JPWO2006046674A1 - Ｃ型肝炎ウイルス感染症の予防および治療剤 - Google Patents

Abstract

ヒメハギ属の植物の抽出物を有効成分として含有する、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物が開示される。好ましくは、本発明の医薬組成物は、オンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａ Ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ Ｗｉｌｌｄｅｎｏｗの根部）の抽出物またはセネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ Ｌｉｎｎｅの根部）の抽出物を含む。好ましくは抽出物はサポニン、例えば、オンジサポニンまたはポリガラサポニンである。

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防および治療するための医薬組成物に関する。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染者は世界中で約１−２億人、日本国内では２００万人以上と推測されている。これらの感染者の約５０％が慢性肝炎に移行し、そのうち約２０％が感染後３０年以上たって肝硬変や肝癌を発症する。肝癌の原因の約９０％はＣ型肝炎であると言われている。日本国内では、毎年２万人以上の患者がＨＣＶ感染に伴う肝癌により死亡している。
Ｃ型肝炎ウイルスは、１本鎖ＲＮＡウイルスであり、コア蛋白、エンベロープ蛋白およびＲＮＡで構成される直径５５〜６５ｎｍの粒子である。この粒子は、ヒトの肝細胞に吸着、侵入したあと脱殻し、ＲＮＡを放出する。肝細胞内で、ウイルス自身が持つＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡおよびウイルス遺伝子ＲＮＡの複製が合成される。ｍＲＮＡの情報によって、ウイルスの構造蛋白やプロテアーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなどが作られ、ウイルス粒子が形成され、ゴルジ装置を通って細胞膜に達し、肝細胞外へ放出され、ウイルスは増殖していく。
ＨＣＶは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した成人に感染した場合でも持続感染が成立することが多い。持続感染は、慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため、肝癌が再発する患者が多いことも知られている。
現在、ＨＣＶ排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン治療が知られている。しかし、インターフェロン治療が有効な患者は、全患者の１／３程度である。特に、ＨＣＶゲノタイプ１ｂに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。また、インターフェロンとリバビリンとの併用によるＣ型肝炎の治療も行われているが、有効率は依然として低い。また、インターフェロンアゴニスト、インターロイキン−１２アゴニスト等、患者の免疫力を増強させることによってウイルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見いだされていない。
したがって、当該技術分野においては、ＨＣＶを排除しＣ型肝炎を治療する有効な治療方法および治療薬の開発が求められている。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：Ｖ．Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ：２８５，１１０−１１３，１９９９；Ｓ．Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｊ．Ｓｈｏｊｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ：２９，２４３１−２４４１，１９８１；Ｓ．Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｊ．Ｓｈｏｊｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ：３０，８１０−８２１，１９８２；Ｙ．Ｓｈｉｍｉｚｕ ａｎｄ Ｓ．Ｗ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８，１５４４−１５４９，１９６６。
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防および治療するのに有効な化合物ならびにこの化合物を含む医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者は、広範な種類の植物および生薬について抗ＨＣＶ活性を調べた結果、ヒメハギ属の植物のエタノール抽出物が強力な抗ＨＣＶ活性を有することを見いだした。すなわち、本発明は、ヒメハギ属の植物の抽出物を有効成分として含有する、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
本発明において、「Ｃ型肝炎ウイルス感染症」とは、Ｃ型肝炎ウイルスの感染に関連する疾患を表し、例えば、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌が挙げられる。Ｃ型肝炎ウイルス感染症の予防および治療には、これらの疾患の症状を軽減または排除すること、感染患者中のＣ型肝炎ウイルスの増殖を阻害すること、ウイルスの活性を低下させること、およびウイルスを消滅もしくは減少させることが含まれる。
本発明において、「ヒメハギ属の植物」とは、ヒメハギ科（Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ）のヒメハギ属（Ｐｏｌｙｇａｌａ）に属する植物であり、その一部は従来より生薬として知られている。代表的なものとしては、オンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａ Ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ Ｗｉｌｌｄｅｎｏｗの根部）およびセネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ Ｌｉｎｎｅの根部）が挙げられる。
「抽出物」とは、ヒメハギ属の植物、例えばその茎、根、葉等を適当な溶媒で抽出し、必要に応じて濃縮・乾燥することにより得られる物質をいい、単離された化合物でもよく、複数の化合物の混合物でもよい。
本発明の１つの好ましい態様においては、ヒメハギ属の植物の抽出物はサポニンである。サポニンは、ステロイドやトリテルペノイドにオリゴ糖が結合した配糖体であり、植物界に広く分布する物質である。本発明において好ましいサポニンは、オンジサポニンまたはポリガラサポニンである。
別の観点においては、本発明は、オンジサポニンＢ、ポリガラサポニンＸＬＩＶ、ポリガラサポニンＸＸＸＩＩおよびオンジサポニンＦからなる群より選択される化合物を有効成分として含有する、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
別の観点においては、本発明は、以下の式（Ｉ）：

［式中、
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、糖、糖鎖または水素であり；
Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲ_７であり、ここで、Ｒ_７はＣ_１−６の直鎖または分枝鎖のアルキル基である］
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。好ましくは、Ｒ_７はＣ_１−３の直鎖または分枝鎖のアルキル基である。
上記式中、糖とは単糖類を意味し、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ラムノース、アピオース、フコースなどが挙げられる。これらの単糖類が、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３、すなわち残基として結合する場合、結合手が存在する位置としては、５単糖、６単糖といった糖の種類にもよるが、例えば、糖における１位（アノメリックポジション）、２位、３位、４位、５位および６位が挙げられる。中でも、１位（アノメリックポジション）に結合手が存在するのが好ましい。糖鎖とは、複数の単糖類、好ましくは２−１０個の単糖類、より好ましくは２−４個の単糖類がグリコシド結合により互いに結合した成分を意味する。
薬学的に許容しうる塩としては、薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属等の塩、アンモニアや各種有機塩基等の塩類を挙げることができる。
特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、式：

で表される化合物（オンジサポニンＦ）である。
別の観点においては、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者にヒメハギ属の植物の抽出物を投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療する方法を提供する。

図１は、オンジのＬＣ−ＵＶ−ＭＳクロマトグラムおよび微量分取フラクションの抗ＨＣＶレプリコン活性および細胞毒性を示す。
図２は、セネガのＬＣ−ＵＶ−ＭＳクロマトグラムおよび微量分取フラクションの抗ＨＣＶレプリコン活性および細胞毒性を示す。
図３は、ポリガラサポニンＸＸＸＩＩおよびオンジサポニンＦの構造を示す。
図４は、Ｆｒ．４（オンジサポニンＦ）の１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す。
図５は、オンジより精製された物質およびリバビリンの抗ＨＣＶレプリコン活性および細胞毒性を示す。
図６は、ウェスタンブロット解析によるオンジサポニンのＨＣＶタンパク質合成阻害の測定結果を示す。
図７は、ウエスタンブロット解析によるオンジサポニンの抗ウイルス効果を示す。
図８は、ノザンブロット解析によるオンジサポニンのＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害の測定結果を示す。
図９は、ノザンブロット解析によるオンジサポニンの抗ウイルス効果を示す。
発明の詳細な説明
ＨＣＶレプリコンアッセイを用いて、市販の生薬のエタノール抽出物２８０種についてスクリーニングしたところ、オンジ（Ｓ．Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｊ．Ｓｈｏｊｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ：２９，２４３１−２４４１，１９８１；Ｓ．Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｊ．Ｓｈｏｊｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ：３０，８１０−８２１，１９８２）およびセネガ（Ｙ．Ｓｈｉｍｉｚｕ ａｎｄ Ｓ．Ｗ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８，１５４４−１５４９，１９６６）の抽出物が選択的かつ強い抗ＨＣＶ活性を有することが見いだされた。生薬オンジおよびセネガは、去痰薬の配合剤原料として用いられており、抽出物には気道分泌亢進および利尿作用が知られている。しかし、オンジまたはセネガ由来の製剤および抽出成分に抗ＨＣＶ活性あるいは肝炎に対する治療効果があることは全く知られていなかった。
下記の実施例に記載されるように、オンジおよびセネガの抽出物をＬＣ／ＭＳで分析、同時に微量分取して各ピーク成分の活性を測定したところ、両生薬に共通する類似のサポニンのピーク群に抗ＨＣＶ活性が認められた。そこで、オンジについて、この成分を明らかにすべく活性物質を精製・単離し、構造を同定したところ、オンジサポニンＦなどのプレセネゲニンおよび桂皮酸誘導体をアグリコンとするサポニンを活性成分として分離することができた。オンジサポニンＦは、０．１７μＭでＨＣＶレプリコン活性を５０％阻害したが、６μＭでも細胞毒性は示さなかった。この活性は、サポニンを加水分解することにより消失した。
有効成分の抽出方法
本発明の医薬組成物は、ヒメハギ属の植物の根、茎、葉または種子から有用成分を抽出することにより製造することができる。ヒメハギ属の植物としては、好ましくは、オンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａ Ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ Ｗｉｌｌｄｅｎｏｗの根部）およびセネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ Ｌｉｎｎｅの根部）が用いられる。あるいは、これらを乾燥したものや粉末としたものを使用してもよい。
ヒメハギ属の植物の根、茎、葉または種子から抽出物を得るためには、これらの原料を細断し、５〜１００倍量の抽出溶媒を加えて数時間から数日間放置または撹拌する。抽出溶媒としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、プロパノール、ブタノール、メチルエチルケトン、ジエチルエーテル等、またはこれらの混合物を用いることができる。抽出は、冷却または加熱しながら行ってもよく、加圧処理してもよい。
得られた根、茎、葉または種子からの抽出物は、必要に応じて、濾過により不溶性成分を除去した後に、抽出溶媒を除去して、本発明の抽出物を得る。この抽出物は、必要に応じて低温殺菌してもよく、さらに濃縮、乾燥してもよい。乾燥は慣用の噴霧乾燥または凍結乾燥などにより行うことができる。抽出物は室温、冷蔵または冷凍条件下で保存することができる。
このようにして分離された粗抽出物は、必要に応じて、さらに精製する工程に付することができる。精製は、生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、例えば、シリカゲル、化学修飾されたシリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、ゲルろ過法等により行うことができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、水等を挙げることができ、これらは２種類以上を併用することができる。化学修飾されたシリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、含水メタノール、含水アセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる。高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体として、例えば、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基などが結合した化学修飾されたシリカゲル；ポリスチレン系ポーラスポリマーゲル等を挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水アセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる。ゲルろ過法においては、セファデックスＬＨ−２０やＧ−１０等のゲルろ過担体等を用いることができ、移動相としては、メタノールや水、含水メタノール等を使用することができる。
さらに、ヒメハギ属の植物の根、茎、葉または種子から上述のようにして抽出された物質を、さらに化学的に改変または修飾してもよい。そのような改変および修飾は、化学合成の分野においてよく知られる方法を用いて容易に行うことができる。
レプリコンアッセイ
本発明の医薬組成物の抗ＨＣＶ活性は、レプリコンアッセイを使用して測定することができる。レプリコンアッセイは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のインビトロＲＮＡ複製系であり、細胞レベルでＨＣＶの増殖能を予測するアッセイ系である。ＨＣＶはインビトロ細胞培養系が無いために、これまでは、抗ＨＣＶ薬の評価をするにあたり他の近縁ウイルスを用いた代替ウイルスアッセイ法を用いなければならなかった。近年、Ｌｏｈｍａｎｎら（Ｖ．Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ：２８５，１１０−１１３，１９９９）によりＨＣＶの非構造領域部分を用いてインビトロでＨＣＶの複製を観測することが可能になったことにより、レプリコンアッセイ法によって抗ＨＣＶ薬の評価が容易となった。オリジナルの方法はＨＣＶ−ＲＮＡ数をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で検出するものであるが、その代わりの方法としてＨＣＶ遺伝子中にレポーター遺伝子を導入する方法が一般的であり、より効率的なアッセイ法として評価に利用されている。
レポーター遺伝子としては、例えば、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを用いることができる。具体的には、Ｋｒｉｅｇｅｒら（Ｎ．Ｋｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：７５，４６１４−２４，２００１）の方法に従い、ＨＣＶ遺伝子のＩｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入する。インビトロで当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法等により適当な細胞に導入して、ホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞を得る。この細胞を９６穴プレートのウエルに蒔き、希釈した被検物質を加えて数日間培養する。次に基質を加えて、プレートリーダーでルミネッセンスを測定する。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、被検物質未添加の値を阻害０％として、被検物質のＩＣ_５０（５０％阻害濃度）を算出することができる。
細胞毒性試験（ＷＳＴ−８）
本発明の医薬組成物の細胞毒性は、例えば、市販のＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ ｃａｔ．ｎｏ．ＣＫ０４）を用いて測定することができる。上述のホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞を９６穴プレートのウエルに蒔き、希釈した被検物質を加えて数日間培養する。各ウエルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を添加し、吸光度を測定する。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、被検物質未添加の値を阻害０％として、被検物質のＩＣ_５０（５０％阻害濃度）を算出することができる。
医薬製剤
本発明の医薬組成物はＣ型肝炎ウイルス感染症の予防および／または治療に有用である。本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば、薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
経口投与用には、本発明の抽出物または化合物またはその塩を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。担体としては、当該技術分野において従来公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリンカカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を用いることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
非経口投与用には、本発明の抽出物または化合物またはその塩を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうるベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射剤用の水溶性ベヒクルとしては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性ベヒクルとしてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
本発明の医薬組成物の適当な投与経路には、限定されないが、経口、直腸内、経粘膜、または腸内投与、または筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が含まれる。投与経路および投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
本発明の医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−３０９１９６号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１
オンジおよびセネガの抽出物の抗ＨＣＶ活性および細胞毒性のアッセイ
生薬：オンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａ Ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ Ｗｉｌｌｄｅｎｏｗの根部）およびセネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ Ｌｉｎｎｅの根部）は小西製薬から購入した。オンジまたはセネガを刻み、それぞれ７０％エタノール水を用いて抽出し、乾燥して被検試料とした。
レプリコンアッセイ：Ｋｒｉｅｇｅｒら（Ｎ．Ｋｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：７５、４６１４−２４、２００１）の方法に従い、ＨＣＶ遺伝子のＩｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。インビトロで当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法でＨｕｈ７細胞に導入しＧ４１８耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞（Ｈｕｈ７−３−１）を５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ ｃａｔ．ｎｏ．ＳＨ３００７１．０３）を含むダルベッコＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ．ｎｏ．１０５６９−０１０）に懸濁し９６穴プレートに５０００細胞／ウエルで蒔き、５％ＣＯ_２、３７℃で一夜培養した。約２０時間後、希釈した化合物をウエルあたり１０μＬ加え、さらに３日間培養した。
アッセイプレートは２系統用意し、１つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートはＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ．ｎｏ．Ｅ２５２０）に用いた。すなわち、ウエルあたり１００μＬの試薬を入れ、３〜４回ピペットで混ぜ、５分間放置後に１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴＲＩＬＵＸ（ＷＡＬＬＡＣ）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害０％として薬剤のＩＣ_５０（５０％阻害濃度）を算出した。
細胞毒性試験（ＷＳＴ−８）：細胞毒性の測定にはＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ ｃａｔ．ｎｏ．ＣＫ０４）を用いた。すなわち、１０μＬのＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を上述のクリアープレートに添加し、３７℃で３０〜６０分間保温した。９６穴プレートリーダーにて波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍで吸光度を測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害０％として薬剤のＩＣ_５０（５０％阻害濃度）を算出した。
ＬＣ／ＭＳ分析：送液モジュール（ポンプおよびオートサンプラー）にはウォーターズ社２７９０、ＵＶ検出器に同９９６、ＭＳ検出器に同ＺＭＤ２０００を用いた。カラムには、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃｏｍｂｉ−ＲＰ５（Ｃ３０、４．６ｍｍＩＤ ｘ ５０ｍｍ、５μｍ、野村化学）を用いた。送液は、０．１％のギ酸を含むアセトニトリル−水グラジエント（アセトニトリルの割合：１５−９８％、１６分間）を用い、１．５ｍＬ／分で送液した。微量フラクションの分取には、フラクションコレクターＦＣ−２０３（ギルソン社製）を用い、０．４分間毎に１フラクション、合計４０フラクションを得た。なお、コントロールとして、フラクションの１番には、ＨＰＬＣ分画前のサンプル、すなわちエタノール抽出物を置いた。フラクションを濃縮乾固した後、レプリコンおよびＷＳＴ−８アッセイに供した。ＭＳでの分析は、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）のＮｅｇａｔｉｖｅモードを用いた。
ＬＣ／ＭＳによるオンジおよびセネガの分析と微量分取フラクションの活性：オンジおよびセネガのエタノール抽出物を、ＬＣ／ＭＳで分析、同時に微量の分取フラクションを調製、ＨＣＶレプリコンおよびＷＳＴ−８アッセイに供した。オンジのＬＣ−ＵＶ−ＭＳクロマトグラムと、微量分取フラクションの抗ＨＣＶレプリコン活性および細胞毒性を図１に、セネガのＬＣ−ＵＶ−ＭＳクロマトグラムと、微量分取フラクションの抗ＨＣＶレプリコン活性および細胞毒性を図２に示す。図中、クロマトグラムはＵＶ３２０ｎｍのものであり、フラクションは０．４分間毎に１フラクションである。各フラクションの５００倍および４５００倍希釈物について、レプリコン（Ｒｅｐ）および細胞毒性（ＷＳＴ）を測定し、その％阻害をグラフに示した。図１右上のパネルは、保持時間７．８２分のピークのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを、図２右上のパネルは、保持時間７．９２分のピークのＵＶスペクトルを、それぞれ示す。
その結果、オンジおよびセネガは類似のクロマトパターンを示し、ピークは、保持時間３−４分付近と７−９分付近のピーク群に別れ、抗ＨＣＶレプリコン活性は、７−９分のピーク群に観察された。これら活性は、オンジ、セネガとも、５００倍希釈で細胞毒性を示さなかったが（ＷＳＴ−８）、４５００倍に希釈しても強い抗ＨＣＶ活性が観察された。
これら活性ピークは、ＥＳＩ＋では明瞭なスペクトルを与えなかったが、ＥＳＩ−分析においては、ｍ／ｚ １４００〜１８００の比較的大きな擬似分子イオンピークをあたえた。また、これら活性ピークは、ＵＶ ３２０ｎｍ付近に吸収極大を示す特徴的なＵＶスペクトルを有していた。これらより、オンジおよびセネガは、構造類似の活性成分を含むと考えられた。
実施例２
オンジサポニンの精製および構造解析
オンジサポニンの精製：１００ｇのオンジ（刻み）より１０００ｍＬの７０％エタノール水を用いて抽出し、これを濃縮後、ブタノールで抽出・乾固し、粗抽出物２０ｇを得た。この一部を、分取ＨＰＬＣにより５つの分画を得た（Ｆｒ．１〜５）。
分取ＨＰＬＣは以下の条件で行った。ＨＰＬＣには、ギルソン社３０６ポンプおよびアジレントテクノロジー１１００ ＰＤＡ検出器を、フラクションコレクターに２１５リキッドハンドラーを用い、ギルソン社ユニポイントシステムで制御した。カラムには、Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（２０ｍｍＩＤ ｘ ２５０ｍｍ、センシュー科学）を用いた。０．０１％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含むアセトニトリル−水グラジエント（アセトニトリルの割合：４０−５０％、１７分間）により、１５ｍＬ／分で送液し、ＵＶ３２０ｎｍの吸収を指標にピーク分取した。加水分解物の分取には、カラムにＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＯＤＳ（２０ｍｍＩＤ ｘ ５０ｍｍ、関東科学）を用い、０．０１％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含むアセトニトリル−水グラジエント（アセトニトリルの割合：４０％、１分間；４０−５０％、１６分間；５０％、３分間）により、１５ｍＬ／分で送液し、フラクションを時間で分取した。
物質の構造解析は、ＬＣ／ＭＳによる解析に加えて、ＮＭＲ（Ａ−５００、日本電子）により行った。Ｆｒ．１は、ＬＣ／ＭＳ ＥＳＩ−スペクトルにおいて、ｍ／ｚ１５７１（Ｍ−Ｈ）および１６１７（Ｍ−Ｈ）を与え（混合物）、それぞれオンジサポニンＢとポリガラサポニンＸＬＩＶと推定された。Ｆｒ．２は、ＥＳＩ−ｍ／ｚ１６７３（Ｍ−Ｈ）を与え、ポリガラサポニンＸＸＸＩＩ（図３ａ、分子量１６７５．８０、分子式Ｃ_７９Ｈ_１１８Ｏ_３８）と推定された。Ｆｒ．３は、ＥＳＩ−ｍ／ｚ１８１７（Ｍ−Ｈ）を与えた。Ｆｒ．４は、ＥＳＩ−ｍ／ｚ１５８７を与え、オンジサポニンＦ（図３ｂ、分子量１５８９．７１、分子式Ｃ_７５Ｈ_１１２Ｏ_３６）と推定され、さらに^１Ｈ−ＮＭＲ（図４）により確認された（１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）スペクトル：測定溶媒は重メタノール）。Ｆｒ．５は、ＥＳＩ−ｍ／ｚ１７３１を与えた。
実施例１と同様にして、オンジより精製されたＦｒ．１〜５の抗レプリコン活性および細胞毒性（ＷＳＴ−８およびＴｈｄ）を測定した。結果を図５および表１に示す（図中、１．Ｆｒ．１、２．Ｆｒ．２、３．Ｆｒ．３、４．Ｆｒ．４、５．Ｆｒ．５、６．リバビリン（陽性対照））。

Ｆｒ．１〜５のＩＣ_５０値は、それぞれ、０．３８、０．０２１、０．４５、０．２７および０．９０μｇ／ｍＬ（０．２４、０．０１３、０．２５、０．１７および０．５２μＭ）であった。これに対して、細胞毒性のＩＣ_５０値はＷＳＴ−８法にて１０μｇ／ｍＬ以上であった。Ｆｒ．２は、５０％以上の増殖阻害にはいたらないものの、弱い細胞毒性が比較的低濃度より観測された。
実施例３
ウェスタンブロット解析によるオンジサポニンのＨＣＶタンパク質合成阻害の測定
ウェスタン解析は以下の方法でおこなった。実施例２で得られたオンジサポニンＦ（Ｆｒ．４）を１０ｎＭから１０００ｎＭの範囲でレプリコン細胞Ｈｕｈ−３−１に与え、５％ＣＯ_２存在下、３７℃にて培養した。７２時間後に培地を捨て、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ．Ｐ３８１３）を加え、ピペッティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。６穴プレートの細胞当たり２００μＬのＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ２９７８）と２μＬのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ．Ｐ８３４０）を加え、室温で１５分間振とうした。遠心分離（１５０００回転、１５分間）後、上清のタンパク定量をＤｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ ｃａｔ．ｎｏ．０７４−２７）にておこなった（ウシγグロブリン標準液、ＢＩＯ−ＲＡＤ ｃａｔ．ｎｏ．５００−０００５）。得られたタンパク質５μｇを９−１１％グラジエントゲル（第一化学薬品ｃａｔ．ｎｏ．３１７５５２）でトリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ ｃａｔ．ｎｏ．１６１−０７７２）を用いて電気泳動した。分子量サイズマーカーはＲａｉｎｂｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ．ｎｏ．ＲＰＮ７５６）を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスブロットセル（ＢＩＯ−ＲＡＤ ｃａｔ．ｎｏ．１７０−３９３０）にてメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ、ミリポアｃａｔ．ｎｏ．ＩＰＦＬ０００１０）に転写した。以下、オデッセイ（アロカ）のプロトコールに従い、一次抗体にＨＣＶタンパク質由来の抗ＮＳ３ウサギ抗体（Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，１６ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ７４２）を用いてウエスタン解析を行った。内部標準として抗アクチンウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ．ｎｏ．７０７４）、二次抗体に抗ウサギＩｇＧ（Ａｌｅｘａ６８０：Ａ２１０７４）を用い、オデッセイで検出した。その結果、オンジサポニンによるＨＣＶタンパク質合成の阻害の濃度依存性が確認された（図６）。各バンドの強度を定量し、ＨＣＶタンパク質の発現を５０％減少させる薬剤濃度（ＩＣ５０）を計算したところ、５５．４ｎＭであった（図７）。
実施例４
ノザンブロット解析によるオンジサポニンのＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害活性の測定
実施例２で得られたオンジサポニンＦ（Ｆｒ．４）を１２ｎＭから１０００ｎＭの範囲でレプリコン細胞Ｈｕｈ−３−１に与え、５％ＣＯ_２存在下、３７℃にて培養した。７２時間後に細胞を回収し、全ＲＮＡを抽出した後で、Ａｍｂｉｏｎ社のノザンマックスキットの方法に従い、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った。
ノザン解析は以下のものを用いた。すなわち、ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ ｃａｔ．ｎｏ．８６７２），転写膜（オデッセイｃａｔ．ｎｏ．９２６−１００００）、ろ紙（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ．Ｐ−６６６４）、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ ｃａｔ．ｎｏ．８６７０）。プローブの標識はＢｉｏｔｉｎ−１６−２’−ｄｅｏｘｙ−ｕｒｉｄｉｎ−５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ．ｎｏ．１１ ０９３ ０７０ ９１０）を用いてＰＣＲ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ．ｎｏ．Ｎ８０８−０００９）にて行った。Ｈｉｇｈ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｉｂｉｏｎ ｃａｔ．ｎｏ．８６７４）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１％ＳＤＳ、Ａｌｏｋａ ｃａｔ．ｎｏ．ＯＤＹ−９２７−４００００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（アロカｃａｔ．ｎｏ．Ｓ２１３７８）。
１％アガロースゲルで１μｇのトータルＲＮＡを泳動し、泳動後エチジウムブロミドでＲＮＡを染色して写真をとり、脱色後ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒを用いて転写膜に２時間転写した。湿ったままの状態でＵＶクロスリンカーにてＲＮＡを転写膜に固定化した。ハイブリローターを用いて、ＵＬＴＲＡｈｙｂにて４２℃、３０分間の回転前処理の後、前処理液を捨て、上記ＰＣＲ法にて作製したビオチン化ネオマイシン耐性遺伝子と１０ｍＬのＵＬＴＲＡｈｙｂ液を加えて４２℃で一夜振とう処理した。
ＵＬＴＲＡｈｙｂ液を捨て、５０℃に保温したＨｉｇｈ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｂｕｆｆｅｒを１５ｍＬ加え５０℃で３０分間振とうした。同様の操作をもう一度繰り返した。以下、オデッセイ（アロカ）のプロトコールに従い、ＲＮＡのバンドを検出した（図８）。その結果、オンジサポニンによるＨＣＶ ＲＮＡ複製の阻害の濃度依存性が確認された。各バンドの強度を定量し、ＨＣＶ ＲＮＡの複製を５０％減少させる薬剤濃度（ＩＣ５０）を計算したところ、５９．６ｎＭであった（図９）。

本発明の医薬組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、例えば、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌の予防および／または治療に有用である。

Claims (12)

1. ヒメハギ属の植物の抽出物を有効成分として含有する、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物。
2. ヒメハギ属の植物の抽出物がオンジの抽出物またはセネガの抽出物である、請求項１記載の医薬組成物。
3. ヒメハギ属の植物の抽出物がサポニンである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. サポニンが、オンジサポニンまたはポリガラサポニンである、請求項３記載の医薬組成物。
5. オンジサポニンＢ、ポリガラサポニンＸＬＩＶ、ポリガラサポニンＸＸＸＩＩおよびオンジサポニンＦからなる群より選択される化合物を有効成分として含有する、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物。
6. 以下の式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、
   Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、糖、糖鎖または水素であり；
   Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲ_７であり、ここで、Ｒ_７はＣ_１−６の直鎖または分枝鎖のアルキル基である］
   の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物。
7. 式（Ｉ）の化合物が、式：
   

   

   で表される化合物である、請求項６記載の医薬組成物。
8. Ｃ型肝炎ウイルス感染症が、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌からなる群より選択される、請求項１−７のいずれかに記載の医薬組成物。
9. Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者にヒメハギ属の植物の抽出物を投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療する方法。
10. Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者に以下の式（Ｉ）：
    

    

    ［式中、
    Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、糖、糖鎖または水素であり；
    Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲ_７であり、ここで、Ｒ_７はＣ_１−６の直鎖または分枝鎖のアルキル基である］
    を投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療する方法。
11. 式（Ｉ）の化合物が、式：
    

    

    で表される化合物である、請求項１０記載の方法。
12. Ｃ型肝炎ウイルス感染症が、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。

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