JPWO2015136689A1 - 磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に用いられる磁性体粒子71は、磁場の作用によって、液体中あるいはゲル状媒体中において、凝集、分散、移動等の操作を行い得るものである。磁性体としては、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。具体的には、マグネタイト(Fe3O4)、ヘマタイト(Fe2O3、またはαFe2O3)、マグヘマイト(γFe2O3)、チタノマグネタイト(xFe2TiO4・(1−x)Fe3O4、イルメノヘマタイト(xFeTiO3・(1−x)Fe2O3、ピロタイト(Fe1−xS(x=0〜0.13)‥Fe7S8(x〜0.13))、グレイガイト(Fe3S4)、ゲータイト(αFeOOH)、酸化クロム(CrO2)、パーマロイ、アルコニ磁石、ステンレス、サマリウム磁石、ネオジム磁石、バリウム磁石が挙げられる。
本発明に用いられる磁性固体60は、磁性体であればその材料は特に限定されず、上記磁性体粒子を構成する磁性体として例示したのと同様に、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。磁性固体の形状は特に限定されず、球状、多面体状、偏平形状、棒状等であってもよい。
本発明では、容器10内に充填された液体層内で、磁性体粒子の操作が行われる。容器内で磁性固体を移動可能であり、液体やゲル状媒体を保持できるものであれば、その材質や形状は特に限定されない。例えば内径1〜2mm程度、長さ50mm〜200mm程度の直管状構造体(キャピラリー)や、幅1〜2mm程度、深さ0.5〜1mm程度、長さ50mm〜200mm程度の直線状溝が形成された平面板材の上面に、別の平面板材を貼り合わせた構造体等が用いられる。
液体層31,32を構成する液体は、磁性体粒子表面に固定された目的物質の、抽出、精製、反応、分離、検出、分析等の化学操作の場を提供する。液体の種類は特に限定されないが、ゲル状媒体を溶解しないものが好ましい。そのため、液体としては、水溶液や、水と有機溶媒の混合溶液等の水系液体が好ましく用いられる。液体は、これら化学操作のための単なる媒体として機能し得る他に、化学操作に直接関与するか、あるいは当該操作に関与する化合物を成分として含んでいてもよい。液体に含まれる物質としては、磁性体粒子に固定された反応性物質と反応する物質、当該反応によって磁性体粒子の表面に固定された物質と更に反応する物質、反応試薬、蛍光物質、各種の緩衝剤、界面活性剤、塩類、およびその他の各種補助剤、並びに、アルコール等の有機溶剤等を例示することができる。水系液体は、水、水溶液、水懸濁液等の任意の態様で提供され得る。容器中に、ゲル状媒体層を間に介して複数の液体層が装填される場合、各液体層を構成する液体は同一であってもよく、異なるものでもよい。
ゲル状媒体層21を形成するゲル状媒体は、粒子操作前においてゲル状、若しくはペースト状であればよい。前述のごとく、ゲル状媒体は、液体層31,32の液体に不溶性または難溶性であり、化学的に不活性な物質であることが好ましい。
容器内へのゲル状媒体および液体の装填は、適宜の方法により行い得る。管状の容器が用いられる場合、装填に先立って容器の一端の開口が封止され、他端の開口部からゲル状媒体および水系液体が順次装填されることが好ましい。内径が1〜2mm程度のキャピラリーのような小さな構造体へ、ゲル状媒体を装填する場合、例えば、アーロック式シリンジに金属製注射針を装着して、キャピラリー内の所定位置へゲル状媒体を押し出す方法により、装填が行われる。
容器内へのゲル状媒体および液体の装填は、粒子操作の直前に行われてもよく、粒子操作前に十分な時間をおいて行われてもよい。前述のように、ゲル状媒体が液体に不溶または難溶である場合は、装填後に長時間が経過しても、両者の間での反応や吸収はほとんど生じない。本発明の磁性体粒子操作用デバイスは、液体およびゲル状媒体が予め容器内に装填された状態で提供することができる。また、デバイス内に予め磁性体粒子や磁性固体を装填した状態で提供することもできる。
本発明では、目的物質が固定された磁性体粒子71を、第一の液体層31からゲル状媒体層21内へ移動させることにより、固液分離(B/F分離)を行い得る。また、ゲル状媒体層21中の磁性体粒子を、第二の液体層32へ移動させることによって、目的物質の抽出、精製、反応、分離、検出、定性・定量分析等の化学操作を行い得る。このような磁性体粒子の操作は、各種分析に先立って行われる前処理や、目的物質の分取(分離)処理、溶解処理、混合処理、希釈処理、撹拌処理、温度調節(加熱あるいは冷却)処理等へも適用可能である。
以下では、図2を参照しながら、核酸の分離・精製を行う例について説明する。図2(A)に示す管状デバイス150では、磁性体粒子171を移動させる方向に沿って、核酸抽出液131、第一の洗浄液132、第二の洗浄液133、および核酸溶出液134が、それぞれの間にゲル状媒体層121,122,123を介して、管状の容器110内に装填されている。
核酸の抽出を行うために用いられる核酸抽出液131としては、カオトロピック物質、EDTA等のキレート剤、トリス塩酸等を含有する緩衝液が挙げられる。また、核酸抽出液には、TritonX−100等の界面活性剤を含めることもできる。オトロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素等が挙げられる。カオトロピック塩は強力な蛋白変性剤で細胞のタンパク質を溶解させ細胞核内の核酸を液中に遊離させる働きがある上、核酸分解酵素の働きを抑える効果がある。また、プロテアーゼK等のタンパク質分解酵素を用い、核酸と結合している核タンパク質の分解を行うことにより、核酸の純度および回収率を向上し得る。
核酸抽出液中で磁性体粒子を十分に分散させ、磁性体粒子の表面に目的物質である拡散を固定化した後、核酸抽出液131の容器側面に磁石9を近付けると、磁石9周辺の容器内壁面に、磁性体粒子171が引き寄せられる(図2(B))。核酸抽出液中には試料由来の変性タンパク質等が含まれているため、磁石に引き寄せられた磁性体粒子は凝集体を形成する傾向がある。
第一の洗浄液132および第二の洗浄液133は、核酸が粒子表面に固定された状態を保持したまま、試料中に含まれる核酸以外の成分(例えばタンパク質、糖質等)や、核酸抽出等の処理に用いられた試薬等を洗浄液中に遊離させ得るものであればよい。洗浄液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液等が挙げられる。第一の洗浄液と第二の洗浄液の組成は、同一でもよく異なっていてもよい。
核酸溶出液としては、水または低濃度の塩を含む緩衝液を用いることができる。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、蒸留水等を用いることができる。中でも、pH7〜9に調整された5〜20mMトリス緩衝液を用いることが一般的である。核酸が固定された粒子が核酸溶出液中に移動することにより、粒子表面から核酸を遊離させることができる。核酸が固定された粒子から核酸を溶出させる具体的方法は、上記溶出液中で粒子を懸濁させる方法が挙げられる。懸濁方法、懸濁のための撹拌時間、溶出時の温度等の溶出条件は、核酸の回収量を増加させ得るように適宜決定することができる。
<管状操作デバイスの作製>
ポリプロピレン製の管状容器110(内径1.8mm)に、溶出液134(1mM EDTA、10mM トリス塩酸緩衝液 pH8.0)200μL;ゲル状媒体層123;第二の洗浄液133(0.5M NaCl、70%エタノール)200μL、ゲル状媒体層122;第一の洗浄液132(4mM 塩酸グアニジン、30%エタノール)200μL;ゲル状媒体層121;および核酸抽出液131(4mM塩酸グアニジン、5%(w/v)Triton X−100、50mMトリス塩酸緩衝液 pH7.0、)を、底部から順に装填した(図2(A)参照)。
抗凝固剤としてEDTAが添加されたヒト全血50μLを、管状デバイスの開口部から、核酸抽出液131内に投入した。マイクロピペットを用いて核酸抽出液内で血液および磁気ビーズを十分に撹拌することで、DNAを遊離させ、磁気ビーズの表面に吸着させた。その後、容器110の開口部を蓋で閉じ、容器を密閉系とした。
実施例1と同様に、管状容器内に水系液体層とゲル状媒体層とが交互に重層された管状デバイスを作製した。ただし、比較例1では、ゲル状媒体層121内への金属球の装填が行われなかった。このデバイスを用いて、実施例1と同様に磁石を移動させることによる粒子操作を行った。比較例1でも、実施例1と同様に、洗浄液132,133および核酸溶出液134の側面で磁石を往復運動させたが、磁気ビーズは凝集状態を保っており、液体層内で分散されなかった。
比較例2では、ゲル状媒体層を備えるデバイスを用いずに、磁気ビーズを用いた核酸抽出キット(東洋紡製 「MagExtractorTM−Genome」)の標準プロトコールに従って、ピペット操作により、全血からのDNAの抽出を行った。
各実施例および比較例で回収した溶出液のUV吸収スペクトルを、分光光度計(島津製作所製「BioSpec nano」)により測定した。結果を図3に示す。また、UV吸収スペクトルから求めた、波長230nm、260nm、280nmにおける吸光度の比(A260/A280、およびA260/A230)を表1に示す。
上記実施例1で磁性固体として用いたSUS403製の金属球を、2M塩酸グアニジンを含む核酸抽出用の緩衝液(50μL)に浸漬し、1週間後に目視観察したところ、金属球表面が腐食していた。実施例1では、管状操作デバイス内に磁性固体を装填後、直ちにDNA抽出操作を行うため、金属球をそのまま用いても問題がなかったが、金属球が高塩濃度溶液等に長時間接触する場合(例えば、デバイスを作成後、実用に供するまでに長時間保管される場合)は、金属球の腐食が懸念される。そこで、実施例2では、金属球の表面に、二液室温硬化型のエポキシ系接着剤を塗布し、10分間室温で乾燥・硬化させたものを磁性固体として用いた。エポキシ樹脂層がコーティングされた金属球を、2M塩酸グアニジンを含む核酸抽出用の緩衝液(50μL)に浸漬し、1週間後に目視にて観察したところ、浸漬前と変化がなく、腐食はみられなかった。
磁性固体として、SUS403製の粒径1.2mmの金属球をそのまま用いる代わりに、上記のエポキシ樹脂層がコーティングされた金属球を、2M塩酸グアニジンを含む核酸抽出用の緩衝液に1週間浸漬したものを用いた。それ以外は上記実施例1と同様に、管状操作デバイスを作製し、磁場操作によりDNAの抽出を行った。
10 容器
21 ゲル状媒体層
31,32 液体層
60 磁性固体
71〜73 磁性体粒子
9 磁石
150 核酸抽出用粒子操作デバイス
110 管状容器
121〜123 ゲル状媒体(シリコーンゲル)
131 液体層(核酸抽出液)
132,133 液体層(洗浄液)
134 水系液体(核酸溶出液)
160 磁性固体(金属球)
171 磁性体粒子(磁気ビーズ)
Claims (11)
- 磁性体粒子を操作する方法であって、
液体層内に、磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを共存させ、
磁場操作によって、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が、前記液体層内で移動させられる、磁性体粒子の操作方法。 - 前記磁性固体は、粒径が50μm以上である、請求項1に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記磁性固体の粒径が、前記磁性体粒子の粒径の10倍以上である、請求項1または2に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記磁性固体は、金属の表面に、前記液体層内での腐食を防止するためのコーティング層を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記磁性体粒子は、特定の目的物質を選択的に固定し得る粒子であり、
前記磁性体粒子に前記目的物質が固定された状態で、磁場操作によって、前記磁性固体と共に前記磁性体粒子が、前記液体層内を移動させるステップが実施される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の磁性体粒子の操作方法。 - 前記磁性体粒子が選択的に固定し得る前記目的物質が、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される1以上である、請求項5に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記液体層内で、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が移動させられることにより、前記磁性体粒子に固定された前記目的物質の溶出が行われる、または、前記磁性体粒子に前記目的物質が固定された状態を保持したまま洗浄が行われる、請求項5または6に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 磁場操作によって、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が、前記液体層内で往復運動させられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 容器内にゲル状媒体層と液体層とが交互に配置されたデバイス内において、
磁場操作により、第一の液体層内の磁性体粒子が、ゲル状媒体内へ移動させられるステップ;
磁場操作により、ゲル状媒体層の内部に存在する前記磁性体粒子が、第二の液体層内へ移動させられるステップ;および
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が前記第二の液体層内において移動させられるステップ、
を有する、磁性体粒子の操作方法。 - 容器内に、ゲル状媒体層と液体層とが交互に配置されており、
さらに、前記容器内において移動されるべき磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを有する、磁性体粒子操作用デバイス。 - 請求項10に記載の粒子操作用デバイスを作製するためのキットであって、
液体;ゲル状媒体;磁性体粒子;および前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体、を含む、磁性体粒子操作デバイス作製用キット。
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