)4E tipo S e no gene de eIF(iso)4E tipo T (a mutação de C para T na posição 330 na SEQ ID N°: 7 e a a mutação de G para A na posição 299 na SEQ ID N°: 8, respectivamente), nenhuma sequência de reconhecimento de enzima de restrição estava contida nas sequências em volta de um polimofirmo de nucleotídeo único (SNP). Portanto, foram desenhados iniciadores para uso em PCR para que um sítio de enzima de restrição fosse artificialmente introduzido na vizinhança do SNP. No caso das mutações mencionadas acima, um gene do tipo mutante exigiu mutação de duas bases para conter um sítio de restrição (no caso de um gene de eIF(iso)4E tipo S, "CATG" como sítio Nla III, e no caso de um gene de eIF(iso)4E tipo T, "GATC" como sítio Mbo I), ao passo que um gene do tipo selvagem exigiu uma mutação de uma única base para conter um sítio de restrição. Por conseguinte, o exemplo 2 introduziu uma mutação de uma única base para preparar um marcador de dCAPS de modo que uma enzima de restrição corte os produtos de PCR obtidos a partir de um gene do tipo selvagem, mas não corte os produtos de PCR obtidos a partir de um gene do tipo mutante. Neste caso, uma diferença no comprimento do fragmento é detectada uma diferença no comprimento de um iniciador. Os iniciadores preparados desta maneira estão mostrados na Tabela 6.
[000249] Toma-se a SEQ ID N°: 46 como um exemplo. Nos casos em que se usa um DNA modelo de um tipo selvagem, as bases "CaT" em uma extremidade 3’ são seguidas por "G", o que leva a um sítio Nla III (CATG). Por outro lado, nos casos em que se usa um DNA modelo de um mutante, as bases "CaT" em uma extremidade 3’ são seguidas por "A", o que não leva a um sítio de restrição. Tomemos a SEQ ID N°: 48 como um exemplo. Nos casos em que se usa um DNA modelo de um tipo selvagem, as bases "GAt" em uma extremidade 3’ são seguidas por "C", o que leva a um sítio Mbo I (GATC). Por outro lado, nos casos em que se usa um DNA modelo de um mutante, as bases "GAt" em uma extremidade 3’ são seguidas por "T", o que não leva a um sítio de restrição.
[000250] Presume-se que uma incompatibilidade seja oferecida na vizinhança de uma extremidade 3' de um iniciador. Neste caso, quando a PCR é realizada com DNA polimerase com atividade corretora, a incompatibilidade pode ser corrigida pela DNA polimerase. Assim sendo, o corte com uma enzima de restrição pode acabar em fracasso. Na verdade, nenhum polimorfismo foi detectado nos produtos obtidos com a realização de PCR, usando um DNA genômico como modelo, com DNA Polimerase Tks GflexTM (fabricada por Takara-Bio Inc.) com atividade corretora, e tratamento dos produtos de PCR com uma enzima de restrição. Entrementes, usando um DNA genômico como modelo, PCR foi realizada com TaKaRa TaqTM (Takara-Bio Inc.) sem atividade corretora. Neste caso, uma amplificação adequada não foi atingida. Assim sendo, PCR aninhada foi realizada para que a 1a PCR com DNA Polimerase Tks GflexTM (com função corretora) fosse realizada para especificamente amplificar uma região contendo uma região SNP e seus arreado- res, e a 2a PCR com TaKaRa TaqTM (sem função corretora) fosse então realizada para produzir um stítio de reconhecimento de enzima de restrição.Tabela 6 Tabela 6: Iniciadores para o marcador dCAPS usado para seleção de mutantes de Tabaco
*Uma letra minúscula indica uma base que foi inserida para criar um sítio de enzima de restrição em um tipo selvagem e que causa uma incompatibilidade com o DNA modelo alvo.
[000251] Iniciadores para uso na 2a PCR foram desenhados de forma a incluir incompatibilidades para que um produto amplificado pelos iniciadores de eIF(iso)4E_S possam ser cortados com uma enzima de restrição Nla III apenas caso um SNP do tipo selvagem esteja contido no produto, e para que um produto amplificado pelos iniciadores de eIF(iso)4E_T possam ser cortados com uma enzima de restrição Mbo I apenas caso um SNP do tipo selvagem esteja contido no produto.
[000252] Primeiro, a 1a PCR foi realizada com Tks GflexTM DNA Poli- merase. Como modelo, foram usados aproximadamente 5 ng de DNA genômico. Os iniciadores foram ajustados para que sua concentração fosse de 1μM. Como tampão, foi usado um tampão que acompanha a enzima. PCR foi realizada nas seguintes condições: 94°C por 1 minuto e 30 ciclos de 98°C por 10 segundos, 60°C por 15 segundos, e 68°C por 30 segundos, seguido por 68°C por 90 segundos. Em seguida, os produtos obtidos pela 1a PCR foram diluídos por um fator de diluição de 1 para 100. Usando 1 μl de produto diluído como modelo, a 2a PCR foi realizada com TaKaRa TaqTM. Como na 1a PCR, os iniciadores foram ajustados para que sua concentração fosse de 1μM, e foi usado tampão que acompanha a enzima. PCR foi realizada nas seguintes condições: 94°C por 2 minutos e 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 52°C por 30 segundos, e 72°C por 30 segundos, seguido por 72°C por 90 segundos. Os produtos obtidos pela 2a PCR de eIF(iso)4E_S foram tratados com Nla III (New England Biolabs Inc.). Os produtos obtidos pela 2a PCR de eIF(iso)4E_T foram tratados com Mbo I (Takara-Bio, Inc.).
[000253] Os resultados estão mostrados na Tabela 5. Para uma amostra em que os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_S não foram cortados quando eles foram tratados com a enzima de restrição, o genótipo da amostra foi determinado como sendo "ss". Entretanto, para uma amostra em que os produtos amplificados pelos iniciadores de iniciadores de eIF(iso)4E_T não foram cortados quando eles foram tratados com a enzima de restrição, o genótipo da amostra foi determinado como sendo "tt". Por exemplo, para uma amostra em que os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_S não foram cortados com a enzima de restrição, e os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_T foram cortados com a enzima de restrição, o genótipo da amostra foi determinado como sendo "ssTT". Para uma amostra em que os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_S foram cortados com a enzima de restrição, e os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_T não foram cortados com a enzima de restrição, o genótipo da amostra foi determinado como sendo "SStt". Para uma amostra em que os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_S foram cortados com a enzima de restrição, e os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_T foram cortados com a enzima de restrição, o genótipo da amostra foi determinado como sendo "SSTT". Para uma amostra em que os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_S não foram cortados com a enzima de restrição, e os produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_T não foram cortados com a enzima de restrição, o genótipo da amostra foi determinado como sendo "sstt". Para uma amostra em que alguns dos produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_S foram cortados com a enzima de restrição enquanto que outros não o foram, e alguns dos produtos amplificados pelos iniciadores de eIF(iso)4E_T foram cortados com a enzima de restrição enquanto que outros não o foram, o genótipo da amostra foi determinado como sendo "SsTt". Desta maneira, a determinação do genótipo foi feita com facilidade. Portanto, como no caso com o marcador de ASP, foi confirmado que o marcador de dCAPS no exemplo 2 é usado efetivamente usado para identificação do genótipo de um indivíduo no qual uma mutação ocorrera em um gene de eIF(iso)4E de tabaco.
[000254] Análise da transcrição do gene de eIF(iso)4E foi feita em vários mutantes de tabaco eIF(iso)4E. De cada um dos seguintes: o mutante tipo eIF(iso)4E_S (ssTT), o mutante tipo eIF(iso)4E_T (SStt), o mutante homozigótico duplo tipo eIF(iso)4E_ST (sstt), e a linhagem do tipo eIF(iso)4E_selvagem (SSTT), todos eles tendo sido selecionados por uma marcador de DNA, RNA foi extraído como no caso mencionado acima, e cDNA foi sintetizado, e uma PCR quantitativa foi realizada. Como um conjunto de iniciadores e uma sonda, as SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, e SEQ ID N°: 21 mostradas na Tabela 2 foram usadas para um gene de eIF(iso)4E tipo S. Para um gene de eIF(iso)4E tipo T, as SEQ ID N°: 49, SEQ ID N°: 50, e SEQ ID N°: 51 mostradas na Tabela 6 foram recém-criadas e apresentadas em uma experiência. Tabela 7 Tabela 7: Conjunto de iniciadores e sonda para PCR quantitativa do gene de eIF(iso)4E tipo T
[000255] Os resultados da medição estão mostrados na Fig. 6. A Fig. 6 mostra os respectivos níveis de expressão de genes de eIF(iso)4E medidos em relação a um valor médio da quantidade de transcritos da linhagem do genótipo SSTT. O eixo horizontal do genótipo A representa um genótipo de cada mutante, e o valor numérico entre parênteses indica o número de indivíduos analisados. O eixo vertical representa o valor médio relativo das quantidades de transcritos em uma linhagem tendo cada genótipo, e a barra representa o desvio padrão. Quanto à linhagem do genótipo SStt, a quantidade de transcritos do gene de eIF(iso)4E tipo S- foi 73% do controle, mas transcritos do gene de eIF(iso)4E tipo T não foram detectados. Em contraste, quanto à linhagem do genótipo ssTT, a quantidade de transcritos do gene de eIF(iso)4E tipo T foi 73% do controle, mas a quantidade de transcritos do gene de eIF(iso)4E tipo S foi reduzido para 8,0% do controle. Além disso, quanto à linhagem do genótipo sstt, transcritos de genes de eIF(iso)4E tipo T não foram detectados, e a quantidade de transcritos de genes de eIF(iso)4E tipo S foi reduzida para 8,3% do controle. Os resultados acima comprovaram que a linhagem do genótipo SStt suprimiu especificamente a expressão do gene de eIF(iso)4E tipo T, que a linhagem do genótipo ssTT suprimiu especificamente a expressão do gene de eIF(iso)4E tipo S, e que a linhagem do genótipo sstt suprimiu a expressão tanto dos genes de eIF(iso)4E tipo S quanto dos genes de eIF(iso)4E tipo S e tipo T.
[000256] A supressão transcricional resultante de uma mutação sem sentido (nonsense) foi atribuída ao decaimento de mRNA mediado por mutações sem sentido (nonsense) (NMD) (Literatura: Baker e Parker 2004, Current Opinion in Cell Biology 16: 293-299) foi considerada.
[000257] Plantas individuais duas semanas após transplante para um solo de cultura foram inoculados com PVY-B (cepa reprodutora de VAM do vírus Y da batata) ou TBTV (vírus do topo espesso do tabaco). Preparação do inóculo viral e inoculação do vírus em tabaco foram efetuadas da mesma maneira que no exemplo 1. Depois da inoculação, os indivíduos foram cultivados em uma estufa, e os respectivos sintomas de doença foram observados nos momentos apropriados. Os resultados dos testes de inoculação de vírus nos mutantes de tabaco sem a função eIF(iso)4E estão mostrados nas Tabelas 8 e 9.
[000258] Nas avaliações de sintomas de doença feitas no 10° dia após a inoculação de PVY-B, o sintoma de doença não foi observado nos indivíduos da linhagem mutante homozigótica dupla do tipo eIF(iso)4E_ST (linhagem com mutações homozigóticas tanto em genes de eIF(iso)4E tipo S quanto em genes de eIF(iso)4E tipo T; genótipo: sstt). Por outro lado, em uma avaliação de sintomas de doença efetuada no 8° dia após a inoculação de PVY-B, o sintoma de doença foi observado em todas as plantas individuais da linhagem do tipo eIF(iso)4E_selvagem (linhagem com genes de eIF(iso)4E tipo S do tipo selvagem e genes de eIF(iso)4E tipo T do tipo selvagem; genótipo: SSTT) e no cultivar TN90. Isto comprovou que o mutante de tabaco sem a função eIF(iso)4E tipo S e sem a função eIF(iso)4E tipo T tinham resistência ao PVY-B. Além disso, as avaliações de sintomas de doença feitas no 10° dia após a inoculação de PVY-B mostraram que a linhagem apenas sem a função eIF(iso)4E tipo T (linhagem mutante do tipo eIF(iso)4E_T com genes de eIF(iso)4E tipo T mutados de forma homo- zigótica; genótipo: SStt) suprimiram significativamente o sintoma de doença, em comparação com a linhagem do tipo eIF(iso)4E_selvagem, o cultivar TN90, e a linhagem apenas sem a função eIF(iso)4E tipo S (linhagem mutante do tipo eIF(iso)4E_S com eIF(iso)4E tipo S mutados de forma homozigótica; genótipo: ssTT). A partir desses resultados, presumiu-se que PVY-B utiliza principalmente o eIF(iso)4E tipo T para expressar seu sintoma de doença causada pela replicação ou movimento de célula para célula de PVY-B, e foi considerado que a supressão da expressão de eIF(iso)4E tipo T possibilita a supressão do sintoma de doença causada por PVY-B.
[000259] Nas avaliações de sintoma de doença feitas no 12° dia após a inoculação de TBTV, o sintoma de doença não foi observado nas plantas individuais na linhagem mutante homozigótica dupla do tipo eIF(iso)4E_ST (sstt). Por outro lado, em uma avaliação de sintomas de doença efetuada no 10° dia após a inoculação de TBTV, sintoma de doença foi observado em mais da metade das plantas individuais da linhagem do tipo eIF(iso)4E_selvagem (SSTT) e no cultivar TN90. Isto comprovou que o mutante de tabaco sem a função eIF(iso)4E tipo S e sem função eIF(iso)4E tipo T tinha resistência ao TBTV. Além disso, a linhagem apenas sem a função eIF(iso)4E tipo S (linhagem mutante do tipo eIF(iso)4E_S; ssTT) suprimiu significativamente o sintoma de doença, em comparação com a linhagem do tipo eIF(iso)4E_selvagem (SSTT), o cultivar TN90, e a linhagem apenas sem a função eIF(iso)4E tipo T (linhagem mutante do tipo eIF(iso)4E_T; SStt). A partir desses resultados, presumiu-se que TBTV utiliza principalmente o eIF(iso)4E tipo S para expressar seu sintoma de doença causado pela replicação ou movimento de célula para célula de TBTV, e foi considerado que a supressão da expressão de eIF(iso)4E tipo S possibilita a supressão do sintoma de doença causado por TBTV. Inibição do crescimento de ta-baco com a função eIF(iso)4E suprimida não foi observada.
[000260] Os resultados acima demonstraram que a supressão da função do fator de iniciação de tradução eIF(iso)4E em tabaco confere ao tabaco resistência ao PVY-B, e demonstraram ainda que a supressão apenas da função do eIF(iso)4E tipo T em tabaco permite conferir ao tabaco resistência ao PVY-B. Além disso, os resultados acima TBTV, e demonstraram ainda que a supressão apenas da função do eIF(iso)4E tipo S em tabaco permite conferir ao tabaco resistência ao TBTV.Tabela 8 Tabela 8: Resultados dos testes de inoculação de PVY-B em mutantes de tabaco sem a função eIF(iso)4ETabela 9 Tabela 9: Resultados dos testes de inoculação de TBTV em mutantes de tabaco sem a função eIF(iso)4E
[000261] A presente invenção aplica-se à reprodução de tabaco.
[000262] Números de acesso FERM BP-22284 FERM BP-22285
Claims (13)
1. Método para produzir um tabaco resistente a vírus, carac-terizado por compreender a introdução de uma mutação em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, para produzir tabaco tendo resistência a um vírus, em que o vírus é um vírus do topo espesso do tabaco, e a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (4): (1) C do códon CAA é substituído por T; (2) C do códon CGA é substituído por T; (3) C do códon CAG é substituído por T; e (4) G (seja um ou ambos de dois Gs) do códon TGG é substituído por A, em um éxon de um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID N°: 5.
2. Método para produzir um tabaco resistente a vírus, carac-terizado por compreender a introdução de uma mutação em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, para produzir tabaco tendo resistência a um vírus, em que o vírus é uma cepa do vírus Y da batata, a cepa que quebra a resistência viral do mutante Virgin A de tabaco, e a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (4): (1) C do códon CAA é substituído por T; (2) C do códon CGA é substituído por T; (3) C do códon CAG é substituído por T; e (4) G (seja um ou ambos de dois Gs) do códon TGG é substituído por A, em um éxon de um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução do tipo selvagem que provoca a produção de mRNA consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID N°: 6.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (27): (1) substituição de C por T na posição 270, (2) substituição de G por A na posição 295, (3) substituição de G por A na posição 296, (4) substituição de G por A na posição 304, (5) substituição de G por A na posição 305, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de C por T na posição 330, (8) substituição de G por A na posição 343, (9) substituição de G por A na posição 344, (10) substituição de C por T na posição 357, (11) substituição de G por A na posição 394, (12) substituição de G por A na posição 395, (13) substituição de C por T na posição 1740, (14) substituição de G por A na posição 1813, (15) substituição de G por A na posição 1814, (16) substituição de G por A na posição 1846, (17) substituição de G por A na posição 1847, (18) substituição de G por A na posição 1888, (19) substituição de G por A na posição 1889, (20) substituição de C por T na posição 2050, (21) substituição de C por T na posição 2104, (22) substituição de G por A na posição 2123, (23) substituição de G por A na posição 2124, (24) substituição de C por T na posição 2152, (25) substituição de G por A na posição 4742, (26) substituição de G por A na posição 4743, e (27) substituição de C por T na posição 4926, em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID N°: 7 no DNA genômico.
4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma mais das seguintes mutações (1) a (26): (1) substituição de C por T na posição 264, (2) substituição de G por A na posição 289, (3) substituição de G por A na posição 290, (4) substituição de G por A na posição 298, (5) substituição de G por A na posição 299, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de G por A na posição 328, (8) substituição de G por A na posição 329, (9) substituição de C por T na posição 342, (10) substituição de G por A na posição 379, (11) substituição de G por A na posição 380, (12) substituição de C por T na posição 1630, (13) substituição de G por A na posição 1703, (14) substituição de G por A na posição 1704, (15) substituição de G por A na posição 1736, (16) substituição de G por A na posição 1737, (17) substituição de G por A na posição 1778, (18) substituição de G por A na posição 1779, (19) substituição de C por T na posição 1940, (20) substituição de C por T na posição 1994, (21) substituição de G por A na posição 2013, (22) substituição de G por A na posição 2014, (23) substituição de C por T na posição 2042, (24) substituição de G por A na posição 3224, (25) substituição de G por A na posição 3225, e (26) substituição de C por T na posição 3406, em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID N°: 8 no DNA genômico.
5. Método para produzir um tabaco resistente a vírus, carac-terizado por compreender a introdução de um fator que suprime um nível de expressão de um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que causa a produção de mRNA consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID NO: 5 ou mRNA consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID NO: 6 para 20% ou menos em relação a um tipo selvagem, para produzir tabaco tendo resistência a um vírus, em que o vírus é (i) uma cepa do vírus Y da batata, a cepa que quebra a resistência viral do mutante Virgin A de tabaco ou (ii) um vírus do topo espesso do tabaco, o fator é uma construção de RNAi usando uma sequência de nucleotídeos do gene eIF(iso)4E ou uma parte da sequência de nucleo- tídeos como um gatilho.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fator suprime o nível de expressão para 10% ou menos em relação ao tipo selvagem.
7. Polinucleotídeo para uso em detecção, caracterizado pelo fato de que é um polinucleotídeo para detectar uma mutação em um fator de iniciação da tradução do gene eIF(iso)4E de tabaco, a mutação que causa a produção de uma proteína do fator de iniciação da tradução eIF(iso)4E que não é funcional em relação a um vírus ou suprime a expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução, em que o polinucleotídeo para uso de detecção é um conjunto de ini-ciadores de ácido nucleico que contém um polinucleotídeo que consiste em uma sequência de nucleotídeos contínua que contém a mutação ou uma sequência completamente complementar à sequência de nucleotí- deos contínua, o vírus é o vírus do topo espesso do tabaco, em que a mutação é uma ou mais das seguintes mutações (1) a (27): (1) substituição de C por T na posição 270, (2) substituição de G por A na posição 295, (3) substituição de G por A na posição 296, (4) substituição de G por A na posição 304, (5) substituição de G por A na posição 305, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de C por T na posição 330, (8) substituição de G por A na posição 343, (9) substituição de G por A na posição 344, (10) substituição de C por T na posição 357, (11) substituição de G por A na posição 394, (12) substituição de G por A na posição 395, (13) substituição de C por T na posição 1740, (14) substituição de G por A na posição 1813, (15) substituição de G por A na posição 1814, (16) substituição de G por A na posição 1846, (17) substituição de G por A na posição 1847, (18) substituição de G por A na posição 1888, (19) substituição de G por A na posição 1889, (20) substituição de C por T na posição 2050, (21) substituição de C por T na posição 2104, (22) substituição de G por A na posição 2123, (23) substituição de G por A na posição 2124, (24) substituição de C por T na posição 2152, (25) substituição de G por A na posição 4742, (26) substituição de G por A na posição 4743, e (27) substituição de C por T na posição 4926, em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de nucle- otídeos definida por SEQ ID N°: 7 no DNA genômico.
8. Polinucleotídeo para uso em detecção, caracterizado pelo fato de que é um polinucleotídeo para detectar uma mutação em um fator de iniciação da tradução do gene eIF(iso)4E de tabaco, a mutação que causa a produção de uma proteína do fator de iniciação da tradução eIF(iso)4E que não é funcional em relação a um vírus ou suprime a expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução, em que o polinucleotídeo para uso de detecção é um conjunto de ini-ciadores de ácido nucleico que contém um polinucleotídeo que consiste em uma sequência de nucleotídeos contínua que contém a mutação ou uma sequência completamente complementar à sequência de nucleotí- deos contínua, o vírus é uma cepa do virus Y da batata, a cepa que quebra a resistência ao vírus do mutante Virgin A de tabaco, em que a mutação é uma ou mais das seguintes mutações (1) a (26): (1) substituição de C por T na posição 264, (2) substituição de G por A na posição 289, (3) substituição de G por A na posição 290, (4) substituição de G por A na posição 298, (5) substituição de G por A na posição 299, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de G por A na posição 328, (8) substituição de G por A na posição 329, (9) substituição de C por T na posição 342, (10) substituição de G por A na posição 379, (11) substituição de G por A na posição 380, (12) substituição de C por T na posição 1630, (13) substituição de G por A na posição 1703, (14) substituição de G por A na posição 1704, (15) substituição de G por A na posição 1736, (16) substituição de G por A na posição 1737, (17) substituição de G por A na posição 1778, (18) substituição de G por A na posição 1779, (19) substituição de C por T na posição 1940, (20) substituição de C por T na posição 1994, (21) substituição de G por A na posição 2013, (22) substituição de G por A na posição 2014, (23) substituição de C por T na posição 2042, (24) substituição de G por A na posição 3224, (25) substituição de G por A na posição 3225, e (26) substituição de C por T na posição 3406, em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID N°: 8 no DNA ge- nômico.
9. Método para selecionar um tabaco resistente a vírus, , ca-racterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de exame do tabaco quanto à presença ou ausência de uma mutação no DNA genômico usando um polinucleotídeo para uso na detecção; e uma etapa de seleção de selecionar, como tabaco resistente a vírus, tabaco no qual a mutação foi detectada na etapa de exame, o polinucleotídeo para uso na detecção sendo um polinucle- otídeo para detectar uma mutação em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução do gene de tabaco, a mutação causando a produção de uma proteína do fator de iniciação da tradução eIF(iso)4E que não é funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução, em que o vírus é o vírus do topo espesso do tabaco, a mutação é uma ou mais das seguintes mutações (1) a (27): (1) substituição de C por T na posição 270, (2) substituição de G por A na posição 295, (3) substituição de G por A na posição 296, (4) substituição de G por A na posição 304, (5) substituição de G por A na posição 305, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de C por T na posição 330, (8) substituição de G por A na posição 343, (9) substituição de G por A na posição 344, (10) substituição de C por T na posição 357, (11) substituição de G por A na posição 394, (12) substituição de G por A na posição 395, (13) substituição de C por T na posição 1740, (14) substituição de G por A na posição 1813, (15) substituição de G por A na posição 1814, (16) substituição de G por A na posição 1846, (17) substituição de G por A na posição 1847, (18) substituição de G por A na posição 1888, (19) substituição de G por A na posição 1889, (20) substituição de C por T na posição 2050, (21) substituição de C por T na posição 2104, (22) substituição de G por A na posição 2123, (23) substituição de G por A na posição 2124, (24) substituição de C por T na posição 2152, (25) substituição de G por A na posição 4742, (26) substituição de G por A na posição 4743, e (27) substituição de C por T na posição 4926, em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID N°: 7 no DNA genômico.
10. Método para selecionar um tabaco resistente a vírus, , caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de exame de tabaco quanto à presença ou ausência de uma mutação no DNA genômico usando um polinucleotídeo de uso de detecção; e uma etapa de seleção de selecionar, como tabaco resistente a vírus, tabaco no qual a mutação foi detectada na etapa de exame, o polinucleotídeo de uso de detecção sendo um polinucleo- tídeo para detectar uma mutação em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução do tabaco, a mutação causando a produção de uma proteína do fator de iniciação da tradução eIF(iso)4E que não é funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução, em que o vírus é uma cepa do virus Y da batata, a cepa que quebra a resistência ao vírus do mutante Virgin A de tabaco, a mutação é uma ou mais das seguintes mutações (1) a (26): (1) substituição de C por T na posição 264, (2) substituição de G por A na posição 289, (3) substituição de G por A na posição 290, (4) substituição de G por A na posição 298, (5) substituição de G por A na posição 299, (6) substituição de C por T na posição 315, (7) substituição de G por A na posição 328, (8) substituição de G por A na posição 329, (9) substituição de C por T na posição 342, (10) substituição de G por A na posição 379, (11) substituição de G por A na posição 380, (12) substituição de C por T na posição 1630, (13) substituição de G por A na posição 1703, (14) substituição de G por A na posição 1704, (15) substituição de G por A na posição 1736, (16) substituição de G por A na posição 1737, (17) substituição de G por A na posição 1778, (18) substituição de G por A na posição 1779, (19) substituição de C por T na posição 1940, (20) substituição de C por T na posição 1994, (21) substituição de G por A na posição 2013, (22) substituição de G por A na posição 2014, (23) substituição de C por T na posição 2042, (24) substituição de G por A na posição 3224, (25) substituição de G por A na posição 3225, e (26) substituição de C por T na posição 3406, em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução consistindo em uma sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID N°: 8 no DNA genômico.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo para uso em detecção é um conjunto de iniciadores de ácido nucleico flanqueando a mutação ou um conjunto de iniciadores de ácido nucleico que contém um polinucleotí- deo consistindo em uma sequência de nucleotídeos contínuos que contém a mutação ou uma sequência completamente complementar à sequência de nucleotídeos contínuos.
12. Marcador de DNA para avaliar tabaco quanto à resistência a um vírus, caracterizado pelo fato de que compreende: um polinucleotídeo consistindo em uma sequência de nucle- otídeos contínuos que contém uma mutação em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução ou uma sequência completamente complementar à sequência de nucleotídeos contínuos, a mutação provocando a produção de uma proteína de eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação de tradução, em que o vírus é o vírus do topo espesso do tabaco, em que a mutação é uma ou mais das seguintes mutações (1) a (27): (1) substituição de C para T na posição 270, (2) substituição de G para A na posição 295, (3) substituição de G para A na posição 296, (4) substituição de G para A na posição 304, (5) substituição de G para A na posição 305, (6) substituição de C para T na posição 315, (7) substituição de C para T na posição 330, (8) G para A substituição na posição 343, (9) G para A substituição na posição 344, (10) C para T substituição na posição 357, (11) G para A substituição na posição 394, (12) G para A substituição na posição 395 , (13) substituição de C para T na posição 1740, (14) substituição de G para A na posição 1813, (15) substituição de G para A na posição 1814, (16) substituição de G para A na posição 1846, (17) substituição de G para Uma substituição na posição 1847, (18) G para A substituição na posição 1888, (19) G para A substituição na posição 1889, (20) C para T substituição na posição 2050, (21) C para T substituição na posição 2104, (22) substituição de G para A na posição 2123, (23) substituição de G para A na posição 2124, (24) subs-tituição de C para T na posição 2152, (25) substituição de G para A na posição 4742, (26) substituição de G para A na posição 4743 e (27) substituição de C para Substituição T na posição 4926, em um gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução que consiste em uma sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID NO: 7 no DNA genômico.
13. Marcador de DNA para avaliar o tabaco quanto à resistência a um vírus, caracterizado pelo fato de que compreende: um polinucleotídeo que consiste em uma sequência de nu- cleotídeos contínua que contém uma mutação em um fator de iniciação da tradução do gene eIF(iso)4E ou uma sequência totalmente complementar à sequência de nucelotídeos contínua, a mutação causando a produção de uma proteína do fator de iniciação da tradução eIF(iso)4E que é não funcional em relação a um vírus ou supressão da expressão do gene eIF(iso)4E do fator de iniciação da tradução, em que o vírus é uma cepa do Potato virus Y, a cepa que quebra a resistência do vírus da Virgem A mutante do tabaco, em que a mutação é uma ou mais das seguintes mutações (1) a (26): (1) substituição de C para T na posição 264, (2) substituição de G para A na posição 289, (3) substituição de G para A na posição 290, (4) substituição de G para A na posição 298, (5) substituição de G para A na posição 299, (6) substituição de C para T na posição 315, (7) substituição de G para A na posição 328, (8) G para substituição A na posição 329, (9) substituição C para T na posição 342, (10) substituição G para A na posição 379, (11) substituição G para A na posição 380, (12) substituição C para T na posição 1630 , (13) G para A substituição na posição 1703, (14) G para A substituição na posição 1704, (15) G para A substituição na posição 1736, (16) G para A substituição na posição 1737, (17) G para Uma substituição na posição 1778, (18) G para A substituição na posição 1779, (19) C para T substituição na posição 1940, (20) C para T substituição na posição 1994, (21) G para A substituição na posição 2013, (22) Substituição de G para A na posição 2014, (23) substituição de C para T na posição 2042, (24) substituição de G para A na posição 3224, (25) substituição de G para A na posição 3225 e (26) substituição de C para T na posição 3406, em uma iniciação de tradução gene do fator eIF(iso)4E que consiste em uma sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID NO: 8 no DNA genômico..
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