JPWO2012108408A1 - ジペプチド及びトリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

Ｎ−保護中性アミノ酸をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルとした後、中性アミノ酸と反応させて末端アミノ基が保護されたジペプチドを合成し、次いで、Ｎ脱保護を行った後、得られたジペプチドを、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの存在下に、Ｎ−保護グルタミン酸無水物と反応させることを含むＮ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドの製造方法によれば、グルタミン酸γ−トリペプチドを効率的に製造できる。

Description

本発明は、Ｖａｌ-Ｇｌｙなどのジペプチド、及びこれから得られるγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸またはアミノ酸誘導体）などのトリペプチドを効率的に製造する方法に関する。

γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘは上記の通りである）などペプチド類は、コク味を有するペプチドとして発見され、食品分野における応用が期待されている（特許文献１）。
γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ型のペプチドのうち、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの製造方法として、特許文献１に完全保護法による合成方法が開示されているが、保護アミノ酸が高価であり、スケールアップが困難なため、その合成方法の改善が要望されている。
一方、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙのように、N末アミノ酸であるグルタミン酸のγ位と縮合したペプチド（以下、「γ−グルタミルペプチド」という。）の合成に関して、グルタミン酸が縮合可能なカルボン酸基を２つ有するため、N−保護グルタミン酸からγ−グルタミルペプチドを選択的に製造することには課題があった。
すなわち、Ｎ−保護グルタミン酸をＮ−保護グルタミン酸無水物とし、アミノ酸と反応させると、α／γ＝２．０／１．０〜３．０／１．０とα−ペプチドが優位的に得られることが報告されている。またＮ−フタロイルグルタミン酸無水物はアミノ酸と反応させるとγ−ペプチドが選択的に得られるが、脱保護に変異原性を有するヒドラジンが必須であり、商業生産には不適であった。
また、Ｎ−保護グルタミン酸γ−誘導体の製法に関し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの存在下にＮ−保護グルタミン酸無水物とアミノ酸またはその誘導体とを反応させる方法が知られている（特許文献２）。しかしながら、この方法が、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの製法においても好適に適用可能であるか否か、すなわち、Ｎ−保護グルタミン酸無水物とＸ−Ｇｌｙ型のペプチドとの反応に好適に適応可能であるか否かは明確ではない。
したがって、効率的かつ経済的に、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙを製造する方法が求められている。

ＷＯ２００７／０５５３９３号公報 特開平０８−１１９９１６号公報

本発明は、中性アミノ酸を２分子結合させてなるジペプチドを効率的に製造できる方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、グルタミン酸γ−トリペプチドを効率的に製造できる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、Ｎ−保護中性アミノ酸をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させて活性エステルであるＮ−保護アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを形成せしめ、さらに、中性アミノ酸と反応させると、特に、ｐＨ８.５〜１１.５の条件下で反応させると、効率的に末端アミノ基の１つが保護されたジペプチドを製造できることを見出した。さらに、このジペプチドを原料として、末端アミノ基の脱保護（Ｎ脱保護）を行った後に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの存在下に、Ｎ−保護グルタミン酸無水物と反応させると、効率的かつ高選択的にＮ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドを製造できることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成したのである。
すなわち、本発明は、Ｎ−保護中性アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルに、中性アミノ酸を反応させることを特徴とする末端アミノ基が保護されたジペプチドの製造方法を提供する。

本発明は、又、上記方法で得たジペプチドのＮ脱保護を行うジペプチドの製造方法を提供する。
本発明は、又、上記方法でＮ脱保護して得られたジペプチドを、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの存在下に、Ｎ−保護グルタミン酸無水物と反応させることを特徴とするＮ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドの製造方法を提供する。
本発明は、又、Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシン、またはその塩を提供する。更には、Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンの結晶を提供する。
本発明は、又、上記方法で得たトリペプチドのＮ脱保護を行うグルタミン酸γ−トリペプチドの製造方法を提供する。
本発明は、又、バリルグリシンを、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの存在下に、Ｚ−グルタミン酸無水物と反応させることを特徴とするＺ−γ−グルタミルバリルグリシンの製造方法を提供し、更には、得られたＺ−γ−グルタミルバリルグリシンのＮ脱保護を行うγ−グルタミルバリルグリシンの製造方法を提供する。

本発明によれば、反応時間が短く、副生物の少ないジペプチドを製造することができる。又、本発明によれば、使用原料が安価でかつ反応操作が簡便であるにも係わらず、効率的かつ高選択的にＮ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドを製造できるという利点がある。

Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンＡ晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを示す。 Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンＢ晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを示す。 Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンＣ晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを示す。 Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンＤ晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを示す。 Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンＥ晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを示す。 Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンＦ晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを示す。 γ−グルタミルバリルグリシン結晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを示す。

本発明で対象とする中性アミノ酸としては、側鎖にアミノ基もしくはカルボキシル基を有しないアミノ酸をいい、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、β−アラニン、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、２−アミノブタン酸（Ａｂｕ）、プロリン（Ｐｒｏ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）等があげられる。これらのうち、グリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルバリン、２-アミノブタン酸が好ましい。
ここで、Ｎ−保護中性アミノ酸としては、上記中性アミノ酸のアミノ基を、例えばベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ホルミル基等の保護基で保護したものがあげられる。本発明において用いるもう１つの中性アミノ酸としては、アミノ基とカルボキシル基のいずれもが保護されていないもの、すなわちフリーの中性アミノ酸を用いるのが好ましい。本発明では、中性アミノ酸として、Ｎ−保護されたものと同じ又は異なったアミノ酸を用いることができる。

Ｎ−保護中性アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルは、Ｎ−保護中性アミノ酸を酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの有機溶媒中、０．５〜２倍モル、好ましくは１．０〜１．２倍モルのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと０．５〜２倍モル、好ましくは１．０〜１．２倍モルのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ．ＨＣｌ）等の縮合剤と反応させて得ることができる。
Ｎ−保護中性アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルと中性アミノ酸の反応は、例えば、Ｎ−保護中性アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルに対して、０．５〜２倍モル、好ましくは０．８〜１．２倍モルの中性アミノ酸を、溶媒中、−２０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃で３０分〜２４時間行うのがよい。
この際、反応をｐＨ８.５〜１０.５の条件下で行うのが好ましく、より好ましくは８．５〜９．５未満で行うのがよい。また、反応が低温で行われる場合は、ｐＨ９．５〜１０．５で行うことも好ましい。
反応に用いられる溶媒としては、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒があげられる。
これら溶媒は混合して用いてもよく、また水との混合溶媒を用いてもよい。

本発明では、次いで、上記の方法で得たジペプチドのＮ脱保護を常法により行う。例えば、保護基がベンジルオキシカルボニル基の場合は、上記の方法で得たジペプチド反応液をアルゴン置換し、パラジウム炭素を加えて、水素置換してＮ脱保護させるのがよい。
本発明では、次いで、上記の方法でＮ脱保護して得られたジペプチドを、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの存在下に、Ｎ−保護グルタミン酸無水物と反応させて、Ｎ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドを製造する。尚、Ｎ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドは、Ｎ−保護グルタミン酸のγ位がジペプチドに結合しているトリペプチドを意味する。
また、本発明の方法で得られうるＮ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドのうち、Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンは新規化合物であり、γ-グルタミルバリルグリシンの製造中間体としてきわめて有用である。また、γ-グルタミルバリルグリシンの製造にあたり、Ｚ−γ-グルタミルバリルグリシンの結晶を取得してもよいが、その場合精製がきわめて容易となり、純度の高いγ-グルタミルバリルグリシンを製造することができる。
例えば、Ｚ−γ-グルタミルバリルグリシンの結晶（Ａ晶）は、粉末Ｘ線回折パターンにおいて、１０．９、１６．３、１９．２、１９．７、２０．３の回折角（２θ）にピークを示すことを特徴とする。

ここで、Ｎ−保護グルタミン酸無水物は、Ｎ−保護グルタミン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）、無水酢酸等の脱水剤で処理するなどの常法により製造することができる。
上記ジペプチドとＮ−保護グルタミン酸無水物の反応は、例えば、Ｎ−保護グルタミン酸無水物に対して、０．５〜２倍モル、好ましくは０．８〜１．２倍モルのジペプチドを、０．２〜２倍モル、好ましくは０．５〜１．２倍モルのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）の存在下に、溶媒中、−２０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃で３０分〜２４時間行うのがよい。
この際、反応を炭酸アルカリ金属塩の存在下で行うのが好ましい。炭酸アルカリ金属塩には、正塩（炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど）又は、炭酸水素塩（炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなど）が含まれる。好ましくは炭酸水素ナトリム、炭酸水素カリウムである。炭酸アルカリ金属塩は、Ｎ−保護グルタミン酸に対して、１．０〜１．２倍モルの量を用いるのが好ましい。
反応に用いられる溶媒としては、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒があげられる。
これら溶媒は混合して用いてもよく、また水との混合溶媒も用いてもよい。

上記の方法で得たトリペプチドのＮ脱保護は、常法により行う。例えば、ジペプチドの場合について説明したのと同様に、保護基がベンジルオキシカルボニル基の場合は、上記の方法で得たトリペプチド反応液をアルゴン置換し、パラジウム炭素を加えて、水素置換してＮ脱保護させるのがよい。
さらに、グルタミン酸γ−トリペプチドのγ体の比率を高めるために、粗グルタミン酸γ−トリペプチドを水に溶解しメタノールを加えて、晶析して、α体を除去するのがよい。又、副生するα体を、保護基の除去前でも除去後でも、結晶化、クロマトグラフィーなどの常用の方法によりγ−体から分離してもよい。
尚、本発明の方法により製造されるＺ−γ−グルタミルバリルグリシンの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などがあげられる。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

実施例１ Ｖａｌ−Ｇｌｙの合成
下記のスキーム１に基づいて、Ｖａｌ−Ｇｌｙを合成した。
スキーム１

(1)Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）−バリンのヒドロキシコハク酸イミドエステルの合成
Ｚ−バリン２０ｇ（７９．６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル１２０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）９．１８ｇ（１ｅｑ）を加えて５℃に冷却した。Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド１６．４２ｇ（１ｅｑ）を酢酸エチル５０ｍｌに溶解して、１０℃以下でゆっくりと加えた。５℃で３０分、室温（２５℃）で一晩撹拌した。析出したジシクロヘキシル尿素をろ過により分離し、酢酸エチル３０ｍｌで洗浄した。目的のＺ−バリンコハク酸イミドエステルを酢酸エチル溶液として得た。

(2)バリルグリシンの合成(Ｒｕｎ１)
グリシン ６．２８ｇ（１．０５ｅｑ）に水５５ｍｌを加えて溶解し、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０に調整した。この溶液にＺ−バリンのヒドロキシコハク酸イミドエステルの酢酸エチル溶液を室温（２０−２５℃）で１時間かけて滴下、その後１時間撹拌した。その間４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５−９．５未満に調整した。６Ｍ塩酸を加えて撹拌、ｐH８に調整した。反応液をアルゴン置換後、５０％ｗｅｔ１０％パラジウム炭素０．４ｇを加えて、水素置換して一晩室温で撹拌した。アルゴン置換後、パラジウム炭素を分離により除いた。反応液を分層して、バリルグリシンの水溶液を得た。収率９５．６％
(２−１) バリルグリシンの合成（Ｒｕｎ２〜６）
Ｒｕｎ１の条件を変化させて、バリルグリシンを合成した。変更した合成条件と結果をまとめて、表１に示す。
表１

尚、Ｒｕｎ６は、次のようにして行った。
グリシン１．５７ｇ（１．０５ｅｑ）に水２５ｍｌを加えて溶解し、炭酸水素ナトリウム５．１ｇ（３．０ｅｑ）を加えて撹拌した。この溶液にＺ−バリンのヒドロキシコハク酸イミドエステルの酢酸エチル溶液（１９．９ｍｍｏｌ）を加えて４０℃で１８時間撹拌した。６Ｍ塩酸を加えて撹拌、ｐH８に調整した。反応液をアルゴン置換し、５０％ｗｅｔ１０％パラジウム炭素０．０５ｇを加えて、水素置換して一晩室温で撹拌した。反応液をアルゴン置換後、パラジウム炭素を分離により除いた。反応液を分層して、バリルグリシンの水溶液を得た。収率８７．４％

実施例２ γ−グルタミルバリルグリシン（γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）の合成
まず、下記のスキーム２に基づいて、Ｚ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ）を合成した。
スキーム２

(3)Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンの合成（粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシン結晶単離）
Ｚ−グルタミン酸２４．６３ｇ（１．１ｅｑ ｖｓ Ｚ−Ｖａｌ）に酢酸エチル１４８ｍｌを加えて撹拌、５℃に冷却した。Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド１８．１ｇ（１ｅｑ）を酢酸エチル６２ｍｌに溶解して、１０℃以下でゆっくりと加えた。５℃で３０分、室温（２５℃）で一晩撹拌した。析出したジシクロヘキシル尿素をろ過により分離し、酢酸エチル３７ｍｌで洗浄した。Ｚ−グルタミン酸無水物の酢酸エチル溶液を得た。
実施例１のＲｕｎ３で製造したバリルグリシン水溶液（ＨＯＳｕを含む）に炭酸水素ナトリウム７．３６ｇ（１．０ｅｑ ｖｓ Ｚ−Ｇｌｕ）を加えて溶解し、そこにＺ−グルタミン酸無水物の酢酸エチル溶液を１．５時間かけて室温で滴下した。滴下終了後１時間撹拌し、分層、Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンの水溶液を得た。収率８４．８％ γ／α＝９６．４／３．６
水２４０ｍｌに６Ｍ塩酸３４．５ｍｌ（２．６ｅｑ）を加えて撹拌し、そこへ上記で得たＺ−γ−グルタミルバリルグリシン水溶液を９時間かけてゆっくりと滴下、滴下後一晩室温で撹拌した。析出した結晶を分離、水１２０ｍｌで洗浄し、ｗｅｔ晶７８．９５ｇ得た。４０℃で一晩減圧乾燥し１３．８２ｇの粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンの結晶（Ａ晶）を得た。収率６８．８％ γ／α＝９７．２／２．８

なお、Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンには以下のＡ晶〜Ｆ晶の結晶多形があることを見出した。これらのうち、結晶としては、Ｅ晶が好ましい。主要ピーク［回折角（２θ）］、製造例と共に以下に示す。又、これらのＡ晶〜Ｆ晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを、図１〜６に示す。
Ａ晶：酸性晶析した結晶（１０．９、１６．３、１９．２、１９．７、２０．３）
Ｂ晶：メタノールでスラリー洗浄して得られる結晶（６．０、７．３，８．３，１５．０，２０．０）
(３)で得た粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンのＡ晶（０．３ｇ）にメタノール１．５ｍｌを加えて２０℃で３日間撹拌した。結晶を分離、４０℃で一晩減圧乾燥し０．２ｇのＺ−γ−グルタミルバリルグリシンの結晶（Ｂ晶）を得た。
Ｃ晶：Ａ晶をエタノールで再晶析した結晶（６．１、１５．１、１７．７、２４．６、２６．９）
(３)で得た粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンのＡ晶（１．０ｇ）にエタノール１０ｍｌを加えて３０℃で３時間、さらに５０℃で１時間撹拌した。その後６時間かけて２０℃まで冷却し、一晩２０℃で撹拌した。結晶を分離、４０℃で一晩減圧乾燥し０．８５ｇのＺ−γ−グルタミルバリルグリシンの結晶（Ｃ晶）を得た。

Ｄ晶：Ｂ晶をエタノールで再晶析した結晶（６．６、６．７、１９．０、１９．５、３１．９）
粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンのＢ晶（６．０ｇ）にエタノール１０８ｍｌを加えて６５℃で１時間撹拌した。その後１０時間かけて１０℃まで冷却し、一晩１０℃で撹拌した。結晶を分離、４０℃で一晩減圧乾燥し３．８ｇのＺ−γ−グルタミルバリルグリシンの結晶（Ｄ晶）を得た。
Ｅ晶：Ａ晶をメタノールで再晶析した結晶（８．５、１４．１、１８．０、２１．６、２２．９）
上記(３)で得た粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンにメタノール７３．３ｍｌを加えて４０℃で３時間撹拌した。その後３時間かけて１０℃まで冷却し、一晩１０℃で撹拌した。結晶を分離、メタノール１２ｍｌで洗浄、４０℃で一晩減圧乾燥し８．０ｇのＺ−γ−グルタミルバリルグリシンの結晶を得た。収率４５．５％ γ／α＝９９．９／０．１
¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；１．７０−１．８１（１Ｈ，ｍ）；１．９３−１．９８（２Ｈ，ｍ）；２．１８−２．３６（２Ｈ，ｍ）；３．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．５，５．８Ｈｚ）；３．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．５，５．９）；３．９０−４．０２（１Ｈ，ｍ）；４．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．９，６．７Ｈｚ）；５．０３（１Ｈ，ｓ）；７．２６−７．４２（５Ｈ，ｍ）；７．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；７．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）；８．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９，５．８Ｈｚ）
¹³Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ１８．３，１９．５，２７．３，３０．８，３２．０，４０．９，５３．８，５７．８，６５．８，１２８．１，１２８．２，１２８．７，１３７．４，１５６．５，１７１．５，１７１．７８，１７１．８４，１７４．０
Ｍａｓｓ（Ｍ＋Ｈ）：４３８ Ｍａｓｓ（Ｍ−Ｈ）：４３６
Ｆ晶：Ｂ晶を酸性で再晶析した結晶（６．６、１３．５、１５．２、２０．９）
粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシンのＢ晶（１．０ｇ）にメタノール８ｍｌとＺ−グルタミン酸（３５ｍｇ）を加えて４０℃で１時間撹拌した。その後３時間かけて１０℃まで冷却し、一晩１０℃で撹拌した。結晶を分離、４０℃で一晩減圧乾燥し０．３５ｇのＺ−γ−グルタミルバリルグリシンの結晶（Ｆ晶）を得た。

次いで、下記のスキーム３に基づいて、γ−Ｇｌｕ-Ｖａｌ−Ｇｌｙを合成し、単離・精製した。
スキーム３

(４-1)γ−グルタミルバリルグリシン（単離・精製されたＺ体を使用）
Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシン（Ｅ晶）７．５ｇに水８０ｍｌ、メタノール８０ｍｌを加えて懸濁し、アルゴン置換した。５０％ｗｅｔ１０％パラジウム炭素０．２ｇを加えて水素置換し、４０℃で一晩撹拌した。反応液をアルゴン置換後、パラジウム炭素を分離により除いた。ろ過液を約５０ｍｌまで減圧濃縮した。ミリポア（０．４５μｍ）ろ過により不溶物を分離、ろ液を約１８．５ｇまで減圧濃縮した。濃縮液を５０℃に加温し撹拌した。メタノール５６ｍｌを３０分かけて滴下し、滴下後５０℃で２時間撹拌後、室温で一晩撹拌した。析出した結晶を分離し、メタノール８ｍｌで洗浄した。４０℃で一晩減圧乾燥して４．５６ｇのγ−グルタミルバリルグリシンの結晶を得た。収率３７．６％ ｆｒｏｍ Ｚ−Ｖａｌ γ／α＝９９．９／０．１
¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；１．９９−２．１０（３Ｈ，ｍ）；２．４０−２．５０（２Ｈ，ｍ）；３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）；３．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．８Ｈｚ）；３．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．８Ｈｚ）；４．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；
¹³Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ１７．７，１８．７，２６．５，３０．３，３１．５，４１．７，５４．２，６０．０，１７３．９，１７４．０，１７４．５，１７５．３
Ｍａｓｓ（Ｍ＋Ｈ）：３０４ Ｍａｓｓ（Ｍ−Ｈ）：３０２

(４-2)γ−グルタミルバリルグリシン（Ｚ体単離・未精製）
ｗｅｔ粗Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシン４４．０ｇ（ｎｅｔ１２．０８ｇ、γ／α＝９６．１／３．９）に水５４ｍｌ、酢酸エチル６０．４ｍｌ、メタノール３０．２ｍｌを加えて懸濁し、アルゴン置換した。５０％ｗｅｔ１０％パラジウム炭素０．２４ｇを加えて水素置換し、４０℃で一晩撹拌した。反応液をアルゴン置換後パラジウム炭素を分離により除いた。ろ過液を分層し、水層を約６０ｍｌまで減圧濃縮した。ミリポア（０．４５μｍ）ろ過により不溶物を分離、ろ液を約３０ｇまで５０℃以下で減圧濃縮した。濃縮液を５０℃に加温し、種付けをして１時間室温で撹拌した。メタノール５４．４ｍｌを３０分かけて滴下し、滴下後５０℃で２時間、２０℃で一晩撹拌した。析出した結晶を分離し、メタノール１２．１ｍｌで洗浄した。４０℃で一晩減圧乾燥して６．８８ｇのγ−グルタミルバリルグリシンの結晶を得た。収率５７．０％ ｆｒｏｍ Ｚ−Ｖａｌ γ／α＝９９．２／０．８であった。

(４-3)γ−グルタミルバリルグリシン（Ｚ体非単離・抽出）
Ｚ−グルタミン酸２４．６４ｇ（１．１ｅｑ）に酢酸エチル１２０ｍｌを加えて５℃に冷却、ジシクロヘキシルカルボジイミド１８．１ｇ（１．０ｅｑ ｖｓ Ｚ−Ｇｌｕ）を酢酸エチル４０ｍｌに溶解して加えた。５℃で３０分、室温で一晩撹拌した。析出したジシクロヘキシル尿素をろ過により除き、酢酸エチル４０ｍｌで洗浄、Ｚ−グルタミン酸無水物の酢酸エチル溶液を得た。
バリルグリシン水溶液（ＨＯＳｕを含む）に炭酸水素ナトリウム７．３６ｇ（１．０ｅｑ ｖｓ Ｚ−Ｇｌｕ）を加え撹拌し、上記で調製したＺ−グルタミン酸無水物の酢酸エチル溶液を１．５時間かけて滴下した。滴下後１時間室温で撹拌し、ＴＨＦ７０ｍｌを加えて４０℃に加温した。濃塩酸２２ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整し抽出した。分層し酢酸エチル層を水１００ｍｌで洗浄した。酢酸エチル層に水１２０ｍｌ、５０％ｗｅｔ１０％パラジウム炭素０．７５ｇを加えて水素置換し、４０℃で撹拌脱保護した。反応終了後、パラジウム炭素をろ過し分層した。水層を１００ｍｌまで減圧濃縮しミリポアろ過（０．４５μｍ）により不溶物を除き、再度５０ｇまで減圧濃縮した。５０℃に加温しメタノール６０ｍｌを滴下、終了後５０℃で３時間、室温で一晩撹拌、晶析した。析出した結晶を分離（ｗｅｔ２５．９３ｇ）し、メタノール３０ｍｌで洗浄した。５０℃で一晩減圧乾燥して、γ−グルタミルバリルグリシンの結晶１７．７３ｇを得た。収率６７．４％ γ／α＝９９．６／０．４

(４-4)γ−グルタミルバリルグリシンの精製
上記γ−グルタミルバリルグリシンの結晶に水７０ｍｌを加えて６０℃に加熱溶解した。不溶物をミリポアろ過（０．４５μｍ）し６２ｇまで減圧濃縮した。５０℃に加熱しメタノール８８ｍｌを加えて種晶を添加、５０℃で３時間、室温で一晩撹拌、晶析した。析出した結晶を分離（ｗｅｔ１８．２ｇ）し、メタノール３５ｍｌで洗浄した。５０℃で一晩減圧乾燥して、γ−グルタミルバリルグリシンの結晶１４．９ｇを得た。収率５８．０％ γ／α＝９９．９／０．１
γ−グルタミルバリルグリシンの結晶の粉末Ｘ線結晶回折パターンを図７に示す。

実施例３ ノルバリルグリシン及びγ−グルタミルノルバリルグリシンの合成
(1)Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）−ノルバリンのヒドロキシコハク酸イミドエステルの合成
Ｚ−ノルバリン１０ｇ（３９．８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル６０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）４．５９ｇ（１ｅｑ）を加えて５℃に冷却した。Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド８．２１ｇ（１ｅｑ）を酢酸エチル２５ｍｌに溶解して、１０℃以下でゆっくりと加えた。５℃で３０分、室温（２５℃）で一晩撹拌した。
析出したジシクロヘキシル尿素をろ過により分離し、酢酸エチル１５ｍｌで洗浄した。目的のＺ−ノルバリンコハク酸イミドエステルを酢酸エチル溶液として得た。
(2)ノルバリルグリシンの合成
グリシン３．１４ｇ（１．０５ｅｑ）に水２８ｍｌを加えて溶解し、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０に調整した。この溶液にＺ−ノルバリンのヒドロキシコハク酸イミドエステルの酢酸エチル溶液を室温（２０−２５℃）で１時間かけて滴下、その後１時間撹拌した。その間４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０−１０．０未満に調整した。６Ｍ塩酸を加えて撹拌、ｐH８に調整した。反応液をアルゴン置換後、５０％ｗｅｔ１０％パラジウム炭素０．２ｇを加えて、水素置換して一晩室温で撹拌した。アルゴン置換後、パラジウム炭素を分離により除いた。反応液を分層して、ノルバリルグリシンの水溶液を得た。収率９０．０％

(３)γ−グルタミルノルバリルグリシン（Ｚ体非単離・抽出）
Ｚ−グルタミン酸１２．３１ｇ（１．１ｅｑ）に酢酸エチル５０ｍｌを加えて５℃に冷却、ジシクロヘキシルカルボジイミド９．０ｇ（１．０ｅｑ ｖｓ Ｚ−Ｇｌｕ）を酢酸エチル１５ｍｌに溶解して加えた。５℃で３０分、室温で一晩撹拌した。析出したジシクロヘキシル尿素をろ過により除き、酢酸エチル２０ｍｌで洗浄、Ｚ−グルタミン酸無水物の酢酸エチル溶液を得た。
ノルバリルグリシン水溶液（ＨＯＳｕを含む）に炭酸水素ナトリウム３．６８ｇ（１．０ｅｑ ｖｓ Ｚ−Ｇｌｕ）を加え撹拌し、上記で調製したＺ−グルタミン酸無水物の酢酸エチル溶液を１．５時間かけて滴下した。滴下後１時間室温で撹拌し、４０℃に加温した。濃塩酸１１ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整し抽出した。分層し酢酸エチル層を水５０ｍｌで洗浄した。酢酸エチル層に水５０ｍｌ、メタノール２５ｍｌ、５０％ｗｅｔ１０％パラジウム炭素０．３７ｇを加えて水素置換し、２０〜２５℃で撹拌脱保護した。反応終了後、パラジウム炭素をミリポアろ過（０．４５μｍ）により除き、４０ｇまで減圧濃縮した。５０℃に加温しメタノール５０ｍｌを滴下、終了後５０℃で３時間、室温で一晩撹拌、晶析した。析出した結晶を分離し、メタノール１２ｍｌで洗浄した。５０℃で一晩減圧乾燥して、γ−グルタミルノルバリルグリシンの結晶８．０９ｇを得た。収率６７．０％ γ／α＝９９．８／０．２

¹Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ０．８１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）； １．２２−１．３８（２Ｈ，ｍ）；１．５５−１．７３（２Ｈ，ｍ）；２．０２−２．１０（２Ｈ，ｍ）；２．３５−２．４８（２Ｈ，ｍ）；３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２ Ｈｚ）；３．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ）；３．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ）； ４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，５．６Ｈｚ）；
¹³Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ１２．７，１８．４，２６．０，３１．１，３３．０，４１．３，５３．７，５３．８，１７３．５，１７４．８，１７５．０；
Ｍａｓｓ（Ｍ＋Ｈ）：３０４ Ｍａｓｓ（Ｍ−Ｈ）：３０２

Claims (10)

1. Ｎ−保護中性アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルと、中性アミノ酸とを、ｐＨ８.５〜１１.５の条件下で反応させることを特徴とする末端アミノ基が保護されたジペプチドの製造方法。
2. Ｎ−保護中性アミノ酸が、Ｎ−保護バリンもしくはＮ−保護ノルバリンであり、中性アミノ酸がグリシンである、請求項１記載のジペプチドの製造方法。
3. Ｎ−保護中性アミノ酸が、Ｎ−保護バリンであり、中性アミノ酸がグリシンである、請求項１記載のジペプチドの製造方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項記載の方法で得たジペプチドのＮ脱保護を行うジペプチドの製造方法。
5. 請求項４に記載の方法でＮ脱保護して得られたジペプチドを、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの存在下に、Ｎ−保護グルタミン酸無水物と反応させることを特徴とするＮ−保護グルタミン酸γ−トリペプチドの製造方法。
6. 反応を炭酸アルカリ金属塩の存在下で行う請求項５記載の方法。
7. 請求項５又は６記載の方法で得たトリペプチドのＮ脱保護を行うグルタミン酸γ−トリペプチドの製造方法。
8. グルタミン酸γ−トリペプチドが、γ−グルタミルバリルグリシンである、請求項７記載の製造方法。
9. グルタミン酸γ−トリペプチドが、γ−グルタミルノルバリルグリシンである、請求項７記載の製造方法。
10. Ｚ−γ−グルタミルバリルグリシン又はその塩。

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