JP2007110951A - リン脂質を塩基交換する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】二相系でのリン脂質の塩基交換反応において、生成するリン脂質の収率を上げる方法、及び、分離を簡便にする方法を提供する。
【解決手段】リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含み、
極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量であり、
リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上３０以下であることを特徴とするリン脂質の塩基交換方法、及び、
リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、食用油及びホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含む、リン脂質の塩基交換方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の塩基交換方法に関する。更に詳しくは、ホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の塩基交換反応において、非極性溶媒と極性溶媒との配合比及びリン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定して反応を行う方法、又は、食用油を用いて反応を行う方法に関する。

ホスホリパーゼＤ（以下、ＰＬＤと略す）は、リン脂質の塩基交換反応を触媒することが知られている。ＰＬＤは、例えば、ホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略す）、ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略す）のようなリン脂質と、受容体であるアルコールとの間の塩基交換反応を触媒する。例えば、アルコールとしてグリセロールを用いた場合には、ホスファチジルグリセロール（以下、ＰＧと略す）が生産される。また、アルコールとしてセリンを用いた場合には、ホスファチジルセリン（以下、ＰＳと略す）が生産される。一方、受容体としてアルコールの代わりに水を用いた場合には、リン脂質の加水分解反応が進行し、ホスファチジン酸（以下、ＰＡと略す）が生産される。

一般的に、ＰＬＤを用いたリン脂質の塩基交換反応は、水系または水相及び有機溶媒相からなる二相系で行われるが、反応系中に水が存在することにより、塩基交換反応と共に副反応として加水分解反応も進行する。なかでも二相系の場合、反応系中の水の含量が多くなると、塩基交換反応よりも加水分解反応が促進されて、塩基交換反応の収率が悪くなる等の影響がある。特にヘプタン、アセトン及び水を用いた場合、水の量が多くなると、収率の低下に加えて生成物の分離が困難になるという問題点がある。

そこで、塩基交換反応の収率をあげるため、様々な方法が報告されている。
水系の場合、塩類（カルシウム塩等）や界面活性剤を添加して加水分解反応を抑制する方法、または塩基交換反応を促進する方法が知られている。
二相系においては、水の量を最小限（１０％以下）にして加水分解反応を抑制する方法が考案されている。二相系の場合、主として水相にＰＬＤ、アルコール等の受容体等が含まれるが、例えばこれらの成分を含む水相を逆ミセル中に封入して反応系に添加する方法（特許文献１参照）、リン脂質と受容体とを担体に吸着させたＰＬＤに接触させて、反応系中の水分含量が１重量％以下の状態でリン脂質と受容体とを反応させる方法がある（特許文献２参照）。
これらの方法でＰＡの生成は抑制されたが、目的とするリン脂質の収率が充分ではなく、更に収率を上げることが望まれている。

塩基交換反応での収率を更に上げるためには、アルコール等の受容体の添加量を増やす必要があるが、受容体の水への溶解度に限界があることから、受容体の添加量を増やすと必然的に水の量も増加せざるを得ないという問題がある。

一方、塩基交換反応後の生成物の分離については、塩基交換反応によるＰＳの製造方法において、濃縮工程又は溶媒除去工程の前に、塩基交換反応で得られたＰＳ含有溶液に希釈油を添加して、流動性のよいＰＳ組成物を効率よく得る方法が報告されている（特許文献３参照）。
しかしながら、塩基交換反応での収率がよく、かつ、生成物の分離が簡便な方法はまだ知られていない。
特公平７−１６４２６号公報 特公平３−６７６７６号公報 特開２００３−３０４８１４号公報

本発明は、上記現状に鑑み、二相系でのリン脂質の塩基交換反応において、生成するリン脂質の収率を上げる方法、及び、分離を簡便にする方法を提供する。

本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、反応系中の非極性溶媒と極性溶媒との配合比、及び、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定することにより、生成物の収率が向上することを見出した。また、二相系でリン脂質の塩基交換反応を行う際、反応系中に食用油を添加することにより、収率を下げることなく生成物の分離が容易になることを見出した。
すなわち第一の本発明は、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含み、極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量であり、リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上、３０以下であることを特徴とするリン脂質の塩基交換方法である。
また、第二の本発明は、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、食用油及びホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含む、リン脂質の塩基交換方法である。

以下に本発明を詳細に説明する。
第一の本発明であるリン脂質の塩基交換方法は、ホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で、極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量で、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを反応させることからなる。
上記非極性溶媒としては特に限定されず、例えば、ヘプタン、ヘキサン、石油エーテル等の脂肪族炭化水素；シクロペンタン、シクロヘキサン等の環状脂肪族炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；四塩化炭素、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類等が挙げられる。上記非極性溶媒としては、ヘプタン、ヘキサンが好ましい。
上記極性溶媒としては特に限定されず、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等のケトン類等が挙げられる。上記極性溶媒としては、アセトンが好ましい。

本発明の塩基交換方法において、極性溶媒の含有量が２０％以下であるか、又は８０％を超えると、目的リン脂質の収率が低くなる。上記極性溶媒の含有量は、好ましくは２５〜５０％である。

本発明の塩基交換方法で用いる水としては、イオン交換水、精製水、蒸留水、水道水等が挙げられる。さらに、これらに酢酸等を含有させてｐＨ調整のための緩衝液としてもよい。好ましくは、イオン交換水、精製水又は蒸留水が用いられる。

本発明の塩基交換方法では、水の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計に対して容積基準で３０〜２５０％であることが好ましく、３０〜２００％であることがより好ましい。更に好ましくは、５０〜１００％である。

また、本発明の塩基交換方法は、リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上３０以下の条件下で行う。ヒドロキシル基含有化合物のモル比が４未満であると、生成するリン脂質の収率が低くなる。上記モル比は、６以上が好ましく、８以上がより好ましい。また、上記モル比が３０を超えるとコストが高くなり、非現実である。

本発明の塩基交換方法で用いられるリン脂質は、いかなる起源のものでもよく、リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物、当該抽出物を精製したもの、合成リン脂質等が好適に用いられる。このようなリン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、これらの混合物等が挙げられる。上記リン脂質は、単独で用いてもよいし、２種以上を同時に用いてもよく、一般的には、大豆レシチン、卵黄レシチン、菜種レシチン等が用いられる。
リン脂質の純度は、好ましくは、上記の化合物の全質量を基準として２０〜９９．５質量％である。また、上記リン脂質は、本反応系中で０．１〜６０質量％用いるのが好ましい。なお、リン脂質と非極性溶媒及び極性溶媒からなる有機溶媒との割合は特に限定されないが、塩基交換反応時にリン脂質が有機溶媒相に溶解していることが好ましく、通常、リン脂質１ｇに対して有機溶媒が１〜１０ｍｌである。

上記ヒドロキシル基含有化合物としては、例えば、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、ヒドロキシ環状化合物等が挙げられる。
アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アスコルビン酸等が挙げられる。
含窒素アルコール類としては、例えば、セリンなどのアミノ酸；１−アミノ−２−プロパノールなどが挙げられる。
糖類としては、例えば、アデノシン、グアノシン、イノシン、キサントシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン等のヌクレオシド；グルコース、トレハロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等が挙げられる。
ポリオール類としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。
ヒドロキシ環状化合物としては、例えば、麹酸、アルブチン等が挙げられる。
本発明の塩基交換方法において、上記ヒドロキシル基含有化合物と水との割合は特に限定されないが、塩基交換反応時に上記ヒドロキシル基含有化合物が水に溶解していることが好ましく、例えばヒドロキシル基含有化合物としてセリンを用いる場合、セリン１ｇに対して、３〜１０ｍｌの水を配合するのが好ましい。

本発明の塩基交換方法は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下で行う。上記ＰＬＤとしては、リン脂質の塩基部分を加水分解、及び/または塩基交換することができるものであれば特に限定されず、例えば植物由来のＰＬＤ、微生物由来のＰＬＤ等が挙げられる。植物由来のＰＬＤとしてはキャベツ、大豆由来のＰＬＤ等が挙げられ、微生物由来のＰＬＤとしては放線菌、糸状菌由来のＰＬＤ等が挙げられる。
本反応系中におけるＰＬＤの濃度は、リン脂質１ｇに対し、好ましくは５〜２００Ｕ、より好ましくは２０〜１００Ｕである。なお、１Ｕは、９５％大豆ホスファチジルコリンを基質とし、基質濃度０．１６％の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む）を３７℃にて反応させた時、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。

上記塩基交換反応は、ｐＨ３．５〜１０の条件で行うことが好ましく、ｐＨ４〜９がより好ましい。反応温度は、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。
また、反応系が二相系であることから、塩基交換反応を行う間は反応系を攪拌することが好ましい。

本発明の塩基交換方法は、また、二相系中に食用油を含むことが好ましい。食用油の存在下で塩基交換反応を行うことにより、水相と有機溶媒相が分離し、生成するリン脂質の分離が容易になる。食用油の添加については、後述する第二の本発明の塩基交換方法と同様に行うことができる。

上記塩基交換反応により、例えばリン脂質中のＰＣ、ＰＥ等と、セリン等のヒドロキシル基含有化合物とが反応してＰＳ等が得られる。
塩基交換反応を行った後は、例えば加熱等の処理でＰＬＤを失活させ、遠心分離法等により有機溶媒層と水層を分離して有機溶媒層を得たあと、有機溶媒を減圧下で除去することによって濃縮する。次いで、アセトン又はエタノールで晶析を行い、固液分離によって固形物を得、乾燥することにより、塩基交換反応で生成したリン脂質を単離することができる。

次に第二の本発明であるリン脂質の塩基交換方法について説明する。
第二の本発明の塩基交換方法は、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、食用油及びホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含む。
上記食用油としては、植物由来のもの、魚油等の動物由来のもの、微生物由来のもの等が挙げられ、ココナツ油、ヤシ油、パーム油、グレープフルーツ油及び中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）の様な飽和脂肪酸を多く含む油類；或いは大豆油、ごま油、シソ油、落花生油、米ぬか油（米胚芽油）、小麦胚芽油、トウモロコシ油、菜種油、綿実油、カボチャ種子油、オリーブ油、グアバ種子油、ナツメヤシ種子油、ブドウ種子油、ツバキ種子油、ヒマワリ油、月見草種子油、サフラワー油などの様な不飽和脂肪酸を多く含む油類の何れか、またはこれらの混合油類を使用できる。上記食用油は天然のものであってもよいし、加工したものであってもよい。また、上記食用油は、液状であってもよいし、反応時に液状となるものであれば固体であってもよい。

食用油の添加量は、リン脂質１００重量部に対して、５重量部以上が好ましい。５重量部未満であると、水相と有機溶媒相が充分に分離せず、リン脂質の分離精製が困難となる場合がある。より好ましくは、５〜８０重量部である。

上記食用油は、塩基交換反応を開始する前に添加してもよいし、反応を開始した後に添加してもよいが、本発明においては反応を開始する前に添加することが好ましい。塩基交換反応の開始前に添加すると、水相と有機溶媒相が良好に分離し、反応後のリン脂質の分離精製が容易である。

本発明で用いるリン脂質、ヒドロキシル基含有化合物、ホスホリパーゼＤ、非極性溶媒、極性溶媒及び水の種類や配合量、反応時のｐＨや反応温度、塩基交換反応後のリン脂質の単離は、上述の第一の本発明と同様である。

これまで二相系中での塩基交換反応では、水相と有機溶媒相が乳化するため反応後にリン脂質の分離精製が困難であったが、本発明の方法では、反応系中に食用油を添加することにより、リン脂質の収率を下げることなく、反応後に水相と有機溶媒相が良好に分離し、リン脂質の精製が容易となる。

第一の本発明の塩基交換方法では、非極性溶媒と極性溶媒との配合比、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定することにより、反応系に水が多く含まれても効率よく塩基交換反応が進むので、ヒドロキシル基含有化合物を多く配合することができ、目的とするリン脂質の収率を上げることができる。
第二の本発明の塩基交換方法では、反応系に食用油を添加することにより、リン脂質の収率を下げることなく反応後も水相と有機溶媒相が良好に分離するので、生成するリン脂質の分離精製が簡便となり、高純度のリン脂質が得られる。

以下に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
レシチンとしてＳＬＰ−ＰＣ５５（辻製油社製、ＰＣ５４．４重量％、ＰＥ１２．２重量％）を、２０％（重量／容量）になるように、ヘプタンおよびアセトンの混合液に溶解した。ヘプタンおよびアセトンの混合比は、ヘプタン：アセトン＝８．０：２．０、７．５：２．５、７．０：３．０、６．５：３．５および６．０：４．０（容量：容量）とした。以後、この溶液をレシチン溶液という。
次にＬ−セリン（協和発酵社製）を２５％（重量／容量）になるように、０．６Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した。以後、この溶液をセリン溶液という。
上記の通り、調製したレシチン溶液およびセリン溶液を、レシチンとセリンのモル比が、レシチン：セリン＝１：２、１：４、１：６、１：８および１：１０となる比率で、全量が１ｍｌになるように、２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した。さらに、ホスホリパーゼＤ（ナガセケムテックス社製）をレシチン１ｇ当り９０Ｕとなるように添加し、ＴＩＴＥＣ社製のＢｉｏ Ｓｈａｋｅｒ Ｍ−ＢＲ−０２２ＵＰを用い、３０℃で１６時間攪拌して、反応を行った。以後、このレシチン溶液とセリン溶液の混合液を反応液という。
リン脂質組成は、反応液５０μｌをクロロホルム：メタノール＝１：１（容量：容量）の混合液に溶解し、遠心分離にて不溶物を除去した後、下記の条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。
使用カラム：ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製 Ｕｎｉｓｉｌ Ｑ ＮＨ_２（内径４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
移動相：アセトニトリル：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝６１９：２９１：９０（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：１．３ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３７℃
検出：ＵＶ ２０５ｎｍ
また、ＰＳの生成率は反応前のＰＣおよびＰＥ量に対する生成したＰＳ量を表した。
ＰＳ生成率％＝（生成したＰＳ量／反応前のＰＣ＋ＰＥ量）×１００
ＰＳの生成率を表１及び図１で示す。なお、反応後レシチン溶液とセリン溶液の分離状態はセリン溶液の量の増加に伴って、悪くなっていった。

実施例２
レシチンとしてイカ由来のリン脂質（日本科学飼料社製、ＰＣ４９．１重量％、ＰＥ８．７重量％）を、２０％（重量／容量）になるように、ヘプタンおよびアセトンの混合液に溶解した。ヘプタンおよびアセトンの混合比は、ヘプタン：アセトン＝７．０：３．０、６．５：３．５、６．０：４．０、５．０：５．０および４．０：６．０（容量：容量）とした。以後、この溶液をレシチン溶液という。
セリン溶液は実施例１と同様に調製した。
上記の通り、調製したレシチン溶液およびセリン溶液を、レシチンとセリンのモル比が、レシチン：セリン＝１：８、１：１０、１：１２、１：１４、１：１６、１：１８、および１：２０となる比率で、全量を１ｍｌになるように、２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した。さらに、ホスホリパーゼＤ (ナガセケムテックス株式会社製)をレシチン１ｇ当り９０Uとなるように添加し、ＴＩＴＥＣ社製のＢｉｏ Ｓｈａｋｅｒ Ｍ−ＢＲ−０２２ＵＰを用い、３０℃で５時間攪拌した。
リン脂質組成の分析は、実施例１記載の方法で行った。ＰＳの生成率を表２及び図２で示す。尚、反応後レシチンとセリン溶液の分離状態は悪かった。

実施例３
レシチンとしてＳＬＰ−ＰＣ５５（辻製油社製、ＰＣ５４．４重量％、ＰＥ１２．２重量％）を、２０％（重量／容量）になるように、ヘプタンおよびアセトンの混合液に溶解した。ヘプタン及びアセトンの混合比は、ヘプタン：アセトン＝７：３（容量：容量）とした。さらに菜種油（ナカライテスク社製）をレシチン１００重量部に対して、表３に示すように０〜１００重量部添加して、レシチン溶液とした。
セリン溶液は実施例１と同様に調製した。
上記の通り、調製したレシチン溶液およびセリン溶液を、レシチンとセリンのモル比が、レシチン：セリン＝１：１０となる比率で、全量を１００ｍｌになるように、５００ｍｌ栓付ビンに分注し、３０℃の水浴中で、５時間、マグネットスターラーを用いて攪拌し、反応を行った。
反応後、２時間静置し、レシチン溶液とセリン溶液の分液状態、レシチン溶液の濁り等を目視により確認した。また、ＰＳの生成率は実施例１記載の方法で実施した。結果は表３で示す。

実施例４
レシチンとしてイカ由来のリン脂質（日本科学飼料社製、ＰＣ４９．１重量％、ＰＥ８．７重量％）を、２０％（重量／容量）になるように、ヘプタンおよびアセトンの混合液に溶解した。ヘプタンおよびアセトンの混合比は、ヘプタン：アセトン＝６：４（容量：容量）とした。さらに菜種油（ナカライテスク社製）をレシチン１００重量部に対して、表４に示すように０〜５０重量部添加して、レシチン溶液とした。
セリン溶液は実施例１と同様に調製した。
上記の通り、調製したレシチン溶液およびセリン溶液を、レシチンとセリンのモル比が、レシチン：セリン＝１：８、１：１２、１：１６、１：１８、および１：２０となる比率で、全量を１ｍｌになるように、２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した。さらに、ホスホリパーゼＤ (ナガセケムテックス社製)をレシチン１ｇ当り９０Uとなるように添加し、ＴＩＴＥＣ社製のＢｉｏ Ｓｈａｋｅｒ Ｍ−ＢＲ−０２２ＵＰを用い、３０℃で５時間攪拌した。
リン脂質組成の分析は、実施例１記載の方法で行った。反応後、２時間静置し、レシチン溶液とセリン溶液の分液状態を目視により確認した。結果は表４で示す。

第一の本発明の塩基交換方法では、非極性溶媒と極性溶媒との配合比、リン脂質とヒドロキシル基含有化合物との配合比を限定することにより、反応系に水が多く含まれても効率よく塩基交換反応が進むので、ヒドロキシル基含有化合物を多く配合することができ、目的とするリン脂質の収率を上げることができる。
第二の本発明の塩基交換方法では、反応系に食用油を添加することにより、リン脂質の収率を下げることなく反応後も水相と有機溶媒相が良好に分離するので、生成するリン脂質の分離精製が簡便となり、高純度のリン脂質が得られる。

実施例１でのＰＳの生成率を表すグラフである。 実施例２でのＰＳの生成率を表すグラフである。

Claims (5)

1. リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含み、
   極性溶媒の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計量に対して、容積基準で２０％を超え、かつ８０％以下の量であり、
   リン脂質に対するヒドロキシル基含有化合物のモル比が４以上３０以下であることを特徴とするリン脂質の塩基交換方法。
2. 水の含有量が、非極性溶媒及び極性溶媒の合計に対して、容積基準で３０〜２００％である請求項１記載の方法。
3. 更に、二相系中に食用油を含む請求項１又は２記載の方法。
4. リン脂質とヒドロキシル基含有化合物とを、食用油及びホスホリパーゼＤの存在下、非極性溶媒、極性溶媒及び水からなる二相系中で反応させる工程を含む、リン脂質の塩基交換方法。
5. 塩基交換反応を開始する前に食用油を添加する請求項４記載の方法。

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