JPWO2007063886A1 - 多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法及び該製造方法により得られる多価不飽和脂肪酸含有リン脂質 - Google Patents

Abstract

二相系での多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法において、生成するリン脂質の収率がよく、分離が簡便で、更に多価不飽和脂肪酸の酸化を抑制する。多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、抗酸化剤とホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含み、極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量であり、リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上３０以下であることを特徴とする多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法。

Description

本発明は、ホスホリパーゼＤを用いた多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法に関する。更に詳しくは、ホスホリパーゼＤを用いた多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法において、抗酸化剤を添加し、更に非極性溶媒と極性溶媒との配合比及びリン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定して反応を行う製造方法に関する。更に本製造方法によって得られた多価不飽和脂肪酸含有リン脂質および該多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を含む油脂に関する。

リン脂質には、その種類に応じて様々な薬効があることが知られており、これまでに多くの研究がなされている。例えば、多価不飽和脂肪酸残基を有するリン脂質の１種であるドコサヘキサエン酸含有ホスファチジルセリンには、学習能の向上効果や環境の変化に順応する知能力を向上させる効果があることが報告されている（特許文献１参照）。

リン脂質は、ホスホリパーゼＤ（以下、ＰＬＤと略す）を触媒とする塩基交換反応により得られることが知られている。ＰＬＤは、例えば、ホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略す）、ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略す）等のようなリン脂質と、受容体であるアルコールとの間の塩基交換反応を触媒する。例えば、アルコールとしてグリセロールを用いた場合には、ホスファチジルグリセロール（以下、ＰＧと略す）が生産される。また、アルコールとしてセリンを用いた場合には、ホスファチジルセリン（以下、ＰＳと略す）が生産される。一方、受容体としてアルコールの代わりに水を用いた場合には、加水分解反応が進行し、ホスファチジン酸（以下、ＰＡと略す）が生産される。

一般的に、ＰＬＤを用いたリン脂質の塩基交換反応は、水相及び有機溶媒相からなる二相系で行われるが、ドコサヘキサエン酸含有ホスファチジルセリン等の人間が服用する成分の製造に、人体に有害な有機溶媒を用いるのは好ましくないため、このような有機溶媒を用いずに塩基交換反応を行う方法が利用されている。

このような方法としては、リン脂質のリポソーム懸濁物、ヒドロキシル基を有する試薬を含有する水性媒体に酵素を溶解し、次いでシリカゲルを添加して攪拌することにより反応を行う方法や（特許文献２参照）、有機溶媒として食品用途に用いても安全なヘキサン、アセトンを用い、ヘキサン、アセトン及び水からなる反応溶媒中で反応を行う方法が提案されている（特許文献３参照）。しかしながら、これらの方法では、反応系に水を多く含むと副反応である加水分解反応が進行し、目的とするリン脂質の収率が充分でなく、また生成するリン脂質の分離が困難になる、多価不飽和脂肪酸残基が酸化する等の問題もあった。

加水分解反応を抑制する方法や塩基交換反応を促進する方法としては様々な報告がなされており、水系の場合、塩類（カルシウム塩等）や界面活性剤を添加する方法が知られている。
二相系においては、水の量を最小限（１０％以下）にして加水分解反応を抑制する方法が考案されている。二相系の場合、主として水相にＰＬＤ、アルコール等の受容体等が含まれるが、例えばこれらの成分を含む水相を逆ミセル中に封入して反応系に添加する方法（特許文献４参照）、リン脂質と受容体とを担体に吸着させたＰＬＤに接触させて、反応系中の水分含量が１重量％以下の状態でリン脂質と受容体とを反応させる方法がある（特許文献５参照）。
しかしながら、これらの方法で加水分解反応は抑制されたが、目的とするリン脂質の収率が充分ではなく、更に収率を上げることが望まれている。また、リン脂質の分離や多価不飽和脂肪酸が酸化する問題については、何ら改善されていない。

塩基交換反応での収率を更に上げるためには、アルコール等の受容体の添加量を増やす必要があるが、受容体の水への溶解度に限界があることから、受容体の添加量を増やすと必然的に水の量も増加せざるを得ないという問題がある。

一方、塩基交換反応後の生成物の分離については、塩基交換反応によるＰＳの製造方法において、濃縮工程又は溶媒除去工程の前に、塩基交換反応で得られたＰＳ含有溶液に希釈油を添加して、流動性のよいＰＳ組成物を効率よく得る方法が報告されている（特許文献６参照）。
しかしながら、塩基交換反応での収率がよく、生成物の分離が簡便で、かつ多価不飽和脂肪酸の酸化を抑制する方法はまだ知られていない。

特開２００５−１０４８９３号公報 特表２００３−５０２０３５号公報 特開２００１−１８６８９８号公報 特公平７−１６４２６号公報 特公平３−６７６７６号公報 特開２００３−３０４８１４号公報

本発明は、上記現状に鑑み、二相系での多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法において、生成するリン脂質の収率がよく、分離が簡便で、更に多価不飽和脂肪酸の酸化を抑制する製造方法、該製造方法によって得られた多価不飽和脂肪酸含有リン脂質、及び、該多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を含む油脂を提供する。

本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、反応系中に抗酸化剤を添加し、更に反応系中の非極性溶媒と極性溶媒との配合比、及び、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定することにより、収率を下げることなく生成するリン脂質の分離が容易になり、更に多価不飽和脂肪酸の酸化が抑制されることを見出した。
すなわち本発明は、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、抗酸化剤とホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含み、極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量であり、リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上３０以下であることを特徴とする多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法に関する。

前記抗酸化剤は脂溶性抗酸化剤であることが好ましい。

前記脂溶性抗酸化剤がビタミンＥ又はその誘導体であることが好ましい。

水の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で３０〜２００％であることが好ましい。

塩基交換反応を開始する前に抗酸化剤を添加することが好ましい。

前記多価不飽和脂肪酸含有リン脂質がイカ由来のレシチンであることが好ましい。

また、本発明は、前記製造方法により得られた多価不飽和脂肪酸含有リン脂質に関する。

前記多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を構成するｎ−３系多価不飽和脂肪酸とｎ−６系多価不飽和脂肪酸の構成比（ｎ−３／ｎ−６）が２５以上であることが好ましい。

また、本発明は、前記多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を含む油脂に関する。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法は、抗酸化剤とホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを反応させることからなる。
本発明で用いられる多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とは、多価不飽和脂肪酸の残基が結合したリン脂質である。上記多価不飽和脂肪酸含有リン脂質としてはいかなる起源のものでもよく、リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物、当該抽出物を精製したもの、合成リン脂質等が好適に用いられる。このようなリン脂質の例としては、多価不飽和脂肪酸の残基が結合したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、これらの混合物等が挙げられる。多価不飽和脂肪酸としては公知のものが挙げられ、例えばリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、アラキドン酸等が挙げられる。上記リン脂質は単独で用いてもよいし、２種以上を同時に用いてもよい。一般的には、大豆、菜種、米、ひまわり、パーム等の植物由来のレシチン；卵黄、マグロ、イカ、イワシ、カツオ、イクラ、オキアミ、ホタテ等の動物由来のレシチン；酵母等の微生物由来のレシチン；水添レシチンのような加工レシチン等が用いられる。

これらの多価不飽和脂肪酸含有リン脂質のなかでも、リン脂質中のｎ−３系多価不飽和脂肪酸の割合が高いという理由から、イカ由来のレシチンが特に好ましい。

リン脂質の純度は、好ましくは、化合物の全質量を基準として２０〜９９．５質量％である。また、上記リン脂質は、本反応系中で０．１〜６０質量％用いるのが好ましい。

本発明で用いる抗酸化剤としては特に限定されないが、脂溶性抗酸化剤または水溶性抗酸化剤が挙げられる。
上記脂溶性抗酸化剤としては、例えば、コエンザイムＱ１０、ビタミンＡ、ビタミンＥ及びその誘導体等が挙げられる。上記水溶性抗酸化剤としては、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオン、ビタミンＣ、ぶどう種子エキス、ピクノジェノール、カテキン、アスタキサンチン、アミノ酸等が挙げられる。上記抗酸化剤としては、脂溶性であるリン脂質を構成する多価不飽和脂肪酸の酸化を防止できるという理由から、また本反応後に水相の分離がし易いという理由から、脂溶性抗酸化剤が好ましく、ビタミンＥ又はその誘導体がより好ましい。上記ビタミンＥの誘導体としては例えば、ニコチン酸トコフェロール、酢酸トコフェロール等が挙げられる。
上記抗酸化剤は、天然物からの抽出物、当該抽出物を精製したもの、合成製品等の何れを用いてもよく、例えば、ビタミンＥ又はその誘導体としては、植物性油脂等から抽出したものを用いることもできる。
また、上記抗酸化剤は、純度に関わらず、液状であってもよいし、塩基交換反応時に液状となるものであれば固体であってもよい。

抗酸化剤の添加量は、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質１００重量部に対して、１〜１５重量部が好ましい。添加量が１重量部未満であるか、１５重量部を超えると、水相と有機溶媒相が充分に分離せず、リン脂質の分離精製が困難となる場合や、多価不飽和脂肪酸の酸化防止効果が充分でない場合がある。より好ましくは、２．５〜１５重量部である。
抗酸化剤は、本発明においては反応を開始する前に添加することが好ましい。塩基交換反応の開始前に添加すると、リン脂質の酸化を防ぐことができ、さらに水相と有機溶媒相が良好に分離し、反応後のリン脂質の分離精製が容易である。

本発明で用いる非極性溶媒としては特に限定されず、例えば、ヘプタン、ヘキサン、石油エーテル等の脂肪族炭化水素；シクロペンタン、シクロヘキサン等の環状脂肪族炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；四塩化炭素、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類等が挙げられる。上記非極性溶媒としては、ヘプタン、ヘキサンが好ましい。
上記極性溶媒としては特に限定されず、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等のケトン類等が挙げられる。上記極性溶媒としては、アセトンが好ましい。

本発明の製造方法では、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で、極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量で、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを反応させる。極性溶媒の含有量が２０％以下であるか、８０％を超えると、目的リン脂質の収率が低くなる。上記極性溶媒の含有量は、好ましくは２５〜５０％であり、より好ましくは２５〜４０％である。
なお、本発明の製造方法では、塩基交換反応時にリン脂質が非極性溶媒及び極性溶媒からなる有機溶媒相に溶解していることが好ましく、リン脂質と非極性溶媒及び極性溶媒との割合は特に限定されないが、通常、リン脂質１ｇに対して有機溶媒が１〜１００ｍｌである。

本発明の製造方法で用いる水としては、イオン交換水、精製水、蒸留水、水道水等が挙げられる。さらに、これらに酢酸等を含有させてｐＨ調整のための緩衝液としてもよい。好ましくは、イオン交換水、精製水又は蒸留水が用いられる。本発明の製造方法では、水の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計に対して容積基準で３０〜２５０％であることが好ましく、３０〜２００％であることがより好ましい。更に好ましくは、５０〜１５０％である。

本発明で用いるヒドロキシル基含有化合物としては、例えば、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、ヒドロキシ環状化合物等が挙げられる。
アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アスコルビン酸等が挙げられる。
含窒素アルコール類としては、例えば、セリンなどのアミノ酸；１−アミノ−２−プロパノールなどが挙げられる。
糖類としては、例えば、アデノシン、グアノシン、イノシン、キサントシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン等のヌクレオシド；グルコース、トレハロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等が挙げられる。
ポリオール類としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。
ヒドロキシ環状化合物としては、例えば、麹酸、アルブチン等が挙げられる。
本発明の製造方法では、ヒドロキシル基含有化合物が水に溶解した状態で反応を行うことが好ましい。ヒドロキシル基含有化合物と水との割合は特に限定されないが、例えばヒドロキシル基含有化合物としてセリンを用いる場合、セリン１ｇに対して、３〜２０ｍｌの水を配合するのが好ましい。

本発明の製造方法では、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上、３０以下の条件下で行う。ヒドロキシル基含有化合物のモル比が４未満であると、生成するリン脂質の収率が低くなる。上記モル比は、６以上が好ましく、８以上がより好ましい。また、上記モル比が３０を超えると、コストが高くなり、非現実である。

本発明の製造方法では、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下で行う。上記ＰＬＤとしては、リン脂質の塩基部分を加水分解、及び／または塩基交換できるものであれば特に限定されず、例えば植物由来のＰＬＤ、微生物由来のＰＬＤ等が挙げられる。植物由来のＰＬＤとしてはキャベツ、大豆由来のＰＬＤ等が挙げられ、微生物由来のＰＬＤとしては放線菌、糸状菌由来のＰＬＤ等が挙げられる。
本反応系中におけるＰＬＤの濃度は、リン脂質１ｇに対し、好ましくは５〜２００Ｕ、より好ましくは２０〜１００Ｕである。なお、１Ｕは、９５％大豆ホスファチジルコリンを基質とし、基質濃度０．１６％の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１０ｍＭのＣａＣｌ、１．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）を３７℃にて反応させた時、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。

上記塩基交換反応は、ｐＨ３．５〜１０の条件で行うことが好ましく、ｐＨ４〜９がより好ましい。反応温度は、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。また、反応系が二相系であることから、塩基交換反応を行う間は反応系を攪拌することが好ましい。

本発明の製造方法により、例えば多価不飽和脂肪酸含有リン脂質中のＰＣ、ＰＥ等と、セリン等のヒドロキシル基含有化合物とが反応してＰＳ等が得られる。
塩基交換反応を行った後は、例えば加熱等の処理でＰＬＤを失活させ、遠心分離法等により有機溶媒層と水層を分離して有機溶媒層を得たあと、有機溶媒を減圧下で除去することによって濃縮する。次いで、アセトン又はエタノールで晶析を行い、固液分離によって固形物を得、乾燥することにより、本発明の製造方法で生成した多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を単離することができる。

これまで二相系中での塩基交換反応では、反応系中の水によって加水分解反応も進むことから、目的とするリン脂質の収率が充分でなく、また水によって多価不飽和脂肪酸が酸化する、水相と有機溶媒相が乳化するため反応後にリン脂質の分離精製が困難であるといった問題があった。本発明の製造方法では、反応系中に抗酸化剤を添加することにより、反応系中に水が多く含まれていても、リン脂質の収率を下げることなく反応後に水相と有機溶媒相が良好に分離し、また多価不飽和脂肪酸の酸化も抑制される。

本発明の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質は、前記製造方法により得られたものである。多価不飽和脂肪酸含有リン脂質において、リン脂質を構成するドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、α−リノレン酸などのｎ−３系多価不飽和脂肪酸とリノール酸やアラキドン酸などのｎ−６系多価不飽和脂肪酸の構成比（ｎ−３／ｎ−６）が、２５以上であることが好ましく、３０以上であることがより好ましい。該構成比（ｎ−３／ｎ−６）を２５未満とすることにより、現在の食生活におけるｎ−６系多価不飽和脂肪酸の過剰摂取を避け、心臓病の危険性を抑えることができる。上限については、とくに限定されるものではなく、現在の食事中の脂肪酸摂取割合から考えれば、値は高ければ高いほどよい。

本発明の油脂は、前記多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を含んでいればよく、該リン脂質以外の脂質を含んでいても良く、該リン脂質以外の脂質としてはとくに限定されるものではない。該油脂中の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の割合は、１０〜１００質量％であるが、リン脂質の割合が高いほど有効であるので、好ましくは２０〜１００質量％、さらに好ましくは、３０〜１００％である。

本発明の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質および油脂は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤等の各種の形態の製剤とすることができる。本発明のリン脂質および油脂は高純度であり、容易に粉状にすることができるので、錠剤、顆粒剤、散剤などの製造に好適であり、粉ミルク等のように粉体のみで提供される製品への加工が容易になる。前記製剤において、公知の賦形剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いることができ、水溶性薬物（生薬エキス、ビタミンＣなど）と配合してもよい。

本発明の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法では、非極性溶媒と極性溶媒との配合比、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定することにより、反応系に水が多く含まれていても効率よく塩基交換反応が進むので、ヒドロキシル基含有化合物を多く配合することができ、目的とするリン脂質の収率を上げることができる。更に、反応系に抗酸化剤を添加することにより、リン脂質の収率を下げることなく多価不飽和脂肪酸の酸化が抑制され、また、反応後も水相と有機溶媒相が良好に分離するので、生成するリン脂質の分離精製が簡便となり、高純度のリン脂質が得られる。

以下に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
不飽和脂肪酸含有レシチンとしてイカ由来レシチン（日本化学飼料社製、ホスファチジルコリン（ＰＣ）４９．１重量％、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）８．７重量％）を用い、２０％（重量／容量）になるように、ヘプタンおよびアセトンの混合液に溶解した。ヘプタンおよびアセトンの混合比は、ヘプタン：アセトン＝６：４（容量：容量）とした。さらに理研Ｅオイル６００（理研ビタミン社製ビタミンＥ）をレシチン１００重量部に対して、表１に示す濃度で０〜１０重量部添加して、レシチン溶液とした。以後、この溶液をレシチン溶液という。
次にＬ−セリン（協和発酵社製）を２５％（重量／容量）になるように、０．６Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した。以後、この溶液をセリン溶液という。
上記の通り調製したレシチン溶液およびセリン溶液を、レシチンとセリンのモル比が、レシチン：セリン＝１：１０となる比率で、全量を１ｍｌになるように、２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した。レシチン溶液およびセリン溶液の容量比は、レシチン溶液：セリン溶液＝１：１．１２であった。さらに、ホスホリパーゼＤ（ナガセケムテックス社製）をレシチン１ｇ当り９０Ｕとなるように添加し、ＴＩＴＥＣ社製のＢｉｏ Ｓｈａｋｅｒ Ｍ−ＢＲ−０２２ＵＰを用い、３０℃で１６時間攪拌した。反応後、反応液を遠心分離にて分離したレシチン溶液に１０倍量（容量比）のアセトンを加えて、不溶化したレシチン（ホスファチジルセリン（ＰＳ））を回収し、減圧下でアセトンを除去した。このようにして得られたレシチンのＤＨＡ量を測定した。
リン脂質組成は、反応液５０μｌをクロロホルム：メタノール＝１：１（容量：容量）の混合液に溶解し、遠心分離にて不溶物を除去した後、下記の条件のＨＰＬＣにて分析した。
使用カラム：ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製 Ｕｎｉｓｉｌ Ｑ ＮＨ２（内径４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
移動相：アセトニトリル：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝６１９：２９１：９０（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：１．３ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３７℃
検出：ＵＶ ２０５ｎｍ
また、ＰＳの生成率は、反応前のＰＣおよびＰＥ量に対する生成したＰＳ量を表した。
ＰＳ生成率％＝（生成したＰＳ量／反応前のＰＣ＋ＰＥ量）×１００
脂肪酸組成の分析はＧＣにて行った。下記に分析条件を記す。

（試料調製）
試料５ｍｇ／ｍｌのクロロホルム溶液１ｍｌに１０％塩化水素含メタノール１ｍｌ混合し、８０℃で３時間処理を行った。さらにヘキサン１ｍｌ、蒸留水６ｍｌを加え、よく混合した後、遠心分離にて分離したヘキサン・クロロホルム層を採取して、ＧＣに供試した。

（ＧＣ分析）
カラム：Ｔｈｅｒｍｏｎ−３０００Ｂ ＨＲシリーズ（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
キャリアガス：ヘリウム
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：１：１０００
試料注入量：１μｌ
温度：カラム温度 １５０から２２０℃まで、２℃／ｍｉｎで上昇、
試料注入口 ２２０℃、
検出器 ２２０℃
ガス圧力：ヘリウム（キャリアガス）１５０ｋＰａ、窒素（メイクアップガス）７５ｋＰａ、水素 ６０ｋＰａ、空気 ５０ｋＰａ
これらの結果を表１に示す。

表１の結果から、抗酸化剤を反応系に添加することにより、収率を下げることなく反応後のレシチン溶液とセリン溶液とが分離しやすくなることが分かった。また、抗酸化剤の添加量が５．０重量部以上であると、レシチン溶液とセリン溶液との分離が良好となり、またリン脂質中のＤＨＡの割合が反応前と同程度となることが分かった。

実施例２
不飽和脂肪酸含有レシチンとしてイカ由来レシチン（日本化学飼料社製、ＰＣ４９．１重量％、ＰＥ８．７重量％）を用い、２０％（重量／容量）になるように、ヘプタンおよびアセトンの混合液に溶解した。ヘプタンおよびアセトンの混合比は、ヘプタン：アセトン＝６：４（容量：容量）とした。さらに理研Ｅオイル６００（理研ビタミン社製）をレシチン１００重量部に対して、１０重量部添加して、レシチン溶液とした。また比較のため、理研Ｅオイル６００（理研ビタミン社製）を添加しないものも用意した。
セリン溶液は実施例１と同様に調製した。
上記の通り、調製したレシチン溶液およびセリン溶液を、レシチンとセリンのモル比が、レシチン：セリン＝１：１０となる比率で、全量を１００ｍｌになるように、５００ｍｌ栓付ビンに分注し（レシチン溶液およびセリン溶液の容量比は、レシチン溶液：セリン溶液＝１：１．１２）、さらに、ホスホリパーゼＤ（ナガセケムテックス社製）をレシチン１ｇ当り９０Ｕとなるように添加し、３０℃の水浴中で、５時間、マグネットスターラーを用いて攪拌し、反応を行った。
反応後、反応液を遠心分離にて分離したレシチン溶液に１０倍量（容量比）のアセトンを加えて、不溶化したレシチンＰＳを回収し、減圧下でアセトンを除去した。
ＰＳの生成率、脂肪酸組成は実施例１記載の方法で実施した。また日本油化学会制定の過酸化物価は基準油脂分析法参２．４に基づいて実施した。結果を表２に示す。

表２の結果から、抗酸化剤を反応系に添加することにより、リン脂質の収率を下げることなく、リン脂質中の多価不飽和脂肪酸の酸化が抑制されることが分かった。また今回実施し、得られたリン脂質のｎ−３系多価不飽和脂肪酸とｎ−６系多価不飽和脂肪酸の割合（ｎ−３／ｎ−６）は、３７．７〜５３．６であった。

調剤例１
実施例２で得られたＰＳを含む下記処方をＶ型混合機で混合し、打錠機にて打錠し、直径７．５ｍｍ、２００ｍｇの錠剤を得た。
ホスファチジルセリン １５０ｍｇ
イチョウ葉エキス ３００ｍｇ
ビタミンＣ １００ｍｇ
結晶セルロース ７５０ｍｇ
部分α化デンプン ４８０ｍｇ
微粒二酸化ケイ素 ２０ｍｇ
合計 １８００ｍｇ／ｄａｙ

調剤例２
実施例２で得られたＰＳを含む下記処方を攪拌造粒機で混合し、粉末重量の５％の精製水を添加し攪拌造粒を行った。造粒物を流動層乾燥機で乾燥して良好な細粒を得た。
ホスファチジルセリン ２００ｍｇ
イチョウ葉エキス ２００ｍｇ
ビタミンＥ２倍散 ２００ｍｇ
結晶セルロース ６５０ｍｇ
トレハロース ４７０ｍｇ
メチルセルロース ３０ｍｇ
合計 １７５０ｍｇ／ｄａｙ

本発明の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法では、非極性溶媒と極性溶媒との配合比、多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定することにより、反応系に水が多く含まれていても効率よく塩基交換反応が進むので、ヒドロキシル基含有化合物を多く配合することができ、目的とするリン脂質の収率を上げることができる。更に、反応系に抗酸化剤を添加することにより、多価不飽和脂肪酸の酸化が抑制され、また、反応後も水相と有機溶媒相が良好に分離するので、生成するリン脂質の分離精製が簡便となり、高純度のリン脂質が得られる。

Claims (9)

1. 多価不飽和脂肪酸含有リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、抗酸化剤とホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含み、極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量であり、リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上３０以下であることを特徴とする多価不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法。
2. 抗酸化剤が脂溶性抗酸化剤である請求項１記載の製造方法。
3. 脂溶性抗酸化剤がビタミンＥ又はその誘導体である請求項２記載の製造方法。
4. 水の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で３０〜２００％である請求項１〜３いずれか１項記載の製造方法。
5. 塩基交換反応を開始する前に抗酸化剤を添加する請求項１〜４いずれか１項記載の製造方法。
6. 多価不飽和脂肪酸含有リン脂質がイカ由来のレシチンである請求項１〜５いずれか１項記載の製造方法。
7. 請求項１〜６いずれか１項記載の製造方法により得られた多価不飽和脂肪酸含有リン脂質。
8. 多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を構成するｎ−３系多価不飽和脂肪酸とｎ−６系多価不飽和脂肪酸の構成比（ｎ−３／ｎ−６）が２５以上である請求項７記載の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質。
9. 請求項７又は８記載の多価不飽和脂肪酸含有リン脂質を１０〜１００質量％含む油脂。